质谱计算蛋白质分子量

毛细管电泳法能够根据蛋白质的分子量快速分离蛋白质并在含有蛋白质的样品中进行蛋白质定量。该法是基于SDS蛋白复合物在一个狭窄的熔融石英毛细管填充低粘度凝胶，在施加电场的作用下进行差分迁移，对其在220 nm波长处的吸光度进行检测。由于低粘度凝胶的存在，SDS蛋白复合物仅根据它们的分子量大小进行分离，因此它也能够确定未知蛋白质的分子量。与SDS-PAGE分离蛋白质相比，毛细管电泳具有几个重要的优点：1.完全自动化；2.直接蛋白质定量；3.无需染色；4.低分析成本；5.分析时间短。

应用体积紧凑小巧的台式MALDI-TOF分析样品，不仅得到了蛋白质的精确分子量，还观察到了二聚体、三聚体等蛋白质多聚体的存在和分布。无需样品前处理、操作简便、分析通量高、速度快、结果准确、仪器维护方便、软件满足21 CFR Part11合规性，是蛋白质类药物分子量分析的有力工具。

生物制药行业已将 LC/MS 广泛应用于治疗性蛋白质的分子量确定。这种方法快速、准确，可实现相对定量。准确的质量测量有助于确定预期的翻译后修饰 (PTM) 是否表达为正确的蛋白质序列，其还提供了同一样品中不同蛋白质或 PTM 的相对丰度。高分离度和高灵敏度质谱仪有利于这一分析的进行。本应用简报介绍了一种使用 Agilent 6550 Q-TOF 质谱仪进行的完整蛋白质分析。

MALDI-8020作为台式基质辅助激光解析电离飞行时间质谱，体积紧凑、分析速度快、仪器维护方便，性能卓越，是蛋白质分子量分析的有力工具。

质谱是定量蛋白组学的主要工具。 近年来随着定量蛋白质组学研究的深入,传统质谱定量技术面临着复杂基质干扰、分析通量限制等诸多问题。 而最近一系列质谱新技术的发展,包括同步母离子选择(SPS)、质量亏损标记、平行反应监测(PRM)、多重累积(MSX)和多种全新数据非依赖性采集(DIA)等,为解决目前蛋白质组学在相对定量和绝对定量分析方面的局限提供了有效途径。 本文对定量蛋白质组学目前遇到的瓶颈问题进行了分析,总结了质谱定量采集技术的最新进展,并评述了这些新技术的特点以及在定量蛋白质组学应用中的优势。

本文应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪（MALDI-TOF）对蛋白质类药物的分子量进行检测，在m/z 10000-100000范围内，除了样品的双电荷离子峰、单电荷离子峰外，成功检测到该蛋白质药物的二聚体、三聚体、四聚体离子峰。结果表明MALDI-TOF适用于蛋白质类药物及其聚集体分子量表征，分析过程具有无需样品前处理、分析速度快、分析成本低的特点。

SAXS是一种快速、没有破坏性的测试溶液中蛋白质结构的方法。在溶液中蛋白质处于其天然态。从溶液中蛋白质颗粒的质量可以快速判断其聚集状态，同时它作为质量控制参数也可以认定溶液中的蛋白质是否处于我们不欢迎的变性或聚集状态。而且， SAXS能够确定蛋白质在其自然环境中的低聚状态。即使我们可以从晶体学数据中得到蛋白质的高分辨结构，但我们仍无法获知蛋白质在其自然状态下是单体还是低聚体。

