液相质谱测定水杨酸含量

作者：http://d.g.wanfangdata.com.cn/Images/head_pic.gif张琰 http://d.g.wanfangdata.com.cn/Images/head_pic.gif陈文秋 http://d.g.wanfangdata.com.cn/Images/head_pic.gif余敏灵 Author：Zhang Yan Chen Wenqiu Yu Minling 作者单位：四川省眉山市人民医院,四川,眉山,620010 四川省乐山食品药品检验所,四川,乐山,614000摘要： 目的 建立测定羟苯乙酯中水杨酸含量的方法 .方法 采用反相高效液相色谱法,Diamonsil C18柱(250mm×4.6 mm,5μm),以0.05mol/L磷酸二氢钠缓冲液(pH=3.4)-乙腈(50:50)为流动相,检测波长为297 mm.结果水杨酸质量浓度在0.51～13.26 μg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系,平均回收率为99.0%,RSD=0.8%(n=6).结论 该法简便、准确、快速,适用于羟苯乙酯中水杨酸的含量测定.http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2012/08/201208201739_384784_2379123_3.jpg

期刊名称：解放军药学学报，2009，25（4）论文题目：高效液相色谱法测定复方乙酰水杨酸片中游离水杨酸含量论文内容：[img]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2010/01/201001292206_199650_1645752_3.jpg[/img][img]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2010/01/201001292206_199651_1645752_3.jpg[/img][img]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2010/01/201001292207_199652_1645752_3.jpg[/img]

【作者】 郑子华； 周斌；【机构】 贵州省贵阳市第二人民医院药剂科； 贵州省疾病控制中心 贵州 贵阳 550005； 贵州 贵阳 550004；【摘要】 目的:测定水氯酊中氯霉素和水杨酸的含量。方法:采用高效液相色谱法,色谱柱为Diamonsil C18柱(150mm×4.6mm,5μm),流动相为0.4％磷酸溶液-甲醇(50:50),紫外检测波长为304nm,流速为1.0 mL/min。结果:氯霉素的线性范围为9.0～45.0μg/mL,回收率为95.85％,RSD为1.82％;水杨酸的线性范围为18.5～94.0μg/mL,回收率为101.17％,RSD为1.49％。结论:方法简便、准确,可作为水氯酊的质控方法。 更多还原http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2012/08/201208271628_386496_2379123_3.jpg

期刊名称：中国现代应用药学，2009，26（2）论文题目：HPLC测定复方乙酰水杨酸片中三组分含量论文内容：[img]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2010/01/201001292156_199632_1645752_3.jpg[/img][img]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2010/01/201001292157_199636_1645752_3.jpg[/img][img]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2010/01/201001292158_199638_1645752_3.jpg[/img][img]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2010/01/201001292158_199639_1645752_3.jpg[/img]

超高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]-串联质谱法测定婴幼儿配方奶粉中叶酸的含量[align=center]户江涛[/align][align=center]（黑龙江省农垦科学院测试化验中心，黑龙江 佳木斯 154007 ）[/align]摘要：本实验建立了超高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]-串联质谱法建立了检测婴幼儿配方奶粉中叶酸含量的分析方法。试样经50℃热水溶解，超声提取，等电法去除蛋白后，在T[sub]3[/sub]色谱柱上以0.1%甲酸水和乙腈为流动相进行[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]分离，质谱检测采用电喷雾正离子化模式和多反应监测模式（MRM）。结果表明该方法在浓度范围内线性关系良好，相关系数（r）为0.9998，定量下限（LOQ）为10 [color=black]u[/color]g/100 g，加标回收率为83.7%~101%，相对标准偏差（RSD）为2.5%~5.1%（n=6）。本方法快速、灵敏、准确，特别适和大批量婴幼儿配方奶粉中叶酸含量检测。