环境空气苯并芘高效法

用的是大连依利特液相色谱，岛津荧光检测器，HJ956-2018标准，做工作曲线，激发波长365，吸收波长430，甲醇：水=90：10，出现的谱图，有两个峰分不开。所有浓度点都这样，什么原因[img=苯并芘,557,435]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/05/201905301434042636_8392_3447031_3.png!w557x435.jpg[/img]

高效液相色谱法分析苯并芘大鼠肝脏线粒体的代谢产物 本实验建立了一种用高效液相色谱法分析苯并芘及其在大鼠肝脏线粒体中的六种代谢产物的分析方法。使用乙腈、水梯度洗脱作为流动相，紫外探测器分析得到苯并芘的羟基化代谢产物以及苯并芘酮，包括3-羟基苯并芘、9-羟基苯并芘、苯并芘4,5-二氢二醇、苯并芘-7,8-二氢二醇、9，10-二羟基-9，10-二氢苯并芘、苯并芘二酮。其中苯并芘二酮含量最低。该实验结果对于推断细胞CYP1A1酶在体内体外模型中对于苯并芘增毒和解毒作用奠定了重要的基础。 前言：苯并芘是苯与芘稠合而成的一类多环芳烃，苯并芘和其他多环芳烃主要是有机物的不完全燃烧或热解生成，并且在环境中普遍存在。除了污染空气的吸入，摄入的主要途径有吸烟和饮食以及一些职业的摄入如煤、焦炭、沥青的燃烧以及煤焦油的使用。苯并芘能够导致细胞毒性、致畸致突变的毒性以及致癌的毒性。动物实验长期暴露于苯并芘中可导致动物的皮肤、胃、肺组织的癌变。苯并芘在作用于DNA之前需要代谢活化，这也是苯并芘发挥毒性很重要的代谢步骤。细胞色素P450（CYP）酶和环氧化物酶是主要的苯并芘的活化酶,首先CYP酶将苯并芘氧化为环氧化物然后在环氧化物水解酶的作用下生成二氢二醇，CYP同工酶将其进一步的活化为活性成分苯并芘-7,8 - 二氢二醇-9,10 - 环氧化物（BPDE），其可作用于DNA，其优先在鸟嘌呤残基上形成加合物，该加合物是BPDE在体内体外试验中于DNA主要的加合物。在CYP酶中，CYP1A1和B1认为是BaP代谢活化中重要的酶，但是CYP1A1在体内排毒的作用较大于其活化BaP的作用。为了解释这些发现，BaP的体内体外代谢与解毒作用应该进一步进行评价，定性和定量分析BaP在CYP同工酶和环氧化物酶下的所有代谢产物，以及这些致癌物与DNA加成物的评价也很有必要。本实验优选色谱条件使得BaP在大鼠肝脏线粒体内的代谢产物能够很好的分离以及通过紫外检测器灵敏的检测。苯并芘在生物体内的代谢步骤：http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2014/09/201409291248_516273_2360169_3.jpg材料和方法试剂甲醇（色谱级）乙腈（色谱级），苯并芘 ,NADP+,葡萄糖-6-磷酸，二喹啉甲酸，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶微粒体的制备微粒体来自于10只SD大鼠的肝脏，预先用苏丹I处理。微粒体蛋白质浓度通过二辛可宁酸蛋白质测定法测定，牛血清蛋白作对照。CYP同工酶的含量通过示差光谱测定。孵化体系：用于研究BaP代谢的孵化体系包含有100mM磷酸钠缓冲液（pH7.4），NADPH生成体系（1毫NADP+，10mL D-葡萄糖-6 - 磷酸，1U/mL的D-葡萄糖-6-磷酸脱氢酶）,0.5mg的微粒体蛋白质，50μM的BaP（溶于5μl甲醇），总体积为500微升。通过加入50μl的NADPH生成体系来启动反应的发生。孵育体系通过未加入酶体系或无NADPH生成体系或无的BaP来控制。孵化在敞开的试管中进行（37℃），20分钟后，取5μl 1mM的非那西丁乙醇溶液加入作为内标物。BaP的代谢物用乙酸乙酯（2×1毫升）萃取两次，并蒸发至干。将样品溶解在25μl的甲醇，通过HPLC分离。BaP代谢物的HPLC分析：安捷伦液相1200高效液相色谱仪配紫外可见检测器，色谱柱为diamonsil 4.6﹡150﹡5u色谱条件：所用的色谱条件如下表： 时间流动相A(乙腈)流动相B（水）流速00%100%0.6ml/min3530%70%4060%40%4580%20%50100%0%我们还对代谢产物进行了质谱

[align=center][b][font=宋体]高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱仪[/color][/url]检测环境空气中苯并[a]芘方法探究[/font][/b][/align][b] [/b][font=宋体]苯并芘（[/font]Benzopyrene[font=宋体]），属于稠环芳烃，其有多种同分异构体，最常见的是苯并[/font][a][font=宋体]芘（[/font]CAS[font=宋体]号为[/font]50-32-8[font=宋体]）及苯并[/font][e][font=宋体]芘（[/font]CAS[font=宋体]号：[/font]192-97-2[font=宋体]），苯并[/font][a][font=宋体]芘是致癌性最强的结构，可以诱发肺癌等，其在大气中的含量已经列入环境监测的常规项目。大气中的苯并芘主要来源于煤、石油、天然气的不充分燃烧，包括汽车尾气、橡胶工业生产等。苯并芘挥发性很小，附着性很强，在大气中主要吸附在大气颗粒物上，易溶于苯、二氯甲烷、氯仿等有机溶剂中，本文将以[/font][font=宋体]超细玻璃纤维滤膜采集环境空气颗粒物中的苯并[/font][a][font=宋体]芘，用二氯甲烷提取，提取液浓缩、净化后，采用高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]分离，荧光检测器检测，根据保留时间定性，外标法定量。