连体式冷冻制备传输系统

童艳丽今年的华东电镜会比以往时候来得更晚一些，经历了漫长的等待，终于10月23日在美丽的宜兴市东氿湖畔举行。会上徕卡纳米技术产品经理童艳丽以《连接即未来 徕卡真空冷冻传输系统》为题做了一个专题报告。报告结束后，老师们对此显示出浓厚的兴趣，纷纷前往展台咨询。徕卡真空冷冻传输系统之核心部分EM VCT500设计理念及其在冷冻扫描电镜，冷冻FIB，真空传输等三个应用方向的相关制样流程及应用实例。徕卡EM VCT500样品传输杆是真空冷冻传输系统的核心，它可以与徕卡各种电镜制样设备相连接，依据样品应用需求实现各种方式样品制备；另一方面，它可以与各种外部设备/分析仪器相连接，依据样品应用需求实现各种方式分析检测。 徕卡EM VCT500样品传输杆是一款货真价实的真空冷冻传输系统，可以长时间保持高真空和低温，并且通过一系列紧密的内部硬件设计及图形化操作界面，实现用户直觉化操作，轻松实现真空冷冻传输。 Cryo-SEM应用方向一个经典制样流程： 如需了解更多详情，可咨询徕卡客户服务热线：400-630-7761.

喷雾干燥 & 冷冻干燥技术制备白细胞介素粉体研究趋化因子是一种小的(8-12 kDa)细胞因子，参与许多病理过程，因此是重要的靶点。它们通常由不同类型的细胞(如白细胞)分泌，并通过与同源 G 蛋白偶联受体的细胞表面结合来介导生物学效应。趋化因子配体和受体有 50 多种，根据其初级氨基酸序列的半胱氨酸残基排列进行分类和命名。趋化因子可用于(慢性)炎症性疾病、癌症和感染性疾病的治疗应用。目前，市场上有两种基于白介素的产品，即重组白介素-11预白介素(Neumega® )和重组人白细胞介素-2醛白介素(Proleukin® )。Neumega® 是一种由大肠杆菌重组 DNA 技术产生的血小板生成生长因子，可静脉给药。皮下应用的 Proleukin® 是一种淋巴因子，也是通过转基因大肠杆菌的重组 DNA 技术产生的。为了增加储存的稳定性、保持药物的生物活性，Neumega® 和 Proleukin® 都采用冷冻干燥的工艺，制成冻干粉制剂使用。虽然冷冻干燥（FD）是一种广泛使用的技术，具有多种优点，可以快速、温和干燥，但喷雾干燥(SD)可以缩短工艺周期，并可以在常压下进行加热处理。同时，颗粒的性质，如粒径、固体状态和残余水含量可以通过参数进行调节。这里必须指出的是，蛋白质的变性或/和展开也可能发生在 SD 过程中，SD 过程的放大是复杂和高成本的。SD 的另一个重要挑战是粉体回收率低于 100%，这对于高成本疗法和工艺开发来说是一个问题，特别是放大到最终设备上。对于白细胞介素，已经有了一些成功的冷冻干燥研究案例。然而，据我们所知，SD 作为一种替代方法尚未被研究过。这项工作的目的是开发一种 SD 工艺，使模型白介素以一种保留白介素结合亲和力和生物活性的方式干燥。为此，我们使用了模型白细胞介素，探索喷雾干燥工艺的潜在可行性，并对比分析冷冻干燥和喷雾干燥工艺对白细胞介素活性影响。1材料在磷酸盐缓冲盐水中提供野生型CXCL8（CXCL8，72个氨基酸，8.4kDa）、CXCL8的突变体（dnCXCL8，66个氨基酸，7.7kDa）等各种试剂。将蛋白质溶液用PBS稀释至最终蛋白质浓度为1mg/ml，即1% w/w。冷冻干燥机喷雾干燥仪：BUCHI B-90 HP▲ 步琦纳米喷雾干燥仪 B-90 HP2实验过程配方溶液分别采用如下冻干程序（表1）和喷干程序（表2）进行样品制备。干燥后的样品在 4-8℃ 的氩气干燥器中保存 12 周。并进行粉体的物性表征。表1，适用于所有配方中 FD 程序。箭头表示间隔内的压力或温度增减。间隔冻干工艺时间间隔[hh：mm]温度[℃] 压力[mbar]0速冻，放入小瓶～00:20-196atm.1冻结，平衡02:00-20atm.2初级干燥00:30↑ -15↓ 0.0453_01:00-150.0454_10:00↑ 00.0455_08:0000.0456二级干燥01:30↑ +200.0457_02:30+200.0458结束，封装小瓶_～+25atm.表2，SD 工艺参数及由此产生的过程变量。通过使用纯缓冲液进行测量来确定以 ml/min 为单位的喷射速率。实验过程中喷嘴温度升高，喷嘴温度是在 SD 过程结束时观察到的温度 。进口温度[℃]喷雾速率[%]空气流量[l/min] 粒度[μm]6030（～0.51ml/min）100±27.0过程变量出口温度[℃]压力[mbar]喷头温度[℃]29±131±152±23实验结果1、 通过激光衍射分析测定粒径SD 蛋白粉通过 HELOS 系统的激光衍射分析进行筛选。在 SD 后和第4周、第8周和第12周将粉末直接湿分散在甲苯中进行分析。通过对同一批次 SD 粉的三个样品进行测量，确定了 PSD 分析的标准误差。不分析 FD 粉末的粒度，因为冻干物通常是最终的药物剂型，没有对饼状进行研磨或破碎，只分析了 SD 粉。图1 通过激光衍射分析测定粉体粒径，在 10 次超声脉冲后进行测量，SD 粉末的 PSD 随储存时间的变化不大。除了在第0周分析的 SD dnCXCL8 喷雾粉末和在第8周分析的 SD HSA-dnCXCL8 外，所有干粉的跨度都小于 2.8。在测量这两个 PSD 时，一些较大的团块将分布分别向 517μm 和 129μm 的 x90 方向移动(图1b、图1c)，导致 PSD 变宽。2、 圆二色光谱测定结构利用圆二色谱(CD)对 SD 和 FD 后的蛋白质二级结构的变化进行评价，并将其与未处理蛋白质的光谱进行比较。CD 光谱在设备上记录，波长为 190-250nm，使用 1mm 石英比色皿，响应时间 4s。5 次扫描取平均值，并用 PBS 校正背景，计算平均残基椭圆率，并绘制不同曲线。由 图4 显示，经过 SD 和 FD 后的 CD 光谱显示只有轻微的结构变化。液体白细胞介素制剂在 90℃ 温度下热处理5分钟，SD 温度在 60℃ 温度下热处理 5 分钟，会产生轻微的沉淀，但结构保持完整 (图4A)。dnCXCL8 也出现类似的结果。SD 和 FD 均未引起二级结构的改变。即使加热蛋白质也未引起二级结构的变化(图4B)。虽然 HSA-dnCXCL8 具有更明确的α-螺旋结构，但 SD 和 FD 后没有变化。在 90℃ 热处理 5min 后二级结构发生了完全损失 (图4C)。3、 离液展开测定稳定性采用荧光光谱检测gdmhcl在0-6M范围内诱导展开，并在SD和FD后和储存3个月后测定蛋白质稳定性。将样品稀释至0.7μM，并在室温下平衡5min。CXCL8 和dnCXCL8 的激发波长为 280nm, HSA-dnCXCL8 的激发波长为 290nm。在 300-400nm 范围内测量所有3种蛋白的发射光谱，并将狭缝宽度设置为 5nm。蛋白质展开的特征是波长移位，并使用 Origin 2019b 的玻尔兹曼进行计算得到如下图谱。图5 显示，展开的过渡中点和 CXCL8 的相对协同性在很大程度上没有变化。对于 dnCXCL8，无法建立明确的过渡点。对于 FD HSA-dnCXCL8 也观察到了同样的情况。对于参考光谱和 FD 光谱（HSA-dnCXCL8 除外），显示了标准偏差，如图中的误差条所示。4、 趋化性测试：博伊登室测定为了检测 SD 和 FD 后以及储存三个月后的白细胞介素的活性，进行了趋化试验测定中性粒细胞的活化和迁移，预计 CXCL8 具有促迁移作用，而 dnCXCL8 和HSA-dnCXCL8 不应表现出任何中性粒细胞迁移激活。使用 NIS-Elements BR 3.2 软件进行细胞计数，计算每种情况下的平均值和标准偏差。上图显示储存 12 周后 SD CXCL8 的 CI 较对照显著增加 (图6a, p = 0.05)。SD 和 FD CXCL8 在中性粒细胞活化和迁移方面没有变化。对于 dnCXCL8, SD 和 FD 样本的 CI 与各自的参考 CI 相当。HSA-dnCXCL8 在 SD 后 (即W0) 的 CI 显著增加 (图6c, p = 0.04)。4结论本研究针对磷酸盐缓冲盐水配制的白细胞介素（未添加额外添加剂）采用 SD 和 FD 两种干燥方式分别进行深入评估。用纯缓冲液进行的 DoE 确定了一种最佳的 SD 工艺，在 60℃ 的干燥空气温度、100 L/min 的空气流速和 30% 的喷雾速率下具有较高产率，这表明即使是热不稳定的蛋白质也可以喷雾干燥。此外，SD 工艺比 FD 更快、更有效，理论上导致每分钟产量比 FD 高 130 倍（甚至考虑到 SD 的产量仅 63% 和 77% 之间）。FD 粉末呈现饼状结构，而 SD 粉末的粒度为 X5020μm。这为粒子工程提供了定义粒子特性的可能性，允许更广泛的应用。RM 是可比较的，同样二级结构没有改变，结合亲和力和活性保持至少 12 周，这些结果表明白细胞介素的 SD 是可行的。未来，将继续优化本研究中的工艺参数，并将其转移到具有工业型台式喷雾干燥器中，以更大规模地系统考察粉体产量和工艺时间，从而对 SD 进行全面评估，作为 FD 的替代方案，实现经济快捷高效的生产！5文献来源Comparing freeze drying and spray drying of interleukins using model protein CXCL8 and its variants

生物大分子的三维结构可以直观地揭示其生物学功能、细胞内进程以及探索其在疾病中发挥作用的方式。冷冻电镜（cryo-electron microscopy,cryo-EM）单颗粒分析技术通过对生物大分子的直接成像进行高分辨率结构测定，已成为结构生物学的重要研究手段。冷冻电镜单颗粒分析技术需要对生物大分子溶液的冷冻样品采集大量电子显微数据，以进行三维结构解析，因此高质量的冷冻样品制备在其中起着至关重要的作用。良好的制样方法需要能够简便地、可控地制备出接近理想状态的生物大分子冷冻样品。诺贝尔化学奖获得者雅克杜博切特（Jacques Dubochet）等人于1984年发明了冷冻样品制备的滤纸夹置法（Pipet-blot-plunge），至今仍然是冷冻电镜样品制备的主要手段。在这种传统的制样方法中，研究人员难以精确控制样品冰层厚度和大分子颗粒分布，导致冷冻样品的均一性和可重复性较差。越来越多的证据表明，在样品被冷冻之前的瞬间，生物大分子会吸附在超薄的液体层的气液界面（Air-water interface, AWI）上，导致生物大分子的颗粒结构损伤、变性或产生优势取向，减低了高分辨率冷冻电镜结构分析的效率和成功性。如何获取可重复的高质量的生物大分子冷冻样品仍然是冷冻电镜技术应用中的一个难题。图1. ESI-cryoPrep方法设计和仪器装置示意图4月25日，清华大学生命科学学院王宏伟课题组和精密仪器系欧阳证、周晓煜课题组在《自然方法学》（Nature Methods）在线发表了题为“电喷雾辅助的冷冻电镜样品制备方法用以减轻界面吸附效应”（Electrospray-assisted cryo-EM sample preparation to mitigate interfacial effects）的研究论文。研究采用非变性质谱（Native mass spectrometry, native MS）中广泛使用的电喷雾电离（Electrospray ionization, ESI）技术，设计并搭建了一种新型冷冻样品制备装置ESI-cryoPrep（图1），成功实现了无需滤纸夹吸的冷冻样品制备，并获得了多种生物大分子近原子分辨率的三维结构。研究表明，ESI-cryoPrep可以有效地将生物大分子颗粒完整嵌入无定形态薄层冰中，避免其吸附在空气-水、固体-水界面上，并对该装置制备生物大分子冷冻样品过程中的界面模型进行了机理阐释。ESI-cryoPrep以“软”电离技术ESI为基础，通过向蛋白溶液施加高电压形成大量带电的蛋白液滴，可以有效地减少蛋白的变性与碎裂。在电场的驱动下，带电液滴飞向电镜载网的过程中伴随着去溶剂化的进行；液滴表面的电荷密度激增至瑞利极限导致库仑裂变形成带电的次级液滴；这一过程循环往复直至液滴最终沉积在电镜载网上；收集到带电液滴的电镜载网被插入液氮冷却的液态乙烷中即可实现对液滴的快速冷冻。该过程完全省却了滤纸的夹吸，避免了滤纸材料对液体和生物大分子的影响。因为液滴表面的小分子离子形成了双电层效应，生物大分子与液体的界面被隔绝开，从而避免了生物大分子吸附到气液或固液界面上，更好地保持了生物大分子的天然结构。该研究首次对ESI液滴中的生物大分子的天然结构（Native structures）进行了直接测定，指导获得ESI的“软着陆”电离参数进行冷冻制样与非变性质谱分析。该工作是冷冻电镜与质谱技术的交叉融合，共同致力于解答生物大分子结构解析与分析的科学问题。研究团队在搭建的设备上，经过多次摸索确定了制备高质量冷冻样品的相关参数。这些参数既能满足保存高比例完整结构生物大分子颗粒的需求，又能促进带电液滴在附着电镜载网表面的扩展和浸润。研究团队运用优化的ESI-cryoPrep装置制备了五种生物大分子的高质量冷冻样品，获得了与目标生物大分子尺寸相对应的理想冰层厚度，并实现了全部测试样品70Sribosome、20Sproteasome、apo-ferritin、ACE2和streptavidin的高分辨率三维结构解析，分辨率分别为2.7[gf]c5[/gf]、2.0[gf]c5[/gf]、2.1[gf]c5[/gf]、3.3[gf]c5[/gf]和1.9[gf]c5[/gf]。研究团队对冷冻电镜数据进行了深入的挖掘与分析，发现与预期假设一致的结果。ESI-cryoPrep可以有效地将生物大分子颗粒完整嵌入无定形态冰的薄层中间，抑制目标生物大分子在空气-水或石墨烯-水界面的吸附（图2），从而避免蛋白质颗粒的结构损伤或者优势取向问题。研究工作提出了电荷残留模型，阐明了电喷雾电离产生的液滴表面的电荷不均匀分布保护蛋白质颗粒免于界面吸附的作用和机制。这种学科交叉的研究成果不仅将为冷冻电镜样品制备提供应用价值，还将对冷冻电镜技术和非变性质谱领域的交叉和发展产生积极影响，为更多创新应用开辟新的可能性。自主研发的高质量冷冻电镜样品制备装置，一方面可以缩短结构解析的漫长探索过程，更高效地获得高分辨三维结构，分析其作用机理；另一方面也提升了原创研发具有自主知识产权和高精尖技术的能力，减少对国外相关仪器和设备的依赖。图2.ESI-cryoPrep方法制备的冷冻样品中蛋白质颗粒在断层成像中的代表性空间分布清华大学生命科学学院2017级博士生杨梓和精密仪器系2018级博士生范菁津（已毕业）为该论文共同第一作者，清华大学生命科学学院教授王宏伟，精密仪器系教授欧阳证和副教授周晓煜为论文共同通讯作者。清华大学生命科学学院王家副研究员和范潇博士等为课题的启动和推进作出重要贡献。研究得到国家自然科学基金、腾讯基金会等的资助，并得到清华大学冷冻电镜中心和计算中心的技术支持。

