条件性位置偏爱实验系统

类器官（Organoid）是十四五国家重点研发计划中6个重点专项之一，是国家科技部的重点关注项目。近年来相关的项目和文章也迅速升温，仅过去的2023年上半年，“Organoid”相关文章就有两千多篇，远超前几年同期水平，意味着该领域的研究热度持续上升。 国自然基金申报“内卷”趋势越来越显著，而类器官（Organoid）作为前沿热点技术之一，近年来备受申请人和评审专家们的关注。类器官相关的课题和项目在申请国自然上具有得天独厚的优势。尤其是2018年以来，类器官相关方向，连续几年被国自然申报指南列为推荐项目的研究方向。作为具有高适用度的体外模型之一，类器官从最初的体外模型补充参考的工具，逐渐开始“挑国自然大梁”。PubMed类器官相关文章数量趋势 近期，一篇以《人脑类器官中的谱系记录》（Lineage recording in human cerebral organoids）为题的类器官文献登上Nature Methods。该文献结合单细胞测序、空间转录组以及4D光片显微成像技术（长时间高分辨类器官光片显微镜），实现了人类大脑类器官的谱系记录。 近年来，人类诱导多能干细胞iPSCs衍生的类器官，为研究人体器官发育提供了模型。单细胞测序技术能够高度鉴定系统内细胞状态的描述，然而，目前还没有很好的方法直接测量细胞谱系关系。谱系偶联scRNA-seq允许在复杂组织和其他细胞分化场景中更好地注释细胞命运规范和轨迹推断。长时间高分辨类器官光片显微镜基于图像的方法，为捕捉全面的发育动态提供了一种可视化方法。因此，谱系偶联单细胞转录组学和长时间高分辨类器官光片显微镜为记录和理解iPSCs建立的类器官系统的谱系动力学提供了全面的解决方案。 长时间高分辨类器官光片显微镜-LS2是一款全新光片成像平台，可实现活细胞的长时间、高分辨、高通量、多样品同时成像，非常适合对直径达300 μm的光敏样品（如卵母细胞，胚胎和类器官）进行长期实时高时空分辨率和低光毒性的观察与成像。这一成熟的长时间实时类器官成像技术也为本实验提供了关键数据支撑。 作者建立了一个双通道细胞谱系记录系统(iTracer) 来了解脑类器官脑区域化过程中的谱系动力学。系统设置从最原始的iPSCs样本库中开始跟踪克隆，同时也允许使用诱导疤痕在不同的时间点进行谱系记录，以解决动力学与神经元命运之间建立关系尚不明确的问题。该系统既可以进行克隆分析，也可以探索细胞命运建立的时间动态，避免了多轮标记。在脑类器官发育的时间过程中进行的单细胞转录组分析证实，在单个类器官中形成了不同的脑区域，类器官中的脑区域特征与发育中的小鼠大脑空间原位地图集的对应区域非常相似。使用iTracer来探索在脑类器官模式和神经发生过程中与分子特征相结合的谱系，并表明该系统与空间转录组学兼容。 图1 iTracer Sleeping Beauty示意图并且揭示了人类大脑类器官细胞命运的克隆性 为了将分子状态、细胞谱系和位置信息联系起来，作者建立了“空间iTracer”，它使用空间转录组测序技术来测量基因表达和iTracer读取结果。数据表明，在脑类器官发育过程中，相关细胞倾向于聚集在类器官的同一区域，接收相似的图案信号，因此平均而言被限制在相同的大脑区域身份中。iTracer和空间iTracer共同揭示了脑类器官不同脑区细胞克隆的富集，这可以追溯到初始化EB 内的克隆。 图2 空间iTracer连接脑类器官的谱系、分子状态和位置信息 为了直接测量神经外胚层到神经上皮阶段发育中的类器官的谱系动力学和克隆的空间积累，作者使用4D光片显微成像技术（长时间高分辨类器官光片显微镜）建立了发育中的脑类器官的长期实时成像(图3a)。