[/font][b][color=black]1[/color][font=宋体][color=black]、主要仪器设备及型号[/color][/font][/b][font=宋体]高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱仪[/color][/url]，[/font][font='Calibri',sans-serif]LC-20AD[/font][font=宋体]空气/智能TSP综合采样器，[/font][font=宋体]崂应[/font]2050[font=宋体]型[/font][b] 2[font=宋体]、试剂和材料[/font][/b][font=宋体]乙腈，高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]纯[/font][font=宋体]二氯甲烷，高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]纯[/font][font=宋体]正己烷，高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]纯[/font][font=宋体]苯并[/font][font='Calibri',sans-serif][a][/font][font=宋体]芘标准溶液，200μg/ml[/font][font=宋体]硅胶固相萃取柱，500mg/6ml[/font][font=宋体]尼龙针式过滤器，13mm×0.45μm[/font][font=宋体] [/font][align=center][font=宋体] [/font][/align][b]3[font=宋体]、样品[/font][/b]3.1[font=宋体]样品采集[/font][font=宋体]采样时，用无锯齿镊子将滤膜放进洁净滤膜夹内，滤膜毛面朝向进气方向，将滤膜牢固压紧。将滤膜夹放入采样器中，[/font]100L/min[font=宋体]采集[/font]24h[font=宋体]，启动采样器开始采样，采样结束后，用镊子取出滤膜，滤膜尘面向内对折，避免尘面接触无尘边缘，放入保存盒中，滤膜避光密封保存，迅速送回实验室。[/font] 3.2[font=宋体]试样制备[/font]3.2.1[font=宋体]样品提取[/font]-[font=宋体]索氏提取[/font][font=宋体]将滤膜放入索氏提取器中，加入[/font]100 ml[font=宋体]二氯甲烷，回流提取至少[/font]40[font=宋体]个循环。提取完毕，冷却至室温，取出底瓶，冲洗提取杯接口，清洗液一并转移至底瓶。提取液用无水硫酸钠干燥，转移至浓缩瓶中，待浓缩、净化。[/font]3.2.2[font=宋体]样品浓缩[/font][font=宋体]二氯甲烷样品提取液在浓缩设备中于[/font]45[font=宋体]℃以下浓缩，将溶剂完全转换为正己烷，浓缩至[/font]1mL[font=宋体]，待净化。[/font]3.2.3[font=宋体]样品净化[/font][font=宋体]将硅胶固体萃取柱固定于净化装置，依次用[/font]4mL[font=宋体]二氯甲烷、[/font]10mL[font=宋体]正己烷冲洗柱床，待柱内充满正己烷后关闭流速控制阀，浸润[/font]5min[font=宋体]后打开控制阀，弃去流出液。当液面稍高于柱床时，将浓缩后的样品提取液转移至柱内，用[/font]1mL[font=宋体]二氯甲烷[/font]-[font=宋体]正己烷（[/font]3+7[font=宋体]）混合溶液洗涤样品瓶两次，将洗涤液一并转移至柱内，接收流出液，用[/font]8mL[font=宋体]二氯甲烷[/font]-[font=宋体]正己烷（[/font]3+7[font=宋体]）混合溶液洗脱，待洗脱液流过净化柱后关闭流速控制阀，浸润[/font]5min[font=宋体]，再打开控制阀，接收洗脱液至完全流出。[/font][font=宋体]洗脱液按[/font]3.2.2[font=宋体]浓缩并将溶剂转化为乙腈，定容至[/font]1mL,[font=宋体]转移至样品瓶中待测。[/font][font=宋体]取同批空白滤膜按照与试样制备相同的步骤制备实验室空白试样。[/font][b]4[font=宋体]、分析步骤[/font][/b][color=black]4.1[/color][font=宋体][color=black]仪器条件[/color][/font][font=宋体][color=black]柱箱温度：[/color][/font][color=black]35[/color][font=宋体][color=black]℃；进样量：[/color][/font][color=black]10[/color][font=宋体][color=black]μ[/color][/font][color=black]l[/color][font=宋体][color=black]，荧光检测器的激发波长[/color][/font][color=black]/[/color][font=宋体][color=black]发射波长：[/color][/font][color=black]305nm/430nm[/color][font=宋体][color=black]；流动相[/color][/font][color=black]A[/color][font=宋体][color=black]：乙腈，流动相[/color][/font][color=black]B[/color][font=宋体][color=black]：水。