全自动诱导荧光毛细管

捷报：7月26日，中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室与北京朝阳医院、澳大利亚昆士兰大学合作，利用全自动毛细管Western技术，研究调节性T细胞外泌体智能递送VEGF抗体用于眼底新生血管性疾病联合治疗发表在Nature Biomedical Engineering（IF：18.952）。研究背景年龄相关性黄斑变性和糖尿病性视网膜病变诱发的新生血管的形成是导致失明的两个主要原因，通常的治疗方案是使用靶向血管内皮生长因子(VEGF)的抗体（anti-VEGF antibodies (aV)）进行治疗。尽管治疗的早期阶段aV具有更高的有效性，但仍有50%–67.4%的aV治疗的老年性黄斑变性患者，在治疗2年后有视力恢复不佳等情况发生。在糖尿病视网膜病变中的患者中，对aV治疗的抵抗率（持续性黄斑增厚）也约为40%。这意味着aV在眼部新生血管病变中的药效不是很理想，或者还有其它致病因素如炎症等因素需要考量。有研究报道，与接受白内障手术的没有其它眼部病变的患者相比，脉络膜新生血管(CNV)或视网膜新生血管（RNV）的患者的房水中炎性细胞因子水平升高，且这些炎症标志物与眼部新生血管疾病中VEGF产生的增加呈正相关。因而，炎症不一定是新血管形成的结果，也有可能是驱动眼部新生血管形成的主要致病因素之一。而原有使用激素疗法来抗炎的案例又有不良反应发生，因此急需一种新型的联合给药方式（抗VEGF+抗炎）出现。研究内容中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室与北京朝阳医院等地的科学家，基于VEGF和炎症的协同活性促进眼部新生血管形成的机制，开发了一种针对抗VEGF和抗炎症的联合疗法。利用体内具有天然抗炎活性的Treg来源的外泌体（rEXS）为载体，通过基质金属蛋白酶（MMP）敏感肽段（cL）连接VEGF抗体（aV），创建了rEXS-cL-aV体系。当玻璃体腔注射后，利用rEXS向炎症部位的趋化性，携带aV富集于眼底新生血管病灶，随后利用病灶部位高表达的MMP酶解敏感肽段cL并释放aV。在上述时空耦合递送的基础上，分别利用rEXS的抑制炎症作用和aV的抑制血管生成作用实现协同增效。全自动毛细管Western技术鉴定调节性T细胞外泌体VEGF抗体递送系统（rEXS-cL-aV）CD9, CD47, ALIX, TSG101: 外泌体marker（鉴定外泌体）CCR6：趋化因子受体（通过炎症趋化因子的梯度增强纳米药物在新生血管病变中的积累）IL-10，CTLA-4：Treg免疫抑制蛋白（鉴定此外泌体是Treg来源）aV：VEGF（鉴定递送药物VEGF抗体）β-Tubulin：内参（蛋白定量归一化）此研究中鉴定调节性T细胞外泌体VEGF抗体递送系统（rEXS-cL-aV），利用了全自动毛细管Western技术。因常规制备方法获取外泌体样本效率不高，因此用传统Western技术会常常面临样本量不足，无蛋白表达的困境。全自动毛细管Western技术，只需3μL样本，不到3小时直接获得24个样本定量结果。且此过程除手动加样+试剂后，无需任何手动操作，数据稳定重现性佳，是微量或珍稀样本蛋白定量的不二之选。

项目编号：HBZJ-2022N1196项目名称：邢台市人民医院全自动毛细管电泳仪采购项目预算金额：1000000最高限价（如有）：1000000采购需求：全自动毛细管电泳仪2台合同履行期限：合同签订生效后60天内本项目不接受联合体投标。

当国内抗击新型冠状病毒已经取得阶段性胜利，各地方政府推出各种积极鼓励政策，普及全民免费接种新冠病毒疫苗的时候，当地时间2021年5月3日，刚果（金）卫生部宣布，该国第12轮埃博拉疫情结束......“国民男神”张文宏医生曾与樊登对话时指出：“如果今年新冠的死亡率、病死率，是像埃博拉一样的，其实这个病还是比较容易控制的。”埃博拉病毒，一个既熟悉又陌生的名字。埃博拉病毒（EBOV）是一种膜包被的负单链RNA病毒，属于Filoviridae家族，编码7种结构蛋白。该病毒在人类和非人类灵长类动物中可引起严重的出血性发热、腹泻、呕吐、肌痛、肝肾功能损伤等临床症状。迄今为止，已确定6种埃博拉病毒，包括扎伊尔型埃博拉病毒（ZEBOV），该病毒对人类的致死率最高，死亡率为60％ ~ 90％。2014年至2016年，西非国家利比亚、几内亚和塞拉利昂曾爆发了最大规模的埃博拉病毒，导致超过28000人感染，11000人死亡。这次史无前例的爆发主要是由扎伊尔型埃博拉病毒所引起，世界卫生组织（WHO）宣布进入国际关注的公共卫生紧急状态。2021年2月至5月，刚果（金）民主共和国北基伍省共发现确诊病例12例，其中死亡6例。