高分辨率扩散通量计

荧光显微成像技术对人们理解神经科学起了非常关键的作用。而最近一些年出现的各种超分辨显微成像技术和专门的荧光探针能够以超过以往普通光学显微镜的分辨率直接观察神经元亚细胞结构和蛋白质排列。并以直观可视方式揭示了神经细胞骨架组成、分布、运动和膜蛋白信号传导、突触下结构和功能，以及神经元−胶质细胞相互作用。同时超高分辨显微成像技术（Super Resolution,SR,下文中出现SR均指超高分辨率显微成像技术）对于许多自身免疫和神经退行性疾病模型中的分子靶点研究也提供了全新的强大工具。今年春，Werner等科学家在美国化学学会会刊（ACS)上最新发表了一篇综述，比较详实系统介绍了超高分辨率显微技术在神经科学上的最新应用进展。我们在此文基础上进行了编译整理。因文章较长，分四期介绍。本期为第三部分内容。5.3. 突触后室突触受体位于突触后室，负责传递来自突触前末端的信号。它包含支架蛋白--负责锚定突触后受体的专门用于信号整合的信号分子。在神经元树突中，从主要树突轴起源并突起的小体积树突棘提供分区功能，并根据突触活动和发育阶段显示大小和形状的动态变化。树突棘是突触长时程增强（LTP）的结构相关物，因此与学习和记忆有关。要想准确观察树突棘的小尺寸、不同形状和动力学，一般要求采用超过衍射极限的分辨率并有可能进行活体成像的光学显微镜方法。第一个将活细胞SMLM应用于原代神经元的研究之一是使用碳菁染料（如Dil）可视化脊髓和丝状足。对于突触后膜结构的可视化，已经发现了一个新的膜标记试剂系列，该系列可实现神经元追踪和树突棘的可视化。最近，通过快速SIM和增强共聚焦显微成像研究了树突棘上微小突起（称为小刺）的动力学。通过将SIM成像与计算方法相结合，进一步评估了树突棘的几何结构，证实凹面对于棘结构稳定的重要性。在树突棘中，F-肌动蛋白高度定位富集在突触后密度区（PSD）和树突棘膜上。肌动蛋白的分子速度升高已让其扩散到除棘尖外整个棘的亚区。为了分析脊髓中肌动蛋白的动力学，我们设计了一种低亲和力的光转换肌动蛋白探针，并利用像差校正光学系统对活体脑切片动力学进行了表征。通过STED显微镜观察对phalloidin-ATTO647N标记的原代神经元，可以在树突棘颈和丝状棘中观察到F-肌动蛋白的周期性片段。同年，STORM成像也显示树突棘颈和丝状棘中存在以肌动蛋白为基础的周期性膜骨架。在树突棘中，分支的F-肌动蛋白在PSD附近聚集，而延伸仅限于指状突起的尖端，并为棘突提供了基础。通过基于监督学习的模式识别进行图像分割，可以对树突肌动蛋白组成异质性做自动分析。用SMLM也对树突F-肌动蛋白进行了同样的分析，并使用树突铂复原电镜进行了验证。使用STED显微镜在活体小鼠脑切片海马CA1神经元上进行延时拍照并结合FRAP及电生理学检查，证明在神经递质释放诱导的长时程增强（LTP)时树突棘颈部具有可塑性（宽度增加并长度减少）。使用正置STED显微镜实现了活体小鼠树突棘动力学的首次超高分辨率成像。在这里Thy1 EYFP小鼠体感皮层中的树突棘在其头部和颈部表现出形态可塑性。另外使用双光子STED成像对活体小鼠的海马树突棘动力学进行了研究，树突棘密度与早期报告相比高出2倍，并能测算几天内的树突棘蛋白周转率（图10）。图10 体内长时程双光子STED成像--海马CA1锥体神经元树突棘蛋白周转。左上图：使用长工作距离物镜的实验方法和CA1锥体神经元的双光子整体图像。右上图：传统的双光子成像与双光子STED成像的比较，显示了总体上更高的棘突密度和更详细的形态，特别是在轴和棘突中。空的箭头标志着常规双光子成像不能显示的棘突，而填充的箭头表示双光子STED报告的棘突数量更多、形态更复杂。底部图像：在海马CA1区基底树突的一个选定区域内，连续几天（第0天、第2天和第4天）成像的树突棘周转。树突棘被连续编号。AB=接近树突的轴突（缩回的棘突用红色标记；新的棘突用绿色标记）。转载自原文参考文献 273。此外，sptPALM揭示了富集在突触棘的突触后激酶CaMKII的空间和动力学亚群，该激酶介导钙依赖性可塑性机制。这些动力学似乎由棘肌动蛋白调节，因为Latrunculin A导致棘内CaMKII扩散显著改变。在PSD内的棘头，一个密集的蛋白质复合物含有不同的突触后支架蛋白，如PSD-95、homer1和shank3，它们排列在大小为∼80纳米的亚突触域中。根据不同的突触类型，PSD-95被动态组织为单个单元或多个纳米簇的形式。STED显微镜揭示了突触后支架蛋白负责将离子受体锚定到突触后膜上，SMLM观察到的活体原代神经元也是一样。在这里，活细胞单分子成像结合定量分析揭示了含有GluA2的AMPA-Rs（优先聚集在突触下的PSD-95簇中）的稳态调节。而PSD-95的uPAINT成像和AMPA-Rs的spt PALM报告在70 nm大小的PSD-95纳米域内平均聚集了20个AMPA-Rs，进一步证实了上面提到的这个发现。AMPA-Rs形成纳米颗粒，并能在几分钟内动态改变其大小和形状。与突触可塑性匹配的是：动态变化是通过突触内和突触外隔室之间的AMPA-Rs在时间维度交换，通过横向扩散来实现的。这些过程通过以微球标记抗体为靶点的内源性受体的单分子追踪实验得到证实。受体运动的类型被认为是布朗扩散，与突触后元件发生短暂的、低亲和力的相互作用。单分子追踪实验中使用Atto 647N修饰的抗体揭示了谷氨酸诱导的脱敏AMPA-Rs的侧向扩散增加导致的短期可塑性。AMPA-Rs的侧向扩散也与突触的短时程增强和长时程增强（分别为STP和LTP）有关。例如，已经证明，为了从突触抑制中恢复，脱敏受体通过侧向扩散被功能受体替换。此外，追踪实验表明，在CaMKII激活诱导LTP后，AMPA-Rs扩散到突触部位。这一过程由钙浓度升高触发，它导致CaMKII介导的stargazin（它与PSD-95一起能够调节AMPA-R的迁移率）磷酸化。进一步的研究报道，AMPA-Rs的交联导致膜上受体制动，它阻止了成功的LTP诱导。这一机制也可能导致由AMPA的致病性抗体介导的自身免疫性CNS疾病的病理生理学。与NMDA-R和mGluR5代谢受体的GluN1亚单位相比，AMPA-Rs的纳米级结构以不同的簇大小为特征。令人惊讶的是，突触前mGluR5受体表现出更均匀的分布，没有聚集行为。通过一种新的基于敲入的基因组编辑方法观察到，代表NMDA-R总库的内源性GluN1亚单位受体被证明聚集在一个由单个受体包围的主要单簇中。在关注NMDA-R细分的NR2A和NR2B亚型时，SMLM表明，在突触发育过程中，这些亚型被分割成纳米结构域，并根据其突触比率进行重塑。关于谷氨酸受体的活动性，单分子追踪实验揭示，神经元活动优先影响AMPA-R的活动性，而NMDA-R的活动是由蛋白激酶C活动触发的，而不是由钾升高触发的。此外，dSTORM成像表明，不同的NR2亚单位定位于不同的纳米结构域，这些纳米结构域在神经元发育过程中表现出灵活性。根据NR2A和NR2B的纳米结构，LTP的表达可以双向调节。kainate受体的单分子追踪实验也表明，突触捕获紧随着突触活性增加后发生。这里，突触激活导致的kainate受体与突触β-连环蛋白/N-钙粘蛋白复合物结合，形成短期可塑性。作为抑制性突触的对应物，gephyrin是将GABAA（GABA-a R）或甘氨酸受体（GlyR）并入突触后膜所必需的关键锚定分子。通过对突触中gephyrin分子的PALM/dSTORM成像发现：抑制性PSD（iPSD）体积为0.01至0.1μm3，并且每个iPSD中有200−250个gephyrin分子。单分子成像进一步揭示了gephyrin分子与受体结合位点的化学计量比约为1:1.96。类似于兴奋性突触，抑制性PSD（IPSD）根据突触活动动态调节其大小。通过NMDA-R激活形成的抑制性突触LTP加剧突触gephyrin积累，从而以CaMKII依赖的方式增加GABA-AR聚集，从而诱导GABA能突触后电流的增强。相反，抑制gephyrin向突触区的募集导致GABA-AR迁移率降低，并阻止iLTP的诱导。iLTP诱导后，gephyrin片段化为纳米结构域。gephyrin的重组降低了抑制性突触后电流的振幅变异性，证明了GABA-AR准确定位对于iLTP的真正表达非常重要。有趣的是，单粒子追踪显示，脱敏的GABA-AR甚至可以通过侧向扩散在并列的GABA能突触之间交换，为控制GABA能电流提供了另一种机制。此外，为了阐明多巴胺能突触的超微结构布局，dSTORM成像将多巴胺转运体映射到胆固醇依赖性纳米结构域，从而为更好地理解多巴胺能神经传递的病理生理过程奠定基础。5.4.亚突触结构域中的跨突触排列早期电生理学实验中已经发现，突触强度取决于突触前融合位点和突触后受体组织之间的空间关系，突触释放由释放位点的数量，突触小泡的释放概率，以及受体提供的突触后基本反应来决定。首先观测到的亚结构域的跨突触组织是突触粘附分子SynCAM 1位于边缘，EphB2位于PSD的中央。SynCam1在PSD中形成突触下云，可被长期抑郁症模式重塑。SMLM观察链霉亲和素的新单体变体（设计用于减少突触区域的交联和空间位阻），表明跨突触伙伴神经肽原1和神经纤维素1ß在突触处扩散受阻，形成相反的簇。这项研究还表明，另一种粘附分子LRRTM2的流动性不如神经肽1，并形成更密集、更稳定的簇。最近揭示了兴奋性突触上活性区的细胞基质和突触后受体支架的跨突触排列，它与提供高保真突触传递的靶向神经递质释放有关。在这里，释放位点定位是通过一种基于融合到突触囊泡蛋白Vglut1的pHluorin标记和RIM1/2纳米簇的超分辨检测的新方法实现的。多色3D定位显微镜显示RIM1/2和突触后PSD-95形成相反的纳米簇。LTP诱导导致PSD-95密度断裂增加，同时增强了纳米柱的排列，而LTD导致突触后柱的紊乱。突触前和突触后关键分子的这种纳米级排列主要由于neuroligin 1。此外，在应用STED显微镜的实时成像实验中，已经报道了树突棘体积增加和排列的纳米模块数量之间的紧密相关性。还报道了抑制性突触的亚突触结构域的纳米级排列。在这里，STED和SIM阐明了gephyrin和GABA-AR突触前亚区域的紧密联系。此外，突触后GABA-A 受体云显示与突触前边缘结构域结合（图11）。在小鼠神经肌肉连接处，带连接褶开口的突触后乙酰胆碱受体和突触前活动区的排列已通过应用SIM成像可视化。图11. 抑制性突触上的突触亚结构域。突触前的RIM元素与突触后的gephyrin支架分子以及抑制性突触的GABA-A R的突触下结构域的排列。PSD的体积和突触下域的数量随着活动相关的突触大小的变化而变化。转载自原文参考文献302。5.5. 三联突触星形胶质细胞是神经传递的基本调节者，神经元突触周围突触前星形细胞突起（PAPs）的吞噬产生了三联突触这一术语。PAPs能够通过传递调节分子来改变和控制突触的传递。通过dSTORM重建星形细胞突起，可以通过标记胶质酸性纤维蛋白（GFAP）和谷氨酰胺合成酶和S100b的成像来实现星形细胞的纳米级可视化。最近的一份报告应用ExM来观察脑片中突触周围的星形胶质细胞谷氨酸转运体显示，在与这些棘附近的GLT-1水平较高有关的较大的神经元树突棘中，谷氨酸的摄取效率降低（图12）。图12. 海马大脑切片中CA 1锥体神经元周围的星形细胞突起。锥体神经元的树突在Thy1-YFP小鼠系标记（绿色）；星形胶质细胞则是在海马脑片上的GLT-1免疫染色显示（红色）。蓝色信号代表树突区和星形细胞突起的共同定位。更高的放大率插图见右图。左下：大棘和小棘的分类。底部中间和右侧：GLT-1和神经元YFP的共定位像素的量化。请注意右图树突棘体积归一化后的变化；红点表示平均数和SEM，p = 0.0220 (绝对GLT-1覆盖率），p = 0.00223（相对GLT-1覆盖率）。转载自原文参考文献307。EM和STORM发现，PAPs也配备了局部翻译位点，以避免星形细胞体细胞中合成的蛋白质的长距离运输路线。最近在器官型切片中进行的3D STED显微镜研究揭示了星形细胞钙信号的结构前提。在星形细胞内检测到了海绵状结构，它包含了接近突触部位的节点和轴。钙离子瞬变的共聚焦成像与星形细胞结构的STED显微镜相结合，显示自发的钙离子瞬变紧密地映射到这些结点。因此，这些结点被认为是类似于树突棘的空间分隔作用。胶质传导物质的外渗需要提供胶质囊泡。通过将电容测量与葡聚糖摄取后星形胶质细胞内的囊泡的SIM图像相关联，发现了外吞和内吞之间的Dynamin依赖性膜中间物。通过STED显微镜和SIM分析单个胶质小泡的特征，在星形胶质细胞中有两个小泡群，其大小和融合能力不同。Phluorin实验结合SIM确定星形胶质细胞囊泡上Syb2分子的拷贝数为25∼。此外，应用STED和TIRF显微镜对培养的星形胶质细胞中的VAMP3阳性囊泡进行了单囊水平的分析。测量结果显示VAMP3覆盖的囊泡大小约为80纳米，并提供证据表明这些囊泡参与了钙依赖性的囊泡循环。SIM成像还可以发现，突触蛋白中一种已知的参与神经元外排的v-SNARE蛋白，也普遍存在并组织在单个星形胶质细胞的囊泡上，以实现高效的外排。星形胶质细胞还通过回收proBDNF到BDNF参与促进兴奋性LTP。这里，SIM成像显示，proBDNF在体细胞区域位于囊泡大小的集群中，而沿星形胶质细胞末梢的点状模式占主导地位，以扩大BDNF对记忆的作用。为了最大限度地减少激发光的散射，通过应用被动CLARITY进行组织透明化和多光子显微镜，改善了组织深处的星形细胞成像。通过使用SiR-actin和SiR-tublulin探针的STED显微镜和原子力显微镜（AFM）的相关方法来测量膜的拓扑结构和硬度，将星形细胞的细胞骨架和膜的生物物理特性联系起来。（未完待续）本文由超高显微技术应用工程师郭连峰、黄梓彤编译（受篇幅限制，未将参考文献列出）相关阅读：超高分辨率显微技术在神经科学中的应用（一）超高分辨率显微技术在神经科学中的应用（二）