梯度洗脱程序如下：[/color][/font][img=,603,123]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2023/10/202310081947280518_3425_6195393_3.jpg!w690x140.jpg[/img][font=宋体]4.2[/font][font=宋体]标准溶液配置校准曲线 [/font][font=宋体]用微量注射器分别移取适量苯并[a]芘标准液，用乙腈稀释，制备标准系列，浓度分别为0.025μg/mL、0.050μg/mL、0.100μg/mL、0.500μg/mL、1.00μg/mL、2.00μg/mL。[/font][font=宋体]将标准系列溶液依次注入高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱仪[/color][/url]，按照仪器条件分离检测，得到各不同浓度的[/font][font=宋体]苯并[a]芘的色谱图。以浓度为横坐标，以其对应的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。[/font][font=宋体]4.3[/font][font=宋体]样品分析[/font][font=宋体]按照仪器条件，对样品进行仪器分析。记录色谱峰的保留时间和峰面积。当试样浓度超出标准曲线的线性范围，用乙腈稀释后，再进行测定。[/font][font=宋体]4.4[/font][font=宋体]空白试验[/font][font=宋体]按照与试样测定相同的仪器条件进行空白试样的测定。 [/font][font=宋体] [/font][b]5[font=宋体]、结果计算[/font][/b][font=宋体][color=black]空气中苯并[/color][/font][font=宋体][a][/font][font=宋体][color=black]芘的质量浓度[/color][/font][color=black]ρ[/color][font=宋体][color=black]按照下面公式进行计算。[/color][/font][align=center][color=black][img=,136,46]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2023/10/202310081947388452_2649_6195393_3.gif!w170x57.jpg[/img][/color][/align][color=black] [/color][font=宋体][color=black]式中：[/color][/font][color=black]ρ[/color][font=宋体][color=black]—空气中苯并[/color][/font][font=宋体][a][/font][font=宋体][color=black]芘的质量浓度，[/color][/font][color=black]ng/m[sup]3[/sup][/color][color=black] ρ[sub]i[/sub][/color][font=宋体][color=black]—由标准曲线得到的试样中苯并[/color][/font][font=宋体][a][/font][font=宋体][color=black]芘的质量浓度，μ[/color][/font][color=black]g/ml[/color][color=black] Vs[/color][font=宋体][color=black]—实际采样体积，[/color][/font][color=black]m[sup]3[/sup][/color][color=black] V[/color][font=宋体][color=black]—试样体积，[/color][/font][color=black]ml[/color][color=black] n[/color][font=宋体][color=black]—稀释倍数。[/color][/font][color=black] [/color][b]6[font=宋体]、样品检测结果[/font][/b][font=宋体]在[/font]A[font=宋体]点位连续多日采集样品后，按照上述步骤前处理并上机分析，检测结果如下：[/font] [table=99%][tr][td] [align=center] [/align] [/td][td] [align=center]DAY1[/align] [/td][td] [align=center]DAY2[/align] [/td][td] [align=center]DAY3[/align] [/td][td] [align=center]DAY4[/align] [/td][td] [align=center]DAY5[/align] [/td][td] [align=center]DAY6[/align] [/td][td] [align=center]DAY7[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center][font=宋体]检测结果，[/font][color=black]ng/m[sup]3[/sup][