核酸蛋白检测仪是层析分析的主要装置,核酸蛋白检测仪配上层析柱、恒流泵、部分收集器、层析谱分析系统(根据需要选配)和电脑打印设备即构成一套完整的核酸蛋白检测仪分离层析系统。它是当今从事生命科学研究、药物测定、化工、食品科学及医学研究等行业的现代分析实验仪器。核酸蛋白检测仪分析系统广泛用于工业、农业、科研和大专院校的科学研究和教学实验。其原理是根据物质(样品)对紫外光有明显吸收的特征,实现对样品成份含量比对分析,以便进行样品蛋白、核酸物质识别检测和含量测定。在生化分析、环保科学、食品研究、毒理研究、新药开发等领域中对核酸、蛋白检测、纯化和提取提供了一种独特的分析手段。
马上要做一个层析系统(做蛋白纯化的)的验证,不知从何处下手。公司内没人知道如何去做,要用在GMP认证中。哪位大侠有参考文件?能否参考的?
[font=宋体]蛋白纯化介质主要应用于研究目的蛋白的结构、功用以及相互作用的和过程中。比如:在蛋白纯化过程中,由于[url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-by-ac][b]亲和层析法[/b][/url]的选择性和结合力较强,分辨率也高。所以,亲和层析法是一种常用的蛋白、抗体纯化方法,天地人和生物多种简单易用的亲和纯化介质,适用于批量或利用重力进行纯化,可以高效、便捷、可靠地从品中分离蛋白和抗体,为下游应用提供有力保证。[/font][font=宋体][b]亲和层析法的原理:[/b][/font][font=宋体][font=宋体]亲和层析是应用生物高分子与配基可逆结合的原理,将配基通过共价键牢固结合于载体上而制得的层析系统。这种可逆结合的作用主要是靠生物高分子对它的配基的空间结构的识别。常用的生物亲和关系有酶[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]底物、底物类似物、抑制剂、激活剂、辅因子,抗体[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]抗原,激素[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]受体蛋白、载体蛋白,外源凝集素[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]多糖、糖蛋白、细胞表面受体,核酸[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]互补核苷酸序列、组蛋白、核酸结合蛋白等,具有高效、简单、快速的优点,是当前最为理想的分离纯化蛋白的方法。[/font][/font][b][font=宋体][font=宋体]亲和层析的操作步骤[/font][font=Calibri]:[/font][/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]在亲和层析中,蛋白在影响蛋白[/font][font=Calibri]([/font][font=宋体]或标签[/font][font=Calibri])[/font][font=宋体]与其配体之间结合的条件下被加载到柱子上。在不破坏特定相互作用但能破坏污染蛋白与固定相之间任何非特异性相互作用的条件下洗涤结合的蛋白。然后用含有竞争性分子的缓冲液或破坏所有蛋白[/font][font=Calibri]/[/font][font=宋体]蛋白相互作用的条件洗脱结合的蛋白。竞争分子与配体结合,取代目标蛋白,这种竞争分子通常通过另一种色谱流程或透析法从目标蛋白中去除。[/font][/font][font=宋体] [/font][table][tr][td][b][font=微软雅黑][color=#232323]亲和层析配体和洗脱条件[/color][/font][/b][/td][td][font=微软雅黑] [/font][/td][td][font=微软雅黑] [/font][/td][/tr][tr][td][b][font=微软雅黑][color=#232323]需纯化的蛋白[/color][/font][/b][/td][td][b][font=微软雅黑][color=#232323]配体[/color][/font][/b][/td][td][b][font=微软雅黑][color=#232323]洗脱条件[/color][/font][/b][/td][/tr][tr][td][font=微软雅黑][color=#232323]抗体(抗原特异性)[/color][/font][/td][td][font=微软雅黑][color=#232323]抗原肽[/color][/font][/td][td][font=微软雅黑][color=#232323]游离肽[/color][/font][/td][/tr][tr][td][font=微软雅黑][color=#232323]多聚组氨酸标签蛋白[/color][/font][/td][td][font=微软雅黑][color=#232323]Ni2+或Co2+[/color][/font][/td][td][font=微软雅黑][color=#232323]咪唑或游离组氨酸[/color][/font][/td][/tr][tr][td][font=微软雅黑][color=#232323]FLAG标签蛋白[/color][/font][/td][td][font=微软雅黑][color=#232323]FLAG特异性抗体[/color][/font][/td][td][font=微软雅黑][color=#232323]FLAG肽或低pH值[/color][/font][/td][/tr][tr][td][font=微软雅黑][color=#232323]GST标签蛋白[/color][/font][/td][td][font=微软雅黑][color=#232323]还原型谷胱甘肽[/color][/font][/td][td][font=微软雅黑][color=#232323]游离谷胱甘肽[/color][/font][/td][/tr][tr][td][font=微软雅黑][color=#232323]Myc标签蛋白[/color][/font][/td][td][font=微软雅黑][color=#232323]Myc特异性抗体[/color][/font][/td][td][font=微软雅黑][color=#232323][font=微软雅黑]低[/font][font=微软雅黑]pH[/font][/color][/font][/td][/tr][tr][td][font=微软雅黑][color=#232323]抗体(类特异性)[/color][/font][/td][td][font=微软雅黑][color=#232323][font=微软雅黑]蛋白[/font][font=微软雅黑]A、G和L或精蛋白[/font][/color][/font][/td][td][font=微软雅黑][color=#232323]pH极端值[/color][/font][/td][/tr][tr][td][font=微软雅黑][color=#232323]DNA结合蛋白[/color][/font][/td][td][font=微软雅黑][color=#232323]肝素[/color][/font][/td][td][font=微软雅黑][color=#232323]高离子强度[/color][/font][/td][/tr][/table][font=宋体][font=宋体]更多详情可以关注:[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-by-ac[/font][/font]
[font=宋体][font=宋体]亲和层析是应用生物高分子与配基可逆结合的原理,将配基通过共价键牢固结合于载体上而制得的层析系统。这种可逆结合的作用主要是靠生物高分子对它的配基的空间结构的识别。常用的生物亲和关系有酶[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]底物、底物类似物、抑制剂、激活剂、辅因子,抗体[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]抗原,激素[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]受体蛋白、载体蛋白,外源凝集素[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]多糖、糖蛋白、细胞表面受体,核酸[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]互补核苷酸序列、组蛋白、核酸结合蛋白等,具有高效、简单、快速的优点,是当前最为理想的分离纯化蛋白的方法。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]亲和层析纯化步骤:[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1[/font][font=宋体]、捕获阶段[/font][/font][font=宋体]在样品捕获阶段,通过将速度和容量进行优化组合,使样品中的目标产物被有效的分离、浓缩和稳定化处理。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]捕获阶段一般选择亲和层析,离子交换层析或者疏水层析,通过吸附作用使样品和杂质实现分离。如果样品带有标签,第一步可以选择标签蛋白亲和层析;如果样品不带有标签,可以考虑使用离子交换[/font][font=Calibri]/[/font][font=宋体]疏水层析。由于捕获阶段一般样品量较大,杂质较多,所以捕获阶段分辨率不是特别主要考虑的因素,可以主要考虑增加上样量和速度。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]、中度纯化阶段[/font][/font][font=宋体]在中度纯化阶段,应将注意力集中于将目标样品和大多数大体积的杂质分开。在中度纯化阶段,速度不是最重要的因素,因为经过捕获阶段样品体积会缩减。中度纯化阶段一般建议使用离子交换层析或者疏水层析进一步提高样品的纯度。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]3[/font][font=宋体]、精细纯化阶段[/font][/font][font=宋体]在精细纯化阶段,关注的重点就是如何达到高分辨率,从而完成最终的纯化。在此前的步骤中已经去除了大部分的污染物和杂质。如果需要达到较高的分辨率,可能会在此步骤造成一些回收率的损失。精细纯化阶段一般建议使用高分辨率的分子筛或者高分辨率的离子交换层析柱。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]亲和层析纯化优缺点:[/b][/font][font=宋体][font=Calibri]1. [/font][font=宋体]亲和层析法是分离蛋白质的一种极为有效的方法,它经常只需经过一步处理即可使某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出来,而且纯度很高。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]2. [/font][font=宋体]是最有效的生物活性物质纯化方法,它对生物分子选择性的吸附和分离,可以取得很高的纯化倍数。此外蛋白在纯化过程中得到浓缩,结合到亲和配基后,性质更加 稳定,其结果提高了活性回收率。此外它可以减少纯化步骤,缩短纯化时间,对不稳定蛋白的纯化十分有利。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]3. [/font][font=宋体]除特异性的吸附外,仍然会因分子的错误认别和分子间非选择性的作用力而吸附一些杂蛋白质,另洗脱过程中的配体不可避免的脱落进入分离体系。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]4. [/font][font=宋体]载体较昂贵,机械强度低,配基制备困难,有的配基本身要经过分离纯化,配基与载体耦联条件激烈等。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]更多详情可以参看义翘神州[url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-by-ac][b]亲和层析纯化蛋白[/b][/url]:[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-by-ac[/font][/font]
国产的中压层析系统哪里有做?