面向原位结构解析的冷冻电子断层成像（cryo-ET）是研究生物大分子复合物的原位高分辨率结构及其相互作用关系的关键技术。但受限于电子束穿透能力，需要先利用聚焦离子束（cryo-FIB）将细胞和组织样品减薄成200纳米左右的薄片后才能进行cryo-ET数据采集。冷冻光电关联成像技术可以为cryo-FIB精准制备包含特定目标结构的冷冻含水切片提供荧光定位指导，但是冷冻荧光显微镜的光学分辨能力以及光镜、电镜图像的对齐精度是制约冷冻光电关联实验成功率的关键因素。　　为了解决上述技术瓶颈，中国科学院生物物理研究所蛋白质科学研究平台生物成像中心一直致力于开发新型冷冻光电关联成像技术，在前期自主研发的冷冻光电关联成像高真空光学冷台HOPE（Journal of Structural Biology，2017）基础上，通过引入结构光照明成像技术，成功研制了冷冻结构光照明成像系统HOPE-SIM，实现了横向优于200纳米的光学分辨率，以及优于150纳米的光镜-聚焦离子束三维关联对齐精度，相关研究成果于4月29日在线发表在《通讯-生物》（Communications Biology）上。 　　光镜-电镜关联成像技术（Correlative Light and Electron Microscopy，CLEM），是利用荧光特异标记对特定生物大分子或亚细胞结构进行荧光示踪，实现对整个细胞的三维荧光定位成像，之后通过荧光图像和电镜图像的配准，获得荧光标记信号和电镜超微结构的关联信息。冷冻光电关联成像技术的应用方向之一，是通过关联图像，指示出荧光标记的结构在电镜图像中的具体位置，实现对荧光示踪目标物的电镜高分辨率结构解析。而得益于光镜成像对生物样品的无损特性，可以在不损伤样品的前提下获得样品内部的三维荧光定位信息，再通过光电关联成像流程和关联对齐软件，将三维荧光图像与扫描电镜图像关联匹配，实现在荧光信号的指导下进行cryo-FIB对目标区域的减薄加工。如此，便可以避免“盲切”，实现对荧光指示目标物的指导切割，以期提高冷冻聚焦离子束技术用于电子断层成像切片样品制备的效率。 　　目前，光电关联成像指导cryo-FIB减薄技术流程的实现方式有多种类型，根据系统构成可以分为光镜电镜分体式光电关联成像系统和集成型光电关联成像系统。生物成像中心技术团队自2013年开始专注于冷冻光电关联成像技术方法学研究，在光镜电镜分体式光电关联成像系统研制方面， 于2017年自主研制了一款可搭载在倒置荧光显微镜上的高真空光学冷台HOPE（High-vacuum Optical Platform for cryo-CLEM），HOPE可与透射电镜冷冻样品杆适配连接，完成荧光定位后样品将随冷冻样品杆被转移进电镜当中进行高分辨率数据采集，同时结合光电关联定位软件，可以实现大视野光学定位成像与电镜成像的匹配。HOPE采用冷冻样品杆来实现冷冻光镜成像、冷冻传输以及冷冻透射电镜成像，有效避免了光电关联成像过程中对冷冻载网的反复夹取，保证了冷冻样品的完整性和同一性，有效提高了关联成功率和实验效率。　　然而，基于宽场成像技术的HOPE系统受限于光学衍射极限和冷冻光学成像装置的空间限制等，仅能使用长工作距离、低数值孔径的冷冻荧光成像系统，所能达到的横向分辨率约为400-500纳米，纵向分辨率则达微米级，这对于精准捕获数微米厚度细胞内百纳米尺度的目标结构而言，是非常不利的。　　结构光照明超分辨荧光成像技术在能提高宽场荧光显微镜一倍分辨率的前提下，还具备不需要特殊的荧光探针、成像速度快、辐照密度低等技术优势，是所有超分辨成像技术中最适合应用到冷冻环境中对冷冻样品进行高分辨率成像的技术。因此，研究团队选择了结构光照明成像技术作为提高冷冻荧光成像分辨率的手段，基于倒置荧光显微镜自主研制了大腔室高真空冷台，腔室内置0.9NA长工作距离光学物镜和防污染器系统（ACS和cryo-box）、外接真空传输系统（TPS）以及冷冻电镜样品杆（cryo-holder）适配器。同时，借助三维结构光照明（SIM）光路，实现了真空环境下对冷冻样品的三维结构光照明成像，在提高冷冻光镜分辨率的同时，有效增强了光电关联成像样品传输过程中对冷冻样品的保护。图1 冷冻结构光照明成像系统HOPE-SIM。a.HOPE-SIM硬件组成，b. HOPE-SIM设计原理图，c. HOPE-SIM光路原理图 　　借助HOPE-SIM高分辨率冷冻光电关联成像系统以及自主编写的三维关联对齐软件3D-View，团队成功制备了包含宿主细胞内鼠疱疹病毒（图2）和海拉细胞内荧光标记的中心体（图3）的细胞切片样品，通过冷冻电子断层原位结构分析图像处理流程和软件分析其在原位结构。实验结果表明，基于HOPE-SIM技术的高精度冷冻光电方法可以实现优于150nm的三维对齐精度，为尺寸较大、胞内丰度高的目标物的原位捕获提供了一种高效、精确的靶向冷冻聚焦离子束减薄技术方案。图2 基于 HOPE-SIM冷冻光电联技术捕获宿主细胞中的MHV-68病毒颗粒。a.冷冻明场透射光图像；b.HOPE-SIM荧光图像的z投影。绿色，荧光微球。红色，MHV-68病毒；c将b中的荧光图像与a中的明场图像合并，以显示目标信号的位置；d.冷冻SIM和冷冻FIB图像之间的三维关联匹配；e.对目标区域减薄后的冷冻FIB图像；f.减薄后冷冻扫描电镜图像，与b中冷冻SIM图像的融合；g.制备的冷冻含水切片的冷冻透射电镜显微照片（3600倍）；h.冷冻断层扫描成像，放大倍率为64000倍，显示了被捕获的病毒颗粒。 图3 基于HOPE-SIM技术流程精准捕获海拉细胞内红色荧光标记的中心体。a.3D-View光-电关联软件获得的冷冻结构光-cryo-FIB关联配准图；b.cryo-FIB对红色荧光标记所在区域进行减薄；c.cryo-FIB减薄获得的200nm冷冻含水切片；d.冷冻含水切片在透射电镜下8700倍成像，黄色框线内为目标中心体；e.目标中心体的cryo-ET数据采集（53000倍）激光指向位置主动稳定系统示意图。 　　相关研究工作得到国家重点研发计划、国家自然科学基金、中科院战略性先导科技专项（B类）等项目的资助。　　值得一提的是，在集成型光电关联成像系统研制方面， 2023年1月，《自然-方法》（Nature Methods）报道了中科院院士、生物物理所研究员徐涛和研究员纪伟团队研发的cryo-CLIEM系统和生物成像中心技术团队自主研发的三束共焦成像系统ELI-TriScope系统，在双束扫描电镜真空腔室内集成了光学成像系统，避免了样品传输过程，有效提高了冷冻光电关联成像的精度和成功率。其中生物成像中心技术团队自主研发ELI-TriScope系统集成了一个基于冷冻样品杆的传输系统（cryo-transfer system），并在冷冻样品下方嵌入了一个倒置荧光成像系统（cryo-STAR system），从而实现电子束(E)、光束(L)和离子束(I)被精确地聚焦到同一点上，可以在cryo-FIB减薄的同时实时监控目标分子的荧光信号，显著提高了cryo-FIB减薄技术对特定目标物的捕获精度，将制备冷冻含水切片的时间成本从每片2-2.5小时降低到约0.8小时。 　　生物成像中心技术团队研发的基于结构光照明技术的HOPE-SIM系统可以实现三维高分辨率冷冻荧光成像，同时还可以通过冷冻样品杆直接衔接三束共焦光电关联成像系统ELI-TriScope，实现高分辨三维冷冻荧光成像的同时，完成后续原位荧光实时监控聚焦离子束减薄全技术流程，有效提高了冷冻聚焦离子束减薄的效率、准确性、成功率和样品制备通量，为原位结构解析研究提供了成功的解决方案，在未来的原位结构生物学中有巨大应用潜力。

揭示生物学样本和材料样本原本无法观察到的内部结构冷冻断裂是一种将冰冻样本劈裂以露出其内部结构的技术。冷冻蚀刻是指让样本表面的冰在真空中升华，以便露出原本无法观察到的断裂面细节。金属/碳复合镀膜能够实现样本在SEM（块面）或TEM（复型）中的成像，主要用于研究如细胞器、细胞膜，细胞层和乳胶。这项技术传统上用于生物学应用，但现在逐渐在物理学和材料科学中展现出重要意义。近年来，研究人员通过冷冻断裂电子显微镜，尤其是冷冻复型免疫标记（FRIL），对膜蛋白在动态细胞过程中所发挥的作用有了新的见解。作者：Gisela Höflinger图1：麦叶上的蚜虫适合于电子显微镜的环境电子显微镜的样品室通过抽真空处理降至极低压力。置于这种环境下的活细胞无法有效保全结构，因为细胞构成中的大部分水分会快速蒸发。生物样本的制备方法有很多种。样品材料被（固定）保存，这样后续脱水对原位结构的破坏最小，同时可以使用环境扫描电镜（SEM）或者将水冷冻。高压冷冻是观察自然状态下含水结构的唯一方法。高压冷冻所形成的冰不是六边形冰（从水变为六边形冰时体积会增加）而是无定形冰，因此体积保持不变。所以，对渗透和温度变化敏感的结构得以保留（见文章“高压冷冻基础介绍”）。要观察诸如细胞器、细胞膜、乳胶或液体的表面界面等结构，冷冻断裂是唯一的方法。通过刀片（或类似物）或释放弹簧负载的外力来破开冷冻样本，并沿着最小阻力线断裂样本。图2：冷冻断裂（来源：http://en.wikibooks.org/wiki/Structural_Biochemistry/Lipids/Membrane_Fluidity） 水的升华与凝结 – 冷冻蚀刻与污染要暴露冷冻断裂面，需要把冰去除。这就需要通过把断裂面的冰升华去除以保存样品的结构。升华的过程是冰不经过液态过程直接转化为气态。而液态过程会导致样品体积和结构的破坏。图3：ES，细胞外表面；PF，细胞膜冷冻断裂面；EF，细胞膜外层冷冻断裂面；FS，细胞膜内表面；Cyt，细胞质水的升华/冷凝过程取决于特定温度下的饱和压力，以及水或冰在室内的有效水分压。注意：良好的真空度会降低水分压。例如：温度为-120℃的冰或冰冻样本饱和压力约为10-7 mbar。如果样品室内达到这个压力，则冷凝和蒸发处于平衡状态。蒸发的分子数量等于冷凝的分子数量。在更高压力下，冷凝速度要快于升华速度 – 因此冰晶会在样本表面上生长。必须采取一切手段来避免这种情况。样本上方一个较冷（比样本更冷）的冷阱会降低局部压力，从而起到了冷凝阱的作用。从样本中带出的水分子优先附着在较冷的表面上。在低于饱和压力的压力下，更多的分子升华而不是冷凝，同时会发生冷冻蚀刻。执行冷冻蚀刻直到样本完全无冰，这一过程称为冷冻干燥。仅适用于合理时间内执行的小样本。该过程分为几个步骤，需要从大约-120℃加热到-60℃，同时在每个步骤上使温度保持一定时间。该过程需要几天的时间来完成。图4：饱和蒸汽压力（感谢Umrath 1982提供的图片）样本温度低于-120℃时，蚀刻速度非常慢，蚀刻持续时间会增加到不切实际的程度。如果真空室的压力固定，则可以通过提高样本温度来提高蚀刻速度。对于生物样本，要特别小心温度高于-90℃。蚀刻速度会大幅提高。另外，要注意玻璃态冰中形成六边形冰晶从而导致脱水伪像。纯水的理论升华速度会降低，因为：• 样本深处的水升华速度比表面的水更慢。• 盐和大分子溶剂会降低升华速度。• 生物样本中大量存在的结合水会降低升华速度。通过冷冻断裂生成图像冷冻断裂和冷冻蚀刻技术往往采用高真空精细镀膜技术，将超细腻重金属和碳薄膜沉积于断裂表面。冷冻断裂样本在一定角度下用金属覆盖，然后在碳背衬膜（徕卡EM ACE600冷冻断裂或徕卡EM ACE900与徕卡EM VCT500）上生成复型进行TEM成像或在SEM的试块面上进行成像。对于这两种方法，冷冻断裂表面经过一定的蚀刻时间后以相同的方式进行镀膜。首先在一定角度下进行一层薄的（2-7nm）重金属镀膜，以形成地形对比度（阴影）。其次再针对重金属薄膜，在90°下进行一层厚的碳层（15-20nm）镀膜，以稳定超薄电子束蒸发。此时的蚀刻处理会停止。要对极小的结构进行成像，需要在极低的角度（2–8°）镀膜重金属并在镀膜期间旋转样本。这样可增加细丝状及其它细小结构的对比度。此项技术又称为小角度旋转投影。蒸镀重金属薄膜需要采用电子束蒸发镀膜技术。这种镀膜技术可实现精细定向沉积。碳的支撑层稳定了未被金属覆盖的结构。随着温度的升高，这些结构会改变它们的轮廓，样本不会完全导电，复型也不会粘在一起。冷冻断裂酵母的单向投影图5：低温SEM，BSE（背散射电子）图像。Walther P, Wehrli E, Hermann R, Müller M.（1995）双层镀膜获取高分辨率低温SEM。J Microsc. 179, 229-237。图6：复型，TEM图像（感谢Electronmicroscopy ETH Zürich提供图片）。Walther P, Wehrli E, Hermann R, Müller M.（1995）双层镀膜获取高分辨率低温SEM。J Microsc. 179, 229-237。图7：徕卡高压冷冻，真空冷冻传输至冷冻断裂系统中，利用电子束发射枪和旋转样本底座来进行冷冻蚀刻和低温镀膜。徕卡真空冷冻传输至低温SEM。油/水基样品，–100℃（升华）3分钟暴露油脂结构。图8：徕卡高压冷冻，真空冷冻传输至冷冻断裂系统中，利用电子束发射枪和旋转样本底座来进行冷冻蚀刻和低温镀膜。徕卡真空冷冻传输至低温SEM。原生生物游仆虫混合培养的羽纹硅藻。感谢英国波特斯巴NIBSC的Roland Fleck博士提供图片图9：徕卡冷冻断裂系统及徕卡真空冷冻传输至低温SEM的HPF、冷冻断裂、冷冻蚀刻和低温镀膜。油/水基乳液破裂，露出洋葱状薄片结构，形成液滴。感谢汉堡拜尔斯多夫Stefan Wiesner博士提供的图片。图10：TEM中的酵母细胞复型。经徕卡高压冷冻和徕卡冷冻断裂复型制备。感谢Elektronenmikroskopie ETH Zürich提供的图片。图11：大麦叶上的真菌。安装于徕卡冷冻断裂仪样本台上，并通过冷却样本台在液氮下进行冷冻。徕卡冷冻断裂仪对样品进行部分冷冻干燥（在更高的样本温度下冷冻干燥）。使用钨镀膜。徕卡真空冷冻传输至低温FESEM 5keV。相关产品徕卡EM ACE900 高端EM样本制备冷冻断裂系统徕卡EM VCT500了解更多：徕卡官网