/color][/align] [/td][td] [align=center]0.5[/align] [/td][td] [align=center]1.7[/align] [/td][td] [align=center]1.9[/align] [/td][td] [align=center]0.3[/align] [/td][td] [align=center]0.2[/align] [/td][td] [align=center]1.2[/align] [/td][td] [align=center]3.3[/align] [/td][/tr][/table][font=宋体]结果分析：该点位位于某橡胶制品企业东侧约[/font]100[font=宋体]米，除路过的机动车外周边无其他污染源，该企业主要工艺为炼胶、硫化工艺。[/font]7[font=宋体]天检测结果最大值为[/font]3.3[color=black]ng/m[sup]3[/sup][/color][font=宋体]，最低值为[/font]0.2[color=black]ng/m[sup]3[/sup][/color][font=宋体]，结果时高时低，可能与风向及实际生产情况有关，其最大值已经超过了[/font]GB3095-2012[font=宋体]《环境空[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/bp][color=#3333ff]气质[/color][/url]量标准》表[/font]2[font=宋体]中苯并[/font][a][font=宋体]芘的浓度限值。[/font][align=left] [/align][align=left] [/align]

前言：苯并芘又称苯并[α]芘，英文缩写BaP，是一种常见的高活性间接致癌物和突变原。苯并[α]芘释放到大气中以后，总是和大气中各种类型微粒所形成的气溶胶结合在一起，在8微米以下的可吸入尘粒中，吸入肺部的比率较高，经呼吸道吸入肺部，进入肺泡甚至血液，导致肺癌和心血管疾病。加压流体萃取技术是近年来发展起来的一种在高温、高压条件下快速处理固体或半固体样品的方法，与常用的索氏提取、超声提取、微波萃取技术等方法相比，具有节省溶剂、快速、回收率高、健康环保、自动化程度高等明显优势。本实验参考方法HJ 956-2018，使用全自动高效快速溶剂萃取系统提取吸附膜中的苯并[α]芘，全自动固相萃取系统净化，平行浓缩系统浓缩后用高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱仪[/color][/url]进行检测的一整套方法。实验方法简便、回收率较高且平行性良好，适用于环境空气中苯并[α]芘的检测。关键词[size=18px]：[/size]环境空气，苯并[α]芘，HJ 956-2018实验部分1仪器与试剂1.1 Flex-HPSE全自动高效快速溶剂萃取系统；1.2 SPE1000全自动固相萃取系统；1.3 M64高通量平行浓缩系统；1.4 LC600高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱仪[/color][/url]，配有荧光检测器；1.5 苯并[α]芘标准储备液（1000μg / mL，溶剂为乙腈）；1.6 苯并[α]芘标准中间液 （30μg / mL，溶剂为乙腈）；1.7 苯并[α]芘标准使用液（3μg / mL，溶剂为乙腈）；1.8 二氯甲烷（色谱纯）；1.9 正己烷（色谱纯）；1.10 乙腈（色谱纯）；1.11 二氯己烷-正己烷混合溶液：3+7；1.12 硅胶固相萃取柱（1g/6mL，LabTech）；1.13 超细石英纤维滤膜2环境空气样品处理2.1 提取将采样后的滤膜放入快速溶剂萃取罐中，设定萃取温度100℃，压力1500psi（10.34Mpa），静态萃取5min，萃取溶剂为二氯甲烷（1.8），淋洗体积为60%池体积，氮气吹扫60s，循环次数2次，萃取液收集在60mL收集瓶内，具体方法如图1所示。[align=center][img]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2022/11/202211091823530837_9961_3191395_3.png[/img][/align][align=center]图1 加速溶剂萃取方法[/align]2.2 浓缩将收集管直接置于M64中，浓缩温度40℃，开启氮吹针定时跟随功能。浓缩过程中使用正己烷淋洗收集管，最后置换溶剂为正己烷，样品体积在1mL左右。2.3 净化净化过程采用硅胶固相萃取柱净化，具体方法如下：按照图2方法进行净化实验，其中洗脱溶剂为二氯己烷-正己烷混合溶液（1.11），收集液用M64浓缩至近干，用乙腈定容至1mL，待测。[img]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2022/11/202211091823537553_6045_3191395_3.png[/img][align=center]图2 硅胶固相萃取柱净化方法[/align]2.4 空白加标处理按2.1方法装填空白滤膜过程中，加0.1mL标准使用液（1.7）至萃取罐中，然后按照2.1~2.3方法进行实验，最后用乙腈定容至1mL，以此来测定空白加标回收率。2.5 仪器参考条件色谱柱：C18 4.6mm*250mm；柱箱温度：30℃；柱流速：1.0mL/min；进样量：20μL；荧光检测器的激发波长/发射波长：305nm/430nm；流动相：乙腈水（8+2）。