关键词：超高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]-串联质谱；婴幼儿配方奶粉；叶酸[align=center]Determination of Folic acid in infant formula by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[/align][align=center]HU Jiangtao[/align][align=center](Testing and Analysis Center of Heilongjiang Academy of Land Reclamation Sciences, Jiamusi 154007,China)[/align]Abstract：A method was developed for the determination of Folic acid in infant formula by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(UP[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LC-MS[/color][/url]/MS). The samples were disolved by 50℃ water，extracted by ultrasound，after protein was removed by Isoelectric method, Folic acid was separated on a Waters HSS T[sub]3[/sub] column with gradient elution with the mobile phase of 0.1% formic acid and acetonitrile, and finally detected by positive eletrospray ionization-mass spectrometry(ESI[sup]+[/sup]-MS/MS) in multiple reaction monitoring(MRM) mode. The results showed the linearity of Folic acid was good in the concentration range of 0.02~1 mg/L, and the correlation coefficient was 0.9998. The limit of quantification(LOQ) was 10 ug/100 g，the mean recovery was 83.7%~101%, and the relative standard deviation(RSD) was 2.5%~5.1%（n=6）.This method is rapid, sensitive, accurate and suitable for simultaneous determination of Folic acid in infant formula.Key words: UP[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LC-MS[/color][/url]/MS infant formula Folic acid叶酸（[font=helvetica][color=#333333]C[/color][/font][font=helvetica][sub][size=12px][color=#333333]19[/color][/size][/sub][/font][font=helvetica][color=#333333]H[/color][/font][font=helvetica][sub][size=12px][color=#333333]19[/color][/size][/sub][/font][font=helvetica][color=#333333]N[/color][/font][font=helvetica][sub][size=12px][color=#333333]7[/color][/size][/sub][/font][font=helvetica][color=#333333]O[/color][/font][font=helvetica][sub][size=12px][color=#333333]6 [/color][/size][/sub][/font]），[font=helvetica][color=#333333]又名维生素B[/color][/font][font=helvetica][sub][color=#333333]9[/color][/sub][/font][font=helvetica][color=#333333]，[/color][/font]是一种水溶性维生素，在人类蛋白质合成、细胞分裂与生长过程中具有重要作用。叶酸缺乏可能会引起婴幼儿[font=helvetica][color=#333333]发生神经闭合不完全[/color][/font]，从而导致神经性厌食症，叶酸虽然广泛存在于[font=helvetica][color=#333333]如菠菜等绿叶蔬菜及肝脏等动物源食品中，但在婴幼儿阶段（特别小于6个月婴儿）很长一段时间不能直接食用这些辅食，[/color][/font]这时婴幼儿配方奶粉便成为婴幼儿获取叶酸的重要途径，因此准确测定婴幼儿配方奶粉中叶酸含量有重要意义。目前食品中叶酸测定的国标方法《GB 5009.211-2022 食品安全国家标准 食品中叶酸的测定》为微生物法，该方法是将鼠李糖乳杆菌接种至含有叶酸的培养基中，培养一段时间后测定吸光度，利用在一定范围内叶酸含量与吸光度值符合某种规律而得到叶酸含量数值。该方法对菌种活力、培养条件、检验人员操作水平要求较高，检测周期较长，且容易受到基质干扰、检测结果重复性往往较差。因此，制定一种准确、高效、快速测定婴幼儿配方奶粉中叶酸的检测方法十分必要。[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]-串联质谱测定法具有前处理简单、分析速度快、抗基质干扰能力强等优点，能有效避免叶酸在长时间、繁琐的前处理及检测过程中损失，可以为奶粉中叶酸含量的测定提供一种有效的检测手段。