采用立陶宛Ekspla公司的和频光谱测量系统（SFG），结合计算模拟分析技术，对固定化蛋白质分子的取向效应进行了实验测量和理论模拟研究

尽管蛋白质生物制品总体来说是相对稳定的分子，但是在生产、制剂和储存过程中，还是会发生一些化学修饰和降解反应。许多蛋白质在纯化过程中可能发生水解断裂，而断裂形成的片段污染物可能会导致患者免疫反应的不良后果。由于存在化学修饰和降解反应，因此需要可靠而且灵敏的方法来评价研发和生产过程中蛋白质的纯度和结构完整性。 完整蛋白质、完整亚基或结构域的精确质量测定对于蛋白质序列组成的快速确认和翻译后修饰、降解和样品处理引起的分子变异的鉴定非常有帮助。电泳、色谱和质谱 (MS) 技术是完整蛋白质及其降解物分子量测定的最常用技术。其中一种最常用的分析是体积排阻色谱 (SEC)，它用于测定蛋白质是否为单体结构，并且在生产和制剂过程中是否始终保持这一结构。

本文展示了应用MALDImini-1 紧凑型基质辅助激光解吸电离数字离子阱质谱（MALDI-DIT）对低浓度牛血清白蛋白（BSA）（上样量100 fmol）进行分子量检测的案例，表明MALDImini-1检测蛋白质分子量的灵敏度较高，结果准确，可以满足m/z 650-70000以内蛋白质分子量检测的要求。

随着“一小时酵母蛋白质组”的实现, 短梯度下实现蛋白质组深度覆盖成为可能.本文利用全新 Q-OT-qIT 三合一质谱系统进行“一小时蛋白质组”分析与优化. 50 min 有效梯度, 单次实验分别从1 μ g和50 ngHeLa全蛋白中鉴定到20860和14100条肽段, 对应到3865和 2877 个非冗余蛋白, 而目前的文献报道至少需要 2~3 h. 同时, 本文考察了 Q-OT-qIT 碎裂模式、检测方法、最大注入时间和自动增益控制等参数对蛋白质组快速分析的影响, 证明了不同采集方法间的互补性, 阐述了不同扫描参数对鉴定结果的影响. 此外, 还讨论了Q-OT-qIT 的并列运行原理和扫描组合模式, 为不同实验目的和样本类型的蛋白质组快速分析奠定了基础.

MALDI-8020作为台式基质辅助激光解析电离飞行时间质谱，体积紧凑、分析速度快、仪器维护方便，性能卓越，是蛋白质分子量分析的有力工具。

采用TriSep ® -3000高效微流电动液相色谱系统，配备ESI-MS检测器，通微 EP-100-20/30-3- C18色谱柱，通过在线富集，可以实现对低浓度蛋白质的检测。蛋白质标准品的检出限可提高20-100倍，此方法已成功应用于浓度为20 mg / mL的蛋白质的分析。结果表明我们提出的方法可能在蛋白质组学研究中发挥重要作用。

蛋白质是一类含氮的生物高分子,分子量大,结构复杂,是构成一切组织和细胞结构必不可少的成分 它是人类生命活动中最重要的物质基础,蛋白质的基本组成单位是氨基酸,组成蛋白质的氨基酸有20 余种,体内只能合成一部分,其余则由食物蛋白质供给。准确测定蛋白质的含量是评价一种食品质量的重要手段,我国现行的检测蛋白质的国家标准检验方法为GB/ T 5009. 5 - 2003 ,样品需要消化等前处理, 污染环境, 步骤繁琐, 耗时长, 而使用Primacs SN总氮/ 蛋白质分析仪不需对样品进行前处理,直接称取样品后放入自动进样器进行分析,5～6 min即可得到检测结果。

赛默飞为蛋白质组学研究提供包括创新的化学试剂、高效的分离产品、领先的色谱质谱技术、以及蛋白质组学数据处理软件产品的最先进和完整的解决方案，帮助科学家们大幅提高研究工作的效率，更有信心地面对蛋白质组学研究的挑战。

为了确定蛋白质样品的纯度和均一性，提出了两种基于毛细管的方法-毛细管凝胶电泳（CGE）和毛细管等电聚焦（CIEF）。前者在分子量不同的蛋白质被分解时应用。后者适用于几乎相同的分子量，但不同的净电荷的蛋白质异构体。