3[size=12px]、[/size]实验结果3.1苯并[α]芘标准色谱图[align=center][img]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2022/11/202211091823536893_8038_3191395_3.png[/img]图3 500ng/mL苯并[α]芘标准色谱图[/align]3.2 空白加标色谱图[img]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2022/11/202211091823537822_1370_3191395_3.png[/img][align=center]图4 300ng/mL空白加标色谱图[/align]3.3 标准曲线的建立分别移取适量苯并[α]芘标准使用液（1.7），用乙腈（1.10）稀释，制备标准系列，质量浓度分别为0.025μg / mL、0.050μg / mL、0.100μg / mL、0.500μg / mL、1.00μg / mL、2.00μg / mL。将标准系列溶液依次注入高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱仪[/color][/url]，按照仪器参考条件（2.5）检测，得到不同浓度的苯并[α]芘的色谱图。以浓度为横坐标，以其对应的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线如下图5所示。[align=center][img]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2022/11/202211091823538917_1927_3191395_3.png[/img][/align][align=center]图5 苯并[α]芘标准曲线[/align]3.4 空白加标回收率[align=center]表1空白加标回收率[/align][table][tr][td=1,2][align=center]名称[/align][/td][td=6,1][align=center]回收率（%）[/align][/td][td][align=center]平均值[/align][align=center]（%）[/align][/td][td][align=center]RSD[/align][align=center](%)[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]1[/align][/td][td][align=center]2[/align][/td][td][align=center]3[/align][/td][td][align=center]4[/align][/td][td][align=center]5[/align][/td][td][align=center]6[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]苯并[α]芘[/align][/td][td][align=center][color=black]113.5[/color][/align][/td][td][align=center][color=black]99.7[/color][/align][/td][td][align=center][color=black]93.0[/color][/align][/td][td][align=center][color=black]116.6[/color][/align][/td][td][align=center][color=black]109.5[/color][/align][/td][td][align=center][color=black]94.5[/color][/align][/td][td][align=center][color=black]104.5[/color][/align][/td][td][align=center][color=black]9.6[/color][/align][/td][/tr][/table]4[size=12px]、[/size]结论由表1可知，高效溶剂萃取-固相萃取-高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]法测定环境空气中的苯并[α]芘，加标回收率为93.0%~116.6%，RSD为9.6%。本方法测定的加标量为0.3μg，样品无检出。60mL收集管同时适用于这三种仪器，实验过程中不需要进行液体的转移，能够有效的减少转移过程中造成的损失。

[color=#444444]以前用gb/t15439-1995方法的紫外光检测器测定空气中苯并芘含量，有两个峰，后一个是苯并芘，现在用荧光检测器测定苯并芘，两个峰合到一起了，改变了流动相比例，和流速都没有什么效果，不是说荧光检测器分辨率高吗，怎么反而变差了呢？[/color][img=,absmiddle]http://muchongimg.xmcimg.com/data/emuch_bbs_images/smilies/rolleyes.gif[/img][img=,675,900]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/05/201905141613157742_3429_1739275_3.jpg!w675x900.jpg[/img]