光学显微镜至今已有三百多年的历史，从观察细胞的初代显微镜发展到如今打破分辨率极限的超分辨显微镜。近年来，生命科学领域蓬勃发展，对显微成像技术不断产生新的需求，光学显微镜不断向更高分辨率、快速成像、3D成像等高端技术方向发展。 我国高端光学显微镜市场长期处于被国外产品垄断的局面，许多关键核心部件依赖进口。令人欣喜的是，近五年来，市场上涌现出多种国产高端光学显微镜，包括超分辨显微镜、双光子显微镜、共聚焦显微镜、光片显微镜等，逐渐打破当前市场格局。基于此，仪器信息网特别制作“破局：国产高端光学显微镜技术‘多点开花’” 专题，并向国产光学显微镜企业广泛征稿（投稿邮箱：lizk@instrument.com.cn），了解各企业主要高端光学显微镜产品技术特点和发展进程。本篇为宁波力显智能科技有限公司供稿，公司主要产品为INVIEW iSTORM超高分辨率显微镜，其采用的STORM技术是目前国内鲜少有的超分辨技术类型。撰稿人：宁波力显智能科技有限公司副总经理张猛博士人类的历史，也是一部工具的历史。人类发展的历程就是关于如何对世界了解的更多，将人类生活变的更好更先进的历程。从旧石器时代，原始人拿起第一块石头当作工具开始，就开启了用工具进行未知世界探索和创造性改变的历程。从古至今，人类都是工具发明和使用的种族，新工具的问世也反哺人类的成长和进步，让人类一次次突破原有认知边界看到更多的未知，解决更多的问题，取得更多的成就。显微镜，正是一项帮助人类认识微观世界从而改变世界的革命性工具，也是人类探索微观世界不可缺少的工具。显微镜问世之前，人类仅可用感官来把握世界，所能认识到最小世界就是“目所能及”的常规世界，人的肉眼仅能分辨约0.1毫米尺度的物体，因而相关科学的发展缓慢。当罗伯特胡克使用显微镜观察到软木塞上的“小室”，并将其命名为细胞时，可能还没有意识到他这次实践将为人类开启微观世界的大门。人类对未知领域无限的好奇心是推动科学技术前进的动力之一，为了解析关乎生命基本结构，回答有关物质与生命等基本问题，为此人类不断开发出更为精密、分辨率更高的显微镜来探寻这些问题的答案。经过400多年的发展，近几年国际上出现了超高分辨率显微镜这一工具，一经面世就引起了众多科学家的关注和极大兴趣。那么什么是超高分辨率显微镜，为什么它能让科学家如此感兴趣呢？我们一起往下看。超高分辨率显微镜的诞生，是生命科学史上的一座里程碑简单的讲，超高分辨率显微技术是通过应用一系列物理原理、化学机制和算法“突破”了光学衍射极限，把光学显微镜的分辨率提高了几十倍，使得人类能在200nm以下以前所未有的视角观察生物微观世界的技术，具有超高分辨成像技术和实现超高分辨率成像能力的显微镜就是“超高分辨率显微镜”。那么什么是光学衍射极限呢？所谓光学衍射极限，是1873年德国科学家恩斯特阿贝提出的，由于光是一种电磁波，存在衍射，一个被观测的点经过光学系统成像后，不可能得到理想的点，而是一个衍射像，每个物点就像一个弥散的斑，如果这两个点靠得很近（小于可见光波长大约一半，约200nm），弥散斑就叠加在一起，看到的就只能是一团模糊的图像，也就无法清晰观测到衍射极限以下物体的微观空间结构。并且光学衍射极限此前长期被认为是限制光学显微镜技术通向更微观的“拦路虎”和“绊脚石”，甚至被科学界一度认为是无法突破或绕开的。直到2000年，几位世界知名科学家先后发明了几种不同技术路线的的超高分辨率显微技术。其中，Stefan Hell、Eric Betzig和W.E. Moerner三位科学家就是因其在超高分辨率显微成像技术领域的突出贡献，获得了2014年诺贝尔化学奖。至此，人类才得以突破光学衍射极限这一横亘在前、不可逾越的“大山”，实现了200nm以下超高分辨率显微成像，以光学的方法观测到纳米尺度世界的真实样貌。超高分辨率显微镜可用来研究分子定位与空间分布、分子相互作用、分子复合物的构成，并可实现分子的计数。除具有200nm以下卓越分辨率性能外，对生命样品结构也可进行精准成像定位，还具备对活体细胞进行微观观察的可能性，对于生物、生命科学、医药、医学等的领域都有着重要意义，因此吸引了全球科学家的持续研究和关注。通常来说，超高分辨率显微镜主要有两大类技术策略，一类是通过特定模式照明对分子受激荧光差异化调制实现超高分辨率成像。代表产品有受激发射光耗损显微镜(Stimulated Emission Depletion, STED)和结构光照明显微镜(Structured Illumination Microscopy, SIM)。另一类，是利用荧光分子的“开关”特性，使其随机闪烁，从而能够对单个分子分别记录，实现超高分辨率成像。随机光学重构显微镜（Stochastic Optical Reconstruction Microscopy, STORM）就是这类技术路线的代表。第一大类中，STED及其衍生都是利用“甜甜圈”状的空心光束来修饰位于中间激发光的点扩散函数（Point Spread Function, PSF），从而达到直接超分辨成像的目的。而SIM则是利用了结构光照明，以获得包含样本的结构信息的干涉图案“摩尔条纹”，加上后期的图像重构，达到超分辨成像的目的。第二大类中，STORM是利用了荧光染料分子“光控开关”（photo-switchable）性质，达到在一个衍射极限空间内（200~300 nm）随机“点亮”单个荧光分子并进行高精度定位的目的。既然叫超高分辨率显微镜，最为重要的就是对空间分辨率的提升。其实无论哪一类技术，理论上空间分辨率都是可以实现无穷小，但是受限于样本、荧光染料特性、标记密度、激发光效率等原因，实际拍摄中能实现的空间分辨率是几十纳米。从遍地洋货到国货崛起众所周知，高端显微镜市场被“洋货”所长期垄断，不仅在国外如此，在中国也是如此，国货“芳踪难觅”，这对于我们这样一个大国来说可算是“一言难尽”。当然，也有令人感到振奋的信息，那就是在超高分辨率显微镜这个细分领域，除了“洋货”最近也已见到了国货产品的身影。宁波力显智能科技有限公司（INVIEW）的超高分辨率显微镜产品INVIEW iSTORM就是一款国产超高分辨率显微产品。宁波力显智能科技有限公司是专业从事超高分辨率显微技术和产品研发的科技企业，依托复旦大学的自动控制、新一代信息技术及香港科技大学的生物、光学、图像处理等的技术，拥有光学、生物、自控、机械、信息技术等多领域交叉学科技术团队，将2014年诺贝尔化学奖得奖技术产业化，推出了INVIEW iSTORM超高分辨率显微产品，以帮助人类以前所未有的视角观察微观世界，突破极限，见所未见。INVIEW iSTORM超高分辨率显微镜产品采用dSTORM技术路线，具有20nm超高分辨率、2-3通道同时成像、界面友好、简单易用、系统稳定性好、环境适应性高等的特点。技术先进，20nm超高分辨率，3D成像采用STORM随机光学重构技术，加入柱面镜设计，在XY轴分辨率达20nm、Z轴分辨率达50nm，具备3D成像功能。多通道同时成像光路设计，稳定性高采用专有的多通道同时成像的光路设计，提供稳定的光路。自主开发的成像分光光路，可保证通道间的光学路径相对独立，使得样品发出的荧光最大效率地被探测器接收，最大限度降低通道间的串扰。并配合以最佳染料方案和最佳成像缓冲液配方，以多通道同时成像的方式，在几秒到十几分钟的时间范围内实现20nm的超高分辨率成像。物理样品锁定设计，锁定精度1nm采用纳米级实时动态锁定技术，以实时物理补偿方式纠正样品漂移，无需预热，即开即用，操作简便，免受如气流、温度变化、噪音、机械振动等的环对样品位置的影响，在高楼层、嘈杂、震动、常温常态的环境下也能稳定成像，因而具有高效、简便、对环境适应性好的特性，友好易用。 “傻瓜式”操作，易学易用软件集成了多种成像算法，并在采集数据时实时呈现超高分辨图像重构结果和详细参数，“所见即所需”，操作流程化，简单易用。具有拍摄过程简单易用、参数优化实时透明、超分辨图像实时重构、自动化用户数据管理、图像数据后分析功能等五大特点。此外，经过优化的样本制备方案更易于实验人员的掌握和实际操作。即便是技术新手，经过简单的技术讲解，2个小时以内就可操控系统并获得理想的超分辨率成像结果。以上，INVIEW iSTORM超高分辨率显微产品所具备的综合特点和优势，使得它能够帮助到更多科学家进行衍射极限尺度以下的生物分子组织与相互作用等的尖端科学研究。另外，值得一提的是，INVIEW iSTORM产品还以优异的光路、较低强度的照明、多通道同时成像所支持的较短成像时间等的综合性能，结合合适的荧光探针及根据探针特性调整的探测器拍照频率等，实现活细胞的超高分辨率成像，这将更大程度上帮助到科学家在生物学基本问题与机制上的科学研究。随着人类对自然的认识向更加微观的时空尺度，传统的科研手段已经不能完全胜任，没有高端科研仪器，要想做出重大原始创新科研成果很困难。力显智能科技将继续立足于超高分辨率显微镜技术研究及产品开发，不断推出新技术、新品，从而推动高端显微技术在中国的产业化和应用，努力为我国生命科学、医学、药学等领域的科学研究提供强大助力。INVIEW iSTORM超高分辨率显微产品超高分辨率显微技术的未来可期作为一种新兴荧光显微成像技术，超高分辨率显微成像正受到科学家们的广泛关注，实验室中不断产生着振奋人心的数据。围绕着超高分辨率核心，主要研究方向为不断提高显微镜成像性能，使其分辨率更高，成像速度更快，成像深度更深，视野范围更大，及更低的光毒性光漂白。而我们也可以清晰的看到，由于不同的超高分辨率成像技术提升分辨率的技术路径差异，很难有“面面俱到”的技术可以满足差异化样品的全部成像需求，“精准成像”，也就是针对不同的样品特点，而选择最适合这类样品的显微成像技术，是进行生命科学等领域研究的最优解，这也促使生物，光学，算法，图像处理等领域的研究人员不断深入跨学科合作，共同探索生命的奥秘。即便有了更快、更高、更深、范围更大，更低光毒性光漂白的超高分辨率显微镜，扩展应用仍有诸多挑战。细胞内有成千上万的转录本，有数以万计的蛋白分子。超高分辨率显微镜能否用来实现组学水平的多分子检测？能够找到或开发出足够多样的荧光染料以匹配更多分子吗？或者能找到奇方妙法可以实现多重、多轮检测吗？ 能否开发出新型的荧光染料，使其具有更高的光子预算，更好的光稳定性、光激活、光开关以及转换速率等特性；研制更快更灵敏的光子探测器、输出功率更高的激光器；更稳定、高效、智能的光学系统；更加高效的算法以及不同超高技术路线的联合应用；开发组学水平的多重检测方法等等，正有许多的科学家、研究者们正在进行着有益的尝试。相信未来超高分辨率技术应可应用于实现细胞内的原位测序、原位转录组与蛋白质组分析，并最终获得全景的、多组学、全时空细胞全部分子组织及相互作用图像，真正实现分子生物学与细胞生物学的新融合，让人类有更全面、更精细的视角来理解生命的基本分子组织及其运行的基本机制！超高分辨率技术和产品应用前景巨大，未来可期，令人振奋！

珀金埃尔默通过推出全新高分辨率液相色谱系统扩展其色谱系列产品与 TotalChrom 软件集成的全新色谱柱技术、自动进样器和泵，能够提高通量，改进分辨率在新奥尔良举行的PITTCON 2008展会上，珀金埃尔默公司推出了 275 HRes™ 系列高效液相色谱系统。此系统包括与 TotalChrom 软件集成在一起的全新的小颗粒/高分辨率色谱柱技术、自动进样器和传输泵，利用此系统，LC 用户可以在超高压范围使用小颗粒尺寸色谱柱技术增加色谱分析通量并提高分辨率。此系统的设计旨在对食品和饮料、环境、制药及材料检测市场的质量保证/质量控制 (QA/QC) 提供支持。“珀金埃尔默始终致力于不断改进我们的色谱系列产品”，珀金埃尔默生命与分析科学部色谱业务副总裁 Eric Ziegler 说道。“此专业系统完全满足了用户对高通量的需求，同时还能够提供更高的速度、分辨率和性能，是对我们液相色谱系列产品的有益补充。” Ziegler 表示，此系统中采用的全新 Brownlee™ HRes LC 色谱柱使用了新开发的小颗粒技术，能够获得高分辨率和快捷分离速度。“在不同的市场范畴内，对提高分辨率的需求日益增加。使用 275 系列 HRes LC 系统，客户有机会重新考虑实验室工作流程和工作效率”，Ziegler 进一步解释道。此系统还包括全新的 275 系列自动进样器，利用它可在关键的进样阶段更好地实现自动化和可再现性。全新的 275 系列二元微量泵支持新开发的小颗粒/高分辨率 LC 色谱柱。为了方便向此新技术过渡，此系统与珀金埃尔默的 TotalChrom 软件完全集成在一起并且可以通过它来进行控制，此系统还符合 21 CFR Part 11 的要求。有关详细信息，请访问:http://las.perkinelmer.com.cn/Catalog/default.htm?CategoryID=HPLCscreen.width-300)this.width=screen.width-300"

在 X 射线 CT 中，空间分辨率是重要的量化参数之一，它被定义为重建图像中两点之间可以区分的最小线性距离。因此，对空间分辨率的适当评估是至关重要的，特别是对于微纳 CT 这种高精度要求的成像系统。目前有两种最常见的空间分辨率评估方法：第一种是利用分辨率测试卡评估，其包含了可进行直接视觉评估的图案结构，在工艺上可制成二维和三维结构，适用于 X 射线断层和 X 射线 CT。测试卡的优势在于操作简单，可直观评估分辨率。但测试卡有一个明确定义的结构分布，只能评估测试卡上所列的图案尺寸；第二种是利用遵守 ASTM E1695-95 标准（Standard Test Method for Measurement of Computed Tomography (CT) System Performance）的斜边法或边缘瞬变法，光源扫描圆柱体或球体边缘，随后基于一套标准的数据处理方法计算空间分辨率。该方法需严格遵守测试标准，能够精确度量空间分辨率且不受测试卡的图案尺寸限制。1Resolution-spirit—微纳 CT 空间分辨率测试捷克CACTUX公司推出的 Resolution-spirit 是按照 ASTM E1695-95 标准制造的微纳 CT 模体，并由超精密三维测量机 nano-CMM 标定。Resolution-spirit 是一个高精度的红宝石球(Φ=0.5~5 mm)，粘在一根碳棒上，如下图(左)所示。为评估 XY 平面的分辨率，只需对模体成像，如下图(右)所示，其中绿点为计算的质量中心。用户只需对模体边缘像素的数据进行处理，即两个红色圈内的数据，以质量中心为准，获得不同半径下强度分布—边缘响应函数(ERF)。这里最大挑战是以非常高的精度确定质量中心，如果没有正确地定义中心，那么根据中心对像素进行分组将不准确，错误将导致边缘模糊。然后依次通过求导和傅里叶变换得到点扩散函数(PSF)和调制传递函数(MTF)，根据体素大小和 MTF 精确算出空间分辨率。最后类推到其他平面，可获得 CT 系统的三维空间分辨率。例如，布尔诺理工大学的研究人员利用传统 2D 分辨率测试卡和模体对 Heliscan 微米 CT 进行分辨率测试，如下表所示，模体能提供更精确的度量。2 Voxel-spirit—纳米 CT 体素校准在锥束 X 射线 CT 中，光源、样品和探测器之间的距离(SOD和SDD)影响重建体的视觉保真度和体素大小。除了这两个距离的估计存在偏差外，体素大小的真实值还受到 X 射线源漂移、CT 组件热膨胀、探测器和转台倾斜等因素的影响。因此，使用参考样品进行校准是防止在估计体素大小时出现误差的适当工具。对于视场在 10 mm及以上的锥束CT，体素尺寸校准已经很好地建立起来，并且有大量合适的参考样品可用。然而，对于小视场、高分辨率的微纳 CT 来说，很难找到合适的参考样品。CACTUX 的 Voxel-spirit 可以对 SOD 和 SDD 的误差进行精确校准，从而提高重建质量和体素大小的准确性，其适用于视场较小且锥束放大倍率接近 1 的微纳 CT。voxel-spirit由两个高精度的红宝石球(Φ=0.3 mm)组成，它们粘在一根碳棒上，球中心间距(约0.5 mm)并且经过 nano-CMM 严格度量，精度约 70 nm，如下图所示。首先保证两个球体完全在视场内，光源中心与探测器平面正交，两球中心连线平行于探测器平面。在对 Voxel-spirit成像后，可根据下图公式 1 计算体素大小。根据这种关系，在体素大小上的误差可能是由于 SOD 和 SDD 的不精确以及像素大小 p 的不精确造成的，而这些在实验中都是难以精确测量的。因此，在给定的 CT 测量条件下，利用图像中两球中心间距 lCT 和真实度量过的球中心间距 lref，可以获得体素修正因子 cf，算出修正后的体素大小，如下图公式 2、3。3 R1-shadow—微纳 CT 机械误差校正在微纳 CT、双能 CT 或 4D CT中，旋转转台同样会引入误差，即旋转中心的不对准、装台的不稳定或移动等等。尤其是针对颗粒、粉末样品，更容易受到这些机械误差的影响。CACTUX 的 R1-shadow 可以快速直观地纠正这些机械误差，并且提供配套的数据处理软件。R1-shadow是一个由 kapton 制成的样品基底(Φ=25~100 um)，在中心处有一根碳纤维增强棒(Φ=2.5~10 um)作为机械误差校准的参考基准点，如下图所示。在确保基准点获得较高对比度的图像后，即可开始 CT 测量。下图展示了胶囊颗粒在机械误差修正前后的图像，可以清晰看到修正后的红色区域伪影消除了。 点击获取产品详细信息：捷克 CactuX—致力于提升您微纳 CT 系统的成像质量和测试效率参考文献：1. Standard Test Method for Measurement of Computed Tomography (CT) System Performance: E 1695–95. 1st edition. United States: American Society for Testing and Materials, 2013.2. Bla&zcaron ek P, &Scaron rámek J, Zikmund T, et al. Voxel size and calibration for CT measurements with a small field of view. Proceedings of the 9th Conference on Industrial Computed Tomography (iCT 2019), Padova, Italy. 2019: 13-15.3. Zemek M, Bla&zcaron ek P, &Scaron rámek J, et al. Voxel size calibration for high-resolution CT. 10th Conf. on Industrial Computed Tomography. 2020: 1-8.4. Laznovsky J, Brinek A, Salplachta J, et al. 3D spatial resolution evaluation for helical CT according to ASTM E1695–95. 10th Conference on Industrial Computed Tomography. 2020.5. Laznovsky J, Brinek A, Salplachta J, et al. Comparison of two different approaches for Spatial Resolution determination for X-ray Computed Tomography with helical scanning trajectory.

美国劳伦斯伯克力国家实验室的科学家们开发了首个真彩(true-color)超高分辨率显微成像技术，为研究细胞结构和相关疾病提供了一个强大的工具。该技术将光谱与超高分辨率显微技术结合起来，在单分子成像时可以达到空前的光谱和空间分辨率。这一突破性成果发表在八月十七日的Nature Methods杂志上。　　“我们用这一技术检测每个分子在空间和光谱中的定位，根据其光谱判断分子的颜色，可以说这是首个真彩超高分辨率显微镜，”助理教授Ke Xu说，他将这一技术命名为SR-STORM(spectrally resolved stochastic optical reconstruction microscopy)。　　SR-STORM能够给出每个分子的光谱和空间信息，为人们打开了一扇新的大门。该技术不仅能够在细胞中成像多个组分，还能检测局部的化学环境(比如pH变化)。更重要的是，SR-STORM是一种高通量技术，能在大约五分钟内获得大量单分子的空间和光谱信息。　　SR-STORM是Xu博士基于自己之前的工作开发出来的，当时他在著名学者庄小威(Xiaowei Zhuang)实验室从事博士后研究。庄小威教授研发的超高分辨率成像技术STORM与诺奖得主Eric Betzig的成果不相伯仲，却和2014年的诺贝尔化学擦肩而过。　　现有的超高分辨率显微技术不能给出光谱信息，这样的信息对于理解分子行为是很有帮助的，而且能够对多个靶标实现高质量的多色成像。Xu博士和同事们经过深入探索，终于解决了这一难题。他们用发射波长相近的14种染料对样本进行染色。尽管这些染料的光谱彼此重叠，但SR-STORM能够很好的将其区分开。研究人员还用四种染料对线粒体、微管等四个不同的亚细胞结构进行标记。研究显示，SR-STORM能够根据分子的光谱轻松分辨不同的颜色，每个亚细胞结构都能鲜明的呈现出来。　　“我们以大约10nm的高分辨率，成像了细胞内四个生物学组分的空间互作，”Xu说。“目前这一技术主要用于基础研究和细胞生物学领域，我们希望日后也能将其用于医疗。研究者们可以在SR-STORM的帮助下观察细胞结构的建立，以及它们在疾病中发生的变化。”　　“细胞骨架包括一系列相互作用的亚细胞结构和蛋白，这一技术可以通过空前的颜色通道和空间分辨率，揭示不同靶标之间的互作。”　　Xu博士正在尝试进一步改良这一技术，使它能够用于常规显微系统。他也在开发合适的染料和探针，在纳米尺度上监控细胞内局部环境的变化，比如pH值。　　原文链接：Ultrahigh-throughput single-molecule spectroscopy and spectrally resolved super-resolution microscopy

超高分辨率让“不可能”变为“可能”!史晓磊Isotope Abundance同位素丰度，是指自然界中存在的某一元素的各种同位素的相对含量（以原子百分计）。如1H的同位素丰度为99.985%，2H为0.015%。可用于追踪物质的运行和变化规律，借助同位素原子以研究有机反应历程的方法，称之为同位素示踪法。因其所引用的同位素标记化合物的化学量是极微量的，不会对体内生理过程产生影响，获得的分析结果符合生理条件，在代谢组学研究中被广泛应用。想在不受13C干扰的条件下去测量低丰度的2H示踪以用于代谢研究，是几乎不可能的，由于来自四极杆质谱的M+1质量同位素13C丰度很高，约为 18%，严重干扰了测定2H的标记示踪[1]。但实际上，2H(0.015%)的低自然丰度使得示踪剂剂量在理论上小于0.5%是可能的[2]，这需要极高分辨率的质谱才能实现完全的基线分离，而Orbitrap Exploris GC 240出现之后，凭借其240000的超高分辨率，让以往在代谢研究中不可能实现的难题变为可能。今天为大家分享一篇美国德克萨斯大学西南医学中心的研究人员利用Orbitrap Exploris GC 240分析棕榈酸中的2H同位素示踪剂的应用。图1.棕榈酸酯C16H31O2的质量同位素分布摘要新生脂肪生成(De novo lipogenesis, DNL)是由碳水化合物等非脂质营养物质合成的脂肪酸，是长期储存热量和维持细胞膜的主要营养物质[3]。监测DNL在细胞器、细胞、组织活检、小鼠模型和人类等环境中的功能，将有助于发现新的分子生理学和许多不同疾病的潜在干预措施。DNL通量通常通过氘水(2H2O)给药后2H掺入脂肪酸来测量。本文利用GC-Orbitrap解析2H和13C脂肪酸质同位素，允许DNL定量使用较低的2H2O剂量和较短的实验周期。NewOrbitrap Exploris™ GC 240科研利器，引领潮流图2. 稳定同位素2H2O是测定DNL的基础 图3.EI模式下的棕榈酸甲酯的质谱图图4.NCI模式下的棕榈酸五氟苯酯质谱图 通过比较棕榈酸甲酯在EI模式和五氟溴代苯衍生棕榈酸酯在NCI模式下的质谱图，NCI测定五氟苯酯产生了未破碎的棕榈酸盐离子(C16H31O2，精确分子量为255.2324)，比EI检测甲酯的效率和灵敏度高1000倍(见图3和图4)。 图5. 采用不同条件验证2H在棕榈酸中的示踪标记 针对不同AGC（自动增益控制）目标的靶向选择离子监测(Target-SIM)(2*104, 2*105和3*106)，2H1和13C1的M + 1两种方法都能很好地分辨。而但全扫描数据为易受离子损失，特别是在AGC目标值高的情况下，容易产生空间电荷效应。同时，准确度高(94-107%)，精度高(变异系数10%)[5-6]，Target-SIM在定量时是更为合适的采集模式。 图6.模拟人体水富集到0.3% 2H2O时棕榈酸质量富集作为DNL的函数研究棕榈酸酯13C1和2H1 (M + 1)质量位移需要用165,000的最小分辨率进行分辨，以往用傅立叶变换离子回旋共振质谱法（FT-ICR-MS）可以实现，但扫描时间长，并需要超导磁体[7]，不易实现。当GC-Orbitrap商业化之后，成为很多代谢组学实验室进行分辨13C和2H的首选。为了确定这种方法是否比单位分辨率的质谱更有优势，模拟了超高分辨率的质谱0-10%的DNL分数范围和0.3%的体内水富集。结果证明，GC-Orbitrap为检测极低前体和产物富集的DNL提供了主要的理论优势。 图7. 在其他脂肪酸中也可以检测到2H富集 结论 本文介绍了一种HR-Orbitrap-GC-MS方法，该方法解决了其他同位素的2H质谱富集，来研究DNL生成。在棕榈酸中直接检测2H质量同位素可防止在低富集时与13C自然丰度的卷积，实验证明，DNL可以在1小时内检测完成，且2H2O的剂量比以前更低[8]。Orbitrap Exploris GC 240因其超高的24万分辨率解决了代谢组学研究中一直以来的难题，成为代谢组学研究中不可或缺的利器。 参考文献：1. Brunengraber, H., Kelleher, J. K. & Des Rosiers, C. Applications of mass isotopomer analysis to nutritional research. Annu. Rev. Nutr. 17, 559 (1997). 2. Diraison, F., Pachiaudi, C. & Beylot, M. In vivo measurement of plasma cholesterol and fatty acid synthesis with deuterated water: 3. Wallace, M. & Metallo, C. M. Tracing insights into de novo lipogenesis in liver and adipose tissues. Semin Cell Dev Biol, https://doi.org/10.1016/j.semcdb.2020.02.012 (2020). 4. Murphy, E. J. Stable isotope methods for the in vivo measurement of lipogenesis and triglyceride metabolism. J. Anim. Sci. 84, E94–E104 (2006). 5. Su, X., Lu, W. & Rabinowitz, J. D. Metabolite spectral accuracy on orbitraps.Anal. Chem. 89, 5940–5948 (2017). 6. Fernandez, C. A., Des Rosiers, C., Previs, S. F., David, F. & Brunengraber, H.Correction of 13C mass isotopomer distributions for natural stable isotope abundance. J. Mass Spectrom. 31, 255–262 (1996). determination of the average number of deuterium atoms incorporated. Metabolism 45,817–821 (1996). 7. Herath, K. B. et al. Determination of low levels of 2H-labeling using highresolution mass spectrometry: application in studies of lipid flux and beyond.Rapid Commun. Mass Spectrom. 28, 239–244 (2014). 8. Previs, S. F. et al. Using [(2)H]water to quantify the contribution of de novo palmitate synthesis in plasma: enabling back-to-back studies. Am. J. Physiol.Endocrinol. Metab. 315, E63–E71 (2018).