2008年，“三鹿”等企业将三聚氰胺加入牛奶中以提高蛋白含量的恶性事件举世震惊！对社会产生了巨大的负面影响，严重打击了人民群众对乳品行业的信任，在短时间内形成全国大面积乳品滞销，致使我国乳品行业发展受到空前摧残。三聚氰胺的添加可使牛奶及奶粉中的蛋白质含量提高，造成蛋白质“虚高”现象。　　牛奶中蛋白质含量检测的国标方法是凯式定氮法，该法不仅适用于乳及乳制品中蛋白质含量的测定，而且适用于其他样品的测定。但操作步骤（消化、蒸馏、滴定）较为复杂，消解过程中需要大量腐蚀性样品浓硫酸，所需时间较长（约2小时），消解温度高（300~500℃），且凯式定氮法测定样品时会将样品中的非蛋白氮也当做蛋白质计算，正是由于方法的这个弊端，才给了不法分子可乘之机，出现了“三聚氰胺”事件。　　对于乳制品中蛋白质的检测，目前常用的方法除了凯式定氮法外，还有杜马斯燃烧法和红外光谱法：杜马斯燃烧法与凯式定氮相比，试剂用量少、省时，可以应用于测定动物营养品中氮含量的测定，但不足之处在于样品称量要求比较苛刻，一般称样量在200 mg左右，对于液体样品的称量难度较大，同样无法区分样品中蛋白质氮和非蛋白质氮；红外光谱法无需对样品进行前处理，具有检测速度快、无损、不消耗化学试剂以及节省人、物力等特点。但目前我国在近红外光谱技术的总体研究水平与国外相比的差距较大，基础研究薄弱，除部分领域外，测量所用的标准仪器、软件基本上都需要进口，检测成本较高，很难推广使用。针对以上情况，我们研制开发出了用于乳及乳制品中真蛋白快速检测的仪器：　　GDYN-200S蛋白质快速检测仪：实现了乳及乳制品中真蛋白的快速检测，检测结果不受非蛋白氮的干扰，且不需要高温、强酸消解，操作简单，污染小，检测成本低，且检测速度快，单个从样品处理到给出检测结果，牛奶样品小于5分钟，奶粉样品小于10分钟。

本文展示了应用MALDImini-1 紧凑型基质辅助激光解吸电离数字离子阱质谱（MALDI-DIT）质谱仪通过肽指纹图谱（PMF）和二级质谱搜库成功鉴定牛血清白蛋白（BSA）的案例，表明MALDImini-1可以满足蛋白质种类鉴定分析的要求

通过聚乙二醇化能够改变治疗性蛋白质的物理化学和生物性质（如提高溶解度、降低免疫原性、延长半衰期以及防止蛋白酶破坏），从而显著提高其价值。体积排阻色谱法 (SEC) 是检测分子量大于聚乙二醇化蛋白质杂质的首选方法。由于聚乙二醇介导的与硅胶固定相的相互作用会导致回收率降低、峰形变差以及过度拖尾，因此聚乙二醇化蛋白质的 SEC 分析面临着很大挑战。本应用简报描述了一种用于检测聚乙二醇粒细胞集落刺激因子 (PEG GCSF) 的简单而灵敏的 SEC 方法。采用 AdvanceBio SEC, 130Å , 7.8 × 300 mm, 2.7 μ m 色谱柱在水相流动相下进行 PEG GCSF 的分离和定量分析。线性曲线在 12.5-2000 μ g/mL 的范围内具有优异的相关系数，表明该方法适用于定量分析。该方法具有出色的保留时间和峰面积精度，证明了该方法的适用性。此外，AdvanceBio SEC 还可对强制应激研究中得到的聚集体进行分离与定量分析。