埃博拉疫情能被一次又一次得到有效控制，死亡率降低，感染人数减少，不得不说，很大一部分原因是得益于埃博拉疫苗的普及。全球首个上市预防埃博拉病毒病的商品化疫苗ERVEBO，即rVSV∆G-ZEBOV-GP疫苗，2019年已获得欧盟EMEA和美国FDA批准使用。此疫苗由全球领先的Merck公司研发生产，采用多种创新性的技术。其疫苗分析研究进展与疫苗工艺开发和商业化部门于2020年8月发表题为Characterization of rVSV∆G-ZEBOV-GP glycoproteins using automated capillary western blotting的文章， 披露了利用全自动毛细管Western Blot技术平台表征rVSV∆G-ZEBOV-GP糖蛋白的详细技术细节。研究背景EBOV主要通过由病毒糖蛋白（GP）介导的相互作用来感染宿主细胞。EBOV基因组由于转录停顿可产生三种不同的包膜GP变体。未编辑的RNA转录编码一个非结构分泌型GP（sGP）蛋白。开放阅读框（ORF）的+1转变，可产生一个结构上重要的病毒膜结合型GP蛋白。最后，ORF的+2转变，可产生一个非结构小型分泌型GP（ssGP）。每种蛋白在致病机制方面的作用先前已经描述。EBOV GP合成为一个多肽，被一种类似呋喃的蛋白酶裂解，生成一个异质二聚体，由GP1和GP2亚基组成，通过一个二硫键连接在一起。ZEBOV包膜GP蛋白的表面含有17个N-连接糖和许多糖基化位点。GP1负责与细胞受体的结合，有三个结构域，包括一个受体结合域、一个糖帽和一个非结构性的重度O型糖基化区域（粘蛋白样结构域）。GP2有一个跨膜结构域，负责与病毒的融合。GP2∆，发现于脱落GP蛋白，是TNF-a转换酶（TACE）对GP2进行酶切的结果。EBOV的细胞进入机制，是由组织蛋白酶的半胱氨酸蛋白酶介导的，它裂解完整的EBOV GP1，去除糖帽和粘液蛋白结构域，暴露出增加受体结合和病毒感染性的氨基酸残基。该项研究阐述了在整个rVSV∆G-ZEBOV-GP疫苗生产过程中，使用全自动定量毛细管Western Blot检测平台，研究和表征ZEBOV糖蛋白。自动化Western Blot与传统手工Western Blot技术平台相比有诸多优点：线性范围增加更高的通量因自动化而增强的重复性由于该技术的高特异性，毛细管Western Blot技术已被应用于疫苗产品和治疗性蛋白质的表征。该项目中，研究人员还进行了方法学对比，对比了传统手动Western Blot技术与全自动毛细管Western Blot检测技术。研究结论我们已开发和应用基于全自动毛细管Western Blot检测方法，去开发及生产ERVEBO疫苗。使用该方法表征在疫苗生产的过程中，GP变体的类型和数量。毛细管Western Blot技术提供了与传统手动Western Blot系统相似的GP结果。但是，具有更好的重复性，更准确的定量，并更简单易用。该方法有助于表征疫苗生产中酶促反应步骤，评估下游纯化步骤中的变化，并确认多批次间的工艺稳定性。实验表明，使用VSV载体产生的GP、sGP和ssGP的相对数量与天然埃博拉病毒中观察到的不同。GP蛋白是在感染期间产生的，只有病毒粒子膜结合的GP包含在rVSVΔG-ZEBOV-GP疫苗最后的DP中。毛细管Westerns表明，ERVEBO生产过程中的每个步骤都有独特的电泳图，该方法可以作为一个有利的工具，去评估生产过程的不同阶段。方法学对比根据工序，rVSV∆G-ZEBOV-GP使用1x样品缓冲液中稀释至7倍。初步稀释后，将样品在2个混合物（含样品缓冲液、二硫苏糖醇和荧光标准品）中稀释2倍，在70℃下加热10分钟。随后，样品经短暂涡旋去除气泡后，加载到12-230 kDa的样品板上。一抗（兔抗ZEBOV-GP）母液被加载到样品板前，用抗体稀释液（终浓度为2μg/mL）稀释1000倍。毛细管Western Blot仪器采购于ProteinSimple公司（Santa Clara, CA, USA）。仪器设置定义如下：分离时间设置为30分钟，一抗体孵育时间为30至60分钟，二抗体孵育时间为30至60分钟。使用仪器的化学发光检测通道在不同的曝光长度下进行检测。除非另有规定，曝光时间为2s。所有未指定的设置均采用供应商的默认选项。Merck早在2012年就曾发表文章指出，对比传统手动WB （罗氏于2005年发表：CV 35%），ProteinSimple全自动Western Blot检测平台的数据CV值可以控制在10%以内。结果展示图1. 基于毛细管法获得的工艺步骤电泳图谱(A) 收获病毒液（HVF：Harvested virus fluid）为工艺流程中最早的步骤，即病毒转染后收获。