高分辨率荧光成像仪

像素并不一定越高越好在几乎所有类型的成像产品中，一个很重要的因素就是分辨率。很多人觉得，分辨率越高，成像效果越好，但在某些石油和天然气成像应用场合，选择并不是黑白分明，非此即彼。在选择光学气体成像(OGI)热像仪时，选择较低分辨率成像仪可能实现的性能更佳，效果更好。今天，小菲就来告诉你这是为什么！规格并不说明全部问题石油和天然气运营商使用的许多设备都是在仅关注规格的情况下购买的，其中分辨率被认为是最重要的规格之一（即便不是最重要的）。虽然这种购买方法效率高，极具成本效益，但也很危险，因为FLIR OGI热成像仪的用户可能更关注那些在具体应用环境中对设备性能并不重要的规格。所谓的高规格就是：在字面上看起来很吸引人的规格，而功能则完全不同。功能取决于具体的环境，最主要的是应用领域和预算。分辨率是本次讨论的核心。供应商可能会声称“我们的成像仪分辨率为X，而我们的竞争产品成像仪分辨率则较低。分辨率越高越好，所以我们的产品更具吸引力。” 这种说法是有道理的，它很容易理解，而且几乎被普遍接受。此外，在选择红外(IR)成像仪（非OGI）时，分辨率历来是需要考虑的重要规格。但更高的分辨率并不总是正确的选择。选择成像仪的重要参数OGI成像仪在红外波段工作。因此，很容易陷入过于简单化的选择，因为在大多数红外应用中，为成像仪增加像素会使其表现“更好”，因为您会获得更小的光斑大小比（可测量面积）以获得更精确的测量，并改善图像质量（通过更高分辨率）。但是，有效的光学气体成像（OGI）取决于红外分辨率和气体灵敏度。灵敏度是通过噪音等效浓度长度(NECL)来衡量的，该标准衡量热像仪经过一段特定长度的路径能检测到的在热像仪固有机器噪音之上的气体量大小。想要更好地理解这两个特性如何相互作用，以下几个因素是关键，当然它们本身就是购买成像仪时的重要考量参数：★ 像素大小★ 像素间距★ 热灵敏度★ 气体吸收性1像素大小对于OGI来说，分辨率和NECL不是线性的。事实上，它们是反向关系。如前所述，在非OGI红外成像仪应用中，分辨率越高，成像仪的辐射测量诊断能力越强（即通过解读到达成像仪的红外信号强度，测量目标的表面温度）。随着像素变小，而要测量的对象保持相同的大小，您就会在待测目标上获得更多像素，提高测量的准确性。在同一个管线中，考虑温度测量与OGI：在图1中可以看出，当分辨率较高/像素较小时，单个像素中出现更多的“白色”。如果您对该像素（即颜色）的所有区域进行平均，像素中的白色越多，温度（强度）读数就越准确。这是一个高分辨率具有优势的情况。在OGI应用中，一般希望有更高的分辨率，以寻求更大的泄漏定义（允许标识出更多泄漏细节）或试图定义小的泄漏点。NO.2像素间距相反，在气体检测中，用户通常不关心像素与视野中物体相比的“大小”。气体检测更关心的是到达一个像素的能量数值；您会希望有尽可能多的能量到达该像素。当您向焦平面阵列(FPA)添加更多分辨率（更多像素）时，每个像素的大小（以微米为单位测量，称为“像素间距”，或从一个像素中心到下一个像素中心的空间）通常会变小，以使整个检测器的大小更小。这减少了每个像素所能收集的“能量”数值，使成像仪不太灵敏。一般来说，这两个参数表现相反（如分辨率上升，灵敏度下降）。因此，对于OGI来说，较大像素间距更为理想，因为相比之下它的单个像素能捕获更多的能量。例如，在FLIR制冷型OGI成像仪中，FLIR GFx320成像仪的像素间距为30µm，而FLIR GF620成像仪的像素间距为15µm，使得GFx320比GF620（15mK与20mK）略微敏感。就NECL而言，GF620检测到的甲烷NECL大约是GFx320检测到的两倍。虽然GF620的灵敏度仍然足以满足灵敏度水平的最严格要求，但并不是所有高分辨率OGI成像仪均属于此类情况。就“小泄漏”而言，GF620的高分辨率（640×480与320×240相比；见图2）可以提供一些优势。首先，您可以更清楚地看到泄漏的定义，并有可能了解泄漏的更多细节。您可以将此更高的分辨率因素与成像仪的数字缩放功能相结合，以查看到更清晰的图像，进而查看到更小的泄漏点。NO.3热灵敏度热灵敏度或噪音等效温差(NETD)描述了使用成像仪所能看到的最小温差。这个数字越低，表示红外系统的热灵敏度越好，这一测量通常是在30°C的工业标准温度下进行的。如果要测量的目标通常表现出很大的温度差异，可能不需要低NETD的成像仪。然而，对于更细微的应用，如检测湿度问题，建议提高灵敏度。在许多情况下，OGI只关注“是否有气体存在/泄漏？” 使得NETD的重要性没有像素间距大。NO.4气体吸收性在红外成像仪的光谱范围内，如果气体不吸收能量（无论是否过滤），成像仪都将无法看到气体。换句话说，如果要成像的气体不吸收成像仪光谱范围内的能量，那么红外成像仪的分辨率将不会影响成像仪看到气体的能力。此外，FLIR获得专利的高灵敏度模式(HSM)得到了更多像素的支持，这可能有助于检测较小的泄漏。这一基本的OGI属性因气体的不同而不同。吸收率可以用气体的响应系数(RF)来描述；数值越高，气体的成像效果越好。例如，对于制冷型成像仪而言，丙烷的RF值比甲烷高（约为三倍），因为在使用FLIR OGI红外成像仪观察碳氢化合物和VOCs泄漏时，丙烷在过滤红外光谱区域吸收更多的能量，如（图3）。OGI成像仪的意义虽然高分辨率成像可能不是所有OGI应用中最重要的因素，但它在其他方面可能非常有益。不论是出于常规维护还是遵从法规之目的，负责泄漏检测和维修(LDAR)或负责健康和安全监察(HSE)的员工，可能会经常被要求使用OGI成像仪来寻找需要维修的气体泄漏。利用FLIR成像仪，这些用户能够找到微小的泄漏点，并对已发现的泄漏点进行定性，同时在整个过程中保证人员安全。无论您的分辨率和NECL需求如何，FLIR都可提供相对应的OGI成像仪，以满足需求，包括专门用于检测碳氢化合物和VOCs气体的GFx320、GF320、GF300、G300a和GF620。你在忍受哪种气体泄漏的困扰？想知道你最适合哪款FLIR OGI热像仪？拥有OGI热像仪该如何充分利用？

近日，记者从中科院化学所获悉，该所胶体、界面与化学热力学重点实验室李峻柏课题组利用其开发的“超高分辨率荧光显微镜”，观测到生物矿化过程中参与结晶的蛋白质分布信息。论文在《德国应用化学》上刊发。　　“超高分辨率荧光显微镜”可以超越远场光学显微镜的分辨率极限，直接检测到几十纳米的精细结构。而与能达到相同或更高分辨率的X光显微镜、各类电子显微镜及原子力显微镜相比，超高分辨荧光成像能在常温常压和基本不损伤生物样本活性的条件下，获得其纳米尺度的图像信息。　　研究人员介绍，“超高分辨率荧光显微镜”又称为随机光学重建显微镜(STORM)，可达到或好于50纳米分辨率。在前期研究中，李峻柏课题组在超高分辨图像采集和数据分析方面发展了实时单分子定位的程序包SNSMIL，该程序包可广泛应用于高背景成像的数据分析。　　他们利用STORM观测到方解石中生物矿化过程中参与结晶的蛋白质分布信息，为研究蛋白质诱导生物矿化的机理提供了数据。

显微镜一直是生物学研究中的重要工具，随着技术的发展显微镜的分辨率在不断提高。最新的超高分辨率显微镜已经达到了超越衍射极限的分辨率。现在MIT的研究团队通过另一种巧妙的方式达到了同样的目的。　　研究人员并没有在显微镜上下功夫，而是从组织样本下手，利用一种吸水膨胀的聚合物将组织样本整体放大。这种方法非常简单成本也很低，能用普通共聚焦显微镜达到超越200nm的分辨率。这项发表在Science上的成果，能使更多科学家接触到超高分辨率成像。　　&ldquo 你在常规显微镜下就可以实现超高分辨率成像，不需要购买新设备，&rdquo 文章的资深作者，MIT的副教授Ed Boyden说，Fei Chen和Paul Tillberg是这篇文章的第一作者。　　物理放大　　衍射极限曾经是光学显微镜的最大障碍之一，使其分辨率无法突破200nm，然而这个尺度恰恰是生物学家最感兴趣的。为了克服这个问题，科学家们开发了超高分辨率显微技术，该技术获得了去年的诺贝尔化学奖。　　然而，超高分辨率显微镜最适合用于薄样本，成像大样本的时间比较长。&ldquo 如果想要分析大脑，或者理解肿瘤转移中的癌细胞，或者研究攻击自身的免疫细胞，你需要在高分辨率水平上观察大块的组织，&rdquo Boyden说。　　为了使组织样本更容易成像，研究人员使用了聚丙烯酸盐制成的凝胶，这是一种高度吸水的材料，通常用于尿不湿中。　　研究人员首先用抗体标记想要研究的细胞组分或蛋白，这种抗体不仅连有荧光染料，还能够将染料连到聚丙烯酸盐上。研究人员向样本添加聚丙烯酸盐并使其形成凝胶，然后消化掉起连接作用的蛋白，允许样本均匀膨胀。样本遇到无盐的水之后膨胀了100倍，但荧光标记在整个组织中的定位并没有改变。　　人们一般用普通共聚焦显微镜进行荧光成像，不过它的分辨率只能达到几百纳米。研究人员通过放大样本，用共聚焦显微镜达到了70nm的分辨率。&ldquo 这种膨胀显微技术能够很好的整合到实验室已有的显微系统中，&rdquo Chen补充道。　　大样本　　MIT的研究团队用这种膨胀显微技术，在常规共聚焦显微镜下成像了500× 200× 100微米的大脑组织切片。而其他超高分辨率技术难以成像这么大的样本。　　&ldquo 其他技术目前可以达到更高的分辨率，但使用起来比较难也比较慢，&rdquo Tillberg说。&ldquo 我们这个方法的优势在于，使用简单而且支持大样本。&rdquo 　　研究人员认为，这一技术对于研究大脑的神经连接非常有用。Boyden的团队将注意力放在大脑研究上，不过这一技术同样适用于肿瘤转移、肿瘤血管生成、自身免疫疾病等研究。

日前，中国科学院长春光学精密机械与物理研究所突破了航天高分辨率高光谱成像关键技术。该技术利用离轴三反非球面光学系统、复合棱镜分光、推扫成像 和指向镜运动补偿技术，有效解决了航天高光谱遥感中高空间分辨率、高光谱分辨率与图像高信噪比之间的矛盾，突破了视场分离、光谱分光、在轨光谱辐射定标等 关键技术瓶颈，为我国航天高分辨率高光谱成像技术的工程化奠定了技术基础。　　长春光机所研究员颜昌翔及其研究团队针对航天高光谱遥感领域的视场分离、光谱分光、图像信噪比、在轨光谱辐射定标等关键技术瓶颈提出了一系 列创新性的解决方法。研究团队采用离轴三反非球面光学系统、单晶硅无基底狭缝的视场分离器和复合棱镜分光加非球面准直成像光谱仪的技术方案，实现了全色、 可见近红外和短波红外三光路准确分离，保证了系统宽波长覆盖，并实现了高光谱和高空间分辨率、高信噪比，保证了光谱成像质量。该团队采用指向镜运动补偿方 案，建立了在轨实时计算指向镜运动补偿曲线的数学模型，实现了实时计算和控制，使探测器接收的光能量增加到4-6倍，显著提高了系统信噪比，解决了高光谱 和高空间分辨率成像的矛盾。同时，该研究团队还采用镀膜的钕镨玻璃加积分球的在轨定标技术，利用指向反射镜自准，实现了全光路光谱和辐射定标。该团队共发 表学术论文85篇，其中EI、SCI收录36篇，并有6项已授权国家发明专利。目前，该技术已获吉林省2013年度科技进步一等奖。　　利用此项技术成果研制的天宫一号高光谱成像仪，为我国首次自主获取航天高分辨率高光谱图像数据提供了技术支撑，填补了国内空白。天宫一号高 光谱成像仪已在轨稳定运行两年半，获取了大量高光谱图像数据，并已应用于油气勘探、矿物探测、林业调查、土地利用/覆盖变化、海岸带资源调查等领域，为国 民经济可持续健康发展规划提供了科学决策依据。　　据悉，此项技术已经在更高性能航天高光谱成像仪的研制工作中得到应用，必将在持续推进我国航天高光谱遥感技术的发展中起到其应有的作用。

超高分辨率荧光显微镜正在不断改变我们对细胞内部结构及运作的认识。不过在现阶段，显微镜技术还是存在着种种不足，如果人们希望显微镜能在生物研究领域发挥重要作用，就必须对其加以改进和提高。　　光学显微镜的出现及其影响　　自荷兰博物学家、显微镜创制者Antonie van Leeuwenhoek(1632-1723)在17世纪第一次将光线通过透镜聚焦制成光学显微镜并用它观察微生物(microorganisms or animalcule)以来，显微镜就一直是生物学家从事研究工作、探寻生命奥秘必不可少的利器。正是因为有了Leeuwenhoek的这项伟大发明及其后继者对显微镜技术的不断改进和发展，人们才能够对细胞内部错综复杂的亚细胞器等结构的形态有了初步的了解。　　此后，研究人员对显微镜技术的追求从未停歇过，他们总是希望能得到分辨率更高的显微镜，从而更好地观察细胞内部更细微的结构。最近，《自然-方法》(Nature Methods)杂志上报道的超高分辨率成像技术(super-resolution imaging, SR imaging)终于使得人们可以在单分子水平上进行观察研究。　　SR技术的发展过程　　在达到今天SR技术水平的过程中，承载了许许多多研究人员辛勤劳动的汗水，也面临着诸多亟待解决的难题。　　在以上这些光学SR成像技术中有两种技术&mdash &mdash 受激发射减损显微镜(stimulated emission depletion microscopy, STED)和饱和结构光学显微镜(saturated structured illumination microscopy，SSIM)最受关注。　　最近，基于探针SR成像技术的光敏定位显微镜(PALM)和随机光学重建显微镜(STORM)，以及借助荧光基团随机激活特性的荧光光敏定位显微镜(FPALM)都已经取得了成功。　　通过基于探针的SR成像技术，可以获得多张原始图像。在每一张原始图像中，细胞内只有一部分被荧光标记的分子能发出荧光，即这些荧光分子都处于不断激活和灭活的交替状态，每一次都只有部分分子能被观察并成像。而且由于每次发出荧光的分子都分散得较为稀疏，因此相互之间不会受到影响，也就避免了因相邻分子发出荧光而无法分辨的问题。最后将这些原始图片叠加、重合在一起就得到了最终的高分辨率图像。这样，就能使得那些以前由于荧光点太密以至于无法成像的结构的分辨率达到纳米级水平，而且成像的分子密度也相当高，可以达到105个分子/&mu m2。　　这种分辨率对于生物学家来说，意味着现在可以在分子水平上观察细胞内的结构及其动态过程了。　　虽然显微镜技术已经发展到了如此高度，但它仍然只是生物学家研究中使用的一种工具。因此还需要将显微镜获得的图像与其它的试验结果互相参照，才能获得准确的结果。人们需要认清SR显微镜的优势与劣势，为操作以及判断SR图像制定出标准化的操作规范，只有这样才能最大限度地发挥SR显微镜的作用。　　现在，由于人们对细胞内各组份的组织结构以及它们的动态变化过程都只有一个概念上的认识，因此，借助显微镜从纳米水平上对这些结构及过程进行真实的观察能让人们发现许多以往所不了解的东西。例如，以前人们通过电镜发现细胞骨架是由大量丝状网格样组织构成时，就有人对此现象持怀疑态度。那些认为细胞骨架是一种用来稀释细胞内生化物质浓汤这样一种结构的细胞生物学家把这种观测结果称作僵化的人为试验结果。　　除非最新的SR显微镜图像或者其它的试验结果都能证明细胞骨架是由大量的丝状网格样组织构成的，否则还会有人持上述的怀疑观点。不过已经有其它的生化试验结果证实了早期的电镜观察结果是正确的。当然新兴的SR技术也需要其它传统的生化试验结果予以佐证才有价值，同时还需要电镜的辅助。因为电镜能提供纳米级的观察结果，这对于佐证具有同样分辨率的SR显微镜观测结果来说是最有价值的。　　今后，大家在逐步了解、接受和广泛使用SR显微镜的同时，需要注意将会出现的各种问题，以下的表格列出了部分与SR显微镜使用相关的缺点及其目前的解决方法。　　最近几年，就如何处理图像已经有了非常严格的操作规范。不过迄今为止，对于怎么处理SR图像还没有一个标准的操作规范。尤其需要指出的是，PALM和STORM数据在某些重要因素上，graph方面的共性要多于image方面。在一张SR图像上，分子的不确定性和密度都能用颜色表示出来，这种图像把细胞内该分子有可能出现的任何地点都标示出来了。而且只有被标记的分子按照一定的标准(发出的光子数)判断它的确是一个单分子并且定位准确之后才显示出来。必须对获得的图像进行这样的标准化处理之后才能分析结果。同样，对于试验数据也需要如此进行标准化处理。要提高分辨率不仅需要分子定位、分布得比较好，还需要分子数目够多，以致能达到尼奎斯特判断法(Nyquist criterion)的要求，即分子间的平均距离要小于显微镜分辨率的一半。虽然上述问题都不会影响SR显微镜的应用，但由于存在这些问题，所以我们应该时刻提醒自己，一定要仔细判读、分析SR显微镜的图像结果，只有这样才能得到有价值的生物学结论。　　SR荧光显微镜在生物学研究中的应用　　到目前为止，人们还很难得知，SR荧光显微镜会对生物学界的哪一个领域带来重大变革，但已经有几个领域出现了明显的改变。这些研究领域是动态及静态的细胞组织结构研究领域、非均质分子组织研究领域、蛋白动态组装研究领域等。这几个领域都有一个共同的特点，那就是它们研究的重点都是分子间如何相互作用、组装形成复合物。因此，能在纳米水平观察这些分子对它们来说具有重大的意义。　　通过观察蛋白质之间的组合关系来了解它们的作用，并能为后续的细胞功能试验打下基础　　结构生物学研究在这方面已经取得了很大的进展，目前已经发现了4-8纳米大小的分子间相互作用组装成细胞微管、肌丝、中间丝这些超过10微米大小聚合物的机制。不过对于核孔复合体、中心体、着丝点、中间体、粘着斑这些由许多不同蛋白经过复杂的三维组装方式组合起来的复合体，还需要更好的办法来进行研究。目标就是要达到分子水平的分辨率，这样就可以观察大复合体形成过程中的单个分子，也就能对这些分子的化学计量学有所了解了。要得到更多的生物学信息就需要SR显微镜这样的三维成像技术，例如可以使用活体细胞SR成像捕捉细胞骨架的动态重构过程等等。　　SR成像有助于人们更好地了解分子间的差异　　细胞膜蛋白组织方式的经典模型已经从随机分布的液态镶嵌模型转变成了脂筏模型、穴样内陷模型或特殊蛋白模型。这种差异与细胞不同功能相关，例如在高尔基体、cargo蛋白和高尔基体酶蛋白之间必须发生相互作用，但最终它们会按照各自的功能分开，发挥各自的作用。有很多试验手段，例如免疫电镜技术、荧光共振能量转移技术(FRET)等都已经被用来研究这种膜不均一性问题了。多色PALM技术(Multicolor PALM)为人们提供了一种新的手段用来观察膜蛋白集合、组织的过程，并且还能定量分析不同蛋白间的空间距离关系。因为有了PALM提供的单分子信息，人们就可以清楚地了解蛋白分子间的空间关系，甚至有可能计算出相隔某一距离的分子之间发生相互作用的可能性。这种方法除了用于研究膜蛋白之外，还能用于许多非随机分布的生物系统研究，例如研究微管上的马达蛋白。　　SR成像技术还能用于在单分子水平研究蛋白动态组装过程　　细胞对外界刺激信号的反应起始于胞膜，在胞膜上受体蛋白之间发生动态的集合，用来调节细胞的反应活性。像HIV这种有被膜病毒也是在细胞膜上完成病毒颗粒组装过程的病毒，也是利用了细胞的物质转运机制。尽管现在蛋白组装的物理模型还远远没有完成，但研究人员知道膜蛋白的动态组装过程是不均一的，所以通常使用荧光试验手段很难获得分子水平上的信息。同样，单分子测量技术(Single molecule measurements)也存在着类似的局限，因为单分子测量技术只能观察细胞内的几个分子，所以缺乏整体的信息。因此由于缺乏空间分辨率，很难动态地研究蛋白质组装过程。SR荧光成像技术与活细胞成像技术和单分子示踪技术(sptPALM)结合就能解决这一问题。我们可以借助分子密度准确地看出PALM图像中的蛋白质簇，蛋白质簇动态的统计数据和形态学数据能帮助我们了解蛋白质动态组装的机制。　　上面只是选了生物学研究中的3个方面来说明SR技术的用途，但这已经很好的展示了我们是如何从Leeuwenhoek最初对于生命组成的假设一步一步走到了今天，使用SR显微镜来证实构成生命体的最基本材料&mdash &mdash 分子的组合过程。STED和PALM的商业化产品已经上市了，这标志着SR显微镜的时代来临了。我们相信SR显微镜在充满创造力的生物学家们手中，一定会充分发挥它的作用，帮助我们发现更多生命的奥秘。　　原文检索：　　Jennifer Lippincott-Schwartz & Suliana Manley. Putting super-resolution fluorescence microscopy to work. Nature Methods, 17 December 2008 doi:10.1038/nmeth.f.233

广州市明美光电技术有限公司创立于2003年，创始人张春旺曾就职于某国际知名显微镜企业，对于光学显微镜的技术和销售都有深刻的了解。怀揣让中国科学仪器自主化的理想，成立了明美光电，“明美”寓意科技让明天更美好。公司创立之初，主要生产显微镜相机和相关配件，这也是业内对明美光电的主要印象。如今，明美光电已是国家高新技术企业，专注于显微成像产品的研发、生产和销售，致力为显微领域的自动化、智能化、国产化贡献力量，曾获国家创新基金扶持，被认定为广东省显微成像工程技术研究中心。明美光电以成为中国显微成像行业领跑者为愿景，强调差异化竞争，聚焦在荧光成像为主的中高端范围。2009年以来，明美光电在国家资助支持下开始攻坚LED荧光显微镜，并在2010-2015年间连续获得高新技术企业认证，陆续推出旗下多款研究级荧光显微镜。本期“创新100 ”特别对话明美光电，带大家了解这家“潜心躬耕十余载，立志光大国产‘器’”的创新光学显微镜企业。张春旺 总经理 广州市明美光电技术有限公司仪器信息网：公司主推的产品及型号是什么，产品/技术可应用于哪些领域，有哪些典型用户，解决了什么样的实际问题？ 张春旺：明美光电聚焦在中高端的荧光显微镜领域，解决细胞生物学等生命科学研究以及FISH荧光原位杂交癌症检测等医疗领域的需要，同时还有应用于高校、疾控、养殖、金相、工业等领域的产品。比如:电动荧光显微镜MF53-N/MF43-N、研究级荧光显微镜MZX81/MF52-N，具有成像质量高、扩展性能强、简单易用的优势；还有数字切片扫描系统，既是研究级荧光显微镜，也是高速自动化切片扫描仪，一机两用，性能强大。数字切片扫描系统在显微镜配套的相机和光源领域，显微镜四大品牌的高端产品依然强势，但受限于成本，很多实验室还会选择一些中低端产品，使用效果或受到一定影响。明美光电的MSH12/MSX11/MSX2/MS60/MC50-S多款高性能CMOS显微镜相机，覆盖高像素和高灵敏度等不同应用需求，让客户以更低成本实现了理想的成像效果。如同田忌赛马，国产“上等马”对进口“中等马”，便可更胜一筹。MG-120/MG-100/MG-200多款LED显微镜光源，可以搭配徕卡DM2500等四大品牌显微镜，除了寿命可达传统汞灯等热光源的数十倍，还能做到即开即用、无需校准，可极大降低实验人员等待光源预热的几十分钟耗时，并显著降低实验室维护荧光显微镜带来的人力成本，对于客户来说极大提升了效率。四通道光源MG-120无论是荧光显微镜，还是相机和光源，明美光电在国内都有很多典型用户。华中科技大学同济医学院生殖健康研究所章慧平教授课题组所发表的论文“Cardiac developmental toxicity and transcriptome analyses of zebrafish(Danio rerio) embryos exposed to Mancozeb”，揭示了代森锌锰(MZ)暴露诱导斑马鱼心脏发育损伤的分子机制，该研究需要用到荧光体视显微镜看斑马鱼和荧光正置显微镜看斑马鱼切片，如果选择进口品牌，预算仅能够购买一台设备，而选择明美光电则可以两台设备备齐。最终课题组使用了明美光电的研究级正置荧光显微镜MF43-N和研究级荧光体视显微镜MZX81，并对明美光电LED荧光显微镜的易用性和荧光效果表示十分满意。此外，北京大学、清华大学、中国科学技术大学、中南大学、中国疾控病毒防控所、广药白云山制药总厂、南京航天科技研究所等都是明美光电的用户。仪器信息网：与国内外同类型产品相比，您认为公司的主要竞争优势有哪些，增长点在哪里？张春旺：明美光电的主要优势在于荧光成像领域，包括LED荧光显微镜、电动荧光显微镜、荧光光源、荧光附件和高灵敏度相机。明美光电已有非常深厚的积累，因而在产品适配度、方案整合度和使用体验等方面更有优势。比如数显荧光模块，我们已经做到了一个模块有三色甚至四色通道，模块自带屏幕显示波段和光强，自带切换机构和无级调节机构，无需外接控制箱和光源灯箱，而许多同行只能做到一个模块单色或者双色，甚至有些像传统荧光光源一样要外接控制箱。此外，明美光电还在电动化、智能化整合上进行创新，已有纳米级高精度XYZ三轴电动荧光显微镜和具备切片自动扫描功能的数字切片扫描系统，性能可比肩进口品牌，且具有更强的价格优势。除了产品实力，明美光电还具有企业实力。作为一家国家高新技术企业，公司连续11年获守合同重信用企业认证，已通过ISO9001管理体系认证，拥有近百个专利、软著，被认定为广东省显微成像工程技术研究中心。在全国20多个城市均设有服务网点，派驻专业工程师为客户提供完善服务，服务信得过。2021年，国家明确要求医院等机构在一定条件下须采购国产显微镜，这说明国产替代进口的进程已经拉开帷幕，未来还将加速，这对国产企业来说是重大的增长点和利好。未来，明美光电将继续强化LED荧光成像方面的优势，推出更加自动化、智能化的产品，以满足更多客户高端的荧光成像需求。如超高分辨率的成像，以往用户主要购买进口的共聚焦显微镜，未来或替换为明美光电新研发的新型超高分辨率荧光成像产品！仪器信息网：请介绍贵公司当前规模，研发人员和研发投入各有多少，与哪些单位之间有合作？张春旺：明美光电当前全职员工近百人，其中约1/4是研发人员，每年研发投入占年利润的30%以上，以MG-100等LED荧光光源产品类目为例，总研发投入已经达到百万级别。此外，我们还与华南师范大学、暨南大学等单位保持紧密合作，是华南师范大学光学工程合作的硕士联合培养基地、广州医科大学生物工程实习基地，联合研发新型超高分辨率显微镜等产品，目前已有成功的工程样机可以进行超高分辨率观察，产品还在完善中。仪器信息网：贵公司下一步在市场和产品方面有何具体计划?张春旺：明美光电将继续集中力量发展LED荧光相关的产品，同时关注细胞生物学相关领域的进展。前者我们有四通道光源MG-120和液冷光源MG-200，效率、寿命和智能化比以往的宽光谱多通道LED荧光光源MG-100有显著提升，且可以高效接入光纤。后者我们近年推出了如活细胞成像仪MCS11、细胞工厂显微镜MI52-CF和多层细胞工厂成像仪MCF400等针对活细胞成像和新型细胞工厂培养皿的产品。目前还有更紧凑而强大的相关产品正在研发中。仪器信息网：如何看待国产科学仪器的发展前景，未来还有哪些机会值得关注？张春旺：随着国家对自主化创新的要求越来越高，国产仪器将会更大范围取代进口仪器，显微镜看似小众，可是应用到很多领域，做好国产显微镜其实是一个艰难的提升过程，我们希望大家一起努力。仪器信息网：企业当前面临的最大困难或挑战是什么，希望借助“创新100”获得怎样的资源或帮助?张春旺：创新需要大量的资金投入、人员的持续努力和企业的厚积薄发。一个LED荧光光源，看似简单，却是明美光电投入数百万资金、花费几十年研发积累打造的。一个内部结构的小细节，看似不起眼，却是我们调研很多用户、理论分析和实践经验总结的成果。现在市场上有很多明美光电的模仿者，参考我们的设计做方案，又不理解内部细节由来，擅自修改并自以为是完善，结果产品出现问题，不仅影响他们自己的品牌，还可能让客户对国产仪器产品产生总体性质疑，对明美光电也是一种伤害。所以我们需要站出来、喊出来，让大家知道，明美光电不只是做显微镜相机，还在LED荧光显微镜领域做了非常多工作，不仅有自己的研究级荧光显微镜，还有帮助客户升级成荧光显微镜的各种产品和方案。我们希望通过“创新100”让客户了解我们的努力，并且收获更高质量的产品和更良好的体验，建立对国产仪器更强的信心。

