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层析实验冷柜专为生化层析实验而研制的特殊用途冷柜,也可用于其他需要低温环境的实验,或用于物品冷藏。主要特点:进口制冷压缩机,工作可靠,噪音低;风冷散热方式,不需水冷却;可选多功能型配置,三层可调开放式钢架;不作层析实验亦可用于样品冷藏保存,一柜多用; 柜内空间高大,便于层析操作; 全透视双层玻璃门,具防露功能,双门锁扣可独立开启;全不锈钢内壁,清洁卫生,美观耐腐蚀; 2根层析固定立柱,2层(YC-2为3层)开放式载重托板;自带照明灯,消毒灯,上下内电源插座; 内胆全部采用优质不锈钢材料;全新改进型智能温控仪表,温度设定、测量均为数显,且设定值可加密码锁定保护;自带超温、差温报警功能 ;下设脚轮,移动方便;
层析柜原理、应用和主要硬件指标性能一、层析柜层析柜是专为生化层析实验而研制的特殊用途低温柜,也可用于其他需要低温环境的实验,或用于物品冷藏。经过科学设计,冷柜总高度一般不超过2米,便于进出房间和电梯。二、层析柜用途主要用在生命科学研究的高校学科和科研院所,主要用来进行各种酶类,肽类,大分子,核酸等物质的生化层析分析试验。也可用于其他需要低温环境的实验,或用于物品冷藏。专门为对温度要求很高的各种应用设计,可以在箱内操作层析设备和其它简易安装的仪器和设备。三、层析柜硬件构成1、制冷系统标准的制冷系统由压缩机、冷凝器、蒸发器、膨胀阀、电磁阀等组成。用管道依次将这些设备连接,形成一个封闭式系统。系统工作时,压缩机将蒸发器所产生的低温低压制冷剂蒸气吸入汽缸内,经压缩机压缩,压力升高(温度也升高)到稍大于冷凝器内的压力时,将其汽缸内的高压制冷制蒸气排到冷凝器中。(所以压缩机起着压缩与输送制冷剂作用)在冷凝内高温高压的制冷剂蒸气与温度较低的空气(或常温水)进行热交换而冷凝为液态制冷剂,这时液态制冷剂经过膨胀阀降温(降压)后入蒸发器,在蒸发器内吸收被冷却物体的热量后在汽化。这样被冷却物体便得到冷却而制冷剂蒸气又被压缩机吸走,因此在制冷系统中经过压缩、冷凝、膨胀、蒸发四个过程完成一个循环。制冷系统原理如下图所示:http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2014/08/201408140927_510241_1705095_3.jpg2、温控系统温控系统的核心部件是温度传感器,温度传感器对环境温度自动进行采样、即时监控,当环境温度高于控制设定值时控制电路启动,可以设置控制回差。如温度还在升,当升到设定的超限报警温度点时,启动超限报警功能。当被控制的温度不能得到有效的控制时,为了防止设备的毁坏还可以通过跳闸的功能来停止设备继续运行。温控系统在层析柜里面是重要的硬件,主要要看传感器的灵敏度、数量和分布,温控性能也要关注,一般来说,温控范围、温控精度等参数是有温控器来决定的,和层析柜的关系不大,有的温控系统能控制的温度范围很宽,但实际温控需要根据层析柜本身的制冷系统来决定;温控均一性也需要和层析柜结合起来才有好的效果。3、风道设计层析柜内部的风道设计是生产商最容易忽略的部分,而风道设计是否合理直接影响到层析柜的温度稳定性和均一性,直接影响到整体使用效果。层析柜内部的设计应考虑到冷风和热风的比重差别,应用风扇的主动送风,在整个柜体里面形成主动均匀的空气流;这里面还需要考虑是否会形成短程的空气循环、开门时对柜体气流的影响应降到最小、风扇的送风能力的设计等等因素。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2014/08/201408140927_510242_1705095_3.jpg层析柜内部空气流动图4、层析柜配件多功能的层析柜一般能在满足层析实验要求的情况下兼顾到药品保存的需求,以提高层析柜的使用效率,所以首先应配置固定层析柱的立柱和夹子,其次需要配置放置仪器设备的搁板(能有一定的承重能力),另外还需配置内部电源,一般应为防水防漏电的插座;药品保存功能则需配置相应数量的搁物架,而且要求能和层析用的搁板进行更换,层析所使用的立柱和夹子应能拆除或不影响药品保存搁物架的放置。四、层析柜主要性能指标层析柜说到底是一种低温柜,核心的功能是提供低温的环境,所以温度性能方面的指标是最重要的指标,例如:温度均一性、温度稳定性、温控精度;当然,温度性能方面的指标是最终的表现,它的好坏是有硬件性能和设计来保障的,例如:压缩机性能、风机性能、整个制冷系统的设计、柜体的厚度、发泡的质量、柜体内部的设计、风道设计等等。综合来说,压缩机性能、内部风道设计、温度均一性几个性能指标应强烈关注。其中压缩机的品质保障了制冷系统的性能及其稳定性;内部风道设计可保障柜体内部的合理冷气流,使温控系统能达到最好的控制效果;温度均一性则是整个柜体的综合性能的集中表现。