本文建立的超高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]-串联质谱法测定奶粉中叶酸含量[color=black]的方法前处理过程简便、分析时间短、灵敏度高、抗干扰能力强，且用到的都是实验室常用试剂，实验成本较低，特别适用于大批量[/color]婴幼儿配方[color=black]奶粉中叶酸[/color]含量的检测。1 实验部分1.1 材料与试剂[color=black]叶酸（纯度[/color][font=宋体][color=black]≥[/color][/font][color=black]99%，Dr公司）；乙腈、甲酸（色谱纯，Fisher公司）；盐酸、氢氧化钠（优级纯，科密欧公司）；0.2 um水系滤膜；实验用水为Millipore纯水仪制备。[/color]1.2 仪器与设备UPLC XEVO TQ-MS超高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]串联质谱仪（Waters公司）；涡旋振荡器。1.3 [color=black]叶酸[/color]标准储备液的配置称取一定量叶酸[color=black]标准品[/color]，用甲醇配置成质量浓度为100 ug/mL标准储备液，于-18℃冰箱保存，待用；临用前将溶液回温至室温，并吸取一定体积储备液用水逐级稀释成所需浓度的标准工作液。1.4 样品前处理准确称取2.00 g(精确到0.01 g) 婴幼儿配方奶粉试样于50 mL刻度离心管中，加入10 mL 50℃纯水使奶粉充分溶解，超声提取10 min，然后用2 mol/L盐酸调节试样pH值至1.7，静置5 min后用2 mol/L氢氧化钠调节试样溶液pH至4.5，用纯水定容至25 mL，在离心机中以10000 r/min离心10 min[color=black]，取上清液[/color]过0.2 um水系微孔滤膜后供UP[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LC-MS[/color][/url]/MS分析测定。1.5 [url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]及质谱条件[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]：色谱柱:Waters HSS [font=times new roman]T3（1.8 μm，50mm×2.1mm）；柱温：35℃[/font]；流速：[font=times new roman]0.3 [/font]mL/min；进样量：[font=times new roman]2[/font] [font=times new roman]μL；流动相A：乙腈；流动相B：0.1%的甲酸水溶液。梯度洗脱程序：0~0.5min，5% A；0.5~3. 0 min，5%~100% A；3. 0 ~4. 0 min，100%A，4 ~4.1min，100% A~5% A，4.1 ~5.0min 5% A。[/font]质谱：离子源：电喷雾离子源( ESI [sup]+[/sup] ) ；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测( MRM)；毛细管电压：3.0 kv；离子源温度：150℃；去溶剂气温度：500℃；去溶剂气流量：1000 L /h；定性、定量离子对及碰撞能量见表1。[align=center]表1叶酸的质谱参数[/align][table][tr][td][align=center]分析物[/align][/td][td][align=center]锥孔电压/V[/align][/td][td][align=center]母离子/(m/z)[/align][/td][td][align=center]子离子/(m/z) [/align][/td][td][align=center]碰撞能量/V[/align][/td][/tr][tr][td]叶酸[/td][td][align=center]18[/align][/td][td][align=center]442.3[/align][/td][td][align=center]295﹡[/align]176[/td][td][align=center]18[/align][align=center]30[/align][/td][/tr][/table]﹡为定量离子2 结果与讨论2.1 色谱质谱条件及前处理过程的优化流动相的选择：B族维生素在酸性条件下比较稳定，对比了酸性体系（0.1%甲酸水溶液）与甲醇、乙腈的流动相体系组合，发现叶酸在乙腈体系中响应值更高，故本研究采用0.1%甲酸水溶液+乙腈流动相体系。色谱柱的选择：比较了[font=宋体]Waters [/font]BEH C[sub]18[/sub]（1.7 μm，50mm×2.1mm）和[font=宋体]Waters [/font]HSS T[sub]3[/sub]（1.8 μm，50mm×2.1mm）两种不同填料的分析柱，实验时发现目标物在C[sub]18[/sub]上保留比T[sub]3[/sub]弱，考虑到若出峰太早可能造成奶粉中一些极性强的基质随目标物共流出，可能会干扰目标物测定，因此本方法采用了HSS T[sub]3[/sub]色谱柱。质谱参数优化：将1.0 mg/L 叶酸标准溶液直接注射到质谱中，在正离子模式下分别进行母离子和子离子全扫描，同时优化质谱条件，找到两对响应好高、干扰小的子离子对，最终确定的质谱条件见表1，相应的色谱质谱图见图1、图2。前处理过程优化：叶酸属于水溶性维生素，易于氧化，这个实验过程需在避光条件下进行。通过查阅相关文献的前处理方法，发现通过先酸化样品再用NaOH调节pH的等电法去除蛋白方式，可以得到很好的提取和净化效果，能大大减少奶粉中蛋白等大分子基质对目标物干扰；调节pH后的溶液产生了蛋白沉淀，需要用过滤或离心方式予以去除，通过实验比较了过滤和离心去除蛋白沉淀的效果，发现高速离心后得到的上清液明显更容易通过0.2 um水系滤膜，综合以上因素本实验最终采用了1.4的前处理方法。