ZHD型紫外蛋白核酸检测仪使用说明 一、系统简介 蛋白核酸检测仪是层析分析的主要装置,配上层析柱、恒流泵、部分收集器(根据需要选配)和电脑打印设备即构成一套完整的液相色谱分离系统。它是当今从事生命科学研究、药物测定、化工、食品科学及医学研究等行业的现代分析实验仪器。广泛用于工业、农业、科研和大专院校的科学研究和教学实验。其原理是根据物质(样品)对紫外光有明显吸收的特征,实现对样品成份含量比对分析,以便进行样品蛋白、核酸物质识别检测和含量测定。然而,目前国内生产的蛋白检测仪虽然种类繁多,但均采用记录仪描谱且预热时间较长。 ZHD型紫外蛋白核酸检测仪的研制成功,为科研和实验人员利用电脑系统实现核酸蛋白检测和分析提供了一种先进的手段,其特点是系统稳定、操作简便、电脑显示谱图、数据分析和打印谱图。 二、系统特点 本系列检测仪有别于其他检测仪,主要有以下特点: 1、预热时间短,一般做实验只要预热10分钟左右。 2、稳定性高,预热后每小时漂移一般小于0.001。 3、操作简洁,开机后仪器自动调整透光率(T)到100%,吸光度(A)调整到0.000。 4、透光率(T)和吸光度(A)对应准确,点两者误差小于1%。 5、双数据显示,仪器适时显示吸光度(A)和透光率(T)。 6、仪器带有电脑接口和记录仪接口(吸光度0—200mv)。 7、工作软件提供谱图采集、分析计算、保存、打印等功能,可将谱图插入文档(word)文件中。 8、一台电脑可配多台检测仪(由电脑有效端口数决定)。 三、 技术性能 1、通过测量选择菜单,在电脑屏幕上可描出吸光度(A)谱图,透过率(T%)谱图以及A-T%谱图。 2、通过图形平移、复读伸缩和压缩选择等菜单,可对谱图并进行幅度、宽度调整和谱图参数计算,预览满意后打印输出。 3、在描谱过程中,电脑会自动将图形左移(也可人工调整),电脑描谱最长时间为20小时。 4、采集数据自动保存。 四、主要参数: 1、波长:254nm,280nm(可根据用户需要调配)。 2、样品池100ul,光程3mm。 3、量程:吸光度(A):0--2.000 透光率(T):1%—100%。 4、分辩率:吸光度(A):0.001 透光率(T):0.1%。 5、电脑分析参数:峰高、峰宽、峰面积、峰面积比、保留时间、面积含量(归一化)、层析柱分辩率等。 6、电源220V±10%,50HZ。 7、主机重量:约3.5Kg。 五、系统安装与操作步骤 1、将仪器背板上的输出端通过一根串行口连接电缆与电脑主机的COM1或COM2串行口相连。 2、打开紫外蛋白核酸检测仪电源,仪器预热10分钟左右。 3、打开电脑后,将应用软件(ZHD.exe)复制到硬盘上。钦一下仪器面板上的复位按钮,待仪器显示0.000A和100%T后,双击ZHD.exe启动应用软件,系统进入采集(分析)状态。 4、在“测量选择”菜单下,用鼠标选择检测项目。 5、在“检测操作”菜单下点击“测量开始”,电脑开始采集。 6、要停止采集,点击“检测操作”下的“测量结束”菜单,然后关闭紫外蛋白酸检检测仪。 六、层析普工作站软件使用 1、 对硬件的基本要求: a、电脑在简体中文Windowsxp操作系统上运行; b、显示器分辩率为1024*768,小字体,256色配置; c、图形打印机; d、电脑系统必须正常工作,并保证串行口(COM2或COM1)有效; 2、系统连接无误后先让检测仪工作,再执行应用软件ZHD.exe; 3、 点击文件操作菜单下的“打开谱图”,出现文件操作对话框,打开随机盘上的数据文件(.ran),图形被打开,熟悉菜单操作。菜单介绍如下: a、“文件操作”菜单下有打开谱图、保存谱图、打印谱图、打印预览等; b、“检测操作”菜单下有测量开始、测量结束(测量结束后,系统在应用程序目录下生成“文件名.TXT”文件,此格式文件可在Excel软件中打开,并可转贴到Word文档中使用); c、“灵敏度选择”菜单下有A、T%、A-T%选项; d、“谱图平移”菜单后有向左慢移动 []和向右快移动[]; e、“谱图重绘”菜单:从起始点描谱;清理屏幕;释放压缩; f、“谱图全貌”菜单:在屏幕上观察全部谱图。 g、“参数选择”菜单:可对谱图进行参数分析计算。方法如下:在吸光度状态下,点击鼠标左键选取基线及时间范围(第一次点击选取第一点,第二次点击选取第二点),点击“选择参数”下拉菜单的峰高、标准差、半峰宽、峰底宽、峰面积、峰面积比、面积含量及保留时间等参数进行计算,还可间接计算出层析柱分辨率;双击鼠标左键,即可取消本次计算。 h、在吸光度(A)或透光率(T%)状态下,单击鼠标右键,屏幕显示该鼠标点的数值;双击鼠标右健,擦除屏幕显示数值。 七、注意事项: a、 更改波长方法:打开样品池挡板后,可见到滤光片的燕尾型支架和印字(245或280代表当前所使用的波长),用手将其轻轻抽出,换向后插入原位,再将样品池挡板装上,拧紧固定螺钉即可。 b、 在检测仪和电脑正常工作后才能运行应用软件; c、 应用软件执行后,十秒钟后不出现采集分析界面,说明电脑未收到数据,需检查系统连接是否正常; d、 在A—T%描谱过程中,开始1小时内,T%谱以实蓝线表示;1小时后(或点击“图形重绘” ),已描过的T%谱会以虚蓝线表示; e、 测量开始后(特别是出峰以后)不要按复位按钮。 f、 要停止采集,请点击“测量结束”后,先点击“EXIT”,再关闭检测仪。 g、 开始测量时,屏幕会弹出保存文件对话框,要求输入数据文件名及存放路径;之后,电脑自动保存数据。 I、基线选取要保证基线与所选峰必须要有两个焦点,并与其他峰无焦点。
目的要求(1)了解克隆基因表达的方法和意义。(2)了解重组蛋白亲和层析分离纯化的方法。实验原理克隆基因在细胞中表达对理论研究和实验应用都具有重要的意义。通过表达能探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理,同时克隆基因表达出所编码的蛋白质可供作结构与功能的研究。大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统,其表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统,表达的目的蛋白量甚至能超过细菌总蛋白量的80%。本实验中,携带有目标蛋白基因的质粒在大肠杆菌BL21中,在 37℃,IPTG诱导下,超量表达携带有6个连续组氨酸残基的重组氯霉素酰基转移酶蛋白,该蛋白可用一种通过共价偶连的次氨基三乙酸(NTA)使镍离子(Ni2+)固相化的层析介质加以提纯,实为金属熬合亲和层析(MCAC)。蛋白质的纯化程度可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。试剂和器材一、试剂 LB液体培养基:Trytone 10g, yeast extract 5g, NaCl 10g, 用蒸馏水配至1000mL. 氨苄青霉素:100mg/mL 上样缓冲液:100 mM NaH2PO4, 10 mMTris, 8M Urea, 10 mM2-ME, pH8.0 Washing Buffer:100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris, 8 M Urea, pH6.3 Elution Buffer:100 mM NaH2PO4, 10 mMTris, 8M Urea, 500 mM Imidazole, pH8.0 IPTG二、器材摇床,离心机,层析柱(1′10 cm)操作方法一、氯霉素酰基转移酶重组蛋白的诱导1. 接种含有重组氯霉素酰基转移酶蛋白的大肠杆菌BL21菌株于5mL LB液体培养基中(含100ug/mL 氨苄青霉素),37℃震荡培养过夜。2. 转接1mL过夜培养物于100mL(含100ug/mL 氨苄青霉素)LB液体培养基中,37℃震荡培养至OD600 = 0.6 - 0.8。取10ul 样品用于SDS-PAGE 分析。3. 加入IPTG至终浓度0.5 mmol/l, 37℃继续培养1-3h.4. 12,000rpm 离心10 min, 弃上清,菌体沉淀保存于-20℃或-70℃冰箱中。二、氯霉素酰基转移酶重组蛋白的分离、纯化1. NTA层析柱的准备:在层析柱中加入1mL NTA介质,并分别用8mL 去离子水,8mL上样缓冲液洗涤。2. 重组蛋白的变性裂解:在冰浴中冻融菌体沉淀,加入5mL上样缓冲液, 用吸管抽吸重悬,超声波破裂菌体,用振荡器等轻柔的混匀样品60min, 4℃ 12000rpm 离心 30 min, 将上清吸至一个干净的容器中,并弃沉淀。取10ul 上清样品用于SDS-PAGE 分析。3. 上清样品以10-15mL/h 流速上Ni2+-NTA柱,收集流出液,取10ul样品用于SDS-PAGE 分析。4. 洗脱杂蛋白:用Washing Buffer以10-15mL/h流速洗柱,直至OD280 = 0.01.分步收集洗脱液,约3-4h,取10ul洗脱开始时的样品用于SDS-PAGE 分析。5. 洗脱目标蛋白:用Elution Buffer洗柱,收集每1 mL 级分,分别取10ul样品用于SDS-PAGE 分析。
[font=宋体]在生物科学领域,蛋白质纯化是一项关键的技术,它对于研究生物分子的结构和功能至关重要。凝胶过滤层析是一种常用的蛋白质纯化技术,它具有分辨率高、分离效果好的优点。本文将介绍用凝胶过滤层析进行蛋白纯化的流程,包括实验准备、样品处理、层析柱的制作和上样、洗脱和收集等步骤。通过学习本文,读者可以了解凝胶过滤层析在蛋白纯化中的应用及其优缺点,为后续的实验和研究提供参考。[/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]用凝胶过滤层析进行蛋白纯化的流程,主要分为以下步骤:[/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体]准备凝胶柱:选择适当的凝胶材料和柱子,根据待纯化蛋白的分子大小选择合适的孔径。[/font][font=宋体]杂质去除:使用缓冲液预先洗脱凝胶,去除其中的杂质和阻塞物。[/font][font=宋体]样品加载:将待纯化的蛋白溶液加载到凝胶柱中,注意保持柱子的垂直姿势,防止样品泄漏。[/font][font=宋体]洗脱:使用缓冲液进行洗脱,以去除非目标蛋白和杂质。[/font][font=宋体]收集纯化蛋白:收集洗脱液,进行后续的分析或使用。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]以上步骤只是粗略的概述,实际操作时还需要注意许多细节和技巧。例如,选择合适的凝胶类型和柱子对纯化效果有很大影响;样品加载时需要防止样品泄漏;洗脱时需要选择合适的缓冲液等。因此,建议在进行实验前仔细阅读相关文献和资料,并请教有经验的实验人员。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][font=宋体]凝胶过滤层析([/font][font=Calibri]Gel Permeation Chromatography[/font][font=宋体],[/font][font=Calibri]GPC[/font][font=宋体])具有以下优点:[/font][/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]①操作条件温和:[/font][font=Calibri]GPC[/font][font=宋体]不需要使用有机溶剂等强烈的条件,因此对样品的活性影响较小。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]②高分离效果:[/font][font=Calibri]GPC[/font][font=宋体]可以分离不同分子量的蛋白质,且分辨率较高,能够实现样品的较纯分离。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]③重复性好:[/font][font=Calibri]GPC[/font][font=宋体]的层析柱可以重复使用,分离效果稳定,有利于提高实验的可重复性和数据可靠性。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]④适用范围广:[/font][font=Calibri]GPC[/font][font=宋体]可用于各种生化物质,如肽类、激素、蛋白质、多糖、核酸等的分离纯化、脱盐、浓缩以及分析测定等。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]在应用方面,[/font][font=Calibri]GPC[/font][font=宋体]被广泛应用于蛋白质和其他生物分子的分离纯化。例如,从混合物中分离纯化蛋白质、去除蛋白质中的盐和缓冲剂、脱去多糖和脂质等杂质、对蛋白质进行分子量测定等。此外,[/font][font=Calibri]GPC[/font][font=宋体]还可以用于分离合成多肽和基因克隆产物的纯度鉴定等。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]总之,凝胶过滤层析具有温和的操作条件、高分离效果、重复性好等优点,被广泛应用于蛋白质和其他生物分子的分离纯化。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]详情可以关注:义翘神州[url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/chromatography-purification][b]蛋白层析纯化[/b][/url][/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/chromatography-purification[/font][/font]
[font=宋体][font=宋体]离子交换层析[/font][font=Calibri](IEX)[/font][font=宋体]是一种主要基于蛋白净电荷的色谱分离方法,通常用于追踪脱酰胺和琥珀酰亚胺的形成。[/font][font=Calibri]IEX[/font][font=宋体]有两种类型:阳离子交换和阴离子交换层析法。当缓冲液[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值高于此[/font][font=Calibri]IP[/font][font=宋体]时,蛋白带负电(阴离子);当[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值低于此[/font][font=Calibri]IP[/font][font=宋体]时,蛋白带正电(阳离子)。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]所有蛋白都表现出净电荷,这取决于蛋白氨基酸组成和任何共价连接的修饰。蛋白净电荷受溶解它的溶剂[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]所影响,因为溶剂会与蛋白进行氢离子交换。通常情况下,蛋白与[/font][font=Calibri]IEX[/font][font=宋体]的结合必须通过反复试验来确定,使用一系列[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值的溶剂以确定蛋白保留的最佳[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]。通常溶剂的[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值与[/font][font=Calibri]pI[/font][font=宋体]相差约一个[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]单位就足以实现蛋白结合。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]离子交换层析优缺点介绍:[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]离子交换层析法是一种常用的分离分析技术,具有分离效率高、操作简单、可靠性高、灵敏度高等优点。其优点如下:[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]分离效率高:离子交换层析法可以快速、有效地分离各种生物分子和配体,对于复杂的生物样品可以获得较高的分离效果。[/font][font=宋体]操作简单:离子交换层析法的操作相对简单,不需要过多的手动操作,可以自动化进行,减少了人为误差。[/font][font=宋体]可靠性高:离子交换层析法的分离过程相对稳定,分离结果重现性好,可以用于大规模的分离分析。[/font][font=宋体]灵敏度高等优点:离子交换层析法对于低浓度的样品也能够获得较好的分离效果,对于痕量物质的分离和鉴定具有重要意义。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体]但是,离子交换层析法也存在一些缺点:[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]生产率低:离子交换层析法的生产率相对较低,对于大规模的分离分析可能不太适合。[/font][font=宋体]需要使用大量的缓冲液和洗脱液:离子交换层析法需要使用大量的缓冲液和洗脱液,对于环境保护有一定的影响。[/font][font=宋体]对样品条件要求严格:离子交换层析法对于样品的条件要求比较严格,对于不同性质的样品需要使用不同的离子交换剂和分离条件。[/font][font=宋体]总的来说,离子交换层析法是一种有效的分离分析方法,但是也存在一些缺点,需要根据具体的实验条件和要求进行选择和使用。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]更多关于[url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/chromatography-purification]蛋白层析纯化[/url]详情可以关注:[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/chromatography-purification[/font][/font]
层析柱过滤蛋白的 它的过滤膜怎么选择?