简单地说，作者生成了含有5% iPSCs的类器官，其细胞核被FUS-mEGFP荧光报告标记，将EB嵌入成像室的Matrigel中，并在神经诱导培养基中培养，类器官使用Viventis Microscopy开发的LS1 Live光片显微镜成像，使用X25物镜，每2 μm获得连续z步，共150步。采集帧率为30分钟，总共100小时(200帧)用于跟踪。并跟踪发育 65-100小时(图3b)。随着EB的生长和发育，观察到几个管腔的形成，每个管腔都可以在三维上跟踪(图3c)。 图3 脑类器官发育的长时间高分辨类器官光片显微镜4D成像 在整个记录时间内，作者使用Mastodon直接跟踪单个细胞核的谱系，这是一个允许在大型4D数据集中半自动跟踪和管理细胞核谱系的方案(图3d,e)。他可视化了源自原始细胞核的子细胞的空间分布，称之为谱系1 (L1)，并生成了100小时增殖后的谱系树(图3f)。一个细胞周期的平均持续时间估计为17.3小时。作者观察到，在整个记录时间内，L1仍然局限于腔内的同一区域(图3d)。跟踪了另外三个核，其中两个核与L1 (L2-L3)在相同的管腔区域相邻，第三个核(L4)位于EB中一个截然相反的未来管腔区域(图3g)。作者量化了每个树之间的空间距离，并检查了类器官3D空间内所有子细胞的分布(图3g-i)。在65小时的过程中，初始化细胞核平均产生13个后代细胞核，它们都填充在扩大的类器官中，但在空间上仍然局限于亲本管腔，表现出有限的远离其谱系成员的迁移(图3g-i)。这些结果表明，克隆的早期空间排列随后的局部扩增导致脑区域的不同谱系组成，这证实了之前基于iTracer的类器官脑区域克隆性观察(图3j)。 脑类器官发育的长时间高分辨类器官光片成像视频（点击图片即可观看） 另外，作者还使用iTracer来确定细胞在脑类器官发育过程中何时限制了它们的命运。研究者使用谱系记录器的两个通道(在EB初始化和发育过程中诱导的疤痕中引入的条形码)以及单细胞转录组来构建命运映射的全类器官系统发育。使用iTracer以高分辨率评估不同脑类器官区域中祖细胞到神经元谱系的可变性。为了实现深层谱系采样，他们对200 μm iTracer类器官切片的两个微解剖外周区域进行了谱系偶联单细胞转录组学。 作者整合了静态序列标记和基于CRISPR 技术的动态序列标记，可用于标记起始时间点的不同干细胞，也包括基于 CRISPR 编辑系统的动态序列标记，结合带有可诱导 Cas9 蛋白基因的干细胞，即可在特定时间点产生额外的随机突变，从而得到第二层细胞谱系信息。通过使用4D光片显微成像技术（长时间高分辨类器官光片显微镜），对稀疏核标记的大脑类器官进行追踪观察。而在此基础上，通过在不同时间点引入动态序列标记，还可得到大脑类器官中不同细胞类型、特别是不同类型神经元的命运决定关键时间点，并对同一多能干细胞产生的不同后代神经元的分化情况进行比较。进而得出在分裂分化过程中，大脑类器官的细胞并未发生显著的细胞迁移，因而其后代细胞呈聚集分布，并在类似的微环境作用下，被诱导为同样类型的神经元。 未来，iTracer以及4D光片显微成像技术（长时间高分辨类器官光片显微镜）的联合应用将成为了解人类类器官系统发育障碍背后的突变影响的有力方法。参考文献：[1]. He et al., Lineage recording in human cerebral organoids. Nature Methods

