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[font=宋体][font=宋体]泛素化是一种细胞内的蛋白质标记系统,蛋白质泛素化是指将小的蛋白质泛素共价地连接到其他蛋白质分子上的过程。泛素([/font][font=Calibri]ubiquitin[/font][font=宋体])是一种高度保守的蛋白质,其结构由[/font][font=Calibri]76[/font][font=宋体]个氨基酸残基组成。泛素连接到目标蛋白质上的过程,经历了泛素激活、泛素转移和靶蛋白接受三个主要步骤。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]蛋白质泛素化具有多种特点,例如它是高度选择性的,不同蛋白质泛素化的位置和数量可以影响其功能;它是可逆的,通过去泛素化反应可以调控蛋白质的泛素化状态;它还是动态调控的,受到多种因素的调控,如细胞信号通路和环境刺激。[/font][b][font=宋体]泛素化蛋白大小:[/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]蛋白泛素化是指将小蛋白颗粒泛素([/font][font=Calibri]Ubiquitin[/font][font=宋体])与其他蛋白质共价结合的修饰过程。 泛素化修饰通常会导致泛素共价连接在蛋白质的赖氨酸残基上形成多重泛素链。 这种蛋白质泛素化增加了蛋白质的分子量,因为每个泛素分子的质量大约为[/font][b][font=Calibri]8.5[/font][font=宋体]千达尔顿([/font][font=Calibri]kDa[/font][/b][font=宋体][b])[/b]。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]泛素化蛋白质组学在许多领域有重要的应用,主要包括:[/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体]①疾病机制研究:泛素化是一种广泛存在于细胞中的蛋白质修饰方式,参与了细胞的生长、分化、修复和调控等多个生命活动。泛素化蛋白质组学的研究可以帮助我们了解泛素化修饰的生物学功能和调控机制,为疾病发生机制和治疗策略的研究提供重要线索。例如,在癌症、代谢综合征、神经退行性疾病等疾病中,则会出现异常泛素化。[/font][font=宋体]②药物研发:通过分析药物对泛素化蛋白质的影响,可以评估药物的效力和选择性,为药物研发提供指导。[/font][font=宋体]③临床诊断:泛素化蛋白质组学鉴定与定量分析技术可以揭示细胞调控的机制,通过分析泛素化蛋白质的组学数据,可以确定泛素化修饰在细胞信号转导、蛋白质降解和细胞周期调控等过程中的重要作用。此外,通过比较病态和正常样品中泛素化蛋白质的差异,可以鉴定与疾病发生发展相关的泛素化修饰靶点,并进一步理解疾病的分子机制。因此,这些技术也可用于临床诊断。[/font][font=宋体]④蛋白质降解调控:在癌症、神经退行性疾病和免疫相关疾病等病症中,蛋白质降解调控出现异常。而泛素化蛋白组在调控蛋白质降解中发挥重要作用。通过与泛素连接,目标蛋白质被送入蛋白酶体或蛋白酶体样体中进行降解。这个过程是细胞清除异常、老化或受损蛋白质的重要途径。[/font][font=宋体]⑤高通量技术应用:高通量泛素化蛋白质组学鉴定与定量分析技术的发展包括质谱鉴定和抗体鉴定两种方法。质谱鉴定技术利用质谱仪的高灵敏度和分辨率,能够鉴定泛素化修饰的蛋白质及其泛素化位点。抗体鉴定技术则通过特异性抗体的使用,可以富集和鉴定泛素化修饰的蛋白质。这些技术为全面了解泛素化在细胞中的作用机制和调控网络提供了可能。[/font][font=宋体]总的来说,泛素化蛋白质组学在多个领域都有重要的应用价值,推动了我们对生命过程的深入理解以及疾病治疗的创新发展。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]更多详情关于[url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review][b]蛋白资源[/b][/url]详情可以参看:[/font][url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review][u][font=宋体][color=#0000ff][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review[/font][/color][/font][/u][/url][b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州:蛋白与抗体的专业引领者,欢迎通过百度搜索[/font][font=宋体]“义翘神州”与我们取得联系。[/font][/font][/b]