应用电子显微镜高分辨本领和高放大倍率，对物体组织形貌和结构特征进行分析和研究的近代材料物理测试方法。但样品的制作直接影响着结果的准确性，所以制作满足要求的样品就成了整个试验的重点。现将一些常见电镜制样方法简介如下。透射电镜（TEM）TEM放大倍数可达近百万，可以看到在光学显微镜下无法看清的0.1~0.2nm的细微结构。它的样品制备工作量非常大，约占全部测试工作的半数以上或90%以上，是十分关键的。图 透射电镜样品台常用样品台分为两种：顶入式样品台和侧插式样品台顶入式样品台要求样品室空间大，一次可放入多个（常见为6个）样品网，样品网盛载杯呈环状排列，使用时可以依靠机械手装置进行依次交换。优点：每观察完多个样品后，才在更换样品时破坏一次样品室的真空，比较方便、省时间。缺点：但是需要的空间过大，使样品远离下方物镜，不宜减小物镜焦距而影响电镜分辨力。侧插式样品台样品台制成杆状，样品网载放在前端，只能盛放1～2个铜网。优点：样品台体积较小且占用空间较少，可布置于物镜内上部，利于提高电镜分辨率。缺点：不可能一次投入多个样品网中，每换一个样品都要打破一次样品室内真空，稍有不方便。支撑网的选择：支撑网有多种材质如Cu、Ni、Be、尼龙等，选择时要与待分析样品的成分分开。图 筛网尺寸制备原则• 简单• 不破坏样品表面• 获得尽量大的可观测薄区主要制备方法• 支持膜法：• 复型法：• 超薄切片法：• 薄膜试样（电解双喷减薄，离子减薄，FIB等）1. 支持膜法适用范围：纳米颗粒（防止样品从铜网缝隙中漏出）支持膜种类：• 微栅膜• FIB微栅膜• 纯碳微栅膜• 多孔碳膜• Quantifoil规则多孔膜• C-flat纯碳多孔支持膜等图 筛网尺寸制备过程：• 制备支持膜：在铜网上覆盖一层有机膜后喷碳• 选择分散剂：根据样品性质选择，常用无水乙醇• 分散：使用超声波或搅拌将粉末分散成悬浮液液滴上支持膜（两种方法）：（a）滴样：用镊子将覆盖支持膜的铜网夹住，并用滴管向支持膜上滴入数滴悬浮液，使其保持夹持状态直至干燥为止（推荐）（b）捞取：用镊子夹持载网浸入溶液捞取液滴（缺点：双面挂样制备关键和注意事项：• 样品粉末能否在支持膜上均匀分布• 确保实验过程中未带入污染物2.复型法基本原理：利用电子束透明膜（碳、塑料、氧化物薄膜）复制材料表面或者断口形态的间接试样制备方法。适用范围：在电镜中易起变化的样品和难以制成薄膜的试样。样品要求：非晶态、分子尺寸小、导电性、导热性良好，耐轰击，有足够的强度和刚度。复型法分类：塑料一级复型、碳一级复型、塑料-碳二级复型、萃取复型。（1）塑料一级复型样品上滴特定溶液，溶液在样表面展平，多余的用滤纸吸掉，溶剂蒸发后样品表面留下一层100nm左右的塑料薄膜。图 塑料一级复型（2）碳一级复型利用真空镀膜装置将碳膜蒸镀于试样表面，将试样置于真空镀膜装置内，将试样置于所配的分离液内经电解或者化学分离得到分离碳膜便可应用于分析。图 碳一级复型（3）萃取复型图 萃取复型（4）塑料-碳二级复型通俗地说，塑料的一级复型中又制造出碳复型即为二级复型。分辨率相当于塑料的一级复型，对试样无损害，耐电子束辐照，复型带重金属投影。图 碳二级复型3. 超薄切片法适用范围：生物组织、较软的无机材料等。1.取材 2.固定 3.漂洗 4.乙醇或丙酮系列脱水 5.渗透 6.包埋 7.聚合 8.修块 9.切片 10.捞片染色 11.电镜观察注意事项：• 迅速：最短时间内取样,投入固定液• 体积小：所取样品体积不超过1mm3• 轻：轻轻操作，使用锋利器械，避免拉、锯、压• 准确：所取部位有代表性• 低温：在0～4℃内操作4.离子剪薄法适用范围：用于非金属材料或非均匀金属制备过程：• 预处理：按预定取向切割成薄片，机械抛光减薄到几十μm，把边长/直径切割至3mm。• 装入离子轰击装置：• 抛光：获得平坦而宽大的薄区。图 离子剪薄法5.电解双喷减薄法适用范围：只能制备金属试样，首选大块金属。样品准备：• 磨抛厚度均匀，避免穿孔偏• 样品保证清洁• 多准备一些试样，试合适的条件制备步骤：• 样品接正极、电解液接负极，电解液从两侧喷向样品• 样品穿孔后，自动停机• 获得中间薄，边缘厚，呈面窝状的TEM薄膜样品电解液选择：根据样品；不损伤仪器优点：条件易控制，快速，重复性好，成功率较高。图 电解双喷减薄法原理图6. 聚焦离子束法（FIB）适用范围：适用于半导体器件的高精度切割与线路修复。原理：采用从液态金属镓中提取离子束，并通过调节束流强度对指定区域进行快速精细处理。方法：铣削阶梯法，削薄法（H-bar）铣削阶梯法：• 预处理：铣削出两个反向的阶梯槽，中间留出极薄的TEM试样• 标记：刻蚀出定位标记• 定位：用离子束扫描定位标记，确定铣削区域• 铣削：自动或手动完成铣削加工图 铣削阶梯法制备的样品TEM照片削薄法（H-bar）：• 使用机械切割和研磨等方法将试样做到50-100μm厚• 使用FIB沉积一层Pt保护层• 使用FIB铣削掉两侧的材料图 削薄法工作示意图扫描电镜（SEM）扫描电镜样品制备比透射电镜样品制备简单，无需包埋和切片。样品要求：样品须为固体；达到无毒、无放射性、无污染、无磁性、无水分、组分稳定。制备原则：• 表面受到污染的试样，要在不破坏试样表面结构的前提下进行适当清洗，然后烘干；• 新断开的断口或断面，一般不需要进行处理，以免破坏断口或表面的结构状态；• 要侵蚀的试样表面或断口应清洗干净并烘干；• 磁性样品预先去磁；• 试样大小要适合仪器专用样品座尺寸。常用方法：块状样品块状导电材料：无需制样，用导电胶把试样粘结在样品座上，直接观察。块状非导电（或导电性能差）材料：先使用镀膜法处理样品，以避免电荷累积，影响图像质量。图 块状样品制备示意图粉末样品直接分散法：• 双面胶粘于铜片表面，借助棉球使被测样品颗粒直接撒布于其上，并用洗耳球对样品进行轻吹以去除粘附的、没有被牢固地固定的粒子。• 将装有颗粒的玻璃片翻起，对着已准备好的试样台用小镊子或者玻璃棒轻敲，使细颗粒能够均匀地落入试样台上。超声分散法：将少量颗粒放入烧杯内，加乙醇适量，超声震荡5分钟，然后用滴管加入铜片内，使其自然干燥。镀膜法真空镀膜真空蒸发镀膜法（简称真空蒸镀）就是将蒸发容器内需要成膜的原材料在真空室内进行加热，将蒸发容器内的原子或分子气化并从表面逸出，一种形成蒸气流并将其射入固体（称为衬底或基片）的表面以冷凝成固态薄膜的工艺。离子溅射镀膜原理：离子溅射镀膜在局部真空溅射室内辉光放电生成正向气体离子；在阴极（靶）与阳极（试样）之间电压加速时，荷正电离子轰击阴极表面并原子化阴极表面材料；生成的中性原子，向四面八方飞溅，射落在样品表面，从而在样品表面生成了均匀的薄膜。特点：• 对任何待镀材料来说，溅射都是可能的，只要它能够制成靶材即可（适用于难蒸发材料和不容易获得高纯度化合物的相应薄膜材料的制备）；• 溅射所获得的薄膜和基片结合较好；• 消耗贵金属少，每次仅约几毫克；• 溅射工艺具有良好的可重复性，膜厚可控，同时能在大范围基片表面得到厚度均一的膜。• 溅射方法：直流溅射、射频溅射、磁控溅射、反应溅射。1．直流溅射图 直流溅射沉积装置示意图已经很少使用了，由于沉积速率过低~0.1μm/min、基片加热、靶材导电、直流电压和气压都必须很高。优点：装置简单，容易控制，支模重复性好。缺点：工作气压高（10-2Torr）,高真空泵不起作用；沉积速率低，基片升温高，只能用金属靶（绝缘靶导致正离子累积）2．射频溅射图 射频溅射工作示意图射频频率：13.56MHz特点：• 电子作振荡运动，延长了路径，不再需要高压。• 射频溅射可制备绝缘介质薄膜• 射频溅射的负偏压作用，使之类似直流溅射。3．磁控溅射原理：用磁场使电子移动方向发生变化，电子移动轨迹被束缚与拉长，工作气体中电子电离几率增加，电子能量得到高效利用。由此使得正离子轰击靶材产生的靶材溅射变得更高效，可以在更低气压下溅射，而被正交电磁场捆绑的电子则会被束缚于靶材周围，仅能在它们能量消耗殆尽后沉积下来的基片中溅射。图 磁控溅射原理示意图特点：低温，高速，有效解决了直流溅射中基片温升高和溅射速率低两大难题。缺点：• 靶材利用率低（10%-30%），靶表面不均匀溅射；• 反应性磁控溅射中的电弧问题；• 薄膜不够均匀• 溅射装置比较复杂反应溅射溅射气体添加氮气、氧气、烷类等少量反应气体，反应气体和靶材原子共同沉积于衬底上，对于某些不容易发现块材而制造靶材的物质，或者溅射时薄膜成分易偏离靶材原成分，均可用此法进行。反应气体：O2，N2，NH3，CH4，H2S等镀膜操作将制备完成的样品台放置在样品托上，放入离子溅射仪，加盖，旋紧螺丝并开启电源抽真空。当真空趋于稳定时，在5 X10-1mmHg左右，按下“启动”键，用调节针阀把电流调节到6~8mA,开始镀金，镀金1分钟后即自动停止镀金，关好电源、打开顶盖螺丝、放掉气体、取下试样即成。图 Cressington 108Auto高性能离子溅射仪冷冻电镜制样冷冻电镜是扫描电镜超低温冷冻制样传输技术（Cryo-SEM）可以实现液体，半液体和电子束敏感样品的直接观测，例如生物和高分子材料。样品经超低温冷冻，断裂和镀膜制样（喷金/喷碳）后可由冷冻传输系统置于电镜中的冷台上（温度可至-185°C）观察。适用范围：塑料，橡胶及高分子材料，组织化学，细胞化学等样品制备要求：能够保持本身的结构，又能抗脱水和电子辐射方法：（a）通过快速冷冻使含水样品中的水处于玻璃态，也就是在亲水的支持膜上将含水样品包埋在一层较样品略高的薄冰内。图 液氮冷冻（b）采用喷雾冷冻装置（spray-freezing equipment），结合基质混合冷冻技术（spray-freezing），可在极短时间内将两种溶液（如受体和配体）混合（ms量级），然后快速冷冻。图 喷雾冷冻装置金相制样金相分析是材料研究领域中非常重要的一个环节，也是材料内部组织研究的一种主要方法。利用定量金相学原理通过对二维金相试样磨面或者薄膜进行金相显微组织测量与计算，确定合金组织在三维空间中的形态，进而建立合金成分，组织与性能之间定量关系。制样过程：样品切割、镶嵌样品、机械制样、检验样品样品切割方法：金相最适合的切割方法是湿式切割轮切割法。优点：所造成的损伤与所用的时间相比是最小的切割片的选择：主要依据材料的硬度和韧性进行选择。图 砂轮片的选择• 陶瓷和烧结碳化物：金刚石切割片• 钢铁材料：氧化铝（Al2O3）切割片和CBN切割片• 有色金属：碳化硅（SiC）切割片镶嵌样品金相样品镶嵌技术（以下简称镶样）是将试样尺寸小或形状不规则造成研磨抛光痛苦时镶嵌或夹持，以便于试样抛磨，提高工作效率和实验精度的一种工艺方法。镶样一般分为冷镶和热镶。冷镶应用：对于温度和压力极为敏感材料、和微裂纹试样要进行冷镶，会使试样组织不发生改变。图 冷镶示意图冷镶材料：一般包括环氧树脂、丙烯酸树脂、聚脂树脂。• 环氧树脂：收缩率低，固化时间长；边缘保护好，用于真空浸渍，适用于多孔性材料；• 丙烯酸树脂：黄或白，固化时间较短，适合批量大、形状不规整样品镶样；对于含裂纹或者孔隙的试件渗透性更好；尤其是对印刷电路板的封装；• 聚酯树脂：黄色、透明、固化时间较长；适用于大批量无孔隙的试样制样，适用期长；真空浸渍：多孔材料（如陶瓷或热喷涂层）需真空浸渍。树脂能增强这些脆弱材料并能尽量减少制备缺陷（例如抽出，开裂或未开孔等）。只有环氧树脂由于其低粘度、低蒸汽压的性质，才能在真空浸渍中使用。荧光染料和环氧树脂可以被混合以方便地发现荧光灯中所有被充填的孔隙。图 冷镶制样 图片来源：司特尔公司热镶应用：适用于低温及压力不大的情况下不发生变形的样品。图 热镶示意图镶材料：目前，通常多用塑料做镶嵌材料。镶嵌材料包括热凝性塑料（如胶木粉），热塑性塑料（如聚氯乙烯），冷凝性塑料（环氧树脂加固化剂）和医用牙托粉与牙托水。胶木粉不透光、色泽多样、且较坚硬、样品不易倒角、但抗强酸、强碱耐腐蚀性较差。聚氯乙烯呈半透明或透明状，抗酸碱耐腐蚀性能良好，但柔软。热镶试样图片来源：司特尔公司机械制样机械制样可分两种操作：研磨和抛光1.研磨研磨的终极目标就是要得到损伤最小的平表面。这些小损伤会在后续抛光中短时间内被去除。研磨分为粗磨和细磨两个过程。• 粗磨粗磨过程就是把全部试样表面变成一个类似的面，用比较粗的固定研磨颗粒就能快速磨去材料。• 精磨 精磨会使样品有些微变形，但这些变形在抛光过程中就会消除掉。2.抛光抛光就像研磨，还得除去前道工序造成的伤害。它可以分为金刚石抛光与氧化物抛光两大工序。• 金刚石抛光唯有把金刚石当作研磨料来抛光才有可能在最快的时间内得到最佳研磨平面。其原因是金刚石非常坚硬，几乎能切割所有的物质和相态。• 氧化物抛光 对于特别软、韧性的样品，须采用氧化物抛光法。抛光在抛光布上完成。金刚石抛光时还须用到润滑剂。研磨和抛光设备检验样品打磨后的检测部位变的发亮，在观察组织的时候需要先将试样的检测部位腐蚀掉，做好之后使用酒精冲淋，使用吹风机吹扫。

天然植物吉洛伊的冷冻干燥处理吉洛伊(Giloy)也称为心叶青牛胆(Tinospora Cordifolia),是一种印度阿育吠陀草药，在印度医学中得到认可并长时间使用；在我国湖北西部、陕西南部、四川东部、西藏东南部、贵州、江西、福建及两广地区均有分布。在梵语中，吉洛伊被称为“仙露”(Amrita)，译为“永生之根”，源于它具有丰富的药用特性。在传统的印度医学中，吉罗伊是最有用的阿育吠陀草药之一。它被用作：增强免疫力治疗慢性发热促进消化治疗糖尿病减少压力和焦虑减轻哮喘症状治疗关节炎减缓肿瘤生长提高视力减少年龄痕迹防治呼吸系统问题在本应用中冷冻干燥作为一种干燥方法来保存吉洛伊。由于实验过程处于无液态水、无氧气和低温的操作环境下，冷冻干燥一直被认为是最适合保存天然植物及生物材料的技术之一。它用一种温和的方式来去除水分，同时获得最高质量的最终产品，能够保留生物活性化合物，以及质地、颜色和气味，同时减少样品重量更加方便运输。吉洛伊茎和其研磨的膏体可以直接进行冷冻干燥处理，干燥后的吉洛伊茎和膏体可以研磨成粉末，直接食用或做成果汁享用。尽管冷冻干燥是一种温和的干燥过程可以保留产品的特性，但某些特质：例如颜色、气味、质地、复水性、体积特性、流动性、水分活性以及营养物质和挥发性化合物的保留，都可能受到干燥过程的影响。例如，生物活性化合物和营养质量的保留，会受氧含量或过高温度的影响。因此，在制定冻干方法时应考虑到这点：以吉罗伊为例，如果温度超过45°C，营养成分可能会受到影响，在设置冷冻干燥方法时必须注意这一参数。 1仪器和实验材料冻干机 BUCHI Lyovapor&trade L-200 Pro，搭配可加热搁板冻干软件 BUCHI Lyovapor&trade Software真空泵 Pfeiffer Duo 6”海尔低温冰箱 -40°C 2实验流程样品准备：新鲜采集的绿色吉洛伊茎 600g，切成长度约 5cm 块。用蒸馏水清洗干净后放入托盘中，连同搁板一起放入 -40℃ 冰箱中进行预冻。冻干参数设定：经过一夜深度冷冻后，冷冻的吉洛伊茎连同托盘和搁板一同被转移到 Lyovapor&trade L-200 冻干机中，冷冻干燥参数如下表所示。可加热搁板的初始加载温度设定为 -25℃，然后设定升温至0℃。此次冷冻干燥分为初级干燥和二级干燥两步，初级干燥时长约为 12 小时，二级干燥搁板温度设定为 40℃，持续时间 12 小时 30 分钟。为保护植物中营养物质不受破坏，因此搁板温度控制在 40℃ 以避免达到临界温度。 3 实验结果冷冻干燥前冷冻干燥后在冷冻干燥处理后，可观察到吉洛伊茎已成功干燥。从上图中可以看出植物外形未受任何影响，去除水分93.5%（下表）。描述重量（g）初始重量600最后重量172.58吉洛伊重量161.40总除水量%93.5 %本实验使用 LyovaporTM L-200 冷冻干燥机，采用一级和二级冷冻干燥编程的方法成功干燥吉洛伊植物茎。冷冻干燥是以温和并高效的方式除去产品中水分的技术，所以非常适合温和干燥吉洛伊这类天然植物。在干燥处理后，冻干的吉洛伊茎可以使用研磨机磨成粉，直接食用或制备成胶囊，也可以加入到果汁中，以获得其中植物性免疫活性成分增强身体免疫能力。4参考文献https://www.fda.gov/inspections-compliance-enforcement-and-criminal-investigations/warning-letters/emmbros-overseas-lifestyle-pvt-ltd-565631-02052019https://food.ndtv.com/health/10-amazing-benefits-of-giloy-the-root-of-immortality-1434732#:~:text=%E2%80%9CGiloy%20(Tinospora%20Cordifolia)%20is,of%20its%20abundant%20medicinal%20propertiesMayer, A.M. Harel, E. Polyphenol oxidases in plants. Phytochemistry 1979, 18, 193–215.Gibson, L.J. The hierarchical structure and mechanics of plant materials. J. R. Soc. Interface 2012, 9, 2749–2766.Kulkarni RC, Mandal AB, Munj CP, Dan A, Saxena A, Tyagi PK. Response of coloured broilers to dietary addition of geloi (Tinospora cordifolia) during extreme summer. Indian Journal of Poultry Science. 2011 46(1):70-74Bhattacharyya C, Bhattacharyya G. Therapeutic potential of Giloy, Tinospora cordifolia (Wild.) Hook. f. and Thomson (Menispermaceae): The magical herb of ayurveda. International Journal of Pharmac. Biol. Arch. 2013 4(4):558-584.

冷冻TEM薄片制备和冷冻体积成像的全新工作流程解决方案 蔡司冷冻关联工作流程联接了光学显微镜和双束电镜(FIB-SEM)，从而用于分析细胞的超微结构随着蔡司冷冻关联工作流程的发布，蔡司为生命科学研究团体提供了一种新的软硬件结合的冷冻显微镜解决方案。该工作流程将宽场显微镜、共聚焦显微镜和双束电镜(FIB-SEM)无缝地连接起来，且便于使用。该解决方案提供了针对冷冻关联工作流程需求而优化的硬件和软件，从荧光大分子的定位到高衬度体积成像和用于冷冻电子断层成像的薄片减薄。冷冻关联显微镜技术是一种新兴的大分子结构分析技术。由于细胞和组织的超微结构可以不带人为假象的保存下来，因此冷冻显微镜可以在接近自然的状态下观察细胞结构。然而，这项技术却给用户带来了复杂的挑战，例如耗时的样品制备和成像流程、去玻璃化、冰晶污染或样品丢失。“在蔡司，我们通常致力于确保研究人员能够更快地采集数据，更好地分析数据。借助蔡司的冷冻关联工作流程，我们正朝着简化和优化科学家的工作流程的方向迈出下一步，以便他们能够完全专注于自己的研究。” 蔡司研究显微镜解决方案负责人Michael Albiez博士强调道。各种研究领域，如细胞生物学、癌症研究、植物科学和发育生物学，都将受益于冷冻显微镜获得的超微结构信息。蔡司冷冻关联工作流程帮助研究人员更容易获得这一先进技术，使他们能够更快地评估样品的质量，获得高分辨率、高衬度的3D数据流，并简化TEM薄片制备的工作流程。简化的工作流程和样本的安全传输蔡司冷冻关联工作流程联接宽场显微镜或共聚焦显微镜（蔡司Axio Imager、蔡司LSM 900/980 with Airyscan）和双束电镜（蔡司Crossbeam），以实现体积成像和TEM薄片的高效制备。专用的配件简化了工作流程，并有助于在显微镜之间安全的转移玻璃化样品。这些部件与冷冻关联显微镜样品台台Linkam CMS196V³和冷冻传输系统Quorum PP3010Z兼容。数据管理由蔡司联用软件ZEN Connect负责。这一系列的工具都有助于增强成像效果。最高的成像性能贯穿全工作流程得益于适用于冷冻成像的物镜和蔡司Airyscan探测器的高灵敏度，蔡司共聚焦显微系统能够以高分辨率探测和定位蛋白质和细胞结构，同时温和的光照可以防止样品去玻璃化。蔡司双束电镜Crossbeam提供了高衬度体积成像-甚至样品没有经过重金属染色。这两种方式为彻底了解超微结构提供了有价值的功能和结构信息。在室温下使用可提高工作效率不同于其他解决方案，该工作流程中使用的蔡司显微镜不仅可用于冷冻显微镜技术，也可用于室温的应用。将设备从冷冻状态转换为室温状态非常快速且无需专业技术。这种灵活性为用户提供了更多的实验时间。成像平台可以从更高的利用率和更快的投资回报中受益。

俄勒冈州希尔斯伯勒市，2022年8月1日讯。赛默飞世尔科技推出了Thermo Scientific Arctis冷冻等离子体聚焦离子束电镜（Cryo-PFIB），这是一款全新的自动化显微镜，经过设计可用于加快冷冻电子断层成像（Cryo-ET）研究的步伐。冷冻电子断层成像（Cryo-ET）技术使得细胞生理环境中的蛋白质研究和其他分子的运行机制研究成为可能，与其他显微镜技术相比，其分辨率达到了前所未有的水平，而且可以在细胞生物学研究方面发挥巨大的潜力，包括传染性疾病、神经退行性疾病和其他具有全球影响力的结构生物学应用。然而，为冷冻电子断层成像技术制备最佳样品的过程仍然耗时且复杂。Arctis Cryo-PFIB通过为用户提供先进的自动化和全新的连接解决方案能力，可以解决工作流程中的多种挑战，与其他的解决方案相比，Arctis Cryo-PFIB极大地提高了通量，可以快速、持续制备适用于冷冻电子断层成像技术的样品。该系统旨在提供厚度均一的高质量样品，同时最大限度地降低样品污染风险。用户可以享受到内置一体化光电联用显微技术、专用等离子体FIB技术、先进的自动化和全新的连接功能，包括简化上样和样品转移功能。亮点包括：1、一体化光电联用显微镜技术（CLEM）：用于快速定位感兴趣的区域。2、等离子体FIB技术：用于快速减薄大块样品并快速定位到感兴趣的区域。3、自动化功能：可简化样品制备并实现远程操作，与当前基于镓的冷冻FIB解决方案相比，可实现长时间的自动化运行、可重复的结果和更高的通量。4、工作流程中的连通性：可简化将样品转移到Thermo Scientific Krios或Glacios冷冻透射电子显微镜（Cryo-TEM）的过程。Arctis Cryo-PFIB 配备了赛默飞世尔科技推出的行业领先的自动上样系统（Autoloader），可自动装载多达12个载网。全新的专用TomoGrid可以确保减薄后的样品与透射电子显微镜倾斜轴实现最佳对齐。如要报名参加9月21日的全球新品发布网络研讨会，请扫描下方二维码注册研讨会。