应用优势：与常规GPC分析相比，可大大缩短肝素钠的分析时间可对肝素钠进行快速监测，从而能提早发现产品开发和质控过程中的变化肝素作为抗凝血剂，从1935年正式应用于临床治疗至今已有近80年历史。目前，肝素仍是世界上最有效和临床用量最大的抗凝血药物，并被世界多个国收入国家《药典》。在中国，肝素类药品不仅得以顺利进入国家基本医保目录，而且还是为数不多的价格上调药品。此外，肝素还是惟一进入我国国家基本药物目录的抗凝血药。源于其下游产品肝素类药物市场迅速扩容并保持高速增长的趋势，国际市场对肝素原料药的需求十分强劲。尤其是质量符合美国FDA认证或欧盟CEP认证标准的肝素原料药产品，已呈现供不应求的局面，成为全球下游生产企业争夺的重要资源。近期肝素安全事件曝光之后，肝素钠原料药的质量得到全球肝素类药物企业的高度关注，市场监管力度一浪高过一浪。肝素原料药检测标准的提高、成本的提高及在环保达标和节能减排方面越来越严的要求让企业倍感压力。本应用纪要比较了基于ACQUITY APC超高效聚合物色谱系统的分离与基于常规GPC的分离，并应用了配有亚3 μm杂化颗粒技术色谱柱的低扩散系统，用以加快分析速度，提高分辨率。这些技术的综合使用能够更稳定、更精确、更快速地测定肝素的分子量参数。肝素钠分析：生产力的突破沃特世解决方案ACQUITY APC超高效聚合物色谱系统ACQUITY APC AQ色谱柱带GPC选项的Empower 3色谱数据软件实验条件：ACQUITY APC系统条件：检测器： ACQUITY RI（示差检测器）RI流通池： 35 ℃流动相： 100 mMol的醋酸铵水溶液流速： 0.6 mL/min色谱柱： ACQUITY APC AQ 200埃柱，4.6×150 mm柱温： 35 ℃样品稀释剂： 醋酸铵水溶液进样量： 10 μL数据处理软件：Empower 3色谱数据软件样品：5 mg/mL肝素钠结果与讨论：沃特世ACQUITY APC（Advanced Polymer Chromatography）超高效聚合物色谱系统是基于体积排阻色谱分离基本原理的突破性技术产品，以前所未有的分析速度为您提供更详尽的聚合物材料信息。ACQUITY APC可缩短运行时间，有助于对肝素原料和生产工艺过程进行监测，从而促进肝素钠的开发并加快产品上市进程。与常规GPC系统相比，ACQUITY APC系统的扩散度更低，因此产生的峰展宽就更少。此外，低扩散性APC系统与支持更高流速和背压的稳定亚3 μm APC色谱柱技术相结合，能提高对肝素样品的分辨率，并使分析时间缩短至原来的1/7。

p　　北京大学陈良怡团队联合华中科技大学谭山团队发明了一种超灵敏结构光超高分辨率显微镜 -- 海森结构光显微镜 （Hessian SIM）。此项成果近日以全文形式在线发表于Nature Biotechnology （影响因子41.67），论文题目为“Fast， long-term， super-resolution imaging with Hessian structured illumination microscopy”。/pp style="text-align: center "img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201804/insimg/9733f7f5-ffa5-4262-9ca6-a6f439e01233.jpg" title="1.png"//pp style="text-align: center "图1：海森结构光显微镜解析囊泡融合孔道形成全过程。上图：实际的动态过程解析；下图：由实验结果得到的囊泡融合的四个中间态。/pp　　在每秒钟得到188张超高分辨率图像时，海森结构光显微镜的空间分辨率可以达到85纳米，能够分辨单根头发的1/600到1/800大小结构，而所需要的光照度小于常用的共聚焦显微镜光照度三个数量级。由于极低的光漂白以及光毒性，实现了100 Hz超高分辨率成像下连续采样10分钟得到18万张超高分辨率图像，或者是在1 Hz超高分辨率成像下连续1小时超高分辨率成像基本无光漂白。/pp　　与获得2014年Nobel化学奖的受激辐射损耗超高分辨率显微镜（STED）相比，海森结构光显微成像以极高的时间分辨率、极低的光毒性在活细胞超高分辨率成像方面占显著优势。例如，在观察细胞内囊泡与细胞质膜融合释放神经递质和激素过程中，海森结构光显微镜与STED显微镜（分辨率60纳米，每秒5幅左右； 巫凌钢实验室2018年3月Cell上线的文章）都可以观察到囊泡融合形成的孔道；但是，海森结构光显微镜还解析出囊泡融合时四个不同中间态，包括囊泡打开3纳米小孔、囊泡塌陷、融合孔道维持和最后的囊泡与细胞质膜完全融合的过程，真正可视化膜孔道形成的全过程（图1）。/pp style="text-align: center "img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201804/insimg/a8d935d2-2f07-4d3a-bfc4-18cf43e9c1ae.jpg" title="2.png"//pp style="text-align: center "图2、海森结构光显微镜显微镜下观察到COS-7细胞中的内质网和线粒体相互作用的动态过程，蓝色的线粒体用MitoTracker Green标记，可以清楚辨识内嵴结构；品红色的是用SEC61-mCherry标记内质网结构。/pp　　此项突破一方面是基于硬件自主设计的新偏振旋转玻片阵列、高精度的时序控制程序以及高数值孔径物镜的应用；另一方面是创新的重构算法，借鉴了人眼区分信号和噪声的机制，首次提出将生物样本在多维时空上连续、而噪声是完全随机分布的先验知识用于构建海森矩阵，指导超高分辨率荧光图像的重建。/pp　　超灵敏海森结构光显微镜是目前活细胞成像时间最长、时间分辨率最高的超高分辨率显微镜，适用于各种细胞、不同探针的荧光成像 – 可以说，所有应用扫描共聚焦显微镜的场景都可以使用海森结构光显微镜，因而具有广泛的应用前景。/pp　　该论文的第一作者为北京大学黄小帅、华中科技大学范骏超和北京大学李柳菊，通讯作者为北京大学陈良怡、华中科技大学谭山。工作得到了国家自然科学基金委重大仪器研制基金、重大研究计划专项、科技部国家重点研发计划基金、重点基础研究发展计划和北京市自然科学基金委重点项目的资助。陈良怡、黄小帅等主创成员参与了早先发表于Nature Methods的高分辨率微型化双光子显微镜的研制，荣获2017年中国十大科学进展等荣誉。未来，他们将进一步实现微型化海森结构光的显微在体成像。/p

目前，基于超快激光的非线性拉曼光谱技术已经越来越成熟了；而且，随着纳米科技的迅猛发展，使得基于纳米结构的表面增强拉曼光谱(SERS)和针尖增强拉曼光谱(TERS)在超高灵敏度检测方面取得了长足的进步，推动拉曼光谱成为迄今很少的、可达到单分子检测水平的技术。　　“港东科技”自二十世纪九十年代初就开始研发“拉曼光谱”系列产品。自主研发、生产、制造的LRS-2型和LRS-3型激光拉曼光谱仪以结构简单、便于调整和测量、灵敏度高、稳定性好等特点分别在1998年和2000年世界银行贷款发展项目中二度中标。该仪器现已大量应用于科研院所、高等院校的物理实验室和化学实验室，作为测量和教学拉曼光谱和荧光光谱的实验仪器。LRS-2/3激光拉曼光谱仪　　仪器特点：　　自动记录拉曼、荧光光谱 　　高分辨率，低杂散光单色系统 　　高灵敏度、低噪音单光子计数器做接收系统 　　大功率半导体激光器作为激发光源 　　配有稳定性好、精度高的外光路系统 　　多种附件可选，适用于液体、固体样品的分析 　　配有用于减小瑞利散射的陷波滤波器。　　2008年，港东科技自主研发的，同时也是国内首款LRS-5型微区激光拉曼光谱仪(将具有自主知识产权的高分辨激光共焦显微镜作为收集拉曼散射光系统，长焦长高分辨平场成像输出的单色器，结合自行研制的计算机软件编程等相关实验技术相整合，构建具有自主知识产权的新型高分辨的激光共聚焦显微光谱探测联用设备-激光共焦拉曼光谱仪)研制成功。　　这是一项将拉曼光谱分析技术与显微分析技术结合起来的应用技术。微区激光拉曼可将激发光的光斑聚焦到微米量级，从而可以在不受周围环境干扰的情况下，精确获得所检测样品的有关化学成分、晶体结构、分子相互作用以及分子取向等各种拉曼光谱信息。　　我们对激光共焦拉曼显微镜的装置设计与技术参数，几何尺寸与配置，显微镜的白光成像照明系统和偏振调光图像处理技术进行了细致的研讨与实际效果的理论计算，为该显微镜的结构定型、技术指标奠定了基础。最终研制成功具有自主知识产权的高性能激光共聚焦拉曼显微镜系统。LRS-5 微区激光拉曼光谱仪　　仪器特点：　　操作简单，友好的人机对话界面 　　高分辨率、高稳定性和低杂散光的非对称800mm焦距平场光谱仪系统 　　接受系统采用具有高灵敏度、低噪音的面阵CCD接收器 　　外光路系统采用显微镜作为激光会聚和拉曼光收集系统，具有很高的效率和稳定性 　　配有用于减小瑞利散射的陷波滤波器。　　2012年至2016年，“港东科技”作为国内唯一一家研发、生产高分辨率长焦拉曼的企业受邀参加了由北京理工大学牵头，协同中国科学院物理研究所共同研发的“激光差动共焦成像与检测仪器研发及其应用研究”项目，该项目属于“国家重大科学仪器开发和应用专项”。在该项目中我司主要承担“拉曼光谱成像探测系统”的研发任务。普通激光束的直径通常为1.7mm左右，而显微激光拉曼光谱可以对被分析对象表面及其以下部分(透明或半透明材料)进行分层扫描，以获得较大范围内的信息，能够进行微区(小于0.2µm)分析，很好地满足了对复合材料中不同组元结构分析的要求。　　对于“拉曼光谱”在未来的发展，那就必须先从“拉曼光谱”与它的姊妹谱——红外光谱的比较说起。　　相似之处：“拉曼光谱”与“红外光谱”一样，都能提供分子振动频率的信息，对于一个给定的化学键，其红外吸收频率与拉曼位移相等，均代表第一振动能级的能量。　　不同之处：　　1.红外光谱的入射光及检测光都是红外光，而拉曼光谱的入射光和散射光大多是可见光。拉曼效应为散射过程，拉曼光谱为散射光谱，红外光谱对应的是与某一吸收频率能量相等的(红外)光子被分子吸收，因而红外光谱是吸收光谱。　　2.从分子结构性质变化的角度看，拉曼散射过程来源于分子的诱导偶极矩，与分子极化率的变化相关。通常非极性分子及基团的振动导致分子变形，引起极化率的变化，是拉曼活性的。红外吸收过程与分子永久偶极矩的变化相关，一般极性分子及基团的振动引起偶极矩的变化，故通常是红外活性的。　　3.红外光谱制样复杂，拉曼光谱勿需制样，可直接测试水溶液。　　姊妹谱的联系：　　1、凡有对称中心的分子，若有拉曼活性，则红外是非活性的 若红外活性，则拉曼是非活性的。　　2、凡无对称中心的分子，大多数的分子，红外和拉曼都活性。　　3、少数分子的振动，既非拉曼活性，又非红外活性。(如：乙烯分子的扭曲振动，在红外和拉曼光谱中均观察不到该振动的谱带。　　综上所述，拉曼光谱相对于红外光谱，其优势之一体现在用拉曼研究水溶液中比较方便，而生命科学的许多研究往往需要的水溶液环境。共振拉曼、表面增强拉曼和非线性拉曼光谱以及它们的联用将成为生命科学前沿领域具有重要价值的研究方法，因为21世纪是生命科学的世纪(如：临床医疗、癌症的检测与诊断等)，我们以为也是纳米技术和激光技术的世纪，因此我们觉得拉曼光谱的发展和应用是大有可为的。　　但就目前来讲，“拉曼光谱”还存在一定的不足，例如：　　1、拉曼散射面积 　　2、不同振动峰重叠和拉曼散射强度容易受光学系统参数等因素的影响 　　3、荧光散射的干扰 　　4、在进行分析时，常出现曲线的非线性的问题 　　5、任何一个物质的引入都会对被测体体系带来某种程度的污染，这等于引入了一些误差的可能性，会对分析的结果产生一定的影响。　　当然我们也相信，随着相关技术领域的不断进步和提高，这些问题在不远的将来都能得到完善的解决。届时“拉曼光谱”的应用领域也将更为广泛。　　“拉曼光谱”揭示了丰富的化学键信息，检测对象从单质到化合物，从纯净物到混合物，从无机物到有机物，从固体到液体甚至到气体。随着技术的进一步发展，便携式拉曼光谱仪的发展趋势将呈现多样化。更加小型化、智能化、应用更加细分(分析化学、安全检查、生物医药、机场安检、爆炸物分析等)，将成为发展的主流，而性能却不会随着小型化而缩水。同时，随着应用领域的扩大，适应恶劣的工作环境(高温、高压)也将是发展方向之一。而价格合理化将是便携式拉曼光谱仪发展的终极目标。（内容来源：港东科技）

近日，记者从中科院化学所获悉，该所胶体、界面与化学热力学重点实验室李峻柏课题组利用其开发的“超高分辨率荧光显微镜”，观测到生物矿化过程中参与结晶的蛋白质分布信息。论文在《德国应用化学》上刊发。　　“超高分辨率荧光显微镜”可以超越远场光学显微镜的分辨率极限，直接检测到几十纳米的精细结构。而与能达到相同或更高分辨率的X光显微镜、各类电子显微镜及原子力显微镜相比，超高分辨荧光成像能在常温常压和基本不损伤生物样本活性的条件下，获得其纳米尺度的图像信息。　　研究人员介绍，“超高分辨率荧光显微镜”又称为随机光学重建显微镜(STORM)，可达到或好于50纳米分辨率。在前期研究中，李峻柏课题组在超高分辨图像采集和数据分析方面发展了实时单分子定位的程序包SNSMIL，该程序包可广泛应用于高背景成像的数据分析。　　他们利用STORM观测到方解石中生物矿化过程中参与结晶的蛋白质分布信息，为研究蛋白质诱导生物矿化的机理提供了数据。

近日，中国科学院空天信息创新研究院遥感科学国家重点实验室研究员倪文俭带领的森林遥感团队，在利用超高分辨率光学遥感立体观测数据提取森林三维结构研究方面取得重要进展。现有研究认为，光学多角度立体观测数据在林区不具备穿透能力，故在缺乏林下地形数据时，无法独立进行森林垂直结构参数的直接测量，特别是在浓密山地林区。本研究发现：分辨率优于0.2 米的光学立体观测数据能够对单株树木的冠顶结构进行精细刻画；受树木异速生长方程启发，创建了“生长关系约束的林下地形逼近算法”(AGAR)，打破了传统的认知局限，实现了仅利用光学立体观测数据对森林垂直结构的直接测量。相关研究成果发表在Remote Sensing of Environment上。 　　森林作为重要的陆地生态系统碳库之一，准确估算其碳储量是遥感研究的主要方向，可服务于我国的“双碳”战略和地球系统碳循环过程研究。过去，国内外开展了基于遥感影像光谱或微波散射强度等“二维”特征的森林碳储量估算原理与方法研究，而“地形影响”“遥感信号饱和”仍是难以逾越的两大科学难题。因此，国际学界逐渐转向以卫星测距技术为基础的“三维”遥感，包括以激光测距为基础的激光雷达遥感、以微波测距为基础的合成孔径雷达干涉以及以视觉测距为基础的光学多角度立体观测。美国科学家致力于发展具备冠层穿透能力的星载激光雷达，包括早期搭载在航天飞机上的激光高度计SLA01和SLA02、2003年至2009年运行的ICESat/GLAS卫星、2018年发射的ICESat-2卫星以及2019年放置在国际空间站上的GEDI。欧洲科研人员则积极发展穿透能力较强的L波段Tandem-L和P波段BIOMASS合成孔径雷达干涉卫星，并计划2024年发射。相较于激光雷达和合成孔径雷达干涉，光学多角度立体遥感具有图像直观形象的显著优势但受穿透能力的限制，目前主要用于地表高程的测量，且需要依靠其他数据源提供的林下地形才能对森林垂直结构进行测量，应用价值和场景受限。 　　近年来，中国在光学多角度立体遥感方面快速发展，先后发射了资源三号、高分七号、天绘系列以及其他商业遥感卫星，同时影像空间分辨率逐步提高。能否利用不断提高的空间分辨率来突破其穿透能力弱的限制，进而最大程度地发挥超高分辨率光学多角度立体遥感数据的应用价值，既是国际前沿科学问题又是中国遥感科研人员亟需回答的问题。 　　森林遥感团队意识到超高分辨率光学多角度立体观测遥感数据的独特价值，自2014年对无人机立体观测数据在森林结构参数测量中的应用进行了持续研究，并于2018年开展了大兴安岭林区大范围无人机采样观测实验，揭示了观测角度与影像分辨率的耦合规律，证实了森林高度信息对叶面积指数估算的补充作用，研发了针对落叶林区森林高度提取的有叶季和无叶季影像协同解决方案，突破了光谱与三维几何特征协同的散发枯立木识别技术、单木识别与分割技术、以背景识别为基础的高精度森林覆盖度提取技术。在上述数据与技术积累的基础上，该团队创建了“生长关系约束的林下地形逼近算法”(AGAR)，实现了复杂地形条件下森林高度的直接提取。该成果证实了无需额外林下地形数据的支持，AGAR算法仅利用超高分辨率光学多角度立体观测数据即可实现森林高度提取。 　　尽管AGAR算法使用无人机获取的立体观测影像开展研究，且算法的具体技术细节需要进一步测试完善，但随着0.1米卫星光学遥感数据时代的到来，该方法将开启超高分辨光学立体遥感影像森林三维遥感新时代。图1.生长关系约束的林下地形逼近算法(AGAR)的核心思路图2.典型地形条件下森林高度提取的效果。(a)-(c)为光学多角度立体观测数据获取的数字表面模型(DSM)；(d)-(f)为光学多角度立体观测数据通过林窗插值提取的森林高度，由于浓密林区林窗较少，导致树高被严重低估或者地形特征去除不彻底；(g)-(i)为利用AGAR提取的森林高度。(a)区域覆盖山脊，(b)区域覆盖山谷；(c)区域覆盖从山脚到山顶的斜坡。