网络研讨会：高分辨率CT成像技术与应用时间：2016-09-08 14:00 注册方式打开以下链接并报名http://www.instrument.com.cn/webinar/meeting/meetingInsidePage/2104 讲座内容概要在过去的几十年中，显微成像技术取得了令人瞩目的发展，涌现出众多新的技术和设备，如光学显微镜，SEM/TEM， AFM等，将显微成像技术的分辨能力不断推向新的高度，从微米到纳米甚至是原子尺度。但是，所有这些技术都只是对样品表面形貌进行观测，对样品制备有严格的要求。而高分辨率CT成功的弥补了这一不足，可在无损的情况下对样品内部组分及三维结构进行精确表征。“高分辨CT技术及其应用”介绍了最新的x射线三维显微成像检测技术及其产品，该技术可对样品内部不同吸收系数的组分及微观结构进行三维高分辨率无损成像，在科研及工业领域有着广泛的应用，如石油地质，材料科学，先进制造等。欢迎各行各业对CT感兴趣的用户参与。

荧光显微成像技术对人们理解神经科学起了非常关键的作用。而最近一些年出现的各种超分辨显微成像技术和专门的荧光探针能够以超过以往普通光学显微镜的分辨率直接观察神经元亚细胞结构和蛋白质排列。并以直观可视方式揭示了神经细胞骨架组成、分布、运动和膜蛋白信号传导、突触下结构和功能，以及神经元−胶质细胞相互作用。同时超高分辨显微成像技术（Super Resolution,SR,下文中出现SR均指超高分辨率显微成像技术）对于许多自身免疫和神经退行性疾病模型中的分子靶点研究也提供了全新的强大工具。今年春，Werner等科学家在美国化学学会会刊（ACS)上最新发表了一篇综述，比较详实系统介绍了超高分辨率显微技术在神经科学上的最新应用进展。我们在此文基础上进行了编译整理。因文章较长，我们将分三期陆续介绍。本期介绍第一部分。1. 背景介绍成像技术是推动生命科学几乎所有学科基础研究的核心平台。在神经科学领域，近几十年来，共聚焦显微镜技术已成为分析神经组织的标准荧光成像技术。激光扫描共聚焦显微镜对固定的神经元样本进行观察，在扫描水平上提供了三维和多色图像并使单个细胞达到树突结构的分辨率。作为补充，电子显微镜（EM）用于获取神经元和亚区室超微结构的信息，并用于大脑的连通性分析。EM非常适合于神经元突触和囊泡、细胞器和膜构象的结构分析。然而，由于靶向特异性标记方法的局限性，基于EM的复杂样品中蛋白质和特定电子密度特征的识别受到限制。为了进一步理解神经元功能，包括双光子显微镜在内的几种活体视频显微镜应用的发展使神经元细胞培养的活细胞成像、器官型切片培养和动物模型的活体成像成为可能。同时，新的荧光染料、功能探针和荧光蛋白以及光遗传学方法和光驱动（如笼状化合物）不仅可以表征神经元，还可以操纵神经元及其从单分子水平到整个神经系统的相互作用。然而，荧光显微图像中可见细节的水平，即图像分辨率，仍然受到衍射极限的限制。一个多世纪以来，由λ/2NA定义的阿贝衍射极限（λ为波长，NA为显微镜物镜的数值孔径）决定了光学显微镜的分辨率极限，限制了两个位置小于200纳米的细节分辨。在过去的二十年中，超分辨显微镜（SRM）已经发展成为一种非常有效的亚细胞水平荧光成像和分辨细胞器结构的研究手段。SRM现在可以提供远低于常规光学显微镜衍射极限的空间分辨率，从而能够深入了解神经元细胞和组织中蛋白质的空间结构和相互作用。本文综述了超分辨显微镜和荧光标记方法及其在神经科学中的成功应用。我们将首先详细介绍各种SRM方法的基本原理、新的功能型荧光探针和标记技术。接着，我们将回顾SRM如何有助于我们理解神经元亚细胞结构和功能以及神经元−胶质细胞相互作用。此外，我们将概述超分辨率成像方法如何帮助研究自身免疫和神经退行性疾病的病理生理学。最后，我们将介绍这些新的成像方法是如何应用于神经精神疾病相关的人类样本的分析。由于该领域持续快速发展，我们最多只能代表一份中期报告。进一步的创新和新的显微镜方法的发展将使人们对神经系统功能有更详细的了解。 2. 神经科学中的超分辨率成像方法2.1. 光学衍射极限及其对神经科学的影响人类大脑包含超过800亿个神经元，每个神经元由数千个突触连接。因此，它构成了复杂神经元网络。这些网络的主要组成部分，例如突触神经末梢，显示的空间维度接近于光学衍射极限分辨率∼200 nm。释放递质的突触活性区（突触前细胞基质的特化区）的直径通常约为300±150 nm。突触小泡作为递质运输和释放的关键元件，其尺寸平均小10倍，直径为40−50nm。这些递质被释放到宽度为20-50nm的突触间隙中−再结合突触后受体。由于衍射极限的尺寸限制，胞吐机制和跨突触信号在传统的光学显微镜下基本上是无法观测到的，因此需要用提高10倍分辨率的方法进一步研究。（图1）。图1. 兴奋性突触结构组成。左图为兴奋性突触的油画示意图，右图为左图的灰度图像，其中浅紫色圆圈为衍射极限光斑；玫红色圆圈为兴奋性突触囊泡，约40-50nm；绿色为突触后膜AMPA受体，尺寸小于10nm；黄色部分为突触间隙，约20-30nm。 此外，大量参与突触信号传导的不同的分子，位于极小的突触内，造成很高的分子分布密度，这对微观研究具有挑战性。例如，对于较小的突触，兴奋性突触可以包含数百个小泡，对于大型苔藓纤维束突触，可以包含数千个小泡，每个小泡包含多达1万到10万个递质分子。在这些囊泡中，约有10±5个与释放部位对接，释放的递质平均与0−20 个NMDA受体和0−200个AMPA受体结合，而这些突触后受体又被320±130个突触后PSD-95密度蛋白分子环绕。由于加速电子的波长要短得多，因此EM是唯一能够解析突触纳米级结构的方法。然而，虽然传统的EM产生的电子密度图像具有极好的超微结构分辨率，但需要进行固定和靶向特异性标记的制样方法在很大程度上限制了蛋白质识别和神经元追踪。荧光显微镜可以很容易地对蛋白质进行选择性标记，但是受制于可见光的衍射（400−700 nm）使生成的图像无法实现对纳米结构的分析。 2.2.绕开光学衍射极限的光学显微镜方法 20世纪后期，人们开发了新的策略，通过利用物理或化学手段来区分不同荧光团的发射或减少同一时间荧光分子的数量，以尽量绕过衍射极限。减少荧光团的点扩散函数（PSF）的重叠可以通过生成光图案在集合级别以确定性方式进行，或者通过减少同一时间荧光团的数量在单分子水平上以随机方式进行。在下文中，我们将从确定性集合方法开始介绍，该方法将激光扫描共聚焦显微镜（CLSM）的有效空间分辨率推到理论极限。2.2.1. 确定性集合超高分辨率成像方法（Deterministic Ensemble SR-Imaging Methods） CLSM用针孔探测器阵列替换单点探测器，空间分辨率可以提高√2倍。CLSM测量每个扫描位置探测器每个点的荧光信号。在应用适当的算法后，生成分辨率提升的图像。这些所谓的像素重分配方法包括图像扫描显微镜（ISM）、重扫描共聚焦（RSC）、光学光子重分配（OPRA）、AiryScan和即时结构照明显微镜（iSIM）。对于信号检测，使用了诸如CCD相机、光电倍增管阵列、单光子雪崩二极管阵列和六角光纤束等探测器阵列。结构照明显微镜（SIM）在光路中插入光栅，产生与样品干涉的相干光束，生成横向和轴向方向不同的新照明图案。然后可以使用傅里叶变换提取这种新照明图案的信息，从而在所有三维空间中实现空间频率分解和分辨率倍增。SIM对样品制备的要求最低，并且可使用所有常规荧光探针，这些探针具有最低的光稳定性，并且可以很容易地扩展到多色成像。然而，当记录三维或长时间成像时，强烈建议使用光稳定性更高的荧光团。此外，SIM使用更低的激发强度，因此是活细胞SR实验的理想选择。为了获得更高的分辨率，引入了通过图案化饱和或荧光激发或图案化耗损光开关染料的非线性SIM（NL-SIM）。然而对染料开关特性的苛刻要求限制了NL-SIM在常规生命科学实验中的适用性。非线性SIM单位时间内还需要采集更多的图像，因此实际上仅限于2D成像。另一方面，掠入射（GI）-SIM显示了高达每秒266帧的快速超分辨率成像以及100nm分辨率，揭示前所未有的细胞器动力学细节。结构照明的局限性在于其对波长的普遍依赖性、与其他SR成像技术相比的低分辨率以及对系统稳定校准的需要。最后，后处理需要进行先验质量检查以避免伪影,例如由于高背景信号或不充分标记产生的低对比度图像导致的人工蜂窝图案。通过受激发射耗损(STED)显微镜进行超分辨率成像是一种实现更高空间分辨率的成像方法。这里，高斯分布的激发激光束被中空的甜甜圈样的耗损激光束覆盖，使扫描点外围的荧光团返回基态，这导致纳米级焦点区的直径与耗损光束的强度成反比，耗损光束的强度直接转换为STED显微镜的分辨能力：上图公式中λ为波长，n为折射率，α为物镜的收集角，ISTED为STED光束的照射强度，IS为饱和强度。因此，可以通过改变损耗激光强度来调整分辨率，可定制设计分辨率达30−80nm 的显微镜。STED显微成像可通过连续或脉冲激光激发、门控检测。带有脉冲激光的STED显微镜会降低激发能量，从而减少实时成像中的光毒性效应。STED显微镜中的时间门控检测可以去除荧光团光子到达时间前的空间信息，并且可以在较低的平均功率下工作。商品化STED能提供用户友好的高分辨率成像，无需进一步的数据后处理。活体成像，例如活体树突棘动态成像已经很成熟，但快速动态成像仅限于小帧尺寸，因为它仍然是点扫描方法，高激光强度可能会导致光损伤。STED通过应用自适应照明方式Dymin和rescue技术，可以明显减少光损伤。在Dymin STED中，在共聚焦模式下扫描时确定最低可能的STED光束强度。根据样品的标记密度，这将使STED光束强度降低20到100倍。Rescue STED同样通过减少STED激光开放的区域，从而比普通STED减少光漂白接近8倍。STED的另一个限制是对荧光团光稳定性的依赖，因为在高激光强度下会发生明显的光漂白。这影响了动力学的研究和三维图像的获取。值得注意的是，最近通过使用荧光团标记的寡核苷酸（瞬时结合到连接靶蛋白结合探针的互补寡核苷酸）或非结合荧光团来进行细胞STED成像，从而绕过了STED光漂白问题。这两种方法中，基于DNA互补标记的STED成像和超分辨率阴影成像SUSHI分别通过荧光团标记的寡核苷酸和高浓度的非结合和自由扩散的荧光团不断交换来防止光漂白。SUSHI的方法已经成功地用于活体脑片中细胞外间隙和神经肽的结构解析及其动力学的STED成像。如果使用具有毫秒或更长寿命的两种稳定状态的可逆切换荧光团来代替标准荧光团，则STED强度可以显著降低。可逆饱和切换光学线性荧光转换方法（RESOLFT）已通过可逆可切换荧光蛋白（reFPs）实现，并成功应用于活体海马脑片树突棘的超分辨率成像。2.2.2. 随机单分子SR成像方法（Stochastic Single-Molecule SR-Imaging Methods）上述的确定性方法是通过改变激发模式或相位掩膜来暂时控制荧光发射达到超分辨成像，而基于单分子的定位SR显微镜则是随机地在时间上分离单个荧光团的发射。单分子定位显微镜（SMLM）基于单个荧光团的随机激活，使用配备高灵敏相机（EMCCD或sCMOS）的宽场荧光显微镜进行单分子检测，以及精确的位置测定。通过将理想PSF与实际测量的光子分布拟合来进行分子定位。只要信号来自单个发射区，且单个发射区之间的距离大于显微镜能分辨的最小距离，则通过收集更多光子和最小化噪声，定位的标准误差可以任意小。激活和定位过程重复多次，所有定位最终用于重建超分辨率图像。为了确保在成像的任何时候，只有稀疏的小荧光团以其活性荧光形式存在（开启状态），使用了光开关、光转换、光激活或自发闪烁的荧光团。由于定位精度和最终图像分辨率取决于每次检测到的光子数量，通常采用明亮且稳定的荧光团与1 kW/cm2的辐照强度相结合的方式。根据所使用的荧光团不同，SMLM可达到10−50 nm横向分辨率。光激活荧光蛋白（FPs），自2006年以来已用于光激活定位显微镜（PALM），例如在405 nm的激光照射下可从关闭状态不可逆地转换为打开状态的PA-GFP和PA-mCherry 以及可通过适当波长的激光照射从一种波长状态不可逆地转移到另一种波长状态的光转换FPs，例如MEO。此外，还成功地应用了诸如Dronpa之类的光开关FPs，其在不同激发波长的激光照射下可在非荧光和荧光状态之间可逆地切换。对于活细胞应用，使用荧光蛋白的PALM是首选方法。因为在理想情况下，每个感兴趣的蛋白质都可以用荧光蛋白进行计量标记。然而，荧光蛋白比有机染料表现出更低的光稳定性和光子计数，从而降低了定位精度，并且通常需要更长的采集时间。此外，对于PALM成像而言，融合蛋白通常会过度表达，这可能会导致不真实图像，而用转基因变体替代显示野生型表达和功能的自身蛋白仍然具有挑战性。对于细胞内源性蛋白质的标记，通常使用有机染料的免疫标记。SMLM适用的有机染料必须是光开关、光激活或自发闪烁的，以实现单个染料发射的时间分离，但化学计量标记要困难得多。有机染料通常表现出较高的光子计数和光稳定性，从而使定位精度达到5−10nm。花菁染料Cy5和Alexa Fluor 647可以在荧光开启状态（其典型寿命为10 ms）和非荧光关闭状态（寿命为几秒，利用光开关缓冲液，缓冲液包括PBS，10−100mM硫醇，如ß-巯基乙缅（MEA），酶促氧清除剂，可以有/没有激活染料）之间可逆切换，为随机光学重建显微镜（STORM）和直接型STORM（dSTORM）的发展铺平了道路。近年来，应用于（d）STORM的染料已大大扩展，除了菁染料外，还包括罗丹明和恶嗪染料。有趣的是，最近的研究表明，即使是多个标记的抗体在光开关缓冲液中也呈现出类似于单发射的表现，因此适用于dSTORM实验。光活化染料的作用与光活化荧光蛋白相似。也就是说，它们在被光照射或自发激活之前处于非荧光状态。罗丹明衍生物PA-JF549和PA-JF646以及桥环菁染料Cy5B是已成功用于SMLM的光活化染料。此外，在没有光开关缓冲液的水溶液中，硅罗丹明HMSiR等自发闪烁染料也能应用于SMLM。最近，通过图案化照明方式实现更高的定位精度，单个荧光发射区的定位得到了改进。定位精度取决于信号的大小和强度，可以通过测量的PSF标准偏差的平方除以收集的光子数来估计。然而，包括拟合性能、标记密度、标记误差和显微镜漂移在内的其它参数决定了高定位精度是否可以转化为低于10 nm的空间分辨率。此外，到目前为止，因为SMLM方法成像需要昂贵的仪器和成像者具备广泛的专业知识，这在一定程度上阻碍了其广泛应用。2.2.3. SMLM-点累计纳米成像技术（PAINT，Point Accumulation for Imaging Nanoscale Topography）第一代SMLM技术依赖于荧光团的光开关和光激活，其分辨率需要有效地利用荧光团发出的光子数，而PAINT(point accumulation for imaging nanoscale topography)方法使用活的，与目标区域结构短瞬结合的染料。在成像过程中，被漂白的荧光团可以被成像介质中充足的新鲜荧光团不断置换替补。由于游离染料在采集单个图像帧期间在多个像素上快速扩散，因此它们仅显示为模糊背景且不能准确定位，而结合染料显示为PSF且能准确定位。因此PAINT的第一种方法是将荧光染料（如尼罗红）与细胞膜进行非特异性结合，然后进行光漂白和新的结合。此外，基于蛋白质片段的探针被用于单分子定位标记。在最近的一个研究中，将这种方法与传统的基于phalloidin的肌动蛋白标记方法进行了比较。通过引入通用PAINT（uPAINT）使Ni-Tris-NTA与转基因蛋白质上表达的His-Tags更特异结合，并可用于突触间隙成像。uPAINT也可以应用于其它标记方法，如免疫标记（内源性蛋白抗体、纳米抗体如绿色荧光蛋白）或受体配体结合。为了提高PAINT的适用性和特异性，引入DNA-PAINT方法。它使用长度小于10个核苷酸的短的可控的寡核苷酸链（成像链）瞬时标记其靶结合互补寡核苷酸链（对接链）。成像链与对接链的瞬时结合产生明显的闪烁。因此，荧光团开-关状态之间的切换与其光物理性质不直接关联。DNA-PAINT首先在DNA折纸（DNA-origami）上得到验证。DNA折纸是一种自组装的DNA结构（具有已知的大小），通过侧链和荧光团进行结合，并通过宽场显微镜观察。总的来说，DNA-PAINT是一种易于实现的SR成像标记方法，无需特定光物理特性的荧光团。因为探针可以在一轮结合后，从成像介质中置换补充荧光团，从而避免了光漂白。DNA-PAINT的缺点是图像获取时间长，这是由成像链与对接链的结合和解离速率决定的，以及荧光成像链的纳摩尔浓度引起的背景信号。尽管通过使用优化的DNA序列和缓冲条件，以及使用串联的周期性DNA结构域或通过短肽的卷曲螺旋相互作用（称为“Peptide-PAINT”），可以加快采集速度，但还是要利用全内反射荧光（TIRF）（仅限于对靠近盖玻片结构进行成像的特点），才能更好地减少成像链的背景信号。另一方面，基于DNA的探针提供了序列成像复用的明显优势，如Exchange PAINT中所述，已成功用于小鼠视网膜切片中多个结构的成像（图2）。Exchange PAINT的概念也被推广到dSTORM、STED、SIM和更传统的衍射限制的宽场和共聚焦荧光显微镜。最近，通过一种称为PRISM(probe-based imaging for sequential multiplexing)的基于DNA-PAINT的成像方法，实现了高达10个神经元蛋白质的分辨率约为20nm的多通道成像。该方法使用了低亲和力成像探针，该探针与突触、肌动蛋白和微管一抗上的对接链结合。图2 原代神经元中多个神经元靶点的多标Exchange-PAINT成像。（A）DNA-PAINT顺序成像的四种突触蛋白的超分辨图像：圆圈表示漂移校正的基准点；（B）为（A）中不带*的感兴趣区域的高放大倍率图和超分辨图像。（C）为（A）中带*的感兴趣区域的超分辨结果及单通道图像。2.2.4. 定量SMLM如果每个目标分子都可以单独标记和定位的话，与所有其他超分辨率成像技术相比，SMLM还可以提供有关分子分布和分子绝对数的单分子信息。然而，内源性蛋白质的定量免疫标记仍然是一个挑战，并且多标记抗体的不同定位数目也会使数据解释复杂化。另一方面，达到内源性表达水平比较困难，另外FPs蛋白成熟缓慢也同样会令定量化困难。然而，可以通过设计专门的对照实验估计拷贝数，并提取出有关生物目标结构分子的真实信息。借助合适的算法，SMLM可以提供有关拷贝数、聚类、共定位和复杂化学计量的数据，用于定量模型的生成和模拟。此外，还可以通过将突触结构信息与其功能关联来实现量化，例如膜片钳神经元的生物细胞素标记。例如，通过对链霉亲和素标记后膜片钳神经元进行STORM成像，结合CB1受体的免疫标记，然后在GABA能的海马轴突终端内定量，研究了内源性大麻素信号。本研究发现，与树突投射型中间神经元相比，胞周投射型中间神经元具有更高的CB1受体密度和更复杂的活动区。通过免疫标记和dSTORM研究了黑腹果蝇神经肌肉连接处内源性Bruchpilot（Brp）分子的数量。利用抗体滴定实验，确定了野生型神经肌肉连接处活性区细胞基质中Brp蛋白的数量为137个，其中四分之三以约15个七聚体簇状排列结合从相同组织样本记录的电生理数据，研究Brp如何组织控制活动区功能。利用DNA纳米结构作为校准，每个活性区Brp蛋白的数量估计通过定量DNA-PAINT（qPAINT）实验证实。此外，定量dSTORM实验表明，每个活性区Brp蛋白的数量和分布受突触标记蛋白-1的影响，这说明突触活性区递质释放的复杂性。在最近的一项研究中，使用Alexa Fluor 532和Alexa Fluor 647免疫标记的双色dSTORM已用于小鼠小脑平行纤维活性区中代谢型谷氨酸受体4（mGluR4）的定量研究（图3）。该研究还使用抗体滴定实验估计每个活性区平均包含约35个mGluR4分子，并排列在小纳米结构中。此外，mGluR4通常在munc-18-1和CaV2.1通道附近被发现，这支持了mGluR4与这些蛋白质相互作用以调节突触传递的观点。图3小鼠脑片中代谢型mGluR4受体定位定量双色dSTORM。上图：mGluR4和Bassoon免疫染色的小脑冠状切片的dSTORM图像，作为活性区参考。与宽场显微镜结果的比较。（A）DBSCAN聚类算法定义了近距离的En face活性区表面积（灰色）和mGluR4信号（品红）。（B）活性区大小的频率分布直方图（C）mGluR4信号到突触和突触外区域的映射。（D）通过Ripley H函数分析评估Bassoon和mGluR4的聚集分布。与随机分布的分子（蓝色、灰色）进行比较。虚线表示Ripley分析的最大值。这些研究显示了定量SMLM在神经科学研究中的潜力。可以预见，定量SMLM的进一步发展将为突触前和突触后蛋白质的功能关系，及其组织和结构的研究提供更有价值的信息。2.2.5. 组织三维（3D）SMLM虽然SMLM方法实现了仅几纳米的非常高的水平定位精度，但它需要特殊的方法来打破图像平面上方和下方PSF的对称性，来实现高轴向定位精度。实现高轴向定位精度的两种方法是PSF重塑和多焦面检测，通常用于在3D中精确定位荧光团。在SMLM中最常用的方法是通过在成像路径中插入单个柱面透镜从而不对称地扭曲PSF，利用光学像散原理来实现三维定位。基于像散方法的3D dSTORM技术还可以与光谱拆分相结合，对COS-7细胞中的网格蛋白表面小窝成像。像散引起的畸变程度由荧光团的轴向位置决定，因此可用于轴向位置计算。例如，3D散光SMLM已用于确定抑制性突触后密度区gephyrin蛋白和受体复合物的分布和拷贝数，或突触前活动区和突触后密度区各种成分的空间关系。采用双物镜像散成像方案，通过3D SMLM研究组织中肌动蛋白、血影蛋白和其他相关蛋白的结构，发现这些蛋白在轴突中形成190nm的周期性环状结构。替代方法包括使用相位掩模、变形镜实现双螺旋、四足或鞍点PSF重塑，和双焦面成像方法实现更大的轴向范围，并已成功应用于不同的应用中。为了在2D和3D中定位单个荧光发射区，已经开发了不同的算法和软件工具。在最近的一次综述中，列出了不同3D SMLM方法获得的水平和轴向分辨率，以供比较。然而，到目前为止，大多数SMLM研究都是在培养细胞上进行的。培养细胞具有相对简单的样品制备和成像要求，例如焦平面上下荧光分子的背景信号较低或没有。而脑片更具挑战性，因为它们在焦平面上下表现出高密度的神经元结构和潜在的高荧光背景，由此产生的低信噪比对于成像来说是一个障碍，会直接影响单分子定位的精度和准确性。此外，脑片必须具有足够的渗透性，以实现有效的免疫标记，而不损害组织结构。除了超微结构保存外，对几十微米厚的脑片进行均匀标记也仍然是一个挑战。因此，最初的尝试是将组织切成薄片，以便于标记。然而，将多个切片进行三维重建也仍然具有挑战性。为了保存好抗原表位，在切割成超薄切片进行SMLM成像之前，需要对组织进行解剖、固定以及免疫标记、后固定、脱水并包埋在环氧树脂中。而且，3D SMLM只能对靠近盖玻片的脑片的一个轴向平面进行成像。如果背景信号和散射太强，也可以使用组织透明化方法和基于光片的照明方法进行SR成像。另一个导致较厚脑片的3D成像不可靠的原因是光学畸变引起的单个荧光团PSF变形和模糊。通常应用自适应光学恢复PSF，使各神经元能够更精确地成像。为了进一步提高基于自适应光学的SR成像的性能，需要将其与自适应PSF重塑相结合。例如，在30μm厚的阿尔茨海默病小鼠模型脑片中，通过同步校正样品引起的畸变并且生成一致的PSF，可以重建纤维淀粉样蛋白斑块的精细细节。荧光团的3D位置也可通过PSF内产生的自干涉精确确定，并已成功用于轴向深达50μm的 SMLM。 3.膨胀样品显微成像技术（EXM）2015年，Ed Boyden及其同事描述了另一种绕过荧光显微镜分辨率极限的创新策略，称为膨胀样品显微成像技术（ExM）。ExM的原理是将蛋白质连接到带电荷的聚丙烯酰胺凝胶中，然后使用蛋白酶进行轻微的机械破坏，然后让其在水中膨胀，从而实现样品的物理放大。最初的方法是将三功能连接体交联到凝胶基质上，将标签信息转移到凝胶上。图4 结合ExM和晶格光片显微镜（LLSM）可观察大量神经元分子组装细节。左上图：概图；右上部位：海马CA1锥体神经元的投射；右下部位：神经元胞体；中下部位：小鼠大脑，通过Thy1 EYFP信号和突触蛋白免疫组织染色进行皮质树突棘成像；左下部位：果蝇投射神经元（PN）束的多样性。左上部位：果蝇中枢复合体PN的神经元追踪。中心部位：果蝇多巴胺能神经元的全脑成像。下图：成年果蝇大脑所有33个脑区的多巴胺能神经元相关Brp信号（体积密度）定量图（nc82抗体免疫染色，绿色曲线=与多巴胺能神经元相关的nc82斑点百分比）。右上图：沿着皮质层I至VI（顶部，最小强度投影）的初级躯体感觉皮层中的Homer 1点密度和25μm×50μm×50μm跨皮质的Homer 1点累积数量。请注意，在第二层/第三层和第五层中，Homer 1的密度较高。三功能连接体含有甲基丙烯酰基团、荧光标记和寡核苷酸，它与连到蛋白质标记的抗体的互补寡核苷酸杂交。将免疫染色的细胞或组织包埋在单体溶液中后，添加含有丙烯酸钠（凝胶高吸水性树脂）的共聚单体丙烯酰胺和交联剂N，N′-亚甲基双（丙烯酰胺）。这些单体组分和位于目标上的甲基丙烯基在高温下聚合，使用四甲基乙二胺(TEMED)作为催化剂，过硫酸铵(APS)作为聚合引发剂。荧光标签通过锚定在凝胶中的特定位置而在空间中固定，并且其位置可以在蛋白酶的化学预处理和水中透析后延伸构象进行物理膨胀。最初使用ExM产生了一个100倍的体积膨胀和目标分子间的4−5倍距离的线性增加。使用常规共聚焦显微镜对其成像，SRM横向分辨率可达到70 nm，轴向分辨率可达200 nm。在随后的几年中，通过使用交联分子如MA-NHS和acryloyl-X将蛋白质锚定到凝胶基质上，开发了改进proExM方法，使用常规荧光团就可保留蛋白质表位。为了避免自由基起始剂对荧光团的影响，设计了新的方法如蛋白质组放大分析（MAP），与SDS结合热介导变性，实现膨胀凝胶的后标记。此外，通过引入三功能连接体，它们能够在聚合、消化和变性后存活，并能够将目标分子和官能团直接共价锚定到水凝胶中，以实现膜和细胞骨架的SR成像。有研究显示，一些荧光团与激动剂发生反应。例如，因为菁染料在样品制备过程中几乎消失，因此不适合用于ExM标记，而其他荧光团如Alexa Fluor 488、CF和Atto染料在ExM处理流程后仍然能发射足够的光子。此外，生物素−亲和素信号放大和交换反应信号放大免疫染色技术(Immuno-SABER)可以有效提高信噪比和对大量目标蛋白进行成像。最近的研究表明，可以通过优化Ultra（U-ExM）的流程保留中心粒的超微结构细节。U-ExM启发于MAP方法，该方法允许膨胀并使用低甲醛和丙烯酰胺浓度交联蛋白质（保留样品的超微结构细节）后进行标记。U-ExM已经成功地用于揭示以前只有电镜才能获得的中心粒的超微结构细节。通过使用不同的单体和引发剂组合，Truckenbrodt及其同事设计了一个对常规培养细胞甚至神经元进行10倍体积膨胀的方案，即通过二次凝胶进行迭代ExM制样，多次嵌入不同的单体（而这些单体又可以通过使用高摩尔氢氧化钠去除）从而达到高达53倍的膨胀系数。应用此方法，可以从突触后支架蛋白中清晰看到位于突触间隙内的膨胀13倍的蛋白，例如神经递质受体GluR1和GABAARα1/α2。如今，ExM已成功用于培养细胞、原代神经元和组织中的蛋白质、RNA、真菌、病理标本和细菌的超分辨率成像。4倍膨胀的ExM已经与晶格光片显微镜相结合，以60×60×90 nm的分辨率对整个果蝇大脑中多种蛋白质之间的纳米级结构进行成像（图4）。为了进一步提高分辨率，ExM已成功地与SRM方法相结合。例如，ExM与SIM相结合到达20nm的空间分辨率，观察果蝇中的联会复合体和小鼠精母细胞。在细胞培养样品中进行多表位标记后，与传统荧光显微镜相比，使用STED结合ExM可使分辨率提高30倍。此外，使用NHS染料对所有蛋白进行标记，然后进行迭代ExM，可以对高蛋白密度的结构或细胞器（如线粒体），实现与EM相比具有更高对比度的超微结构细节。为了在分子尺度上进行成像，ExM与SMLM方法（如dSTORM）相结合是一个理想的选择。然而在含有硫醇和盐的传统光转换缓冲液中，会发生荷电氢凝胶收缩。可通过使用低离子强度缓冲液或加入中性溶液使凝胶稳定以避免收缩。另一种策略是使用自发闪烁的荧光团（如HMSiR）在水中进行SMLM。通过Ex-dSTORM实现分子分辨率的关键是膨胀后标记，这增加了表位可及性，从而提高了标记效率并减少了标记错误。Ex-dSTORM超分辨成像已成功应用于原代细胞和神经元中微管和中心粒结构的解析。