青藏高原中华羊茅不同部位的营养价值及分子结构特性研究1.2 常规营养成分测定和CNCPS指标测定本试验采用常规化学方法,并结合CNCPS6.5,对中华羊茅各部分营养成分指标进行测定。参照 AOAC(2005)[14]的方法对样品的干物质(dry matter,DM)、粗脂肪(ether extract,EE，使用格哈特Sxotherm SOX416)和粗灰分(Ash)含量进行测定 参照 Van Soest 等[15]的方法使用全自动纤维分析仪(Fibretherm FT12,德国)测定样品中的中性洗涤纤维(neutral detergent fiber,NDF)、酸性洗涤纤维(acid detergent fiber,ADF)和酸性洗涤木质素(acid detergent lignin,ADL)含量 参照 Licitra 等[16]的方法将检测完NDF和ADF的残余物,使用杜马斯定氮仪(Dumatherm,Gerhardt,德国)测定氮含量,计算相应的酸性洗涤不溶粗蛋白质(acid detergent insoluble crude protein,ADICP)非蛋白氮(non protein nitrogen,NPN)、中性洗涤不溶粗蛋白质(neutral detergent insoluble crude protein,NDICP)和可溶性粗蛋白质(soluble crude protein,SCP)含量 使用淀粉酶总量检测试剂盒(K-TSTA,Megazyme,爱尔兰)测定淀粉含量[17]。最后根据测定值及CNCPS公式[8]计算各组分的含量。

目前，在蛋白质的分析中，使用质谱仪及利用基因组数据库搜索引擎进行蛋白质鉴定的蛋白质组分析是主流的分析技术。体内表达的蛋白质经过翻译后修饰而具有各种功能，并且前体和成熟蛋白质之间可能具有不同的理论质量数。在不使用数据库的情况下，使用质谱仪鉴定氨基酸序列非常复杂和困难。另一方面，作为常规方法，使用埃德曼降解法的蛋白质测序仪所得到的氨基酸序列结果的可靠性高，即使在数据库不充分的情况下，也可以轻松地鉴定氨基酸序列。本次为您介绍使用蛋白质测序仪PPSQ™ -50A系统（等度系统和梯度系统）对含有半胱氨酸和胱氨酸的样本进行氨基酸序列分析的实例。

加压毛细管电色谱（pCEC）是综合了高效液相色谱（HPLC）与毛细管电泳（CE）的优势而发展起来的一种高效微型分离技术，在继承了液相色谱的高选择性以及毛细管电泳的高效率特性的基础上，克服了毛细管电泳难以分离中性物质的缺陷，同时解决了微小颗粒固定相由于输液泵的耐压能力在常规HPLC中的应用限制。 本文是加压毛细管电色谱－质谱联用技术在多肽和蛋白质领域的应用技术文章。

PEG修饰的蛋白类（亦称蛋白的PEG化）包括PEG与蛋白质与多肽类药物的物理结合物和化学修饰物，可大大改善蛋白类药物的一些性质。此类药物PEG化后的改变包括：增加溶解度；免疫原性降低或消除；被水解酶降解的可能性减小；被肾脏清除的速率降低；药物体内分布和动力学参数的改变；稳定性的提高；增加蛋白药物的治疗指数，扩大临床应用等。本应用是采用东曹HLC-8320GPC高效凝胶渗透色谱和LenS3光散射检测器，配合使用TSKgel G3000SWXL色谱柱可以对PEG化蛋白样品的绝对分子量进行测定，根据两个PEG化蛋白组分分子量计算结果，推测PEG重均分子量在2400以内。

血液是最重要的临床检验样品来源。精准医学研究中的大队列生物标志物研究对于分析方法提出了高通量和高稳定性的要求，利用Orbitrap Fusion Lumos质谱极佳的灵敏度和稳定性，我们发展了一种快速、稳定的高通量血浆蛋白质组研究策略。简化的前处理步骤通量高、稳定性好，仅用1小时梯度即可定量700种蛋白，2.5小时梯度可定量超过1000种蛋白。基于高通量的深度血浆蛋白质组解析，我们可从大规模临床队列中发现潜在的生物标志物，助力精准医学研究。