[font=宋体]层析法无疑是下游处理中主要和常用的操作,因为层析法相比其他单元操作具有某些优势。例如层析法支持高分辨率的效率,可以分离分子性质非常相似的复杂粗制混合物。此外,层析法是生物工艺中遇到的稀释溶液中捕获分子的理想选择。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]柱色谱法[/font][font=Calibri]([/font][font=宋体]层析法[/font][font=Calibri])[/font][font=宋体]的原理是将一个大的蛋白池分离成许多小的蛋白池,其中一些富集了目标蛋白。虽然柱色谱法有昂贵的专业设备,但只需要基本的设备就可以了。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体]在所有色谱技术中,亲和层析法占主要地位。事实上,亲和层析是最特异、最有效的蛋白纯化技术,为靶蛋白纯化提供了合理的依据。它利用了生物分子识别的原理,即生物活性大分子与亲和配体形成特定的可逆复合物的能力。随着高价值蛋白的传统纯化方案被基于亲和色谱等先进的方法所取代,人们的关注重点转向了设计和选择具有高亲和力和特异性的配体。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]从用于生化表征的浓缩蛋白提取物的制备到治疗性重组蛋白的大规模生产,任何纯化过程都需要经济且足量地获得纯化蛋白。因此,下游处理面临的挑战是高产能、高分辨率和高成本效率。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]亲和层析法适用于基于高特异性相互作用的生化混合物的分离。在纯化过程中可以利用具有明确特性的靶蛋白。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-by-iec][b]离子交换层析法[/b][/url]是一种常见的蛋白纯化方法,该方法基于与离子交换器的亲和力分离离子和极性分子。可溶性分子在通过色谱柱时与带相反电荷的不溶性固定相结合。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]尺寸排阻色谱法,根据分子的大小和分子量分离分子。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]疏水作用层析分离表面有疏水氨基酸侧链的靶蛋白,与疏水基团相互作用并结合在一起。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]蛋白纯化的原理为:不同蛋白质的氨基酸序列及空间结构不同,导致其在物理、化学、生物学等性质上存在差异,利用待分离蛋白质与其它蛋白质性质上的差异,即可以设计出一套合理的蛋白纯化方案。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]蛋白的纯化大致分为粗分离阶段和精细纯化阶段两个阶段。粗分离阶段主要将目的蛋白和其他细胞成分如[/font][font=Calibri]RNA[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]等分开,常用的方法为硫酸铵沉淀法。精细纯化阶段的目的是把目的蛋白与其他大小及理化性质接近的蛋白区分开来,[b]常用的方法有:凝胶过滤层析、离子交换层析、疏水层析、亲和层析等。[/b][/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]凝胶过滤层析[/b][/font][font=宋体]凝胶过滤(也叫排阻层析或分子筛)是一种根据分子大小从混合物中分离蛋白质的方法。不同蛋白的形状及分子大小存在差异,在混合物通过含有填充颗粒的凝胶过滤层析柱时,由于各种蛋白的分子大小不同,扩散进入特定大小孔径颗粒内的能力也各异,大的蛋白分子会被先洗脱出来,分子越小,越晚洗脱,从而达到分离蛋白的目的。一般来说,凝胶过滤层析柱越细、越长纯化的效果越好。凝胶过滤层析详细介绍[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]凝胶过滤层析所能纯化的蛋白分子量范围很宽,纯化过程中也不需要能引起蛋白变性的有机溶剂。缺点是所用树脂有轻度的亲水性,电荷密度较高的蛋白容易吸附在上面,不适宜纯化电荷密度较高的蛋白。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]离子交换层析[/b][/font][font=宋体][font=宋体]离子交换层析是一种依据蛋白表面所带电荷量不同进行蛋白分离纯化的技术。蛋白表面通常会带有一定的电荷,电荷的氨基酸残基均匀地分布在蛋白质的表面,在一定条件下可以与阳离子交换柱或阴离子交换柱结合。这种带电分子与固定相之间的结合作用是可逆的,在改变[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]或者用逐渐增加离子强度的缓冲液洗脱时,离子交换剂上结合的物质可与洗脱液中的离子发生交换而被洗脱到溶液中。由于不同物质的电荷不同,其与离子交换剂的结合能力也不同,所以被洗脱到溶液中的顺序也不同,从而达到分离的效果。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]亲和层析[/b][/font][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-by-ac][b]亲和层析纯化[/b][/url]是利用生物大分子物质具有与某些相应的分子专一性可逆结合的特性进行蛋白纯化的技术。该方法适用于从成分复杂且杂质含量远大于目标物的混合中提纯目标物,具有分离效果好、分离条件温和、结合效率高、分离速度快的优点。亲和层析技术可以利用配基与生物分子间的特异性吸附来分离蛋白,也可以在蛋白上加入标签,利用标签与配基之间的特异性结合来纯化蛋白。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]疏水作用层析[/b][/font][font=宋体][font=宋体]疏水作用层析是利用盐[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]水体系中样品分子的疏水基团和层析介质的疏水配基之间疏水力的不同而进行分离的一种层析方法。该法利用了蛋白的疏水性,蛋白经变性处理或处于高盐环境下疏水残基会暴露于蛋白表面,不同蛋白疏水残基与固定相的疏水性配体之间的作用强弱不同,依次用从高至低离子强度洗脱液可将疏水用作由弱至强的组分分离。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]更多详情可以关注:[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/chromatography-purification[/font][/font]
[font=宋体]亲和层析依赖于蛋白对基质结合配体的特异性和可逆性结合。该配体可以直接与目的蛋白结合或共价连接到蛋白的标签上。亲和层析通常是最有效的纯化方法,通常用在纯化方案的早期阶段。这种特定的亲和相互作用能够捕获目标蛋白,同时去除溶液中的污染物或其他分子,并一步富集或纯化目标分子,使其与其他不能结合配体的分子分离。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]除了理论上蛋白能够通过免疫亲和层析纯化之外,亲和法仅限于具有特异结合特性的蛋白,而免疫亲和层析是所有亲和技术中特异性最强的。[font=宋体]下面是关于亲和层析纯化蛋白的注意事项![/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][font=宋体]一、[/font][font=Calibri]Ni[/font][font=宋体]柱进行蛋白纯化时注意点:[/font][/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri](1)[/font][font=宋体]避免缓冲液中有高浓度的电子供体基团,比如:[/font][font=Calibri]NH4[/font][font=宋体],甘氨酸,精氨酸,等等;[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](2)[/font][font=宋体]各种缓冲液中不能有强螯合剂,如[/font][font=Calibri]EDTA[/font][font=宋体],[/font][font=Calibri]EGTA[/font][font=宋体],等等;[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](3)[/font][font=宋体]各种缓冲液里不能有高浓度的强还原剂,,比如[/font][font=Calibri]DTT[/font][font=宋体],防止二价[/font][font=Calibri]Ni[/font][font=宋体]被还原;[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](4) [/font][font=宋体]不能含离子型的去垢剂,比如[/font][font=Calibri]SDS[/font][font=宋体],防止[/font][font=Calibri]Ni[/font][font=宋体]流失;[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](5)[/font][font=宋体]在破碎细胞的时候建议加入蛋白酶抑制剂,比如[/font][font=Calibri]0.1-1mM[/font][font=宋体]的[/font][font=Calibri]PMSF[/font][font=宋体],防止目的蛋白被降解;[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](6)[/font][font=宋体]缓冲液里可以加入甘油,防止蛋白之间由于疏水相互作用而发生聚集沉淀,甘油浓度最高可达[/font][font=Calibri]50%[/font][font=宋体]([/font][font=Calibri]v/v[/font][font=宋体])[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](7)[/font][font=宋体]应避免含碳酸氢钠,柠檬酸等物质;[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](8)[/font][font=宋体]缓冲液里[/font][font=Calibri]NaCl[/font][font=宋体]的浓度应在[/font][font=Calibri]300mM[/font][font=宋体]到[/font][font=Calibri]2M[/font][font=宋体]之间;[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](9)[/font][font=宋体]可加入变性剂促溶,盐酸胍(最高可[/font][font=Calibri]6M[/font][font=宋体]),尿素(最高可[/font][font=Calibri]8M[/font][font=宋体])[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](10)[/font][font=宋体]可加入非离子型去垢剂,如[/font][font=Calibri]Triton[/font][font=宋体],[/font][font=Calibri]Tween[/font][font=宋体],[/font][font=Calibri]NP40[/font][font=宋体]等,最高[/font][font=Calibri]2%[/font][font=宋体],可以减少背景蛋白污染和去除核酸污染;[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][font=宋体]二、[/font] [font=Calibri]gst[/font][font=宋体]柱进行蛋白纯化时注意点[/font][/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri](1)[/font][font=宋体]在细胞裂解时,加入终浓度[/font][font=Calibri]1[/font][font=宋体]–[/font][font=Calibri]10 mM DTT[/font][font=宋体]可以显著提高[/font][font=Calibri]GST[/font][font=宋体]融合蛋白的结合效率, 在[/font][font=Calibri]Binding Buffer[/font][font=宋体]和[/font][font=Calibri]Elution Buffer[/font][font=宋体]中加入[/font][font=Calibri]1[/font][font=宋体]–[/font][font=Calibri]10 mM DTT[/font][font=宋体],可以提高蛋白纯度,但是会导致其产率降低[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](2)[/font][font=宋体]超声太剧烈或时间过长会引起蛋白变性,导致蛋白不能与介质结合。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](3)[/font][font=宋体]在[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值低于[/font][font=Calibri]6.5[/font][font=宋体]或高于[/font][font=Calibri]8.0[/font][font=宋体]结合效率会降低,使用前需用[/font][font=Calibri]pH6.5[/font][font=宋体]~[/font][font=Calibri]8.0[/font][font=宋体]的[/font][font=Calibri]Buffer[/font][font=宋体]如[/font][font=Calibri]PBS[/font][font=宋体]进行平衡;[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](4)[/font][font=宋体]增大[/font][font=Calibri]Elution Buffer[/font][font=宋体]的[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值。[/font][font=Calibri]Elution Buffer[/font][font=宋体]的[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值调至[/font][font=Calibri]pH 8[/font][font=宋体]–[/font][font=Calibri]9[/font][font=宋体]可以提高洗脱效率而不需要增加[/font][font=Calibri]glutathione[/font][font=宋体]的浓度;[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](5)[/font][font=宋体]增加[/font][font=Calibri]Elution Buffer[/font][font=宋体]的离子强度。加入[/font][font=Calibri]0.1[/font][font=宋体]–[/font][font=Calibri]0.2 M NaCl[/font][font=宋体]能提高洗脱效率;[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](6)Elution Buffer[/font][font=宋体]中加入非离子型变性剂。非特异性的疏水作用可能会阻碍[/font][font=Calibri]GST[/font][font=宋体]融合蛋白从介质上增溶和洗脱。