p　　近期，中国科学院深圳先进技术研究院劳特伯医学成像研究中心郑海荣团队在高分辨率超声成像研究中取得一系列进展。/pp　　高分辨率超声主要采用大于15MHz的超声频率进行成像，可获得几十微米量级的成像分辨率。在临床中主要应用于浅表、内窥和眼科等方面的疾病检测。高频超声换能器是成像系统的关键部件，主要基于压电材料进行设计加工。但传统压电材料介电常数较小(夹持介电常数小于1500)，造成压电阵元尺寸小的高频换能器的电阻抗会大幅度提升，进而导致换能器成像性能不佳。郑海荣团队邱维宝课题组利用新开发的一种高介电常数、高压电性能的改性PMN-PT陶瓷(夹持介电常数为3500)设计制备了性能优异的40MHz高频超声换能器(阵元尺寸可为0.4mm× 0.4mm)，使得制备的高频超声换能器的电阻抗大幅度降低，更容易与电子系统的阻抗相匹配，实现较高的成像灵敏度(-13dB)。此外，该研究中设计制备的超声换能器具有较高的成像带宽(80%)和信噪比，并在高分辨率医学成像领域中展现出应用潜力。相关研究成果已被IEEE Trans Ultrason Ferroelectr Freq Control接收。/pp　　邱维宝课题组在高分辨率超声成像方法和电子系统方面也取得了研究进展。高频超声获得高分辨率医学图像存在衰减系数增大导致成像穿透深度降低的问题。据此，课题组提出了基于编码超声的高频超声成像方法，在激励换能器时，采用带有一定编码的超声信号进行激励，回波接收时通过算法解码恢复出高分辨率图像，使得在成像中既可以维持图像的分辨率，也可以提升超声成像的穿透深度。该技术在浅表和内窥等成像中具有应用潜力。相关研究成果发表于IEEE Trans Biomed Eng。/pp　　在进行高分辨率超声成像时，电子系统需要具有较高的数据采样率，以获取超声回波的原始数据信息，因此需要大幅度提高模数转换器(ADC)的采样频率。然而，传统超声成像系统的ADC采样频率通常为60MHz或者更低，不能满足大于30MHz的高频成像需要。据此，邱维宝课题组提出了一种延迟激励方法，通过将激励波束的时序进行规律性调整，在多次发送后获取多个数据图像，通过延迟复合处理，即可以获得高采样率的图像。该方法有望使临床用的超声设备，在不改动主要电子器件模数转换器的前提下，实现高分辨率超声成像的功能。相关研究成果发表于IEEE Trans Biomed Eng。/pp　　高分辨率超声成像技术在内窥镜领域具有重要的应用潜力，邱维宝课题组在推进血管内超声成像技术的同时，也在尝试新型内窥成像技术。胶囊内窥镜(capsule endoscopy)是一种胶囊形状的内窥镜，它是用来检查人体肠胃的医疗仪器。胶囊内窥镜体积仅有普通胶囊大小，消除了传统检查耐受性差的缺点，能够拍摄食道、胃、小肠、大肠等，从而完成对人体整个消化道的检查。然而目前该技术是采用光学成像方法，仅能观测组织表层的病变信息，不能获得深层次的组织情况。由于超声成像技术的穿透性较好，因此课题组拟尝试进行超声胶囊内窥镜的设计验证，提出了基于高分辨率超声的内窥成像控制方案，采用40MHz的超声频率获得了小于60微米的肠道组织成像分辨率。相关研究成果发表于IEEE Trans Med Imaging。/pp　　以上研究得到了国家自然科学基金、中科院前沿科学重点研究计划、广东省杰出青年基金、深圳市孔雀计划等项目的资助，以及美国南加州大学、宾夕法尼亚州立大学，英国格拉斯哥大学，东北大学等高校的支持与合作。/pp　　论文题目：High Performance Ultrasound Needle Transducer Based on Modified PMN-PT Ceramic with Ultrahigh Clamped Dielectric Permittivity/pp style="text-align: center "img title="01.png" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201712/insimg/76653693-b0cd-480d-ab1c-d835a6a2f035.jpg"//pp style="text-align: center "strong图1.(a)高频超声换能器技术参数对比 (b)高频超声换能器结构示意图和实物图 (c)成像性能测试图/strong/pp style="text-align: center "img title="02.png" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201712/insimg/c0246a6c-4345-4ee5-b1a2-fe74a5030a04.jpg"//pp style="text-align: center "strong图2.(a-c)编码成像原理示意图 (d)编码成像技术可以大幅度提高血管内超声成像的穿透深度/strong/pp style="text-align: center "img title="03.png" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201712/insimg/86bdbf66-cabb-484d-92d3-d2dc22d62b25.jpg"//pp style="text-align: center "strong图3.左：延迟激励成像原理示意图 右：眼睛组织超声成像图/strong/pp style="text-align: center "img title="04.png" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201712/insimg/90b38fc1-6ef0-4192-83b1-723cacb12d4c.jpg"//pp style="text-align: center "strong图4.(a-b)胶囊超声内窥镜设想方案示意图 (b)高分辨率肠道组织超声成像图/strong/pp /p

p　　癌症被谓为众病之王，如何预防恶性肿瘤的转移和扩散，一直是临床医学界难题。/pp　　有没有一种技术手段，能够对生物活体进行观察和追踪，让医生从整体上了解疾病发展的进程，及时调整药物和基因治疗方案，从而改变或阻止疾病发展?/pp　　答案是肯定的。/pp　　由宁波永新光学股份有限公司牵头，联合浙江大学、上海理工大学、复旦大学附属中山医院、南京医科大学等共同进行研究和开发的“高分辨荧光显微成像仪”正在为解决这一难题而不懈努力，也正因此，该项目获得了科技部重大科学仪器设备开发重点专项立项。/pp　　“‘高分辨荧光显微成像仪’是以永新公司现有的一代高端倒置荧光显微成像系统主体为基础，开发出一个具有光切片成像、荧光标记与共定位、三维空间还原及动态成像、单分子荧光探测、荧光漂白后恢复等的复杂多功能高端荧光显微成像系统。”公司技术总监、项目负责人毛磊对科技日报记者说。/pp　　虽然电子显微镜、原子力显微镜等技术已经实现获得更高的分辨率，但由于不能对活体实时成像，样品制备复杂等原因，光学显微镜仍然是当前生物医学、生命科学以及医学研究等方面的主要观测设备。/pp　　“相比较传统的显微成像技术，这种高分辨荧光成像技术不仅可以实现对活体组织微观结构、各种肿瘤细胞的显微成像，还为细胞组学、基因组学、蛋白组学、肿瘤学等研究提供了强大的技术支撑，是一项在生命科学领域有着不可替代优势的技术。”毛磊说。/pp　　此外，这种技术还可以在活体动物体内进行显微成像，通过对同一组实验对象在不同时间点进行记录，跟踪同一观察目标(标记细胞及基因)的移动及变化，让研究人员直接快速地检测各种癌症模型中肿瘤的生长、转移以及对药物的反应，比传统方法更适合于肿瘤体内生长的定量分析。/pp　　值得一提的是，为了提高光学显微的成像效果，以便从复杂的细胞组织中提取出自己想要的细节，研发团队还采用了荧光标记的方法，在细胞中加入特殊的荧光标记物，这些标记物在特定的光照下，有的发红光，有的发绿光，而且每种荧光标记物都具有一定的选择性，只与细胞中既有的特定分子结合，然后发出荧光。/pp　　“荧光成像大大提高了光学显微成像的对比度，还帮助研发人员分辨细胞中的不同结构。预期项目结题后，3—5年内将可实现累计销售1亿多元，10年内可实现年销售3—5亿元，利税超亿元。该项成果将推动我国高端显微镜的‘跨代式’发展。”毛磊说。/pp　　相关统计显示，2016年全球该类产品市场共有30多亿美元，中国市场大约在16亿元人民币(约占世界市场8%)，年增长率超过30% 而在世界高端显微镜市场，我国显微镜制造企业占比小于1%，具有很大的市场空间。/pp　　“永新已经与三家应用单位共同在遗传/发育生物学、细胞生物学等荧光免疫方面进行了应用开发，其中NIB900、NE900系列研究级显微镜已实现批量生产，并在国内外高校及科研院所销售超过200台。下一阶段，我们将围绕切片成像模块、单分子探测模块及全内反射模块以及核心部件如高倍率、大数值孔径平场复消色差物镜，荧光滤光片，微分干涉组件等进行深度研发，最终实现预期目标。”毛磊表示。/p

p　　癌症被谓为众病之王，如何预防恶性肿瘤的转移和扩散，一直是临床医学界难题。/pp　　有没有一种技术手段，能够对生物活体进行观察和追踪，让医生从整体上了解疾病发展的进程，及时调整药物和基因治疗方案，从而改变或阻止疾病发展?/pp　　答案是肯定的。/pp　　由宁波永新光学股份有限公司牵头，联合浙江大学、上海理工大学、复旦大学附属中山医院、南京医科大学等共同进行研究和开发的“高分辨荧光显微成像仪”正在为解决这一难题而不懈努力，也正因此，该项目获得了科技部重大科学仪器设备开发重点专项立项。/pp　　“‘高分辨荧光显微成像仪’是以永新公司现有的一代高端倒置荧光显微成像系统主体为基础，开发出一个具有光切片成像、荧光标记与共定位、三维空间还原及动态成像、单分子荧光探测、荧光漂白后恢复等的复杂多功能高端荧光显微成像系统。”公司技术总监、项目负责人毛磊对记者说。/pp　　虽然电子显微镜、原子力显微镜等技术已经实现获得更高的分辨率，但由于不能对活体实时成像，样品制备复杂等原因，光学显微镜仍然是当前生物医学、生命科学以及医学研究等方面的主要观测设备。/pp　　“相比较传统的显微成像技术，这种高分辨荧光成像技术不仅可以实现对活体组织微观结构、各种肿瘤细胞的显微成像，还为细胞组学、基因组学、蛋白组学、肿瘤学等研究提供了强大的技术支撑，是一项在生命科学领域有着不可替代优势的技术。”毛磊说。/pp　　此外，这种技术还可以在活体动物体内进行显微成像，通过对同一组实验对象在不同时间点进行记录，跟踪同一观察目标(标记细胞及基因)的移动及变化，让研究人员直接快速地检测各种癌症模型中肿瘤的生长、转移以及对药物的反应，比传统方法更适合于肿瘤体内生长的定量分析。/pp　　值得一提的是，为了提高光学显微的成像效果，以便从复杂的细胞组织中提取出自己想要的细节，研发团队还采用了荧光标记的方法，在细胞中加入特殊的荧光标记物，这些标记物在特定的光照下，有的发红光，有的发绿光，而且每种荧光标记物都具有一定的选择性，只与细胞中既有的特定分子结合，然后发出荧光。/pp　　“荧光成像大大提高了光学显微成像的对比度，还帮助研发人员分辨细胞中的不同结构。预期项目结题后，3—5年内将可实现累计销售1亿多元，10年内可实现年销售3—5亿元，利税超亿元。该项成果将推动我国高端显微镜的‘跨代式’发展。”毛磊说。/pp　　相关统计显示，2016年全球该类产品市场共有30多亿美元，中国市场大约在16亿元人民币(约占世界市场8%)，年增长率超过30% 而在世界高端显微镜市场，我国显微镜制造企业占比小于1%，具有很大的市场空间。/pp　　“永新已经与三家应用单位共同在遗传/发育生物学、细胞生物学等荧光免疫方面进行了应用开发，其中NIB900、NE900系列研究级显微镜已实现批量生产，并在国内外高校及科研院所销售超过200台。下一阶段，我们将围绕切片成像模块、单分子探测模块及全内反射模块以及核心部件如高倍率、大数值孔径平场复消色差物镜，荧光滤光片，微分干涉组件等进行深度研发，最终实现预期目标。”毛磊表示。/p

近期，中国科学院半导体研究所研发的“水睛”水下高分辨率环视摄像机完成了针对水下礁盘的摸底海试工作。海洋观测是开发海洋资源、保护海洋生态的关键技术，受到全球的关注，但是目前海洋生物群落及环境变化监测技术仍无法满足海洋大时空数据获取的需求，特别是深海。光学成像技术可提供高分辨率、符合人眼视觉特征的图像，但是在保障高分辨率的前提下存在视场小的问题，难以实现大范围的海底详查的需求。针对此种情况，半导体所周燕、王新伟及其科研团队研制了水下高分辨率环视摄像机“水睛”，可实现水下高分辨率大视角的光学成像，具备180°下视走航观测和360°原位环视观测两种模式（图1）。本次海试中，“水睛”搭载半导体所海面移动光学试验平台“冲浪者”号（图2），在约1000平方米海域进行了水下高分辨观测，完成了海上走航式观测、定点原位观测等摸底性观测试验，验证了设备具备5900万像素下良好的实时彩色成像功能。图1 水下环视摄像机的下视及环视工作模式（上图下视模式，下图环视模式）图2 搭载冲浪者号走航式观测过程中的“水睛”摄像机此次海试，研究人员利用水下摄像机多次完成了礁盘生态系统的观测，拍摄了大量的珊瑚、海星、贝类、鱼类等，形成了水下光学彩色图像库（图3），可用于海洋光学图像处理、目标识别等算法研究。图3海域美丽的珊瑚、鱼类、海星、砗磲等除珊瑚及鱼类等生物要素外，本次海试中，在海底还发现了生物附着的碗和盘子各一只（图4）。图4 生物附着的盘子和碗此次海试由半导体所和南开大学共同组织完成，除“水睛”摄像机外，还利用多参量海洋水体测量系统完成了海洋温盐深、核素、水体光学衰减系数等海洋水体多物理化学参量采集。相关工作得到了南方海洋实验室、中科院青促会项目的经费支持。 图5 项目团队及设备在海试现场

一、项目基本情况1.项目编号：OITC-G230661389项目名称：中国科学院海洋研究所海洋生物微区原位代谢组学研究平台（区域中心）高分辨率原位质谱成像系统采购项目预算金额：550.0000000 万元（人民币）最高限价（如有）：550.0000000 万元（人民币）采购需求：包号设备名称数量预算简要要求交货期交货地点第1包高分辨率原位质谱成像系1套550万人民币拟购置的高分辨率原位质谱成像系统主要用于小分子代谢物、短肽或蛋白的鉴定、定量及成像分析功能。具体而言，可以针对各种海洋生物细胞或组织开展各类分子如脂类（磷脂：PC、PE、SM、SE）、多肽、代谢物、药物及代谢产物等数百种分子的同时成像；能实现物质筛选与鉴定同时进行，目标分子可进行多级质谱分析，准确鉴定其组成与结构；实现高空间分辨率、高质量精度、高质量分辨率的非靶向性快速检测，且无需任何标记。合同签订后8个月内交货海洋研究所（青岛）投标人可对其中一个包或多个包进行投标，须以包为单位对包中全部内容进行投标，不得转包、分包，评标、授标以包为单位。技术要求详见本文件第八部分。合同履行期限：合同签订后8个月内交货。本项目( 不接受 )联合体投标。2.项目编号：OITC-G230310496项目名称：中国科学院海洋研究所2023改善科研条件专项-深海岩芯原位分析测试平台微区X射线荧光光谱仪采购项目预算金额：300.0000000 万元（人民币）最高限价（如有）：300.0000000 万元（人民币）采购需求：包号设备名称数量预算简要要求交货期交货地点第1包微区X射线荧光光谱仪1套300万人民币可以对岩心、矿石、沉积物等进行多元素分布成像，还可以自动识别2000多种矿物，进行矿物分布成像、矿物分类统计，突破了以往数字化测试的局限，通过成像的方式带给科研人员元素和矿物分布信息。采购的设备需满足元素分布成像、矿物分布成像功能合同签订后5个月内交货海洋研究所（青岛）投标人可对其中一个包或多个包进行投标，须以包为单位对包中全部内容进行投标，不得转包、分包，评标、授标以包为单位。技术要求详见本文件第八部分。合同履行期限：合同签订后5个月内交货。本项目( 不接受 )联合体投标。3.项目编号：OITC-G230610913项目名称：中国科学院海洋研究所2023改善科研条件专项-深海岩芯原位分析测试平台场发射扫描电镜及能谱系统采购项目预算金额：250.0000000 万元（人民币）最高限价（如有）：250.0000000 万元（人民币）采购需求：包号设备名称数量预算简要要求交货期交货地点第1包场发射扫描电镜及能谱系统1套250万人民币场发射扫描电镜及能谱系统基于扫描电镜的微观形貌和能谱得到的元素分布扫描，全自动快速得到目标材料样品（包括矿物岩心、海底岩石、沉积物、废石废物、冶炼残渣、金属制品、陶瓷器等）的夹杂物（矿物）分布与组成、元素分布信息和夹杂物（矿物）的颗粒尺寸等，配合相关设备，可进行化学和成分分析。合同签订后12个月内交货海洋研究所（青岛）投标人可对其中一个包或多个包进行投标，须以包为单位对包中全部内容进行投标，不得转包、分包，评标、授标以包为单位。技术要求详见本文件第八部分。合同履行期限：合同签订后12个月内交货。本项目( 不接受 )联合体投标。二、获取招标文件时间：2023年07月04日 至 2023年07月11日，每天上午9:00至12:00，下午13:00至17:00。（北京时间，法定节假日除外）地点：登录“东方招标”平台http://www.oitccas.com注册并购买。方式：登陆“东方招标平台”（http://www.oitccas.com/），点击“获取采购文件”链接图标，或直接输入访问地址（http://www.oitccas.com/pages/sign_in.html?page=mine）完成投标人注册手续（免费），然后登陆系统寻找有意向参与的项目，已注册的投标人无需重新注册。招标文件售价：每包人民币600 元。如决定购买招标文件，请完成标书款缴费及标书下载手续。售价：￥600.0 元，本公告包含的招标文件售价总和三、对本次招标提出询问，请按以下方式联系。1.采购人信息名 称：中国科学院海洋研究所　　　　　地址：青岛市市南区南海路7号 　　　　　　　　联系方式：王老师；0532-82898629 　　　　　　2.采购代理机构信息名 称：东方国际招标有限责任公司　　　　　　　　　　　　地　址：北京市海淀区丹棱街1号互联网金融中心20层　　　　　　　　　　　　联系方式：李雯、王军、郭宇涵； 010-68290530；010-68290508　　　　　　　　　　　　3.项目联系方式项目联系人：王老师电　话：　　0532-82898629