糖蛋白在细胞内部，细胞膜和细胞外均有发现，大部分蛋白质是糖蛋白。对糖蛋白的检测和分析发现，糖蛋白中糖组分的结构和功能具有多样性。糖蛋白中的糖通常是不同种类的，而且是由一些可控数量的单糖组成。糖基化的多样性与细胞周期，细胞分化和发展的状态有关。

各种裂解液中含有的去垢剂均会影响胰蛋白酶活性，并且对质谱分析产生很大影响，因此均需要在蛋白质样品酶解前除去。不同的去垢剂也均有不同的去除方法，包括常用的超滤和丙酮沉淀等。在进行各种各样纷繁复杂的蛋白质组学实验时，我们需要根据我们具体的实验目的来选择合适的裂解液和裂解方法，才能保证我们后续实验顺利进行，并且获得可信的结果。

由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸收高峰在280nm波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值（OD280）与其含量呈正比关系，可用作定量测定。利用紫外吸收法测定蛋白质含量的优点是民迅速、简便、不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。因此，在蛋白质和酶的生化制备中（特别是在柱层析分离中）得到广泛应用。此法的缺点是：（1）对于测定那些与标准蛋白质酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定的误差；（2）若样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外线的物质，会出现较大的干扰。根据蛋白质和核酸的吸收高峰不同，并利用这一性质，通过计算可以适当校正核酸的干扰作用。

白质是复杂的含氮有机化合物,分子量很大,大部分高达数万至数百万,分子的长链从数纳米至100nm,它们由20种氨基酸通过酰胺键以一定的方式结合,并具有一定的空间结构,所含的主要化学元素为C、H、O、N,在某些蛋白质中还含有P、Cu、Fe、I等元素,但氮的相对丰度基本稳定,是区别于其它有机化合物的主要标志。不同蛋白质的氨基酸构成比例及方式不同,所以各种蛋白质其含氮量也不同。一般蛋白质含氮量平均为16%,即1份氮素相当于6.25份蛋白质,此即蛋白质系数。我们利用蛋白质的这一特性,主要采用微量凯氏定氮法测定松杉灵芝子实体水溶性多糖中蛋白质含量。

蛋白质测定仪是一种用于快速测定奶粉中蛋白质含量的仪器。在奶粉生产过程中，控制蛋白质含量是非常重要的，因为蛋白质是婴儿生长发育所必需的营养素。通过使用蛋白质测定仪，可以及时了解奶粉中蛋白质的含量，确保产品质量和婴儿的健康。

Q Exactive HF， DDA，DIA，293T，定量蛋白质组学数据非依赖性的扫描模式（data-independent acquisition， DIA）是近几年来发展的一种新的质谱数据采集方式(1)。DIA 扫描模式中，超高分辨质谱对特定质量范围内的所有母离子进行碎裂，采集所有母离子的碎片离子，并快速地依次扫描相邻的母离子窗口内的所有碎片离子。DIA 的数据中包含了所有碎片离子的保留时间和强度信息。用非常小的质量偏差窗口（如 10 ppm）目标性地抽提同一肽段的多个子离子，计算子离子的强度，就能对该肽段进行鉴定和定量。 DIA 定量相比传统的基于母离子强度的 DDA 定量有选择性好，定量准确等优点，所以 DIA 成为定量蛋白组学新的热门发展方向 (2)。Q Exactive HF 是赛默飞世尔科技在 2014 年的 ASMS 上推出的全新静电场轨道阱超高分辨质谱仪(3, 4)。Q Exactive HF 采用了分段式四极杆技术（Advanced Quadrupole Technology，AQT）使离子传输效率至少提高了 2 倍；超高场 Orbitrap 技术，提高了 Orbitrap 扫描速度，在 15000 分辨率时，二级谱图的扫描速度是 18 Hz。这两项技术提高了 Q Exactive HF 进行 DDA、DIA 数据的采集能力。本文用 Q Exactive HF 质谱，170 min 色谱梯度对 293T 细胞蛋白质组进行 DIA 定量分析，考察 Q Exacive HF DIA 定量的能力。