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原位杂交组织化学的方法和常用试剂配制 一、杂交前准备 (一)DEPC水是经DEPC处理过的灭菌蒸馏水。 DEPC即二乙基焦碳酸酯(diethylprocarbonate),可灭活各种蛋白质,是RNA酶的强抑制剂。原位杂交在杂交及其以前的各步处理中,所有液体试剂都应经DEPC处理。方法是:取市售DEPc 1ml,加入1L待处理水(蒸馏水等)中,经猛烈振摇后,于室温静止数小时,然后高压灭菌,以除去降解DEPC(DEPC分解为CO2和乙醇)。有些试剂可直接加入DEPC,终浓度一般为0.1%~0.4%,原则上在杂交及其以前的步骤中,所有液体试剂均需用DEPC处理,或用DEPC水配制,包括乙醇的稀释。此外,接触标本以及标本有关的空中的洗涤也需DEPC水洗涤。 注意:DEPC是一种潜在的致癌物质,在操作中应尽量在通风的条件下进行,并避免接触皮肤。②含有Tris缓冲液的溶液中,不能加入DEPC。 (二)载玻片的处理 组织原位杂交,常在载玻片上进行,故载玻片的洗涤至关重要,必须保持清洁,并且不能有任何核酸的污染。处理方法如下: (1)先经洗衣粉浸泡过夜,次日自来水冲洗后,泡酸数小时以上,取出后再用流水冲洗,双蒸水冲洗2~3次,置160℃以上烤箱中烧烤4h以上,或经15磅高压灭菌20min。经以上处理可清除载片上的核酸酶。(2)HCl处理法试剂: 1M HCL, DEPC 水, 95%乙醇步骤: a. 玻片在室温下于1M HCL中浸泡30分钟 b. DEPC水中洗片 c. 95%乙醇中洗片 d. 空气中干燥 e. 重复一遍 a—d. f. 铝箔包好备用. (三)硅化 【方法1】(1)将一扎新的盖玻片散开,在通风条件下于0.1mol/L的HCI中煮20min,等其冷却后,倒掉盐酸。 (2)用去离子水沉漂洗玻片,竖放在架子上自然干燥。 (3)硅化盖玻片:通风条件下,将单块的盖玻片在二甲二氯硅浣(dimethyldichorsilane,DMDC)液中浸几下,竖入在架子上干燥。 (4)收集干燥的盖玻片于一可耐热的petri氏盘(或培养皿)中,用去离子水漂洗数次,彻底清洗。 (5)用铝箔将装有盖玻片的培养皿包好,于180℃烘烤4h过夜。取出待冷至室温后,即可进行后续处理。附:2%DMDCDMDC 2ml 三氯乙烷 98ml 配制:按比例两者充分混匀,静止待气泡消失即可使用。 用途:硅化玻片(载片、盖片均可)。 【方法2】将经过洗净的玻璃盖片分散开放在一金属网中,并将该网放入一接有真空泵的干燥器中。同时,在干燥器中放一盛有约1m二甲二氯硅浣(dimethyldiorosilane,DMDC)的小烧杯。盖好干燥器(确保密闭),抽真空约5min,然后让空气冲入。取出盛有盖片的金属网架,用锡箔纸包埋,于250℃以上烘烤4h以上,最好过夜。冷却后备用。 本法可用于玻璃及塑料器皿的硅化。塑料器皿只能于60℃烧干。【方法3】APES(氨丙基三乙氧基硅浣)法 试剂: 2%的APES/丙酮(V/V), 丙酮, DEPC水 步骤: 1. 玻片先于室温中在APES液中浸泡10秒2. 丙酮中洗涤3.DEPC水中漂洗4.空气中干燥5.4度保存(最好用铝箔包好,避免污染)
http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2010/12/201012141626_266970_2215024_3.jpghttp://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2010/12/201012141627_266972_2215024_3.jpg最近拍了一些原位杂交的图片,虽然原位杂交信号很弱,但拍摄系统的捕捉能力还是非常不错的。。。。