[align=center][img]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2023/10/202310041348335007_5097_1729077_3.png[/img][/align][align=center]图1 [color=black]叶酸[/color]标准溶液（1 ug/mL）MRM色谱图[/align][align=center][img]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2023/10/202310041348338570_9110_1729077_3.png[/img][/align][align=center]图2 奶粉样品中[color=black]叶酸[/color]MRM色谱图[/align][color=black]2.2 线性范围和定量限[/color][color=black]吸取不同体积的叶酸标准储备液（1.3），用[/color]纯水[color=black]分别配置不同浓度的[/color]上机标准溶液，以各自定量离子的峰面积为Y对应质量浓度X（[color=black]m[/color]g/L）做标准曲线，得到的线性方程和相关系数见表2；以10倍信噪比（S/N）计算得到叶酸的定量下限，结果见表2。表2 叶酸标准溶液的线性方程、相关系数和定量下限（LOQ）[table][tr][td][align=center]分析物[/align][/td][td][align=center]线性范围/(mg/L)[/align][/td][td][align=center]线性方程[/align][/td][td][align=center]R[/align][/td][td][align=center]LOQ/(ug/100 g)[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]叶酸[sub] [/sub][/align][/td][td][align=center]0.02~1[/align][/td][td][align=center]Y=12793X-56.759[/align][/td][td][align=center]0.9998[/align][/td][td][align=center]10[/align][/td][/tr][/table][color=black]2.3回收率和精密度[/color][color=black]选用[/color]不添加叶酸的奶粉样品作为基质进行加标。添加水平为：[color=black]20，100，200[/color][size=12px] ug/100g。[/size][color=black]每个[/color]水平重复6次，[color=black]同时做该奶粉的本底实验。[/color]按照1.4前处理方法处理后上机检测，回收率计算结果见表3。结果表明，该方法叶酸的平均回收率为83.7%~101%，相对标准偏差（RSD，n=6）为2.5%~5.1%，均满足实验要求。[align=center]表3 奶粉叶酸的加标回收率和相对标准偏差（n=6）[/align][table][tr][td][align=center]分析物[/align][/td][td][align=center]添加水平(ug/100g)[/align][/td][td][align=center]回收率/%[/align][/td][td][align=center]相对标准偏差/%[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]叶酸[/align][sub] [/sub][/td][td][align=center]20[/align][align=center]100[/align][align=center]200[/align][/td][td][align=center]89.0±5.3[/align][align=center]95.3±2.7[/align][align=center]98.5±2.5[/align][/td][td][align=center]5.1[/align][align=center]3.2[/align][align=center]2.5[/align][/td][/tr][/table][color=black]2.4实际样品分析[/color][color=black]采用本方法随机抽取市售8批次婴幼儿配方奶粉，对其叶酸含量进行测定[/color]，实测值、标示值及实测值与标示值比值见表4。结果表明，这些样品中叶酸实测含量均符合《GB 28050-2011 食品安全国家标准 预包装食品营养标签通则》中对维生素等营养成分的规定——婴幼儿配方奶粉中叶酸实际含量不应低于标示值的80%。[align=center]表4 实际样品中叶酸实测值与标示值比对结果[/align][table][tr][td][align=center]样品编号[/align][/td][td][align=center]实测值(ug/100g)[/align][/td][td][align=center]标示值(ug/100g)[/align][/td][td][align=center]比值[/align][/td][/tr][tr][td]1[sub] [/sub]2345678[/td][td][align=center]65[/align][align=center]156[/align][align=center]103.2[/align][align=center]57[/align][align=center]117[/align][align=center]86.5[/align][align=center]79[/align][align=center]101[/align][/td][td]81.3203230134106146198185[/td][td][align=center]1.25[/align]1.302.232.350.911.692.511.83 [/td][/tr][/table]3 结语本文建立了超高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]-串联质谱法（UP[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LC-MS[/color][/url]/MS）测定婴幼儿配方奶粉中[color=black]叶酸[/color]含量的分析方法。