应用专家 肖丽国 期待已久的华东电镜会于10月24日在美丽的宜兴东氿湖畔落下帷幕，徕卡显微系统分别在材料分会与生命科学分会两个分会场进行专题报道，为大家介绍Leica在不同研究领域中的电镜制样解决方案。 生命科学专场中UM应用专家肖丽国在大家的心头种了一把草，通过介绍Leica在Cryo TEM与Cryo SEM方向的解决方案和多个应用实例，为大家安利了一套全新的电镜制样设备。图1 生命科学分会场专题报道自2017年的诺贝尔化学奖颁布，冷冻电镜技术就以不可阻挡的态势走进大家的视野。Leica作为专业的电镜制样设备专家，在冷冻电镜制样上有着全流程的解决方案。 Cryo TEM在Cryo TEM方向，想要实现在黑白成像的冷冻透射电镜中快速找到目标小样品，以前是非常困难的，耗时又费力。Leica结合自身的光学成像优势，推出了一套冷冻光电联用系统Thunder Imager EM Cryo CLEM，能够实现低温光学荧光成像。通过与各类电镜进行软件和硬件上的联用，利用荧光与电镜位置叠加，实现在电镜下快速寻找和成像，极大地提高了工作效率。图2 Thunder Imager EM Cryo CLEM 图3 样品展示Cryo SEM在Cryo SEM方向，Leica拥有真正的真空冷冻传输系统EM VCT500，在对低温样品进行安全传输和转移的同时，可以将常温SEM升级为冷冻SEM，实现冷冻扫描观察。当然，扫描不仅可以观察表面，Leica冷冻断裂镀膜系统EM ACE600可以实现冷冻断裂，将低温样品敲断后镀膜，通过EM VCT500即可转移至Cryo SEM中进行冷冻断面观察，实现立体断裂成像，极大扩宽了应用范围。图4 Cryo VCT500制样技术解决方案 图5 样品展示如需了解更多内容，请返回点击右下角联系我们吧！

真空冷冻干燥机制冷系统常见的故障及排除方法 真空冷冻干燥机广泛用于医学、制药、生物研究、化工和食品等领域。经冷冻干燥处理的物品易于长期保存，加水后能恢复到冻干前状态并保持原有生化特性。LGJ-18N系列立式冷冻干燥机，适用于实验室使用或少量生产，可满足大多数实验室常规冻干的要求。 　　真空冷冻干燥机制冷系统常见的故障及排除方法： 　　1)高压报警。出现高压报警的主要原因有: 　　①冷却水水温过高或冷却水量不足。 　　②冷凝器内部结垢，导致换热效率降低。 　　③压缩机工作时，低压管道发生泄漏，从而导致外界空气进入制冷系统。 　　④制冷管道存在未开足阀门或因管道被堵而造成排气不畅的情况。 　　解决办法: 　　①降低冷却水温度或增加水流量。 　　②清洗冷凝器的冷却水管路。 　　③对制冷管道进行检漏，如果在工作中无法实现该项操作，可将水冷凝器上方的截止阀打开，使存在于冷凝器中的空气排放出一部分。 　　④将压缩机管道.上的阀门开启到最大。 　　2)水压报警。水压报警的主要原因有: 　　①冷却水供水压力不足或供水泵不运转。 　　②水压力控制器故障。 　　解决办法: 　　①增大外部供水压力或检修供水泵。 　　②检查压力控制器的触头是否能正常工作或检查在其线路.上是否存在其他问题。 　　3)压缩机吸气温度异常。吸气温度异常的主要原因是膨胀阀调节不当，开启度过小或过大，导致回气量过小或过大。其解决办法是对膨阀进行调节，如回气量过大，应关小开启度，如回气量过小，应开大开启度，调节过程中以微调为主，多观察压缩机的回霜情况。 　　4)膨胀阀堵塞。堵塞分泌物物堵塞(脏堵)和冰堵塞两种。 　　①杂物堵塞。在堵塞不严重时，可用扳手轻轻敲打阀体，经振动使阀体疏通。若不奏效或膨胀阀很快又重新堵塞，则说明堵塞严重，应拆卸膨胀阀，对膨胀阀滤网进行清洗，清洗完后重新装上即可。 　　②冰堵。出现冰堵，应更换冷凝器出液端过滤器。 　　5)载冷剂泄漏 　　可用肉眼观察，查找板层，软管上的泄漏点。若发现可疑漏点，应放空板层或软管内的载冷剂，对泄漏点进行充压确认，确认后放气补好泄漏点，重新加入载冷剂并排出板层和软管内气体。

纵观历史，人类经历了三大能源利用阶段，分别是“火与薪柴”、“煤炭与蒸汽机”与“石油与内燃机”时期。古希腊神话中，普罗米修斯从太阳神阿波罗处盗火种给人类送来了文明，中国则有一万多年前“神鸟鸮啄木，灿然火出，圣人燧人氏故此钻木取火”的传说。荀子曰：“君子性非异也，善假于物也”。上万年间，人类借助着能源的内在力量延续着智慧与文明。从薪柴到煤炭、石油、天然气，人类也一直在探索更高效、便捷的能源形态。 随着化石能源的大量使用，能源危机和环境污染问题逐渐凸显，太阳能、风能、热能、潮汐能等能源在人类的智慧中应运而生。从资源到可再生资源的应用，人类窥到了“取之不尽用之不竭”的理想能源的冰山一角。而如何利用和控制好这些能源，则需要有效的能量转换和储能技术。 现如今，人类能源进程进入“新能源与可持续发展”阶段。新能源汽车势如破竹，动力电池和储能系统的重要性被推至历史高度。现有的动力电池和储能器件的性能与其组成部件的性能息息相关，为了提升其整体性能，研究人员需要对组成部件材料的物理和化学性质有更深入的了解。如果这些材料对空气和水分敏感，这项研究将更具挑战。 Thermo Scientific针对空气敏感样品开发了惰性气体/真空保护样品传输系统CleanConnect，为空气敏感材料表征开拓出了全新视野。惰性气体/真空保护样品转移工作流程能够帮助科研工作者拓展空气敏感材料的研究边界，探究更多未知领域。 产品介绍 CleanConnect 惰性气体/真空保护样品传输系统可与大多数 Thermo Scientific扫描电镜和双束电镜系统兼容。它主要由样品装载室、闸阀单元、真空控制装置、样品转移仓和转移杆组成。CleanConnect的真空系统可与扫描电镜或双束电镜集成，无需额外配置真空泵，仅需要60s即可完成抽真空过程。和传统的样品转移杆不同，CleanConnect创新性地使用了惰性气体进行样品保护，使得转移仓持续维持正压，ZUI大限度地保证样品与空气隔绝。CleanConnect系统配备的气压表可以实时显示转移仓中气压，使得用户对样品的气压状态有清晰的认识。CleanConnect的正压可以维持十个小时以上，可以实现样品长时间、长距离的转移。图1 赛默飞电镜惰性气体/真空保护样品传输系统CleanConnect™ 工作流程 利用CleanConnect与扫描电子显微镜进行联用时，可将空气敏感的样品在手套箱中转移至CleanConnect样品台中，随后将 CleanConnect与扫描电镜的样品交换仓进行对接，将样品转移至扫描电镜的样品台中，这样就实现了惰性气体保护下的隔绝空气地转移，随后再利用扫描电镜进行形貌观察、元素分析等。图2 惰性气体保护下将样品转移至赛默飞扫描电子显微镜 此外，CleanConnect也可加载在双束电镜上用于材料截面形貌的观察和TEM样品的制备。当需要观察空气敏感样品的内部显微结构时，先利用CleanConnect实现手套箱至双束电镜的转移，随后利用双束电镜的离子束对样品进行切割，再利用电子束对切割后的新鲜截面进行高分辨成像。如果期望实现原子尺度分辨率成像时，则可利用双束电镜制备TEM薄样，再使用CleanConnect将制备好的TEM薄样在手套箱中转移至TEM样品杆，再转移至透射电镜中完成纳米或原子尺度的高分辨成像。图3 惰性气体保护下将样品转移至双束电镜和透射电镜中进行纳米尺度分析 产品优势 CleanConnect的使用给电子显微镜用户带来了全新的体验，产品具有如下优势：1 保护样品避免与空气中的氧气、水分或二氧化碳发生反应，获取材料表面真实形貌与结构信息。2 CleanConnect系统适用于不同的SEM和DualBeam产品型号，对于有多台设备的实验室，CleanConnect可实现多设备之间的样品关联互通。3 CleanConnect系统兼容液氮冷冻台，样品从手套箱可以转移至双束电镜上的冷冻台上，使得样品在随后的的切割过程中免受离子束的热损伤。4 模块化的设计，符合人体工程学，可实现更便捷的样品转移。5 分离式的样品转移舱和转移杆设计,可以使CleanConnect从手套箱的小过渡仓直接进行快速转移，无需对手套箱进行改装。 产品应用 部分电池材料（如锂金属、硫基固态电解质、满充负极等）对水分和氧气非常敏感，因此在样品处理和转移过程中需要对其实施特殊保护以便于获取材料的真实形貌与结构信息。此外，固态电池的表征也需要在隔绝空气的条件下进行开展：例如固态电池材料的形貌表征、原位实验以表征枝晶在SEI（固态电解质界面）中横向生长形态以及由于硅材料体积膨胀导致的SEI不稳定性实验等。下面两图分别对比了锂金属和满充石墨负极样品在采用CleanConnect系统保护和在空气暴露后的形貌，结果表明CleanConnect有效保护了样品免受空气/水分污染，从而帮助研究者获取本真形貌结构信息，实现对样品更深入的分析研究。 图4 采用CleanConnect传输锂金属样品（左）和在空气中暴露2 min的锂金属（右） 图5 采用CleanConnect传输满充石墨负极样品（左）和在空气中暴露2 min的满充石墨阳极（右） 如果希望对锂金属进行原子尺度的表征，需要进行TEM样品制备。传统的Ga离子在室温下会与锂金属发生反应，难以用于锂金属的加工。Thermo Scientific研发的氙气等离子气体源的PFIB（Plasma FIB）可以实现锂金属透射样品的无损制备。为了避免锂金属暴露在空气中造成表面氧化，使用了CleanConnect进行样品传输，随后使用Cryo-PFIB技术进行样品冷冻制备和进一步的观察。图6是利用Cryo-PFIB技术在-178℃进行锂金属样品的TEM样品制备过程以及在TEM中观察到的样品形貌信息。图7TEM明场像中可以看到Li的碳化物与Li2CO3的分布，利用高分辨成像可以看到清晰的锂原子排列，可见在切割和转移过程中样品并未受到损伤或氧化。 图6 利用Cryo-PFIB进行TEM样品制备过程 图7 利用TEM进行明场像（中）及原子尺度的观察（右） CleanConnect除了可以应用在钠离子电池、钠硫电池、固态电池材料等空气敏感的电极材料以外，还非常适用于镁铝合金、钙钛矿材料、金属有机框架材料、催化剂等这些对空气敏感的材料表征。无论是在寻求替代能源的工作中，还是开发更强、更轻材料和高精尖的纳米技术研究中，都需要有利的仪器和工作流程来实现更深入的研究表征需求，以推进科学技术发展。我们相信随着CleanConnect系统在扫描电镜、双束电镜上的推广与普及，越来越多的科学家及工程师们能受惠于这一科技带来的对新材料研究的便捷，推进新材料、新产品研究的进程。 虽然人类无法实现永动机的美好愿望，但却可以更好地开发先进技术、更有效地使用能源，让人类文明生生不息。如今，科学家们仍致力于电池材料研究以实现电池技术的突破，旨在开发更安全、更高能量密度和功率性能的电池产品。赛默飞也一直在持续开发更先进的分析技术应用于电池研发和生产中，助力科学家们实现这一目标。未来赛默飞也会竭诚为广大科研与工业用户开发出更多满足客户需求的产品，帮助客户让世界更健康、更清洁、更安全！

自人类起源以来，从未停止过对能源的追寻和探索。许多科学家曾梦想发明永动机，一劳永逸地解决能源供给问题，然而热力学第一定律的发现使人们认识到“永动机”永远无法实现，于是人类只能继续踏上探索能源的漫漫征程。纵观历史，人类经历了三大能源利用阶段，分别是“火与薪柴”、“煤炭与蒸汽机”与“石油与内燃机”时期。古希腊神话中，普罗米修斯从太阳神阿波罗处盗火种给人类送来了文明，中国则有一万多年前“神鸟鸮啄木，灿然火出，圣人燧人氏故此钻木取火”的传说。荀子曰：“君子性非异也，善假于物也”。上万年间，人类借助着能源的内在力量延续着智慧与文明。从薪柴到煤炭、石油、天然气，人类也一直在探索更高效、便捷的能源形态。随着化石能源的大量使用，能源危机和环境污染问题逐渐凸显，太阳能、风能、热能、潮汐能等可再生能源在人类的智慧中应运而生。从不可再生资源到可再生资源的应用，人类窥到了“取之不尽用之不竭”的理想能源的冰山一角。而如何利用和控制好这些能源，则需要有效的能量转换和储能技术。现如今，人类能源进程进入“新能源与可持续发展”阶段。新能源汽车势如破竹，动力电池和储能系统的重要性被推至前所未有的历史高度。现有的动力电池和储能器件的性能与其组成部件的性能息息相关，为了提升其整体性能，研究人员需要对组成部件材料的物理和化学性质有更深入的了解。如果这些材料对空气和水分敏感，这项研究将更具挑战。 Thermo Scientific针对空气敏感样品开发了惰性气体/真空保护样品传输系统CleanConnect，为空气敏感材料表征开拓出了全新视野。惰性气体/真空保护样品转移工作流程能够帮助科研工作者拓展空气敏感材料的研究边界，探究更多未知领域。产品介绍CleanConnect 惰性气体/真空保护样品传输系统可与大多数 Thermo Scientific扫描电镜和双束电镜系统兼容。它主要由样品装载室、闸阀单元、真空控制装置、样品转移仓和转移杆组成。CleanConnect的真空系统可与扫描电镜或双束电镜集成，无需额外配置真空泵，仅需要60s即可完成抽真空过程。和传统的样品转移杆不同，CleanConnect创新性地使用了惰性气体进行样品保护，使得转移仓持续维持正压，最大限度地保证样品与空气隔绝。CleanConnect系统配备的气压表可以实时显示转移仓中气压，使得用户对样品的气压状态有清晰的认识。CleanConnect的正压可以维持十个小时以上，可以实现样品长时间、长距离的转移。工作流程利用CleanConnect与扫描电子显微镜进行联用时，可将空气敏感的样品在手套箱中转移至CleanConnect样品台中，随后将 CleanConnect与扫描电镜的样品交换仓进行对接，将样品转移至扫描电镜的样品台中，这样就实现了惰性气体保护下的隔绝空气地转移，随后再利用扫描电镜进行形貌观察、元素分析等。图1 惰性气体保护下将样品转移至赛默飞扫描电子显微镜此外，CleanConnect也可加载在双束电镜上用于材料截面形貌的观察和TEM样品的制备。当需要观察空气敏感样品的内部显微结构时，先利用CleanConnect实现手套箱至双束电镜的转移，随后利用双束电镜的离子束对样品进行切割，再利用电子束对切割后的新鲜截面进行高分辨成像。如果期望实现原子尺度分辨率成像时，则可利用双束电镜制备TEM薄样，再使用CleanConnect将制备好的TEM薄样在手套箱中转移至TEM样品杆，再转移至透射电镜中完成纳米或原子尺度的高分辨成像。图2 惰性气体保护下将样品转移至双束电镜和透射电镜中进行纳米尺度分析产品优势CleanConnect的使用给电子显微镜用户带来了前所未有的体验，产品具有如下优势：• 保护样品避免与空气中的氧气、水分或二氧化碳发生反应，获取材料表面真实形貌与结构信息。• CleanConnect系统适用于不同的SEM和DualBeam产品型号，对于有多台设备的实验室，CleanConnect可实现多设备之间的样品关联互通。• CleanConnect系统兼容液氮冷冻台，样品从手套箱可以转移至双束电镜上的冷冻台上，使得样品在随后的的切割过程中免受离子束的热损伤。• 模块化的设计，符合人体工程学，可实现更便捷的样品转移。• 分离式的样品转移舱和转移杆设计,可以使CleanConnect从手套箱的小过渡仓直接进行快速转移，无需对手套箱进行改装。产品应用部分电池材料（如锂金属、硫基固态电解质、满充负极等）对水分和氧气非常敏感，因此在样品处理和转移过程中需要对其实施特殊保护以便于获取材料的真实形貌与结构信息。此外，固态电池的表征也需要在隔绝空气的条件下进行开展：例如固态电池材料的形貌表征、原位实验以表征枝晶在SEI（固态电解质界面）中横向生长形态以及由于硅材料体积膨胀导致的SEI不稳定性实验等。下面两图分别对比了锂金属和满充石墨负极样品在采用CleanConnect系统保护和在空气暴露后的形貌，结果表明CleanConnect有效保护了样品免受空气/水分污染，从而帮助研究者获取本真形貌结构信息，实现对样品更深入的分析研究。图3 采用CleanConnect传输锂金属样品（左）和在空气中暴露2 min的锂金属（右）图4 采用CleanConnect传输满充石墨负极样品（左）和在空气中暴露2 min的满充石墨阳极（右）如果希望对锂金属进行原子尺度的表征，需要进行TEM样品制备。传统的Ga离子在室温下会与锂金属发生反应，难以用于锂金属的加工。Thermo Scientific研发的氙气等离子气体源的PFIB（Plasma FIB）可以实现锂金属透射样品的无损制备。为了避免锂金属暴露在空气中造成表面氧化，使用了CleanConnect进行样品传输，随后使用Cryo-PFIB技术进行样品冷冻制备和进一步的观察。5图是利用Cryo-PFIB技术在-178℃进行锂金属样品的TEM样品制备过程以及在TEM中观察到的样品形貌信息。图6TEM明场像中可以看到Li的碳化物与Li2CO3的分布，利用高分辨成像可以看到清晰的锂原子排列，可见在切割和转移过程中样品并未受到损伤或氧化。图5 利用Cryo-PFIB进行TEM样品制备过程图6 利用TEM进行明场像（中）及原子尺度的观察（右）图6 利用TEM进行明场像（中）及原子尺度的观察（右）CleanConnect除了可以应用在钠离子电池、钠硫电池、固态电池材料等空气敏感的电极材料以外，还非常适用于镁铝合金、钙钛矿材料、金属有机框架材料、催化剂等这些对空气敏感的材料表征。无论是在寻求替代能源的工作中，还是开发更强、更轻材料和高精尖的纳米技术研究中，都需要有利的仪器和工作流程来实现更深入的研究表征需求，以推进科学技术发展。我们相信随着CleanConnect系统在扫描电镜、双束电镜上的推广与普及，越来越多的科学家及工程师们能受惠于这一科技带来的对新材料研究的便捷，推进新材料、新产品研究的进程。虽然人类无法实现永动机的美好愿望，但却可以更好地开发先进技术、更有效地使用能源，让人类文明生生不息。如今，科学家们仍致力于电池材料研究以实现电池技术的突破，旨在开发更安全、更高能量密度和功率性能的电池产品。赛默飞也一直在持续开发更先进的分析技术应用于电池研发和生产中，助力科学家们实现这一目标。未来赛默飞也会竭诚为广大科研与工业用户开发出更多满足客户需求的产品，帮助客户让世界更健康、更清洁、更安全！