实验七 葡聚糖凝胶层析脱盐一. 目的学习凝胶层析的工作原理和操作方法掌握利用葡聚糖凝胶层析进行蛋白质脱盐的技术二. 原理凝胶层析又称凝胶过滤或排阻层析。凝胶过滤的主要装置是填充有层析介质的层析柱。1. 层析介质的特点(1)遇水为不溶解的固相;(2)是化学惰性物质;(3)离子基团含量少;(4)颗粒大小和网眼均匀;(5)机械强度较强;(6)具有可选择的多种孔径。目前使用较多的是葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶及其衍生物。尤其葡聚糖凝胶(商品名称Sephadex)是最常用的层析介质。它是由一定平均分子量的葡聚糖和交联剂1-氯-2,3-环氧丙烷( )交联成的具有三维结构不溶于水的高分子化合物。调节葡聚糖和交联剂配比,可以获得网眼大小不同,型号各异的凝胶。当葡聚糖分子量越小,交联剂用量越大,则交联度越大,凝胶网眼越小,吸水量越小,G值也越小。G值表示每克干胶吸水量(mL)的十倍。例如Sephadex G-25其吸水量应为2.5mL/g干胶。常用的葡聚糖凝胶有多种规格,如G-10、G-15、G-25、G-50、G-75、G-100等。实验中选用何种型号应根据被分离的混合物分子的大小及工作目的来确定(参见附录五)。2. 分离原理当混合样液加到凝胶柱上,随着洗脱剂而通过凝胶柱时,分子大小不同的物质受到不同的阻滞作用。颗粒接近或大于网眼的分子,不能进入凝胶的网眼中,在重力作用下它们随着溶剂在凝胶颗粒之间沿较短流程向下流动,受到的阻滞作用小,移动速度快,先出层析柱(此现象叫作被排阻。被排阻的最小分子量称为该规格凝胶的排阻极限);而颗粒小于网眼的分子可渗入凝胶网眼之中,它们被洗脱时不断地从一个网眼穿到另一个网眼,逐层扩散,阻滞作用大,流程长,移动速度慢,因而后出层析柱。在层析柱的出口处,我们用多个试管分步收集洗脱液,就可将混合物中各组分彼此分离。当我们从生物组织中用盐析法提取蛋白质后,常需要进行蛋白质的脱盐工作,我们可采用层析介质为葡聚糖凝胶G-25(或G-15、G-50),用适当的洗脱剂进行洗脱,经凝胶层析,就可以将大分子蛋白质与小分子盐类分离。三. 实验材料及设备1. 材料含硫酸铵盐的蛋白质溶液(参见附注3)2. 器材层 析 柱:内径×柱高=1.0cm×25cm滴定台架、螺丝夹:各1刻度试管:10mL×14移 液 管:1mL×1烧 杯:250mL×1 50mL×1滴 管:2洗 耳 球:2洗瓶、试管架、移液管架、玻棒:各1四. 试剂的配制1. 葡聚糖凝胶G-25(或G-15、G-50)溶胀凝胶方法:按每个层析柱约4g的量称取葡聚糖凝胶G-25于烧杯中,加过量蒸馏水于沸水浴中溶胀2小时或在室温下溶胀6小时以上。用倾泻法除去上层漂浮的细碎凝胶,重复3~4次。操作中避免剧烈搅拌,防止破坏其交联结构。2. BaCl2溶液(1%)3. 考马斯亮蓝G-250称取0.1g考马斯亮蓝G-250,先溶于50mL95%乙醇中,再加入85%的磷酸100mL,最后用蒸馏水定容到1000mL。暗处存放。4. 脲(6mol/L)5. 洗脱剂应依据被纯化的蛋白质的不同特性而选用不同的缓冲液。五. 操作步骤1. 层析柱的准备(1) 清洗:每组取一支层析柱,用清水冲洗干净。(若玻璃柱较脏,应卸去塑料装置,先入洗液中浸泡2小时。)(2) 安装与检查:检查出口装置中尼龙绸或烧结滤板是否完好干净。安装层析柱,让其垂直固定于滴定台架上。对准出口处,放一只250mL烧杯。向层析柱内灌洗脱剂,打开出口螺旋夹,检查有无渗漏、出口乳胶管是否通畅等情况。(3) 排气泡:保持柱内一定的水位,用手指弹击柱壁,部分气泡会从溶液中上浮排出。