加入[/font][font=Calibri]0.1% Triton X-100 or 2% N-octylglucoside[/font][font=宋体]可以显著增加洗脱效率[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][font=宋体]三、[/font] [font=Calibri]proteinA[/font][font=宋体]柱进行蛋白纯化时注意点[/font][/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri](1)[/font][font=宋体]介质的选择[/font][font=Calibri]A,G or [/font][font=宋体]其他,其结合能力的选择[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](2)[/font][font=宋体]上样流速尽量小,让[/font][font=Calibri]Protein G[/font][font=宋体]和抗体有充分的结合时间[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](3)[/font][font=宋体]在低[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值洗脱后,快速中和。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](4)[/font][font=宋体]长时间保存加入[/font][font=Calibri]0.02-0.05[/font][font=宋体]%叠氮钠;[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](5)[/font][font=宋体]加入[/font][font=Calibri]10%[/font][font=宋体]甘油,可有效防止疏水作用引起的聚集。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](6)[/font][font=宋体]抗体纯度不够,杂蛋白含量高,易引起蛋白的沉淀。 [/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]四、亲和层析配体和洗脱条件[/b][/font][align=center][font=宋体][b][img=亲和层析配体和洗脱条件,690,224]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2023/09/202309061557423472_5868_5907840_3.png!w690x224.jpg[/img][/b][/font][/align][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]更多详情[url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-by-ac][b]亲和层析纯化蛋白[/b][/url]参看:[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-by-ac[/font][/font]
上世纪60、70年代是色谱/层析技术快速发展的时代,首先是层析介质有了飞速的发展,各种人工合成的介质出现,如硅胶、聚苯乙烯二乙烯基树脂、琼脂糖、葡聚糖、聚丙烯酰胺等树脂或凝胶的出现,极大地拓展了层析技术的应用领域和范围,基于不同介质的层析方法也如雨后春笋般不断涌现。如Bio-Rad公司于上世纪50年初推出的分析级离子交换树脂AG系列,广泛用于各种分子物质的分离纯化,包括无机离子、有机酸、核酸以及糖类等。值得一提的是,上世纪4、50年代正是DNA、RNA研究如火如 荼的时期,而Bio-Rad推出的AG系列树脂在核酸纯化方面具有极其出色表现,受到众多研究人员的欢迎与好评。 http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2014/01/A1388734846.JPG_small.jpg http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2014/01/A1388734847.JPG_small.jpg Bio-Rad AG系列树脂 此外,因为马丁(Martin)和辛格(Synge)的钻研与畅想,他们的预言分别在1952年及20世纪60年代被人们所应证。而马丁(Martin)和辛格(Synge)两人也于1952年被授予诺贝尔化学奖。 http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2014/01/A1388734849.JPG_small.jpg Bio-Rad专家介绍:其中设想1“流动相可用气体代替液体,因为与液体相比,分离时候,物质间作用力更小,对分离也就更有好处”也就是气相色谱仪(GC),即以气体作为流动相的色谱法,1952年诞生,目前,该法已被广泛应用于分离和分析复杂的多组分混合物。特别是挥发性物质,我们都知道挥发性物质在实验或分离时会受到干扰,而气相色谱仪的产生给挥发性的化合物的分离测定带来了划时代的变单。 http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2014/01/A1388734850.JPG_small.jpg 设想2“若能够使用非常细的颗粒填料,并在色谱柱两端施加较大的压差,从而增加了理论培板数,这将会大大提高分离效率。”也就是高效液相色谱HPLC,20世纪60年代末诞生,现在高效液相色谱HPLC已成为化学、生物化学与分子生物学、医药学、农业、环保、商检、药检、法检等学科领域与专业最为重要的分离分析技术,是分析化学家、生物化学家等用以解决他们面临的各种实际分离分析课题必不可少的工具。高效液相色谱的优点是:检测的分辨率和灵敏度高,分析速度快,重复性好,定量精度高,应用范围广。适用于分析高沸点、大分子、强极性、热稳定性差的化合物。其缺点是:不能很好地兼容生物缓冲系统,因为HPLC系统通常采用不锈钢材质,因此具有良好的有机溶剂耐受性以及高压力承受。但是生物缓冲系统往往涉及到各种不同浓度的盐溶液,比如最常用的磷酸盐缓冲液等,而不锈钢系统不能耐受盐腐蚀,因此为了满足生物研究中样品的快速分析、分离,蛋白质快速层析技术应运而生。蛋白质快速液相层析(Fast Protein Liquid Chromatography),基于HPLC技术,但又有别于HPLC,它的主要液体接触部件均采用生物盐溶液耐受的塑料或者橡胶,这样能够极大地降低缓冲盐对系统的腐蚀,如Bio-Rad最早一代层析系统Biological LP,正是为了满足70-80年代间快速发展的生命科学领域内对未知组分、物质的分离、纯化的需求应运而生。在其诞生之初,风靡北美。下期,伯乐生命bio-rad专家将为大家带来21世纪层析法特点及先进层析系统,敬请关注!如今的色层分析法经常用于分析、分离无色的物质,已没有颜色这个特殊的含义,但色谱法或色层分析法这个名字仍保留下来沿用。http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2014/01/A1388734851.JPG_small.jpg 现在我们简称为色谱法、层析法或色谱技术、层析技术。
[font=宋体]蛋白质是包括人类在内的各种生物有机体的重要组成成分,是生命的物质基础之一。生物体的生长、发育、遗传和繁殖等一切生命活动都离不开蛋白质。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]随着分子生物学、结构生物学、基因组学等研究的不断深入,人们意识到仅仅依靠基因组的序列分析来试图阐明生命活动的现象和本质是远远不够的。只有从蛋白质组学的角度对所有蛋白质的总和进行研究,才能更科学地掌握生命现象和活动规律,更完善地揭示生命的本质。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]由此许多学者将生命科学领域的研究焦点从基因转向蛋白质,使蛋白质成为揭示生命活动现象和分子生物学机理的重要研究对象。研究蛋白质首要的步骤是将目的蛋白从复杂的大分子混合物中分离纯化出来,得到高纯度具有生物学活性的目的物。因此,高效的纯化技术和手段是蛋白质研究的重要基础和关键之一。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=宋体]蛋白纯化的目的[/font] [/font][/b][font=宋体][font=宋体]蛋白纯化的目的是将目标蛋白质从细胞裂解液的全部组分中分离出来,同时仍保留蛋白的生物学活性及化学完整性。蛋白质的分离和提纯工作是一项艰巨而繁重的任务,需根据蛋白的特性选择合适的纯化方法来提高获得的蛋白制品的纯度。[/font] [/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=宋体]蛋白纯化的原理[/font] [/font][/b][font=宋体][font=宋体]不同蛋白质的氨基酸序列及空间结构不同,导致其在物理、化学、生物学等性质上存在差异,利用待分离蛋白质与其它蛋白质性质上的差异,即可以设计出一套合理的蛋白纯化方案。蛋白的纯化大致分为粗分离阶段和精细纯化阶段两个阶段。粗分离阶段主要将目的蛋白和其他细胞成分如[/font] [font=Calibri]RNA[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]DNA [/font][font=宋体]等分开,常用的方法为硫酸铵沉淀法。精细纯化阶段的目的是把目的蛋白与其他大小及理化性质接近的蛋白区分开来,[/font][/font][b][font=宋体][font=宋体]常用的方法有:凝胶过滤层析、离子交换层析、疏水层析、亲和层析等。[/font] [/font][/b][font=宋体] [/font][b][font=宋体]①[/font][font=宋体]凝胶过滤层析[/font][/b][font=宋体]凝胶过滤层析(又叫做分子筛)是根据样品的分子大小对样品进行分离的一种简单温和的层析技术。凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析,是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用,根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。不同于离子交换层析和亲和层析,凝胶过滤的层析样品不与层析柱料结合,因此,缓冲液成分不直接影响分辨率。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]原理:层析柱中的填料是球状颗粒的惰性的多孔网状结构的柱料,多是交联的聚糖[/font][font=Calibri]([/font][font=宋体]如葡聚糖或琼脂糖[/font][font=Calibri])[/font][font=宋体]类物质。在加入样品之后,样品中的小分子物质能进入球状填料内部,在柱子中停留时间较长;而大分子物质不能进入球状填料内部,停留时间较短。所以当样品经过凝胶过滤层析柱分离后,样品中的不同分子大小的物质就可以被分离开了。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]特点:[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]根据分子大小和形状进行分离[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]是一种非吸附的分离方式[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]缓冲液成分不直接影响分辨率,只需要一种缓冲液[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]操作便捷[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]②[/font][font=宋体]离子交换层析[/font][/b][font=宋体]离子交换层析是目前蛋白质分离纯化中应用最广泛的方法之一。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]原理:不同蛋白等电点差异,分子大小差异,在同一个流动相中电荷密度分布不同,电荷量不等,与具有相反电荷的离子交换介质结合强度不同,在流动相洗脱时保留时间不同,从而得以分离。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体]特点:[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]根据分子大小和等电点差异进行分离[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]灵敏度高,重复性,选择性好,分析速度快[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]③[/font][font=宋体]疏水层析[/font][/b][font=宋体]原理:疏水层析是依据蛋白质疏水性差异分离的。即根据蛋白质和疏水介质表面的疏水基团的可逆相互作用进行分离。蛋白的疏水性在高离子强度下被增强,因此在高离子强度环境中结合,通常采用降低离子强度的方式进行洗脱。独特的吸附分离模式使得疏水层析成为硫酸铵盐析后或离子交换高盐洗脱后理想的纯化方式。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]特点:[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]采用了盐的水溶液作为流动相,色谱条件温和,生物大分子的活性回收率很高。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]蛋白质在[/font][font=Calibri]HIC[/font][font=宋体]操作过程中是高盐上样,低盐洗脱(高盐浓度的样品不必作处理就可直接上样)。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]在一次色谱中可同时实现出去盐酸胍、蛋白质复性和分离三个目的。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]温度升高,蛋白质天然折叠伸展,暴露出更多内部疏水集团,使蛋白质的[/font][font=Calibri]HIC[/font][font=宋体]保留发生变化。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]色谱填料稳定性好,盐水体系作流动相无环境污染。[/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]④[/font][font=宋体]亲和层析[/font][/b][font=宋体][font=宋体]原理:[url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-by-ac][b]亲和层析[/b][/url]是应用生物高分子与配基可逆结合的原理,将配基通过共价键牢固结合于载体上而制得的层析系统。这种可逆结合的作用主要是靠生物高分子对它的配基的空间结构的识别。常用的生物亲和关系有酶[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]底物、底物类似物、抑制剂、激活剂、辅因子,抗体[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]抗原,激素[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]受体蛋白、载体蛋白,外源凝集素[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]多糖、糖蛋白、细胞表面受体,核酸[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]互补核苷酸序列、组蛋白、核酸结合蛋白等,具有高效、简单、快速的优点,是当前最为理想的分离纯化蛋白的方法。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]更多详情可以参看蛋白纯化技术[/font][font=Calibri]/[/font][font=宋体]方法:[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-techniques[/font][/font][font=Calibri] [/font]
请问:多糖疫苗的鉴定是如何做的?听说需要用到蛋白层析仪的。具体是怎么用呢?