近日，精密测量院毛伟建研究团队在高分辨率油气勘探地震保幅成像方面取得一系列新进展。团队借助人工智能、散射波场和点扩散函数等多学科理论和方法，开展交叉学科研究，创新提出高精度人工智能速度建模、逆散射保幅成像条件以及点扩散函数深度域反演技术，为解决长期以来困扰深层复杂地质条件下的油储特征反演和预测难题给出了新的思路。该系列研究成果2022年在国际著名地学Q1区学术期刊上发表5篇论文，其中2篇发表在《IEEE地球科学和遥感汇刊》 (《IEEE TGRS》), 3篇发表在《IEEE 地球科学和遥感快报》(《IEEE GRSL》)上。准确的速度模型在高精度地震成像中起着关键作用。作为一个非线性逆问题，传统速度建模方法由于数据中缺少低频分量、计算效率低等问题在实际地震勘探中受到限制。团队借助深度学习方法逼近不同数据域之间的非线性映射函数的强大能力，来解决原始地震数据高效速度建模问题。在这项工作中，该团队开发了一种数据驱动反演方法，该方法基于具有编码器-解码器结构的多尺度深度卷积神经网络，以直接从原始地震数据中解决具有不同尺度速度模型的反演问题。通过设计压缩矩阵压缩输入数据，网络可以获得任意尺度的预测。三种不同尺度的测试数据的反演结果随着地震勘探进入更精细的岩性成像阶段(如：深水、深层、复杂储存、非常规储存等)，如何正确理解地震成像结果，成为极为关键的问题。传统的地震成像以求取地震反射率为目标，在深层成像阶段会出现成像数值不准确等问题。该团队以地震波散射理论为基础，提出各向异性逆散射反演成像条件，并将此成像条件用于逆时偏移。该方法能够有效计算地层参数扰动值，为超深层保幅地震成像提供了有效的方法。各向同性逆散射反演成像(左)与各向异性逆散射反演成像(右)的对比地震勘探经历了从二维走向三维，从叠后走向叠前，从时间域成像走向深度域成像的发展过程。然而，目前在工业界，仍缺乏在深度域直接进行反演的有效技术。现有方法无法满足精细储层解释的需要并计算量很大。针对上述问题，该团队发展了一种基于点扩散函数的深度域最小二乘反演方法，避免了“时深转换”的过程，大幅提高了反演效率。该方法可以有效地均衡照明，清晰刻画断层面，明显提升空间分辨率。并且计算量只有传统数据域最小二乘方法的1/10。标准高斯束偏移及其波数谱(左)与PSF处理结果及波数谱(右)的对比该系列研究分别以“Deep Learning Based Seismic Variable-size Velocity Model Building”、“Amplitude-Preserving Imaging Condition for Scattering-Based RTM in Acoustic VTI Media”、“Elastic Least-Squares Gaussian Beam Imaging With Point Spread Functions”为题发表在《IEEE Geoscience and Remote Sensing Letters》上；以“Multi-Parameter True-Amplitude Generalized Radon Transform Inversion for Acoustic Transversely Isotropic Media With a Vertical Symmetry Axis”、“Born Scattering Integral, Scattering Radiation Pattern, and Generalized Radon Transform Inversion in Acoustic Tilted Transversely Isotropic Media” 为题发表在《IEEE Transaction on Geoscience and Remote Sensing》上 五篇论文的第一作者分别是博士研究生杜蒙、孙史磊、段伟国，副研究员欧阳威，博士后梁全，通讯作者均为毛伟建，博士后石星辰和程时俊是合作作者。上述研究由国家自然科学基金重点和面上项目、中石油科技重大专项和中石油科学研究与技术开发项目联合资助。

p　　近期，中国科学院深圳先进技术研究院劳特伯医学成像研究中心郑海荣团队在高分辨率超声成像研究中取得一系列进展。/pp　　高分辨率超声主要采用大于15MHz的超声频率进行成像，可获得几十微米量级的成像分辨率。在临床中主要应用于浅表、内窥和眼科等方面的疾病检测。高频超声换能器是成像系统的关键部件，主要基于压电材料进行设计加工。但传统压电材料介电常数较小(夹持介电常数小于1500)，造成压电阵元尺寸小的高频换能器的电阻抗会大幅度提升，进而导致换能器成像性能不佳。郑海荣团队邱维宝课题组利用新开发的一种高介电常数、高压电性能的改性PMN-PT陶瓷(夹持介电常数为3500)设计制备了性能优异的40MHz高频超声换能器(阵元尺寸可为0.4mm× 0.4mm)，使得制备的高频超声换能器的电阻抗大幅度降低，更容易与电子系统的阻抗相匹配，实现较高的成像灵敏度(-13dB)。此外，该研究中设计制备的超声换能器具有较高的成像带宽(80%)和信噪比，并在高分辨率医学成像领域中展现出应用潜力。相关研究成果已被IEEE Trans Ultrason Ferroelectr Freq Control接收。/pp　　邱维宝课题组在高分辨率超声成像方法和电子系统方面也取得了研究进展。高频超声获得高分辨率医学图像存在衰减系数增大导致成像穿透深度降低的问题。据此，课题组提出了基于编码超声的高频超声成像方法，在激励换能器时，采用带有一定编码的超声信号进行激励，回波接收时通过算法解码恢复出高分辨率图像，使得在成像中既可以维持图像的分辨率，也可以提升超声成像的穿透深度。该技术在浅表和内窥等成像中具有应用潜力。相关研究成果发表于IEEE Trans Biomed Eng。/pp　　在进行高分辨率超声成像时，电子系统需要具有较高的数据采样率，以获取超声回波的原始数据信息，因此需要大幅度提高模数转换器(ADC)的采样频率。然而，传统超声成像系统的ADC采样频率通常为60MHz或者更低，不能满足大于30MHz的高频成像需要。据此，邱维宝课题组提出了一种延迟激励方法，通过将激励波束的时序进行规律性调整，在多次发送后获取多个数据图像，通过延迟复合处理，即可以获得高采样率的图像。该方法有望使临床用的超声设备，在不改动主要电子器件模数转换器的前提下，实现高分辨率超声成像的功能。相关研究成果发表于IEEE Trans Biomed Eng。/pp　　高分辨率超声成像技术在内窥镜领域具有重要的应用潜力，邱维宝课题组在推进血管内超声成像技术的同时，也在尝试新型内窥成像技术。胶囊内窥镜(capsule endoscopy)是一种胶囊形状的内窥镜，它是用来检查人体肠胃的医疗仪器。胶囊内窥镜体积仅有普通胶囊大小，消除了传统检查耐受性差的缺点，能够拍摄食道、胃、小肠、大肠等，从而完成对人体整个消化道的检查。然而目前该技术是采用光学成像方法，仅能观测组织表层的病变信息，不能获得深层次的组织情况。由于超声成像技术的穿透性较好，因此课题组拟尝试进行超声胶囊内窥镜的设计验证，提出了基于高分辨率超声的内窥成像控制方案，采用40MHz的超声频率获得了小于60微米的肠道组织成像分辨率。相关研究成果发表于IEEE Trans Med Imaging。/pp　　以上研究得到了国家自然科学基金、中科院前沿科学重点研究计划、广东省杰出青年基金、深圳市孔雀计划等项目的资助，以及美国南加州大学、宾夕法尼亚州立大学，英国格拉斯哥大学，东北大学等高校的支持与合作。/pp　　论文题目：High Performance Ultrasound Needle Transducer Based on Modified PMN-PT Ceramic with Ultrahigh Clamped Dielectric Permittivity/pp style="text-align: center "img title="01.png" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201712/insimg/76653693-b0cd-480d-ab1c-d835a6a2f035.jpg"//pp style="text-align: center "strong图1.(a)高频超声换能器技术参数对比 (b)高频超声换能器结构示意图和实物图 (c)成像性能测试图/strong/pp style="text-align: center "img title="02.png" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201712/insimg/c0246a6c-4345-4ee5-b1a2-fe74a5030a04.jpg"//pp style="text-align: center "strong图2.(a-c)编码成像原理示意图 (d)编码成像技术可以大幅度提高血管内超声成像的穿透深度/strong/pp style="text-align: center "img title="03.png" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201712/insimg/86bdbf66-cabb-484d-92d3-d2dc22d62b25.jpg"//pp style="text-align: center "strong图3.左：延迟激励成像原理示意图 右：眼睛组织超声成像图/strong/pp style="text-align: center "img title="04.png" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201712/insimg/90b38fc1-6ef0-4192-83b1-723cacb12d4c.jpg"//pp style="text-align: center "strong图4.(a-b)胶囊超声内窥镜设想方案示意图 (b)高分辨率肠道组织超声成像图/strong/pp /p

网络研讨会：高分辨率CT成像技术与应用时间：2016-09-08 14:00 注册方式打开以下链接并报名http://www.instrument.com.cn/webinar/meeting/meetingInsidePage/2104 讲座内容概要在过去的几十年中，显微成像技术取得了令人瞩目的发展，涌现出众多新的技术和设备，如光学显微镜，SEM/TEM， AFM等，将显微成像技术的分辨能力不断推向新的高度，从微米到纳米甚至是原子尺度。但是，所有这些技术都只是对样品表面形貌进行观测，对样品制备有严格的要求。而高分辨率CT成功的弥补了这一不足，可在无损的情况下对样品内部组分及三维结构进行精确表征。“高分辨CT技术及其应用”介绍了最新的x射线三维显微成像检测技术及其产品，该技术可对样品内部不同吸收系数的组分及微观结构进行三维高分辨率无损成像，在科研及工业领域有着广泛的应用，如石油地质，材料科学，先进制造等。欢迎各行各业对CT感兴趣的用户参与。

p　　中科院膜生物学国家重点实验室联合华中科技大学发明了一种超灵敏结构光超高分辨率显微镜-----海森结构光显微镜 （Hessian SIM)，实现了活细胞超快长时程超高分辨率成像，能辨清囊泡融合孔道和线粒体内嵴动态。在每秒钟得到188张超高分辨率图像时，海森结构光显微镜的空间分辨率可以达到85纳米，能够分辨单根头发的1/600到1/800大小结构，而所需要的光照度小于常用的共聚焦显微镜光照度三个数量级。同时，该显微镜也实现了细胞“能量工厂”线粒体的超快超分辨成像，首次在活细胞中解析线粒体融合、分裂时内嵴的活动，及线粒体内嵴自身的重组装过程，并能够观察内质网与线粒体发生相互作用时的动态变化。/pp　　与获得2014年Nobel化学奖的受激辐射损耗超高分辨率显微镜（STED）相比，其具有极高的时间分辨率、极低的光毒性，在活细胞超高分辨率成像方面优势显著。/pp style="text-align: center "img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201805/insimg/235ade60-4b77-42b8-bfd2-21c083b4ea5d.jpg" title="640-2.jpeg"//pp　　海森结构光显微镜解析囊泡融合孔道形成全过程。上图：实际的动态过程解析；下图：由实验结果得到的囊泡融合的四个中间态。/pp　　灵敏海森结构光超高分辨率显微镜的成功验证，一方面基于新偏振旋转玻片阵列、高精度的时序控制程序以及高数值孔径物镜等硬件的自主研制；另一方面是重构算法的创新，首次提出将生物样本在多维时空上连续，而噪声是完全随机分布的先验知识用于构建海森矩阵，指导超高分辨率荧光图像的重建。/pp　　超灵敏海森结构光显微镜适用于各种细胞、不同探针的荧光成像。可以说，所有应用点扫描共聚焦显微镜的场景都可以使用海森结构光显微镜，因而具有广泛的应用前景。/pp　　此项研究成果以题为“Fast, long-term, super-resolution imaging with Hessian structured illumination microscopy” 以全文形式于近日在线发表于《Nature Biotechnology》 上。/pp　　论文链接：https://www.nature.com/articles/nbt.4115/ppbr//p

微球透镜（SMAL）成像技术，突破传统光学显微镜光学衍射分辨率极限（200nm），将用户带入全新的显微镜时代。　　 微球成像专利技术提高了光的功率，横向分辨率可达50nm，SMAL物镜可放大到400x。　　 通过SMAL成像技术，用户能够得到超高分辨率图像并保留光学显微镜所有优势——快速、简单、无损、完整、真实颜色。我们致力于为所有人能获得超高分辨率图像，无需昂贵的设备和严格的使用环境也无需大量的样品，只需光源、透镜和相机。　　 定制软件算法将高分辨率的微球图像拼接在一起，机械台会将样品移动到镜头下方。使用户能够快速的得到全彩色和超高分辨率的大区域样品图像。创新点：微球透镜（SMAL）成像技术，突破传统光学显微镜光学衍射分辨率极限（200nm），将用户带入全新的显微镜时代。　　微球成像专利技术提高了光的功率，横向分辨率可达50nm，SMAL物镜可放大到400x。　　通过SMAL成像技术，用户能够得到超高分辨率图像并保留光学显微镜所有优势——快速、简单、无损、完整、真实颜色。我们致力于为所有人能获得超高分辨率图像，无需昂贵的设备和严格的使用环境也无需大量的样品，只需光源、透镜和相机。　　定制软件算法将高分辨率的微球图像拼接在一起，机械台会将样品移动到镜头下方。使用户能够快速的得到全彩色和超高分辨率的大区域样品图像。