2023年8月6日至12日，由清华大学蛋白质研究技术中心、生物医学测试中心、中国细胞生物学学会细胞器生物学分会联合主办的第四届活细胞与超高分辨成像高级研讨会在清华大学成功举办。众多领域专家学者、行业头部翘楚齐聚一堂，和来自全国各地的100余位青年学者一起见证了这场学术盛宴。研讨会邀请了北京大学席鹏教授、陈良怡教授、孙育杰教授，中科院生物物理所李栋研究员，中国科技大学唐爱辉教授，西湖大学章永登研究员、清华大学陈春来副教授等十数位在活细胞、超分辨、单分子成像等领域的知名专家进行报告，还邀请了尼康、徕卡、蔡司等公司就超分辨成像、一体化活细胞成像等仪器进行了专业介绍和体验展示。在本次研讨会上，力显智能科技联合创始人兼COO张猛博士就《单分子定位超高分辨率显微镜iSTORM在生物医学领域的应用》进行了相关报告分享。会议期间，力显智能科技研发的新品活细胞超高分辨率显微成像系统iSTORM VIVO在清华大学正式发布，更是为这场精彩盛宴增添了一抹亮色。现场，清华大学高级工程师王文娟老师与力显智能科技联合创始人兼COO张猛博士共同为活细胞超高分辨率显微成像系统iSTORM VIVO揭幕。揭幕仪式力显智能科技联合创始人兼COO张猛博士表示：非常感谢一路支持力显的各位朋友和老师，是大家的支持和帮助，促成了这次活细胞超分辨新品在清华大学的圆满发布，这是广大用户对力显超分辨的再一次肯定，也是力显智能科技自研国产超分辨之路的又一个重要里程碑。活细胞超高分辨率显微成像系统iSTORM VIVO作为目前国内唯一的商业化单分子超分辨显微系统，iSTORM成功实现了光学显微镜对衍射极限的突破，使得在20纳米的分辨率尺度上从事生物大分子的单分子定位与计数、亚细胞及大分子复合物结构解析、生物大分子生物动力学等的研究成为现实。在原先标准版iSTORM的基础上，经光机系统、染料、算法协同开发，iSTORM VIVO在活细胞超分辨成像领域获得极大技术提高，提升原始图像拍摄速度，搭配高密度快速荧光定位算法，可以在维生条件下进行快速活细胞超高成像，以高精密度的成像能力解析活细胞的各种生命生理过程，极大弥补了传统STORM技术在活细胞超分辨成像领域的短板，给生命科学、医学等领域带来重大突破。

光学显微镜至今已有三百多年的历史，从观察细胞的初代显微镜发展到如今打破分辨率极限的超分辨显微镜。近年来，生命科学领域蓬勃发展，对显微成像技术不断产生新的需求，光学显微镜不断向更高分辨率、快速成像、3D成像等高端技术方向发展。 我国高端光学显微镜市场长期处于被国外产品垄断的局面，许多关键核心部件依赖进口。令人欣喜的是，近五年来，市场上涌现出多种国产高端光学显微镜，包括超分辨显微镜、双光子显微镜、共聚焦显微镜、光片显微镜等，逐渐打破当前市场格局。基于此，仪器信息网特别制作“破局：国产高端光学显微镜技术‘多点开花’” 专题，并向国产光学显微镜企业广泛征稿（投稿邮箱：lizk@instrument.com.cn），了解各企业主要高端光学显微镜产品技术特点和发展进程。本篇为宁波力显智能科技有限公司供稿，公司主要产品为INVIEW iSTORM超高分辨率显微镜，其采用的STORM技术是目前国内鲜少有的超分辨技术类型。撰稿人：宁波力显智能科技有限公司副总经理张猛博士人类的历史，也是一部工具的历史。人类发展的历程就是关于如何对世界了解的更多，将人类生活变的更好更先进的历程。从旧石器时代，原始人拿起第一块石头当作工具开始，就开启了用工具进行未知世界探索和创造性改变的历程。从古至今，人类都是工具发明和使用的种族，新工具的问世也反哺人类的成长和进步，让人类一次次突破原有认知边界看到更多的未知，解决更多的问题，取得更多的成就。显微镜，正是一项帮助人类认识微观世界从而改变世界的革命性工具，也是人类探索微观世界不可缺少的工具。显微镜问世之前，人类仅可用感官来把握世界，所能认识到最小世界就是“目所能及”的常规世界，人的肉眼仅能分辨约0.1毫米尺度的物体，因而相关科学的发展缓慢。当罗伯特胡克使用显微镜观察到软木塞上的“小室”，并将其命名为细胞时，可能还没有意识到他这次实践将为人类开启微观世界的大门。人类对未知领域无限的好奇心是推动科学技术前进的动力之一，为了解析关乎生命基本结构，回答有关物质与生命等基本问题，为此人类不断开发出更为精密、分辨率更高的显微镜来探寻这些问题的答案。经过400多年的发展，近几年国际上出现了超高分辨率显微镜这一工具，一经面世就引起了众多科学家的关注和极大兴趣。那么什么是超高分辨率显微镜，为什么它能让科学家如此感兴趣呢？我们一起往下看。超高分辨率显微镜的诞生，是生命科学史上的一座里程碑简单的讲，超高分辨率显微技术是通过应用一系列物理原理、化学机制和算法“突破”了光学衍射极限，把光学显微镜的分辨率提高了几十倍，使得人类能在200nm以下以前所未有的视角观察生物微观世界的技术，具有超高分辨成像技术和实现超高分辨率成像能力的显微镜就是“超高分辨率显微镜”。那么什么是光学衍射极限呢？所谓光学衍射极限，是1873年德国科学家恩斯特阿贝提出的，由于光是一种电磁波，存在衍射，一个被观测的点经过光学系统成像后，不可能得到理想的点，而是一个衍射像，每个物点就像一个弥散的斑，如果这两个点靠得很近（小于可见光波长大约一半，约200nm），弥散斑就叠加在一起，看到的就只能是一团模糊的图像，也就无法清晰观测到衍射极限以下物体的微观空间结构。并且光学衍射极限此前长期被认为是限制光学显微镜技术通向更微观的“拦路虎”和“绊脚石”，甚至被科学界一度认为是无法突破或绕开的。直到2000年，几位世界知名科学家先后发明了几种不同技术路线的的超高分辨率显微技术。其中，Stefan Hell、Eric Betzig和W.E. Moerner三位科学家就是因其在超高分辨率显微成像技术领域的突出贡献，获得了2014年诺贝尔化学奖。至此，人类才得以突破光学衍射极限这一横亘在前、不可逾越的“大山”，实现了200nm以下超高分辨率显微成像，以光学的方法观测到纳米尺度世界的真实样貌。超高分辨率显微镜可用来研究分子定位与空间分布、分子相互作用、分子复合物的构成，并可实现分子的计数。除具有200nm以下卓越分辨率性能外，对生命样品结构也可进行精准成像定位，还具备对活体细胞进行微观观察的可能性，对于生物、生命科学、医药、医学等的领域都有着重要意义，因此吸引了全球科学家的持续研究和关注。通常来说，超高分辨率显微镜主要有两大类技术策略，一类是通过特定模式照明对分子受激荧光差异化调制实现超高分辨率成像。代表产品有受激发射光耗损显微镜(Stimulated Emission Depletion, STED)和结构光照明显微镜(Structured Illumination Microscopy, SIM)。另一类，是利用荧光分子的“开关”特性，使其随机闪烁，从而能够对单个分子分别记录，实现超高分辨率成像。随机光学重构显微镜（Stochastic Optical Reconstruction Microscopy, STORM）就是这类技术路线的代表。第一大类中，STED及其衍生都是利用“甜甜圈”状的空心光束来修饰位于中间激发光的点扩散函数（Point Spread Function, PSF），从而达到直接超分辨成像的目的。而SIM则是利用了结构光照明，以获得包含样本的结构信息的干涉图案“摩尔条纹”，加上后期的图像重构，达到超分辨成像的目的。第二大类中，STORM是利用了荧光染料分子“光控开关”（photo-switchable）性质，达到在一个衍射极限空间内（200~300 nm）随机“点亮”单个荧光分子并进行高精度定位的目的。既然叫超高分辨率显微镜，最为重要的就是对空间分辨率的提升。其实无论哪一类技术，理论上空间分辨率都是可以实现无穷小，但是受限于样本、荧光染料特性、标记密度、激发光效率等原因，实际拍摄中能实现的空间分辨率是几十纳米。从遍地洋货到国货崛起众所周知，高端显微镜市场被“洋货”所长期垄断，不仅在国外如此，在中国也是如此，国货“芳踪难觅”，这对于我们这样一个大国来说可算是“一言难尽”。当然，也有令人感到振奋的信息，那就是在超高分辨率显微镜这个细分领域，除了“洋货”最近也已见到了国货产品的身影。宁波力显智能科技有限公司（INVIEW）的超高分辨率显微镜产品INVIEW iSTORM就是一款国产超高分辨率显微产品。宁波力显智能科技有限公司是专业从事超高分辨率显微技术和产品研发的科技企业，依托复旦大学的自动控制、新一代信息技术及香港科技大学的生物、光学、图像处理等的技术，拥有光学、生物、自控、机械、信息技术等多领域交叉学科技术团队，将2014年诺贝尔化学奖得奖技术产业化，推出了INVIEW iSTORM超高分辨率显微产品，以帮助人类以前所未有的视角观察微观世界，突破极限，见所未见。INVIEW iSTORM超高分辨率显微镜产品采用dSTORM技术路线，具有20nm超高分辨率、2-3通道同时成像、界面友好、简单易用、系统稳定性好、环境适应性高等的特点。技术先进，20nm超高分辨率，3D成像采用STORM随机光学重构技术，加入柱面镜设计，在XY轴分辨率达20nm、Z轴分辨率达50nm，具备3D成像功能。多通道同时成像光路设计，稳定性高采用专有的多通道同时成像的光路设计，提供稳定的光路。自主开发的成像分光光路，可保证通道间的光学路径相对独立，使得样品发出的荧光最大效率地被探测器接收，最大限度降低通道间的串扰。并配合以最佳染料方案和最佳成像缓冲液配方，以多通道同时成像的方式，在几秒到十几分钟的时间范围内实现20nm的超高分辨率成像。物理样品锁定设计，锁定精度1nm采用纳米级实时动态锁定技术，以实时物理补偿方式纠正样品漂移，无需预热，即开即用，操作简便，免受如气流、温度变化、噪音、机械振动等的环对样品位置的影响，在高楼层、嘈杂、震动、常温常态的环境下也能稳定成像，因而具有高效、简便、对环境适应性好的特性，友好易用。 “傻瓜式”操作，易学易用软件集成了多种成像算法，并在采集数据时实时呈现超高分辨图像重构结果和详细参数，“所见即所需”，操作流程化，简单易用。具有拍摄过程简单易用、参数优化实时透明、超分辨图像实时重构、自动化用户数据管理、图像数据后分析功能等五大特点。此外，经过优化的样本制备方案更易于实验人员的掌握和实际操作。即便是技术新手，经过简单的技术讲解，2个小时以内就可操控系统并获得理想的超分辨率成像结果。以上，INVIEW iSTORM超高分辨率显微产品所具备的综合特点和优势，使得它能够帮助到更多科学家进行衍射极限尺度以下的生物分子组织与相互作用等的尖端科学研究。另外，值得一提的是，INVIEW iSTORM产品还以优异的光路、较低强度的照明、多通道同时成像所支持的较短成像时间等的综合性能，结合合适的荧光探针及根据探针特性调整的探测器拍照频率等，实现活细胞的超高分辨率成像，这将更大程度上帮助到科学家在生物学基本问题与机制上的科学研究。随着人类对自然的认识向更加微观的时空尺度，传统的科研手段已经不能完全胜任，没有高端科研仪器，要想做出重大原始创新科研成果很困难。力显智能科技将继续立足于超高分辨率显微镜技术研究及产品开发，不断推出新技术、新品，从而推动高端显微技术在中国的产业化和应用，努力为我国生命科学、医学、药学等领域的科学研究提供强大助力。INVIEW iSTORM超高分辨率显微产品超高分辨率显微技术的未来可期作为一种新兴荧光显微成像技术，超高分辨率显微成像正受到科学家们的广泛关注，实验室中不断产生着振奋人心的数据。围绕着超高分辨率核心，主要研究方向为不断提高显微镜成像性能，使其分辨率更高，成像速度更快，成像深度更深，视野范围更大，及更低的光毒性光漂白。而我们也可以清晰的看到，由于不同的超高分辨率成像技术提升分辨率的技术路径差异，很难有“面面俱到”的技术可以满足差异化样品的全部成像需求，“精准成像”，也就是针对不同的样品特点，而选择最适合这类样品的显微成像技术，是进行生命科学等领域研究的最优解，这也促使生物，光学，算法，图像处理等领域的研究人员不断深入跨学科合作，共同探索生命的奥秘。即便有了更快、更高、更深、范围更大，更低光毒性光漂白的超高分辨率显微镜，扩展应用仍有诸多挑战。细胞内有成千上万的转录本，有数以万计的蛋白分子。超高分辨率显微镜能否用来实现组学水平的多分子检测？能够找到或开发出足够多样的荧光染料以匹配更多分子吗？或者能找到奇方妙法可以实现多重、多轮检测吗？ 能否开发出新型的荧光染料，使其具有更高的光子预算，更好的光稳定性、光激活、光开关以及转换速率等特性；研制更快更灵敏的光子探测器、输出功率更高的激光器；更稳定、高效、智能的光学系统；更加高效的算法以及不同超高技术路线的联合应用；开发组学水平的多重检测方法等等，正有许多的科学家、研究者们正在进行着有益的尝试。相信未来超高分辨率技术应可应用于实现细胞内的原位测序、原位转录组与蛋白质组分析，并最终获得全景的、多组学、全时空细胞全部分子组织及相互作用图像，真正实现分子生物学与细胞生物学的新融合，让人类有更全面、更精细的视角来理解生命的基本分子组织及其运行的基本机制！超高分辨率技术和产品应用前景巨大，未来可期，令人振奋！

p 作为质谱领域最具前景的技术之一，质谱成像技术现已经成为仪器厂商、科研院所的重要关注焦点，预测未来市场争夺也将日益激烈。为提升用户对质谱成像技术、应用的了解，促进质谱成像技术的推广应用，仪器信息网邀请科瑞恩特公司对其质谱成像技术、应用等方面进行了讲解。/ppspan style="color: rgb(0, 112, 192) "strong　　1、请介绍一下贵公司的质谱成像系统研发过程，该系统有哪些特点?/strong/span/pp　　TransMIT AP-SMALDI 10超高分辨率质谱成像系统由德国吉森大学世界知名质谱学家Bernhard Spengler教授研制开发。Spengler教授于1994年在芝加哥举行的第42届美国质谱年会(ASMS)上提出了MALDI Ion Imaging和Biological Ion Imaging的概念，即“质谱成像(Mass Spectrometry Imaging)”，并首次把MALDI成像方法用于分析多肽类化合物。/pp　　TransMIT AP-SMALDI 10质谱成像系统搭载Thermo Scientific™ Q Exactive™ 系列质谱仪，实现了超高空间分辨率和超高质量分辨率的完美结合，是一款高端的质谱成像系统。该系统目前能够实现细胞水平的空间成像分辨率，并且集高质量分辨率、高质量精度及串联质谱于一身，为准确、全面的分析质谱成像数据提供了可靠保证。其具体优势如下：/pp　　1)常压到中压的操作环境，极大简化了样品制备的方法，无需昂贵的导电靶板(如ITO导电玻璃)，极大的节约了成本；/pp　　2)能够获得 5 μm的高空间分辨率，全景呈现了分析物在组织中的分布和细微差别，可用于单细胞质谱成像分析；/pp　　3)激光束和离子流的同轴设计解决了高空间分辨率和低采样量之间的矛盾；/pp　　4)具有独立开发的用于高分辨质谱成像的数据分析处理软件；/pp　　5)与Thermo Scientific™ Q Exactive™ 系列质谱仪兼容，实现未知化合物的准确鉴定。/pp style="text-align: center "img title="001.jpg" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201801/noimg/34a40d28-94da-4d5c-963a-bdc9ddb678cf.jpg"//pp style="text-align: center "span style="color: rgb(0, 112, 192) "strong图1 TransMIT AP-SMALDI 10质谱成像系统/strong/span/ppspan style="color: rgb(0, 112, 192) "strong　　2、目前，贵公司质谱成像系统主要应用在哪些方面?应用情况如何?请举例说明。/strong/span/pp　　超高分辨率TransMIT AP-SMALDI 10质谱成像系统问世后，在生命科学领域展示了绝对优势，已经应用于不同组织中多种内源性物质的可视化检测，如脂类、多肽、蛋白质、核酸和糖类等，以及外源性物质检测，如药物及其代谢产物。多项研究成果发表于Nature Methods、Angewandte Chemie International Edition，The Plant Journal， Analytical Chemistry，Analytical and Bioanalytical Chemistry等国际知名期刊上。/ppspan style="color: rgb(0, 112, 192) "　　2.1 应用 TransMIT AP-SMALDI 10研究脂类分子的组织空间特异性分布/span/pp　　脂类代谢异常是引发多种疾病的重要原因，研究脂类分子的组织空间特异性分布对于阐明脂代谢异常疾病的机制具有重要意义。下图2中所示为小鼠膀胱组织内磷脂分子的分布特征。采用高空间分辨率成像能够实现离子成像(图2a)和组织染色(图2b)的完美对接，精准定位不同磷脂分子在组织中的特异性分布。当空间分辨率提升到3μm时，细微的差异得以揭示，如图2d中的膀胱组织肌层(绿色)和上皮层(红色)可明显区分开来。因此同传统染色方法相比，TransMIT AP-SMALDI 10系统可以提供高度特异磷脂分子在不同类型细胞中的分布，获得更为详尽的组织化学信息。/pp style="text-align: center "img title="002.jpg" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201801/noimg/e815aafc-dd5e-4c1c-ab7c-9b22673e5df8.jpg"//pp style="text-align: center "span style="color: rgb(0, 112, 192) "strong图2 应用 TransMIT AP-SMALDI 10研究脂类分子在小鼠膀胱组织中的空间特异性分布/strong/span/pp style="text-align: center "span style="color: rgb(0, 112, 192) "strong(引自：Angewandte chemie international edition, 2010, 49(22): 3834-3838)/strong/span/pp　　span style="color: rgb(0, 112, 192) "2.2 应用TransMIT AP-SMALDI 10研究肿瘤相关生物标记物的组织空间特异性分布/span/pp　　在肿瘤学领域，生物标志物一直是研究热点。作为个体化医疗的“关键词” 之一，其相关研究方兴未艾。质谱成像技术的诞生，为发现肿瘤标志物的组织特异性提供了不可替代的技术手段。TransMIT AP-SMALDI 10系统可以同时提供高空间分辨率和高质量分辨率，为准确捕捉标记物提供了双重保障。以人非小细胞肺癌诱导重症联合免疫缺陷小鼠模型为例，在肿瘤组织的坏死部位发现了少量LPC存在(图3c绿色)，而坏死部位的细胞开始退化，同时出现了脂类的降解产物。因此，可以通过发现未知分子的分布情况，获取肿瘤发生过程中的分子变化特征，以判断肿瘤所处的不同阶段，为肿瘤研究提供更为详尽、精准的判断依据。/pp　　此外，TransMIT AP-SMALDI 10的高质量精度和分辨率为脂类的精确分析提供了保证。当质量窗口为Δm/z=0.1时，健康组织和肿瘤组织无法区分开(图3d)，而当质量窗口为Δm/z=0.01时(图3 e、g、f)，则能把两种组织明确的区分开，获得更为可靠、准确的成像结果。/pp style="text-align: center "img title="003.png" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201801/noimg/377a9cfb-03af-494f-acf2-eefabe5490e1.jpg"//pp style="text-align: center "span style="color: rgb(0, 112, 192) "strong图3 脑苷脂类和溶血卵磷脂酰胆碱类在小鼠脑组织中的分布，空间分辨率10μm/strong/span/pp style="text-align: center "span style="color: rgb(0, 112, 192) "strong(引自：Histochemistry and cell biology, 2013, 139(6): 759-783)/strong/span/pp　　span style="color: rgb(0, 112, 192) "2.3 应用TransMIT AP-SMALDI 10研究药物分子的组织空间特异性分布/span/pp　　研究药物分子及其代谢产物在动物组织中的空间分布是质谱成像技术的主要应用方向之一。与传统放射自显影方法相比，质谱成像技术的主要优势是能够实现无标记检测和准确区分药物及其代谢产物。以往用于药物成像分析的分辨率普遍较低，不足以检测药物分子在组织中的空间分布。图4所示为应用TransMIT AP-SMALDI 10系统可视化抗肿瘤药物伊马替尼(图4-Ⅰ、4-Ⅱ)和异环磷酰胺(图4-Ⅲ)在小鼠肾脏组织中的分布，获得特异药物分子在组织中的精确定位，为肿瘤的靶向研究提供更为精准的信息。/ppimg title="004.png" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201801/noimg/173df3ae-6f58-40a8-bc67-a132a8468662.jpg"//pp style="text-align: center "span style="color: rgb(0, 112, 192) "strong图4 Ⅰ 伊马替尼在肾脏组织中的分布，空间分辨率35μm；Ⅱ 伊马替尼在肾脏组织局部分布，空间分辨率10μm；Ⅲ 异环磷酰胺在肾脏组织局部分布，空间分辨率25μm(引自：Analytical and bioanalytical chemistry, 2011, 401(1): 65-73)/strong/span/ppspan style="color: rgb(0, 112, 192) "　　2.4 应用TransMIT AP-SMALDI 10研究植物次生代谢物组织空间特异性分布/span/pp　　毫无疑问天然产物是人类药物开发的宝库。质谱成像技术为天然产物化学家和植物学家提供了新的研究思路和手段。以“国老”甘草为例，其根茎中的黄酮类和皂苷类成分得到了精确的定位。如图5所示，TransMIT AP-SMALDI 10系统的高质量分辨率和质量精度确保了具有相同平均质量、紧密相邻的两个峰能够被分离出合适的选择性离子图像。图5b所示m/z相差0.02098的两个离子呈现出差异性，在甘草根茎中的数量和空间分布截然不同。如采用低质量分辨率质谱成像，甘草酸(m/z 861.36676)和甘草皂苷G2(m/z 861.38721)无法区分开，因此高空间分辨率和高质量分辨率是准确可视化平均质量相同的化合物的可靠保证。/ppimg title="006.jpg" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201801/noimg/0384c690-695d-45d6-8363-990e9cc445b5.jpg"//pp style="text-align: center "span style="color: rgb(0, 112, 192) "strong图5 a 甘草根茎横切面光学成像 b 甘草酸(m/z 861.36676)和甘草皂苷G2(m/z 861.38721)的单像素质谱图及其质谱成像图，空间分辨率30μm c 低分辨率质谱图(引自：The Plant Journal, 2014, 80(1): 161-171)/strong/span/ppspan style="color: rgb(0, 112, 192) "　　2.5 应用TransMIT AP-SMALDI 10研究昆虫内源性代谢物的空间分布/span/pp　　昆虫在“生物圈”扮演着很重要的角色，在很多方面起到传播媒介的作用，但有些昆虫也会对人类产生威胁，能够通过释放毒液或叮咬对人类造成伤害，比如斯氏按蚊能够携带疟原虫引发疟疾的传播。TransMIT AP-SMALDI 10高空间分辨率的特性为体积极小的生物体成像提供了完美的解决方案。如下图6所示，该系统清晰地呈现了脂类物质在斯氏按蚊头部、胸部、腹部的空间分布，为昆虫研究提供了一个全新的技术手段。/pp style="text-align: center "img title="001.jpg" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201801/noimg/b1d2fe78-0b77-491b-b6ec-8c1c76726df6.jpg"//pp style="text-align: center "span style="color: rgb(0, 112, 192) "strong图6 TransMIT AP-SMALDI 10斯氏按蚊质谱成像，空间分辨率 5 μm/strong/span/pp style="text-align: center "span style="color: rgb(0, 112, 192) "strong(引自：Analytical chemistry, 2015, 87(22): 11309-11316 )/strong/span/ppspan style="color: rgb(0, 112, 192) "　　2.6 TransMIT AP-SMALDI 10在单细胞研究中的应用/span/pp　　细胞是组成生命体的基本单元，了解一个细胞中发生的事件对于我们认识生命过程有重要意义。由于细胞的异质性，在群体细胞乃至组织水平上的采样可能已经使得一些重要的分子信息淹没在大量正常细胞中而被遗漏掉了。TransMIT AP-SMALDI 10系统为客户提供了单细胞质谱成像分析方案，能够可视化单细胞中的重要代谢物。如下图7所示，首次实现了单个Hela细胞中多种物质的精确区分和精准定位，为单细胞内研究提供了坚实的技术支撑。/ppimg title="009.png" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201801/noimg/0e758951-5515-4020-ba00-8ed803256d4f.jpg"//pp style="text-align: center "span style="color: rgb(0, 112, 192) "strong图7 TransMIT AP-SMALDI 10 Hela细胞质谱成像，空间分辨率7μm/strong/span/pp style="text-align: center "span style="color: rgb(0, 112, 192) "strong(引自：Analytical chemistry, 2012, 84(15): 6293-6297)/strong/span/ppspan style="color: rgb(0, 112, 192) "　strong　3、贵公司如何看待质谱成像仪器的技术及市场发展现状，目前有哪些问题亟待解决?/strong/span/pp　　在国际上，质谱成像技术是分析化学领域的一支新生力量，是目前最前沿的表面分析技术之一。因其独特的分析方式，为科研工作者带来了全新的研究视角。近五年，在各大领域将继续大显身手，获得越来越多的青睐和认可。TransMIT AP-SMALDI 10离子源与Obitrap高分辨率质谱仪结合独具特色，兼具高空间分辨率、高质量分辨率和质量精度，以及串联质谱功能，将成为医学研究、药物开发、植物生物学、昆虫学、微生物等领域的重要研究工具。/pp　　未来质谱成像仪的各项性能都会继续得到提升，最受关注的依然是空间分辨率的提升，定量方法的开发以及便捷准确的数据处理方法。/pp　span style="color: rgb(0, 112, 192) "strong　4、质谱成像仪器需求情况如何?贵公司质谱成像仪器推广做了哪些工作?/strong/span/pp　　预测质谱成像仪在我国的需求量将呈现快速增长的态势，成为各大科研院所的必备科研设备。我公司在产品推广上主要以参加学术会议和讲座为主，比如中国质谱学会学术年会和生物学术年会。到目前为止，我们先后在中科院微生物所、中科院高能物理所、第二军医大学、中科院上海植物生理生态所开展了系列学术讲座，向科研工作者介绍TransMIT AP-SMALDI 10质谱成像仪的原理和应用，收到了很多的关注和好评。/pp　　未来，我公司会逐步加大推广力度，为科研工作者提供切实可靠的质谱成像整体解决方案，相信TransMIT AP-SMALDI 10能够为我国研究人员带来意想不到的效果。/pp　　本文由TransMIT国内授权代理商科瑞恩特(北京)科技有限公司(Create (Beijing) Technology Co., Limited)提供。/ppspan style="color: rgb(0, 112, 192) "strong　　参考文献：/strong/span/pp　　1、Kompauer M, Heiles S, Spengler B. Atmospheric pressure MALDI mass spectrometry imaging of tissues and cells at 1.4-[mu] m lateral resolution[J]. Nature methods, 2017, 14(1): 90-96./pp　　2、Kompauer M, Heiles S, Spengler B. Autofocusing MALDI mass spectrometry imaging of tissue sections and 3D chemical topography of nonflat surfaces[J].Nature methods, 2017, 14(12): 1156./pp　　3、Khalil S M, Rompp A, Pretzel J, et al. Phospholipid topography of whole-body sections of the anopheles stephensi mosquito, characterized by high-resolution atmospheric-pressure scanning microprobe matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging[J]. Analytical chemistry, 2015, 87(22): 11309-11316./pp　　4、Li B, Bhandari D R, Janfelt C, et al. Natural products in Glycyrrhiza glabra (licorice) rhizome imaged at the cellular level by atmospheric pressure matrix‐assisted laser desorption/ionization tandem mass spectrometry imaging[J]. The Plant Journal, 2014, 80(1): 161-171./pp　　5、Rompp A, Spengler B. Mass spectrometry imaging with high resolution in mass and space[J]. Histochemistry and cell biology, 2013, 139(6): 759-783./pp　　6、Schober Y, Guenther S, Spengler B, et al. Single cell matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging[J]. Analytical chemistry, 2012, 84(15): 6293-6297./pp　　7、Rompp A, Guenther S, Takats Z, et al. Mass spectrometry imaging with high resolution in mass and space (HR2 MSI) for reliable investigation of drug compound distributions on the cellular level[J]. Analytical and bioanalytical chemistry, 2011, 401(1): 65-73./pp　　8、Rompp A, Guenther S, Schober Y, et al. Histology by mass spectrometry: label‐free tissue characterization obtained from high‐accuracy bioanalytical imaging[J]. Angewandte chemie international edition, 2010, 49(22): 3834-3838./p