一、实验目的1. 了解凝胶层析的原理及其应用。2. 通过测定蛋白质分子量的训练,初步掌握凝胶层析技术。二、实验原理凝胶层析又称排阻层析,凝胶过滤,渗透层析或分子筛层析等。它广泛地应用于分离、提纯、浓缩生物大分子及脱盐、去热源等,而测定蛋白质的分子量也是它的重要应用之一。凝胶是一种具有立体网状结构且呈多孔的不溶性珠状颗粒物质。用它来分离物质,主要是根据多孔凝胶对不同半径的蛋白质分子(近于球形)具有不同的排阻效应实现的。亦即它是根据分子大小这一物理性质进行分离纯化的。分离原理参见“理论部分的凝胶层析一节”。对于某种型号的凝胶,一些大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全被排阻在外,只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外;而一些小分子不被排阻,可自由扩散,渗透进入凝胶内部的筛孔,尔后又被流出的洗脱液带走。分子越小,进入凝胶内部越深,所走的路程越多,故小分子最后流出柱外,而大分子先从柱中流出。一些中等大小的分子介于大分子与小分子之间,只能进入一部分凝胶较大的孔隙,亦即部分排阻,因此这些分子从柱中流出的顺序也介于大、小分子之间。这样样品经过凝胶层析后,分子便按照从大到小的顺序依次流出,达到分离的目的。凝胶层析分离原理示意动画。对于任何一种被分离的化合物在凝胶层析柱中被排阻的范围均在0~100%之间,其被排阻的程度可以用有效分配系数Kav(分离化合物在内水和外水体积中的比例关系)表示,Kav值的大小和凝胶柱床的总体积(Vt)、外水体积(V0)以及分离物本身的洗脱体积(Ve)有关:Kav = (Ve-V0)/(Vt-V0) ----------- (1)在限定的层析条件下,Vt和V0都是恒定值,而Ve是随着分离物分子量的变化而改变。分子量大,Ve值小,Kav值也小。反之,分子量小Ve值大,Kav值大。有关凝胶层析柱中凝胶自身(基质)体积(Vg)、外水体积(V0)、内水体积(Vi)及柱床总体积(Vt)的参见示意图。凝胶层析柱中的几种层析峰。有效分配系数Kav是判断分离效果的一个重要参数,同时也是测定蛋白质分子量的一个依据。在相同层析条件下,被分离物质Kav值差异越大,分离效果越好。反之,分离效果差或根本不能分开。在实际的实验中,我们可以实测出Vt、V0及Ve的值,从而计算出Kav的大小。对于某一特定型号的凝胶,在一定的分子量范围内,Kav与logMw (Mw表示物质的分子量) 成线性关系:Kav =-b logMw + C --------- (2)其中 b,C为常数。同样可以得到:Ve =-b'logMw + C' --------- (3)其中 b', C'为常数。即 Ve 与 logMw 也成线性关系。我们可以通过在一凝胶柱上分离多种已知分子量的蛋白质后,并根据上述的线性关系绘出标准曲线,然后用同一凝胶柱测出其它未知蛋白的分子量。三、器材与试剂(一)器材1. 玻璃层析柱((20mm×60cm)2. 恒流泵(或下口恒压贮液瓶)3. 自动部分收集器4. 紫外分光光度计5. 100ml试剂瓶6. 1000ml量筒7. 250ml烧杯8. 50ml、100ml烧杯9. 10ml(或5ml)刻度试管(二)试剂1. 标准蛋白(1)牛血清白蛋白:Mw=67,000(上海生化所)(2)鸡卵清清蛋白:Mw=45,000(美国SIGMA公司)(3)胰凝乳蛋白酶原A:Mw=24,000(美国SIGMA公司)(4)溶菌酶:Mw =14,3002. 未知蛋白质样品:由实验室准备3. 0.025M KCl-0.1M HAC(乙酸)(洗脱液1000ml)4. 蓝色葡聚糖-2000
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请教:疏水层析和反相层析相比对蛋白质吸附能力较弱??原文大意如下——疏水等系和反相层析的原理都是利用疏水作用分离蛋白质、多肽的但是二者使用的介质和流动相有一定的差别其中疏水层析介质的极性反相层析介质的极性所以疏水层析的介质对于蛋白质的吸附能力较弱 可以使用温和的盐水就可以洗脱但是反相层级的介质极性较弱 需要更强的有机溶剂洗脱之【问题是——蛋白质应该是水溶性的啊? 应该是和极性更强的疏水层析介质接近 继而疏水层析介质对蛋白质的吸附能力更强?????????????????????】 [em0808]
[font=宋体]离子交换层析是一种在生物化学和生物技术领域中广泛使用的分离和纯化技术。它基于离子间的相互作用,特别是离子与固定在层析介质上的带电基团之间的相互作用,从而实现对混合物中不同离子的分离。以下将详细介绍离子交换层析的步骤及其作用。[/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]一、步骤[/font][/b][font=宋体][font=Calibri]1[/font][font=宋体]、预处理:在开始离子交换层析之前,通常需要对样品进行预处理,以去除大颗粒杂质和不需要的成分。这通常包括离心、过滤和可能的浓缩步骤。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]、选择合适的离子交换剂:离子交换剂是层析过程的核心。根据待分离离子的性质(如电荷、大小和与交换剂的亲和力)选择合适的离子交换剂。常见的离子交换剂包括阳离子交换剂和阴离子交换剂。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]3[/font][font=宋体]、平衡离子交换剂:在将样品加载到离子交换柱之前,需要用适当的平衡溶液(通常是水或盐溶液)冲洗离子交换剂,以去除可能存在的杂质并确保离子交换剂处于最佳状态。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]4[/font][font=宋体]、加载样品:将预处理过的样品加载到离子交换柱上。样品中的离子会与离子交换剂上的带电基团发生相互作用。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]5[/font][font=宋体]、洗脱:用洗脱液(通常是盐溶液,其浓度逐渐增加)将结合的离子从离子交换剂上洗脱下来。这一步骤是离子交换层析中最为关键的一步,因为它决定了不同离子之间的分离效果。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]6[/font][font=宋体]、收集和分析:收集洗脱下来的各个组分,并进行分析,以确定每个组分中包含的离子种类和浓度。常见的分析方法包括电导率测量、紫外[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]可见光谱和质谱等。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]7[/font][font=宋体]、后处理:根据需要对收集到的组分进行进一步的处理,如浓缩、脱盐或重新配制等。[/font][/font][b][font=宋体] [/font][font=宋体]二、作用[/font][/b][font=宋体]离子交换层析在生物化学和生物技术领域有着广泛的应用,主要作用包括:[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1[/font][font=宋体]、分离和纯化蛋白质:离子交换层析可用于从复杂的混合物中分离和纯化蛋白质,这对于后续的生物化学研究和药物开发至关重要。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]、去除杂质:离子交换层析能够有效地去除样品中的离子杂质,提高样品的纯度。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]3[/font][font=宋体]、样品制备:在进行其他分析或实验之前,离子交换层析可用于样品的制备和预处理。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]4[/font][font=宋体]、研究蛋白质与离子的相互作用:通过离子交换层析,可以研究蛋白质与不同离子之间的相互作用和亲和力,这对于理解蛋白质的生物学功能和调控机制具有重要意义。[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=宋体]三[/font] [font=宋体]、应用领域[/font][/font][/b][font=宋体]离子交换层析法在许多领域得到广泛应用:[/font][font=宋体]●生物制药:用于药物蛋白质的纯化,确保生物制剂的质量和稳定性。[/font][font=宋体]●生物学研究:在分离和纯化特定电荷性质的蛋白质时被广泛使用,尤其在基因表达和蛋白质互作研究中。[/font][font=宋体]●食品工业:用于提取和纯化食品中的蛋白质,改善食品的质地和口感。[/font][font=宋体]●环境监测:可用于从环境样品中分离和检测特定蛋白质,例如水体中的生物标志物。离子交换层析法凭借其良好的选择性和高效性,是生物分离和纯化领域不可或缺的重要工具。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]更多详情可以关注:[url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-by-iec][b]离子交换层析蛋白纯化[/b][/url][/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-by-iec[/font][/font][b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州:蛋白与抗体的专业引领者,欢迎通过百度搜索[/font][font=宋体]“义翘神州”与我们取得联系。[/font][/font][/b]
[color=#d801e5][color=#dc143c][size=2]维权声明:本文为lily002原创作品,本作者与仪器信息网是该作品合法使用者,该作品暂不对外授权转载。其他任何网站、组织、单位或个人等将该作品在本站以外的任何媒体任何形式出现的,均属侵权违法行为,我们将追究法律责任。[/size][/color]大家好,我是凝胶色谱一名新手,以前常常在咱们论坛中学习和下载资料,看到论坛中轰轰烈烈的第三届原创大赛开始了,还有各位达人们的攻略、帮助,心里有点小激动呢~~~于是就拿出自己的一些实验和研究的东东来与大家分享!!说实话拿出来有点小担心,毕竟自己的水平不高拿出来有点献丑了!本着分享第一荣誉第二的原则,就硬着头皮绣出来了!!也希望大家轻拍哦![/color][align=center][color=#d40a00]===================================Show Time========================================[/color][/align] 我在本次试验中研究的是金属硫蛋白(Metallothionein, MT)又名金属组氨酸甲基内盐,是分子量较小,富含半胱氨酸的非酶蛋白质,其内含有镉、铜、锌、汞等金属元素,不含芳香组胺酸残基。MT与微量元素代谢、重金属解毒、自由基清除以及应急反应有关。是一种广泛存在于各种组织的蛋白质。这些蛋白具有很高的结构稳定性。分析不同的动物和不同的组织器官,发现MT氨基酸组成差异很小。在真菌和动物体内,MT能够缓解镉、汞等有害元素的毒害并在不同应激条件保护机体,被认为是和生物体解毒有关的蛋白,在脊椎动物,MT则被更多地认为和锌的储藏和代谢有关。最显著的功能是可消除体内过量的自由基、重金属及有害物质的污染。在如今环境污染日趋严重的情况下,这种能增强自 身抗污染能力的产品,将越来越为人们所需要。香菇多糖、糖蛋白及 其衍生物具有较强的保肝、抗衰老、增食欲等功效,它是一种有效的免疫激活剂和调节剂,能通过提高机体免疫功能,抑制癌细胞的生长 和扩大。 聚丙烯酰胺是以丙烯酰胺和甲撑双丙烯酰胺聚合而成的具有三维网状结构的凝胶,其孔径可调,性质稳定,无色透明。用聚丙烯酰胺凝胶作为电泳的支持物分离蛋白,具有分辨力高、酶活性影响小、显带效果好等优点,因此应用广泛。 近年来,河流湖泊及近海海域不同程度受到重金属的污染,镉被美国毒理委员会列为第6位危及人体健康的有害物质。镉(Cd)是人体非必需元素,在自然界中常以化合物状态存在,一般含量很低,在正常环境下,不会影响人体健康。镉被人体吸收后在体内形成了镉硫蛋白,选择性地储存于肾、肝中,其中肾脏可吸收进入人体近1/3的镉,是镉 中毒的“靶器官”。其它如脾、胰、甲状腺和毛发等也有一定量的积蓄。镉在体内可与含羟基、氨基、硫基的蛋白质分子结合,使许多酶系统受到抑制,从而影响到肝、肾器官中酶系统的正常功能。由于镉损伤肾小管,病者出现糖尿、蛋白尿和氨基酸尿,特别是使骨骼的代谢受阻,造成骨质酥松,萎缩,变形等症状。 本实验通过体外暴露氯化镉染毒法处理长江华溪蟹,对华溪蟹的蛋白进行SDS-PAGE电泳,得到相应的分子量,并通过紫外分光光度计对华溪蟹体内的金属硫蛋白进行鉴定。 [b]一、实验材料和仪器[/b] 1.材料:华溪蟹于家门口的水场市场购回,先在实验室的饲养池中用清水驯养数天,不喂任何食物,选取大小均等、重量相似的个体进行染毒处理。 2.部分主要仪器:高速冷冻离心机Centrifuge 5804R(eppendorf),高速台式离心机 Centrifuge 5415D(eppendorf),恒温水浴锅,循环水式多用真空泵,超低温冰箱MDF-U50V(日本SANYO),国产凝胶柱(上海华美实验仪器厂,26*100),SephadexG-50(Amerchsham),AKTA Prime蛋白纯化系统(Amersham),UV-2102 PC型紫外可见分光光度计(UNICOTM) [b]二、 实验过程:[/b] 1.体外镉暴露法染毒 因为镉对金属硫蛋白有高度的诱导作用,所以在的、高镉环境中可以诱导华溪蟹的金属硫蛋白的产生。[14] 通过查阅资料及进行预实验,最终确定染毒的镉溶液浓度为58mg/l染毒时间为30h提取组织为肝胰腺。实验华溪蟹的解剖,用镊子将华溪蟹从染毒缸中取出,用清水冲洗干净,在解剖盘中先将其附肢剪掉,然后打开蟹壳,腮为半片状,分布在两侧,可以很轻易的取出,卵巢分布在中后部,颜色为亮黄色,颗粒状,用镊子可以方便取出,肝胰腺在卵巢和心脏的下面,将心脏剥离后向下夹入便可夹出整个肝胰腺,其呈暗黄色,絮状,从华溪蟹的螯中取出肌肉,先将其剪开,再用手术刀从螯壁上刮下肌肉组织,其半透明粘性大。 2. MT粗提取的制备 取染毒华溪蟹的肝胰腺,按每克湿组织用3ml0.02mol/lTris-Hcl缓冲液(pH8.6)在玻璃研钵中充分匀浆,将匀浆液放入-800C的冰箱中保存备用。 