荧光显微成像技术对人们理解神经科学起了非常关键的作用。而最近一些年出现的各种超分辨显微成像技术和专门的荧光探针能够以超过以往普通光学显微镜的分辨率直接观察神经元亚细胞结构和蛋白质排列。并以直观可视方式揭示了神经细胞骨架组成、分布、运动和膜蛋白信号传导、突触下结构和功能，以及神经元−胶质细胞相互作用。同时超高分辨显微成像技术（Super Resolution,SR,下文中出现SR均指超高分辨率显微成像技术）对于许多自身免疫和神经退行性疾病模型中的分子靶点研究也提供了全新的强大工具。今年春，Werner等科学家在美国化学学会会刊（ACS)上最新发表了一篇综述，比较详实系统介绍了超高分辨率显微技术在神经科学上的最新应用进展。我们在此文基础上进行了编译整理。因文章较长，我们将分三期陆续介绍。本期介绍第一部分。1. 背景介绍成像技术是推动生命科学几乎所有学科基础研究的核心平台。在神经科学领域，近几十年来，共聚焦显微镜技术已成为分析神经组织的标准荧光成像技术。激光扫描共聚焦显微镜对固定的神经元样本进行观察，在扫描水平上提供了三维和多色图像并使单个细胞达到树突结构的分辨率。作为补充，电子显微镜（EM）用于获取神经元和亚区室超微结构的信息，并用于大脑的连通性分析。EM非常适合于神经元突触和囊泡、细胞器和膜构象的结构分析。然而，由于靶向特异性标记方法的局限性，基于EM的复杂样品中蛋白质和特定电子密度特征的识别受到限制。为了进一步理解神经元功能，包括双光子显微镜在内的几种活体视频显微镜应用的发展使神经元细胞培养的活细胞成像、器官型切片培养和动物模型的活体成像成为可能。同时，新的荧光染料、功能探针和荧光蛋白以及光遗传学方法和光驱动（如笼状化合物）不仅可以表征神经元，还可以操纵神经元及其从单分子水平到整个神经系统的相互作用。然而，荧光显微图像中可见细节的水平，即图像分辨率，仍然受到衍射极限的限制。一个多世纪以来，由λ/2NA定义的阿贝衍射极限（λ为波长，NA为显微镜物镜的数值孔径）决定了光学显微镜的分辨率极限，限制了两个位置小于200纳米的细节分辨。在过去的二十年中，超分辨显微镜（SRM）已经发展成为一种非常有效的亚细胞水平荧光成像和分辨细胞器结构的研究手段。SRM现在可以提供远低于常规光学显微镜衍射极限的空间分辨率，从而能够深入了解神经元细胞和组织中蛋白质的空间结构和相互作用。本文综述了超分辨显微镜和荧光标记方法及其在神经科学中的成功应用。我们将首先详细介绍各种SRM方法的基本原理、新的功能型荧光探针和标记技术。接着，我们将回顾SRM如何有助于我们理解神经元亚细胞结构和功能以及神经元−胶质细胞相互作用。此外，我们将概述超分辨率成像方法如何帮助研究自身免疫和神经退行性疾病的病理生理学。最后，我们将介绍这些新的成像方法是如何应用于神经精神疾病相关的人类样本的分析。由于该领域持续快速发展，我们最多只能代表一份中期报告。进一步的创新和新的显微镜方法的发展将使人们对神经系统功能有更详细的了解。 2. 神经科学中的超分辨率成像方法2.1. 光学衍射极限及其对神经科学的影响人类大脑包含超过800亿个神经元，每个神经元由数千个突触连接。因此，它构成了复杂神经元网络。这些网络的主要组成部分，例如突触神经末梢，显示的空间维度接近于光学衍射极限分辨率∼200 nm。释放递质的突触活性区（突触前细胞基质的特化区）的直径通常约为300±150 nm。突触小泡作为递质运输和释放的关键元件，其尺寸平均小10倍，直径为40−50nm。这些递质被释放到宽度为20-50nm的突触间隙中−再结合突触后受体。由于衍射极限的尺寸限制，胞吐机制和跨突触信号在传统的光学显微镜下基本上是无法观测到的，因此需要用提高10倍分辨率的方法进一步研究。（图1）。图1. 兴奋性突触结构组成。左图为兴奋性突触的油画示意图，右图为左图的灰度图像，其中浅紫色圆圈为衍射极限光斑；玫红色圆圈为兴奋性突触囊泡，约40-50nm；绿色为突触后膜AMPA受体，尺寸小于10nm；黄色部分为突触间隙，约20-30nm。 此外，大量参与突触信号传导的不同的分子，位于极小的突触内，造成很高的分子分布密度，这对微观研究具有挑战性。例如，对于较小的突触，兴奋性突触可以包含数百个小泡，对于大型苔藓纤维束突触，可以包含数千个小泡，每个小泡包含多达1万到10万个递质分子。在这些囊泡中，约有10±5个与释放部位对接，释放的递质平均与0−20 个NMDA受体和0−200个AMPA受体结合，而这些突触后受体又被320±130个突触后PSD-95密度蛋白分子环绕。由于加速电子的波长要短得多，因此EM是唯一能够解析突触纳米级结构的方法。然而，虽然传统的EM产生的电子密度图像具有极好的超微结构分辨率，但需要进行固定和靶向特异性标记的制样方法在很大程度上限制了蛋白质识别和神经元追踪。荧光显微镜可以很容易地对蛋白质进行选择性标记，但是受制于可见光的衍射（400−700 nm）使生成的图像无法实现对纳米结构的分析。 2.2.绕开光学衍射极限的光学显微镜方法 20世纪后期，人们开发了新的策略，通过利用物理或化学手段来区分不同荧光团的发射或减少同一时间荧光分子的数量，以尽量绕过衍射极限。减少荧光团的点扩散函数（PSF）的重叠可以通过生成光图案在集合级别以确定性方式进行，或者通过减少同一时间荧光团的数量在单分子水平上以随机方式进行。在下文中，我们将从确定性集合方法开始介绍，该方法将激光扫描共聚焦显微镜（CLSM）的有效空间分辨率推到理论极限。2.2.1. 确定性集合超高分辨率成像方法（Deterministic Ensemble SR-Imaging Methods） CLSM用针孔探测器阵列替换单点探测器，空间分辨率可以提高√2倍。CLSM测量每个扫描位置探测器每个点的荧光信号。在应用适当的算法后，生成分辨率提升的图像。这些所谓的像素重分配方法包括图像扫描显微镜（ISM）、重扫描共聚焦（RSC）、光学光子重分配（OPRA）、AiryScan和即时结构照明显微镜（iSIM）。对于信号检测，使用了诸如CCD相机、光电倍增管阵列、单光子雪崩二极管阵列和六角光纤束等探测器阵列。结构照明显微镜（SIM）在光路中插入光栅，产生与样品干涉的相干光束，生成横向和轴向方向不同的新照明图案。然后可以使用傅里叶变换提取这种新照明图案的信息，从而在所有三维空间中实现空间频率分解和分辨率倍增。SIM对样品制备的要求最低，并且可使用所有常规荧光探针，这些探针具有最低的光稳定性，并且可以很容易地扩展到多色成像。然而，当记录三维或长时间成像时，强烈建议使用光稳定性更高的荧光团。此外，SIM使用更低的激发强度，因此是活细胞SR实验的理想选择。为了获得更高的分辨率，引入了通过图案化饱和或荧光激发或图案化耗损光开关染料的非线性SIM（NL-SIM）。然而对染料开关特性的苛刻要求限制了NL-SIM在常规生命科学实验中的适用性。非线性SIM单位时间内还需要采集更多的图像，因此实际上仅限于2D成像。另一方面，掠入射（GI）-SIM显示了高达每秒266帧的快速超分辨率成像以及100nm分辨率，揭示前所未有的细胞器动力学细节。结构照明的局限性在于其对波长的普遍依赖性、与其他SR成像技术相比的低分辨率以及对系统稳定校准的需要。最后，后处理需要进行先验质量检查以避免伪影,例如由于高背景信号或不充分标记产生的低对比度图像导致的人工蜂窝图案。通过受激发射耗损(STED)显微镜进行超分辨率成像是一种实现更高空间分辨率的成像方法。这里，高斯分布的激发激光束被中空的甜甜圈样的耗损激光束覆盖，使扫描点外围的荧光团返回基态，这导致纳米级焦点区的直径与耗损光束的强度成反比，耗损光束的强度直接转换为STED显微镜的分辨能力：上图公式中λ为波长，n为折射率，α为物镜的收集角，ISTED为STED光束的照射强度，IS为饱和强度。因此，可以通过改变损耗激光强度来调整分辨率，可定制设计分辨率达30−80nm 的显微镜。STED显微成像可通过连续或脉冲激光激发、门控检测。带有脉冲激光的STED显微镜会降低激发能量，从而减少实时成像中的光毒性效应。STED显微镜中的时间门控检测可以去除荧光团光子到达时间前的空间信息，并且可以在较低的平均功率下工作。商品化STED能提供用户友好的高分辨率成像，无需进一步的数据后处理。活体成像，例如活体树突棘动态成像已经很成熟，但快速动态成像仅限于小帧尺寸，因为它仍然是点扫描方法，高激光强度可能会导致光损伤。STED通过应用自适应照明方式Dymin和rescue技术，可以明显减少光损伤。在Dymin STED中，在共聚焦模式下扫描时确定最低可能的STED光束强度。根据样品的标记密度，这将使STED光束强度降低20到100倍。Rescue STED同样通过减少STED激光开放的区域，从而比普通STED减少光漂白接近8倍。STED的另一个限制是对荧光团光稳定性的依赖，因为在高激光强度下会发生明显的光漂白。这影响了动力学的研究和三维图像的获取。值得注意的是，最近通过使用荧光团标记的寡核苷酸（瞬时结合到连接靶蛋白结合探针的互补寡核苷酸）或非结合荧光团来进行细胞STED成像，从而绕过了STED光漂白问题。这两种方法中，基于DNA互补标记的STED成像和超分辨率阴影成像SUSHI分别通过荧光团标记的寡核苷酸和高浓度的非结合和自由扩散的荧光团不断交换来防止光漂白。SUSHI的方法已经成功地用于活体脑片中细胞外间隙和神经肽的结构解析及其动力学的STED成像。如果使用具有毫秒或更长寿命的两种稳定状态的可逆切换荧光团来代替标准荧光团，则STED强度可以显著降低。可逆饱和切换光学线性荧光转换方法（RESOLFT）已通过可逆可切换荧光蛋白（reFPs）实现，并成功应用于活体海马脑片树突棘的超分辨率成像。2.2.2. 随机单分子SR成像方法（Stochastic Single-Molecule SR-Imaging Methods）上述的确定性方法是通过改变激发模式或相位掩膜来暂时控制荧光发射达到超分辨成像，而基于单分子的定位SR显微镜则是随机地在时间上分离单个荧光团的发射。单分子定位显微镜（SMLM）基于单个荧光团的随机激活，使用配备高灵敏相机（EMCCD或sCMOS）的宽场荧光显微镜进行单分子检测，以及精确的位置测定。通过将理想PSF与实际测量的光子分布拟合来进行分子定位。只要信号来自单个发射区，且单个发射区之间的距离大于显微镜能分辨的最小距离，则通过收集更多光子和最小化噪声，定位的标准误差可以任意小。激活和定位过程重复多次，所有定位最终用于重建超分辨率图像。为了确保在成像的任何时候，只有稀疏的小荧光团以其活性荧光形式存在（开启状态），使用了光开关、光转换、光激活或自发闪烁的荧光团。由于定位精度和最终图像分辨率取决于每次检测到的光子数量，通常采用明亮且稳定的荧光团与1 kW/cm2的辐照强度相结合的方式。根据所使用的荧光团不同，SMLM可达到10−50 nm横向分辨率。光激活荧光蛋白（FPs），自2006年以来已用于光激活定位显微镜（PALM），例如在405 nm的激光照射下可从关闭状态不可逆地转换为打开状态的PA-GFP和PA-mCherry 以及可通过适当波长的激光照射从一种波长状态不可逆地转移到另一种波长状态的光转换FPs，例如MEO。此外，还成功地应用了诸如Dronpa之类的光开关FPs，其在不同激发波长的激光照射下可在非荧光和荧光状态之间可逆地切换。对于活细胞应用，使用荧光蛋白的PALM是首选方法。因为在理想情况下，每个感兴趣的蛋白质都可以用荧光蛋白进行计量标记。然而，荧光蛋白比有机染料表现出更低的光稳定性和光子计数，从而降低了定位精度，并且通常需要更长的采集时间。此外，对于PALM成像而言，融合蛋白通常会过度表达，这可能会导致不真实图像，而用转基因变体替代显示野生型表达和功能的自身蛋白仍然具有挑战性。对于细胞内源性蛋白质的标记，通常使用有机染料的免疫标记。SMLM适用的有机染料必须是光开关、光激活或自发闪烁的，以实现单个染料发射的时间分离，但化学计量标记要困难得多。有机染料通常表现出较高的光子计数和光稳定性，从而使定位精度达到5−10nm。花菁染料Cy5和Alexa Fluor 647可以在荧光开启状态（其典型寿命为10 ms）和非荧光关闭状态（寿命为几秒，利用光开关缓冲液，缓冲液包括PBS，10−100mM硫醇，如ß-巯基乙缅（MEA），酶促氧清除剂，可以有/没有激活染料）之间可逆切换，为随机光学重建显微镜（STORM）和直接型STORM（dSTORM）的发展铺平了道路。近年来，应用于（d）STORM的染料已大大扩展，除了菁染料外，还包括罗丹明和恶嗪染料。有趣的是，最近的研究表明，即使是多个标记的抗体在光开关缓冲液中也呈现出类似于单发射的表现，因此适用于dSTORM实验。光活化染料的作用与光活化荧光蛋白相似。也就是说，它们在被光照射或自发激活之前处于非荧光状态。罗丹明衍生物PA-JF549和PA-JF646以及桥环菁染料Cy5B是已成功用于SMLM的光活化染料。此外，在没有光开关缓冲液的水溶液中，硅罗丹明HMSiR等自发闪烁染料也能应用于SMLM。最近，通过图案化照明方式实现更高的定位精度，单个荧光发射区的定位得到了改进。定位精度取决于信号的大小和强度，可以通过测量的PSF标准偏差的平方除以收集的光子数来估计。然而，包括拟合性能、标记密度、标记误差和显微镜漂移在内的其它参数决定了高定位精度是否可以转化为低于10 nm的空间分辨率。此外，到目前为止，因为SMLM方法成像需要昂贵的仪器和成像者具备广泛的专业知识，这在一定程度上阻碍了其广泛应用。2.2.3. SMLM-点累计纳米成像技术（PAINT，Point Accumulation for Imaging Nanoscale Topography）第一代SMLM技术依赖于荧光团的光开关和光激活，其分辨率需要有效地利用荧光团发出的光子数，而PAINT(point accumulation for imaging nanoscale topography)方法使用活的，与目标区域结构短瞬结合的染料。在成像过程中，被漂白的荧光团可以被成像介质中充足的新鲜荧光团不断置换替补。由于游离染料在采集单个图像帧期间在多个像素上快速扩散，因此它们仅显示为模糊背景且不能准确定位，而结合染料显示为PSF且能准确定位。因此PAINT的第一种方法是将荧光染料（如尼罗红）与细胞膜进行非特异性结合，然后进行光漂白和新的结合。此外，基于蛋白质片段的探针被用于单分子定位标记。在最近的一个研究中，将这种方法与传统的基于phalloidin的肌动蛋白标记方法进行了比较。通过引入通用PAINT（uPAINT）使Ni-Tris-NTA与转基因蛋白质上表达的His-Tags更特异结合，并可用于突触间隙成像。uPAINT也可以应用于其它标记方法，如免疫标记（内源性蛋白抗体、纳米抗体如绿色荧光蛋白）或受体配体结合。为了提高PAINT的适用性和特异性，引入DNA-PAINT方法。它使用长度小于10个核苷酸的短的可控的寡核苷酸链（成像链）瞬时标记其靶结合互补寡核苷酸链（对接链）。成像链与对接链的瞬时结合产生明显的闪烁。因此，荧光团开-关状态之间的切换与其光物理性质不直接关联。DNA-PAINT首先在DNA折纸（DNA-origami）上得到验证。DNA折纸是一种自组装的DNA结构（具有已知的大小），通过侧链和荧光团进行结合，并通过宽场显微镜观察。总的来说，DNA-PAINT是一种易于实现的SR成像标记方法，无需特定光物理特性的荧光团。因为探针可以在一轮结合后，从成像介质中置换补充荧光团，从而避免了光漂白。DNA-PAINT的缺点是图像获取时间长，这是由成像链与对接链的结合和解离速率决定的，以及荧光成像链的纳摩尔浓度引起的背景信号。尽管通过使用优化的DNA序列和缓冲条件，以及使用串联的周期性DNA结构域或通过短肽的卷曲螺旋相互作用（称为“Peptide-PAINT”），可以加快采集速度，但还是要利用全内反射荧光（TIRF）（仅限于对靠近盖玻片结构进行成像的特点），才能更好地减少成像链的背景信号。另一方面，基于DNA的探针提供了序列成像复用的明显优势，如Exchange PAINT中所述，已成功用于小鼠视网膜切片中多个结构的成像（图2）。Exchange PAINT的概念也被推广到dSTORM、STED、SIM和更传统的衍射限制的宽场和共聚焦荧光显微镜。最近，通过一种称为PRISM(probe-based imaging for sequential multiplexing)的基于DNA-PAINT的成像方法，实现了高达10个神经元蛋白质的分辨率约为20nm的多通道成像。该方法使用了低亲和力成像探针，该探针与突触、肌动蛋白和微管一抗上的对接链结合。图2 原代神经元中多个神经元靶点的多标Exchange-PAINT成像。（A）DNA-PAINT顺序成像的四种突触蛋白的超分辨图像：圆圈表示漂移校正的基准点；（B）为（A）中不带*的感兴趣区域的高放大倍率图和超分辨图像。（C）为（A）中带*的感兴趣区域的超分辨结果及单通道图像。2.2.4. 定量SMLM如果每个目标分子都可以单独标记和定位的话，与所有其他超分辨率成像技术相比，SMLM还可以提供有关分子分布和分子绝对数的单分子信息。然而，内源性蛋白质的定量免疫标记仍然是一个挑战，并且多标记抗体的不同定位数目也会使数据解释复杂化。另一方面，达到内源性表达水平比较困难，另外FPs蛋白成熟缓慢也同样会令定量化困难。然而，可以通过设计专门的对照实验估计拷贝数，并提取出有关生物目标结构分子的真实信息。借助合适的算法，SMLM可以提供有关拷贝数、聚类、共定位和复杂化学计量的数据，用于定量模型的生成和模拟。此外，还可以通过将突触结构信息与其功能关联来实现量化，例如膜片钳神经元的生物细胞素标记。例如，通过对链霉亲和素标记后膜片钳神经元进行STORM成像，结合CB1受体的免疫标记，然后在GABA能的海马轴突终端内定量，研究了内源性大麻素信号。本研究发现，与树突投射型中间神经元相比，胞周投射型中间神经元具有更高的CB1受体密度和更复杂的活动区。通过免疫标记和dSTORM研究了黑腹果蝇神经肌肉连接处内源性Bruchpilot（Brp）分子的数量。利用抗体滴定实验，确定了野生型神经肌肉连接处活性区细胞基质中Brp蛋白的数量为137个，其中四分之三以约15个七聚体簇状排列结合从相同组织样本记录的电生理数据，研究Brp如何组织控制活动区功能。利用DNA纳米结构作为校准，每个活性区Brp蛋白的数量估计通过定量DNA-PAINT（qPAINT）实验证实。此外，定量dSTORM实验表明，每个活性区Brp蛋白的数量和分布受突触标记蛋白-1的影响，这说明突触活性区递质释放的复杂性。在最近的一项研究中，使用Alexa Fluor 532和Alexa Fluor 647免疫标记的双色dSTORM已用于小鼠小脑平行纤维活性区中代谢型谷氨酸受体4（mGluR4）的定量研究（图3）。该研究还使用抗体滴定实验估计每个活性区平均包含约35个mGluR4分子，并排列在小纳米结构中。此外，mGluR4通常在munc-18-1和CaV2.1通道附近被发现，这支持了mGluR4与这些蛋白质相互作用以调节突触传递的观点。图3小鼠脑片中代谢型mGluR4受体定位定量双色dSTORM。上图：mGluR4和Bassoon免疫染色的小脑冠状切片的dSTORM图像，作为活性区参考。与宽场显微镜结果的比较。（A）DBSCAN聚类算法定义了近距离的En face活性区表面积（灰色）和mGluR4信号（品红）。（B）活性区大小的频率分布直方图（C）mGluR4信号到突触和突触外区域的映射。（D）通过Ripley H函数分析评估Bassoon和mGluR4的聚集分布。与随机分布的分子（蓝色、灰色）进行比较。虚线表示Ripley分析的最大值。这些研究显示了定量SMLM在神经科学研究中的潜力。可以预见，定量SMLM的进一步发展将为突触前和突触后蛋白质的功能关系，及其组织和结构的研究提供更有价值的信息。2.2.5. 组织三维（3D）SMLM虽然SMLM方法实现了仅几纳米的非常高的水平定位精度，但它需要特殊的方法来打破图像平面上方和下方PSF的对称性，来实现高轴向定位精度。实现高轴向定位精度的两种方法是PSF重塑和多焦面检测，通常用于在3D中精确定位荧光团。在SMLM中最常用的方法是通过在成像路径中插入单个柱面透镜从而不对称地扭曲PSF，利用光学像散原理来实现三维定位。基于像散方法的3D dSTORM技术还可以与光谱拆分相结合，对COS-7细胞中的网格蛋白表面小窝成像。像散引起的畸变程度由荧光团的轴向位置决定，因此可用于轴向位置计算。例如，3D散光SMLM已用于确定抑制性突触后密度区gephyrin蛋白和受体复合物的分布和拷贝数，或突触前活动区和突触后密度区各种成分的空间关系。采用双物镜像散成像方案，通过3D SMLM研究组织中肌动蛋白、血影蛋白和其他相关蛋白的结构，发现这些蛋白在轴突中形成190nm的周期性环状结构。替代方法包括使用相位掩模、变形镜实现双螺旋、四足或鞍点PSF重塑，和双焦面成像方法实现更大的轴向范围，并已成功应用于不同的应用中。为了在2D和3D中定位单个荧光发射区，已经开发了不同的算法和软件工具。在最近的一次综述中，列出了不同3D SMLM方法获得的水平和轴向分辨率，以供比较。然而，到目前为止，大多数SMLM研究都是在培养细胞上进行的。培养细胞具有相对简单的样品制备和成像要求，例如焦平面上下荧光分子的背景信号较低或没有。而脑片更具挑战性，因为它们在焦平面上下表现出高密度的神经元结构和潜在的高荧光背景，由此产生的低信噪比对于成像来说是一个障碍，会直接影响单分子定位的精度和准确性。此外，脑片必须具有足够的渗透性，以实现有效的免疫标记，而不损害组织结构。除了超微结构保存外，对几十微米厚的脑片进行均匀标记也仍然是一个挑战。因此，最初的尝试是将组织切成薄片，以便于标记。然而，将多个切片进行三维重建也仍然具有挑战性。为了保存好抗原表位，在切割成超薄切片进行SMLM成像之前，需要对组织进行解剖、固定以及免疫标记、后固定、脱水并包埋在环氧树脂中。而且，3D SMLM只能对靠近盖玻片的脑片的一个轴向平面进行成像。如果背景信号和散射太强，也可以使用组织透明化方法和基于光片的照明方法进行SR成像。另一个导致较厚脑片的3D成像不可靠的原因是光学畸变引起的单个荧光团PSF变形和模糊。通常应用自适应光学恢复PSF，使各神经元能够更精确地成像。为了进一步提高基于自适应光学的SR成像的性能，需要将其与自适应PSF重塑相结合。例如，在30μm厚的阿尔茨海默病小鼠模型脑片中，通过同步校正样品引起的畸变并且生成一致的PSF，可以重建纤维淀粉样蛋白斑块的精细细节。荧光团的3D位置也可通过PSF内产生的自干涉精确确定，并已成功用于轴向深达50μm的 SMLM。 3.膨胀样品显微成像技术（EXM）2015年，Ed Boyden及其同事描述了另一种绕过荧光显微镜分辨率极限的创新策略，称为膨胀样品显微成像技术（ExM）。ExM的原理是将蛋白质连接到带电荷的聚丙烯酰胺凝胶中，然后使用蛋白酶进行轻微的机械破坏，然后让其在水中膨胀，从而实现样品的物理放大。最初的方法是将三功能连接体交联到凝胶基质上，将标签信息转移到凝胶上。图4 结合ExM和晶格光片显微镜（LLSM）可观察大量神经元分子组装细节。左上图：概图；右上部位：海马CA1锥体神经元的投射；右下部位：神经元胞体；中下部位：小鼠大脑，通过Thy1 EYFP信号和突触蛋白免疫组织染色进行皮质树突棘成像；左下部位：果蝇投射神经元（PN）束的多样性。左上部位：果蝇中枢复合体PN的神经元追踪。中心部位：果蝇多巴胺能神经元的全脑成像。下图：成年果蝇大脑所有33个脑区的多巴胺能神经元相关Brp信号（体积密度）定量图（nc82抗体免疫染色，绿色曲线=与多巴胺能神经元相关的nc82斑点百分比）。右上图：沿着皮质层I至VI（顶部，最小强度投影）的初级躯体感觉皮层中的Homer 1点密度和25μm×50μm×50μm跨皮质的Homer 1点累积数量。请注意，在第二层/第三层和第五层中，Homer 1的密度较高。三功能连接体含有甲基丙烯酰基团、荧光标记和寡核苷酸，它与连到蛋白质标记的抗体的互补寡核苷酸杂交。将免疫染色的细胞或组织包埋在单体溶液中后，添加含有丙烯酸钠（凝胶高吸水性树脂）的共聚单体丙烯酰胺和交联剂N，N′-亚甲基双（丙烯酰胺）。这些单体组分和位于目标上的甲基丙烯基在高温下聚合，使用四甲基乙二胺(TEMED)作为催化剂，过硫酸铵(APS)作为聚合引发剂。荧光标签通过锚定在凝胶中的特定位置而在空间中固定，并且其位置可以在蛋白酶的化学预处理和水中透析后延伸构象进行物理膨胀。最初使用ExM产生了一个100倍的体积膨胀和目标分子间的4−5倍距离的线性增加。使用常规共聚焦显微镜对其成像，SRM横向分辨率可达到70 nm，轴向分辨率可达200 nm。在随后的几年中，通过使用交联分子如MA-NHS和acryloyl-X将蛋白质锚定到凝胶基质上，开发了改进proExM方法，使用常规荧光团就可保留蛋白质表位。为了避免自由基起始剂对荧光团的影响，设计了新的方法如蛋白质组放大分析（MAP），与SDS结合热介导变性，实现膨胀凝胶的后标记。此外，通过引入三功能连接体，它们能够在聚合、消化和变性后存活，并能够将目标分子和官能团直接共价锚定到水凝胶中，以实现膜和细胞骨架的SR成像。有研究显示，一些荧光团与激动剂发生反应。例如，因为菁染料在样品制备过程中几乎消失，因此不适合用于ExM标记，而其他荧光团如Alexa Fluor 488、CF和Atto染料在ExM处理流程后仍然能发射足够的光子。此外，生物素−亲和素信号放大和交换反应信号放大免疫染色技术(Immuno-SABER)可以有效提高信噪比和对大量目标蛋白进行成像。最近的研究表明，可以通过优化Ultra（U-ExM）的流程保留中心粒的超微结构细节。U-ExM启发于MAP方法，该方法允许膨胀并使用低甲醛和丙烯酰胺浓度交联蛋白质（保留样品的超微结构细节）后进行标记。U-ExM已经成功地用于揭示以前只有电镜才能获得的中心粒的超微结构细节。通过使用不同的单体和引发剂组合，Truckenbrodt及其同事设计了一个对常规培养细胞甚至神经元进行10倍体积膨胀的方案，即通过二次凝胶进行迭代ExM制样，多次嵌入不同的单体（而这些单体又可以通过使用高摩尔氢氧化钠去除）从而达到高达53倍的膨胀系数。应用此方法，可以从突触后支架蛋白中清晰看到位于突触间隙内的膨胀13倍的蛋白，例如神经递质受体GluR1和GABAARα1/α2。如今，ExM已成功用于培养细胞、原代神经元和组织中的蛋白质、RNA、真菌、病理标本和细菌的超分辨率成像。4倍膨胀的ExM已经与晶格光片显微镜相结合，以60×60×90 nm的分辨率对整个果蝇大脑中多种蛋白质之间的纳米级结构进行成像（图4）。为了进一步提高分辨率，ExM已成功地与SRM方法相结合。例如，ExM与SIM相结合到达20nm的空间分辨率，观察果蝇中的联会复合体和小鼠精母细胞。在细胞培养样品中进行多表位标记后，与传统荧光显微镜相比，使用STED结合ExM可使分辨率提高30倍。此外，使用NHS染料对所有蛋白进行标记，然后进行迭代ExM，可以对高蛋白密度的结构或细胞器（如线粒体），实现与EM相比具有更高对比度的超微结构细节。为了在分子尺度上进行成像，ExM与SMLM方法（如dSTORM）相结合是一个理想的选择。然而在含有硫醇和盐的传统光转换缓冲液中，会发生荷电氢凝胶收缩。可通过使用低离子强度缓冲液或加入中性溶液使凝胶稳定以避免收缩。另一种策略是使用自发闪烁的荧光团（如HMSiR）在水中进行SMLM。通过Ex-dSTORM实现分子分辨率的关键是膨胀后标记，这增加了表位可及性，从而提高了标记效率并减少了标记错误。Ex-dSTORM超分辨成像已成功应用于原代细胞和神经元中微管和中心粒结构的解析。