出口处的小气泡易停留在螺旋夹附近的乳胶管内,要想法排尽,否则会影响分离结果,排气完毕,保留柱内1~2cm高水位,关紧螺旋夹。(4) 标记高度:在距顶端8~10cm处做一标记,作为衡量灌装层析介质床体高度(15~17cm)的依据。2. 装柱每组用50mL烧杯取溶胀的凝胶悬浆25~30mL,静置片刻,观察凝胶沉淀与水的体积之比,约为1:1即可,否则应作调整。轻轻搅匀杯中凝胶,用玻璃棒引流入柱,打开出水口,并不断地向柱内补充凝胶,直到凝胶沉淀高度位于标记上方约2cm为止,凝胶柱内若有气泡和断层或柱床表面干水和歪斜,都将影响分离效果。必要时,需倒出凝胶,重新装柱。3. 平衡取15mL洗脱剂,用滴管沿柱内壁旋转着缓缓流下,不可冲动胶平面,打开出水口,经洗脱液的流动,一方面清洗内壁,另一方面使胶床收紧。洗脱平衡完毕,胶床上方保留约4cm高水位,关闭出水口。此时,胶床高度≥15cm为宜。4. 准备收集取6只干净的刻度试管(除净试管内残留的水),1~6编号,并在试管2mL处作一标记,插入试管架上,为收集洗脱样品作好准备。5. 上样与收集打开出口排水,当胶床与上方水层的弯月面相切时,关闭出口,用滴管将0.2mL混合样液沿柱内壁缓缓加入,勿冲动胶面。上样完毕,打开出水口,开始收集一号管。每管收集洗脱液2mL。当样液进入胶床,其弯月面与胶平面相切时,暂停排液,用滴管将洗脱剂沿柱内壁旋转着加入1cm高水位,然后排液,至其弯月面与胶平面相切,再缓缓注入3~5cm高的洗脱剂。6. 洗脱不断向柱内加洗脱剂,保持胶床上水位3~5cm。出口流速控制在每6秒1滴,直至收集到6号管达2mL时,关闭出口。7. 鉴定另取6只干净试管,按收集顺序将洗脱液一分为二,即每管1mL,依次在试管架上排成二排。第一排每管加2滴BaCl2,根据白色沉淀多少,判断SO42-在各管中的浓度。第二排每管加1mL考马斯亮蓝G-250试剂,根据蓝色情况,判断蛋白质在各管中的浓度。将结果记录于下表中。若鉴定的第6号管中,仍有样品,表明洗脱和收集不够,需增加7号、8号……试管继续洗脱与收集,同上法鉴定其蛋白质和盐浓度情况。管 号项 目1234567891011白色沉淀量蓝色深浅8. 再生鉴定完毕,打开出水口,继续用2~3倍床体积洗脱剂洗脱,洗脱后关闭出口,以备下次使用。六. 结果处理1. 根据实验结果,在同一坐标系中,以收集的管号为横坐标,颜色深浅程度为纵坐标,绘制二条(蛋白质及(NH4)2SO4)洗脱曲线。2. 分析混合样品分离效果。七. 思考题1. 利用凝胶层析分离混合物时,怎样才能得到较好的分离效果?2. 还有哪些方法可进行蛋白质脱盐?附注1. 凝胶的再生通常层析柱经洗脱剂再生、平衡后,就可反复使用。但使用过多次后凝胶床体积变小,流速降低,凝胶污染杂质过多,甚至变色,需经再生后才可使用。再生方法有多种:如(1)用水进行逆向冲洗,再用洗脱剂平衡,便可重新使用。又如(2)把凝胶倒出,用6mol/L脲浸泡凝胶半小时,抽滤,再用水漂洗数次,除净脲,必要时重复上述操作即可重新使用。2. 凝胶的保存(1) 湿法保存,可保存几个月至一年,有多种方法: 加入防腐剂硫柳汞,使其浓度为0.005%,下次使用前,水洗除去硫柳汞。 加入几滴氯仿,摇匀存放。下次使用前用热水浴除去氯仿。(沸点60℃)。 凝胶保存在60~70%乙醇溶液中,即凝胶以部分收缩状态保存。(2) 干法保存此法操作不及湿法简便,但处理得好,凝胶存放时间长。先抽取过量水分,再向凝胶逐步加入百分浓度递增的乙醇溶液,每次停留一段时间,使凝胶逐步脱水,最后加入95%乙醇,凝胶脱手收缩。抽干,铺与搪瓷盆中,60~80℃经常翻动烘烤。若有结块,在下次膨胀时会散开的,不可用力敲碎,否则会破坏颗粒结构。3. 用盐析法分离提取麦清蛋白取10g小麦种子,粉碎。转入250mL具塞磨口锥形瓶中。加100mL蒸馏水,在康氏震荡器上震荡1小时。静置半小时,上清液以3000转/分钟离心15分钟。将上清液在布氏漏斗上(铺3~4层滤纸)抽滤。滤液应透明。用醋酸酸化滤液至pH4.7。加等体积的饱和硫酸铵溶液,边加边搅动,即有白色絮状沉淀生成。置冰箱过夜,使麦清蛋白全部盐析沉淀出来,以3000转/分钟离心20分钟,弃去上清夜,加10mL无离子水使沉淀溶解,即得麦清蛋白和硫酸铵的混合液。