3. Sephadex G-50凝胶柱的制备 (1)凝胶柱的清洗 将购买国产凝胶柱(26*100)用70%浓盐酸浸泡过夜,用洗衣粉水浸泡,冲洗,最后用去离子水冲洗干净。 (2)凝胶填料的溶胀 商品凝胶是干燥的颗粒状固体,将凝胶均匀铺洒在干净并且干燥的烧杯内,缓缓家入超纯水,使其溶胀.待凝胶体积超过烧杯容积1/2后,将一般凝胶转移至另一干净烧杯,防止凝胶溢出.用封口膜封住烧杯放2d,然后将烧杯放入真空泵抽滤2d,排除凝胶中的气泡. (注意在凝胶溶胀和处理凝胶悬浮液的整个过程中,不能进行激烈的搅拌,这样会使凝胶颗粒破碎而产生碎片,以至影响层析的流速,在处理凝胶时,严禁使用电磁搅拌,它会象磨一样,在很短时间内把凝胶碾碎.) (3)凝胶柱的装填 把凝胶柱竖直固定好(有滤膜的一端为底部),用Ph8.6Tris-Hcl缓冲液润洗后加入柱体积1/3Tris-Hcl缓冲液,将少量凝胶转移至小烧杯中家Tris-Hcl缓冲液,用玻璃棒轻轻搅拌均匀,并观察凝胶是否有不均匀处(若有不均匀处,可将不均匀凝胶重新搅拌使重新沉降),然后用玻璃帮引流到凝胶柱内并不停地轻轻搅拌使凝胶均匀沉降,直至凝胶沉降至柱顶约10cm处,加Tris-Hcl缓冲液至柱顶,盖好柱顶螺帽,并将凝胶柱与蛋白纯化系统连接好,用Tris-Hcl缓冲液反复洗脱. (4)Sephadex G50 凝胶层析分离纯化MT 将装着已提取的染毒华溪蟹组织的EP管从冰箱中取出解冻,把组织倒入研钵加入1.5mlTris-Hcl缓冲液,充分研磨,将样品转至5mlEP管中,把EP管插在漂浮板上,放入80℃恒温水浴锅5min,取出后抽去表层脂肪,上样. (5)洗脱峰紫外光谱扫描分析 (6)洗脱峰SDS-PAGE分析 [b]三、实验结果与分析[/b] 1.SephdexG50凝胶层析分离纯化MT[img]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2010/07/201007291845_233096_1917139_3.jpg[/img] 图1为匀浆热沉淀处理上样经SephadexG-50凝胶柱层析图,洗脱液为0.01mol/L Tris-Hcl缓冲液,pH为8.60,洗脱速度为0.5ml/min,在254nm处检测吸光度,结果显示,层析后样品分为Ⅰ,Ⅱ两个峰. 2. 洗脱峰紫外光谱扫描分析 由于金属硫蛋白中不含有芳香族氨基酸,所以在紫外不能形成280nm特征光谱.但是由于金属硫蛋白在二级结构中形成特征性的巯基金属簇,而导致在紫外光谱中出现对应于金属簇结构的特殊吸收峰,吸收峰的位置主要决定于金属的种类,如:镉硫金属簇的吸收位于250nm附近,而锌硫金属簇的吸收峰位于225nm附近. 将接收峰Ⅰ,Ⅱ分别在190nm-300nm扫描。[img]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2010/07/201007291848_233097_1917139_3.jpg[/img] 图2,3分别为匀浆热沉淀处理上样洗脱峰Ⅰ,Ⅱ稀释8倍后在190nm-300nm间紫外吸收光谱.结果显示,洗脱峰Ⅰ在280nm处都有一个高的吸收峰,而洗脱峰Ⅱ在250nm附近具有一个高的吸收峰,在280nm处急剧下降,据此分析MT主要存在于峰Ⅱ中. 3.洗脱峰SDS-PAGE分析[img]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2010/07/201007291856_233100_1917139_3.jpg[/img] 图4,5为匀浆上样后洗脱峰SDS-PAGE电泳图谱,如图8所示峰2峰3蛋白浓度过低,经冷冻干燥浓缩再次上样,图9显示MT存在于峰Ⅱ中但未能得到完全纯化,还需进一步上离子交换柱层析分离.
[font=宋体][b]亲和层析技术的原理:[/b][/font][font=宋体][font=宋体]亲和分析是利用生物聚合物与基础可逆结合的原理,通过共价键将基础与载体牢固结合而成的分析系统。这种可逆结合的作用主要取决于生物聚合物对其基础的空间结构的识别。受体蛋白、载体蛋白、外源凝集素[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]多糖、糖蛋白、细胞表面受体、核酸[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]互补核苷酸序列、组蛋白、核酸结合蛋白等。它具有高效、简单、快速的优点,是目前分离纯化蛋白质最理想的方法。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]在亲和色谱中,在影响蛋白质(或标签)与其配体结合的情况下,将蛋白质装载在柱子上。在不破坏特定相互作用但能破坏污染蛋白质与固定相互作用的情况下,清洗组合蛋白质。然后用含有竞争性分子的缓冲液或破坏所有蛋白[/font][font=Calibri]/[/font][font=宋体]蛋白相互作用的条件洗脱结合的蛋白。竞争分子与配体结合,取代目标蛋白,这种竞争分子通常通过另一种色谱流程或透析法从目标蛋白中去除。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]亲和色谱配体和条件[/b][/font][font=宋体]需纯化的蛋白[/font][font=宋体]配体[/font][font=宋体]洗脱条件[/font][font=宋体]抗体(抗原特异性)[/font][font=宋体]抗原肽[/font][font=宋体]游离肽[/font][font=宋体]多聚组氨酸标签蛋白[/font][font=宋体][font=Calibri]Ni2+[/font][font=宋体]或[/font][font=Calibri]Co2+[/font][/font][font=宋体]咪唑或游离组氨酸[/font][font=宋体][font=Calibri]FLAG[/font][font=宋体]标签蛋白[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]FLAG[/font][font=宋体]特异性抗体[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]FLAG[/font][font=宋体]肽或低[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]GST[/font][font=宋体]标签蛋白[/font][/font][font=宋体]还原型谷胱甘肽[/font][font=宋体]游离谷胱甘肽[/font][font=宋体][font=Calibri]Myc[/font][font=宋体]标签蛋白[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]Myc[/font][font=宋体]特异性抗体[/font][/font][font=宋体][font=宋体]低[/font][font=Calibri]pH[/font][/font][font=宋体]抗体(类特异性)[/font][font=宋体][font=宋体]蛋白[/font][font=Calibri]A[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]G[/font][font=宋体]和[/font][font=Calibri]L[/font][font=宋体]或精蛋白[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]极端值[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]结合蛋白[/font][/font][font=宋体]肝素[/font][font=宋体]高离子强度[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]亲和纯化蛋白的注意点:[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]a. Ni[/font][font=宋体]柱进行蛋白纯化时注意点:[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri](1)[/font][font=宋体]避免缓冲液中有高浓度的电子供体基团,比如:[/font][font=Calibri]NH4[/font][font=宋体],甘氨酸,精氨酸,等等;[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](2)[/font][font=宋体]各种缓冲液中不能有强螯合剂,如[/font][font=Calibri]EDTA[/font][font=宋体],[/font][font=Calibri]EGTA[/font][font=宋体],等等;[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](3)[/font][font=宋体]各种缓冲液里不能有高浓度的强还原剂,,比如[/font][font=Calibri]DTT[/font][font=宋体],防止二价[/font][font=Calibri]Ni[/font][font=宋体]被还原;[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](4) [/font][font=宋体]不能含离子型的去垢剂,比如[/font][font=Calibri]SDS[/font][font=宋体],防止[/font][font=Calibri]Ni[/font][font=宋体]流失;[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](5)[/font][font=宋体]在破碎细胞的时候建议加入蛋白酶抑制剂,比如[/font][font=Calibri]0.1-1mM[/font][font=宋体]的[/font][font=Calibri]PMSF[/font][font=宋体],防止目的蛋白被降解;[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](6)[/font][font=宋体]缓冲液里可以加入甘油,防止蛋白之间由于疏水相互作用而发生聚集沉淀,甘油浓度最高可达[/font][font=Calibri]50%[/font][font=宋体]([/font][font=Calibri]v/v[/font][font=宋体])[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](7)[/font][font=宋体]应避免含碳酸氢钠,柠檬酸等物质;[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](8)[/font][font=宋体]缓冲液里[/font][font=Calibri]NaCl[/font][font=宋体]的浓度应在[/font][font=Calibri]300mM[/font][font=宋体]到[/font][font=Calibri]2M[/font][font=宋体]之间;[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](9)[/font][font=宋体]可加入变性剂促溶,盐酸胍(最高可[/font][font=Calibri]6M[/font][font=宋体]),尿素(最高可[/font][font=Calibri]8M[/font][font=宋体])[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](10)[/font][font=宋体]可加入非离子型去垢剂,如[/font][font=Calibri]Triton[/font][font=宋体],[/font][font=Calibri]Tween[/font][font=宋体],[/font][font=Calibri]NP40[/font][font=宋体]等,最高[/font][font=Calibri]2%[/font][font=宋体],可以减少背景蛋白污染和去除核酸污染;[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]b. gst[/font][font=宋体]柱进行蛋白纯化时注意点[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri](1)[/font][font=宋体]在细胞裂解时,加入终浓度[/font][font=Calibri]1[/font][font=宋体]–[/font][font=Calibri]10 mM DTT[/font][font=宋体]可以显著提高[/font][font=Calibri]GST[/font][font=宋体]融合蛋白的结合效率, 在[/font][font=Calibri]Binding Buffer[/font][font=宋体]和[/font][font=Calibri]Elution Buffer[/font][font=宋体]中加入[/font][font=Calibri]1[/font][font=宋体]–[/font][font=Calibri]10 mM DTT[/font][font=宋体],可以提高蛋白纯度,但是会导致其产率降低[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](2)[/font][font=宋体]超声太剧烈或时间过长会引起蛋白变性,导致蛋白不能与介质结合。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](3)[/font][font=宋体]在[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值低于[/font][font=Calibri]6.5[/font][font=宋体]或高于[/font][font=Calibri]8.0[/font][font=宋体]结合效率会降低,使用前需用[/font][font=Calibri]pH6.5[/font][font=宋体]~[/font][font=Calibri]8.0[/font][font=宋体]的[/font][font=Calibri]Buffer[/font][font=宋体]如[/font][font=Calibri]PBS[/font][font=宋体]进行平衡;[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](4)[/font][font=宋体]增大[/font][font=Calibri]Elution Buffer[/font][font=宋体]的[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值。