自人类起源以来，从未停止过对能源的追寻和探索。许多科学家曾梦想发明永动机，一劳永逸地解决能源供给问题，然而热力学第一定律的发现使人们认识到“永动机”永远无法实现，于是人类只能继续踏上探索能源的漫漫征程。纵观历史，人类经历了三大能源利用阶段，分别是“火与薪柴”、“煤炭与蒸汽机”与“石油与内燃机”时期。古希腊神话中，普罗米修斯从太阳神阿波罗处盗火种给人类送来了文明，中国则有一万多年前“神鸟鸮啄木，灿然火出，圣人燧人氏故此钻木取火”的传说。荀子曰：“君子性非异也，善假于物也”。上万年间，人类借助着能源的内在力量延续着智慧与文明。从薪柴到煤炭、石油、天然气，人类也一直在探索更高效、便捷的能源形态。随着化石能源的大量使用，能源危机和环境污染问题逐渐凸显，太阳能、风能、热能、潮汐能等可再生能源在人类的智慧中应运而生。从不可再生资源到可再生资源的应用，人类窥到了“取之不尽用之不竭”的理想能源的冰山一角。而如何利用和控制好这些能源，则需要有效的能量转换和储能技术。现如今，人类能源进程进入“新能源与可持续发展”阶段。新能源汽车势如破竹，动力电池和储能系统的重要性被推至前所未有的历史高度。现有的动力电池和储能器件的性能与其组成部件的性能息息相关，为了提升其整体性能，研究人员需要对组成部件材料的物理和化学性质有更深入的了解。如果这些材料对空气和水分敏感，这项研究将更具挑战。 Thermo Scientific针对空气敏感样品开发了惰性气体/真空保护样品传输系统CleanConnect，为空气敏感材料表征开拓出了全新视野。惰性气体/真空保护样品转移工作流程能够帮助科研工作者拓展空气敏感材料的研究边界，探究更多未知领域。产品介绍CleanConnect 惰性气体/真空保护样品传输系统可与大多数 Thermo Scientific扫描电镜和双束电镜系统兼容。它主要由样品装载室、闸阀单元、真空控制装置、样品转移仓和转移杆组成。CleanConnect的真空系统可与扫描电镜或双束电镜集成，无需额外配置真空泵，仅需要60s即可完成抽真空过程。和传统的样品转移杆不同，CleanConnect创新性地使用了惰性气体进行样品保护，使得转移仓持续维持正压，最大限度地保证样品与空气隔绝。CleanConnect系统配备的气压表可以实时显示转移仓中气压，使得用户对样品的气压状态有清晰的认识。CleanConnect的正压可以维持十个小时以上，可以实现样品长时间、长距离的转移。工作流程利用CleanConnect与扫描电子显微镜进行联用时，可将空气敏感的样品在手套箱中转移至CleanConnect样品台中，随后将 CleanConnect与扫描电镜的样品交换仓进行对接，将样品转移至扫描电镜的样品台中，这样就实现了惰性气体保护下的隔绝空气地转移，随后再利用扫描电镜进行形貌观察、元素分析等。图1 惰性气体保护下将样品转移至赛默飞扫描电子显微镜此外，CleanConnect也可加载在双束电镜上用于材料截面形貌的观察和TEM样品的制备。当需要观察空气敏感样品的内部显微结构时，先利用CleanConnect实现手套箱至双束电镜的转移，随后利用双束电镜的离子束对样品进行切割，再利用电子束对切割后的新鲜截面进行高分辨成像。如果期望实现原子尺度分辨率成像时，则可利用双束电镜制备TEM薄样，再使用CleanConnect将制备好的TEM薄样在手套箱中转移至TEM样品杆，再转移至透射电镜中完成纳米或原子尺度的高分辨成像。图2 惰性气体保护下将样品转移至双束电镜和透射电镜中进行纳米尺度分析产品优势CleanConnect的使用给电子显微镜用户带来了前所未有的体验，产品具有如下优势：• 保护样品避免与空气中的氧气、水分或二氧化碳发生反应，获取材料表面真实形貌与结构信息。• CleanConnect系统适用于不同的SEM和DualBeam产品型号，对于有多台设备的实验室，CleanConnect可实现多设备之间的样品关联互通。• CleanConnect系统兼容液氮冷冻台，样品从手套箱可以转移至双束电镜上的冷冻台上，使得样品在随后的的切割过程中免受离子束的热损伤。• 模块化的设计，符合人体工程学，可实现更便捷的样品转移。• 分离式的样品转移舱和转移杆设计,可以使CleanConnect从手套箱的小过渡仓直接进行快速转移，无需对手套箱进行改装。产品应用部分电池材料（如锂金属、硫基固态电解质、满充负极等）对水分和氧气非常敏感，因此在样品处理和转移过程中需要对其实施特殊保护以便于获取材料的真实形貌与结构信息。此外，固态电池的表征也需要在隔绝空气的条件下进行开展：例如固态电池材料的形貌表征、原位实验以表征枝晶在SEI（固态电解质界面）中横向生长形态以及由于硅材料体积膨胀导致的SEI不稳定性实验等。下面两图分别对比了锂金属和满充石墨负极样品在采用CleanConnect系统保护和在空气暴露后的形貌，结果表明CleanConnect有效保护了样品免受空气/水分污染，从而帮助研究者获取本真形貌结构信息，实现对样品更深入的分析研究。 图3 采用CleanConnect传输锂金属样品（左）和在空气中暴露2 min的锂金属（右）图4 采用CleanConnect传输满充石墨负极样品（左）和在空气中暴露2 min的满充石墨阳极（右）如果希望对锂金属进行原子尺度的表征，需要进行TEM样品制备。传统的Ga离子在室温下会与锂金属发生反应，难以用于锂金属的加工。Thermo Scientific研发的氙气等离子气体源的PFIB（Plasma FIB）可以实现锂金属透射样品的无损制备。为了避免锂金属暴露在空气中造成表面氧化，使用了CleanConnect进行样品传输，随后使用Cryo-PFIB技术进行样品冷冻制备和进一步的观察。5图是利用Cryo-PFIB技术在-178℃进行锂金属样品的TEM样品制备过程以及在TEM中观察到的样品形貌信息。图6TEM明场像中可以看到Li的碳化物与Li2CO3的分布，利用高分辨成像可以看到清晰的锂原子排列，可见在切割和转移过程中样品并未受到损伤或氧化。图5 利用Cryo-PFIB进行TEM样品制备过程图6 利用TEM进行明场像（中）及原子尺度的观察（右）CleanConnect除了可以应用在钠离子电池、钠硫电池、固态电池材料等空气敏感的电极材料以外，还非常适用于镁铝合金、钙钛矿材料、金属有机框架材料、催化剂等这些对空气敏感的材料表征。无论是在寻求替代能源的工作中，还是开发更强、更轻材料和高精尖的纳米技术研究中，都需要有利的仪器和工作流程来实现更深入的研究表征需求，以推进科学技术发展。我们相信随着CleanConnect系统在扫描电镜、双束电镜上的推广与普及，越来越多的科学家及工程师们能受惠于这一科技带来的对新材料研究的便捷，推进新材料、新产品研究的进程。虽然人类无法实现永动机的美好愿望，但却可以更好地开发先进技术、更有效地使用能源，让人类文明生生不息。如今，科学家们仍致力于电池材料研究以实现电池技术的突破，旨在开发更安全、更高能量密度和功率性能的电池产品。赛默飞也一直在持续开发更先进的分析技术应用于电池研发和生产中，助力科学家们实现这一目标。未来赛默飞也会竭诚为广大科研与工业用户开发出更多满足客户需求的产品，帮助客户让世界更健康、更清洁、更安全！8月23日 下午2：00-3：00观看直播，扫码预约

前言细胞中的RNA质量控制，如RNA的降解及RNA总量稳定的调控，被细胞内的多种蛋白质机器精确调控，比如被称为细胞监视器的RNA外切体（exosome)，RNA外切体激活子NEXT复合物（Nuclear exosome targeting complex），从而维持机体的正常生理功能。NEXT在剪切体上游行使功能，招募RNA外切体对新转录出来的RNA进行降解。很长一段时间里，结构生物学手段利用晶体学手段尝试解析NEXT的结构，以期了解NEXT调控RNA质量稳定的作用机制，但由于复杂的结构组成和高度动态的特征结构解析一直未果。近日，冷冻电镜让NEXT复合物的结构得以呈现，RNA质量稳定背后的详细机制得以窥见。在生物学中，清理机体产生的“废物”与制造物质同等重要。生物体产生的不再需要的细胞、蛋白质或其他分子的聚集，如不及时处理，会导致机体产生一些问题。不过，生物已经进化了出多种方法来完成清理多余物质的清理。一个典型的例子是RNA外切体。RNA分子在细胞中扮演许多角色。其中一些被翻译成蛋白质，一些则与细胞的蛋白质一起形成蛋白质-RNA机器。RNA外切体是一种细胞机器，可以降解有缺陷、有害或不再需要的RNA分子。如果不依靠外切体进行修剪，我们的细胞就会变成功能失调的囤积者，进而无法正常行驶功能。“RNA的监测和降解途径存在于所有形式的生命中，”斯隆凯特林研究所结构生物学项目主席Christopher Lima解释说。“从细菌到人类，所有生物都有监测RNA的状态并靶向降解RNA的机制。Lima博士说，在很长一段时间里，这些降解通路被认为像家务一样，是重复且枯燥的。但事实证明，这些降解通路受到高度调控，并控制着从胚胎发育到细胞周期的许多过程。更重要的是，通路一旦发生失调，从癌症到神经系统退化的许多类型疾病便会产生。在2022年6月9日发表在Cell上的一篇新论文中，Lima博士和实验室的博士后研究员Puno提出了有助于解释RNA外切体如何定位需要降解的RNA的研究结果。在冷冻电镜的帮助下，科学家们解析了一种RNA降解机制的关键部分，名为细胞核外切体靶向复合物（ Nuclear Exosome Targeting ，NEXT）的蛋白质组装体的结构。“我们知道NEXT将RNA靶向递送到RNA外切体，但在生物化学和结构上，我们不知道它是什么样子，也不知道它是如何工作的。”—Puno 结构生物学家现在，通过冷冻电镜，科学家们首次获得了获得了NEXT与RNA结合的第一张清晰图片。这些图片及相关的生化和生物实验揭示了RNA分子被传递到RNA外切体并进行降解的过程。逐渐了解结构几年前，Puno博士开始使用当时的金标准X射线晶体学方法研究NEXT的结构。在这种方法中，蛋白质首先首先进行晶体生长，它们以相同的方式排列并形成晶体。然后，X射线穿过晶体并击中探测器，所形成的图案被用来确定蛋白质的结构。虽然Puno博士能够结晶NEXT蛋白，但由此产生的X射线衍射图像不足以看到结构的细节。“不过，随后出现了冷冻电镜革命，”他说。“冷冻电镜帮助我们可视化这种蛋白质的样子以及它如何结合其RNA底物。动态蛋白质的可视化冷冻电镜的工作原理是捕获冷冻但非结晶的蛋白质样品的许多不同图像，然后使用计算方法将它们校准成最终的清晰图像。“这几乎就像捕捉一堆飞行中的鸟的照片，”Lima博士说：“鸟在飞行过程中又多种动作，导致鸟的翅膀看起来很模糊。但是，如果我们能在所有这些不同的图片中找到翅膀的部分，那么我们就可以通过对齐这些图片来重建鸟的翅膀的样子，并确定它们是如何工作的。”从冷冻电镜图片中，科学家们能够看到NEXT蛋白形成了一个非常灵活的二聚体：这意味着NEXT蛋白的两个单体在一起形成一个功能单元。Puno博士说：“这真的非常非常令人费解”，并指出这些类型的蛋白质以前没有可视化过二聚体的形成。“这几乎就像捕捉一堆飞行中的鸟的照片”—Lima 结构生物学家“从我们进行的生化实验中，我们知道二聚化对降解很重要，”他继续说道。“但对我们来说，尚不清楚二聚体在引导RNA到RNA外切体的过程中起了什么作用。为了解开这个谜团，研究小组希望在降解的不同步骤中捕获相互作用的NEXT复合物，然后用冷冻电镜将这些构象可视化。RNA的降解与疾病RNA降解的重要性不言而喻：有缺陷或失控的降解会引起许多疾病。最著名的例子是便是囊性纤维化，在这种情况下，一些负责编码离子通道或者转运体蛋白的信使RNA被RNA降解通路降，这使得肺粘膜中的一些关键蛋白质无法正常表达，从而造成粘液的堆积并导致呼吸严重受损。“这是RNA质量控制失调的一个典型例子，”Lima博士说。RNA降解途径的缺陷也在几种类型的癌症中发挥作用。事实上，MSK的基因检测平台MSK-IMPACT检测的与RNA外切体途径相关的两个突变基因，其中一个突变在NEXT蛋白上。“不仅信使RNA需要适当的质量控制，”Lima博士解释说。“现实情况是，如果你的RNA质量控制通路出现了问题，你的核糖体将不起作用，你的转移RNA将不起作用，你的剪接体也将不起作用的话，引起一系列连锁反应，会有很多种疾病找上门来”RNA所起的作用之广解释了为什么有缺陷的RNA降解途径会产生严重的致病作用。要理解这些效应，不仅需要对RNA外切体本身有更深入、更广泛的了解，还需要对NEXT等“上游”蛋白质有更深入、更广泛的了解，这些蛋白质有助于监测RNA并确定RNA何时存在缺陷或不再需要。“我们希望能在体外进行RNA降解反应，将样品放入冷冻电镜中，并捕捉到它们在工作时所有可能动态构象。”Lima博士说。“作为结构生物学家，我们希望能够看到动态的过程，重现其工作过程。相关文献摘要RNA质量控制依赖于辅助因子和链接物来识别和准备底物，以便由核糖核酸酶（如3′到5′核糖核酸外显子）进行降解。我们解析了人源细胞核外切体靶向蛋白（nuclear exosome targeting ，NEXT）结合RNA的复合物的冷冻电镜结构，为底物识别以及RNA移交给RNA外切体之前作用机制提供了见解。结构揭示了ZCCHC8作为一个支架蛋白，形成同源二聚体，和MTR4螺旋酶相互作用并介导将柔性较大的RBM7结合到解旋酶的核心位置。三个亚基协同作用以结合RNA：RBM7和ZCCHC8检查3′端上游的序列，促进MTR4捕获RNA。ZCCHC8覆盖了MTR4的表面，这对RNA的结合和释放以及MPP6依赖性的招募和对接到RNA外切体核心很重要。这些相互作用，通过协调RNA的捕获、移位和从螺旋酶中释放到外切体中，完成RNA的降解和调控。总结 RNA的质量控制是细胞生命的重要组成部分。 RNA外切体会降解有缺陷、有害或不再需要的RNA。 科学家们已经使用冷冻电镜来确定降解机制关键部分的结构，称为NEXT。 NEXT蛋白的突变可导致包括癌症在内的疾病。相关文献Structural basis for RNA surveillance by the human nuclear exosome targeting (NEXT) complex