包含：GP1（260 kDa）、未知（190 kDa）、可溶性GP（95 kDa）和GP2 + GP2∆（40 kDa）；(B) 澄清病毒液（CVH：Clarified viral harvest）为工艺流程中的第二步，过死端过滤以去除细胞碎片和样品。包含：GP1（260 kDa）、可溶性GP（95 kDa）和GP2 + GP2∆（40 kDa），未知的190 kDa峰被去除；(C) 反应后病毒收获（RVH：Reacted viral harvest ），在纯化过程的酶解步骤之后。包含：由胰蛋白酶处理的GP1、可溶性GP（95 kDa）、GP2 + GP2∆（40 kDa）和较低分子量的蛋白质（12 kDa）组成，可能是胰蛋白酶处理后产生的GP1片段；(D) 超滤产品（UFP：Ultrafiltration product），样品被超滤后。包含：GP1（95 kDa）和GP2（40 kDa），所有可溶性GP和脱落的GP被去除；(E) 药物产品（DP: Drug product），通过加入Tris和rHSA （recombinant Human Serum Albumin:重组人血清白蛋白）稀释DS（Drug substance：原药）至目标浓度。包含：GP1（95 kDa）和GP2（40 kDa），由于rHSA与一抗的交叉反应，DP中观察到一个约60 kDa的rHSA峰，DP浓度比UFP中低约2-logs。原药电泳图（补充信息图.1S）与UFP相似，因为其浓度与UFP相似，尽管含有rHSA作为稳定剂。图片中的峰高经过调整，以最好地呈现出每个样品。图2. 胰蛋白酶处理步骤的过程表征(A) 胰蛋白酶处理CVH样品时间过程电泳图，GP1峰在10分钟内从260 kDa转移到95 kDa，随着时间的推移，峰面积持续减少；(B) 加入胰蛋白酶抑制剂后结果，RVH样品在室温下进行Hold Time Study。在168小时内，GP1峰值持续缓慢下降。图3. 批间工艺一致性评价：通过峰面积评估四个不同批次的GP变体的百分比，以确保工艺一致性(A) 四个不同批次的CVH中GP和可溶性GP的峰面积百分比；(B) 其中一个批次的CVH的电泳图，显示峰值积分和分配；(C) 四个不同批次的UFP样品，显示峰面积分布；(D) UFP样品的电泳图，显示峰值积分整合和分配。四个批次CVH样品中，GP（包括GP1和GP2+GP2Δ）占总峰面积的78%，可溶性GP平均占22%。全自动毛细管Western Blot技术平台展望后疫情时代，我们依然需要居安思危，对科学与自然保持敬畏之心。潜心开发传统疫苗、亚单位疫苗、联合疫苗、核酸疫苗和治疗性疫苗，惠及人民。作为地球人，疾病无国界，先进技术无国界，爱与帮助也同样无国界。国外成熟的疫苗研发与生产技术路线，值得我们学习和借鉴。ProteinSimple全自动毛细管Western Blot技术平台，已被众多科研工作者使用，从事人用和兽用疫苗相关研发、生产和质控，包括埃博拉病毒疫苗，狂犬病病毒疫苗，肺结核病病毒疫苗，新型人乳头瘤病毒疫苗，SARS-CoV-2疫苗等等。正如ERVEBO生产整个过程中，全自动毛细管Western Blot技术平台可呈现出独特的电泳图，去评估疫苗生产过程的不同阶段。其高质量高重复性数据（CV 10%）、全自动高通量快速检测流程（25个样品仅需3h，最高通量为96个样品）、超微量样品（仅需3ul）、除分子量分离外，可兼容等电点分离的灵活应用，等等诸多优势，使得全自动毛细管Western Blot技术平台逐渐取代传统手工Western Blot检测技术，被广泛应用于疫苗领域。 代表文献 1. A single-dose live-attenuated YF17D-vectored SARS-CoV-2 vaccine candidate, L. Sanchez-Felipe, T. Vercruysse, S. Sharma, J. Ma, V. Lemmens, D. Van Looveren, M. Javarappa, R. Boudewijns, B. Malengier-Devlies, L. Liesenborghs, S. Kaptein, C. De Keyzer, L. Bervoets, S. Debaveye, M. Rasulova, et al., Nature, 2021 590: 320–325.2. OvHV-2 glycoprotein B delivered by a recombinant BoHV-4 is immunogenic and induces partial protection against sheepassociated malignant catarrhal fever in a rabbit