质谱(MS)是利用各种离子化技术将化合物转化为离子,按其质核比的差异进行分离测定,从而进行物质结构和成分分析的方法。近年来,质谱技术凭借其高通量、高特异性、高灵敏度的特点,在医学检验领域飞速发展,在临床生化检验、临床微生物检验、免疫检验等方面都成为了不可或缺的重要技术。微量元素在生物体生长发育及代谢过程中起着重要的作用,同时它们也可以作为人体内某些疾病的检测指标。质谱法可以实现多元素同时检测,且灵敏度高、检测限低、动态范围宽、分析速度快,可以直接对血液样品进行检测。其中,[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/yp][color=#3333ff]电感耦合等离子体质谱[/color][/url]法([url=https://insevent.instrument.com.cn/t/yp][color=#3333ff]ICP-MS[/color][/url]) ,已成为临床最为推荐的微量元素检测方法之一。与国外发展水平相比,我国质谱技术的临床应用还非常有限,很多相关部分还需要进一步完善,例如:质谱检测数据的判断标准、技术方法的掌握与人员培训、质量控制体系的建立等等。其中,方法学和质量管理体系是检测结果和应用的关键。在中国医师协会检验医师分会临床质谱检验医学专业委员会的指导下,首都医科大学北京妇产医院检验科质谱中心携手国内顶尖临床质谱应用专家,结合目前已公布的质谱技术标准、相关指南、文献及实际操作经验,制定本共识,重点阐述质谱技术在临床微量元素检测应用中对人员、环境、仪器、试剂、耗材、检测规程、方法性能评估及质量控制的要求,为临床实验室采用质谱技术开展微量元素检测提供基本指导。
[align=center][size=24px]超高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]-串联质谱检测农产品中阿维菌素残留方法研究[/size][/align][align=center][size=18px]鹤壁市农产品检验检测中心 张艳丽[font=宋体] 王丽娟[/font][/size][/align][align=left] 阿维菌素是一种新型类广谱性杀虫杀螨剂,由阿维链霉素经液体发酵加工而成,具有高效、广谱、有效期长、不易产生抗药性等特点,已经作为高毒有机磷农药的替代品而广泛应用。目前阿维菌素已广泛用于要水果样品中果树(苹果、梨、桃)、蔬菜(黄瓜、番茄)有害生物的防治,GB 2763-2021《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》中阿维菌素的残留限量(MRL)要求很高,规定其在柑桔、梨和黄瓜中的MRL为0.02mg/kg,叶菜和豆中为0.05mg/kg。目前阿维菌素的检测方法主要有高效液相色谱法(HPLC)[sup][1-5][/sup]、酶联免疫法(ELISA)、液质联用仪法(LC-MS)[sup][6-10][/sup]等。近几年液相色谱质谱法应用日益广泛,它可以提高目标物质的灵敏度以及回收率,缩短进样时间,提高检测效率。但在实际工作中,阿维菌素的响应值低、灵敏度低、标准曲线线性差等问题一直存在,本文应用超高效液相色谱-串联质谱仪(UPLC-MS/MS),对阿维菌素的检测条件进行色谱、质谱条件的优化,可以在检测农产品中阿维菌素时,得到快速、准确的检测方法。[/align]1 实验部分1.1 仪器与试剂AB Sciex4500高效液相色谱-串联质谱仪(配有电喷雾电离(ESI)源,美国AB SCIEX公司);GL-21M高速冷冻离心机(湖南湘仪);混匀器(德国heidolph公司);涡旋混匀器(德国IKA公司)。阿维菌素(100ug/mL)甲醇作为溶剂,购于农业部环境保护科研监测所;乙腈(HPLC级,上海安谱公司);甲醇(HPLC级,美国Merck公司)。甲酸(LCMS,美国Fisher公司);甲酸铵(LCMS,美国Fisher公司);十八烷基键合硅胶(C18)、N-丙基乙二胺(PSA)、无水MgSO[sub]4 [/sub][font=calibri]、[/font]NaCL均为分析纯(深圳逗点生物)。1.2 标准溶液的配置精确称取一定量的阿维菌素标液,用甲醇溶解后定容,配制成2.0ug/mL贮备溶液,于-20℃避光储存。1.3前处理方法称取10g(精确至0.01g)试样于50mL塑料离心管中,加人10mL乙腈及1颗陶瓷均质子,剧烈振荡1min.加人4g无水硫酸镁、1g氯化钠、1g柠檬酸钠二水合物、0.5g柠檬酸二钠盐倍半水合物,剧烈振荡1min后4200r/min离心5min。吸取8mL上清液至内含除水剂和净化材料的塑料离心管中 对于颜色较深的试样,离心管中另加人GCB,涡旋混匀1min。4200r/min离心5min,吸取上清液过0.22μm有机微孔滤膜后上机测定。1.4 仪器条件条件1.4.1色谱条件色谱柱:Altantis T3柱(150mm×2.1mm,3.0μm);柱温:40℃;流动相:A相为水(含0.01%甲酸(v/v)和1mM/L甲酸铵),B相为甲醇(含0.005%甲酸(v/v)和2mM/L甲酸铵)。柱流速为0.40mL/min。梯度洗脱程序:0~2.0min,90%A;5.0~12min,5%A;12.1~13min,90%A;流速:0.4mL/min;进样量:1μL。1.4.2质谱条件离子源:ESI;扫描方式:正离子扫描;扫描方式:多反应监测(MRM)模式;电喷雾电压:4500V;雾化气压力:50psi;气帘气压力:30psi;辅助加热气:60psi;离子源温度:300℃;碰撞气压力:9psi。2 结果与讨论2.1样品前处理的优化本实验采用GB23200.121《食品安全国家标准植物源性食品中331种农药及其代谢物残留量的测定 液相色谱-质谱联用法》,以乙腈作为提取溶剂,将目标物质、色素等有机物质提出,然后采用饱和盐进行层析分层,用吸附剂进行净化。