2021年1月初，我国多地出现多点零星散发病例甚至局部聚集性疫情。而春节假期临近，避免出现大规模的人口流动，1月20日国家颁布《关于做好人民群众就地过年服务保障工作的通知》，首次倡导“就地过年”，并对中高风险地区进行严格的防疫措施，交通、出行等方面也出台相应的管控政策。倡导就地过年，留在家里的空巢老人、留守儿童该怎么办？同时，1月初中国疾病预防控制中心周报文中提到2020年以来，国内外面临着新冠疫情的防控问题。我国积极采取封锁城市、居家隔离、保持社交距离等卫生干预措施，有效控制住了新冠疫情的蔓延。但同时专家也发现，受到新冠的影响，中国结核病检测至少下降了20%。根据预测，结核病的检测率降低，可能导致1.17万人的额外死亡，2020年结核病的死亡人数可能达到51,100（超过2011年的结核病死亡人数50,900人）［1］。随着我国居民生活水平的改善及保健水平的提高，居民的寿命在不断提高，老年人在社会中的比例也在不断增加。根据国家统计局公布的数据，截至2019年末，我国65周岁及以上人口1.76亿人，占总人口的12.6%。中国老龄化全国委员会预测，到2050年，老年人口将达到4.87亿的峰值，占总人口的35％。但是随着老年人机体免疫功能下降、慢性疾病增多，老年肺结核的发病率也不断增加［2］，结核病发病年龄向老年推移是当今世界结核病的流行趋势［3］，老年肺结核已经成为一个重要的公共卫生问题，老年人已成为结核病防控的重点人群。在此背景下，如何保证老年人群体的结核病发现和及时治疗，是我们不可忽视的重要问题。一、意见征求稿明确建议有条件的医疗机构进行免疫学检查2020年中国疾病预防控制中心、地级市疾病预防控制中心及中国防痨协会等相关单位起草《老年人肺结核筛查流程（意见征求稿）》，规定了老年人肺结核筛查的方法、流程和处置方法。使用免疫筛查（如IGRAs检测等方法）对重点人群进行结核感染筛查，并对筛查结果异常的对象给予明确的转诊检测方案，提供预防性治疗，将会是降低结核病发病率的一项重要战略。二、筛查流程图意见征求稿中，将筛查的流程分2类：第一类是：老年人体检中的肺结核筛查流程，先询问其是否有相关症状（咳嗽、咳痰、咯血等），发现肺结核可疑症状者，以及重点筛查对象，开展胸部影像学检查，对于胸部影像检查异常的疑似肺结核患者，将疑似肺结核患者转诊到辖区结核病定点医疗机构开展结核分枝杆菌病原学检查。第二类是：医疗机构就诊的老年人（如呼吸科及内科等）肺结核筛查流程，先询问其是否有相关症状（咳嗽、咳痰、咯血等），发现肺结核可疑症状者，以及重点筛查对象，开展胸部影像学检查，对于胸部影像检查异常的疑似肺结核患者，建议有条件的医疗机构进行免疫学检查（如TST、IGRAs试验、结核分枝杆菌抗体检测等），异常后再将疑似肺结核患者转诊到辖区结核病定点医疗机构开展结核分枝杆菌病原学检查。三、重点筛查对象1、有疑似症状者：咳嗽、咳痰；偶尔咳嗽、少痰，不发热，按支气管感染治疗效果差；乏力、饮食量减少、浑身没劲等。2、高危人群：患有糖尿病、风湿免疫、艾滋病及恶性肿瘤等疾病。3、正常人群体检建议一年一次。四、结核特异性细胞因子检测试剂盒可满足老年人肺结核筛查需求广州迪澳生物结核分枝杆菌特异性细胞因子（IFN-γ和IL-2）检测试剂盒是“十三五”国家科技重大专项传染病防治专项成果转化产品，由国家重大传染病专项首席科学家、第十四批国家重大人才工程入选者黄曦教授历经近十年的研究，筛选了多个结核相关的特异性细胞因子最终形成的成果，是目前国内首个获批的“双因子”联合检测试剂。本项目通过联合检测人外周静脉血（仅需4ml）中结核特异性的细胞因子IFN-γ和IL-2，来实现对活动性结核的发现和潜伏感染的排筛，由于其采样方便，结果准确，非常适合老年人的结核病筛查。