双倍提升结构光照明显微技术分辨率蔡司新一代超高分辨率显微成像系统Elyra 7 with Lattice SIM2蔡司推出了具有开创性的Lattice SIM²，可提高结构照明显微镜（SIM）的分辨率和光切质量。使用显微镜系统蔡司 Elyra 7上的Lattice SIM²，将传统的SIM分辨率提高一倍，生命科学研究人员现在可以以60nm分辨率区分出活的和固定的样品的最佳亚细胞结构。SIM是一种基于栅格的照明技术，可以以超出光学显微镜衍射极限的分辨率进行成像。两年前，随着蔡司Lattice SIM的推出，SIM成像技术迈入新的时代，蔡司将SIM的分辨率优势与成像速度和检测灵敏度的大幅提高相结合，使超高分辨率显微镜蔡司 Elyra 7成为活细胞成像的理想选择。借助Lattice SIM²，蔡司通过不懈努力将超高分辨率成像技术又向前推进一大步，使研究人员能够突破以往超高分辨率成像技术在分辨率，成像速度和光毒性等方面的限制。Lattice SIM2同时提升分辨率、光切性能和样品适用性Lattice SIM²在分辨率，光切性能和样品适用性方面均优于传统的SIM，而无需特殊的染色方案或复杂的显微镜技术的专业知识。Lattice SIM²不仅可以解析低至60 nm的结构，还可以同时进行超高分辨率和高动态成像——这是观察活细胞或生物体中快速生物过程的必要条件。以远低于100 nm分辨率进行活体生物样品成像借助Lattice SIM²，研究人员现在可以同时以低于100 nm的分辨率和高达255fps速度进行活体生物样品的细节成像。这种简单易用又能达到高时空分辨率的成像方式，将使发现新的亚细胞功能原理成为可能，并有助于更好地了解细胞器的分布和结构。发育生物学，神经科学，植物科学和相关学科的研究人员将通过揭示快速的细胞过程，以更深的成像深度解析3D结构并研究分子水平的结构变化，来获得对模式生物和标本的更多见解。参与产品测试的用户立即意识到Elyra 7 with Lattice SIM²的研究潜力，并对新的可能性表示了热情。约克大学影像与细胞计量学负责人Peter O’Toole：“我记得最初看到结果时，我惊讶的大笑。我的下一个反应是向可以立即受益的一些关键用户发送电子邮件。从组织神经生物学家到细胞和分子免疫学家，再到从事酵母和细菌研究的科学家，他们都已经从Lattice SIM²中受益。”随着Lattice SIM²的推出，蔡司Elyra 7将不断发展成为兼容活细胞的超高分辨率显微成像的主要平台。蔡司有着强大的动力，想为科学界提供可轻松使用先进的成像技术

组织透明化技术和光片荧光显微技术的发展，使研究者能从宏观到微观对生物组织内部的结构及生理、病理特征进行观察和功能性分析。锘海生物科学仪器（上海）股份有限公司提供完整器官的组织透明化、组织免疫荧光染色、高分辨3D显微成像以及大数据分析一体化服务，旨在通过精准、快速、多样化的CRO服务为每一位生命科学工作者提供个体化/定制化的解决方案。基于SHIELD、SWITCH等技术（Park et al., Nature Biotechnology, 2019）的主动式组织透明化方法和快速3D免疫染色让组织处理的时间极大的缩短，同时又很好的保护了荧光蛋白，实现快速、均一的大组织透明化及免疫染色。只需要与我们的技术人员进行简单沟通和必要的前期准备，即可开始你的3D成像之旅。锘海LS 18宣传视频小鼠肺部成像全脑血管成像组织透明化/免疫染色/高分辨率3D成像一体化解决方案无需切片 / 无需等待 / 无需担忧基于SHIELD方法优化的固定剂，对生物组织荧光、蛋白抗原性和组织结构起到保护作用。SHIELD方法无需水凝胶包埋操作，可重复性高。SmartClear II Pro组织透明化仪器与SHIELD、SWITCH等方法固定的组织兼容。与采取有机溶剂的组织透明化（BABB, iDisco, uDisco, 3DISCO, vDISCO等）相比，具有更好的荧光保护效果，并且加快了处理速度，减少了有毒和挥发性物质的危害。SmartLabel独创性地将随机电泳技术和SWITCH技术结合起来，实现对大组织从里到外均一的免疫标记。与其它被动式的免疫标记方法相比，SmartLabel极大地缩短了抗体染色处理时间，达到前所未有的组织穿透深度。锘海LS18光片荧光显微镜采取平铺光片技术，对透明化大组织进行三维高分辨率成像，适用于各种透明化方法制备的微米级到厘米级的组织，为分子生物学研究、药物筛查和各细分学科领域提供更快速、更精准的分析方法。锘海LS18光片显微镜锘海生物科学仪器（上海）股份有限公司与西湖大学高亮（平铺光片技术发明人)实验室共同研制的新型光片照明显微镜LS 18，克服了传统光片显微镜3D空间分辨率、Z轴层析能力和成像视野之间的矛盾；摒弃原有选择性平面照明显微镜中的单光片照明的方式，运用多个薄的光片分段照明，在不损失成像视野的情况下，获得更高分辨率的3D图像。LS 18光片照明显微镜适用于各种不同类型透明化方法处理的样品（水性透明化方法如Scale、SeeDB、CLARITY、CUBIC、SWITCH、SHIELD等；油性透明化方法如BABB、3DISCO、iDISCO、uDISCO、PEGASOS等），都可得到高分辨率、高信噪比的多色荧光3D图像，能够快速定位宏观样品中的目标细胞，获得高分辨率的3D细胞微结构。关于锘海锘海生物科学仪器（上海）股份有限公司是一家创新型科技公司，总部位于开发区的上海漕河泾开发区松江园区内，在北京，广州，成都，沈阳等十余座城市设有办事处, 作为“生命科学的服务者，医疗创新的推动者“，致力于打造完整的生命科学研发、制造、服务生态体系。我们积极推进科学技术转化，其中，与西湖大学高亮实验室合作共同研制的光片显微镜Nuohai LS18是专为大组织样品设计的高速均匀高分辨率的3D荧光成像系统，Nuohai LS18的 “平铺光片技术”完美地解决了传统光片显微镜中空间分辨率、光学层析能力和成像视野大小之间的矛盾，满足高通量、准确定位的荧光成像分析需求，广泛应用于脑科学、肿瘤学、药物研发、干细胞研究、组织胚胎学等各个领域。我们拥有一支专业和经验丰富的研发、销售、技术和本地化服务的团队，团队中80%以上人员为高学历专业硕博人才，致力于为生命科学领域的科研及企业客户提供个性化、专业化的产品、服务和整体解决方案，让生命科学更加简单、高效。

荧光显微成像技术对人们理解神经科学起了非常关键的作用。而最近一些年出现的各种超分辨显微成像技术和专门的荧光探针能够以超过以往普通光学显微镜的分辨率直接观察神经元亚细胞结构和蛋白质排列。并以直观可视方式揭示了神经细胞骨架组成、分布、运动和膜蛋白信号传导、突触下结构和功能，以及神经元−胶质细胞相互作用。同时超高分辨显微成像技术（Super Resolution,SR,下文中出现SR均指超高分辨率显微成像技术）对于许多自身免疫和神经退行性疾病模型中的分子靶点研究也提供了全新的强大工具。今年春，Werner等科学家在美国化学学会会刊（ACS)上最新发表了一篇综述，比较详实系统介绍了超高分辨率显微技术在神经科学上的最新应用进展。我们在此文基础上进行了编译整理。因文章较长，分四期介绍。本期为第三部分内容。5.3. 突触后室突触受体位于突触后室，负责传递来自突触前末端的信号。它包含支架蛋白--负责锚定突触后受体的专门用于信号整合的信号分子。在神经元树突中，从主要树突轴起源并突起的小体积树突棘提供分区功能，并根据突触活动和发育阶段显示大小和形状的动态变化。树突棘是突触长时程增强（LTP）的结构相关物，因此与学习和记忆有关。要想准确观察树突棘的小尺寸、不同形状和动力学，一般要求采用超过衍射极限的分辨率并有可能进行活体成像的光学显微镜方法。第一个将活细胞SMLM应用于原代神经元的研究之一是使用碳菁染料（如Dil）可视化脊髓和丝状足。对于突触后膜结构的可视化，已经发现了一个新的膜标记试剂系列，该系列可实现神经元追踪和树突棘的可视化。最近，通过快速SIM和增强共聚焦显微成像研究了树突棘上微小突起（称为小刺）的动力学。通过将SIM成像与计算方法相结合，进一步评估了树突棘的几何结构，证实凹面对于棘结构稳定的重要性。在树突棘中，F-肌动蛋白高度定位富集在突触后密度区（PSD）和树突棘膜上。肌动蛋白的分子速度升高已让其扩散到除棘尖外整个棘的亚区。为了分析脊髓中肌动蛋白的动力学，我们设计了一种低亲和力的光转换肌动蛋白探针，并利用像差校正光学系统对活体脑切片动力学进行了表征。通过STED显微镜观察对phalloidin-ATTO647N标记的原代神经元，可以在树突棘颈和丝状棘中观察到F-肌动蛋白的周期性片段。同年，STORM成像也显示树突棘颈和丝状棘中存在以肌动蛋白为基础的周期性膜骨架。在树突棘中，分支的F-肌动蛋白在PSD附近聚集，而延伸仅限于指状突起的尖端，并为棘突提供了基础。通过基于监督学习的模式识别进行图像分割，可以对树突肌动蛋白组成异质性做自动分析。用SMLM也对树突F-肌动蛋白进行了同样的分析，并使用树突铂复原电镜进行了验证。使用STED显微镜在活体小鼠脑切片海马CA1神经元上进行延时拍照并结合FRAP及电生理学检查，证明在神经递质释放诱导的长时程增强（LTP)时树突棘颈部具有可塑性（宽度增加并长度减少）。使用正置STED显微镜实现了活体小鼠树突棘动力学的首次超高分辨率成像。在这里Thy1 EYFP小鼠体感皮层中的树突棘在其头部和颈部表现出形态可塑性。另外使用双光子STED成像对活体小鼠的海马树突棘动力学进行了研究，树突棘密度与早期报告相比高出2倍，并能测算几天内的树突棘蛋白周转率（图10）。图10 体内长时程双光子STED成像--海马CA1锥体神经元树突棘蛋白周转。左上图：使用长工作距离物镜的实验方法和CA1锥体神经元的双光子整体图像。右上图：传统的双光子成像与双光子STED成像的比较，显示了总体上更高的棘突密度和更详细的形态，特别是在轴和棘突中。空的箭头标志着常规双光子成像不能显示的棘突，而填充的箭头表示双光子STED报告的棘突数量更多、形态更复杂。底部图像：在海马CA1区基底树突的一个选定区域内，连续几天（第0天、第2天和第4天）成像的树突棘周转。树突棘被连续编号。AB=接近树突的轴突（缩回的棘突用红色标记；新的棘突用绿色标记）。转载自原文参考文献 273。此外，sptPALM揭示了富集在突触棘的突触后激酶CaMKII的空间和动力学亚群，该激酶介导钙依赖性可塑性机制。这些动力学似乎由棘肌动蛋白调节，因为Latrunculin A导致棘内CaMKII扩散显著改变。在PSD内的棘头，一个密集的蛋白质复合物含有不同的突触后支架蛋白，如PSD-95、homer1和shank3，它们排列在大小为∼80纳米的亚突触域中。根据不同的突触类型，PSD-95被动态组织为单个单元或多个纳米簇的形式。STED显微镜揭示了突触后支架蛋白负责将离子受体锚定到突触后膜上，SMLM观察到的活体原代神经元也是一样。在这里，活细胞单分子成像结合定量分析揭示了含有GluA2的AMPA-Rs（优先聚集在突触下的PSD-95簇中）的稳态调节。而PSD-95的uPAINT成像和AMPA-Rs的spt PALM报告在70 nm大小的PSD-95纳米域内平均聚集了20个AMPA-Rs，进一步证实了上面提到的这个发现。AMPA-Rs形成纳米颗粒，并能在几分钟内动态改变其大小和形状。与突触可塑性匹配的是：动态变化是通过突触内和突触外隔室之间的AMPA-Rs在时间维度交换，通过横向扩散来实现的。这些过程通过以微球标记抗体为靶点的内源性受体的单分子追踪实验得到证实。受体运动的类型被认为是布朗扩散，与突触后元件发生短暂的、低亲和力的相互作用。单分子追踪实验中使用Atto 647N修饰的抗体揭示了谷氨酸诱导的脱敏AMPA-Rs的侧向扩散增加导致的短期可塑性。AMPA-Rs的侧向扩散也与突触的短时程增强和长时程增强（分别为STP和LTP）有关。例如，已经证明，为了从突触抑制中恢复，脱敏受体通过侧向扩散被功能受体替换。此外，追踪实验表明，在CaMKII激活诱导LTP后，AMPA-Rs扩散到突触部位。这一过程由钙浓度升高触发，它导致CaMKII介导的stargazin（它与PSD-95一起能够调节AMPA-R的迁移率）磷酸化。进一步的研究报道，AMPA-Rs的交联导致膜上受体制动，它阻止了成功的LTP诱导。这一机制也可能导致由AMPA的致病性抗体介导的自身免疫性CNS疾病的病理生理学。与NMDA-R和mGluR5代谢受体的GluN1亚单位相比，AMPA-Rs的纳米级结构以不同的簇大小为特征。令人惊讶的是，突触前mGluR5受体表现出更均匀的分布，没有聚集行为。通过一种新的基于敲入的基因组编辑方法观察到，代表NMDA-R总库的内源性GluN1亚单位受体被证明聚集在一个由单个受体包围的主要单簇中。在关注NMDA-R细分的NR2A和NR2B亚型时，SMLM表明，在突触发育过程中，这些亚型被分割成纳米结构域，并根据其突触比率进行重塑。关于谷氨酸受体的活动性，单分子追踪实验揭示，神经元活动优先影响AMPA-R的活动性，而NMDA-R的活动是由蛋白激酶C活动触发的，而不是由钾升高触发的。此外，dSTORM成像表明，不同的NR2亚单位定位于不同的纳米结构域，这些纳米结构域在神经元发育过程中表现出灵活性。根据NR2A和NR2B的纳米结构，LTP的表达可以双向调节。kainate受体的单分子追踪实验也表明，突触捕获紧随着突触活性增加后发生。这里，突触激活导致的kainate受体与突触β-连环蛋白/N-钙粘蛋白复合物结合，形成短期可塑性。作为抑制性突触的对应物，gephyrin是将GABAA（GABA-a R）或甘氨酸受体（GlyR）并入突触后膜所必需的关键锚定分子。通过对突触中gephyrin分子的PALM/dSTORM成像发现：抑制性PSD（iPSD）体积为0.01至0.1μm3，并且每个iPSD中有200−250个gephyrin分子。单分子成像进一步揭示了gephyrin分子与受体结合位点的化学计量比约为1:1.96。类似于兴奋性突触，抑制性PSD（IPSD）根据突触活动动态调节其大小。通过NMDA-R激活形成的抑制性突触LTP加剧突触gephyrin积累，从而以CaMKII依赖的方式增加GABA-AR聚集，从而诱导GABA能突触后电流的增强。相反，抑制gephyrin向突触区的募集导致GABA-AR迁移率降低，并阻止iLTP的诱导。iLTP诱导后，gephyrin片段化为纳米结构域。gephyrin的重组降低了抑制性突触后电流的振幅变异性，证明了GABA-AR准确定位对于iLTP的真正表达非常重要。有趣的是，单粒子追踪显示，脱敏的GABA-AR甚至可以通过侧向扩散在并列的GABA能突触之间交换，为控制GABA能电流提供了另一种机制。此外，为了阐明多巴胺能突触的超微结构布局，dSTORM成像将多巴胺转运体映射到胆固醇依赖性纳米结构域，从而为更好地理解多巴胺能神经传递的病理生理过程奠定基础。5.4.亚突触结构域中的跨突触排列早期电生理学实验中已经发现，突触强度取决于突触前融合位点和突触后受体组织之间的空间关系，突触释放由释放位点的数量，突触小泡的释放概率，以及受体提供的突触后基本反应来决定。首先观测到的亚结构域的跨突触组织是突触粘附分子SynCAM 1位于边缘，EphB2位于PSD的中央。SynCam1在PSD中形成突触下云，可被长期抑郁症模式重塑。SMLM观察链霉亲和素的新单体变体（设计用于减少突触区域的交联和空间位阻），表明跨突触伙伴神经肽原1和神经纤维素1ß在突触处扩散受阻，形成相反的簇。这项研究还表明，另一种粘附分子LRRTM2的流动性不如神经肽1，并形成更密集、更稳定的簇。最近揭示了兴奋性突触上活性区的细胞基质和突触后受体支架的跨突触排列，它与提供高保真突触传递的靶向神经递质释放有关。在这里，释放位点定位是通过一种基于融合到突触囊泡蛋白Vglut1的pHluorin标记和RIM1/2纳米簇的超分辨检测的新方法实现的。多色3D定位显微镜显示RIM1/2和突触后PSD-95形成相反的纳米簇。LTP诱导导致PSD-95密度断裂增加，同时增强了纳米柱的排列，而LTD导致突触后柱的紊乱。突触前和突触后关键分子的这种纳米级排列主要由于neuroligin 1。此外，在应用STED显微镜的实时成像实验中，已经报道了树突棘体积增加和排列的纳米模块数量之间的紧密相关性。还报道了抑制性突触的亚突触结构域的纳米级排列。在这里，STED和SIM阐明了gephyrin和GABA-AR突触前亚区域的紧密联系。此外，突触后GABA-A 受体云显示与突触前边缘结构域结合（图11）。在小鼠神经肌肉连接处，带连接褶开口的突触后乙酰胆碱受体和突触前活动区的排列已通过应用SIM成像可视化。图11. 抑制性突触上的突触亚结构域。突触前的RIM元素与突触后的gephyrin支架分子以及抑制性突触的GABA-A R的突触下结构域的排列。PSD的体积和突触下域的数量随着活动相关的突触大小的变化而变化。转载自原文参考文献302。5.5. 三联突触星形胶质细胞是神经传递的基本调节者，神经元突触周围突触前星形细胞突起（PAPs）的吞噬产生了三联突触这一术语。PAPs能够通过传递调节分子来改变和控制突触的传递。通过dSTORM重建星形细胞突起，可以通过标记胶质酸性纤维蛋白（GFAP）和谷氨酰胺合成酶和S100b的成像来实现星形细胞的纳米级可视化。最近的一份报告应用ExM来观察脑片中突触周围的星形胶质细胞谷氨酸转运体显示，在与这些棘附近的GLT-1水平较高有关的较大的神经元树突棘中，谷氨酸的摄取效率降低（图12）。图12. 海马大脑切片中CA 1锥体神经元周围的星形细胞突起。锥体神经元的树突在Thy1-YFP小鼠系标记（绿色）；星形胶质细胞则是在海马脑片上的GLT-1免疫染色显示（红色）。蓝色信号代表树突区和星形细胞突起的共同定位。更高的放大率插图见右图。左下：大棘和小棘的分类。底部中间和右侧：GLT-1和神经元YFP的共定位像素的量化。请注意右图树突棘体积归一化后的变化；红点表示平均数和SEM，p = 0.0220 (绝对GLT-1覆盖率），p = 0.00223（相对GLT-1覆盖率）。转载自原文参考文献307。EM和STORM发现，PAPs也配备了局部翻译位点，以避免星形细胞体细胞中合成的蛋白质的长距离运输路线。最近在器官型切片中进行的3D STED显微镜研究揭示了星形细胞钙信号的结构前提。在星形细胞内检测到了海绵状结构，它包含了接近突触部位的节点和轴。钙离子瞬变的共聚焦成像与星形细胞结构的STED显微镜相结合，显示自发的钙离子瞬变紧密地映射到这些结点。因此，这些结点被认为是类似于树突棘的空间分隔作用。胶质传导物质的外渗需要提供胶质囊泡。通过将电容测量与葡聚糖摄取后星形胶质细胞内的囊泡的SIM图像相关联，发现了外吞和内吞之间的Dynamin依赖性膜中间物。通过STED显微镜和SIM分析单个胶质小泡的特征，在星形胶质细胞中有两个小泡群，其大小和融合能力不同。Phluorin实验结合SIM确定星形胶质细胞囊泡上Syb2分子的拷贝数为25∼。此外，应用STED和TIRF显微镜对培养的星形胶质细胞中的VAMP3阳性囊泡进行了单囊水平的分析。测量结果显示VAMP3覆盖的囊泡大小约为80纳米，并提供证据表明这些囊泡参与了钙依赖性的囊泡循环。SIM成像还可以发现，突触蛋白中一种已知的参与神经元外排的v-SNARE蛋白，也普遍存在并组织在单个星形胶质细胞的囊泡上，以实现高效的外排。星形胶质细胞还通过回收proBDNF到BDNF参与促进兴奋性LTP。这里，SIM成像显示，proBDNF在体细胞区域位于囊泡大小的集群中，而沿星形胶质细胞末梢的点状模式占主导地位，以扩大BDNF对记忆的作用。为了最大限度地减少激发光的散射，通过应用被动CLARITY进行组织透明化和多光子显微镜，改善了组织深处的星形细胞成像。通过使用SiR-actin和SiR-tublulin探针的STED显微镜和原子力显微镜（AFM）的相关方法来测量膜的拓扑结构和硬度，将星形细胞的细胞骨架和膜的生物物理特性联系起来。（未完待续）本文由超高显微技术应用工程师郭连峰、黄梓彤编译（受篇幅限制，未将参考文献列出）相关阅读：超高分辨率显微技术在神经科学中的应用（一）超高分辨率显微技术在神经科学中的应用（二）