该方法具有较高的灵敏度、准确度和精密度，前处理快速、简单，特别适合大批量样品的检测。参考文献：[1] GB 5009.211-2016 食品安全国家标准 食品中叶酸的测定[s].[2] GB 28050-2011 食品安全国家标准 预包装食品营养标签通则[s].[3]张丽芳,张鑫,周鑫，等. 高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]法同时测定婴幼儿奶粉中7种水溶性维生素[J].[size=13px] [/size]食品工业，2022,43(01):[size=13px] [/size]277-280.[4]刘娜,陈大舟,汤桦，等. 婴幼儿奶粉中8种水溶性维生素的高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]同时测定[J].[size=13px] [/size]分析测试学报，2008,27(4):[size=13px] [/size]408-411.[5]严华,崔凤云,别玮，等. 超高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]-同位素稀释质谱法同时测定婴幼儿奶粉中10种水溶性维生素 [J].[size=13px] [/size]食品安全质量检测学报，2020,17(11):[size=13px] [/size]5871-5878.[6]郭建博,宋莉,牟霄，等.超高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]法快速测定复合维生素产品中的10种水溶性维生素 [J].[size=13px] [/size]食品安全质量检测学报，2017,8(5):[size=13px] [/size]1794-1799.[7]夏静,俞婧,孙磊，等.功能性饮料中9种水溶性维生素的HP[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LC-MS[/color][/url]-MS同步检测技术 [J]. 食品科学，2014,35(12): 196-199.[/s][/s]

【作者】 霍保方； 徐英宏； 杨君； 段旭； 【Author】 HUO Bao-fang, XU Ying-hong , YANG Jim, DUAN Xu( Second Affiliated Hospital, China Medical University, Shenyang 110004, China) 【机构】 中国医科大学附属第二医院药剂科； 中国医科大学附属第二医院药剂科 辽宁 沈阳 110004； 辽宁 沈阳 110004； 辽宁 沈阳 110004； 【摘要】 目的建立同时测定复方麝香草酚醑中麝香草酚和水杨酸含量的方法。方法采用高效液相色谱法。分析色谱柱Dia—monsil C18(4.6 mm ×150 mm,5μm),流动相为乙腈-甲醇-磷酸二氢钾(0.02 moL·L-1用磷酸调节pH值至3.0)(45:10:45),流速为1.0 mL·min-1,检测波长231 nm。结果该方法不受处方中其他成分干扰,麝香草酚和水杨酸浓度均在0.1-0.3 mg·L-1内,峰面积与浓度呈良好的线性关系(rthymol=0.999 9,rsalicylic acid=0.999 8),平均回收率:麝香草酚为99.5%、水杨酸为100.1%。RSD 分别为1.1%,1.3%(n=5)。结论该方法可用于复方麝香草酚醑中2种主要成分的含量测定。 【关键词】 高效液相色谱法； 复方麝香草酚醑； 麝香草酚； 水杨酸；http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2012/09/201209022124_388017_1838299_3.jpg

【作者】 袁祥慧； 杨惠莲（重庆市药品检验所）【摘要】 目的建立测定五苓片中肉桂酸含量的高效液相色谱法。方法色谱柱采用Diamonsil C18柱(250 mm×4.6 mm,5μm),以乙腈-0.1%磷酸溶液(30∶70)为流动相,流速1.0 mL/min,检测波长285 nm。结果肉桂酸进样量在0.009 608～0.288 24μg范围内与峰面积线性关系良好,r=0.999 9(n=6);平均回收率为96.39%,RSD为0.44%(n=6)。结论高效液相色谱法专属性强、操作简便、结果准确、重现性好,可用于测定五苓片中肉桂酸的含量。 【谱图】 http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2012/08/201208211746_385115_1609970_3.jpg

[size=16px]超高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]-串联质谱法测定奶粉中生物素的含量[/size][align=center][size=16px]户江涛[/size][/align][align=center][size=16px]（黑龙江省农垦科学院测试化验中心，黑龙江 佳木斯 154007 ）[/size][/align][size=16px]摘要：采用超高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]-串联质谱法建立了检测奶粉中生物素含量的分析方法，对试样提取、净化条件，流动相、色谱柱和质谱条件进行了优化，结果表明该方法与国标微生物法对同一样品检测得到的生物素含量基本一致，但检测所需时间大大减少，且抗干扰能力、精密度均比微生物法高，特别适和大批量奶粉中生物素含量检测。关键词：超高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]-串联质谱；奶粉；生物素生物素又称维生素B7，是生物体内羧基转化酶作用的一种辅酶，在人体生长、代谢、发育过程中发挥着重要的作用。