model, S. Shringi, D. O’Toole, E. Cole, K. Baker, S. White, G. Donofrio, H. Li and C. Cunha, Vaccines, 2021 9:90.3. Analysis of the antigenic properties of membrane proteins of Mycobacterium tuberculosis, H. Li, L. Liu, W. Zhang, X. Zhang, J. Zheng, L. Li, X. Zhu, Q. Yang, M. Zhang, H. Liu, X. Chen and Q. Jin, Scientific Reports, 2019 9:3042.4. Inactivated rabies virus-vectored immunocontraceptive vaccine in a thermo-responsive hydrogel induces high and persistent antibodies against rabies, but insufficient antibodies against gonadotropin-releasing hormone for contraception, X. Wu, Y. Yang, C. Kling, L. Seigler, N. Gallardo-Romero, B. Martin, T. Smith and V. Olson, Vaccines, 2019 7: 73.5. Quantitation of CRM197 using imaged capillary isoelectric focusing with fluorescence detection and capillary Western, J. Loughney, S. Ha and R. Rustandi, Analytical Biochemistry, 2017 534:19–23.6. Neutralization of diverse human cytomegalovirus strains conferred by antibodies targeting viral gH/gL/pUL128-131 pentameric complex, S. Ha, F. Li, M. Troutman, D. Freed, A. Tang, J. Loughney, D. Wang, I. Wang, J. Vlasak, D. Nickle, R. Rustandi, M. Hamm, P. DePhillips, N. Zhang, J. McLellan, et al., Journal of Virology, 2017 91:e02033-16.7. Applications of an automated and quantitative CE-based size and charge western blot for therapeutic proteins and vaccines, R. Rustandi, M. Hamm, C. Lancaster and J. Loughney, Methods in Molecular Biology, 2016 1466:197–217. 参考文献 1. Characterization of rVSVΔG-ZEBOV-GP glycoproteins using automated capillary western blotting, K. Minsker, R. Rustandi, S. Ha and J. Loughney, Vaccine, 2020 38(45):7166–7174.2. Qualitative and quantitative evaluation of SimonTM, a new CE-based automated Western blot system as applied to vaccine development, R. Rustandi, J. Loughney, M. Hamm, C. Hamm, C. Lancaster, A. Mach and S. Ha, Electrophoresis, 2012 33:2790–2797.3. Precision and variance components in quantitative gel electrophoresis, Koller, A. and H. Watzig, Electrophoresis, 2005 26(12):2470-2475.