产品临床价值：“双阳”结果能够警示活动性结核：帮助临床更好的发现疑似活动性结核病患者。及时发现老年人肺外结核病：老年人的淋巴结核、骨结核、泌尿系统结核等肺外结核病，起病隐匿，症状不典型，容易被忽视，双因子筛查能够及时发现肺外结核病。提高对老年人结核筛查的准确性：通过富集血液中的单核细胞，避免了老年人免疫力降低，血液中免疫细胞不足的漏检风险；同时“双因子”联合检测，使其特异性更高，能够极大的提高筛查的准确性，减少漏诊误诊情况的发生。及时指导老年人基础疾病预防性治疗方案：对于患有糖尿病、高血压以及其他免疫系统相关疾病的老年人，通过双因子筛查，能够及时发现结核潜伏感染，从而更好的指导疾病的预防性治疗方案。五、结 论

位置选择是常被忽视的导致误差或问题的来源之一利用声学多普勒流速剖面系统测量河流流速和流量时，或许可以在仪器操作、安装等方面准备得很全面，但如果选择的位置违背了 ADCP 河道测量的基本假设，将无法获得精确的数据。选择测量位置时，目标是测量出能代表河道的平均流速。理想情况下，应有一段适当长度的平直河道，以避免因河道弯曲、水中障碍物、流入量、流出量等引起的流动干扰。一般我们建议测量或安装位置应位于任何流动干扰源的上游和下游至少5-10个河道宽度处，这样可保持充分的线性距离，从而使任何湍流、涡流、上升流、回水效应等均能形成均匀而稳定的水流。河道的植物生长及水底地形会影响流动条件，同时在水面之下可能存在某些不可见的流动干扰源。下面列出了使用多波束声学多普勒流速系统时的相关考虑。01均匀条件多波束声学多普勒流速测量系统的一个基本假设是各波束的测量条件是相似的，因此通过各波束的流速均值将提供准确的平均流速。02空间平均使用诸如 RiverSurveyor S5/M9、SonTek-SL 和 SonTek-IQ 等多波束声学多普勒水流测量系统时，测试记录的速度是各个声学波束测量的速度的平均值，这些波束非常狭窄。所记录的流速近似于由 2、3 或 4 束波束测得的流速计算出的空间平均值，并且平均面积随距系统距离的增加而增加。SonTek 系统的离轴波束角为25度*，因此在距系统任何特定距离（即范围）处，光束之间的距离为（0.93 x 范围）。例如，使用2波束 SonTek-SL 系统时，在10m的范围内，波束之间的距离为9.3m。2 波束系统的空间平均处理示例。*注意：IQ 偏斜光束偏离轴 60 度SonTek-SL 系统在河道上的任何位置均可实现高精度的测量在测量河道中的不同条件时，如果一切均保持平静且无任何障碍物，则是非常理想的情况。但事实并非总是如此....03湍流/涡流当河道中存在明显的湍流或涡流时，各个波束可能会在截然不同的条件下进行测量（因此违背了均匀条件的假设），从而导致其平均流速明显不同于实际平均流速。例如，可能存在这样的情况：即较大的涡流造成波束沿相反方向测量流速，从而导致平均流速为零。在河道（尤其是天然河道）中，通常存在一定程度的湍流或涡流，但在适当的较长时间内对流速数据求平均值可以帮助改善测量结果。诸如“流速误差”和“相关性”之类的参数可指示测量的均质性。04电磁影响位置选择的另一个考虑因素是局部磁场，它会影响包括罗盘在内的系统，例如 RiverSurveyor S5/M9 系统。电磁干扰源可能包括钢桥、混凝土桥梁或结构中使用的钢筋以及电力线等。电磁干扰源可能包括钢桥、混凝土桥梁或结构中使用的钢筋以及电力线等。根据可用的测量位置，上述建议和考量可能并非始终可行。理想的位置是不存在的，但是在选择位置时请务必谨记基本假设。