科研进展moorfield薄膜生长设备的用户英国剑桥大学christopher j. russo教授研究组利用高质量的薄膜生长与加工技术制备了用于冷冻电镜样品制备的“hexaufoil”金属网，该金属网使得冷冻电镜观察生物大分子样品时样品的位置漂移小于1埃米，进一步提高了冷冻电镜的成像质量，该结果刊登在2020年10月的science杂志上。“hexaufoil”金属网制备过程中的关键环节就是采用moorfield提供的高精度电子束蒸发技术以及液氮冷却的低温样品台，使得au膜当中的粒径更小，在大缩小金属网圆孔直径的情况下仍保证了金属网孔的圆度和质量。图1：生长在si 片上的“hexaufoil”金属网阵列（图片由分子生物学mrc实验室的neil grant提供） 说到冷冻电镜，近几年在分子生物学方向可谓是大放异彩，我国生物学家利用冷冻电镜技术在结构生物学方面也做出了许多举世瞩目的重要成果。冷冻电镜技术几乎的实现了对生物大分子的高精度观察。但在实际应用中仍有很多因素限制了冷冻电镜观测精度的进一步提升。其中重要因素之一是由于电子束照射导致金属网上的玻璃态的水膜发生移动从而影响观测精度。英国剑桥大学的christopher j. russo研究组对金属网上玻璃态水膜的移动建立了物理模型，通过分析得出水膜的直径和厚度存在一个临界比值，超过临界比值，水膜在快速冷冻过程中会由于应力作用发生弯曲，并有部分应力冻结在内部。而在电子束照射时，由于电子束照射作用提高了水膜中水分子的扩散系数（~1046倍），玻璃态的水膜便成为了一个“超粘流体”，水膜的应力会进一步的释放使得水膜的曲率发生变化，从而导致了生物大分子的位移，而这个位移只发生在电子束照射时，从而影响成像质量。图2：a冷冻电镜在观测时样品的位置移动，b、c不同角度，不同孔径对位移的影响，d水膜曲率变化导致样品位移的示意图。e孔径比的临界值（孔的直径/水膜厚度） 如果缩小金属网孔的直径，使水膜的直径和厚度比值在临界以内，在冷冻时水膜内聚集的能量不足以使水膜发生弯曲，电子束照射的能量也不会引发水膜曲率的变化，仅仅会引起水分子的扩散，而扩散对成像的影响远小于曲率的变化。从而可以提高冷冻电镜的成像质量。因此制备高精度小孔径金属网格就显得尤为重要。christopher j. russo课题组利用了高精的光刻和电子束蒸发薄膜制备技术在硅片上成功的批量制备出了孔径在200 nm尺度的金属支撑网，使得冷冻电镜测量时样品的位移小于1埃米。图3：利用“hexaufoil”金属网的冷冻电镜观测结果 后作者利用制备的“hexaufoil”金属网对223-kda dps蛋白质进行了冷冻电镜的观测。结果表明，采用“hexaufoil” 金属网可以有效减小样品的移动，使得分辨率轻松突破2埃米（更多细节请参考原文）。该篇文章介绍了一种减小样品位置漂移提高冷冻电镜精度的有效途径。moorfield薄膜制备与加工设备moorfield nanotechnology是英国材料科学领域高性能仪器研发公司，成立26年来专注于高质量的薄膜生长与加工技术，拥有雄厚的技术实力，推出的多种高性能设备受到科研与工业领域的广泛好评。moorfield公司近十年来与曼彻斯特大学诺奖技术团队紧密合作，推出的台式高精度薄膜制备与加工系列产品由于其体积小巧、性能、易于操作更是受到很多科研单位的赞誉。moorfield nanotechnology推出的大型系列设备具有更大的配置自由度，可以满足各种用户的特殊功能需求，并且接受设备的特殊定制化设计。 冷冻电镜背景介绍2017年诺贝尔化学奖颁给了发明冷冻电镜（cryo-em）的三位科学家，哥伦比亚大学教授joachim frank、苏格兰分子生物学家和生物物理学家richard henderson、以及瑞士洛桑大学生物物理学荣誉教授jacques dubochet以表彰他们在冷冻显微术领域的贡献。严格来说，其实这次化学奖是颁发给了三维“物理学家”以表彰他们对生物领域做出的贡献。richard henderson在20世纪90年代改进了电子显微镜，实现了原子分辨率；joachim frank在70、80年代开发了一种图像合成算法，能将电子显微镜模糊的二维图像解析合成清晰的三维图像；jacques dubochet发明了迅速将液体水冷冻成玻璃态以使生物分子保持自然形态的技术。这些发明使低温冷冻电子显微镜得到很大的优化。为什么观察蛋白质等生物大分子需要冷冻电镜呢？这是由于蛋白质等生物大分子往往只能保存在水溶液中无法满足电镜的真空要求，并且这些生物大分子是通过氢键链接的，电子的轰击会导致氢键断裂破坏分子结构，此外蛋白质等活性物质是运动的，不是一个静止状态。由于以上原因，普通电镜是不能用于观察蛋白质等生物活性物质的。科学家们经过探索发现，快速冷冻可使水在低温状态下呈玻璃态，减少冰晶的产生（水凝结成冰晶体积会膨胀从而会破坏生物分子结构），从而不影响样品本身结构，生物大分子就可以冷冻在这个玻璃态的水里，通过冷冻传输系统保证在样品始终保持在低温状态下，这样就可以对样品进行电镜观察了。然后利用计算软件通过大量的二维照片解析出生物大分子的三维结构，这便实现了对生物大分子的高精度观测。近些年来，冷冻电镜在结构生物学领域大放异彩，使得对蛋白质等生物大分子的研究取得了长足的发展。我国生物学家去年在新冠病毒研究方面取得的诸多进展中也有很多重要的工作都用到了冷冻电镜技术。 【参考文献】[1]. naydenova k , jia p , russo c j . cryo-em with sub–1 specimen movement[j]. science, 370.

p 　　 strong 仪器信息网讯 /strong 冷冻电镜，是用于电镜的超低温冷冻制样及传输技术(Cryo-EM)，可实现直接观察液体、半液体及对电子束敏感的样品，如生物、高分子材料等。2017年诺贝尔化学奖授予了三位杰出的生物物理学家Jacques Dubochet、Joachim Frank和Richard Henderson，以表彰他们在Cryo-EM发展过程中的推动性贡献。此次获奖也将人们对Cryo-EM这项技术的关注推向新的高度。 /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201811/uepic/66bc40e7-3748-4e22-973e-016b023580af.jpg" title=" 002.jpg" alt=" 002.jpg" / /p p 　　由于针对生物样品，Cryo-EM技术克服了传统电镜技术真空环境、电子辐射损伤等问题，使得该技术在结构生物学领域得到广泛应用与发展。随之，一批高质量研究成果相继发表前提下，国内科研机构对Cryo-EM技术、设备的引进配置也不短涌现：6月份，武汉病毒所2789万元采购1套日本电子冷冻透射电镜 10月份，哈尔滨工业大学6633万元采购2套赛默飞冷冻电子显微镜系统 11月份，清华大学和上海交通大学先后发布招标公告，分别拟8352万元与7665万元采购两套冷冻电镜系统。值得一提的是，11月19日，南方科技大学冷冻电镜中心揭牌，中心将安装300千伏冷冻电镜6台，200千伏冷冻电镜2台，120千伏电镜2台，共计10台冷冻透射电子显微镜及其它71台/套相关辅助仪器和样品制备设备，全部建成后，将是我国配套最齐全、最先进的冷冻电镜实验室。 /p p 　　在此背景下，聚焦仪器行业关注热点，仪器信息网仪器论坛特别开设“冷冻电镜(Cryo-EM)”版面，并于即日正式上线。旨在促进Cryo-EM学术交流和成果传播，为相关专家学者、一线用户等提供交流讨论在线平台。 span style=" color: rgb(255, 0, 0) " 欢迎冷冻电镜专家学者前来分享互动! /span span style=" text-decoration: underline color: rgb(0, 176, 240) " 【 /span a href=" https://bbs.instrument.com.cn/forum_711.htm" target=" _blank" style=" text-decoration: underline color: rgb(0, 176, 240) " span style=" color: rgb(0, 176, 240) " 版面链接 /span /a span style=" text-decoration: underline color: rgb(0, 176, 240) " 】 /span /p p 　　同时，为更好促进Cryo-EM技术交流、针对网友不同提问深入探讨，“冷冻电镜(Cryo-EM)” span style=" color: rgb(255, 0, 0) text-decoration: none " 版面的版主专家招募活动正式开启，欢迎自荐或推荐合适人选! /span /p p 　　 span style=" color: rgb(255, 0, 0) " 【申请条件】 /span /p p 　　1. 熟悉冷冻电镜的操作或样品制备等，具有一定的专业技术水平 /p p 　　2. 乐于分享经验并解答版友求助问题。 /p p 　　 span style=" color: rgb(255, 0, 0) " 【版主专家职责】 /span /p p 　　1. 活跃论坛，规范版面秩序 /p p 　　2. 发起话题，组织活动，引导讨论 /p p 　　3. 积极解答版友的求助帖 /p p 　　4. 发现推荐新版主、专家。 /p p 　　 span style=" color: rgb(255, 0, 0) " 【版主专家福利】 /span /p p 　　1. 仪器信息网科学仪器发展年会ACCSI(科学仪器行业年度盛会)针对版主、专家定向邀请，免费参会 /p p 　　2. 仪器论坛协助版主、专家发展论坛个人品牌，塑造个人形象，提升版主、专家在科学仪器行业声望 /p p 　　3. 仪器论坛每季度会进行优秀版主、专家评选，不仅有现金奖励，更会提供专属证书，为版主、专家证明荣誉 /p p 　　4. 仪器信息每年举办的小蜜蜂奖励金评选(科学仪器行业内，对实验员名利双收的奖励)，会着力关注用户在论坛中的表现，仪器论坛优先举荐合格的版主、专家。 /p p 　　 span style=" color: rgb(255, 0, 0) " 【申请方法】 /span /p p 　　方法一：加微信xyz4077(小叶子) /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201811/uepic/174fd508-0f9f-461d-b0d9-0be6e7cfdb1d.jpg" title=" 000.jpg" alt=" 000.jpg" / /p p 　　方法二：填写表单—— a href=" http://lengdong.mikecrm.com/RSZCB8x" target=" _blank" style=" color: rgb(255, 0, 0) text-decoration: underline " span style=" color: rgb(255, 0, 0) " 仪器信息网论坛冷冻电镜版面版主专家招募链接 /span /a /p

真空冷冻干燥机在生物制品行业中有着广泛的应用，其需求和优势主要体现在以下几个方面：1. 需求：保存生物制品的活性成分： 生物制品，如蛋白质、酶、细胞等，具有特定的生物活性。真空冷冻干燥可以在较低的温度下将水分脱除，从而保留这些生物制品的活性成分。 延长生物制品的稳定性： 生物制品通常在液态状态下容易受到氧化、降解等因素的影响。冷冻干燥过程可以有效降低水分含量，延长生物制品的稳定性和保存寿命。 提高生物制品的储存和运输效率： 冷冻干燥后的生物制品更轻便、易于储存和运输。这对于生物制品的分发、贮存和运输等环节非常重要。2. 优势：保留生物活性： 真空冷冻干燥技术通过控制温度和压力，将水分从冰固态直接升华为水蒸气，避免了液态水分对生物制品的影响，保留了其天然的活性。 维持生物制品的结构和形态： 由于真空冷冻干燥是在较低的温度下进行的，因此生物制品的结构和形态往往能够得到较好的保持，减少了冻融损伤的风险。 提高溶解度： 冷冻干燥过程能够使得水分以固体的形式存在，这有助于提高生物制品的溶解度。在制备药物或其他生物制品时，提高溶解度是一个重要的考虑因素。 降低水分活性： 冷冻干燥后的生物制品中水分活性较低，使得其在储存期间不易受潮，有助于维持产品的质量和稳定性。 适用于多种生物制品： 真空冷冻干燥机广泛适用于不同种类的生物制品，包括药物、疫苗、酶、细胞、抗体等，使其成为生物制品行业中一种通用的制备和保存技术。总体而言，真空冷冻干燥技术在生物制品行业中的应用为这些生物制品的稳定性、保存和运输提供了高效可靠的解决方案。

在过去的二十年中，冷冻显微镜方法已经成为生命科学家、制药研究人员等广泛使用的有效工具，用于检查接近其原生状态的生物结构1。冷冻显微镜能够可视化蛋白质和蛋白质复合物等物质的生物分子结构，是对现有的方法如x射线晶体学和核磁共振(NMR)等的有价值的补充。确定蛋白质和蛋白质复合物的结构是药物发现的一个重要部分，这对研究药物靶点非常有意义，也是深入了解疾病机制的重要课题。在这篇文章中，我们将阐述冷冻显微镜技术的使用，包括冷冻光学电子显微镜(cryo-CLEM)，冷冻干燥显微镜(FDM)，药物研究中的低温保存，以及温度控制显微镜如何使研究人员能够在低温下推进药物发现和开发研究。冷冻光学电子显微镜（Cryo-CLEM）电子显微镜(EM)使用微量材料，具备接近原子的分辨率，可以研究不同功能状态下的分子。冷冻电镜（Cryo-EM）使用极低温度，克服了真空条件下使用电子束测量高含水量生物标本的难题。在20世纪80年代冷冻电镜商业化之前，生物标本是通过化学固定或染色等方法制备的，但这些方法存在保存伪影，会影响图像分辨率。快速冷冻通常用于将样品保持在与自然生理环境相似的冷冻状态，在临床前阶段取得的结果必须在临床研究中可复制，这在药物研究中尤其重要。Cryo-CLEM结合低温荧光技术和冷冻电镜技术，提高了活检细胞内生物、化学和遗传过程的灵敏度。Cryo-CLEM能够对冷冻固定样品中的分子或分子组件(如细胞内膜、DNA或细胞结构元件)进行直接荧光标记和靶向，精确定位区域，以便后续使用EM进行高分辨率成像。为了使生物样品与EM中发现的真空条件兼容并保存结构细节，样品被嵌入玻璃状的冰中，需要保持在-140°C以下。必须避免与空气中水分接触，因为一旦接触会形成冰晶并污染样品。在低温条件下，荧光信号的结构细节被保留，光漂白显著减少。冷冻光学电子显微镜技术的进步体现在它包含了创新的冷冻荧光级，如Linkam CMS196，它能够自动获取整个电镜网格的高分辨率荧光图。这也用于样品导航，并将cryo-CLEM的案例情况与EM或与x射线显微镜等其他技术相关联。西班牙巴塞罗那的一组研究人员和临床医生使用荧光显微镜、透射电子显微镜(TEM)和低温软x射线断层扫描(cryo-SXT)，可以观察到抗癌药物顺铂在极低浓度下的有效性，确定产生效果所需的最低剂量，以最大限度地降低毒性2。该小组在荧光显微镜上对低温冷冻的细胞样本进行成像，使用CMS196冷冻荧光台在液氮温度下将它们玻璃化，然后使用cryo-SXT对样本进行分析，这使得在纳米尺度上进行3D研究成为可能。得益于现有的低温成像技术，研究结果表明，三甲碱(研究的两种佐剂之一)促进了顺铂在较低剂量下的有效治疗，这可能为化疗治疗的发展铺平了道路，减少了对患者的副作用。冻干显微镜许多药物生产为冻干或冻干配方，以增加稳定性和延长保质期。药物开发人员必须为新的药物化合物创建一个优化的冷冻干燥过程，这可能是一项复杂而昂贵的工作。为了简化流程和开发更高效的冷冻干燥循环，了解三个主要冷冻干燥步骤的温度和压力要求是很重要的。使用冷冻干燥显微镜(FDM)，研究人员可以直接可视化每个步骤，并确定药物产品在不同热条件下的行为。FDM包括一个专用的光学显微镜和一个专用的热工作台，它可以准确地控制样品的温度和压力，并允许实时进行热测量。冷冻干燥的一个关键参数是塌陷温度(Tc)，即产品失去结构完整性并导致加工缺陷的温度。FDM使药物开发人员能够密切监测样品并快速有效地调整冷冻干燥方案。英国国家生物标准与控制研究所(NIBSC)的一个研究小组正在利用先进的FDM技术研究冷冻干燥药物的复杂性。该小组由Paul Matejtschuk博士领导，正专注于研究优化冻干脂质体药物的配方。由于冻干脂质体药物物理和化学性质不稳定，这对开发提出了挑战。Matejtschuk博士和他的团队使用安装在光学显微镜上的专用冷冻台(FDCS196, Linkam科学仪器)(图1)，通过估计冻结、塌陷和融化温度，预测脂质体-冷冻保护剂混合物的理想的冷冻干燥条件3。图1:NIBSC实验室的仪器配置。Linkam FDCS196冷冻干燥冷冻台，T94控制器和液氮泵，真空泵，奥林巴斯BX51光学显微镜。图像显示FDM系统的旧版本图2: Linkam FDCS196冻干显微镜系统的最新版本这样的实验对于继续努力开发快速、可转移和可扩展的冷冻干燥方法来稳定脂质体等药物化合物至关重要。低温贮藏储存用于研究的生物标本有赖于有效的保存技术，以保持细胞的物理和生物完整性。冷冻或冷冻样品可能会导致冰晶的积聚，导致终端细胞损伤。冷冻保护剂是在冷冻过程中通过降低水的熔点来防止细胞损伤的重要物质。许多生物，如极地昆虫、鱼类和两栖动物，会产生自己的冷冻保护剂或防冻化合物。科学家们正在研究这些化合物，以开发新的冷冻保护剂来保存研究用的细胞。例如，由Matthew Gibson博士领导的英国华威大学的研究人员，正在研究防冻剂(糖)蛋白(AFP)，目的是开发新的合成AFP模拟化合物。该实验室使用低温生物学工作台(BCS196，Linkam Scientific Instruments)来测量细胞中的冰晶生长，依靠该仪器的温度控制能力来观察AFP。Gibson博士研究了使用金纳米颗粒作为探针来测量冰再结晶抑制活性现象，使用低温生物学工作台来改变温度，并开发出一种高通量方法来筛选类似AFP具有结构特征的材料。4诸如此类的发现为开发新型冷冻保护剂提供了潜力，这种保护剂可以防止冷冻保存细胞中冰的生长，从而保持细胞的完整性，因此在生物医学和药学研究中具有潜在用途。未来药物研究本文中描述的技术强调了目前已有的各种冷冻显微镜方法的选择，这些方法有助于推进药物研究。Cryo-CLEM结合了cryo-EM和低温荧光的力量，作为一种相对较新的技术，它的成功依赖于专用冷冻工作台的发展，从而促进了Cryo-CLEM工作流程。这种工作台能够在液氮温度下保持玻璃化样品，使它们在从荧光显微镜移动到冷冻电镜成像时保持无污染。其他专用的冷冻台可与广泛的显微镜技术兼容，如FDM，可在成像过程中精确控制样品的温度，低至-196°C。这些创新为制药研究人员新疗法和生产工艺评估，以及生物样本保存以供未来研究等大量应用提供了工具。 作者：Linkam Scientific Instruments销售及市场部经理Clara Ko参考文献：1. Booy, F. and Orlova, E.V. Cryomicroscopy, in: Chemical Biology: Applications and Techniques (eds Larijani, B., Rosser, C.A., and Woscholski, R.) 2007.2. Gil, S., Solano, E., Martinez-Trucharte, F., et al. Multiparametric analysis of the3. effectiveness of cisplatin on cutaneous squamous carcinoma cells using two different types of adjuvants. PLoS ONE. 2020 15(3): e0230022.4. Hussain M.T., Forbes N., Perrie Y., Malik K.P., Duru C. and Matejtschuk P. Freeze-drying cycle optimization for the rapid preservation of protein-loaded liposomal formulations. International Journal of Pharmaceutics 573, 2020 118722.5. Mitchell, D. E., Congdon, T., Rodger, A., and Gibson, M. I. Gold Nanoparticle Aggregation as a Probe of Antifreeze (Glyco) Protein-Inspired Ice Recrystallization Inhibition and Identification of New IRI Active Macromolecules. Scientific Reports, 2015 5: 15716.