2.2色谱条件的优化2.2.1色谱柱选择分别用Shimadzu C18(75mmx2.0m,1.6μm)、Agilent EC-C18(100mmx3.0m,2.7μm)、Altlantis T3(150mm×2.1mm,3μm)等3种液相色谱柱对阿维菌素进行响应值与分离效果的比对,所有色谱柱均能出峰,但采用Altlantis T3和Shimadzu C18色谱柱时峰形对称性好,半峰宽窄、且出峰时间相同,但采用Altlantis T3色谱柱时峰面积明显高于Shimadzu C18色谱柱。因此最终选择Altlantis T3色谱柱进行分离。2.2.2流动相选择流动相条件是影响目标化合物的色谱分离和仪器响应的一个重要方面,根据阿维菌素的性质,比较了甲醇和乙腈两种有机相,结果表明,甲醇是质子性溶剂,更易离子化,[M+NH[sub]4[/sub]][sup]+[/sup]峰的响应值要高于乙腈流动相,所以在本实验中选用甲醇和水作为流动相。在水相中加入甲酸铵和甲酸等试剂,是改善色谱峰形、提高仪器响应值和离子化率的常用手段,通常采用酸性流动相有利于在正离子模式下进行质谱检测,试验考察了不同浓度的甲酸与甲酸铵溶液与甲醇组合,发现随着甲酸铵浓度含量增大,阿维菌素的响应值也在增强,若甲酸铵浓度超过2mmol/L时,响应值开始降低。因此,最终选择0.005%甲酸加2mmol/L甲酸铵作为水相。优化后的液相条件下,可得到标准图谱如图1。[align=center][img=,690,611]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2022/09/202209011806214247_4665_1645480_3.png!w690x611.jpg[/img][/align] 图1 阿维菌素标液的MRM总离子及选择离子的离子流色谱图(10μg/L)2.3质谱条件的选择2.3.1检测离子的选择阿维菌素的分子式是C[sub]48[/sub]H[sub]72[/sub]O[sub]14[/sub],理论分子量为872.4921。采用母离子扫描(MS Scan),获得一级质谱图,通过分子质量确定阿维菌素多以加合离子[M+NH[sub]4[/sub]][sup]+[/sup]、[M+Na][sup]+[/sup]、[M+H][sup]+[/sup]形式存在,本实验选择离子丰度极强的[M+NH[sub]4[/sub]][sup]+[/sup](m/z890.5)作为母离子。然后,优化毛细管电压等参数,使母离子强度达到最高。选择母离子后,进行子离子扫描(Daughter Scan),获得二级质谱图,得到305.2、567和145.1。进行MRM多反应监测扫描,再次优化碰撞能量,使其离子化效率达到最佳。最终,本实验选择丰度最强、受干扰小的890.5/567作为定性离子对,而890.5/305.2作为定量离子对。阿维菌素检测的质谱参数见表1。 表1 阿维菌素检测的质谱条件[table][tr][td][align=center][color=black]化合物[/color][/align][/td][td][align=center][color=black]母离子/[/color][/align][align=center][color=black](m/z)[/color][/align][/td][td][align=center][color=black]保留时间/min[/color][/align][/td][td][align=center][color=black]产物离子/(m/z)[/color][/align][/td][td][align=center][color=black]碰撞能量/eV[/color][/align][/td][td][align=center][color=black]去簇电压/V[/color][/align][/td][/tr][tr][td][align=center][color=black]阿维菌素[/color][/align][/td][td][align=center][color=black]890.5[/color][/align][/td][td][align=center][color=black]7.56[/color][/align][/td][td][align=center][color=black]305.2[/color][/align][/td][td][align=center][color=black]32[/color][/align][/td][td][align=center][color=black]65[/color][/align][/td][/tr][tr][td] [/td][td] [/td][td] [/td][td][align=center][color=black]567[/color][/align][/td][td][align=center][color=black]19[/color][/align][/td][td][align=center][color=black]65[/color][/align][/td][/tr][/table]2.3.2离子源温度的选择考察了电喷雾离子源(ESI[sup]+[/sup])对阿维菌素的灵敏度影响,结果表明:ESI[sup]+[/sup]源受离子源温度影响比较明显,阿维菌素用的[M+NH4][sup]+[/sup]峰作母离子,温度过高或过低都会抑制目标物离子化,分别用300℃、350℃、400℃离子源温度作了试验,由表2可知:随着离子源温度的升高,响应值越低,当离子源温度为300℃时,灵敏度最高。