人类自身不能合成生物素，需从膳食中获得，而奶粉是人类（特别是婴幼儿）获取生物素的重要途径，准确测定奶粉中生物素含量有重要意义。目前国家标准规定的生物素测定方法《GB 5009.259-2016 食品安全国家标准 食品中生物素的测定》为微生物法。该方法需要购买特定菌种，成本较高，且菌种难保存、易受污染，实验操作复杂、费时费力、技术难度大、对检验人员和实验室要求较高，且容易受到基质干扰、检测结果重复性较差。同时奶粉成分复杂，所含生物素含量极低，一般为十几个微克/100克。因此，制定一种准确、高效、便捷、灵敏度高的生物素测定方法迫在眉睫。基于高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]的分离能力和质谱的高灵敏度、高选择性，采用[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]串联质谱测定法具有前处理简单、分析速度快，适用的基质范围广、实用性强，可以为奶粉中生物素含量的测定提供一种有效的检测手段。本文建立的超高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]-串联质谱法测定奶粉中生物素含量[color=black]的方法前处理过程简便、分析时间短、灵敏度高、抗干扰能力强，特别适用于大批量奶粉样品中生物素[/color]含量的检测。1 实验部分1.1 材料与试剂[color=black]生物素（纯度[/color][font=宋体][color=black]≥[/color][/font][color=black]99%，Sigma公司）；婴儿配方乳粉定量分析质控样品（BQC1051147452，北京普天同创生物科技有限公司）；乙腈、甲酸（色谱纯，Fisher公司）；Prime HLB固相萃取柱（200 mg，3 mL，[/color][font=宋体]Waters[/font][color=black]公司）；0.2 um有机系滤膜；实验用水为Millipore纯水仪制备。[/color]1.2 仪器与设备UPLC XEVO TQ-S超高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]串联质谱仪（Waters公司）；涡旋振荡器。1.3 [color=black]生物素[/color]标准储备液的配置称取一定量生物素[color=black]标准品[/color]，用50%乙醇-水溶液配置成质量浓度为100 ug/mL标准储备液，于2~4℃冰箱保存（有效期1个月），待用；临用前将溶液回温至室温，并吸取一定体积储备液用水逐级稀释成所需浓度的标准工作液。1.4 样品前处理准确称取1.00 g(精确到0.01 g)奶粉试样于50 mL离心管中，加入10.00 mL纯水涡旋混匀2 min，然后加入10.00 mL乙腈，涡旋混匀1 min，然后在离心机中以15000 r/min离心5 min，取出后吸取2 mL上清液置于[color=black]Prime HLB固相萃取柱中，使其自然流出弃去最初几滴，然后用玻璃试管接取流出液约1 mL涡旋混匀，[/color]过0.22[font=宋体]ｕ[/font]m有机系微孔滤膜后供UP[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LC-MS[/color][/url]/MS分析测定。1.5 [url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]及质谱条件[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]：色谱柱:Waters HSS [font=times new roman]T3（1.8 μm，100mm×2.1mm）；柱温：30℃[/font]；流速：[font=times new roman]0.3 [/font]mL/min；进样量：[font=times new roman]2[/font] [font=times new roman]μL；流动相A：乙腈；流动相B：0.1%的甲酸水溶液。梯度洗脱程序：0~0.5min，10% A；0.5~3. 0 min，10%~100% A；3. 0 ~4. 0 min，100%A，4 ~4.1min，100% A~10% A，4.1 ~5.0min 10% A。[/font]质谱：离子源：电喷雾离子源( ESI [sup]+[/sup] ) ；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测( MRM)；毛细管电压：3.2 kv；离子源温度：150℃；去溶剂气温度：500℃；去溶剂气流量：1000 L /h；定性、定量离子对及碰撞能量见表1。[/size][align=center][size=16px]表1生物素的质谱参数[/size][/align][table][tr][td][align=center][size=16px]分析物[/size][/align][/td][td][align=center][size=16px]锥孔电压/V[/size][/align][/td][td][align=center][size=16px]母离子/(m/z)[/size][/align][/td][td][align=center][size=16px]子离子/(m/z) [/size][/align][/td][td][align=center][size=16px]碰撞能量/V[/size][/align][/td][/tr][tr][td][size=16px]生物素[/size][/td][td][align=center][size=16px]30[/size][/align][size=16px][/size][/td][td][align=center][size=16px]245[/size][/align][size=16px][/size][/td][td][align=center][size=16px]227﹡[/size][/align][align=center][size=16px]97[/size][/align][size=16px][/size][/td][td][align=center][size=16px]13[/size][/align][align=center][size=16px]25[/size][/align][size=16px][/size][/td][/tr][/table][size=16px]﹡为定量离子2 结果与讨论2.1 色谱质谱条件及前处理过程的优化流动相的选择：对比了酸性体系（0.1%甲酸水溶液）与甲醇、乙腈的流动相体系组合，结果发现生物素在乙腈体系中响应值比甲醇更好一些，故本研究采用0.1%甲酸水溶液+甲醇流动相体系。