[/font][font=Calibri]Elution Buffer[/font][font=宋体]的[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值调至[/font][font=Calibri]pH 8[/font][font=宋体]–[/font][font=Calibri]9[/font][font=宋体]可以提高洗脱效率而不需要增加[/font][font=Calibri]glutathione[/font][font=宋体]的浓度;[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](5)[/font][font=宋体]增加[/font][font=Calibri]Elution Buffer[/font][font=宋体]的离子强度。加入[/font][font=Calibri]0.1[/font][font=宋体]–[/font][font=Calibri]0.2 M NaCl[/font][font=宋体]能提高洗脱效率;[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](6)Elution Buffer[/font][font=宋体]中加入非离子型变性剂。非特异性的疏水作用可能会阻碍[/font][font=Calibri]GST[/font][font=宋体]融合蛋白从介质上增溶和洗脱。加入[/font][font=Calibri]0.1% Triton X-100 or 2% N-octylglucoside[/font][font=宋体]可以显著增加洗脱效率[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]c. proteinA[/font][font=宋体]柱进行蛋白纯化时注意点[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri](1)[/font][font=宋体]介质的选择[/font][font=Calibri]A,G or [/font][font=宋体]其他,其结合能力的选择[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](2)[/font][font=宋体]上样流速尽量小,让[/font][font=Calibri]Protein G[/font][font=宋体]和抗体有充分的结合时间[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](3)[/font][font=宋体]在低[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值洗脱后,快速中和。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](4)[/font][font=宋体]长时间保存加入[/font][font=Calibri]0.02-0.05[/font][font=宋体]%叠氮钠;[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](5)[/font][font=宋体]加入[/font][font=Calibri]10%[/font][font=宋体]甘油,可有效防止疏水作用引起的聚集。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](6)[/font][font=宋体]抗体纯度不够,杂蛋白含量高,易引起蛋白的沉淀。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]目前义翘神州提供[url=https://cn.sinobiological.com/services/recombinant-protein-expression-service]重组蛋白表达服务[/url],包含[/font][font=Calibri]VLP[/font][font=宋体]形式的膜蛋白表达服务、原核([/font][font=Calibri]E. coli[/font][font=宋体])蛋白表达服务、哺乳动物细胞瞬时表达服务、杆状病毒[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]昆虫细胞蛋白表达服务、稳定细胞系构建服务等,想咨询蛋白纯化服务的用户,可以直接[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/recombinant-protein-expression-service[/font][/font]
[font=宋体][b]离子交换层析基本原理:[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]离子交换层析法是蛋白纯化的一种方式,通过带电的溶质分子与离子交换层析介质中可交换离子进行交换,从而达到分离纯化的目的。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]离子交换层析法主要依据电荷间的相互作用,利用带电分子中电荷的微小差异而进行分离,具有较高的分离容量。几乎所有的生物大分子都是极性的,都可使其带电,所以离子交换层析法的应用很广泛。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]离子交换层析的介质:[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]有许多离子交换介质都已经商品化,但不存在一种神奇的介质其最适合各种蛋白质的纯化。选择离子交换介质的标准包括应用的特异性需要、样品成分的等电点和分子大小(即目的蛋白和污染物),以及可得到的装备(如泵和柱子)。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]首先需要选择阴离子或阳离子介质,如果目的蛋白的等电点已知,选择阴离子介质且操作的[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]高于目的蛋白的[/font][font=Calibri]pI[/font][font=宋体],或选择阳离子介质且操作[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]低于目的蛋白的[/font][font=Calibri]pI[/font][font=宋体]。如果靶蛋白的[/font][font=Calibri]pI[/font][font=宋体]未知,开始之前最好先测定它。最佳操作[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]可根据经验确定。因为大多数蛋白质的[/font][font=Calibri]pI[/font][font=宋体]低于[/font][font=Calibri]7[/font][font=宋体],选择阴离子交换和操作[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]为[/font][font=Calibri]8.5[/font][font=宋体]开始是合理的,然后根据估计结果和优化条件。知道蛋白质溶液中污染物[/font][font=Calibri]pI[/font][font=宋体]和结合特征也是有用的。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]离子交换层析应用:[/b][/font][font=宋体][font=宋体]离子交换层析法是生物纯化中应用最广泛的色谱模式,应用于大多数下游处理平台。在[/font][font=Calibri]IEX[/font][font=宋体]中结合目标蛋白、洗脱柱子和洗脱目标蛋白的典型方案被称为“结合[/font][font=Calibri]/[/font][font=宋体]洗脱模式”,经常应用于中间纯化步骤如抗体的下游处理。阴离子交换层析是大多数血浆蛋白纯化平台的组成部分如凝血因子[/font][font=Calibri]VIII[/font][font=宋体]的纯化。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][font=宋体]离子交换层析([/font][font=Calibri]IEX[/font][font=宋体])具体操作步骤:[/font][/b][/font][font=宋体]平衡[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]第一步是固定相的平衡。当达到平衡时,所有的固定相带电基团都与可交换的平衡离子结合,如氯或钠。选择起始缓冲液的[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]和离子强度,以确保目标蛋白与介质的结合。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]上样和清洗[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]第二步的目标是结合目标分子,并清洗出所有未结合的物质。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]洗脱[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]随着离子强度的增加,在选定的[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值下净电荷最低的蛋白将最先从柱子上洗脱。同样地,在一定[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值下电荷最高的蛋白被保留得最牢固,并且在最后被洗脱。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]再生[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]最后用高离子强度的缓冲液进行最后一次清洗,使色谱柱再生,并去除任何仍结合的分子。然后在开始下一次运行之前,色谱柱需要在起始缓冲液中重新平衡。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-by-iec][b]离子交换层析蛋白纯化[/b][/url]详情可以关注:[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-by-iec[/font][/font]
[b]简 介[/b]1975年,Porath等人提出了一种新的纯化方法-固定化金属鳌合层析,利用金属离子(Ni2+,Cu2+等)与氨基酸表面的残基(如组氨酸的咪唑基)的配位鳌合作用,来纯化与金属离子有亲和作用的蛋白质。组氨酸标签由于分子量小,几乎不干扰靶蛋白的功能、活性和结构而被广泛的使用。固定的金属离子亲和层析是纯化组氨酸标签蛋白的最常用方法。[b]组氨酸标签蛋白的纯化工具[/b]月旭Ni亲和填料Ni Tanrose 6FF(NTA)Ni Tanrose 6FF(NTA)亲和介质是将金属离子Ni2+鳌合在以氨三乙酸为配基的6%高度交联的琼脂糖凝胶上形成的亲和层析介质。月旭科技研发的Ni Tanrose 6FF(NTA)不仅纯化纯度较高,通过控制合理的Ni离子密度,结合载量可达到~40mgHis标签蛋白/ml介质,可以用于各种表达来源(如大肠杆菌、酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞)的组氨酸标签(6xHis-tagged)蛋白的纯化。NTA含有四个螯合区,较一般的三齿螯合剂能更好的结合Ni2+。6xHis可与Ni2+螯合,从而使His标签蛋白结合在Ni Tanrose 6FF(NTA)纯化介质上,未结合的蛋白被洗涤下去,结合在介质上的蛋白经过一定浓度的咪唑或低pH缓冲液被温和的洗脱下来,从而得到高纯度的目标蛋白。具有载量高、选择性好、易于再生、成本低等优点。有了它,再也不用担心完不成纯化任务了。PreCot Ni 6FF(NTA)是Ni Tanrose 6FF(NTA)的1ml和5ml预装柱,用来纯化6xHis-tagged蛋白,可以使用注射器、蠕动泵,或者液相层析系统(例如AKTA或FPLC)。[b]Ni Tanrose 6FF(NTA)应用案例预装柱:[/b]PreCot Ni 6FF(NTA) 5ml[b]样品:[/b]含有His标签蛋白(大肠杆菌表达)[b]平衡液A:[/b]50mM Tris-HCl,0.5M NaCl,20mM咪唑pH8.0[b]洗脱液B:[/b]50mM Tris-HCl,0.5M NaCl,0.5M 咪唑,pH8.0[b]流速:[/b]平衡、洗脱-1.0ml/min上样-0.5ml/min[align=center][img=,600,283]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/09/201909061457288940_2085_932_3.jpg!w628x297.jpg[/img][/align][align=center][color=#595959]PreCot Ni 6FF(NTA)纯化His标签蛋白的纯化色谱图[/color][/align][color=#595959][/color][align=center][color=#595959][img=,600,507]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/09/201909061500136459_713_932_3.jpg!w459x388.jpg[/img][/color][/align][align=center][color=#595959][/color][/align][align=center]备注:1-3(样品和平衡液中不含咪唑);[/align][align=center]4-6(样品和平衡液中含20mM咪唑)[/align][color=#595959]1:原液[/color][color=#595959]2:流穿[/color][color=#595959]3:洗脱(100%B[/color][color=#595959])[/color][color=#595959]4:原液[/color][color=#595959]5:流穿[/color][color=#595959]6:洗(100%B)[/color][align=left][/align]由于宿主蛋白中也存在组氨酸和/或半胱氨酸氨基酸残基,其他的非特异性蛋白与靶蛋白一起与金属离子亲和层析填料结合,造成纯化样品纯度不高。提高样品中的咪唑浓度,组氨酸标签蛋白通过Ni Tanrose 6FF(NTA),可以一步纯化得到85%以上纯度的纯化样品。[align=center][img=,300,183]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/09/201909061502393331_9248_932_3.jpg!w690x422.jpg[/img] [img=,300,194]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/09/201909061502479331_4768_932_3.jpg!w690x447.jpg[/img][/align][align=center][color=#595959]月旭科技提供各种规格的层析填料预装柱,关注月旭科技公众号,欢迎咨询申请免费试用![/color][/align]