表2 不同离子源温度的灵敏度[table][tr][td][align=center][color=black]化合物[/color][/align][/td][td][align=center][color=black]母离子/[/color][/align][align=center][color=black](m/z)[/color][/align][/td][td][align=center][color=black]保留时间/min[/color][/align][/td][td][align=center][color=black]产物离子/(m/z)[/color][/align][/td][td][align=center][color=black]离子源温度/℃[/color][/align][/td][td][align=center][color=black]响应强度/%[/color][/align][/td][/tr][tr][td][align=center][color=black]阿维菌素[/color][/align][/td][td][align=center][color=black]890.5[/color][/align][/td][td][align=center][color=black]7.56[/color][/align][/td][td][align=center][color=black]305.2[/color][/align][/td][td][align=center][color=black]300[/color][/align][/td][td][align=center][color=black]3.1e[/color][sup][color=black]4[/color][/sup][/align][/td][/tr][tr][td] [/td][td] [/td][td] [/td][td][align=center][color=black]567[/color][/align][/td][td] [/td][td][align=center][color=black]1.1e[/color][sup][color=black]4[/color][/sup][/align][/td][/tr][tr][td][align=center][color=black]阿维菌素[/color][/align][/td][td][align=center][color=black]890.5[/color][/align][/td][td][align=center][color=black]7.56[/color][/align][/td][td][align=center][color=black]305.2[/color][/align][/td][td][align=center][color=black]350[/color][/align][/td][td][align=center][color=black]2.1e[/color][sup][color=black]4[/color][/sup][/align][/td][/tr][tr][td] [/td][td] [/td][td] [/td][td][align=center][color=black]567[/color][/align][/td][td] [/td][td][align=center][color=black]6000[/color][/align][/td][/tr][tr][td][align=center][color=black]阿维菌素[/color][/align][/td][td][align=center][color=black]890.5[/color][/align][/td][td][align=center][color=black]7.56[/color][/align][/td][td][align=center][color=black]305.2[/color][/align][/td][td][align=center][color=black]400[/color][/align][/td][td][align=center][color=black]2.0e[/color][sup][color=black]4[/color][/sup][/align][/td][/tr][tr][td] [/td][td] [/td][td] [/td][td][align=center][color=black]567[/color][/align][/td][td] [/td][td][align=center][color=black]5000[/color][/align][/td][/tr][/table]2.4标准曲线、线性范围及检出限分别用甲醇配制含量分别为0.005mg/L、0.01mg/L、0.05mg/L、0.1mg/L、0.2mg/L的阿维菌素标准溶液,在上述实验条件下进样1.0μL,以峰面积为纵坐标,浓度为横坐标绘制线性关系曲线,结果表明阿维菌素标准溶液与相对应峰面积呈现良好的线性关系,其线性回归方程:A=6.82989e6+11635.39890,R=0.99913。