显微镜一直是生物学研究中的重要工具，随着技术的发展显微镜的分辨率在不断提高。最新的超高分辨率显微镜已经达到了超越衍射极限的分辨率。现在MIT的研究团队通过另一种巧妙的方式达到了同样的目的。　　研究人员并没有在显微镜上下功夫，而是从组织样本下手，利用一种吸水膨胀的聚合物将组织样本整体放大。这种方法非常简单成本也很低，能用普通共聚焦显微镜达到超越200nm的分辨率。这项发表在Science上的成果，能使更多科学家接触到超高分辨率成像。　　&ldquo 你在常规显微镜下就可以实现超高分辨率成像，不需要购买新设备，&rdquo 文章的资深作者，MIT的副教授Ed Boyden说，Fei Chen和Paul Tillberg是这篇文章的第一作者。　　物理放大　　衍射极限曾经是光学显微镜的最大障碍之一，使其分辨率无法突破200nm，然而这个尺度恰恰是生物学家最感兴趣的。为了克服这个问题，科学家们开发了超高分辨率显微技术，该技术获得了去年的诺贝尔化学奖。　　然而，超高分辨率显微镜最适合用于薄样本，成像大样本的时间比较长。&ldquo 如果想要分析大脑，或者理解肿瘤转移中的癌细胞，或者研究攻击自身的免疫细胞，你需要在高分辨率水平上观察大块的组织，&rdquo Boyden说。　　为了使组织样本更容易成像，研究人员使用了聚丙烯酸盐制成的凝胶，这是一种高度吸水的材料，通常用于尿不湿中。　　研究人员首先用抗体标记想要研究的细胞组分或蛋白，这种抗体不仅连有荧光染料，还能够将染料连到聚丙烯酸盐上。研究人员向样本添加聚丙烯酸盐并使其形成凝胶，然后消化掉起连接作用的蛋白，允许样本均匀膨胀。样本遇到无盐的水之后膨胀了100倍，但荧光标记在整个组织中的定位并没有改变。　　人们一般用普通共聚焦显微镜进行荧光成像，不过它的分辨率只能达到几百纳米。研究人员通过放大样本，用共聚焦显微镜达到了70nm的分辨率。&ldquo 这种膨胀显微技术能够很好的整合到实验室已有的显微系统中，&rdquo Chen补充道。　　大样本　　MIT的研究团队用这种膨胀显微技术，在常规共聚焦显微镜下成像了500× 200× 100微米的大脑组织切片。而其他超高分辨率技术难以成像这么大的样本。　　&ldquo 其他技术目前可以达到更高的分辨率，但使用起来比较难也比较慢，&rdquo Tillberg说。&ldquo 我们这个方法的优势在于，使用简单而且支持大样本。&rdquo 　　研究人员认为，这一技术对于研究大脑的神经连接非常有用。Boyden的团队将注意力放在大脑研究上，不过这一技术同样适用于肿瘤转移、肿瘤血管生成、自身免疫疾病等研究。

仪器信息网讯 2013年10月25日，德国耶拿公司在北京展览馆举行了&ldquo 高分辨ICP-OES新品发布会&rdquo ，推出目前市场同类产品中最高分辨率的ICP-OES新品&mdash &mdash PQ9000。发布会现场德国耶拿公司在BCEIA 2013上展示的ICP-OES新品&mdash &mdash PQ9000(左一：德国耶拿公司CEO Berka，左二：德国耶拿中国区总经理赵泰)　　在新品发布会上，仪器信息网(以下简称：instrument)编辑也就相关问题采访了德国耶拿中国区总经理赵泰。　　Instrument：多年来，耶拿公司一直以原子吸收的著名厂家而知名，尤其是2004年推出的划时代的连续光源原子吸收，目前中国的ICP市场已被许多品牌领先占据，德国耶拿公司为什么选择当前推出ICP-OES?　　赵泰：大家都知道ICP-OES产品经过多年的发展，在化学分析领域有着非常重要的地位，但是ICP的应用技术还是存在很多难以克服的问题，给我们的分析工作带来很大的障碍。　　比如，发射光谱的主要缺陷是发射谱线多、光谱干扰严重，很多分析问题都是源于此，所以对ICP-OES分辨率的要求就非常高，理想目标是分辨率达到发射谱线的自然宽度(1-3pm)，而目前市场上ICP-OES都未达到这一目标。　　还有ICP-OES很难直接测量高盐，痕量类样品，所以也限制了ICP的分析范围。另外，随着技术的进步大家对仪器研发要求越来越高，大家心目中理想的仪器，不仅性能要好，使用成本也要低。　　为了能克服不足，满足当前分析的需求，德国耶拿公司就一直在研发这样的ICP-OES。德国耶拿公司在光学仪器制造行业有非常丰富的经验，已经有160多年的发展历史和经验，具有得天独厚的优势，所以在光谱领域一直以来都能推出品质非凡的产品。耶拿新品ICP-OES PQ9000也是在传承历史，经过多年的研发，针对目前的ICP-OES产品的不足之处，为了满足当前分析需求，为分析者&ldquo 量身定做&rdquo 的，所以选择当前隆重推出。　　Instrument：耶拿推出的ICP-OES新品与市场上同类产品相比的在技术方面有哪些新的突破，仪器性能有何显著提高?给分析工作带来哪些优越?　　赵泰：首先，借助耶拿特有的光学技术优势，加上设计独特的分光系统，PQ9000的光谱分辨率能达到3pm，达到了相当于发射谱线自然宽度的理想目标，在目前市场上同类产品中是最高分辨率的ICP-OES。用户可以轻松应对很多难分析的、光谱干扰严重的样品。光学性能上也有很大的突破，保证了分析的稳定性和准确性。　　第二，PQ9000采用了先进的垂直矩管、双向观测设计方式，消除了高盐和基体的影响，不仅能满足各类样品(有机，高盐)的分析，也能满足不同浓度(µ g/L～%)的同时测量，保证了灵敏度和检测限。另外PQ9000采用冷锥加氩气反吹消除尾焰，无自吸，无空气，降低背景 持续氩气对光室和检测器的吹扫，消除空气和水分等对紫外光的吸收，从而使得PQ9000的检出限比常规降低2～10倍，灵敏度达到µ g/L级。从短波到长波，常用元素的检测限都大幅提高。从而解决了&ldquo 复杂基质&rdquo ，&ldquo 痕量分析&rdquo 的难题。　　第三，采用高性能的新一代CCD检测器，产生高量子效率和紫外超高灵敏度，可以自动选择最佳积分时间，同时记录元素线与其直接光谱环境，自动扣除背景，检测器只需致冷到零下6到10度即可稳定工作，大大缩短了预热时间(5分钟)，能做到真正的即开即用。　　第四，耶拿本着创新的理念，PQ9000在其他部分的设计上也充分体现。比如新颖独特的尾焰消除技术，采用最先进的气路设计，即吹扫和冷却用氩气又巡回到等离子体使用，没有额外消耗，大大地降低了氩气的消耗 　　另外，组合式炬管，体积小，氩气消耗少，从而最大程度降低氩气的消耗。整个外观设计也很精巧，是世界上体积最小的高分辨率ICP-OES。　　Instrument：耶拿新品ICP-OES主要在哪些应用领域推出?如何能获得用户的认可?　　赵泰：PQ9000在技术上的创新突破，打破了目前ICP-OES的分析局限，带来分析工作带来更多的自由空间。各种样品中低含量、微量和痕量的金属元素以及部分非金属元素的定性和定量分析 尤其适合分析样品量大，检测结果要求高的用户 可广泛应用于石油化工、农业，质检、环保、钢铁、科研、卫生等行业。凡是追求更好分析性能的用户都能认可该技术。　　Instrument：您是如何看待原子吸收与ICP-OES未来发展的关系?ICP-OES的推出对原子吸收业务发展有何影响?耶拿如何制定发展规划?战略目标是?　　赵泰：原子吸收和ICP-OES技术都是目前无机分析的主力军，两者一直是即有交叉又有互补的关系，应用上各有所长。　　ICP-OES的推出对原子吸收业务发展不会有太大影响，只是一些以往必须用石墨炉原子吸收分析的痕量元素现在有更多可能在高分辨率ICP-OES上完成，有更多分析任务可以全部依靠高分辨率ICP-OES完成，而不必分到两种仪器上才能全部满足分析任务的要求。但很多以往特别适合用原子吸收分析项目，如分析元素种类少，或仅靠火焰原子吸收就能完成的分析仍应采用原子吸收更为合适或更加经济。　　PQ9000高分辨率ICP-OES的推出，使耶拿公司的原子光谱仪器家族又增加了新的成员，能满足更多的分析需求，可以为更多的用户提供更多的服务，也为信赖耶拿品质的用户提供更大的合作空间。这也加进一步强了耶拿公司在无机分析领域的技术领先地位和市场影响力。耶拿公司将继续不遗余力的做好售后服务和技术支持，借助此超高分辨率ICP-OES的先进性能为用户解决更多的分析难题，增强实验室分析能力，更加简便、有效的完成高质量的分析任务。　　耶拿公司的战略目标是不断创新，用更多先进技术巩固和加强光谱技术领先者的市场地位。　　Instrument：谈谈新品ICP-OES PQ9000的市场定位和预期?　　赵泰：PQ9000高分辨率ICP-OES的市场定位与其它众多耶拿产品一样，仍然是瞄准高端市场，以技术优势和非凡品质赢得广泛用户的信赖。可以预期，期盼有更好、更强分析性能力装备的用户一定会欢迎这一新品，而耶拿公司的PQ9000绝不会让这样懂行的专业用户失望，将再次为德国耶拿赢得光彩夺目的品牌声誉!　　Instrument：2013年，在全球经济依然不景气的情况下，耶拿面对市场变化，取得了怎样的销售业绩?在耶拿中国的业绩情况?　　赵泰：2013年，德国耶拿一如继往的取得了骄人的业绩，除日本市场外，全球市场继续有较快增长，尤其生命科学业务，有近2位数的增长。　　耶拿中国的业绩继续领先全球，业务总量仍然保持2位数的增长速度，对总增长约推高2个百分点的生命科学业务更是增长了近80%!撰稿人：刘丰秋

使用超高效聚合物色谱（APC）系统对低分子量聚合物进行快速高分辨率分析Mia Summers和Michael O&rsquo Leary沃特世公司（美国马萨诸塞州米尔福德）应用优势■ 既能对聚合物进行快速表征又不会降低性能水平■ 与常规GPC分析相比，可提高对低分子量低聚物的分辨率■ 与常规GPC分析相比，可提高校准水平并由此对低分子量低聚物进行更准确的测定■ 可对聚合物进行快速监测，从而能提早发现产品开发过程中出现的变化 沃特世提供的解决方案ACQUITY 超高效聚合物色谱（APC&trade ）系统ACQUITY APC XT色谱柱沃特世聚合物标准品带有GPC选项的Empower 3色谱数据软件关键词聚合物、SEC、GPC、APC、聚合物表征、低分子量聚合物、低聚物、环氧树脂 引言凝胶渗透色谱（GPC）是一种广泛认可并行之有效的聚合物表征方法。然而，尽管使用此技术可获得大量信息，但这类分析本身仍存在缺陷。色谱柱通常填充苯乙烯-二乙烯基苯，同时需要进行适当老化并应在低背压下运行以确保其长期稳定。填充颗粒通常较大（&ge 5 &mu m），分辨率一般会因此而受影响。填充较小颗粒（5 &mu m）的色谱柱已投放市场，并能提高GPC分离速度，但分离速度会因色谱柱本身的最大工作压力偏低而受限。此外，常规GPC仪器的系统体积较大，这需要使用较大直径的色谱柱以减缓可能导致分辨率降低的系统峰展宽。沃特世ACQUITY超高效聚合物色谱（APC）系统与亚3 &mu m杂化颗粒色谱柱相结合，可增强系统稳定性并能在更高压力下确保流速准确性。此外，APC系统的总体扩散度低，能显著提升分辨率，在分析低分子量低聚物时尤为明显。提高分离低分子量低聚物的分辨率并缩短运行时间能对聚合物工艺开发进行快速监测，提早检测出新的聚合物类型并从总体上加快聚合物新产品的上市进程。这篇应用纪要将基于ACQUITY APC系统的分离与基于常规GPC的分离进行了比较。本文将会说明使用一种采用亚3 &mu m杂化颗粒技术色谱柱的低扩散系统能加快分析速度，提高分辨率并有助于对低分子量低聚物进行校正。综合使用这些技术能够更稳定、更精确地测定低分子量聚合物样品的分子量参数。提早识别某种聚合物所出现的甚至比较细微的改变都能明显加快化学和生物材料应用中聚合物的开发速度。 实验Alliance GPC系统条件检测器： 2414 RI （示差折光检测器）RI流通池： 35 ℃流动相： THF流速： 1mL/min色谱柱： Styragel 4e，2和0.5，7.8 x 300 mm（3根串联）柱温： 35 ℃样品稀释剂： THF进样量： 20 &mu LACQUITY APC系统条件检测器： ACQUITY RI（示差折光检测器）RI流通池： 35 ℃流动相： THF流速： 1 mL/min色谱柱： ACQUITY APC XT 200 Å 柱和两根45 Å 柱，4.6 x 150 mm（3根柱串联）柱温： 35 ℃样品稀释剂： THF进样量： 20 &mu L数据管理Empower 3色谱数据软件样品1 mg/mL的沃特世聚苯乙烯标准品（100K、10K和1K）环氧树脂（2 mg/mL）结果与讨论为了使用SEC对聚合物进行适当表征，重要的是要使用适当的标准品生成一条校准曲线以确定当前所用色谱柱的分离范围。使用常规GPC分析标准品和样品相当耗时，运行时间可长达1小时（或更长）。由于样品所产生的数据将与经校准的标准品进行比较以确定分子量，因此标准品分析结果的准确度对获得关于聚合物样品的准确结果而言具有至关重要的作用。除了GPC本身的运行时间较长之外，常规GPC系统的额外柱体积较大也会导致峰展宽，从而降低分辨率并由此降低校准数据点的准确度。与常规GPC系统相比，ACQUITY APC系统的扩散度更低，因此产生的峰展宽就更少，并且窄分布标准品的色谱峰也明显更清晰，如图1所示。此外，低扩散性APC系统与支持更高流速和背压的稳定的亚3 &mu m APC色谱柱柱技术相结合也能提高对1K聚苯乙烯标准品的分辨率，并使分析时间缩短至原来的1/5。图1. 比较在常规GPC系统和ACQUITY APC系统中分析聚苯乙烯标准品（Mp：100K、10K和1K）的运行时间和分辨率使用APC系统所提高的分辨率为确定1K聚苯乙烯标准品分子量增添了更多可识别的色谱峰。如图2所示，通过使用标准品供应商提供的数值或根据外部方法得出的标准品测定值而确定的分子量信息，更多的数据点由此可被添加到校准曲线上，从而为根据这条曲线所计算出的样品结果增加了可信度。图2. 使用ACQUITY APC系统时，因对1K低分子量标准品的分辨率提高而在校准曲线上得出关于聚苯乙烯标准品（100K、10K和1K）的更多数据点一般说来，需要运行一系列标准品以得出用来生成校准曲线的数据点。使用常规GPC时，平衡、配制并分析每种标准品可能需要数小时至数天的时间。因此，通常不进行校准并根据原有校准曲线确定分析结果。ACQUITY APC系统因其系统滞留体积低而使平衡速度明显加快，并且因在更高流速下使用更小的颗粒而使运行时间明显缩短。运行时间的缩短使得平衡和校准操作可在一小时内轻松完成。最后，得益于分辨率的提高，可能只需要配制并进样检测更少的标准品，就能获得一条可用来进行校准的稳定曲线。分析样品时，校准操作的稳定性提高使得对低分子量低聚物的分子量测定具有更高的可信度。图3显示出一份环氧树脂样品相对于用聚苯乙烯标准品校准的分析结果。该结果表明使用三根ACQUITY APC XT 4.6 x 150 mm串联柱可在不到5分钟的运行时间内分辨出不同低聚物。图3. 使用配有ACQUITY RI检测器的三根ACQUITY APC XT 4.6 x 150 mm串联柱对溶于四氢呋喃的一份环氧树脂样品进行分析。低分子量低聚物（显示为峰尖分子量）可在不到5分钟的时间内被分辨开来。APC可缩短运行时间的特点有助于在工艺开发过程中进行反应监测。分辨率提高能够促进对合成应用或降解研究中可能出现的聚合物改变进行更快速的鉴别。通过监测各种分子量而提早发现工艺改变有助于更好地了解聚合物及其预期属性，从而可促进新型聚合物的开发并加快产品上市进程。结论由于超高效聚合物色谱系统的扩散度更低并能承受更高的背压以允许使用更小的杂化颗粒，因此该系统明显优于常规GPC系统。通过与最新的色谱柱技术相结合，APC系统与常规GPC相比也提高了对低分子量低聚物的分辨率。APC在性能方面的优点包括校准结果更可靠，这对生成用于聚合物表征的准确测定值而言是必不可少的。低分子量聚合物检测速度和分辨率的同时提高可在开发过程中实现对聚合物的快速且可靠的表征，从而促进对新型聚合物进行密切的上市跟踪。

近期，中国科学院合肥物质科学研究院安徽光学精密机械研究所副研究员许振宇团队在激光外差光谱技术研究中获进展。相关研究成果发表在《光学通信》（Optics Letters）上。激光外差光谱仪因具有高光谱分辨率、体积小、易集成等优点，已经逐渐发展成为与地基傅里叶变换光谱仪互补的温室气体柱浓度与廓线测量工具。激光外差光谱技术因受限于光学天线理论，无法通过增加光学接收口径的方法提高外差信号信噪比，这导致高分辨率激光外差探测中气体廓线测量精度受限。对此，研究人员提出基于半导体光放大技术的微弱太阳光放大方法，解决了高分辨率激光外差探测中光学天线理论限制的外差信号信噪比提高问题。研究结果表明，相比于传统的高分辨率激光外差光谱仪，所研发的基于半导体光放大的高分辨率激光外差光谱仪的弱光信号探测和气体浓度测量精度得到大幅提升。该研究有助于提高高分辨率激光外差光谱仪的性能，在大气温室气体传感等方面具有巨大应用潜力。相关研究工作获得国家自然科学基金、国家重点研发计划等项目的资助。基于半导体光放大技术的激光外差光谱仪实验装置示意图信号对比测量结果

集成光信号分配、处理和传感网络需要小型化基本光学元件，如波导、分光器、光栅和光开关。为了实现这一目标，需要能够实现高分辨率制造的方法。弯曲元件（如弯管和环形谐振器）的制造尤其具有挑战性，因为它们需要更高的分辨率和更低的侧壁粗糙度。此外，必须采用精确控制绝对结构尺寸的制造技术。已经开发了几种用于亚波长高分辨率制造的技术，如直接激光写入、多光子光刻、电子束光刻、离子束光刻和多米诺光刻。然而，这些技术成本高、复杂且耗时。纳米压印光刻是一种新兴的复制技术，非常适合高分辨率和高效制造。然而，它需要高质量的母版，通常使用电子束光刻来生产。新发表在《光：先进制造》的一篇论文中，来自汉诺威莱布尼兹大学的科学家Lei Zheng博士等人开发了一种低成本、用户友好的制造技术，称为基于紫外发光二极管的显微投影光刻（MPP），用于在几秒钟内快速高分辨率制造光学元件。这种方法在紫外光照射下将光掩模上的结构图案转移到涂有光致抗蚀剂的基板上。a.采用基于UV-LED的显微镜投影光刻系统的草图。b.工艺链示意图，包括从结构设计到最终投影光刻的步骤。c.使用MPP制造的高分辨率光栅。d.通过MPP实现的低于200nm的特征尺寸。上部和下部所示的线条分别使用昂贵的物镜和经济物镜制造。MPP系统基于标准光学和光机械元件。使用波长为365nm的极低成本UV-LED作为光源，而不是汞灯或激光。研究人员开发了一种前处理工艺，以获得MPP所需的结构图案化铬掩模。它包括结构设计、在透明箔上印刷以及将图案转移到铬光掩模上。他们还建立了一个光刻装置来制备光掩模。通过该装置和随后的湿法蚀刻工艺，可以将印刷在透明箔上的结构图案转移到铬光掩模上。MPP系统可以制造特征尺寸低至85纳米的高分辨率光学元件。这与更昂贵和更复杂的制造方法（如多光子和电子束光刻）的分辨率相当。MPP可用于制造微流体设备、生物传感器和其他光学设备。研究人员开发的这种制造方法在光刻领域取得了重大进展，可用于光学元件的快速和高分辨率结构化。它特别适合于快速原型设计和低成本制造重要的应用。例如，它可以用于开发用于生物医学研究的新型光学设备，或为消费电子产品应用原型化新型MEMS设备。

div class="content"!--enpcontent--p近期，中国科学院国家天文台南京天文光学技术研究所天文光子学团队在超高分辨超高定标精度光谱技术研究中取得进展。研究团队将虚拟成像相位阵列（VirtuallyImaged PhasedArray，VIPA）作为主色散元件，以激光频率梳作为波长定标源，在实验上获得的光谱分辨率为106万（~0.6皮米），短时标波长定标精度优于10厘米/秒；目前，由于仪器未做任何温度和压力控制，6小时双通道同步定标精度~13米/秒，奇偶次定标精度~40厘米/秒。相关研究成果发表在TheAstronomical Journal上。/pp该研究第一完成人、博士朱小明和团队负责人、研究员何晋平介绍，后续通过优化系统，做好装置的温控和压控，该类光谱技术可兼顾超高分辨率（50万~1000万）及超高定标精度（10厘米/秒量级），且装置紧凑，造价低，可为未来天文超高分辨率光谱观测提供技术支撑，有望在恒星化学元素探测及大气同位素比、系外行星探测及大气成分表征、星际物质分子丰度、太阳物理动力学过程、精细结构和磁横流研究等方面获得实用。除天文方面的应用，该类技术在高精度测距、测力、测温及测速方面均有较明确的应用前景，后续有望应用在生物力学特性研究、基于精密温度测量的海底非合作目标探测、空间激光精密测距等研究领域或场景中。/pp当前，该研究团队正在调试及优化样机，为后续实际观测及应用做准备。研究工作得到国家自然科学基金面上项目及重点项目的资助。/pp论文链接/ppimg src="https://pic.cyol.com/img/20200929/img_96b326fbc54a2f995b8241ef054906cf33_c.jpg" data-bd-imgshare-binded="1"//pp图1.实测二维光谱数据。重复频率808MHz的激光频率梳梳齿阵列可被完全分开 /ppimg src="https://pic.cyol.com/img/20200929/img_968949af075f01c499503ed9560950a5a1_c.jpg" data-bd-imgshare-binded="1"//pp图2.六小时双通道同步定标波长精度 /p/div