p 　 strong 　仪器信息网讯 /strong 2015年5月29日-6月2日，“2015全国生物医学农林 a href=" http://www.instrument.com.cn/zc/1139.html" 电镜 /a 技术研讨会暨生物电镜前沿技术培训班”在浙江大学举行。本次会议特别邀请了国内外知名专家教授和电镜工作者讲授生物电子显微镜技术的最新发展，交流生物样品制备和应用方面的技术经验，并安排部分学员参加实验操作及演示。 /p p 　　台湾中央研究院植物暨微生物学研究所简万能博士作了题为“Ultrastructure of plant cells using high pressure freezing and freeze substitution”的报告。 /p p style=" text-align: center" img alt=" " src=" http://img1.17img.cn/17img/old/NewsImags/images/201565105212.jpg" style=" width: 500px height: 333px" / /p p style=" text-align: center" strong 简万能博士 /strong /p p 　　据介绍，由于早年看到所有的教科书都说想要获得更好的电镜观察结果，就要用冷冻制样技术，简万能便开始了这方面的研究，然而不做不知道，一做才知道有多难。冷冻制样对于动物来说比较简单，而对于植物来说由于细胞壁的影响却非常难。20年来，在研究当中，他碰到的失败的次数永远比成功多。“但是当你成功后，你会发现你的眼界比以前做化学固定大得多。”简万能这样说道。 /p p 　　“电镜是生物学研究非常有用的工具。由于生物细胞的含水量可以达到80%-90%，所以制样能否成功主要是解决水的问题。传统的透射电镜制样技术，对样品损伤最大的步骤是脱水，往往使得细胞结构发生很大的变化。而利用冷冻制样最大的优点就是可以保持细胞原来的结构，并保持一些可溶性的物质。如果要做溶在细胞质里的元素分析，一定要采用冷冻制样技术。” /p p 　　由于水在冷冻的过程中会形成冰晶影响观察，所以在如何避免形成冰晶是冷冻制样的一个关键点。简万能表示：“在制样中一定要注意一些关键的温度节点。如-137℃是水的重结晶点，如果能迅速降低到这一温度，样品中的水就会形成玻璃态的冰。如果超过-70℃，玻璃态的冰就会形成二次冰晶。” /p p 　　在报告中，简万能介绍了目前常用的冷冻方法，如投入式冷冻、冷金属块撞击式冷冻、丙烷喷射冷冻、高压冷冻等。并指出高压冷冻的优点是可以做活的生物样品，可以做超过200& amp #956 m厚的样品。 /p p 　　此外，简万能还介绍了在冷冻固定之后，如何更好的实现冷冻置换。他表示，如果要做超薄切片，高压冷冻和冷冻置换是最好的选择，可以获得非常好的样品形态，会有更多的信息被保留。 /p p 　　在研讨会之后，简万能博士亲自指导参加培训的学员，进行了投入冷冻、高压冷冻、冷冻置换等实验操作。 /p p style=" text-align: right " 撰稿：秦丽娟 /p p style=" text-align: left " & nbsp & nbsp & nbsp & nbsp 第一届电镜网络会议： a href=" http://www.instrument.com.cn/webinar/icem2015/" _src=" http://www.instrument.com.cn/webinar/icem2015/" http://www.instrument.com.cn/webinar/icem2015/ /a /p

02017年4月20-21日，第七届仿制药国际峰会-亚洲(GIS Asia 2017)在上海拉开帷幕。大会由中国药学会制药工程专业委员会与Best Media主办，300多名业内同行，专家学者代表参加了此次会议。围绕国家审评审批制度改革、上市许可人制度试点、仿制药一致性评价、药品价格放开以及医保目录调整等一系列重大举措。与会人员共聚一起，积极商讨如何确定自己新形势下的药物研发策略，进军国外仿制药市场前景，如何应对国外的专利法规，怎样让自己的研发技术水平达到国际标准等议题。步琦公司作为此次会议的赞助商，携新品无极限冷冻干燥机Lyovapor™ L-200 系列产品以及最先进的快速制备色谱系统Reveleris® , 蒸发光散射检测器 Alltech® ELSD 3300，旋转蒸发仪R-300等产品参加了本次会议。Lyovapor™ L-300 (冷冻干燥机) 作为蒸发技术的市场领导者，步琦公司2017.4.18号正式推出了世界上首款可连续升华的实验室冷冻干燥机，首款搭载 Infinite-Control™ 和Infinite-Technology™ 技术的冷冻干燥机。Lyovapor™ L-300 (冷冻干燥机) 凭借两个交替工作并可自动进行卫生清洁的冷凝器，首次在 –105 °C 的条件下实现连续升华，水和有机溶剂的升华都不受限制，还可实现在整个过程中控制所有相关参数，并可通过移动设备进行控制，实现随时随地无极限控制。Alltech® 3300 ELSD 蒸发光散射检测器简化复杂化合物的检测过程ELSD 可简化复杂化合物的分析过程，如药品、杂质、脂肪酸和聚合物等。可检测所有化合物，使用任意洗脱溶剂。BUCHI Alltech® 引领ELSD 技术发展20多年步琦公司提供专业的 ELSD 设计和制造， Alltech® ELSD 已走过20 多年的发展历史，我们的经验和创新技术引领着ELSD 技术的不断向前发展。最新一代ELSD3300 采用市场上最先进的蒸发光技术，是低温型检测器，它能提供纳克级范围的灵敏度，稳定性好，设计紧凑，易于摆放，满足最广泛的应用需求。Reveleris® PREP 全息快速制备色谱系统使用快速和制备型 HPLC 时的理想选择Reveleris® PREP 纯化系统是一款功能强大的高性能系统，它将快速色谱和制备型 HPLC功能完美结合在了一台直观的仪器中。先进的双模式系统可满足有机化学家和制备型HPLC色谱工作人员的需求，进而简化纯化过程。简单直观的Windows界面，单画面编程和运行控制，紫外和蒸发光散射双检测器，可加速系统设置和极大地提高药物的纯度，同时提高工作人员的纯化效率。

真空冷冻离心浓缩仪是一款常用于化学分离和纯化技术应用的实验室设备；该技术可通过将化学物质置于离心管中，利用离心力可将混合物中的各种化学物质分离开来，提高纯度。冷冻型的设备则是利用低温环境和真空状态可使化学物质在离心管中迅速冷冻、快速蒸发，从而提高实验的操作应用效率。本篇文章将深入探讨这款低温冷冻型离心浓缩设备的原理应用。　　　　　　冷冻真空离心浓缩仪利用离心和真空技术可将化学混合物中的化合物迅速分离，从而达到对样品的纯化和浓缩目的；该设备被广泛应用于分析化学、医药、生物学等行业领域。冷冻型的实验设备相比较于其他款，它是利用低温环境和真空状态分离化学物质，并将它们冷冻起来以提高实验效率。　　在使用冷冻真空浓缩设备时，需要先将样品置于离心管中，塞进盖子中央的叶轮上，接着运转机器，对离心管内的化合物进行旋转，在加入真空度后，通过减压和外部加热的方式来提高该系统内的温度以及气体流通性；随后可将化合物冷冻蒸发出来，达到样品的浓缩效果。　　　　真空冷冻离心浓缩仪是一款常用于制备RNA和DNA等高浓度浓缩样品的实验设备，该设备使用温度较低功率较少的真空泵和离心机器，可有效提高了实验对样品的纯度和浓缩效率；实验设备基于不同的原理应用，旨在提高化学物质的纯度；而冷冻型真空离心浓缩仪则比其他设备的应用更为高效。

瑞士步琦冷冻干燥含酵母菌的微球应用冷冻干燥应用”益生菌是一种有益于人体健康的微生物，常被用于改善肠道菌群。微胶囊包埋技术可以帮助保护菌株，延长其在体内的存活时间，不易受外界环境的影响而失活。因此，在生产益生菌产品时，需要考虑选择合适的微胶囊技术，以确保益生菌的稳定性和活性。下面这篇应用非常好的结合了微胶囊包埋和冷冻干燥技术，证明菌种经过包埋干燥后仍具有生物活性，为发酵工艺和食品转化等领域开辟新的可能性。1介绍冷冻干燥，也称为冻干是一种非常通用的脱水方法，常用于保存微生物、食物或药物，如蛋白质类药物。它将冷冻和干燥结合在一个独特的操作中，可以创造出高质量的干燥终产品。冷冻干燥通常用于保存微生物培养物，因为它具有不可忽视的优点：储存的方便性和增加邮寄微生物的可能性。此外，制得的产品只需要少量维护，培养基在储存过程中不会受到污染，微生物可以长时间保持活力。然而，众所周知，冷冻干燥技术对微生物至关重要，因为它对微生物的生存能力和生理状态都有负面影响。根据方法和生物体的不同，微生物存活率也各有不同；然而，活力水平明显低于液氮储存 2。观察到的活力下降主要是由于一些不良副作用引起的，例如细胞内冰晶的形成1、敏感蛋白的变性或在此过程中膜脂质的物理状态发生一些不可逆的变化 3,5。为了防止这种影响，通常在冷冻或冷冻干燥前使用脱脂牛奶、蔗糖、甘油、 DMSO 或海藻糖等作为冻干保护物质1,3。据报道，海藻糖在干燥、冷冻、渗透胁迫和热休克等极端环境下对酵母和细菌具有保护作用。这些保护效果与膜的稳定和酶活性的保存有关。关于海藻糖的保护作用，已经报道了几种假设。一些报道认为它的作用是通过多个外部氢键取代参与维持蛋白质三级结构的水分子，另一些报道认为它形成玻璃态结构以确保物理稳定性。除了发酵过程或食品转化，酿酒酵母或乳酸菌等微生物在益生菌膳食食品和饲料补充剂领域具有重要的经济意义。然而，这些应用需要在储存过程中保持细胞活力。通过造粒和冷冻干燥技术相结合，可以得到大小和组成均匀的无尘颗粒。由于具有更高的颗粒表面积，这使得产品将具有良好的颗粒流动性，更容易掌握的剂量和更快的产品复原性。尽管存在上述挑战，冷冻干燥仍然是一种酵母、孢子真菌和细菌的方便保存方法，因为它们的长期生存能力通常保持得相当好，而且菌株的储存和分发要求也很简单。因此，本应用旨在生产酿酒酵母颗粒作为模型微生物，使用微胶囊造粒仪 Encapsulator B-390 作为造粒机，将酵母悬浮液挤压进入液氮中形成单分散球体，然后使用冷冻干燥机 Lyovapor&trade L – 200 进行冷冻干燥处理。2仪器，试剂和器材仪器：ESCO NordicSafe, Biosafety Cabinet Class IIBUCHI 微胶囊造粒仪 Encapsulator B-390BUCHI 冷冻干燥机 LyovaporTM L-200 Pro，干燥腔体搭配可加热搁板BUCHI LyovaporTM Software试剂：YPD 培养基, Sigma Aldrich海藻糖, Sigma Aldrich脱脂奶粉琼脂去离子水液氮器材：玻璃培养皿液氮杜瓦瓶3实验本应用中描述的工作是在无菌条件下进行的。将 84g 市售面包酵母悬浮溶解在 50mL 无菌 YPD 培养基(Sigma Aldrich)中。在酵母悬浮液中加入 50mL 无菌冻干保护剂培养基（5g 海藻糖(Sigma Aldrich)和 5g 脱脂牛奶溶于去离子水中），然后用微胶囊造粒仪 B-390 进行制粒(表1)。将挤压后的液滴收集在液氮浴中冷冻，然后转移到不锈钢托盘中，保存在 -25°C 的冰箱中进行冷冻干燥。表1：微胶囊包埋参数_300μm 喷嘴1mm 喷嘴频率[Hz]68060电压[V]7502500压力[mbar]500500冷冻干燥步骤(初级干燥和次级干燥)使用 LyovaporTM 编程软件，如表 2 所示。使用 LyovaporTM L-200 Pro 干燥腔体、可加热的搁板和环境空气。表2：初级干燥和次级干燥冻干参数无酵母菌微球采用与含酵母菌微球相同成分培养基和参数进行制备。冷冻干燥后，将 1mL 无菌水加入 1mL 微球中，用以复原样品。对于含有酵母菌的菌珠，对每个重组溶液进行10倍、100 倍和 1000 倍的连续稀释。将复原后的溶液和稀释液分别涂于 YPD 琼脂平板上，如图 1 所示。琼脂板在 28℃ 培养 24h，评价细胞活力。▲ 图1：琼脂平板上的酵母活力测试4结果与讨论含有酵母的微球可以通过使用微胶囊造粒仪B-390 进行包埋制备，结果表明:用微胶囊造粒仪 B-390 将酵母滴入液氮中，可使酵母迅速颗粒化；用 300μm 的喷嘴和 1mm 的喷嘴分别制备了 700μm 和 1500μm 左右的微球。仅使用含冻干保护剂介质的溶液也得到了类似的结果。如图 2 所示，冻干后的微球在形状和大小上与湿冻微球保持相似。▲ 图2：用微胶囊造粒仪 B-390 制得的 300μm 酵母微球，在冻干前（左）后（右）的对比通过扫描电镜对其结构进行分析。在图 3 中，可以观察到含有酵母的球珠(下两图)和仅由冻干保护剂培养基制成的球珠（上两图）在形态上的差异。含有酵母菌的微球具有由 5μm 颗粒组成的粗糙结构，可以认为是微生物，而只含有冻干保护剂的微球具有更光滑的结构。▲ 图3：含酵母菌的冻干微球（下）和不含酵母菌冻干微球（上）的结构对比当冷冻干燥时，考虑到膜中脂质物理状态的变化或由于某些蛋白质结构的变化，生物系统可能受到破坏3,9。为了验证酵母菌的活力，将酵母菌重新水合，稀释，并在 28°C 的 YPD 琼脂板上培养 24 小时。图 4 证实了文献报道的内容，即便失去了部分活力，酵母在冻干后仍然可以生长2,4,6,10。▲ 图4：在 28℃ 琼脂板中培养 24 小时后的酵母菌活力5结论含有酵母菌的微粒可以很容易地用微胶囊造粒仪 B-390 进行制备，并使用冻干机 LyovaporTM L-200 进行冷冻干燥处理。B-390 的喷嘴直径分别为300 μm和1000 μm，制得的微粒直径分别为 700μm 和 1500μm。冷冻干燥后，珠粒的大小和形状没有变化。该颗粒流动性好，容易掌握使用剂量，且与水混合后溶解速度快。冻干后的微生物在贮藏过程中仍能保持良好的活力，并能在复水化后成功生长。在本应用中，造粒包埋和冷冻干燥的结合显示出了非常好的实验结果。它可以在发酵工艺和食品转化等领域开辟新的可能性，有利于生产制备剂量易控制和重组的培养发酵剂；另外，在益生菌和食品补充剂领域中获得无尘且可自由流动的粉末，同时保证产品颗粒大小和组成的均匀度。6参考文献N’Guessan, F. K. Coulibaly, H. W. Alloue-Boraud, M. W. A. Cot, M. Djè, K. M. Production of Freeze-Dried Yeast Culture for the Brewing of Traditional Sorghum Beer, Tchapalo. Food Sci. Nutr. 2016, 4 (1), 34–41.Bond, C. Freeze-Drying of Yeast Cultures. In Cryopreservation and Freeze-Drying Protocols Day, J., Stacey, G., Eds. Methods in Molecular BiologyTM Humana Press, 2007 pp 99–107.Leslie, S. B. Israeli, E. Lighthart, B. Crowe, J. H. Crowe, L. M. Trehalose and Sucrose Protect Both Membranes and Proteins in Intact Bacteria during Drying. Appl. Environ.Microbiol. 1995, 61 (10), 3592–3597.Miyamoto-Shinohara, Y. Imaizumi, T. Sukenobe, J. Murakami, Y. Kawamura, S. Komatsu, Y. Survival Rate of Microbes after Freeze-Drying and Long-Term Storage.Cryobiology 2000, 41 (3), 251–255.Wolkers, W. F. Tablin, F. Crowe, J. H. From Anhydrobiosis to Freeze-Drying of Eukaryotic Cells. Comp. Biochem. Physiol. A. Mol. Integr. Physiol. 2002, 131 (3), 535–543.Lodato, P. Huergo, M. S. de Buera, M. P. Viability and Thermal Stability of a Strain of Saccharomyces Cerevisiae Freeze-Dried in Different Sugar and Polymer Matrices. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1999, 52 (2), 215–220.Strasser, S. Neureiter, M. Geppl, M. Braun, R. Danner, H. Influence of Lyophilization,Fluidized Bed Drying, Addition of Protectants, and Storage on the Viability of Lactic Acid Bacteria. J. Appl. Microbiol. 2009, 107 (1), 167–177.Miyamoto, T. (Kyushu U. Kawabata, K. Honjoh, K. Hatano, S. Effects of Trehalose on Freeze Tolerance of Baker’s Yeast. J. Fac. Agric. - Kyushu Univ. Jpn. 1996.Giulio, B. D. Orlando, P. Barba, G. Coppola, R. Rosa, M. D. Sada, A. Prisco, P. P. D. Nazzaro, F. Use of Alginate and Cryo-Protective Sugars to Improve the Viability of Lactic Acid Bacteria after Freezing and Freeze-Drying. World J. Microbiol. Biotechnol. 2005, 21 (5), 739–746.Cerrutti, P. Huergo, M. S. de Galvagno, M. Schebor, C. Buera, M. del P. Commercial Baker’s Yeast Stability as Affected by Intracellular Content of Trehalose, Dehydration Procedure and the Physical Properties of External Matrices. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2000, 54 (4), 575–580.