按上述样品前处理方法及液相色谱检测条件分析得出阿维菌素在农产品样品中的定量限为0.01mg/kg。2.5方法准确度及精密度选取不同的果蔬、食用菌等农产品,进行添加水平为0.01mg/kg、0.05mg/kg、0.10mg/kg等加标回收试验,添加回收率为80%[font=宋体]~[/font]102.5%,RSD1.5[font=宋体]~[/font]8.5%,见表3,其结果满足农药残留检测回收率和相对标准偏差的分析要求。表3 不同农产品样品中阿维菌素添加回收测定结果(n=3)[table][tr][td=1,2][align=center][color=black]样品名称[/color][/align][/td][td=2,1][align=center][color=black]0.01mg/kg[/color][/align][/td][td=2,1][align=center][color=black]0.05mg/kg[/color][/align][/td][td=2,1][align=center][color=black]0.10mg/kg[/color][/align][/td][/tr][tr][td][color=black]回收率/(%)[/color][/td][td][align=center][color=black]RSD/(%)[/color][/align][/td][td][align=center][color=black]回收率/(%)[/color][/align][/td][td][align=center][color=black]RSD/(%)[/color][/align][/td][td][color=black]回收率/(%)[/color][/td][td][align=center][color=black]RSD/(%)[/color][/align][/td][/tr][tr][td][align=center][color=black]西葫芦[/color][/align][/td][td][align=center][color=black]85.6[/color][/align][/td][td][align=center][color=black]5.1[/color][/align][/td][td][align=center][color=black]89.5[/color][/align][/td][td][align=center][color=black]6.0[/color][/align][/td][td][align=center][color=black]91.4[/color][/align][/td][td][align=center][color=black]1.5[/color][/align][/td][/tr][tr][td][align=center][color=black]西红柿[/color][/align][/td][td][align=center][color=black]92.5[/color][/align][/td][td][align=center][color=black]3.5[/color][/align][/td][td][align=center][color=black]94.6[/color][/align][/td][td][align=center][color=black]2.2[/color][/align][/td][td][align=center][color=black]98.1[/color][/align][/td][td][align=center][color=black]3.4[/color][/align][/td][/tr][tr][td][align=center][color=black]芹菜[/color][/align][/td][td][align=center][color=black]90.1[/color][/align][/td][td][align=center][color=black]4.3[/color][/align][/td][td][align=center][color=black]92.1[/color][/align][/td][td][align=center][color=black]5.6[/color][/align][/td][td][align=center][color=black]102.5[/color][/align][/td][td][align=center][color=black]7.8[/color][/align][/td][/tr][tr][td][align=center][color=black]桔子[/color][/align][/td][td][align=center][color=black]86.1[/color][/align][/td][td][align=center][color=black]6.5[/color][/align][/td][td][align=center][color=black]90.3[/color][/align][/td][td][align=center][color=black]7.1[/