色谱柱的选择：比较了[font=宋体]Waters [/font]BEH C[sub]18[/sub]（1.7 μm，50mm×2.1mm）和[font=宋体]Waters [/font]HSS T[sub]3[/sub]（1.8 μm，100mm×2.1mm）两种不同填料的分析柱，实验时发现目标物在这两款色谱柱上响应值差不多，但目标物在BEH C[sub]18[/sub]上保留时间比HSS T[sub]3[/sub]要短，考虑到生物素本身属于水溶性维生素，极性较强，若出峰太早可能造成奶粉中一些极性强的基质随目标物一起共流出进而干扰目标物测定，因此本方法采用了HSS T[sub]3[/sub]色谱柱。质谱参数优化：将1.0 mg/L 生物素标准溶液直接注射到质谱中，在正离子模式下进行母离子全扫描，发现目标物各自对应的准分子离子峰[M+H][sup]+[/sup]具有很好的响应，然后在分别进行子离子全扫描，各得到两对丰度高、干扰小的子离子对进行MRM监测，最终确定的质谱条件见表1，相应的色谱质谱图见图1、图2。前处理过程优化：生物素属于水溶性维生素，用纯水作为提取试剂可以得到很好的提取效果。但实验过程中发现，用纯水将奶粉溶解后整个溶液呈乳白色，只通过离心方式很难去除其中大量的蛋白、脂肪等杂质，需要对提取液进行除蛋白操作。通过考察乙酸铅、三氯乙酸、乙腈等几种常用的沉淀蛋白方法，综合考虑在去除蛋白的同时要尽可能减少其它杂质的引入，因此本方法采用乙腈除蛋白的方式，比较了几种不同水/乙腈比例，最终选定水/乙腈（1:1体积比）达到最优的实验效果。对于脂肪的去除则选用了目前较流行的[color=black]Prime HLB固相萃取柱通过式方法，即提取液通过Prime HLB时脂肪等大分子保留在SPE小柱上，目标物不保留以达到去除脂肪等杂质的目的，[/color]综合以上因素本实验最终采用了1.4的前处理方法。[/size][align=center][size=16px][img]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2022/10/202210071506558084_124_1729077_3.jpg[/img][/size][/align][align=center][size=16px]图1 [color=black]生物素[/color]标准溶液（10 ng/mL）MRM色谱图[/size][/align][size=16px][/size][align=center][size=16px][img]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2022/10/202210071506561980_1283_1729077_3.jpg[/img][/size][/align][align=center][size=16px]图2 奶粉样品中[color=black]生物素[/color]MRM色谱图[/size][/align][size=16px][color=black]2.2 线性范围和定量限[/color][color=black]吸取不同体积的生物素标准储备液（1.3），用[/color]纯水[color=black]分别配置不同浓度的[/color]上机标准溶液，以各自定量离子的峰面积（或与内标峰面积比值）为Y对应质量浓度X（[color=black]m[/color]g/L）做标准曲线，得到的线性方程和相关系数见表2；以10倍信噪比（S/N）计算得到生物素的定量下限，结果见表2。表2 生物素标准溶液的线性方程、相关系数和定量下限（LOQ）[/size][table][tr][td][align=center][size=16px]分析物[/size][/align][/td][td][align=center][size=16px]线性范围/(ng/mL)[/size][/align][/td][td][align=center][size=16px]线性方程[/size][/align][/td][td][align=center][size=16px]R[/size][/align][/td][td][align=center][size=16px]LOQ/(ug/100g)[/size][/align][/td][/tr][tr][td][align=center][size=16px]生物素[sub] [/sub][/size][/align][/td][td][align=center][size=16px]0.2~50[/size][/align][size=16px][/size][/td][td][align=center][size=16px]Y=3078.1X-106.32[/size][/align][size=16px][/size][/td][td][align=center][size=16px]0.9993[/size][/align][size=16px][/size][/td][td][align=center][size=16px]0.5[/size][/align][/td][/tr][/table][size=16px][color=black]2.3回收率和精密度[/color][color=black]生物素在奶粉中天然存在[/color]，选取已知生物素含量的奶粉作为基质进行加标。