荧光显微成像技术对人们理解神经科学起了非常关键的作用。而最近一些年出现的各种超分辨显微成像技术和专门的荧光探针能够以超过以往普通光学显微镜的分辨率直接观察神经元亚细胞结构和蛋白质排列。并以直观可视方式揭示了神经细胞骨架组成、分布、运动和膜蛋白信号传导、突触下结构和功能，以及神经元−胶质细胞相互作用。同时超高分辨显微成像技术（Super Resolution,SR,下文中出现SR均指超高分辨率显微成像技术）对于许多自身免疫和神经退行性疾病模型中的分子靶点研究也提供了全新的强大工具。今年春，Werner等科学家在美国化学学会会刊（ACS)上最新发表了一篇综述，比较详实系统介绍了超高分辨率显微技术在神经科学上的最新应用进展。我们在此文基础上进行了编译整理。因文章较长，我们将分三期陆续介绍。本期接着上期的第一部分超高分辨率显微技术在神经科学中的应用（一） ，为第二部分内容。4.荧光标记与样品制备4.1. 荧光标记神经元和脑片的超分辨率成像是用适当的荧光团标记感兴趣的生物分子，理想情况下是以定量和化学计量的方式。虽然SIM和其他超分辨方法的成像质量取决于信号背景（S/B）比，但SIM对荧光团没有特殊要求。另一方面，STED显微镜可达到的分辨率在很大程度上取决于所用荧光团的光稳定性。RESOLFT显微镜使用可逆光开关FPs，具有两个稳定状态，因此可以使用较低的激光照射强度。所有SMLM方法的定位精度取决于每个事件检测到的光子数。dSTORM需要光开关有机荧光团，包括菁、罗丹明和恶嗪染；而PALM则需要使用光开关、光转换和光激活FPs。与此相反，DNA-PAINT理论上适用于所有荧光团，因为开/关速率由对接链和成像链序列和缓冲条件决定，而其中 Cy3B和ATTO 643效果最好。、为了获得一张好的超分辨率图像，除了成像方法以外，样品制备也非常关键。使用荧光探针进行高效和特异的标记，并且使标记误差（荧光团和目标之间的距离）达到最小。为了通过荧光成像进行结构解析，标记密度（即荧光探针之间的距离）必须显著高于所需的分辨率。另一方面，特别是对于接近几乎分子分辨率的超分辨率成像方法，标记误差必须尽可能小，以达到高精度成像。对于活细胞标记而言，在合适的表达载体中融合感兴趣的蛋白质的基因编码FPs无疑成为首选。然而，FPs的亮度较低，与有机染料相比，其图像分辨率较低。理想的标记方法是使用荧光染料标记基因编码的蛋白质、肽标签或单一氨基酸。在模式生物如果蝇或秀丽隐杆线虫的应用得益于基因编码工具，通过转座子、操纵二分体Gal4/UAS表达系统或Crispr/Cas9方法引入或去除突触蛋白和荧光蛋白。由于瞬时转染的细胞表现出不同的蛋白质表达水平，蛋白质的分布和功能不一定反映野生型的情况。图5 通过单体链霉亲和素结合AP标记的突触蛋白成像结果显示Nlg1和LRRTM2的差异分布（dSTORM成像）。上排：Homer 1c GFP作为突触后室的参考。第二排：Nlg1和LRRTM2（dSTORM成像）。左下：频率分布直方图，用于显示相对于Homer 1位置中心的信号分散情况。右下：列出比较两种蛋白质的突触结构域数量的直方图。然而，通过构建优化表达，稳定表达的细胞或CRISPR基因敲入等方法可以产生从内源性到强过表达的蛋白质表达水平。根据不同的转染策略，可以采用不同的方法转染神经元。传统的磷酸钙共沉淀法和脂质体法在大多数实验室都可实施，但这两种技术的转染效率很低。而病毒转染的效率比较高，允许注射到大脑区域，但需要实验者具备病毒生产方面的专业知识，并需要考虑生物安全问题。此外，还必须考虑病毒类型、插入片段大小、毒性和差异表达等因素。要达到高转染效率，可以使用高压脉冲将核酸直接输送到细胞核，进行核转染。然而其缺点是，当这种方法应用于小鼠原代神经元时，会导致细胞存活率较低，并且实验设备昂贵，还需要根据神经元密度和物种对脉冲参数进行多次测试。另外，也可以使用细胞附着式高电阻管，在完整神经元网络（如器官型切片）中进行单细胞电穿孔。利用这种方式，结合CRISPR基因敲入获得了接近内源性的蛋白质表达水平。基于CRISPR基因敲入，在神经元发育的不同时间点通过脂质感染、核感染或病毒转染在神经元中实现。如前所述，FPs光稳定性和荧光光子输出较低，这降低了图像质量。另外，连接大小为2−5nm的FP后,蛋白质功能可能会受到影响。因此,首先必须清楚感兴趣的蛋白质在野生型的功能表现。而有机染料比FPs小得多，有更高的光子产率和光稳定性，但需要与其它能与感兴趣分子结合的分子进行连接耦合。对于固定细胞，使用一抗和二抗进行免疫染色仍然是标记内源性蛋白质的首选方法。缺点是由两个大小17.5 nm左右的IG抗体间接免疫标记有可能导致标记误差。使用直接法免疫荧光或Fab片段可以减少标记误差。另外针对GFP或转基因短肽标签的更小（1.5×2.5 nm）的骆驼“纳米抗体”已应用于dSTORM成像。此外，耦合了链霉亲和素的荧光染料可用于神经元和器官型组织中靶蛋白的特异性标记。使用这种标记方法，研究了神经氨酸酶-1ß、神经肽原-1和富含亮氨酸的重复跨膜蛋白2的动力学和纳米级结构，并揭示了跨突触粘附结构的形成（图5）。另外可以使用生物正交肽或自标记蛋白质标签，例如FlAsH tags, SNAP-tags, and Halo-tags。这些标签蛋白与目标蛋白共表达，并以共价和特异性结合其各自的荧光标记试剂或配体。对于肌动蛋白和微管的标记，可以使用小肽药物，如双环七肽-鬼笔环肽和紫杉烷类药物，如紫杉醇。膜和细胞器的标记可以通过荧光脂质和细胞器的追踪试剂来实现。此外，小肽或配体可以直接用荧光团标记，并特异性结合生物分子，例如，显示抑制性突触后位点的超结合肽。要达到最小的标记误差，可以通过单个非天然氨基酸的特定位点标记实现。通过基因编码导入设计的非天然氨基酸，并用四嗪染料进行生物正交点击化学标记。显然，神经元和组织切片必须根据要成像的结构进行透膜和固定。与所使用的标记方法无关，特别注意所用的试剂必须能保留自然细胞环境中生物分子的超微结构。通过化学试剂固定交联蛋白质，可能会影响结合亲和力，也可能削弱分子间的相互作用。在大多数情况下，多聚甲醛（PFA）和戊二醛已成功用于神经科学的超分辨率成像。此外，还引入了乙二醛等新型固定剂。膜分子应始终使用4%的PFA和0.2%戊二醛固定，以尽量减少残余流动性并避免伪影，例如抗体结合诱导的簇形成。4.2. 神经元的多色遗传标记荧光蛋白彻底改变了神经元的活细胞成像方式，因为荧光蛋白可以与感兴趣的蛋白质融合，并且在假定不影响野生型功能的前提下，用于双色和三色成像。神经系统具有非常高密度的轴突和树突相互作用结构，需要使用更多不同颜色的标记来区分不同的神经元连接。2007年，随着一种名为Brainbow的转基因方案的开发，这一问题得到了解决，该策略能够对神经元进行多色标记。结合单细胞分辨率成像技术，Brainbow技术可以用来创建大脑图谱，详细描述神经元如何形成回路，其连接体以及它们投射到何处。Brainbow利用了三原色，即可见光谱的所有颜色都可以由三种原色的不同混合物生成，即红色、绿色、蓝色（RGB）或转化为荧光蛋白，例如RFP、YFP和CFP。为了实现这一想法，应用了Cre/lox重组系统，该系统可以通过DNA切除、反转或染色体重组启动基因表达，使三个荧光蛋白基因中的一个在转基因中随机表达。转基因盒的多个拷贝的引入导致三个不同拷贝数的基因在每个细胞中组合表达，从而产生几十种颜色，使相邻神经元分化并观察其相互作用。Brainbow技术非常适合绘制不同神经元类型之间的连接模式，追踪轴突，并识别大脑中远距离的神经元连接。此外，已经证明Brainbow表达可以成功地用于研究周围神经损伤后的轴突再生，并检测大脑发育过程中的重要阶段。为了进一步改进Brainbow在包括突触蛋白在内的大脑和连接图谱中的应用，SRM的应用是显而易见的。最近通过结合Brainbow、顺序免疫染色和ExM同时研究同一脑切片上的形态、分子标记和连接，成功地证明了这一点（图6）。将这项技术应用到全脑研究一直是一个挑战，直到最近才成功应用。图6 结合Brainbow和ExM的多轮免疫染色和ExM(miriEx)成像。(A) 实验方案：在Parvalbumin cre/+ 小鼠的脑切片中，Parvalbumin蛋白阳性中间神经元通过Brainbow进行观察，并在下一轮应用4倍ExM成像。使用EYFP信号对Homer1和Gephyrin进行免疫染色来观察突触。(B) Brainbow 信号的免疫染色。(C) 分别通过突触后标记homer1和Gephyrin的免疫染色来区分抑制性和兴奋性突触。插图(D)−(F)和(G)−(I) 显示图像的更多细节图。(J)和(K)神经元的形态重建(使用ImageJ软件插件nTracer)，包括其各自传入的特征。虚线框表示(B)和(C)中所示的区域。重建的神经元按顺序编号。标尺(膨胀前的)：10μm(B/C)、2.5μm(I)、20μm(J/K)。4.3. 神经科学中的光电联合显微镜电子显微镜(EM)和电子断层扫描具有光学显微镜无法达到的空间分辨率，可以获得细胞和细胞器的超微结构信息。然而，EM和电子断层扫描不能标记特定的分子，因此难以识别未知的细胞结构或具有相似形态特征的结构。用胶体金标记结合抗体可以实现蛋白质的纳米级定位，但抗原的标记效率低下，这意味着胶体金颗粒的数量仅占抗原总数量的1%到20%。而另一方面，荧光显微镜虽然分辨率较低，但可以进行大视场成像和对活细胞中蛋白质进行定位。对固定样本细胞中的各种分子进行高效和特异的分子标记后，结合超分辨率荧光显微镜方法，达到的空间分辨率可以远低于衍射极限。因此，光电联合显微镜（CLEM）作为一种通用的方法，在电子显微镜提供的细胞超微结构背景下，通过超分辨率成像来可视化蛋白质的定位和相互作用。然而，将超分辨率成像与EM结合起来更为困难，因为乍一看，这主要是由于两种方法的样品制备流程不同且不兼容。例如，EM中保存超微结构所需的固定和染色会引入很强的自发荧光。而且荧光蛋白还会在固定和聚合物包埋所需的脱水和氧化条件下淬灭。此外，这两幅图像必须在纳米精度下精确叠加，首先需要使用在荧光成像和EM中都表现出极好的对比度的固定对准标记物，如裸金微球。 另外，样品脱水引起的结构变形会严重破坏两幅图像的正确叠加。所以必须在超微结构和荧光保存之间找到折衷方案。例如，已经证明，对于某些周期性分子结构，如核孔复合体，无需使用对准标记，dSTORM和EM扫描图像可以以20 nm的精度叠加。光电联合显微镜的流程是先对轴突和树突进行荧光实时成像后，再使用透射电镜观察。例如，表达GFP的脑组织在荧光成像后进行化学固定，再使用电子密度标记进行免疫标记，例如EM金。或者采用更成熟的方法，如过氧化物酶或胶体金标记。最后，可以通过光转化在荧光团处局部生成二氨基联苯胺（DAB）聚合物。为了克服标记问题并确保超微结构的保存，已经开发了用于EM (NATIVE)的纳米体辅助组织免疫染色。NATIVE能够高效标记蛋白质，无需苛刻的渗透步骤、特殊树脂、锇替代物或透明化试剂。随着方法的改进和技术的发展，光电联合显微镜已被证明是研究不同种类突触和定位突触蛋白的理想选择。5.超分辨显微镜观察神经元隔室/突触以及神经元−胶质细胞相互作用下面我们将展示通过超高技术获得的有关细胞骨架组成和动力学、突触前室和突触后室对神经传递准确性至关重要的分子组装，以及形成神经元功能的星形细胞结构的调节和构建的最新数据。5.1. 细胞骨架神经元的极化性质以及树突和轴突的长度都需要结构和功能性支架来支持它们的稳定性、适应可塑性和物质运输，这些特性对神经元的存活和信号传递是必不可少的。因此，神经细胞骨架的结构在过去几十年中引起了神经科学家的注意，并在其它文献中进行了详细的回顾。20世纪70年代的电镜研究表明，神经细胞骨架由三种主要类型的神经纤维组成：大小约为20−30 nm的微管，直径为10 nm的神经纤维和5−10 nm大小的肌动蛋白丝。微管是由异二聚体在GTP依赖性组装过程中结合α和β微管蛋白单体组装而成的圆柱体，称为原丝，再由13个这样的原丝形成一个微管单元。轴突的微管成束状组织，并根据其相对于神经元胞体的位置显示不同的方向。它们的极化通过快速增长的正端和缓慢增长的负端体现。STED显微镜揭示了快速生长极依赖钙锚定在肌动蛋白皮质上。使用dSTORM对发育中的神经元进行活细胞成像证明了神经元极性和轴突具有方向一致的、平行的由TRIM46驱动的微管束，而树突微管的特征是混合极性。用Motor-PAINT方法进行纳米跟踪发现稳定和乙酰化的微管显示负端向外的方向，而动态和酪氨酸酶化的微管则显示相反的方向（图7）。例如轴突起始节中微管密集地聚集在束簇中，由于密集的重叠定位，使用SMLM方法具有挑战性。这个问题可以通过两种实验方法来解决：第一，设计更小的标记探针，如微管蛋白纳米抗体，这不需对神经元微管更详细的观察。第二，一种降低群聚密度的超分辨率方法，如ExM，可用于胞体和树突中微管亚群的可视化。神经纤维是在轴突中形成的广泛平行网络的异质聚合物，它为轴突提供稳定性并调节轴突直径和传导速度，其组成包括低、中、高分子量神经纤维、中间蛋白和外周蛋白的三联体。它们的自组装首先形成平行的异二聚体，然后半交错地结合成反平行的四聚体。最后，八个四聚体横向聚集成单位长度的神经纤维，进一步拉长并径向压缩至最终的神经纤维外观。用电镜观察到在神经纤维之间的交界面，形成3−5 nm大小的交叉桥，但对其功能及其与神经纤维的分子相互作用仍不清楚。在这里，ExM与SMLM的结合或DNA-PAINT的应用可能有助于研究密集神经纤维中的这种相互作用。神经纤维动力学已经通过光转换和光活化SRM实验进行了研究，显示了端到端蛋白合成中的退火和切断过程。肌动蛋白最初被认为与一组更集中的短肌动蛋白丝结合在一起，在轴浆中形成斑点状的膜下层。在原代神经元和脑切片中使用phalloidin Alexa Fluor 647进行STORM成像，揭示了轴突肌动蛋白的新的组成原理。这些实验揭示了轴突中存在圆周式肌动蛋白环，每190 nm固定重复间隔绕一圈，并进一步表征了轴突中具有类似尺寸的ßII血影蛋白和钠通道的周期性条带，而树突状腔室内显示出更细长的肌动蛋白组织。此外，通过STORM成像发现，并通过STED显微镜的研究得到证实，这种肌动蛋白组织模式的普遍性也存在于树突中。进一步的报告发现，尽管树突中也存在基于肌动蛋白血影蛋白的周期性膜骨架，树突中这种结构的形成倾向和发育速度低于轴突。此外，本文还显示了肌动蛋白和血影蛋白在胞体和部分树突中的二维多边形晶格结构，类似于红细胞中的膜骨架结构。此外，使用SiR-actin，可通过STED显微镜在活的原代神经元中观察到这种周期性结构。最后，最近的CLEM方法结合铂金复原电镜（PREM）和STORM研究了无顶轴突中的肌动蛋白组织，并提供了轴突编织状肌动蛋白结构与周期性肌动蛋白超微结构相关的证据（图8）。图8。原代神经元无顶轴突（unroofed axons）的CLEM成像（结合铂复型电子显微镜和STORM的光电联合成像）。用铂复型电镜（PREM）（灰色）显示的轴突辫状条带（箭头）被叠加到大鼠原代神经元的超分辨肌动蛋白环（伪彩）上，比例尺=2, 1, 0.2μm（从左到右）。中间：轴突辫状条带间距测量后显示出与周期肌动蛋白间距相似的尺寸。右图：在铂复型电镜（PREM）中记录的神经纤维厚度，未分裂（交织在一起）和分裂（分裂开）的轴突肌动蛋白辫状条带为蓝色，树突中的单个肌动蛋白神经纤维为紫色，微管为灰色参考。采用平均值和标准误显示数据。Copyright 2019 Springer Nature.ßII 血影蛋白基因敲除导致周期性肌动蛋白环结构破坏，同时细胞器的双向轴突运输受损。SMLM结果显示，与轴突相比，轴突起始节中的分子组织其特征是轴突起始节（AIS）蛋白ankyrin-G和ßIV-血影蛋白，这种基于肌动蛋白-血影蛋白的细胞骨架与远端轴突相似。此外，在AIS中存在ßIV-血影蛋白和Ankyrin G，而在远端轴突中存在ßi--血影蛋白和Ankyrin B。SMLM显示与肌动蛋白环相连的纵向头对头ßIV血影蛋白和Ankyrin的二价取向有助于建立紧凑的AIS超微结构，该超微结构甚至对针对肌动蛋白和微管的药物治疗具有抵抗力。进一步显示Ankyrin-G会聚集到亚结构域，增强神经元活性，而成为精神疾病的主要风险基因。随后的SMLM研究还阐明了αII血影蛋白与ßIV血影蛋白共同在AIS提供强健的周期性细胞骨架组织以及防止AIS装配不完全和神经变性的重要性。一份相关报告显示，αII 血影蛋白丰度随有髓鞘轴突直径的增加而增加，表明大直径轴突更容易发生神经退行性病变。在免疫标记II血影蛋白后，将其连接到一种可膨胀的聚合物，并在水中膨胀后，通过ExM研究ßII spectrin沿轴突的周期性模式。这一新方法证实了如前所述的细胞骨架内部的组织原理。不幸的是，在ExM过程中，phalloidin探针在膨胀过程中被冲掉。有两种策略解决这一问题：一方面，携带甲基丙烯酸基团的phalloidin三功能抗体被设计用于与凝胶的有效标记；另一方面，最近的一份报告使用荧光团结合抗体，类似于常规免疫染色，将荧光团靶向phalloidin探针与凝胶连接。在中枢神经系统的几种神经细胞类型和动物物种中，肌动蛋白和附属蛋白的强大超微结构组织也得到了证实。外周神经系统（PNS）中，STED显微镜也显示在梳理的神经纤维样本上有重复的细胞骨架成分。最后，SMLM揭示了肌动蛋白-血影蛋白骨架的一个重要生物学功能：它可以作为一个信号平台，通过组织跨膜信号蛋白，包括G蛋白偶联受体（GPCR）、细胞粘附分子（CAM）和受体酪氨酸激酶（RTK），在神经元中进行信号转导从而实现GPCR-和CAM介导的RTK信号。5.2. 突触前室为了确保有效的神经化学传递，突触前膨大参与突触囊泡循环、神经递质填充以及与突触前膜在活性区（特殊蛋白质密集分布的纳米隔室）的融合，以最终释放神经递质。在这里，我们关注SRM如何扩展我们对突触前功能的理解。早期只能使用EM对化学固定神经元里的小直径突触小泡进行研究，但随着SRM的出现，应用快速STED显微镜，通过免疫标记位于突触前室突触小泡上的钙传感器突触标记蛋白1（SYT1）来观察突触小泡的活动。STED显微镜进一步显示，突触小泡融合后Syt1分子似乎驻留在突触膜上，也支持胞吐后突触小泡蛋白的清除过程。此外，在突触小泡融合过程中，当暴露于细胞外空间时，靶向Synaptobevin 2 pHluorin的荧光团结合纳米体后，亚衍射追踪显示了突触小泡的异质性迁移。一种类似的方法使用vGlut1 pHluorin在原代神经元中的表达来观察单个神经元突触小泡，定位精度为27 nm，并揭示了突触小泡的多个不同释放位点。作为一项方法学的进步，为了对主动循环的小泡成像，设计了一种名为mCLING的亲脂膜探针，该探针可对突触膜进行染色，通过内吞作用和固定，可以进行免疫标记，且和SRM相结合。突触小泡的胞吐过程需要一组属于突触前细胞基质的突触前蛋白质的高度可靠的相互作用，使突触小泡接近和暂时驻留在所谓活动区的膜上，并最终释放突触小泡。黑腹果蝇易于遗传，有助于精确定位果蝇幼虫神经肌肉接头（NMJ）活动区的第一个重要蛋白质。Bruchpilot（Brp）是一种必不可少的活性区成分，是一种大的、卷曲的螺旋蛋白，对于钙通道聚集和突触囊泡定位到突触释放位点至关重要。除了通过Brp研究钙通道聚集外，STED显微镜还证明了该蛋白细长的组织结构，并揭示了与Brp相互作用的蛋白（如syd-1α、liprin和rim结合蛋白（RBP））的定位。定量dSTORM方法研究了果蝇活动区Brp丝的数量，并显示了Brp的结构组织与其功能之间的强相关性。接下来的研究通过dSTORM评估Syt1敲除后的活动区（CAZ）电生理学和细胞基质参数。这项研究表明，在果蝇NMJs 1b型突触膨胀中，Syt1基因的敲除导致更高的Brp计数和簇内Brp图谱的改变。在哺乳动物突触中，突触前支架蛋白bassoon 和 piccolo参与突触囊泡释放的调节。据报道，bassoon蛋白通过与RBP的相互作用来控制CaV2.1型钙通道的定位。此外bassoon蛋白能加速囊泡释放，因为其丢失导致小脑苔藓纤维到颗粒细胞突触中的突触囊泡数量显著减少和突触抑制。STED显微镜显示bassoon 和 piccolo蛋白是一个夹心三明治结构，两侧为piccolo蛋白，bassoon蛋白居中。STORM成像通过距离测量显示bassoon蛋白相对于突触前和突触后室中其他相关突触蛋白质的方向。囊泡胞吐过程由一组可溶性ethylmaleimide敏感因子附着受体（SNARE）蛋白质进一步协调。位于突触膜上的囊泡SNAREs (v-SNAREs) 蛋白和 t-SNARES蛋白的复杂形成导致突触囊泡成功融合。在质膜上的突触体相关蛋白25（SNAP-25）和突触融合蛋白聚集首先通过STED显微镜进行研究。这项研究表明，大约75个突触融合蛋白分子被堆积成50- 60 nm大小的纳米团簇。在之后的研究中，SMLM以更高的精度对SNAP-25和突触融合蛋白的分布进行成像。在这里，描述了Syntaxin簇内的分子密度梯度。dSTORM成像显示，未聚集的分子紧密地定位于聚集区域。最近的一项研究显示了一种以syntaxin或SNAP-25为靶点的纳米抗体。这使密集的突触前区域更好的标记，并显示突触外突触融合蛋白可在增强突触活动后进入突触室。SNARE结合蛋白tomosyn被证明定位于突触融合蛋白簇，据报道，其ß-螺旋结构域的突变是SNAP-25复合物形成的关键。此外，tomosyn与v-SNARE突触结合蛋白竞争，与突触融合蛋白和SNAP-25形成复合物，因此被认为下调了胞吐过程。 相反，rim结合蛋白2（RBP2）可根据所研究的突触类型在调节突触可塑性方面发挥多种作用。SRM显示RBP2通过调节CaV2.1钙通道相对于释放位点的纳米定位来调节释放概率。此外，STED显微镜显示海马脑片中RBP2对锥体CA3-CA1突触的神经传递只有轻微的影响，它通过控制munc-13-1的定位，在苔藓纤维突触中强烈调节囊泡启动和释放概率。图9。与突触释放位点相关的Munc-13-1纳米组装体。上排：应用高钙溶液和钾通道阻滞剂（A1）以及相应的munc-13-1信号（A2）激活突触后eEOS（增强型谷氨酸光学传感器）的荧光反应图像。注意主动释放条件下的紧密空间相关性。比例尺：5μm。第二行：常规显微镜图像（B1）与munc-13-1（B2）的3D STORM成像。比例尺：500nm。（C） 释放位点数量与munc-13-1纳米团数量的相关性。（D） munc-13-1（黄色）和syntaxin-1A（蓝色）的超分辨双色图像。比例尺：2μm。侧面（顶部）和正面（底部）视图。比例尺：200nm。Copyright 2017 Springer Nature.Munc-13是unc-13的哺乳动物直系同源物，是引发突触小泡释放的另一个不可或缺的成分。Munc-13-3被证明能够将钙通道募集到活动区，3D-STORM成像提供了证据，证明Munc-13-1聚集在突触释放位点，并与突触融合蛋白分子相关（图9）。通过活体成像和STED显微镜对果蝇中显示不同突触前钙通道距离的两种munc-13亚型进行研究，发现unc-13亚型由CAST/ELK同源物Brp和RIM结合蛋白定位，导致释放部位相对于钙通道的不同超微结构。在神经元发育过程中改变不同Unc-13亚型的比率，通过改变其与钙通道的纳米结构域耦合，导致神经传递增强。Unc-13 A定位通过突变分析表明C末端部分调控释放位点的产生，而蛋白质的N末端部分参与活性区靶向调节。 在活性区内，钙通道的纳米定位和潜在的动力学对于有效调节神经传递至关重要。钙通道和突触小泡之间的纳米域耦合可以是紧密的，也可以是松散的，并以这种方式决定神经传递的精确性。小脑突触中的免疫金电镜定量显示，强突触的耦合距离约为10nm，但其钙通道数量是弱突触的三倍，弱突触的特征是耦合距离较长且低效。一项结合电生理学的免疫金冷冻断裂EM研究提供了证据，证明释放部位随突触前钙通道数量的增加而增加。为了研究电压门控钙通道的活动性，应用单粒子跟踪PALM（sptPALM）对原代神经元成像。研究表明，集中在突触前部位的60%的通道是可变的。此外，通过应用BAPTA钙缓冲降低了钙通道的扩散。结果表明，突触小泡和钙通道之间的纳米域偶联保证了神经传递的精确度，并可根据需要通过突触前钙通道的扩散进行精细调节。 在融合和递质释放后，内吞机制诱导循环产生新的囊泡，从而重建可释放的囊泡池并为持续的神经传递提供基础。囊泡循环的主要机制由网格蛋白介导的内吞作用组成。使用光遗传学和”闪光冷冻”电镜的研究也报道了比超快的内吞快200倍的过程。如双色iso-STED显微镜所示，通过摄取针对囊泡内膜结合位点的Syt 1抗体，将内吞位点定位到活性区外周。此外，在神经内分泌细胞中，STED显微镜也揭示了囊泡只能部分与突触前膜融合释放递质，形成一个“Ω”形状的结构，而没有完全融入膜中，因此有利于“接触后即脱离”（kiss and run）的模式。与网格蛋白介导的内吞作用相比，它会产生更快囊泡再循环率的递质释放模型。依赖于活性的大量内吞作用进一步增加了可能涉及的机制的复杂性，有人提出，根据突触类型和活动，多种内吞模式可能并行运作。本文由超高显微技术应用工程师郭连峰、黄梓彤编译

成果名称适用于单细胞内单分子动态观测的层状光超高分辨率扫描荧光显微系统的研究单位名称北京大学联系人马靖联系邮箱mj@labpku.com成果成熟度□研发阶段 &radic 原理样机 □通过小试 □通过中试 □可以量产成果简介：超分辨技术是利用随机光学重构等方法，突破光学衍射极限的一种新型显微技术，它使得我们有机会在单分子水平上观察亚细胞结构。但是传统意义的超分辨技术是基于全内反射照明的，这就使得我们可观测的样品厚度远小于细胞厚度，从而无法对细胞深处，如细胞核内的分子进行实时观测。层状光扫描技术是利用高斯光束的性质，通过光线的单方向汇聚产生亚微米级的层状光，从而可以对组织样品进行3D扫描。层状光荧光扫描显微系统有着成像速度快，光致漂白与光毒性效应小等优势，非常适合于组织及真核细胞的观测，但它的分辨率会受到衍射极限的限制。生命科学学院孙育杰课题组将这两种技术进行了优势互补，发展了新型集成芯片技术，研发出了一种适用于单细胞内单分子动态观测的新型显微系统。在基金的资助下，通过相关设备的购置和材料的加工，有力地推动了项目组相关工作的开展，其主要工作包括：（1）层状光-荧光扫描系统的实现；（2）适用于单细胞层状光成像的新型细胞芯片技术的研究；（3）单分子超高分辨率荧光技术的实现；（4）超高分辨率一层状光荧光扫描复合光路的实现。通过以上工作的开展，单分子超高分辨率荧光显微系统的样机搭建已经完成，顺利通过了第四期项目的验收。这项工作获得了国家自然科学基金委重大项目的后续支持，项目名称为&ldquo 细胞中活性分子实时动态变化与相互作用的荧光探针研究&rdquo 。应用前景：该研究成果在细胞生物学，特别是干细胞定向分化、胚胎早期发育、胞内运输等生物过程的研究领域中有着重要的应用前景。