color][/align][/td][td][align=center][color=black]92.9[/color][/align][/td][td][align=center][color=black]5.9[/color][/align][/td][/tr][tr][td][align=center][color=black]苹果[/color][/align][/td][td][align=center][color=black]82.3[/color][/align][/td][td][align=center][color=black]5.8[/color][/align][/td][td][align=center][color=black]87.8[/color][/align][/td][td][align=center][color=black]4.6[/color][/align][/td][td][align=center][color=black]90.1[/color][/align][/td][td][align=center][color=black]2.2[/color][/align][/td][/tr][tr][td][align=center][color=black]葡萄[/color][/align][/td][td][align=center][color=black]95.4[/color][/align][/td][td][align=center][color=black]3.6[/color][/align][/td][td][align=center][color=black]95.8[/color][/align][/td][td][align=center][color=black]2.0[/color][/align][/td][td][align=center][color=black]91.8[/color][/align][/td][td][align=center][color=black]7.9[/color][/align][/td][/tr][/table]3结论本研究对液相质谱法检测农产品中阿维菌素残留的仪器条件,进行了优化,解决了阿维菌素检出限高、灵敏度低、标准曲线线性差等问题,优化后的仪器条件方法检出限符合标准要求,阿维菌素的灵敏度高,在浓度0.005mg/L[font=宋体]~[/font]0.20mg/L范围内有良好的线性关系;添加回收率和相对标准偏差均符合分析的要求,是比较理想的阿维菌素残留量的分析方法。参考文献:[1]李晶,董丰收,刘新刚.高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]检测梨中阿维菌素残留方法研究[J]. 农药科学与管理,2008,29(2):17-22.[2]谢显传,张少华,王冬生等.柱前行生高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]法测定果蔬产品阿维菌素及其有毒代谢物的残留量[J].中国农业科学,2005,38(11):2254-2260.[3]梁振益,李嘉诚,罗盛旭,等.高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]法检测水果中阿维菌素残留量[J].现代农药,2005,4(4):20-22.[4]张儒令,安凤颖,胡德禹,等.高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]法检测菜豆中阿维菌素残留量[J].现代农业科技,2020(06):106-108.[5]刘桂伶,李婷婷.高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]法检测8种果蔬中阿维菌素残留量的分析方法[J].新疆农业科技,2020(01):38-39.[6]李增梅,邓立刚,赵涉及.超高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]串联质谱法测定苹果和土壤中阿维菌素的残留量[J].分析化学,2010,(10):1505-1509.[7]林涛,邵金良,刘兴勇,等.QuEChERS-超高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]-串联质谱测定蔬菜中41种农药残留[J].色谱,2015,33(3):235-241.[8]王连珠,黄小燕,陈游,等.QuEChERS前处理-[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]-串联质谱测定果蔬中18种弱酸性农药残留[J].分析测试学报,2014,33(10):1102-1108.[9]李欣,孙素群,张卫锋,等.QuEChERS-[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]-串联质谱测定蔬菜中56种农药残留[J].现代食品科技,2017,33(10):245-253,177.[10]李瑞雪,王晶蕾,龚慧.超高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]-串联质谱测定蔬菜水果中阿维菌素残留量[J].现代食品,2020,(22):180-182,189.