具体添加水平为：[color=black]0.5，5，50[/color] ug/100g。[color=black]每个[/color]水平重复6次，[color=black]同时做该奶粉的本底实验。[/color]按照1.4前处理方法处理后上机检测，回收率计算结果（扣除空白后）见表3。结果表明，该方法生物素的平均回收率为87.2%~110%，相对标准偏差（RSD，n=6）为2.3%~5.2%，均满足实验要求。[/size][align=center][size=16px]表3 奶粉生物素的加标回收率和相对标准偏差（n=6）[/size][/align][table][tr][td][align=center][size=16px]分析物[/size][/align][/td][td][align=center][size=16px]添加水平(ug/100g)[/size][/align][/td][td][align=center][size=16px]回收率/%[/size][/align][/td][td][align=center][size=16px]相对标准偏差/%[/size][/align][/td][/tr][tr][td][align=center][size=16px]生物素[/size][/align][size=16px][sub] [/sub][/size][/td][td][align=center][size=16px]0.5[/size][/align][align=center][size=16px]5[/size][/align][align=center][size=16px]50[/size][/align][/td][td][align=center][size=16px]86.8[/size][/align][align=center][size=16px]93.2[/size][/align][align=center][size=16px]91.6[/size][/align][size=16px][/size][/td][td][align=center][size=16px]4.6[/size][/align][align=center][size=16px]3.3[/size][/align][align=center][size=16px]2.1[/size][/align][size=16px][/size][/td][/tr][/table][size=16px][color=black]2.4实际样品分析[/color][color=black]为进一步验证该方法的准确性，采用本方法和《[/color]GB 5009.259-2016[color=black]》微生物法同时对北京普天同创生物科技有限公司的奶粉质控样品BQC1051147452生物素含量进行检测，结果见表4[/color]。由表4可知，UP[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LC-MS[/color][/url]/MS法测定结果与国标方法的结果基本一致，无显著性差异，但前者所需时间更短，精密度更好。[/size][align=center][size=16px]表4 奶粉质控样品[color=black]BQC1051147452[/color]生物素的测定结果[/size][/align][table][tr][td][align=center][size=16px]检测方法[/size][/align][/td][td][align=center][size=16px]特性值区间(ug/100g)[/size][/align][/td][td][align=center][size=16px]测定平均值（n=6）[/size][/align][/td][td][align=center][size=16px]相对标准偏差/%（n=6）[/size][/align][/td][/tr][tr][td][size=16px]UP[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LC-MS[/color][/url]/MS法微生物法[sub] [/sub][/size][/td][td][align=center][size=16px]15.6~22.4[/size][/align][align=center][size=16px]15.6~22.4[/size][/align][size=16px][/size][/td][td][size=16px]18.718.1[/size][/td][td][align=center][size=16px]2.5[/size][/align][size=16px] 4.6[/size][/td][/tr][/table][size=16px]3 结语本文建立了超高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]-串联质谱法（UP[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LC-MS[/color][/url]/MS）测定奶粉中[color=black]生物素[/color]含量的分析方法。该方法具有较高的灵敏度、准确度和精密度，前处理步骤简单，分析速度快，特别适合大批量样品的检测。参考文献：[1] GB 5009.259-2016 食品安全国家标准 食品中生物素的测定.[2] 薛霞, 赵慧男, 魏莉莉, 等. 超高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]-串联质谱法测定蜂蜜中五种水溶性维生素的含量[J]. 食品与发酵工业. 2021,47(12) : 250-256.[3] 李佳兴, 周利, 金艳, 等. 超高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]-串联质谱法测定枸杞子中8种水溶性维生素[J]. 食品科技. 2018,43(11) : 336-341.[/size]