超高分辨率荧光显微镜正在不断改变我们对细胞内部结构及运作的认识。不过在现阶段，显微镜技术还是存在着种种不足，如果人们希望显微镜能在生物研究领域发挥重要作用，就必须对其加以改进和提高。　　光学显微镜的出现及其影响　　自荷兰博物学家、显微镜创制者Antonie van Leeuwenhoek(1632-1723)在17世纪第一次将光线通过透镜聚焦制成光学显微镜并用它观察微生物(microorganisms or animalcule)以来，显微镜就一直是生物学家从事研究工作、探寻生命奥秘必不可少的利器。正是因为有了Leeuwenhoek的这项伟大发明及其后继者对显微镜技术的不断改进和发展，人们才能够对细胞内部错综复杂的亚细胞器等结构的形态有了初步的了解。　　此后，研究人员对显微镜技术的追求从未停歇过，他们总是希望能得到分辨率更高的显微镜，从而更好地观察细胞内部更细微的结构。最近，《自然-方法》(Nature Methods)杂志上报道的超高分辨率成像技术(super-resolution imaging, SR imaging)终于使得人们可以在单分子水平上进行观察研究。　　SR技术的发展过程　　在达到今天SR技术水平的过程中，承载了许许多多研究人员辛勤劳动的汗水，也面临着诸多亟待解决的难题。　　在以上这些光学SR成像技术中有两种技术&mdash &mdash 受激发射减损显微镜(stimulated emission depletion microscopy, STED)和饱和结构光学显微镜(saturated structured illumination microscopy，SSIM)最受关注。　　最近，基于探针SR成像技术的光敏定位显微镜(PALM)和随机光学重建显微镜(STORM)，以及借助荧光基团随机激活特性的荧光光敏定位显微镜(FPALM)都已经取得了成功。　　通过基于探针的SR成像技术，可以获得多张原始图像。在每一张原始图像中，细胞内只有一部分被荧光标记的分子能发出荧光，即这些荧光分子都处于不断激活和灭活的交替状态，每一次都只有部分分子能被观察并成像。而且由于每次发出荧光的分子都分散得较为稀疏，因此相互之间不会受到影响，也就避免了因相邻分子发出荧光而无法分辨的问题。最后将这些原始图片叠加、重合在一起就得到了最终的高分辨率图像。这样，就能使得那些以前由于荧光点太密以至于无法成像的结构的分辨率达到纳米级水平，而且成像的分子密度也相当高，可以达到105个分子/&mu m2。　　这种分辨率对于生物学家来说，意味着现在可以在分子水平上观察细胞内的结构及其动态过程了。　　虽然显微镜技术已经发展到了如此高度，但它仍然只是生物学家研究中使用的一种工具。因此还需要将显微镜获得的图像与其它的试验结果互相参照，才能获得准确的结果。人们需要认清SR显微镜的优势与劣势，为操作以及判断SR图像制定出标准化的操作规范，只有这样才能最大限度地发挥SR显微镜的作用。　　现在，由于人们对细胞内各组份的组织结构以及它们的动态变化过程都只有一个概念上的认识，因此，借助显微镜从纳米水平上对这些结构及过程进行真实的观察能让人们发现许多以往所不了解的东西。例如，以前人们通过电镜发现细胞骨架是由大量丝状网格样组织构成时，就有人对此现象持怀疑态度。那些认为细胞骨架是一种用来稀释细胞内生化物质浓汤这样一种结构的细胞生物学家把这种观测结果称作僵化的人为试验结果。　　除非最新的SR显微镜图像或者其它的试验结果都能证明细胞骨架是由大量的丝状网格样组织构成的，否则还会有人持上述的怀疑观点。不过已经有其它的生化试验结果证实了早期的电镜观察结果是正确的。当然新兴的SR技术也需要其它传统的生化试验结果予以佐证才有价值，同时还需要电镜的辅助。因为电镜能提供纳米级的观察结果，这对于佐证具有同样分辨率的SR显微镜观测结果来说是最有价值的。　　今后，大家在逐步了解、接受和广泛使用SR显微镜的同时，需要注意将会出现的各种问题，以下的表格列出了部分与SR显微镜使用相关的缺点及其目前的解决方法。　　最近几年，就如何处理图像已经有了非常严格的操作规范。不过迄今为止，对于怎么处理SR图像还没有一个标准的操作规范。尤其需要指出的是，PALM和STORM数据在某些重要因素上，graph方面的共性要多于image方面。在一张SR图像上，分子的不确定性和密度都能用颜色表示出来，这种图像把细胞内该分子有可能出现的任何地点都标示出来了。而且只有被标记的分子按照一定的标准(发出的光子数)判断它的确是一个单分子并且定位准确之后才显示出来。必须对获得的图像进行这样的标准化处理之后才能分析结果。同样，对于试验数据也需要如此进行标准化处理。要提高分辨率不仅需要分子定位、分布得比较好，还需要分子数目够多，以致能达到尼奎斯特判断法(Nyquist criterion)的要求，即分子间的平均距离要小于显微镜分辨率的一半。虽然上述问题都不会影响SR显微镜的应用，但由于存在这些问题，所以我们应该时刻提醒自己，一定要仔细判读、分析SR显微镜的图像结果，只有这样才能得到有价值的生物学结论。　　SR荧光显微镜在生物学研究中的应用　　到目前为止，人们还很难得知，SR荧光显微镜会对生物学界的哪一个领域带来重大变革，但已经有几个领域出现了明显的改变。这些研究领域是动态及静态的细胞组织结构研究领域、非均质分子组织研究领域、蛋白动态组装研究领域等。这几个领域都有一个共同的特点，那就是它们研究的重点都是分子间如何相互作用、组装形成复合物。因此，能在纳米水平观察这些分子对它们来说具有重大的意义。　　通过观察蛋白质之间的组合关系来了解它们的作用，并能为后续的细胞功能试验打下基础　　结构生物学研究在这方面已经取得了很大的进展，目前已经发现了4-8纳米大小的分子间相互作用组装成细胞微管、肌丝、中间丝这些超过10微米大小聚合物的机制。不过对于核孔复合体、中心体、着丝点、中间体、粘着斑这些由许多不同蛋白经过复杂的三维组装方式组合起来的复合体，还需要更好的办法来进行研究。目标就是要达到分子水平的分辨率，这样就可以观察大复合体形成过程中的单个分子，也就能对这些分子的化学计量学有所了解了。要得到更多的生物学信息就需要SR显微镜这样的三维成像技术，例如可以使用活体细胞SR成像捕捉细胞骨架的动态重构过程等等。　　SR成像有助于人们更好地了解分子间的差异　　细胞膜蛋白组织方式的经典模型已经从随机分布的液态镶嵌模型转变成了脂筏模型、穴样内陷模型或特殊蛋白模型。这种差异与细胞不同功能相关，例如在高尔基体、cargo蛋白和高尔基体酶蛋白之间必须发生相互作用，但最终它们会按照各自的功能分开，发挥各自的作用。有很多试验手段，例如免疫电镜技术、荧光共振能量转移技术(FRET)等都已经被用来研究这种膜不均一性问题了。多色PALM技术(Multicolor PALM)为人们提供了一种新的手段用来观察膜蛋白集合、组织的过程，并且还能定量分析不同蛋白间的空间距离关系。因为有了PALM提供的单分子信息，人们就可以清楚地了解蛋白分子间的空间关系，甚至有可能计算出相隔某一距离的分子之间发生相互作用的可能性。这种方法除了用于研究膜蛋白之外，还能用于许多非随机分布的生物系统研究，例如研究微管上的马达蛋白。　　SR成像技术还能用于在单分子水平研究蛋白动态组装过程　　细胞对外界刺激信号的反应起始于胞膜，在胞膜上受体蛋白之间发生动态的集合，用来调节细胞的反应活性。像HIV这种有被膜病毒也是在细胞膜上完成病毒颗粒组装过程的病毒，也是利用了细胞的物质转运机制。尽管现在蛋白组装的物理模型还远远没有完成，但研究人员知道膜蛋白的动态组装过程是不均一的，所以通常使用荧光试验手段很难获得分子水平上的信息。同样，单分子测量技术(Single molecule measurements)也存在着类似的局限，因为单分子测量技术只能观察细胞内的几个分子，所以缺乏整体的信息。因此由于缺乏空间分辨率，很难动态地研究蛋白质组装过程。SR荧光成像技术与活细胞成像技术和单分子示踪技术(sptPALM)结合就能解决这一问题。我们可以借助分子密度准确地看出PALM图像中的蛋白质簇，蛋白质簇动态的统计数据和形态学数据能帮助我们了解蛋白质动态组装的机制。　　上面只是选了生物学研究中的3个方面来说明SR技术的用途，但这已经很好的展示了我们是如何从Leeuwenhoek最初对于生命组成的假设一步一步走到了今天，使用SR显微镜来证实构成生命体的最基本材料&mdash &mdash 分子的组合过程。STED和PALM的商业化产品已经上市了，这标志着SR显微镜的时代来临了。我们相信SR显微镜在充满创造力的生物学家们手中，一定会充分发挥它的作用，帮助我们发现更多生命的奥秘。　　原文检索：　　Jennifer Lippincott-Schwartz & Suliana Manley. Putting super-resolution fluorescence microscopy to work. Nature Methods, 17 December 2008 doi:10.1038/nmeth.f.233

p style="margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em "使用显微镜，是为了实现人力所不能及的事情。显微镜一直是生物学家从事研究工作、探寻生命奥秘必不可少的利器。为了看到更精细的生命体精细结构，研究人员对显微镜技术更高分辨率的追求从未停止。/pp style="margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em "早在19世纪初，John Herschel和George Airy分别提出，点光源通过理想透镜成像时，由于衍射而在焦点处形成的光斑。这种中央明亮、周围有一组较弱的明暗相间同心环状条纹的光斑，在第一暗环以内的的中央亮斑称作艾里斑，在数学中通常用点扩散函数PSF来表示sup[1,2]/sup。如图所示，当两点之间的距离大于埃里斑时，才能被解析出来，可以被解析的最小距离即为分辨率。/pp style="margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em "德国物理学家Ernst Abbe在此基础上提出了分辨率的解析方程Angular Resolusion，可以用来描述人眼、相机、物镜等一系列成像设备的解析能力。他将这个假说应用的物镜上第一次提出了物镜的数值孔径（NA）的概念，并在1873年提出了决定物镜分辨率的方程sup[3]/sup。1896年，Lord Rayleigh对这个方程做了z轴的测算sup[4]/sup。具体如下：/pp style="margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em "其中d代表分辨率，表示可以解析的两点之间最小距离；λ代表入射光波长；NA即为数值孔径，由光的最大入射夹角决定。/pp style="margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 0em text-align: center " img style="max-width: 100% max-height: 100% width: 450px height: 314px " src="https://img1.17img.cn/17img/images/202007/uepic/f54bf352-44d0-429f-b2b1-df42d4702fbf.jpg" title="图片1.png" alt="图片1.png" width="450" height="314" border="0" vspace="0"//pp style="margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 0em text-align: center "图1：（a）埃里斑示意图，中央明亮、周围有一组较弱的明暗相间同心环状条纹的光斑。（b）可以解析的两个相邻埃里斑。（c）无法解析的两个相邻埃里斑。（图片来源于网络）/pp style="margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em "因此，20世纪的显微镜生产商们主要通过提高物镜的数值孔径来提高物镜的分辨率。span style="text-indent: 2em "但是，由于衍射的存在数值孔径的提高是有极限的，衍射极限限制了系统的分辨率。/span/pp style="margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em "span style="color: rgb(192, 0, 0) "strong极限是用来打破的/strong/span/pp style="margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em "几十年以来，研究者们采取了不同策略进一步了提高显微镜的分辨率。 有一些尽在衍射极限之外适度地提高了分辨率，比如共聚焦成像时采用更小的针孔大小、借助于反卷积或者神经网络算法sup[5,6]/sup、4Pi显微镜sup[7]/sup和结构光照明显微镜技术sup[8]/sup等等，这些技术不需要特殊制样，分辨率提升一般在2倍左右（100-150nm）。除此之外，还有另外两种被称为Nanoscopy的超高显微技术：一类是采用受激辐射或其他方法对发射光PSF进行擦除的确定性超高分辨率显微镜，如STED、GSD、RESOLFT和SSIM等sup[9,10]/sup；另一类是基于荧光分子随机定位的超分辨技术，使得相邻的荧光分子在不同时间发光，从而将它们分辨开来，如STORM、PALM、PAINT、dSTORM等等sup[11,12]/sup。这两类技术都可以将显微镜的成像分辨率推进到100nm以内，相较于荧光分子定位技术而言，第一类技术对生物制样要求相对容易，因此在常规生物实验室研究中应用更加广泛。/pp style="margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em "span style="color: rgb(192, 0, 0) "strong常用商业化超高显微技术/strong/span/pp style="margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em "随着技术的发展，硬件和软件都更趋于稳定，超高分辨显微技术也有了越来越多的商业化产品。由于成像技术和成像需求的多元化，根据成像需求和样品特点来选择合适的超高分辨率显微镜技术对用户来说相当重要。在此，我们针对几类常见超高分辨显微镜技术在生命科学领域中应用做简要介绍。/pp style="margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em "strong（1）反卷积计算技术/strong/pp style="margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em "这是一类最早走进生物学应用的超高分辨率技术，它主要基于图像计算。只要有光线传播就存在卷积现象，在光学成像过程中也是如此。一般来说显微镜成像中的信号模糊主要受卷积和噪音两方面因素影响。因此，采用适合的采样方式和去卷积算法可以很大程度上提高图像的分辨率和信噪比。这类技术对物镜的品质要求较高，需要物镜的PSF参数达到可以计算的标准才能有比较好的效果；另外，传统的去卷积技术也对成像的像素点密度有所要求，需要参考Nyquist定律来判断采样频率是否达到需求。/pp style="margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 0em text-align: center " /pp style="text-align: center"img style="max-width:100% max-height:100% " src="https://img1.17img.cn/17img/images/202007/uepic/f50ef5b2-747b-4812-a935-f525916de89f.jpg" title="图2.png" alt="图2.png"//pp style="margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 0em text-align: center "图2. （a）PSF在成像过程中的影响。（b）荧光显微镜图片去卷积前（右）和后（左）/pp style="margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 0em text-align: center "（图像来源于网站）/pp style="margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em "目前市场上此类产品主要分为两类，一类是反卷积显微镜，另一类是单独的反卷积软件。一般来说，反卷积显微镜是基于宽场荧光显微镜设计的自动化成像系统，综合考虑了特定物镜的PSF、采样频率和相对应的反卷积算法，因此成像速度快、操作简单。而单独的去卷积软件需要用户了解该图像处理方法对样品、物镜和采样方式的要求，并匹配合适的分析方法。虽然操作有一定的门槛，但是这类软件针对的显微镜种类较多，从荧光显微镜到共聚焦乃至超高分辨率显微镜都有相应的算法，一般成像技术都可以通过去卷积算法进一步提高分辨率。/pp style="margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em "strong（2）基于共聚焦的超高技术/strong/pp style="margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em "针孔（Phinhole）是激光共聚焦显微镜成像中的必要组件，在共聚焦成像中通过针孔来去掉焦平面以外的杂散光，从而实现层扫的效果。而针孔的大小除了影响层扫的厚度之外还影响成像的分辨率。当针孔缩小时，层扫厚度变薄、xy和z轴分辨率提高（PSF减小）、可检测的信号减少。我们可以使用较小的针孔大小（0.5AU）和去卷积技术结合得到分辨率和信噪比较高的图像。span style="text-align: center text-indent: 0em " /span/pp style="text-align: center"img style="max-width: 100% max-height: 100% width: 550px height: 473px " src="https://img1.17img.cn/17img/images/202007/uepic/6ba2022e-1146-4803-bb6b-fd8a05e3dd23.jpg" title="图片2.png" alt="图片2.png" width="550" height="473" border="0" vspace="0"//pp style="margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 0em text-align: center "图3. 共聚焦侧向分辨率与针孔大小的关系。在针孔小于1AU的情况下，针孔越小分辨率越高。（图片来源于网络）/pp style="margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em "由于上述方法在实际使用时会大大降低光效率，无法对较弱信号实现超高分辨率成像。近几年来，基于这种分辨率提高方式也有两类商业化产品推出，一是基于阵列检测器的Airyscan技术，它利用带有32 个同心排列的检测元件一次性采集1.25 AU的信号。单个检测元件可以检测0.2AU左右的信号，在针孔变小和点结构光运算的基础上，成像分辨率和灵敏度都得到了明显地提高。另一种是基于转盘共聚焦的超高成像技术，以yokogawa的为例，这种技术并通过光学变倍达到针孔信号扩束的效果并采用点结构光运算，提高分辨率。/pp style="text-align: center"img style="max-width:100% max-height:100% " src="https://img1.17img.cn/17img/images/202007/uepic/b38871c2-288c-4a52-9dfb-268d2f546adf.jpg" title="图片3.png" alt="图片3.png"//ppbr//pp style="margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-align: center text-indent: 0em "图4. （a）Airyscan检测器示意图[13]。（b）Sora转盘共聚焦示意图。br/（右图来源于网络）/pp style="margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em "这两种技术总体上来说分辨率相当，在120-150nm左右，去卷积处理后都可以进一步改善图像分辨率和信噪比；相较而言，Airyscan对弱信号更加灵敏，而基于Sora等技术的成像速度更快。/pp style="margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em "strong（3）基于结构光照明的超高技术/strong/pp style="margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em "1995年，早在SIM的概念提出之前，Guerra便通过光栅旋转的方式得到了更高分辨率的图像，随后的研究发现通过类似照明手段和傅立叶变换的方法可以收集到观察区域外的频域信号从而能够重构出更高分辨率的图像。这种光学成像技术近年来发展迅速，目前已经有更多的照明方式和相应算法出现，而这种成像方式也融合到多种成像技术中用以提高成像的效果，可以提高荧光显微镜、全内反射显微镜、光片显微镜等成像技术的分辨率。span style="text-align: center text-indent: 0em " /span/pp style="text-align: center"img style="max-width: 100% max-height: 100% width: 550px height: 257px " src="https://img1.17img.cn/17img/images/202007/uepic/7109771f-658b-4344-8c6b-c0cd3f924fea.jpg" title="图片4.png" alt="图片4.png" width="550" height="257" border="0" vspace="0"//pp style="margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 0em text-align: center "图5. 光栅式结构光照明荧光显微镜技术重构示意图。（a）宽场荧光显微镜成像结果。（b）结构光照明成像结果，箭头部分指的是高频信息。（c）经过获取不同格栅位置的图像计算得出七个不同组分的高频信息。（d）将七组分拟合得到包含高频信息的高分辨率图像。（图像来源于网络）/pp style="margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em "目前商用的SIM技术主要集中在荧光显微镜和全内反射显微镜，分辨率为100-120nm之间，对样品折射率和样品厚度有一定的要求，广泛应用于活细胞成像中。/pp style="margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em "strong（4）基于受激辐射损耗的超高技术/strong/pp style="margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em "除了前面提到的缩小针孔之外，使用受激辐射的方法将埃里斑变小也可以进一步地提高分辨率，这种方法也被称为受激发射损耗（STimulated Emission Depletion，STED）显微镜。受激辐射，即处于激发态的发光原子在恰好是原子两能级能量差的外来辐射场的作用下，发出与外来光子的频率、位相、传播方向以及偏振状态全相同的光子的现象。由于这种现象造成原荧光发射波段信号被擦除的效果，甜甜圈形状的同心圆受激辐射光使得荧光光斑变小，从而进一步得提高了分辨率。/pp style="text-align: center"img style="max-width: 100% max-height: 100% width: 550px height: 179px " src="https://img1.17img.cn/17img/images/202007/uepic/a73facd6-7365-4a21-850a-29e376cf2f9a.jpg" title="图片5.png" alt="图片5.png" width="550" height="179" border="0" vspace="0"/span style="text-indent: 0em " /span/pp style="margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 0em text-align: center "图6. STED成像方式示意图。（a）STED成像中用于激发光的光斑。（b）STED成像中用于受激辐射的光斑。（c）实际成像过程中的光斑。（图像来源于网络）/pp style="margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em "十几年以来，这种成像技术发展迅速，cwSTED、gated STED、3d STED、MINFLUX等技术的出现，使得STED成像光漂白更小、3D成像效果更好也更加易用。相较于Airyscan和Sora技术，STED样品的优化对于成像效果影响明显。结合去卷积算法，一般生物组织样品的分辨率可以达到40-60nm。但是，STED样品经常需要对荧光探针和制样方法进行优化，尤其在进行多通道成像和Z-stack成像时。/pp style="margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em "span style="color: rgb(192, 0, 0) "strong结语/strong/span/pp style="margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em "结合平时的应用，针对生物组织样品成像中常见的几种商业化超高分辨率技术做了简要综述。超高分辨率技术发展迅速、种类繁多，每一种超高成像技术都有明显的优势和短板，因此针对不同的应用目的做出相应的选择对于用户而言非常重要[14]。希望此次分享，能够为其他用户提供参考。/pp style="margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em "strongspan style="font-size: 14px font-family: 宋体, SimSun "参考文献：/span/strong/pp style="margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em "span style="font-size: 14px font-family: 宋体, SimSun "[1] Herschel, J. F. W. (1828). Treatises on physical astronomy, light and sound contributed to the Encyclopaedia metropolitana. R. Griffin./span/pp style="margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em "span style="font-size: 14px font-family: 宋体, SimSun "[2] Airy, G. B. (1835). On the diffraction of an object-glass with circular aperture. TCaPS, 5, 283./span/pp style="margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em "span style="font-size: 14px font-family: 宋体, SimSun "[3] Abbe, E. (1873). Beiträ ge zur Theorie des Mikroskops und der mikroskopischen Wahrnehmung. Archiv fü r mikroskopische Anatomie, 9(1), 413-468./span/pp style="margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em "span style="font-size: 14px font-family: 宋体, SimSun "[4] Rayleigh, L. (1896). L. Theoretical considerations respecting the separation of gases by diffusion and similar processes. The London, Edinburgh, and Dublin Philosophical Magazine and Journal of Science, 42(259), 493-498./span/pp style="margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em "span style="font-size: 14px font-family: 宋体, SimSun "[5] McNally, J. G., Karpova, T., Cooper, J., & Conchello, J. A. (1999). Three-dimensional imaging by deconvolution microscopy. Methods, 19(3), 373-385./span/pp style="margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em "span style="font-size: 14px font-family: 宋体, SimSun "[6] Wang, H., Rivenson, Y., Jin, Y., Wei, Z., Gao, R., Gü nayd?n, H., ... & Ozcan, A. (2019). Deep learning enables cross-modality super-resolution in fluorescence microscopy. Nature methods, 16(1), 103-110./span/pp style="margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em "span style="font-size: 14px font-family: 宋体, SimSun "[7] Egner, A., Verrier, S., Goroshkov, A., Sö ling, H. D., & Hell, S. W. (2004). 4Pi-microscopy of the Golgi apparatus in live mammalian cells. Journal of structural biology, 147(1), 70-76./span/pp style="margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em "span style="font-size: 14px font-family: 宋体, SimSun "[8] Gustafsson, M. G. (2000). Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of microscopy, 198(2), 82-87./span/pp style="margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em "span style="font-size: 14px font-family: 宋体, SimSun "[9] Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., & Hell, S. W. (2006). STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis. Nature, 440(7086), 935-939./span/pp style="margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em "span style="font-size: 14px font-family: 宋体, SimSun "[10] Xue, Y., & So, P. T. (2018). Three-dimensional super-resolution high-throughput imaging by structured illumination STED microscopy. Optics express, 26(16), 20920-20928./span/pp style="margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em "span style="font-size: 14px font-family: 宋体, SimSun "[11] Rust, M. J., Bates, M., & Zhuang, X. (2006). Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature methods, 3(10), 793-796./span/pp style="margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em "span style="font-size: 14px font-family: 宋体, SimSun "[12] Betzig, E., Patterson, G. H., Sougrat, R., Lindwasser, O. W., Olenych, S., Bonifacino, J. S., ... & Hess, H. F. (2006). Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science, 313(5793), 1642-1645./span/pp style="margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em "span style="font-size: 14px font-family: 宋体, SimSun "[13] Huff, J. (2015). The Airyscan detector from ZEISS: confocal imaging with improved signal-to-noise ratio and super-resolution. Nature methods, 12(12), i-ii./span/pp style="margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em "span style="font-size: 14px font-family: 宋体, SimSun "[14] Schermelleh, L., Ferrand, A., Huser, T., Eggeling, C., Sauer, M., Biehlmaier, O., & Drummen, G. P. (2019). Super-resolution microscopy demystified. Nature cell biology, 21(1), 72-84./span/pp style="margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 0em text-align: right "作者：李晓明 上海科技大学生命科学分子影像平台/ppbr//p