[b]职位名称:[/b]蛋白纯化工程师/经理[b]职位描述/要求:[/b]收藏职位信息液相色谱填料的技术应用,需配合公司销售人员对大区客户提供应用技术方案解决服务。1、根据客户需求,为客户推荐合适的产品,为销售制定和执行销售计划;2、负责公司生物大分子层析填料及层析设备的售后服务;3、帮助销售拓展客户及渠道,给销售培训相关层析技术;4、能够为客户纯化相关蛋白样品,给其制定合理的纯化方案。任职资格:1、生物工程或相关专业本科及以上学历,生物制药、生物化工、药学、免疫学等相关专业;2、两年以上生物制药企业纯化工作经验,熟练使用AKTA等层析系统;’3、具有在相关填料企业应用经验者优先;4、具备良好的沟通能力及自我管理能力;做事细心、认真,责任心强;富有团队合作精神;5、优秀应届生或1年以内工作经验者也可以培养。[b]公司介绍:[/b] 月旭科技(上海)股份有限公司2003年8月在上海张江高科技园区注册成立,2011年在浙江金华成立全资子公司,2014年10月完成股份制改造,2015年5月在全国中小企业股份转让系统(新三板)挂牌上市(股票代码:832463)。月旭科技集研发、生产、销售和服务为一体,致力为客户提供色谱分离分析技术、产品和整体解决方案。色谱技术广泛应用于生物医药、食品安全检测、环境监测、精细化工等关系民生并处于快速发...[url=https://www.instrument.com.cn/job/user/job/position/70433]查看全部[/url]
随着常规分子生物学研究的深入,越来越多的生物实验室日常需要测量的核酸、蛋白样品量也在不断地加大。传统的分光光度计虽然已经非常普及,但由于需要在测量后清洗比色杯,实际上消耗了不少宝贵的研究时间。同时,由于核酸样品的体积较小,即使使用昂贵的微量石英比色杯(容积数十ul左右),也往往需要对原始样品进行稀释,从而带来可能的操作偏差。对于一些稀有的样品来说,稀释即意味着测量后无法回收,同样也会对后续研究带来更高成本。因此,无需比色杯,仅需数ul即可测定样品浓度的超微量分光光度计现在受到很多实验室的关注和欢迎。NanoVue是GE Healthcare公司于2008年最新推出超微量分光光度计。GE Healthcare公司的分光光度计品牌Ultrospec和GeneQuant在市场上已经有了十多年的历史,在用户中有着很好的信誉和口碑。NanoVue在该系列仪器的基础上延续了出众的检测性能,同时大大改进了检测的光路设计,通过专利的检测技术使检测样品的体积最小仅需0.5ul, 190-1100nm的宽范围连续波长设计较市场上同类仪器宽了一倍左右,使得能够轻松检测核酸、蛋白样品和Cydye荧光染料标记物的浓度。仪器内置了RNA、DNA 和寡核苷酸浓度和纯度测定方法;寡核苷酸转换因子,分子量,理论Tm计算功能;包括一般紫外、Bradford、 Biuret、BCA、Lowry的蛋白定量法;以及波长扫描,动力学,标准曲线,多波长测定等扩展功能。除了强大的检测性能外,NanoVue还在许多操作性能上进行了精心的设计,能够给用户带来众多全新的体验,主要包括以下方面:1 唯一不需电脑就能在仪器面板上直接检测的超微量分光光度计。仪器配置了一块大面积高分辨率的背光液晶屏和操作面板。相对于点样后转去电脑控制,再回去仪器清洁的过程,NanoVue不仅节省了购买电脑的支出,同时点样,按键测量,擦拭一气呵成。可以通过整合的打印机直接打印分析数据。当然,如果需要在电脑上保存分析数据,NanoVue同样支持USB或蓝牙连接电脑,将珍贵的实验数据永久记录下来。2 通过特别设计的疏水点样表面,能够很容易回收稀有的样品,并且有效避免多个测量间的样品交叉污染,提高测量的准确性。NanoVue的点样表面具有专利设计,表面坚固而且光滑。不管是样品回收还是测量完直接擦去都非常简易,不会有任何样品粘附残留在点样面上。而且点样面耐用性也非常出众,保守估计可以至少测量20000个样品以上。3 最快的检测速度。NanoVue通过独特的光路设计,使得所有样品的检测都能够在5秒钟之内完成,把微量分光光度计的测量时间提升到了一个新的高度。而且NanoVue具备即开即用功能,避免了许多分光光度计开机需要预热的麻烦,真正做到省时省力。由此可见,NanoVue不仅性能出众,其易用性和灵活性也是目前超微量分光光度计中出类拔萃的。通过试用NanoVue的体验,使用者可以完全感受到,原来,核酸蛋白的测定可以这么简单,这么快速!目前,NanoVue已经正式在中国推出,欲了解更多的信息,请直接联系GE公司。
[font=宋体]蛋白质纯化系统是一种用于从混合物中纯化目标蛋白的设备和方法。它结合了多种技术和步骤,可以有效地分离和纯化蛋白质,提供高纯度和高活性的目标蛋白。蛋白质纯化系统是实现蛋白质纯化的关键装置,它结合了各种分离、富集和纯化方法,帮助科研工作者实现蛋白质的高纯度提取。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]蛋白质纯化系统的基本原理[/b][/font][font=宋体]蛋白质纯化系统主要依据蛋白质的特性利用不同的物理化学方法进行分离和纯化。下面将介绍几种常见的蛋白质纯化系统的基本原理。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]①[url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-by-ac][b]亲和层析[/b][/url][/font][/font][font=宋体]亲和层析是一种基于蛋白质的特异性与配体的亲和性相互作用来实现分离和纯化的方法。在亲和层析过程中,蛋白质溶液通过填充有配体的柱子,与配体结合形成复合物,而非特异性结合的其他组分被洗脱。最后,通过改变条件来破坏蛋白质与配体的结合,从而使得目标蛋白质得以纯化。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]②凝胶过滤层析[/font][font=宋体]凝胶过滤层析是一种基于蛋白质大小差异来进行分离的方法。在凝胶过滤层析中,待纯化的蛋白质溶液通过一系列的凝胶层析柱,大分子的蛋白质不能进入凝胶颗粒的内部,而小分子的蛋白质则可以进入凝胶颗粒内部。通过调整凝胶的孔径,可以实现对目标蛋白质的选择性分离和纯化。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]③[url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-by-iec][b]离子交换层析[/b][/url][/font][/font][font=宋体][font=宋体]离子交换层析是一种基于蛋白质与固定在柱子上的离子交换基的电荷相互作用来实现分离和纯化的方法。在离子交换层析中,蛋白质溶液通过带有离子交换基的柱子,与柱子上的离子交换基之间发生相互作用。通过改变溶液的离子浓度和[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值,可以实现对蛋白质的选择性吸附和洗脱。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]④逆流层析[/font][font=宋体]逆流层析是一种基于分子质量和电荷差异来实现蛋白质分离和纯化的方法。在逆流层析中,蛋白质溶液通过填充有逆流层析介质的柱子,溶液在反向流动的情况下通过层析柱。由于不同蛋白质之间的分子质量和电荷差异,它们在逆流层析介质中的移动速度不同,从而实现对蛋白质的分离和纯化。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]蛋白质纯化系统的应用[/b][/font][font=宋体]蛋白质纯化系统在生物医药领域有着广泛的应用,下面将介绍几个常见的应用场景。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]①药物研发[/font][font=宋体]蛋白质纯化系统在药物研发中起到了非常重要的作用。通过蛋白质纯化系统,科研人员可以从复杂的生物样品中高效纯化出目标蛋白质,为药物研发提供了可靠的原料和工具。蛋白质纯化系统不仅可以提高药物研发的效率,还可以确保药物的纯度和质量,从而提高药物的疗效和安全性。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]②生物学研究[/font][font=宋体]在生物学研究中,蛋白质纯化系统被广泛应用于蛋白质相互作用研究、蛋白质结构解析和功能分析等方面。通过蛋白质纯化系统,科研人员可以从不同的细胞和组织中提取目标蛋白质,进一步研究它们之间的相互关系和作用机制。蛋白质纯化系统还可以用于蛋白质结构解析,帮助科学家揭示蛋白质的三维结构以及其功能。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]③临床诊断[/font][font=宋体]蛋白质纯化系统在临床诊断中也起到了重要的作用。通过蛋白质纯化系统,医生可以从患者的生物样本中纯化出特定的蛋白质标志物,用于疾病早期诊断、病情监测和治疗评估等方面。蛋白质纯化系统在临床诊断中的应用可以帮助医生及早发现疾病,提高诊断的准确性和效率。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体]蛋白质纯化系统是实现蛋白质纯化的重要装置,它结合了多种分离、富集和纯化方法,帮助科研人员高效地提取目标蛋白质。蛋白质纯化系统的应用广泛,不仅在药物研发、生物学研究和临床诊断等领域发挥重要作用,还为科学家揭开蛋白质的结构和功能提供了有力的支持。通过不断的技术创新和优化,蛋白质纯化系统将更好地满足科研和临床的需求,推动生物医药领域的发展。[/font][font=Calibri] [/font]
很多从事生物药品研发和检验的兄弟一直徘徊在AKTA explorer和各种名目的HPLC之间,这次小弟带来的是GE集团的科学家(即被收购的瑞典阿玛西亚公司,拥有著名的AKTA系列层析系统)编写的工业层析专著,希望大家喜欢
[color=#dc143c]最近版里原创热风呼呼的刮~~于是我也特来跟风积极参与!近来一直在做包涵体的复性与纯化,就特来与大家分享,希望大家多多支持、指点[em09511][/color][b]1.包涵体的分离纯化[/b] 蛋白质的纯化是基因工程下游的关键内容,以包涵体形式表达的重组蛋白质的纯化研究一直是重组基因工程药物研究中的热点和难点。重组蛋白在宿主系统中高水平表达时,无论是用原核表达体系或酵母表达体系甚至高等真核表达体系,都可形成包涵体。蛋白表达后的分离纯化对蛋白的规模化生产也是至关重要的,所以本实验通过采用稀释复性、透析复性、离子交换层析、凝胶过滤层析等实验方法,研究探讨对分离纯化以及蛋白复性的最佳方法和条件。[b]1.2.1包涵体的复性[/b] 重组蛋白质在分离纯化的过程中, 必须维持一定的浓度和生物活性形式, 以及防止被降解。从包涵体中获得有生物活性的蛋白,需要寻找一种简单而有效的复性方法。在小规模的蛋白复性研究及其进一步的纯化中,稀释复性是最常用的方法。但是稀释复性在商业规模生产中具有一定的缺陷,如需要较大体积的复性液,以及需要附加的浓缩步骤。许多其他方法也已发展起来,例如:透析、渗透、低分子量辅助物添加复性、离子和无离子表面活性剂辅助复性、聚乙烯乙二醇辅助复性等方法。 在折叠反应中,从伸展态到中间体的速度是非常快的,只需要几毫秒,但从中间体转变为天然态的过程比较缓慢,是一个限速过程。聚集过程与复性过程相互竞争,故而应尽量避免聚集体的产生。一般认为,蛋白质在复性过程中涉及两种疏水作用,一是分子内的疏水相互作用,可促进蛋白质正确折叠 一是部分折叠的肽链分子间的疏水相互作用,在复性过程中,部分折叠的中间体的疏水簇外露,分子间的疏水相互作用会导致蛋白质聚集。蛋白质的立体结构虽然由其氨基酸的顺序决定,然而伸展肤链折叠为天然活性结构的过程还受到周围环境的影响,如温度、pH值、离子强度、复性时间等因素的影响。[b]1.2.2包涵体离子交换层析纯化[/b] 为了获得高纯度的活性蛋白, 需要对复性的蛋白质进行进一步纯化。根据分离目标蛋白的特点(如P I、疏水性、氨基酸组成, 分子量大小、表面电荷的分布状况) , 然后确定分离方法, 从而正确选择最有效的分离介质,本实验采用SP Sepharose F.F 阳离子交换层析分离纯化重组蛋白 离子交换层析是以蛋白质分子净电荷和表面电荷分布为分离基础的。具体说就是利用蛋白质带电性的差异,在离子吸附剂上静电吸附能力不同,用不同的pH 离子强度洗脱液洗脱,从而使蛋白质分离的柱层析方法。离子交换又分为阴离子交换和阳离子交换。离子交换剂又有强弱之分,强的离子交换剂在整个pH 范围内都是离子化的,而弱的离子交换剂通常仅在pH6~9 之间是离子化状态,因而后者对所适用的pH 范围又有了进一步的限制。 在洗脱方式上,阳离子交换主要是改变pH ,它主要应用于等电点大于5 的蛋白质。20 种氨基酸中,大部分带正电或负电,这是IEC 应用范围广的原因。离子交换层析处理量大,附载系数高,一步缩小样品体积很多。离子交换层析去除杂质能力强,如对热原质,核酸、及电荷性有差别的蛋白均可去除。它还有一个特点,利用蛋白质在不同pH 和盐浓度下带电性的不同,通过不同条件下应用同种类型或不同类型介质,分步使目标蛋白质达到提纯目的,这是除亲和柱层析外,别的柱层析达不到的分离能力。离子交换层析原则上可放在纯化工艺的任何一步,它属吸附型层析,单步损失也较大。
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