两亲分子在选择性溶剂中发生自组装，可形成多种高级结构。在生物系统中，两亲分子的组装形成细胞膜，运输载体和反应容器，其具有精确控制的尺寸和含量。在合成系统中，表面活性剂，磷脂和嵌段共聚物形成各种两亲性结构，例如胶束，囊泡，环形和双连续结构，其可用于生物医学，食品科学，分离科学和模板合成等。为了设计特定的结构，并实现一般在自然界中观察到的精确控制，需要了解组装过程的热力学和动力学过程。尽管之前的研究做出了重大努力，两亲自组装结构演化的分子机制仍未完全解决，特别是在控制失衡-平衡途径方面。两亲性自组装结构可以通过自上而下或自下而上的方法制备。对于嵌段共聚物体系的自下而上组装而言，其自组装过程的第一步一般是球形胶束的形成，其可以稳定或转化成其他结构，例如圆柱体或囊泡。众所周知，在特定条件下，均聚物溶液可以进行液 - 液相分离，由旋节线分解过程形成富含聚合物的液滴。Sato和Takahashi理论上描述了在弱两亲性条件下两亲共聚物体系中如何发生相分离，但对于其他两亲性过程中的相分离过程并未进行讨论和验证。近日，来自荷兰Eindhoven University of Technology的吴杭隆和Alessandro Ianiro等人于Nature Chemistry杂志上发表了题为“Liquid–liquid phase separation during amphiphilic self-assembly”的文章，文中作者利用DENSsolutions 原位液体样品杆结合透射电镜首次直接观察到囊泡的形成过程，显示了液体前体相的形成并揭示了相分离在囊泡形成过程中的作用，对Sato和Takahashi的理论框架进行了修正，证明相分离应该在各种两亲系统的自下而上自组装过程中发生。对于高分子材料而言，因其不耐受电子束辐照，对于这类材料以往均是采用冷冻电镜进行表征，本文中作者利用DENSsolutions的原位液体杆结合普通透射电镜进行实验，得到了与冷冻电镜相比，分辨率仍然很好的照片，同时还可以观察到原位过程。这对于很多仅可以使用冷冻电镜完成的实验提供了新的实验思路。

2021年7月8日，国际结构生物学领域权威期刊《Journal of Structural Biology》在线发表了由中国科学院生物物理研究所蛋白质科学研究平台生物成像中心与孙飞研究组合作的技术创新成果《VHUT-cryo-FIB, a method to fabricate frozen hydrated lamellae from tissue specimens for in situ cryo-electron tomography》，针对组织样品原位结构生物学研究的技术瓶颈开发了组织样品冷冻含水切片制备技术VHUT-cryo-FIB，这是该中心在2016年开发的细胞样品冷冻含水切片制备技术（Journal Structural Biology, 2016，194：218-222）后的又一技术创新，将原位结构生物学的研究对象从单细胞拓展到更接近于生理状态的组织样品。　　冷冻电子断层成像技术（cryo-electron tomography，cryo-ET）是一项重要的冷冻电镜技术，可以获得细胞和组织样品原位三维高分辨率超微结构、生物大分子的原位结构信息以及蛋白质机器原位相互作用信息。该技术被认为是分子生物学和细胞生物学联结的桥梁，被称为"可视化蛋白质组学"。然而该技术要求样品的厚度必须在300nm以下，获取高分辨率信息则需要更薄的样品（150nm以下），但是大多数生物样品厚度都在数微米以上，无法直接应用该技术进行研究。此外，为了研究生物组织样品更接近生理状态的结构，通常需要利用高压冷冻技术对生物组织样品进行冷冻固定，但是高压冷冻后的样品厚度一般都在100μm以上，如何制备出适合冷冻电子断层成像技术研究的高质量的生物组织样品切片是原位结构生物学领域面临的一个重要技术问题。　　本项技术研究基于最新的冷冻聚焦离子束技术（cryo-FIB），设计和研制了一套冷冻传输硬件，有效将振颤切片技术、高压冷冻技术、冷冻修块技术和冷冻聚焦离子束减薄技术结合起来，创新冷冻聚焦离子束切割工艺，形成了一套完整高效的组织样品冷冻含水切片制备技术流程VHUT-cryo-FIB。利用该技术流程可以高效制备出厚度在150-300nm之间的组织样品冷冻含水切片。本研究中应用VHUT-cryo-FIB方法分别制备了菠菜叶片、小鼠骨骼肌、肝脏和心肌的冷冻含水切片，并成功解析了菠菜胞质核糖体（34 Å）和小鼠肝脏胞质核糖体（18 Å）的原位三维结构（图1）。这些结果证明VHUT-cryo-FIB方法可以广泛应用于各种生物组织样品的冷冻含水切片制备，为原位结构生物学研究提供有力的样品制备方法。　　孙飞研究员为该论文的通讯作者，高级工程师张建国、孙飞研究组张丹阳博士（已毕业）和高级工程师孙磊为共同第一作者。蛋白质科学研究平台生物成像中心的多位工程师季刚、黄小俊、牛彤欣为该项成果贡献了力量，徐伟研究员为实验的设计和方向提供建议。北京大学生命科学学院的高宁教授和马成英博士在小鼠肝脏核糖体数据分析方面给予了帮助。　　该工作受到国家自然科学基金委、科技部重点研发计划、北京市科委等的资助。图1. Cryo-FIB方法制备的冷冻含水切片样品，Cryo-ET 方法解析菠菜叶片和小鼠肝样品中核糖体三维结构。a菠菜叶片重构后的细胞内部结构，其超微结构包括细胞壁、细胞质、叶绿体、囊泡、核糖体和基粒。b三维渲染后的图a，黄色,核糖体 淡粉色，细胞壁 橙色,细胞膜 紫色,囊泡 绿色,叶绿体膜 青色, 叶绿体基质。菠菜核糖体的原位结构，大亚基蓝色的，小亚基黄色。c Subtomo average得到小鼠肝脏核糖体的原位结构(左)，与通过单粒子重构得到小鼠胞质核糖体密度图(右)。d小鼠肝脏核糖体原位结构密度图，大亚基和小亚基分别为蓝色和黄色。红色(P/E位点)和紫色(A/P位点)显示了两个tRNAs。Scale bar:150nm。　　文章链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S104784772100068X?dgcid=coauthor#s0075

近期，QRB discovery在线发表了中国科学院生物物理研究所研究员章新政课题组题为Low-cooling-rate freezing in biomolecular cryo-electron microscopy for recovery of initial frames的研究论文。研究发现了在冷冻电镜成像过程中导致电子束诱导蛋白质样品快速漂移的新机制，并提出通过降低冷却速率制备无快速漂移的冷冻电镜样品的新方法。该方法可以有效恢复辐照损伤最少，含最多高分辨信号的成像数据质量，提升重构分辨率，实现辐照损伤敏感氨基酸的高分辨重构，高分辨信号的恢复也为冷冻电镜达到原子分辨率奠定了基础。　　1980年代，有科学家把含水样品快速投入到-183℃的液态乙烷中，制备包埋在玻璃态冰中的低温样品来减少生物样品受高能电子束照射产生的损伤。一般认为，降温速率越快越容易产生玻璃态冰，但是玻璃态冰中的蛋白质在电子束照射初期会产生快速漂移，无法矫正，使冷冻电镜前几帧成像模糊而无法有效应用于三维重构。电子束曝光初期的冷冻电镜数据具有最小的辐照损伤，含有最主要的高分辨信号，所以电子束诱导的快速漂移是实现原子分辨率结构解析以及易辐照损伤氨基酸高分辨重构所需要克服的壁垒，有科学家称其为冷冻电镜中的“Key outstanding problem”。　　经过近5年的攻关，研究人员发现快速漂移源自玻璃态冰在急速冻结时产生的应力，该应力和过高的降温速率相关，可以通过降低冷却速率来减少。通过优化冷冻制样技术，降低冷冻过程中样品的降温速率，研究实现了蛋白质快速漂移的消除（如图）。在降低冷却速率制备得到的冷冻样品中，数据分析展示出冷冻电镜前几帧数据被有效恢复，从恢复的电子密度图中可以清晰看到在普通冷冻样品结构中无法得到的辐照损伤敏感的氨基酸侧链信息。　　研究工作得到国家重点研发计划、国家自然科学基金委员会重点项目、中科院战略性先导科技专项（B类）、中科院基础前沿科学研究计划项目的支持。　　论文链接 降低样品冷却速率消除快速漂移示意图。a.通过降低样品冷却速率，冷冻电镜前几帧数据明显恢复。b-c.增加载网与镊子的传热在载网形成的冷却速率梯度和在不同冷却速率下GDH样品前几帧的恢复情况。d-e.提高液态乙烷温度至-110℃时制备的铁蛋白样品，以及在不同温度下铁蛋白前几帧的恢复情况。f.冷冻电镜前几帧恢复后，易受辐照损伤的氨基酸侧链密度图对比

我国海洋领域首个冷冻电镜中心建成，目前已全面对外开放共享，为用户提供样品制备、数据解析等服务。冷冻电镜也称低温电子显微镜，是一种能够对生物样品实现高分辨三维结构解析的高精尖设备。“如果说天文望远镜观测的是极宏观的天体，那么冷冻电镜则是针对极微观的生物大分子，观测水平达到十分之一纳米（百亿分之一米）级别。” 海洋试点国家实验室冷冻电镜中心主任沈庆涛教授说，冷冻电镜技术目前还非常新颖，但已经在生物学领域产生了极大影响，被诺贝尔奖官方称为“使得生物化学进入一个新时代”的技术。自2013年开始，冷冻电镜成为诸多诺奖级论文成果的得力助手。海洋试点国家实验室建设的冷冻电镜中心，是山东省首个冷冻电镜中心，也是我国乃至全球首个聚焦海洋生命科学的冷冻电镜中心。“生命来源于海洋，但目前国内外对陆地生物的研究比海洋生物更全面更系统，冷冻电镜的工作也多集中在陆地模式生物上。” 沈庆涛介绍，针对生命科学回归海洋的趋势，充分发挥海洋试点国家实验室的“向海”特长，他们建立了海洋领域首个冷冻电镜中心，以海洋生物为研究目标，推动海洋生物学从宏观走向微观，从生态、细胞水平走向分子水平。为了保证冷冻电镜的高分辨率解析能力，海洋试点国家实验室同时配备了冷冻电镜中心环境适配系统。“冷冻电镜设施昂贵精密，对于每个样品通常需要花费2-3天拍摄成千上万张照片，提取近百万生物大分子颗粒进行后续的图像处理。” 沈庆涛表示，在此过程中，环境适配系统能够对温度、湿度、磁场、震动等因素进行控制并适配，从而保证冷冻电镜自始至终状态稳定。

1.项目编号：0706-224100004N003项目名称：中国检验检疫科学研究院全自动物种信息鉴定分析一体机设备采购项目预算金额：48.0000000 万元（人民币）最高限价（如有）：48.0000000 万元（人民币）采购需求：名称数量简要技术需求交货期是否接受进口产品全自动物种信息鉴定分析一体机1套可视化的高通量测序数据分析；单分子测序及数据分析；基于测序的物种来源鉴定分析。2个月否2.项目编号：0706-224100004N002项目名称：中国检验检疫科学研究院QuEChERS制冷全自动样品制备系统设备采购项目预算金额：44.0000000 万元（人民币）最高限价（如有）：44.0000000 万元（人民币）采购需求：名称数量简要技术需求交货期是否接受进口产品QuEChERS制冷全自动样品制备系统1台主要用于食品、农产品农药残留检测时，利用QuEChERS方法对不同种类样品进行提取和净化处理合同签订后4周否3.项目编号：0706-224100004N005项目名称：中国检验检疫科学研究院微生物快速检测仪设备采购项目预算金额：27.0000000 万元（人民币）最高限价（如有）：27.0000000 万元（人民币）采购需求：名称数量简要技术需求交货期是否接受进口产品微生物快速检测仪1套1.用于微生物预培养，包括为微生物快速生长提供预置培养基、温度、搅拌等条件 2.用于核酸快速检测和数据云传输和管理；3.用于进行现场离心、涡旋、移液等前处理。签订合同后七个工作日否合同履行期限：签订合同后七个工作日本项目( 不接受 )联合体投标。

近日，无锡佰翱得生物科学有限公司和北京深势科技有限公司宣布达成战略合作协议。双方将结合深势科技在“AI+分子模拟”领域的算法能力及佰翱得国际领先的药靶蛋白制备及结构生物学研发能力，在冷冻电镜(cryoEM)算法及计算机辅助药物设计(CADD)领域开展合作，共同聚焦新药研发的“源头创新”，建立计算与“湿”实验相结合的商业化合作新模式。根据协议，双方将充分发挥各自专长的协同优势，基于佰翱得强大的冷冻电镜平台所产生的海量实测数据，结合深势科技在蛋白结构预测、分子动力学以及微观尺度上的建模能力，对电镜算法及蛋白三维模型构建进行持续优化，并探索开发新一代自动化数据处理方法，同时结合RiD增强采样算法，进一步提高冷冻电镜的结构解析效率和准确度。在商业化协同方面，双方充分发挥计算+“湿”实验相结合的模式，基于深势科技的超高通量虚拟筛选引擎和Uni-FEP自由能微扰计算模块，充分利用佰翱得强大的药靶结构数据库，提供从药靶结构出发的苗头化合物筛选和先导化合物优化的交付能力，为行业客户打造新型研发范式，提供更具价值的服务体系。未来，双方还将在商业化拓展及CADD人才发展等领域展开进一步的合作。佰翱得首席运营官金雷博士表示：“佰翱得已经建成全球新药研发界最大的冷冻电镜CRO平台，赋能新药研发‘源头创新’。新药发现和优化阶段的节奏很快，客户对药靶结构交付的速度和精度上，提出了更高的要求。深势科技在数据处理的算法和蛋白结构建模上有独特的优势。相信双方在电镜技术开发上的合作，会大大促进冷冻电镜在药靶结构测定中的应用。佰翱得的‘千靶万苗’计划已经开始实施，药靶蛋白库、药靶结构库和苗头化合物库初步建成。与深势科技强大的计算优势相结合，将极大地提升佰翱得基于结构的药物研发服务的广度和深度。同时，佰翱得也可利用其技术平台为深势科技CADD的结果提供‘湿’实验的验证，形成研发闭环，加速新药的发现和优化迭代。”深势科技创始人、CEO孙伟杰表示：“佰翱得拥有全球领先的商业冷冻电镜平台，在药靶蛋白制备和结构生物学领域有非常丰富的技术积累和研发经验。本次合作将充分发挥双方在产研和商业化领域的协同效应，通过计算+实验相结合的模式，双方将共同在实际的研发项目中不断迭代电镜平台及Uni-FEP相关算法，打造从结构出发到高通量筛选及化合物评估的完整产业链条，共同为国内外新药研发企业提供真正的‘源头创新’服务能力。”关于佰翱得无锡佰翱得生物科学有限公司由“中国企业500强”之一的双良集团与多名拥有国际药企工作经历的海归科学家联合创立。自2009年成立以来，公司致力于为全球创新药物研发机构提供“以复杂蛋白制备为核心，以结构生物学为特色”的创新药物早期研发CRO服务，促进基于结构的药物研发，打造结构生物学细分领域的国际领先品牌。佰翱得拥有蛋白表达与纯化、生物分析与筛选、结构生物学、药靶蛋白库等生物平台技术，拥有X-射线衍射仪、300KV冷冻电镜等先进科研设备，具有国际一流的蛋白样品制备和生物结构解析技术，组建了由经验丰富的领军人才带领的强大的队伍，是目前全球唯一一家具备从基因到冷冻电镜解析结构的全方位服务能力的标杆企业，建有全球新药研发CRO行业最大的冷冻电镜服务平台。公司客户覆盖了美国波士顿、旧金山、圣地亚哥、新泽西等生物医药企业聚集地，包含了在美洲、欧洲和亚洲的数十家合作伙伴，其中既有国际大药企，也有新兴的生物科技公司。关于深势科技深势科技是“AI+分子模拟”领域的领跑者，致力于将过去业内以实验为主的试错式研发模式，逐渐转变为“计算设计-实验验证”的理性设计研发模式。深势科技的新一代分子模拟平台能够实现效率与精度的统一，结合高性能计算,能够对数十亿原子规模的体系进行量子力学精度的计算模拟。团队核心成员获得2020年全球计算机高性能计算领域的最高奖项“戈登贝尔奖”，相关工作当选2020年中国十大科技进展，以及2020年全球人工智能十大科技进展。深势科技具有强大的科研与产业落地能力，目前，深势科技已在医药和材料领域与数十家工业界客户携手合作。

“ 了解喷雾干燥 & 冷冻干燥 帮你拿下实验室的 MVP！喷雾干燥和冷冻干燥是实验室常用的两种方法，在进行项目课题“升级打怪”过程中贡献出大量战绩。所以，如何准确选择合适的处理方法，关系到制备样品的后续应用。我们将喷雾干燥和冷冻干燥的相关知识点整理分类，希望可以帮助大家更好的了解这两种技术，选择更合适您的样品的处理方法。喷雾干燥喷雾干燥是物料干燥和粉体制备的常用方法。液体浆料在喷嘴处雾化成极细的雾滴，极大增加了水分表面积，细小雾滴与热空气接触过程中水分迅速汽化，使物料中固体物质干燥成粉末，即得到干燥产品。使用实验级别喷雾干燥仪，一般液滴干燥成粉末仅需要几秒钟的时间；并且能直接使溶液、乳浊液、分散液干燥成粉状或颗粒状制品，可省去蒸发、粉碎等工序。喷雾干燥技术特点1广泛应用于食品、制药、化工材料等行业，用于干燥、造粒工艺研究和生产。2一步工艺就能完成液体到粉体的转化，工艺简单，可复制性强，瞬间干燥，有效保留活性成分，适用于热敏性物料。3干燥过程高效迅速、处理量大，一般实验室型号处理水溶液物料效率可达 1L/h，同时也可以处理低至个位体积的少量样品。4喷雾干燥的颗粒较为均匀，有很好的流动性，在干燥的同时完成造粒、合成等工艺。2通过配方设计等改变产品的粒径大小、形态或密度，不容易引入杂质，提高产品生产质量标准。6通过设置参数可以控制干燥物料含水率（1-5%），以保证产品可以长期存放。相关设备推荐步琦小型喷雾干燥仪 B-290更多设备信息和应用案例可以关注公众号-产品系列冷冻干燥冷冻干燥又称为升华干燥或真空冷冻干燥，是物料干燥最常用的一种方法。物料的干燥过程发生在水的三相点以下，通常需要压力低于 6.11 hPa，温度低于 0 ℃。冷冻干燥的前提是保证物料完全冷冻，首先将含水物料冷冻到冰点以下，使液态水转变为固态冰，随后在真空条件下由冰直接转变为蒸汽而除去。蒸汽溢出需要借助外部提供热量，这部分所需的热量，一般通过热辐射方式进行供给。冷冻干燥过程中物料一直停留在样品容器中，因此物料不受破坏，也不会产生损失。冷冻干燥技术特点1广泛应用于各类行业，适合各种类型的物料，是一种非常柔和的干燥工艺。2在冷冻干燥过程中，微生物的生长和酶的作用无法进行，因此能稳定维持原有性状，同时整个工艺还可以在无菌条件下进行。3工艺过程在低温低氧的条件下进行，特别适合处理热敏性物质和易氧化物质。4冷冻干燥后物质呈海绵状、疏松多孔，体积几乎不变，可以保持原有的体积结构。2干燥能除去 95-99% 以上的水分，使干燥后产品能长期保存而不致变质。6干燥工艺时间长，需要 24h 左右或者更长的时间。相关设备推荐步琦冷冻干燥机 L-200更多设备信息和应用案例可以关注公众号-产品系列下表总结对比了喷雾干燥和冷冻干燥技术的区别点，希望可以帮助您更轻松的了解这两项技术。喷雾干燥冷冻干燥+ 时间短- 时间成本高+ 产品粉末状- 产品多呈块状，需碾磨+ 易于放大实验- 不易放大实验+ 适用所有溶剂- 部分溶剂使用受限- 回收率限制，通常60 – 70 %+ 产率基本可达 100 %- 部分热敏性样品受限+ 适合极端温度敏感样品步琦拥有包含旋转蒸发、喷雾干燥及冷冻干燥等完整干燥解决方案，非常欢迎您留言与我们技术交流。