磁畴是铁磁体材料在自发磁化的过程中，为降低静磁能而产生分化的方向各异的小型磁化区域。它的研究可将材料的基本物理性质、宏观性质和应用联系起来。近年来，由于材料的日益完善和器件的小型化，人们对磁畴分析的兴趣与日俱增。目前市面上主要的磁畴观测设备有磁光克尔显微镜、磁力显微镜、洛伦兹电镜、以及近兴起的NV色心超分辨磁学显微镜等，其中，磁光克尔显微镜可以灵活的结合外加磁场、电流及温度环境等来对材料进行面内、面外的动态磁畴观测，成为目前常用的磁畴观测设备，可用于多种磁性材料的研究，如铁磁或亚铁磁薄膜、钕铁硼等硬磁材料、硅钢等软磁材料。 2020年11月，Quantum Design中国与致真精密仪器（青岛）有限公司签署了中国区战略合作协议，合作推出多功能高分辨率磁光克尔显微成像系统。通过此次战略合作，Quantum Design中国希望能够为磁学及自旋电子学等领域的研究提供更多的可能。图1 多功能高分辨率磁光克尔显微成像系统 多功能高分辨率磁光克尔显微成像系统由北京航空航天大学集成电路学院张学莹老师带领团队，根据多年的磁畴动力学实验技巧积累和新的磁学及自旋电子学领域的热点课题研究需求研发。它采用先进的点阵LED光源技术，能够在不切换机械结构的情况下，同时进行向和纵向克尔成像，不仅能同时检测样品垂直方向和面内方向的磁性，成像分辨率还能够达到270 nm，逼近光学衍射限。与传统的磁光克尔显微镜相比，多功能高分辨率磁光克尔显微成像系统配置了多功能磁铁探针台，能够在保证450 nm高分辨率的前提下，向被测样品同时施加面磁场、垂直磁场、电流和微波信号。 此外，多功能高分辨率磁光克尔显微成像系统拥有专门的智能控制系统，用户界面友好，无需复杂设置，一键触发既能实现多维度磁场、电学信号与克尔图像的同步操控。该系统的另一亮点是配置了反应速度高达1 μs的超快磁场，为微米器件中磁畴的产生、磁畴的高速运动捕捉等提供了可能。 张学莹老师师从北航赵巍胜教授和法国巴黎萨克雷大学Nicolas Vernier教授，从2015年开始研究磁光克尔成像技术和磁畴动力学，其有关磁性材料性质的论文获得北京航空航天大学博士学位论文。经过3年潜心研究，该团队于2018年完成了台克尔显微镜样机的集成，并创立致真精密仪器（青岛）有限公司。至2020年初，在北航青岛研究院和北航集成电路学院经过两轮迭代和打磨，已经完成了产品的稳定性验证，目前，该设备已经被清华大学、中科院物理所、北京工业大学等多家单位采购。 产品磁畴成像照片案例图2 CoFeB(1.3 nm)/W(0.2)/CoFeB(0.5)薄膜中的迷宫畴图3 斯格明子磁畴观测 多重信号的叠加，能够满足客户多种前沿课题的实验需求面内磁场和垂直磁场的叠加可以进行Dzyaloshinskii-Moriya作用（DMI）的测试[1,2]图4 样品Pt(4 nm)/Co(1 nm)/MgO(t nm)/Pt(4 nm)DMI作用测量[1] 自旋轨道矩（spin-orbit torque,简称SOT）是近年来发展起来的新一代电流驱动磁化翻转技术，如何更好的表征SOT翻转，在当今自旋电子学领域具有重要的理论和应用价值。 多功能高分辨率磁光克尔显微成像系统配置的面内磁场和电学测试系统，不但可以实现这个过程的电学测试，还可以利用相机与信号采集卡同步的功能，逐点解析翻转曲线对应的磁畴状态 [3,4]。图5 面内磁场和电流的叠加用于sot驱动的磁性变化过程研究 在某些材料中，无法观测到纯电流驱动的磁畴壁运动。这时，可以利用多功能高分辨率磁光克尔显微成像系统微秒别的超快磁场脉冲与电流同步，观测垂直磁场与电流共同驱动的畴壁运动，从而解析多种物理效应，如重金属/ 铁磁体系的自旋化率由于自旋散射降低的效应 [5]。图6 垂直磁场和电流的叠加可用于观测单磁场或者电流无法驱动的磁性动力学过程 克尔成像下磁场和微波的叠加则能够为自旋波和磁畴壁的相互作用研究提供可能 [6]。图7 自旋波驱动的磁畴壁运动[6] 多功能高分辨率磁光克尔显微成像系统还可进行多种磁性参数的微区测量局部饱和磁化强度Ms表征[7]由于偶作用，磁畴壁在靠近时会相互排斥。通过观察不同磁场下磁畴壁的距离，可以提取局部区域的饱和磁化强度Ms。此方法由巴黎- 萨克雷大学Nicolas Vernier 教授（致真技术顾问）在2014 年先提出并验证，与VSM测量结果得到良好吻合。图8 局部饱和磁化强度Ms表征及与其他测试方法Ms结果对比 海森堡交换作用刚度[8]采用系统的磁场“自定义波形”功能，将样品震荡退磁，再将得到的迷宫畴图片进行傅里叶变换，能够得知磁畴宽度，从而提取海森堡交换作用刚度Aex。图9 海森堡交换作用刚度提取 自旋电子薄膜质量的表征、自旋电子器件的损坏检测等[9]图10 磁性薄膜质量检测 除此之外，该系统还开发了性价比超高的变温系统。针对永磁材料研究的用户，开发了能够兼容克尔成像的高温强磁场模块。针对硅钢等软磁材料研究用户，开发了大视野面内克尔显微镜。 动态磁畴成像案例图11 cofeb薄膜动态磁畴图12 sot磁场+电流驱动磁畴翻转图13 钕铁硼永磁动态磁畴观测图14 磁性材料内钉扎点的观测，可与巴克豪森噪声同步匹配 产品基本参数✔ 向和纵向克尔成像分辨率可达300 nm；✔ 配置二维磁场探针台，面内磁场高达1 t，垂直磁场高达0.3 t（配置磁场增强模块后可达1.5 t）；✔ 快速磁场选件磁场反应速度可达1 μs；✔ 可根据需要选配直流/ 高频探针座及探针；✔ 可选配二次谐波、铁磁共振等输运测试；✔ 配置智能控制和图像处理系统，可同时施加面内磁场、垂直磁场和电学信号同步观测磁畴翻转；✔ 4k~800k，80k~500k 变温选件可选。 小结多功能高分辨率磁光克尔显微成像系统除了拥有超高分辨的动态磁畴观测能力外，还能结合多功能磁场探针台提供的外加电流、面内/面外磁场等对多种磁学参数进行提取。 样机体验目前，致真精密仪器（青岛）有限公司可对相关领域感兴趣的科学工作者提供了测样体验，欢迎感兴趣的老师或同学拨打电话010-85120280或发送邮件至info@qd-china.com体验磁光克尔显微成像全新技术！ 参考文献[1] A. Cao et al., Nanoscale 10, 12062 (2018).[2] A. Cao et al., Nanotechnology 31, 155705 (2020).[3] X. Zhao et al., Appl. Phys. Lett. 116, 242401 (2020).[4] G. Wang et al., IEEE Trans. Circuits Syst. I Regul. Pap. 66, 215 (2019).[5] X. Zhang et al., Phys. Rev. Appl. 11, 054041 (2019).[6] J. Han et al., Science (80-. ). 366, 1121 (2019).[7] N. Vernier et al., Appl. Phys. Lett. 104, 122404 (2014).[8] M. Yamanouchi et al., IEEE Magn. Lett. 2, 3000304 (2011).[9] Y. Zhang et al., Phys. Rev. Appl. 9, 064027 (2018).

目前，基于超快激光的非线性拉曼光谱技术已经越来越成熟了；而且，随着纳米科技的迅猛发展，使得基于纳米结构的表面增强拉曼光谱(SERS)和针尖增强拉曼光谱(TERS)在超高灵敏度检测方面取得了长足的进步，推动拉曼光谱成为迄今很少的、可达到单分子检测水平的技术。　　“港东科技”自二十世纪九十年代初就开始研发“拉曼光谱”系列产品。自主研发、生产、制造的LRS-2型和LRS-3型激光拉曼光谱仪以结构简单、便于调整和测量、灵敏度高、稳定性好等特点分别在1998年和2000年世界银行贷款发展项目中二度中标。该仪器现已大量应用于科研院所、高等院校的物理实验室和化学实验室，作为测量和教学拉曼光谱和荧光光谱的实验仪器。LRS-2/3激光拉曼光谱仪　　仪器特点：　　自动记录拉曼、荧光光谱 　　高分辨率，低杂散光单色系统 　　高灵敏度、低噪音单光子计数器做接收系统 　　大功率半导体激光器作为激发光源 　　配有稳定性好、精度高的外光路系统 　　多种附件可选，适用于液体、固体样品的分析 　　配有用于减小瑞利散射的陷波滤波器。　　2008年，港东科技自主研发的，同时也是国内首款LRS-5型微区激光拉曼光谱仪(将具有自主知识产权的高分辨激光共焦显微镜作为收集拉曼散射光系统，长焦长高分辨平场成像输出的单色器，结合自行研制的计算机软件编程等相关实验技术相整合，构建具有自主知识产权的新型高分辨的激光共聚焦显微光谱探测联用设备-激光共焦拉曼光谱仪)研制成功。　　这是一项将拉曼光谱分析技术与显微分析技术结合起来的应用技术。微区激光拉曼可将激发光的光斑聚焦到微米量级，从而可以在不受周围环境干扰的情况下，精确获得所检测样品的有关化学成分、晶体结构、分子相互作用以及分子取向等各种拉曼光谱信息。　　我们对激光共焦拉曼显微镜的装置设计与技术参数，几何尺寸与配置，显微镜的白光成像照明系统和偏振调光图像处理技术进行了细致的研讨与实际效果的理论计算，为该显微镜的结构定型、技术指标奠定了基础。最终研制成功具有自主知识产权的高性能激光共聚焦拉曼显微镜系统。LRS-5 微区激光拉曼光谱仪　　仪器特点：　　操作简单，友好的人机对话界面 　　高分辨率、高稳定性和低杂散光的非对称800mm焦距平场光谱仪系统 　　接受系统采用具有高灵敏度、低噪音的面阵CCD接收器 　　外光路系统采用显微镜作为激光会聚和拉曼光收集系统，具有很高的效率和稳定性 　　配有用于减小瑞利散射的陷波滤波器。　　2012年至2016年，“港东科技”作为国内唯一一家研发、生产高分辨率长焦拉曼的企业受邀参加了由北京理工大学牵头，协同中国科学院物理研究所共同研发的“激光差动共焦成像与检测仪器研发及其应用研究”项目，该项目属于“国家重大科学仪器开发和应用专项”。在该项目中我司主要承担“拉曼光谱成像探测系统”的研发任务。普通激光束的直径通常为1.7mm左右，而显微激光拉曼光谱可以对被分析对象表面及其以下部分(透明或半透明材料)进行分层扫描，以获得较大范围内的信息，能够进行微区(小于0.2µm)分析，很好地满足了对复合材料中不同组元结构分析的要求。　　对于“拉曼光谱”在未来的发展，那就必须先从“拉曼光谱”与它的姊妹谱——红外光谱的比较说起。　　相似之处：“拉曼光谱”与“红外光谱”一样，都能提供分子振动频率的信息，对于一个给定的化学键，其红外吸收频率与拉曼位移相等，均代表第一振动能级的能量。　　不同之处：　　1.红外光谱的入射光及检测光都是红外光，而拉曼光谱的入射光和散射光大多是可见光。拉曼效应为散射过程，拉曼光谱为散射光谱，红外光谱对应的是与某一吸收频率能量相等的(红外)光子被分子吸收，因而红外光谱是吸收光谱。　　2.从分子结构性质变化的角度看，拉曼散射过程来源于分子的诱导偶极矩，与分子极化率的变化相关。通常非极性分子及基团的振动导致分子变形，引起极化率的变化，是拉曼活性的。红外吸收过程与分子永久偶极矩的变化相关，一般极性分子及基团的振动引起偶极矩的变化，故通常是红外活性的。　　3.红外光谱制样复杂，拉曼光谱勿需制样，可直接测试水溶液。　　姊妹谱的联系：　　1、凡有对称中心的分子，若有拉曼活性，则红外是非活性的 若红外活性，则拉曼是非活性的。　　2、凡无对称中心的分子，大多数的分子，红外和拉曼都活性。　　3、少数分子的振动，既非拉曼活性，又非红外活性。(如：乙烯分子的扭曲振动，在红外和拉曼光谱中均观察不到该振动的谱带。　　综上所述，拉曼光谱相对于红外光谱，其优势之一体现在用拉曼研究水溶液中比较方便，而生命科学的许多研究往往需要的水溶液环境。共振拉曼、表面增强拉曼和非线性拉曼光谱以及它们的联用将成为生命科学前沿领域具有重要价值的研究方法，因为21世纪是生命科学的世纪(如：临床医疗、癌症的检测与诊断等)，我们以为也是纳米技术和激光技术的世纪，因此我们觉得拉曼光谱的发展和应用是大有可为的。　　但就目前来讲，“拉曼光谱”还存在一定的不足，例如：　　1、拉曼散射面积 　　2、不同振动峰重叠和拉曼散射强度容易受光学系统参数等因素的影响 　　3、荧光散射的干扰 　　4、在进行分析时，常出现曲线的非线性的问题 　　5、任何一个物质的引入都会对被测体体系带来某种程度的污染，这等于引入了一些误差的可能性，会对分析的结果产生一定的影响。　　当然我们也相信，随着相关技术领域的不断进步和提高，这些问题在不远的将来都能得到完善的解决。届时“拉曼光谱”的应用领域也将更为广泛。　　“拉曼光谱”揭示了丰富的化学键信息，检测对象从单质到化合物，从纯净物到混合物，从无机物到有机物，从固体到液体甚至到气体。随着技术的进一步发展，便携式拉曼光谱仪的发展趋势将呈现多样化。更加小型化、智能化、应用更加细分(分析化学、安全检查、生物医药、机场安检、爆炸物分析等)，将成为发展的主流，而性能却不会随着小型化而缩水。同时，随着应用领域的扩大，适应恶劣的工作环境(高温、高压)也将是发展方向之一。而价格合理化将是便携式拉曼光谱仪发展的终极目标。（内容来源：港东科技）

日本东京大学科学家利用六方氮化硼二维层中的硼空位，首次完成了在纳米级排列量子传感器的精细任务，从而能够检测磁场中的极小变化，实现了高分辨率磁场成像。氮化硼是一种含有氮和硼原子的薄晶体材料。氮化硼晶格中人工产生的自旋缺陷适合作为传感器。研究团队在制作出一层薄的六角形氮化硼薄膜后，将其附着在目标金丝上，然后用高速氦离子束轰击薄膜，这样就弹出了硼原子，形成了100平方纳米的硼空位。每个光点包含许多原子大小的空位，它们的行为就像微小的磁针。光斑距离越近，传感器的空间分辨率就越好。当电流流经导线时，研究人员测量每个点的磁场，发现磁场的测量值与模拟值非常接近，这证明了高分辨率量子传感器的有效性。即使在室温下，研究人员也可检测到传感器在磁场存在的情况下自旋状态的变化，从而检测到局部磁场和电流。此外，氮化硼纳米薄膜只通过范德华力附着在物体上，这意味着量子传感器很容易附着在不同的材料上。高分辨率量子传感器在量子材料和电子设备研究中具有潜在用途。例如，传感器可帮助开发使用纳米磁性材料作为存储元件的硬盘。原子大小的量子传感器有助于科学家对人脑进行成像、精确定位、绘制地下环境图、检测构造变化和火山喷发。此次的纳米级量子传感器也将成为半导体、磁性材料和超导体应用的“潜力股”。(a)六方氮化硼中的硼空位缺陷。空位可充当用于磁场测量的原子大小的量子传感器，对磁场敏感，就像一个纳米“磁针”。(b)量子传感器纳米阵列的光致发光可反应磁场的变化。图片来源：东京大学研究团队

微球透镜（SMAL）成像技术，突破传统光学显微镜光学衍射分辨率极限（200nm），将用户带入全新的显微镜时代。　　 微球成像专利技术提高了光的功率，横向分辨率可达50nm，SMAL物镜可放大到400x。　　 通过SMAL成像技术，用户能够得到超高分辨率图像并保留光学显微镜所有优势——快速、简单、无损、完整、真实颜色。我们致力于为所有人能获得超高分辨率图像，无需昂贵的设备和严格的使用环境也无需大量的样品，只需光源、透镜和相机。　　 定制软件算法将高分辨率的微球图像拼接在一起，机械台会将样品移动到镜头下方。使用户能够快速的得到全彩色和超高分辨率的大区域样品图像。创新点：微球透镜（SMAL）成像技术，突破传统光学显微镜光学衍射分辨率极限（200nm），将用户带入全新的显微镜时代。　　微球成像专利技术提高了光的功率，横向分辨率可达50nm，SMAL物镜可放大到400x。　　通过SMAL成像技术，用户能够得到超高分辨率图像并保留光学显微镜所有优势——快速、简单、无损、完整、真实颜色。我们致力于为所有人能获得超高分辨率图像，无需昂贵的设备和严格的使用环境也无需大量的样品，只需光源、透镜和相机。　　定制软件算法将高分辨率的微球图像拼接在一起，机械台会将样品移动到镜头下方。使用户能够快速的得到全彩色和超高分辨率的大区域样品图像。

一、项目基本情况项目编号：0835-220Z12306661项目名称：超高分辨率显微成像系统采购采购方式：公开招标预算金额：6,800,000.00元采购需求：合同包1(超高分辨率显微成像系统采购):合同包预算金额：6,800,000.00元品目号品目名称采购标的数量（单位）技术规格、参数及要求品目预算(元)最高限价(元)1-1其他专用仪器仪表超高分辨率显微成像系统1(套)详见采购文件6,800,000.00-本合同包不接受联合体投标合同履行期限：合同生效180天内完成货物安装调试并交付使用。二、申请人的资格要求：1.投标供应商应具备《政府采购法》第二十二条规定的条件，提供下列材料：1）具有独立承担民事责任的能力：在中华人民共和国境内注册的法人或其他组织或自然人， 投标（响应）时提交有效的营业执照（或事业法人登记证或身份证等相关证明） 副本复印件。分支机构投标的，须提供总公司和分公司营业执照副本复印件，总公司出具给分支机构的授权书。2）有依法缴纳税收和社会保障资金的良好记录：提供投标截止日前6个月内任意1个月依法缴纳税收和社会保障资金的相关材料。 如依法免税或不需要缴纳社会保障资金的， 提供相应证明材料。3）具有良好的商业信誉和健全的财务会计制度：供应商必须具有良好的商业信誉和健全的财务会计制度（提供2021年度财务状况报告或基本开户行出具的资信证明） 。4）履行合同所必需的设备和专业技术能力：按投标（响应）文件格式填报设备及专业技术能力情况。5）参加采购活动前3年内，在经营活动中没有重大违法记录：参照投标（报价）函相关承诺格式内容。 重大违法记录，是指供应商因违法经营受到刑事处罚或者责令停产停业、吊销许可证或者执照、较大数额罚款等行政处罚。（根据财库〔2022〕3号文，“较大数额罚款”认定为200万元以上的罚款，法律、行政法规以及国务院有关部门明确规定相关领域“较大数额罚款”标准高于200万元的，从其规定）2.落实政府采购政策需满足的资格要求：合同包1(超高分辨率显微成像系统采购)落实政府采购政策需满足的资格要求如下:本项目不属于专门面向中小企业项目。本项目落实促进中小企业发展政策、支持监狱企业发展政策、支持残疾人福利性单位发展政策、支持脱贫攻坚等相关政策。本项目所属行业为工业。3.本项目的特定资格要求：合同包1(超高分辨率显微成像系统采购)特定资格要求如下:(1)供应商未被列入“信用中国”网站(www.creditchina.gov.cn)“记录失信被执行人或重大税收违法失信主体或政府采购严重违法失信行为”记录名单；不处于中国政府采购网(www.ccgp.gov.cn)“政府采购严重违法失信行为信息记录”中的禁止参加政府采购活动期间。（以资格审查人员于投标（响应）截止时间当天在“信用中国”网站（www.creditchina.gov.cn）及中国政府采购网（http://www.ccgp.gov.cn/）查询结果为准，如相关失信记录已失效，供应商需提供相关证明资料）。(2)单位负责人为同一人或者存在直接控股、 管理关系的不同供应商，不得同时参加本采购项目（或采购包） 投标（响应）。 为本项目提供整体设计、 规范编制或者项目管理、 监理、 检测等服务的供应商， 不得再参与本项目投标（响应）。 投标（报价） 函相关承诺要求内容。(3)本项目不接受联合体投标；不允许分包、转包。三、获取招标文件时间： 2022年09月07日 至 2022年09月14日 ，每天上午 00:00:00 至 12:00:00 ，下午 12:00:00 至 23:59:59 （北京时间,法定节假日除外）地点：广东省政府采购网https://gdgpo.czt.gd.gov.cn/方式：在线获取售价： 免费获取四、提交投标文件截止时间、开标时间和地点2022年09月27日 09时30分00秒 （北京时间）递交文件地点：广州市越秀区先烈中路102号华盛大厦北塔26楼广东元正招标采购有限公司开标室开标地点：广州市越秀区先烈中路102号华盛大厦北塔26楼广东元正招标采购有限公司开标室五、公告期限自本公告发布之日起5个工作日。六、其他补充事宜1.本项目采用电子系统进行招投标，请在投标前详细阅读供应商操作手册，手册获取网址：https://gdgpo.czt.gd.gov.cn/help/transaction/download.html。投标供应商在使用过程中遇到涉及系统使用的问题，可通过400-1832-999进行咨询或通过广东政府采购智慧云平台运维服务说明中提供的其他服务方式获取帮助。2.供应商参加本项目投标，需要提前办理CA和电子签章，办理方式和注意事项详见供应商操作手册与CA办理指南，指南获取地址：https://gdgpo.czt.gd.gov.cn/help/problem/。3.如需缴纳保证金，供应商可通过"广东政府采购智慧云平台金融服务中心"(http://gdgpo.czt.gd.gov.cn/zcdservice/zcd/guangdong/)，申请办理投标（响应）担保函、保险（保证）保函。-七、对本次招标提出询问，请按以下方式联系。1.采购人信息名 称：广东工业大学地 址：广州市广州大学城外环西路100号联系方式：020-393400322.采购代理机构信息名 称：广东元正招标采购有限公司地 址：广东省广州市越秀区先烈中路102号华盛大厦北塔26楼2608联系方式：020-87258495-1053.项目联系方式项目联系人：陈小姐、黄先生电 话：020-87258495-105广东元正招标采购有限公司2022年09月06日

p　　北京大学陈良怡团队联合华中科技大学谭山团队发明了一种超灵敏结构光超高分辨率显微镜 -- 海森结构光显微镜 （Hessian SIM）。此项成果近日以全文形式在线发表于Nature Biotechnology （影响因子41.67），论文题目为“Fast， long-term， super-resolution imaging with Hessian structured illumination microscopy”。/pp style="text-align: center "img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201804/insimg/9733f7f5-ffa5-4262-9ca6-a6f439e01233.jpg" title="1.png"//pp style="text-align: center "图1：海森结构光显微镜解析囊泡融合孔道形成全过程。上图：实际的动态过程解析；下图：由实验结果得到的囊泡融合的四个中间态。/pp　　在每秒钟得到188张超高分辨率图像时，海森结构光显微镜的空间分辨率可以达到85纳米，能够分辨单根头发的1/600到1/800大小结构，而所需要的光照度小于常用的共聚焦显微镜光照度三个数量级。由于极低的光漂白以及光毒性，实现了100 Hz超高分辨率成像下连续采样10分钟得到18万张超高分辨率图像，或者是在1 Hz超高分辨率成像下连续1小时超高分辨率成像基本无光漂白。/pp　　与获得2014年Nobel化学奖的受激辐射损耗超高分辨率显微镜（STED）相比，海森结构光显微成像以极高的时间分辨率、极低的光毒性在活细胞超高分辨率成像方面占显著优势。例如，在观察细胞内囊泡与细胞质膜融合释放神经递质和激素过程中，海森结构光显微镜与STED显微镜（分辨率60纳米，每秒5幅左右； 巫凌钢实验室2018年3月Cell上线的文章）都可以观察到囊泡融合形成的孔道；但是，海森结构光显微镜还解析出囊泡融合时四个不同中间态，包括囊泡打开3纳米小孔、囊泡塌陷、融合孔道维持和最后的囊泡与细胞质膜完全融合的过程，真正可视化膜孔道形成的全过程（图1）。/pp style="text-align: center "img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201804/insimg/a8d935d2-2f07-4d3a-bfc4-18cf43e9c1ae.jpg" title="2.png"//pp style="text-align: center "图2、海森结构光显微镜显微镜下观察到COS-7细胞中的内质网和线粒体相互作用的动态过程，蓝色的线粒体用MitoTracker Green标记，可以清楚辨识内嵴结构；品红色的是用SEC61-mCherry标记内质网结构。/pp　　此项突破一方面是基于硬件自主设计的新偏振旋转玻片阵列、高精度的时序控制程序以及高数值孔径物镜的应用；另一方面是创新的重构算法，借鉴了人眼区分信号和噪声的机制，首次提出将生物样本在多维时空上连续、而噪声是完全随机分布的先验知识用于构建海森矩阵，指导超高分辨率荧光图像的重建。/pp　　超灵敏海森结构光显微镜是目前活细胞成像时间最长、时间分辨率最高的超高分辨率显微镜，适用于各种细胞、不同探针的荧光成像 – 可以说，所有应用扫描共聚焦显微镜的场景都可以使用海森结构光显微镜，因而具有广泛的应用前景。/pp　　该论文的第一作者为北京大学黄小帅、华中科技大学范骏超和北京大学李柳菊，通讯作者为北京大学陈良怡、华中科技大学谭山。工作得到了国家自然科学基金委重大仪器研制基金、重大研究计划专项、科技部国家重点研发计划基金、重点基础研究发展计划和北京市自然科学基金委重点项目的资助。陈良怡、黄小帅等主创成员参与了早先发表于Nature Methods的高分辨率微型化双光子显微镜的研制，荣获2017年中国十大科学进展等荣誉。未来，他们将进一步实现微型化海森结构光的显微在体成像。/p