项目编号：3109-234Z20233006 （项目编号：Z20230363）项目名称：同济大学高分辨率三合一质谱系统采购项目预算金额：880.0000000 万元（人民币）最高限价（如有）：880.0000000 万元（人民币）采购需求：序号产品名称数量简要技术规格1高分辨率三合一质谱系统 1套1. 流量范围：最高可达8mL/min或更高；2. *压力范围：最高可达13,000psi或更高；3. 流量准确度：±0.1%或更优；4. 流量精度：不高于0.05% RSD5. 溶剂通道数：≥6通道（详见采购需求）合同履行期限：合同签订后6个月交货。本项目( 不接受 )联合体投标。获取招标文件时间：2023年02月20日 至 2023年02月27日，每天上午9:00至11:00，下午13:00至16:00。（北京时间，法定节假日除外）地点：上海政采项目管理有限公司（上海市静安区天目中路380号11楼）方式：现场或邮件获取售价：￥500.0 元，本公告包含的招标文件售价总和对本次招标提出询问，请按以下方式联系。1.采购人信息名称：同济大学地址：中国上海四平路1239号联系方式：段老师 86-21-659826702.采购代理机构信息名称：上海政采项目管理有限公司地址：上海市静安区天目中路380号11楼联系方式：戴小军、朱逸元8621-620912733.项目联系方式项目联系人：戴小军电话：8621-62091273

4月末，通用电气医疗集团(GE Healthcare)签署了一项协议，收购细胞成像产品制造商Applied Precision，具体收购金额不详。随着这次收购行动，GE Healthcare有望进入快速增长的细胞成像领域。 　　总部位于华盛顿西雅图郊外的Applied Precision开发并制造高分辨率以及超高分辨率的显微镜仪器，让研究人员能够以其他类型显微镜无法实现的规模来研究细胞过程。 　　一般显微镜所拥有的分辨率能让研究人员观察到200 nm及以上的物体。因此，对于大小在10 nm左右的胰岛素，一般的显微镜是无法看到的。然而，有了超高分辨率显微镜，研究人员就能看到。电镜的分辨率与超高分辨率显微镜相似，但它们不能活体观察细胞，而后者能做到。 　　GE Healthcare负责细胞技术的总经理Amr Abid向国外媒体透露，通过在此水平研究细胞功能，研究人员能够对功能异常细胞的机制有了更深入的了解。他举了一些例子，比如利用超高分辨率显微镜来研究HIV病毒如何穿透细胞，这为新药开发提供了信息。 　　几个世纪以来，科学家们都是利用光学显微镜对肉眼无法看到的结构进行观测，目前光学显微镜已经成为了实验室必备的实验器材之一，但是随着研究的深入，光学显微镜的分辨率已经无法达到科学家们的要求了。2008年，《Nature》杂志将超高分辨率显微技术评为年度技术。 　　Abid估计，如今整个显微镜市场大概在20亿-30亿美元。其中，超高分辨率显微镜占了约20%。Applied Precision和徕卡(Leica)是硬件方面的行业领先者，他们各自的市场份额大约为30%-35%。 　　GE目前不提供超高分辨率显微镜，也不曾开发它们。Applied Precision的产品是对GE细胞分析产品线的很好补充。GE也在探索一些方法，将其现有的细胞研究技术与Applied Precision的仪器捆绑起来。 　　目前，GE在细胞成像方面的旗舰产品是2009年上市的IN Cell平台。IN Cell Analyzer平台提供了一整套从自动化图像获取到数据的定量和深度分析以及可视化的强大工具，来协助整个高内涵分析过程。前不久，GE推出了最新版本的分析平台&mdash &mdash IN Cell 6000。 　　据Abid透露，由于Applied Precision在高分辨率以及超高分辨率显微镜方面声名卓著，故GE打算保留其名称。该公司还计划保留全部130名员工，并在技术上继续投资。GE还打算加大力度提高Applied Precision在亚太地区(如中国、印度和日本)的知名度，对于超高分辨率显微镜而言，这些区域是一个增长点，然而，Applied Precision目前的份额还很有限。 关于通用电气（中国）医疗集团生命科学部 GE Healthcare Life Science隶属于通用电气医疗集团，我们的产品和技术主要应用于基因科学、蛋白质科学、药物开发研究、以及生物制药、诊断、法医和环保等行业。 我们为制药公司提供完整解决方案，以减少新药筛选和开发的时间和费用，迅速、简单地将研究成果转为规模化生产，并更好地从药物开发候选方案中选择开发出有效、安全药物的方案，更快地研制新药，为医药研发领域的重大突破铺平道路。我们的Biacore和Microcal非标记分子相互作用分析系统是生物分子间相互作用、动力学和热力学研究的标准方法。我们的AKTA系统是专为生物分子纯化而设计的平台，集成了液相层析系统、软件和预装柱；市场上90% 以上FDA批准的生物药正是使用基于相同设计理念的可放大平台AKTAProcess系统和填料进行生物药物分子的提纯。我们的Whatman品牌提供在全球享有盛誉的过滤产品和技术，为分析领域、医疗保健和生物科学市场提供全新的解决方案。 欲了解更多有关GE医疗集团生命科学部的信息，请访问公司网站www.gelifesciences.com.cn，或垂询800-810-9118。

一、项目基本情况项目编号：310000000231018136459-00044392项目名称：上海科技大学磁-惯性约束聚变能源系统关键物理技术项目购高分辨率光谱仪1预算编号： 0023-J00046862 预算金额（元）： 8600000元（国库资金：8600000元；自筹资金：0元）最高限价（元）： 无 采购需求： 包名称：磁-惯性约束聚变能源系统关键物理技术项目购高分辨率光谱仪1 数量：4 预算金额（元）：8600000.00 简要规格描述或项目基本概况介绍、用途：上海科技大学磁-惯性约束聚变能源系统关键物理技术项目购高分辨率光谱仪4套及相关售后服务，交货期：合同签订后6个月内交付；质保期：不少于一年 合同履约期限： 合同签订后至合同规定内容全部完成 本项目（ 否 ）接受联合体投标。二、获取招标文件时间：2023年11月23日至2023年11月30日，每天上午00:00:00-12:00:00，下午12:00:00-23:59:59（北京时间，法定节假日除外）地点：上海市政府采购网方式： 网上获取 售价（元）： 0 三、对本次采购提出询问，请按以下方式联系1.采购人信息名 称：上海科技大学地 址：华夏中路393号联系方式：021-206851792.采购代理机构信息名 称：上海健生教育配置招标有限公司地 址：上海市瞿溪路350号1楼联系方式：53087656-1053.项目联系方式项目联系人：余大为电 话：53087656-105

能源部TEAM 计划目标于直接观察0.5 埃尺度 [2004 年11 月29 日] FEI 公司(NASDAQ:FEIC)宣布，联合承担TEAM 计划的几家实验室，已选择FEI 公司作为建造世界上最高分辨率(扫描)透射电子显微镜的研发合作伙伴。TEAM 计划是由美国能源部基础能源科学司投资数千万美元资助的显微学项目。该项目将促成一台新型显微镜的诞生。这台能在前所未有的0.5 埃分辨率下直接观察和分析纳米结构的显微镜，必将创造卓越的新科学良机。0.5 埃大约是碳原子尺寸的三分之一，也是原子尺度研究的一个关键尺寸。 在此项独一无二的计划中，电子显微学领域颇有建树的五家主要实验室(阿贡国家实验室，Brookhaven 国家实验室，劳伦斯伯克力国家实验室，橡树岭国家实验室，Frederick Seitz 材料研究室)通力合作，并筛选出FEI 公司为研发伙伴。每家实验室分别在这项雄心勃勃的使命中担当不同的角色，以期实现(甚至在三维空间)直接观察原子尺度的有序度、电子结构、单体纳米结构的动态。提议中的电子显微镜，自成一小型材料科学实验室，可进行实时的分析和特征描述，以促进独特的多学科交叉研究。 像差矫正电子显微技术将是TEAM 显微镜的核心。为达到0.5 埃分辨率而需要的更密集、更明亮的电子束，也会导致更强的样品信息、更高的图像衬度、更灵敏的分析本领以及史无前例的空间分辨率。成功开发新型像差矫正器将展现最基本的原子世界景观。矫正器的设计和开发，将与CEOS 公司(FEI 公司在尖端矫正器技术上的协作单位)合作完成。 “TEAM 协作团体考察了FEI 公司，以及公司的发展规划和在尖端电子光学上的历史记录，得出结论该公司是促成这项热望中的计划成功的最佳伙伴。”TEAM 科学总监暨伯克力国家电镜中心主任Uli Dahmen 指出：“FEI 公司全新的矫正器专用平台，因为能满足像差矫正仪器严格的稳定性要求，是TEAM 显微镜的最可行的出发点。有FEI 公司作为合作伙伴，我们有信心实现TEAM 计划的挑战性目标。” “我们对被有威望和有国际声誉的TEAM 计划选中而感到自豪，” FEI 公司董事长、总裁兼执行总监Vahé Sarkissian 说：“这将给我们机会以提升我们的电子光学才能，保持在高分辨成像和分析领域的世界领先地位，保持纳米技术时代的重要设备厂商地位。FEI 公司承诺：通过与TEAM计划等的合作，与CEOS 公司的联系，我们将竭尽全力完成任务。” “我们十分自豪，TEAM 计划首肯了我们常规推广的、用于超高分辨率的300 千伏(扫描)透射专用矫正电镜。” FEI 公司(扫描)透射电镜事业部副总裁George Scholes 说。“几年来我们致力于开发具有前所未闻的可靠性和不可比拟的重复性的系统。在此过程中，我们认真听取了TEAM伙伴和其它(扫描)透射电镜科学泰斗的建议。”他补充道：“我们深感激动，将要出台的新矫正器专用平台就已被TEAM 选中。我们坚信，我们的努力将重建纳米尺度研究、发现、开发的准则。” 科研人员和工业界用户的最大收益之一，是新平台所提供的极为重要的变通性，以适应于今后的部件升级发展。将来FEI 公司和TEAM 计划所做的(扫描)透射电镜技术革新，能在这一系统上进行翻新改造。 “成功制做了200 千伏透射和扫描透射电镜的球差矫正器之后，我们很高兴被选中为TEAM计划300 千伏球差/色差矫正器的开发伙伴。” 位于德国海德堡的CEOS 公司的创办人之一Max Haider 博士说：“我们自信我们今天在FEI 公司超稳定平台上所做的工作，必将为科学家们提供新的装备，以迎接前沿开发和研究的挑战。” 关于FEI 公司： FEI 公司服务于纳米技术的装备，以聚焦离子束和电子束技术为特色，提供最高分辨率小于1 埃的3D 特征描述、分析及修改功能。公司在北美和欧洲拥有研究开发中心，在全球四十多个国家经营销售和提供维修服务。FEI 公司将纳米尺度呈献给研究人员和生产厂商，协助将本世纪一些最杰出的理念变成现实。更多的信息可在FEI 公司网页上找到：http://www.feicompany.com 关于TEAM 计划： 能源部电子束微特征描述中心提议，引导开发尖端像差矫正电子显微镜，提供必要的基础设施，使该设备能广泛地被科学界用户利用。五家在电子显微学卓有成绩的单位阿贡、Brookhaven、橡树岭、劳伦斯伯克力国家实验室、Frederick Seitz 材料研究室，将联手在国家电镜中心(运作于劳伦斯伯克力国家实验室)建造第一台TEAM电镜。更多信息，请访问： http://ncem.lbl.gov/team3.htm 和http://www.anl.gov/Media_Center/News/2004/MSD041112.html 关于CEOS公司： CEOS公司(Corrected Electron Optical Systems或矫正电子光学系统)是带电粒子透镜像差矫正器的代表。由M. Haider博士和J. Zach博士八年前在德国海德堡成立的公司，专门从事高尖端电子光学部件的研究和开发。更多信息见： http://www.ceos-gmbh.de 此新闻发布具有瞻前性的陈述，对预期产品的论述。影响到这些超前性陈述的可能因素包括(并不局限于项目的改变和取消)：FEI 公司、供应商或项目伙伴在实现项目预期计划上的技术能力局限性；执行中产生的延迟因素或与预期结果相异的结论；意料之外的技术需求；主要供应商或项目伙伴破产。欲了解这些或其它有可能造成与预期目标不符的因素，请参阅10-K 和10-Q 表格，以及美国证券交易委员会的文件。FEI 公司将不予进一步陈述。 中文版译注： 1. TEAM为Transmission Electron Aberration-corrected Microscope 的字头缩写，意为透射电子像差矫正显微镜。 2. (扫描)透射电子显微镜的英文原文是scanning/transmission electron microscope 或(S)TEM，意为带有或不带有扫描透射功能的透射电子显微镜。 3. 任何中文版疑义，以英文版为准。

近期，中国科学院半导体研究所研发的“水睛”水下高分辨率环视摄像机完成了针对水下礁盘的摸底海试工作。海洋观测是开发海洋资源、保护海洋生态的关键技术，受到全球的关注，但是目前海洋生物群落及环境变化监测技术仍无法满足海洋大时空数据获取的需求，特别是深海。光学成像技术可提供高分辨率、符合人眼视觉特征的图像，但是在保障高分辨率的前提下存在视场小的问题，难以实现大范围的海底详查的需求。针对此种情况，半导体所周燕、王新伟及其科研团队研制了水下高分辨率环视摄像机“水睛”，可实现水下高分辨率大视角的光学成像，具备180°下视走航观测和360°原位环视观测两种模式（图1）。本次海试中，“水睛”搭载半导体所海面移动光学试验平台“冲浪者”号（图2），在约1000平方米海域进行了水下高分辨观测，完成了海上走航式观测、定点原位观测等摸底性观测试验，验证了设备具备5900万像素下良好的实时彩色成像功能。图1 水下环视摄像机的下视及环视工作模式（上图下视模式，下图环视模式）图2 搭载冲浪者号走航式观测过程中的“水睛”摄像机此次海试，研究人员利用水下摄像机多次完成了礁盘生态系统的观测，拍摄了大量的珊瑚、海星、贝类、鱼类等，形成了水下光学彩色图像库（图3），可用于海洋光学图像处理、目标识别等算法研究。图3海域美丽的珊瑚、鱼类、海星、砗磲等除珊瑚及鱼类等生物要素外，本次海试中，在海底还发现了生物附着的碗和盘子各一只（图4）。图4 生物附着的盘子和碗此次海试由半导体所和南开大学共同组织完成，除“水睛”摄像机外，还利用多参量海洋水体测量系统完成了海洋温盐深、核素、水体光学衰减系数等海洋水体多物理化学参量采集。相关工作得到了南方海洋实验室、中科院青促会项目的经费支持。 图5 项目团队及设备在海试现场