显微镜技术经过长期发展，加之近年来物理学界接二连三出现的重大科研进展，终于，在2008年，显微镜发展史上的新成果&mdash &mdash 超高分辨率荧光显微镜为科学家所研制出。人们预言，它定会成为生物学家的好帮手。　　Stefan Hell打破了物理学界的传统看法　　自从1873年Ernst Abbe第一次发现光学成像具有衍射限制现象以来，物理学界就公认，显微镜的分辨率具有极限，该极限与光源的波长有关。直到一个多世纪之后，罗马尼亚物理学家Stefan Hell推翻了这一观点。他是首位不仅从理论上论证了，而且用实验证明了使用光学显微镜能达到纳米级分辨率的科学家。　　罗马尼亚物理学家Stefan Hell，现任德国马克斯· 普朗克生物物理化学研究院(Max Planck Institute of Biophysical Chemistry)主任。　　早在上世纪80年代中期，当时师从德国海德堡大学(University of Heidelberg)一位低温固态物理学家的Stefan Hell就已经发现，如果不是像常规那样使用一个透镜聚焦，而是将两个大孔径的透镜组合在一起聚焦，就可以提高光学显微镜的分辨率。Stefan Hell是首位发现这一现象的研究人员。　　Hell于1990年顺利完成了他的博士学业，但同时，这也意味着他将无法再凭借奖学金的资助进行研究了。Hell最终决定独自一人继续在家研究以上的发现，并最终成功发明了4Pi显微镜。4Pi显微镜，超高分辨率成像中的一个步骤　　时任美国马萨诸塞州坎布里奇市哈佛大学(Harvard University)化学系教授的Sunney Xie遇到了Hell，当他了解了Hell发明的4Pi高分辨率显微镜时，Xie对Hell勇敢地对传统物理学观点提出挑战的精神表示赞许。　　随后，Hell带着他的发明来到了位于德国海德堡的欧洲分子生物学实验室(European Molecular Biology Laboratory, EMBL)，并获得了德国科学基金会提供的奖学金。1991年，Hell在该实验室开始他的博士后研究工作。　　起初，许多科学家，包括那些声名显赫的物理学家都认为Hell的工作对于提高光学显微镜的分辨率没有太大的意义。他们认为，Hell仅用他那少得可怜的科研经费来从事这项研究简直就是在冒险。但Hell却始终坚信他能够打破衍射极限。　　Hell的努力没有白费，他的冒险终于获得了回报。1992年，Hell第一次用他的4Pi高分辨率显微镜证明了他的确能将传统光学显微镜的分辨率提高3~7倍。然而，尽管Hell提高了Z方向的分辨率，他还是没能突破衍射极限的限制。　　此后不久，Hell又在芬兰土尔库大学(University of Turku)得到了他的第二个博士后职位。一个星期六的早晨，Hell正躺在研究生公寓的床上看一本有关光学量子理论的书，突然，灵光一闪，Hell脑海里浮现了一个想法：如果使用一种合适的激光，仅激发一个点的荧光基团使其发光，然后再用一个面包圈样的光源抑制那个点周围的荧光强度，这样就只有一个点发光并被观察到了。Hell给他的这项发明取名STED，即受激发射损耗显微镜(stimulated emission depletion)。有了这个想法后，Hell立即行动，冲进实验室进行相关实验。每当回想起当时的心情，Hell都会觉得那是他科研生涯中最激动的时刻。　　曾在EMBL与Hell共事，并共同研发4Pi显微镜的Pekka Hanninen指出，Hell在土尔库大学进行研究工作时非常刻苦。那时，他经常被许多问题困扰。尽管如此，研究过程中还是有许多快乐萦绕着他们。Hell不仅是一名严谨的科学研究者，还是一名音乐爱好者，每当工作至深夜时，实验室走廊总会回响起Hell吹奏萨克斯风的动听乐声。由共聚焦显微镜(左图)和STED(右图)成像的一个神经元。　　1994年，Hell在《光学快报》(Optics Letters)上发表了他关于STED的理论文章。不过直到多年以后，这项理论才得以在实践中被证实。在那段时间里，Hell一面继续研究工作，一面四处奔走筹集科研经费，还卖掉了他4Pi 显微镜的专利。　　但是那个时候Abbe的衍射极限理论仍然在学界占统治地位，许多物理学家对Hell的理论都持怀疑甚至批评态度，因此他们也都将研究重点放在其它的成像技术上。尽管如此，Hell还是在1997年与马普生物物理化学研究所签订了一份长达5年的合同，以继续他的STED研究。　　1999年，Hell将他的研究成果分别投给了《自然》(Nature)杂志和《科学》(Science)杂志，不过都被退稿。当时两位杂志的主编都没有意识到他的研究成果将会改变整个显微镜领域。　　直到2000年，事情才终于有了转机&mdash &mdash 《美国国家科学院院刊》(PNAS)发表了Hell的科研成果。采用 Hell的STED技术，人们第一次得到了纳米级的荧光图像。Hell的工作由此获得了广泛的肯定，2002年，他获得了马普研究所的终身职位。从此，Hell一直在马普研究所从事成像技术的研究工作。　　紧随STED这项开创性工作之后，世界各地实验室等研究机构内陆续出现了一批高分辨率的显微镜技术。例如，由珍妮莉娅法姆研究学院(Janelia Farm Research Campus)的物理学家兼工程师Mats Gustafsson领导的研究团队开发出了结构光学显微镜(structured-illumination microscopy, SIM)。果蝇卵母细胞内的肌动蛋白的3D SIM成像，该照片拍摄于完整的卵泡内。　　SIM技术的原理是通过一系列光成像的图案对低分辨率莫尔条纹形式的精细结构进行成像，此类图像是采用其它技术所无法观察到的。然后再由计算机处理、分析这些条纹中包含的信息，最终就可以获得高分辨率的图像。　　同年，Gustafsson小组得到了HeLa细胞中肌动蛋白细胞骨架的图像，他的图像相比传统显微镜的图像来说，在测向上的分辨率提高了2倍。随后，Gustafsson小组又使用非线性技术将整体分辨率提高了4倍。　　科研竞赛　　2006年，超高分辨率显微镜研究行业翻开了新的篇章。Eric Betzig、Harald Hess以及Lippincott-Schwartz小组、Samuel Hess小组以及庄晓威(音译)科研小组几乎同时报道了他们提高显微镜分辨率的科研成果，下面分别介绍这三个小组的研究情况。　　Eric Betzig、Harald Hess以及Jennifer Lippincott-Schwartz小组　　2005年夏天，细胞生物学家Jennifer Lippincott-Schwartz卸下了她在美国马里兰州贝塞斯达美国国立卫生研究院(HIV)暗室里的红色灯泡。Lippincott-Schwartz正在为赋闲在家的两位物理学家Eric Betzig和Harald Hess腾出空间，筹备实验室。正是这两位物理学家研制出了光敏定位显微镜(photoactivated localization microscopy, PALM)，他们的这种新产品能将荧光显微镜的分辨率提升至纳米级水平。　　接下来的整个冬天，Eric Betzig、Harald Hess以及Lippincott-Schwartz等人都一直在那间狭小的没有取暖设备的实验室里工作。现在就职于美国弗吉尼亚州阿士伯恩霍华德休斯医学研究所珍妮莉娅法姆研究学院(Howard Hughes Medical Institute&rsquo s Janelia Farm Research Campus in Ashburn, Virginia)的Hess承认，自己与Betzig对生物学的认识都不深。不过近15年来，他们一直都在努力，希望能运用生物学知识获取高分辨率的显微图像，但是没有取得明显进展。然而，当Hess和Betzig了解到Lippincott-Schwartz和George Patterson在2002年发明的光敏绿色荧光蛋白(photoactivatable green fluorescent protein)后，他们知道他们已经找到了解决问题的关键所在。　　回想起当时的情形，Lippincott-Schwartz指出：&ldquo 他们当时非常激动。我还记得当我们得到第一张显微图像时，你根本无法看出那是什么东西。直到我看到他们将荧光图像和电镜图像叠加之后的结果才相信，我们成功了。我当时觉得这一切真是太神奇了。&rdquo 　　2006年，Eric Betzig、Harald Hess以及Lippincott-Schwartz小组在《科学》(science)杂志上发表了他们的PALM研究成果。使用PALM可以清楚得看到细胞黏着斑和特定细胞器内的蛋白质。　　Samuel Hess小组　　Samuel Hess小组是上述三个小组之一。Hess是美国缅因州立大学(University of Maine)物理系的助理教授。2005年夏天，Hess一直在和他们学校的化学工程师和生物学工程师，就如何提高观察活体细胞脂筏结构的分辨率等问题进行交流。　　2005年的一个夏夜，Hess被邻居家举办舞会的声音吵醒。半睡半醒的Hess走下楼来，随手画了一副设计图，他的这种设计是需要借助荧光标记的蛋白质来显示细胞形态的。第二天早上，当Hess重新翻看这幅非清醒状态绘制的潦草的设计图时，不由得大笑起来。不过令人吃惊的是，他的这幅设计图竟然没有一点问题。于是他把这幅图拿给物理系的同事检查，但同事也没有发现任何问题。　　接下来，Hess就按照他的设计图开始制作显微镜了。此时，他的科研经费所剩不多，而结题时间转眼就到。因此，Hess等人以最快的速度组装好显微镜，并进行了试验。同时，在不到两天的时间里，缅因州立大学表面科学技术实验室的同事就为Hess制备好供检验显微镜效果的蓝宝石晶体样品。　　对于同事们的帮助，Hess总是不胜感激。　　2006年，《生物物理学期刊》(Biophysical Journal)刊登了Hess小组的科研成果。他们将这项研究成果命名为荧光光敏定位显微镜(fluorescence photoactivation localization microscopy, FPALM)。2007年，Hess小组证明了FPALM可以分辨细胞膜脂筏上的蛋白质簇。　　庄晓威科研小组　　与此同时，另一个研究小组&mdash &mdash 哈佛大学霍华德休斯医学研究所(Howard Hughes Medical Investigator at Harvard University)的研究员庄晓威科研小组也在研究高分辨率成像技术。　　通过3D STORM观察到的一个哺乳动物细胞内线粒体网状系统。传统荧光成像(左图) 3D STORM成像(中图)，其中，采用不同颜色标记出z的位置 3D STORM成像中xy维图像(右图)。　　其实，这三个小组都有一个共同的也是非常简单的理念，那就是先获得单分子荧光图像，再将成千上万个单分子图像叠加在一起，获得最终的高分辨率的图像。　　早在2004年初，庄等人就已经意外发现了有一些花青染料可以用作光敏开关。这也就意味着这些染料既可以被激活发出荧光，也可以被关闭不发光，人们可以使用不同颜色的光束来随意控制这些花青染料的开和关。　　从那以后，庄等人就一直在研究如何用光敏开关探针来实现单分子发光技术。他们希望能用光敏开关将原本重叠在一起的几个分子图像暂时分开，这样就能获得单分子图像，从而提高分辨率。Eric Betzig小组和Samuel Hess小组也都采用了同样的策略，只不过他们使用的不是光敏开关而是一种可以先被荧光激活继而被漂白失活的探针。　　2006年，庄的科研成果在《自然-方法》(Nature Methods)杂志上发表，他们将这项成果命名为随机光学重建显微镜(stochastic optical reconstruction microscopy, STORM)。使用STORM可以以20nm的分辨率看到DNA分子和DNA-蛋白质复合体分子。　　此后几年，超高分辨率荧光显微镜又得到了进一步的发展。现在，生物学家已经能够使用超高分辨率荧光显微镜在纳米水平上观察细胞内部发生的生化变化了。以往那些大小在200nm至750nm之间的模糊泡状图像再也无法对他们造成困扰了。尽管早在上世纪80年代，科研机构里就已经出现了超高分辨率显微镜的构思，但只是最近几年里这项技术才伴随着它的商业化进程获得了快速发展。现在，已经有几十家实验室安装了这种最新型的显微镜并投入了使用。正像Lippincott-Schwartz所说的，超高分辨率显微镜正在以飞快的速度被科研界接受，在生物学界更是如此。　　超高分辨率显微镜的成绩　　已经开始使用这些显微镜的生物学家对这项技术都表示出了极高的热情。Jan Liphardt这位在美国劳伦斯伯克力国家实验室(Lawrence Berkeley National Laboratory)工作的生物学家，还清楚地记得他2006年第一次在《科学》(science)杂志读到Betzig的那篇有关PALM技术的论文时的激动心情。当他看到那幅线粒体蛋白的图像时立刻想到了该技术可以用于他自己的微生物研究领域。　　Liphard说道：&ldquo 通常，我们得到的大肠杆菌荧光图像都只有20像素，甚至更低，现在突然有一幅几千像素的图片摆在你面前，你可以想象那是一种什么感觉。&rdquo 　　Liphard现在正与Betzig以及其他一些研究人员一起研究大肠杆菌的趋化现象(chemotaxis)。Liphard还提到：&ldquo 我从没想到这项技术达到的分辨率有这么高，可以如此清楚地看到细胞内单个蛋白质分子的定位，甚至还能定量。而对我来说，每天的工作实际上就是在弄清楚这些蛋白质在什么位置，什么时候存在。而之前我们的研究主要采用间接方法。但超高分辨率显微镜这项新技术是我从事科研工作这么长时间以来，感触最深，获益最大的一项科技成果。&rdquo 　　美国丹佛市科罗拉多州立大学医学院(Medicine at the University of Colorado Denver)的助理教授Nicholas Barry也正在和Betzig合作，他们使用了一台蔡司的全内反射荧光成像系统(total internal reflection fluorescence imaging, TIRF)来研究肾细胞顶端胞膜上的蛋白质簇。　　Barry指出，只需要一台蔡司显微镜和普通电脑，差不多就足够了。此外，他们还花费3万美元添置了两台激光发射器。现在，Barry等人可以在8分钟内得到一幅图像，这幅图像由10000帧图像合成，每一帧图像上显示10个分子。最后的图像文件大小大约是0.3GB。Barry等人还使用Perl语言自己开发了一套免费程序。Barry表示：&ldquo 这里面包含了每帧图像的资料信息，客户可以根据这些信息进行相关计算。&rdquo Barry充满信心地提到，很快就会有人为NIH的那套免费图像分析软件ImageJ开发出一套运算程序作为插件使用。　　美国斯坦福大学(Stanford University)化学及应用物理系教授W.E. Moerner曾于1989年第一个在试验中使用光学显微镜得到了单分子图像。W.E. Moerner教授表示，这几年来，超高分辨率显微镜研究领域已经取得了巨大的进展，终于达到了纳米级单分子分辨率。他兴奋地说：&ldquo 经过了近20年对单分子成像课题的研究，我们终于取得了完美的成果。&rdquo 　　展望　　自从2006年STORM技术和PALM技术问世以来，科技工作者就一直在不断努力，对它们进行改进、完善和提升。2008年，Lippincott-Schwartz的研究团队将PALM技术和单颗粒示踪技术(single-particle tracking)结合，成功地观测到活体细胞胞膜蛋白的运动情况。同年，庄小威研究组在《科学》(science)杂志上也发表了他们的3D STORM成像成果，该技术的空间分辨率比以往所有光学3D成像技术的分辨率都要高出10倍。论文中，他们展示了用3D STORM成像技术拍摄的肾细胞内微管结构图和其它的分子结构图。随后，他们又进一步将该技术发展成了多色3D成像技术(multicolor 3D imaging)。Gustafsson，还有其他一些科研工作者使用3D SIM技术(该技术使用3束干涉光，而不是常见的2束)观察到了共聚焦显微镜(confocal microscopes)无法观测到的哺乳动物细胞核内结构。位于德国的世界知名光学仪器制造公司蔡司公司进一步发展了SIM和PALM技术，不过他们将PALM称为PAL-M。蔡司公司预计将于2009年末推出全新的成像产品。　　2008年，Hell小组使用STED技术通过抗体标记目标蛋白，观察到了活体神经元细胞中突触小泡(synaptic vesicles)的运动过程。同年稍晚些时候，他们又使用4Pi显微镜和STED技术得到了固定细胞内线粒体的3D图像，分辨率达到了40至50nm。最近，他们又使用超高分辨率显微镜成像技术对脑切片组织中的形态学变化进行了研究，并得到了活体神经元细胞树突棘(dendritic spines)的3D图像。PALM在哺乳动物细胞内拍摄到的粘附复合物。　　由于最近几年这些新技术的不断涌现，现在可以对活体细胞进行三维观察了。Gustafsson指出，随着PALM技术和STORM等新技术的出现，以前很多看起来不可能的事情现在都变得可能了。　　尽管已有许多科学家从这项技术进展中获益，但是仍然可以进一步提高，以使更多的研究人员能够在自己的工作中使用它。到目前为止，那些成功应用此项技术的实验室都采取了正确的技术组合：研究人员可以很好地将物理学与生物学相结合&mdash &mdash 他们将显微镜装配并做适当的调节，然后用它对生物学样品进行检测。Moerner指出，软件的编写也不容小觑：对检测到的光子进行定位和报告需要进行准确计算，从而得到合适的分辨率。　　仅仅是显微镜的价格就已经限制了它的普及性，Leica&rsquo s TCS STED显微镜高达100万美元。因此，如何获得相应的资金来购置显微镜仍然是摆在研究人员面前的一个难题，位于丹佛市的科罗拉多大学(University of Colorado)光学显微镜组主任Bill Betz这样说道。　　Betz曾申请用于显微镜购置的资金，但遭到了拒绝。但他表示，他们已经计划再次申请相关资金。而Stefan Hell曾指出，激光领域的技术进展已经可以使得研究人员自己在实验室内构建一个STED平台，花费只需不到10万美元。　　除了要将这一技术方法普及，使生物学家能够加以利用之外，该项技术的研发人员还表示，他们已经开始致力于研究更宽范围及更多样的荧光探针了。更好的探针当然能够为我们带来更高的分辨率及更快速的图像处理。美国纽约阿尔伯特&bull 爱因斯坦医学院(Albert Einstein College of Medicine)解剖学及结构生物学副教授Vladislav Verkhusha说到：&ldquo 为了对活体哺乳动物细胞进行研究，你就需要有一整套的荧光标记蛋白和可通过光控开关控制的蛋白质。&rdquo 他本人在荧光蛋白领域的研究工作就受益于PALM的出现。　　庄晓威的众多项目之一便是与Alice Ting及其在麻省理工学院(MIT)的实验室合作，对蛋白标记技术进行研究，希望能够找到一种方法可以将小和明亮的光控开关可控的探针标记于细胞的特异蛋白上，从而可以对活细胞进行成像。她提到：&ldquo 将遗传标记方法与小而明亮且可被光控开关控制的探针结合在一起，将是今后发展分子级别超高分辨率成像的十分理想的一种方法。&rdquo 　　尽管研发人员还将继续努力，以进行相应技术的提高，但是超高分辨率荧光显微镜更加广泛的应用还是毫无疑问地成为新的一年的标志。Harald Hess说：&ldquo 这一技术的确会为生物学家的工作带来很大的帮助。同时，我们也在不断询问，&lsquo 你们想要用它做什么精彩的实验?&rsquo 事实上，我们也得到了许多精彩的答案。&rdquo

p　　中科院膜生物学国家重点实验室联合华中科技大学发明了一种超灵敏结构光超高分辨率显微镜-----海森结构光显微镜 （Hessian SIM)，实现了活细胞超快长时程超高分辨率成像，能辨清囊泡融合孔道和线粒体内嵴动态。在每秒钟得到188张超高分辨率图像时，海森结构光显微镜的空间分辨率可以达到85纳米，能够分辨单根头发的1/600到1/800大小结构，而所需要的光照度小于常用的共聚焦显微镜光照度三个数量级。同时，该显微镜也实现了细胞“能量工厂”线粒体的超快超分辨成像，首次在活细胞中解析线粒体融合、分裂时内嵴的活动，及线粒体内嵴自身的重组装过程，并能够观察内质网与线粒体发生相互作用时的动态变化。/pp　　与获得2014年Nobel化学奖的受激辐射损耗超高分辨率显微镜（STED）相比，其具有极高的时间分辨率、极低的光毒性，在活细胞超高分辨率成像方面优势显著。/pp style="text-align: center "img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201805/insimg/235ade60-4b77-42b8-bfd2-21c083b4ea5d.jpg" title="640-2.jpeg"//pp　　海森结构光显微镜解析囊泡融合孔道形成全过程。上图：实际的动态过程解析；下图：由实验结果得到的囊泡融合的四个中间态。/pp　　灵敏海森结构光超高分辨率显微镜的成功验证，一方面基于新偏振旋转玻片阵列、高精度的时序控制程序以及高数值孔径物镜等硬件的自主研制；另一方面是重构算法的创新，首次提出将生物样本在多维时空上连续，而噪声是完全随机分布的先验知识用于构建海森矩阵，指导超高分辨率荧光图像的重建。/pp　　超灵敏海森结构光显微镜适用于各种细胞、不同探针的荧光成像。可以说，所有应用点扫描共聚焦显微镜的场景都可以使用海森结构光显微镜，因而具有广泛的应用前景。/pp　　此项研究成果以题为“Fast, long-term, super-resolution imaging with Hessian structured illumination microscopy” 以全文形式于近日在线发表于《Nature Biotechnology》 上。/pp　　论文链接：https://www.nature.com/articles/nbt.4115/ppbr//p

2021年5月，多功能高分辨率磁光克尔显微成像系统在清华大学顺利完成安装和调试，并获得用户的高度认可。该系统是由北京航空航天大学集成电路学院赵巍胜教授指导，张学莹老师带领团队根据多年积累的磁畴动力学实验技巧和 新的磁学及自旋电子学领域的热点课题研究需求设计的，也是Quantum Design中国与致真精密仪器（青岛）有限公司合作推出后在国内完成的套安装和验收。 致真精密仪器（青岛）有限公司工程师与用户的现场合影 安装精彩瞬间相比于传统的磁光克尔显微镜，该系统除了拥有高达300 nm的纵向和向克尔成像（分别对应面内和垂直各向异性样品磁畴测量），还增加了灵活的磁场探针台及面内旋转的磁场和高度智能化的软件控制系统。其中磁场探针台可以同时施加面内和垂直的磁场，通过智能控制系统，能够让用户利用软件定义电、磁等多种想要的波形，一键触发后，在样品上可同步施加垂直/面内磁场、电流脉冲、微波信号，进行磁光克尔成像及微区磁滞回线提取、局部饱和磁化强度Ms表征、局部各项异性能K的表征、海森堡交换作用常数Aex，Dzyaloshinskii-Moriya作用的表征等，在磁性薄膜材料和自旋电子器件动力学分析领域有着突出的优势。这套多功能高分辨率磁光克尔显微成像系统历经5年多的研发历程，在北航集成电路学院、北航青岛研究院的支持下，经过了3轮迭代和试用，在致真精密仪器（青岛）有限公司团队进行工程化之后，形成了性能稳定，功能多样，多场景适配改装方便的系统。该产品还获得了青岛市市长杯创新创业大赛一等奖。北航团队在该设备的强大功能支撑下，在DMI测量[1]、自旋轨道矩（SOT）效应研究[2]、磁畴壁动力学[3-4]、磁性材料和自旋电子器件研究[5]等方面，取得了丰富的成果。同时，该设备还可用于永磁材料和硅钢等软磁材料的磁畴分析等。该设备的成功落户标志着国产商用磁光克尔显微镜领域的长期空白得以弥补。作为北航集成电路学院工艺与装备系孵化的公司，致真精密仪器（青岛）有限公司传承了北航文化，响应在高端科研设备方面的需求，与时俱进，精益求精，敢于啃硬骨头，做高品质高可靠性产品。同时，作为本土企业，致真精密仪器会始终与用户保持良好沟通，紧密追踪前沿热点，以用户的需求和科学发展方向为指引，将 新的测试技术融入到产品中去，为新老用户持续做好服务，支持中国甚至全球更多的科研者的科学探索。目前，该系统已经更新至三代，感谢所有提出过建议的老师和同学们，也欢迎大家继续提供宝贵的意见！在此，特别感谢清华大学的老师对我们的信任与支持，祝他们科研顺利，硕果累累！目前，这款多功能高分辨率磁光克尔显微成像系统已经获得了清华大学、中国科学院物理研究所、北京工业大学、上海科技大学等客户多套订单。 产品基本参数： ☛ 向和纵向克尔成像分辨率可达300 nm；☛ 配置二维磁场探针台，面内磁场 高达1 T，垂直磁场 高达0.3 T（配置磁场增强模块后可达1.5 T）；☛ 快速磁场选件磁场反应速度可达1 μs；☛ 可根据需要选配直流/ 高频探针座及探针；☛ 可选配二次谐波、铁磁共振等输运测试；☛ 配置智能控制和图像处理系统，可同时施加面内磁场、垂直磁场和电学信号同步观测磁畴翻转；☛ 4K~800K，80K~500K 变温选件可选。 样机体验：目前，致真精密仪器（青岛）有限公司可对相关领域感兴趣的科学工作者提供测样体验，欢迎感兴趣的老师或同学通过拨打电话010-85120280或发送邮件至info@qd-china.com体验磁光克尔显微成像全新技术！ 参考文献：[1]. Cao, A. et al. Tuning the Dzyaloshinskii–Moriya interaction in Pt/Co/MgO heterostructures through the MgO thickness. Nanoscale 10, 12062–12067 (2018).[2]. Zhao, X. et al. Ultra-efficient spin–orbit torque induced magnetic switching in W/CoFeB/MgO structures. Nanotechnology 30, 335707 (2019).[3]. Zhang, X. et al. Low Spin Polarization in Heavy-Metal–Ferromagnet Structures Detected Through Domain-Wall Motion by Synchronized Magnetic Field and Current. Phys. Rev. Appl. 11, 054041 (2019).[4]. Zhang, Y. et al. Domain-Wall Motion Driven by Laplace Pressure in CoFeB/MgO Nanodots with Perpendicular Anisotropy. Phys. Rev. Appl. 9, 064027 (2018).[5]. Zhang, X. et al. Spin‐Torque Memristors Based on Perpendicular Magnetic Tunnel Junctions for Neuromorphic Computing. Advanced Science 8, 2004645 (2021).