色谱分析中蛋白质分离分析

最近在尝试着进行蛋白质提取物的分析，大家有没有做过？能否分享交流一下你成功的色谱分析条件

自80年代以来一系列新的软电离技术如快原子轰击电离 、基质辅助激光解吸电离 、电喷雾电离等发现后,生物质谱技术迅速发展,已成为现代科学研究前沿的热点之一。而其中又以基质辅助激光解吸质谱(MALD I2MS)和电喷雾电离质谱(ESI2MS)应用最为广泛。基质辅助激光解吸质谱灵敏度高、可操作性强且对生物样品中的无机盐和缓冲溶液具有较好包容性;电喷雾电离质谱选择性好、分析质量范围宽、样品消耗量小、易于与各种色谱联用。在生物样品的处理中常常需要用到非挥发性的盐,用于为细胞营造无毒的环境,稳定溶剂化的样品及维持酶的活性等。此外,许多用于分离生物分子的分离方法也需要高浓度的盐和缓冲溶液 。但是,样品处理及分离过程中所用的NaCl、十二烷基磺酸钠、盐酸胍、尿素、甘油、二甲基亚砜等都会影响后续质谱高灵敏的分析 。因为这些不挥发的低分子量污染物会导致复杂加合物的形成,增加噪音及造成明显的信号抑制 。此外,在复杂的组织或细胞蛋白质组中,与疾病和信号传导相关的蛋白质往往是属于低丰度的蛋白质,这些重要的蛋白质由于本身存在的量极少而很难得以有效鉴定 。因此,对蛋白质/多肽样品的预富集处理将是MALD I2MS或ESI2MS得到高质量质谱图的前提,也是成功鉴定蛋白质的关键。该文献主要侧重于相关工作的概述。

PS1利用基质辅助激光解吸电离-飞行时间（MALDI-TOF）技术来表征生物分子。样品溶于固定的底物中形成晶体，用激光脉冲使其离子化，离子被加速后通过飞行管时分离，所有离子均可被检测。系统包括三个组成部件：样品点样制备工作站（SymBiot 1）、生物质谱工作站（Voyager-DE PRO）和自动化分析软件（AutoMS-Fit）。SymBiot1 是一个自动样品处理系统，支持亚微升级微量点样，具有快速省时、重现性好的特点；Voyager-DE PRO是为蛋白质组研究专门设计的自动飞行时间质谱分析系统，配有AB公司之专利—延迟检测技术，具有高分辨率、质荷比宽等特点；AutoMS软件可以批处理方式或实时动态方式检索Protein Prospector蛋白数据库或您指定的蛋白数据库，查询参数可以任意设定，检索结果以Microsoft Access格式分类编号及储存。 PS 1技术平台建立伊始便受到了许多蛋白质课题研究组的关注。中国科学院上海生物化学研究所戚正武院士课题组从猪肝中提取某一活性蛋白组分，该组分理化性质不清楚，天然含量十分低，并无相关文献报道。用HPLC分离以后对活性组分的成分不能确定。上海基康生物技术有限公司运用PS 1系统对HPLC分离后的活性组分作了质谱分析，仅在一个工作日内就精确确定该组分由分子量极为相近的几种蛋白质构成，分子量精确度达到10 ppm。后经HPLC再次细分（洗脱梯度增加了2.5倍），证实了质谱的结论。此活性组分曾滤过1kD分子筛，基康的质谱数据纠正了研究人员过去对该活性组分分子量的误判，为研究人员明确实验方向、优化实验步骤提供了强有力的依据。 PS1除了可以进行生物大分子的精确分子量测定，还可用于蛋白的肽指纹图谱分析(peptide mass fingerprint，PMF)，提供相关生物信息学服务，并且还可以利用源后衰变（Post Source Decay，PSD）技术来获得样品的MS/MS数据，以得到一级结构信息。PSD方法通常增加了激发激光的功率，使其超过产生一般肽指纹谱图所需功率的阈值，过剩的能量使前体离子在源内离子化之后发生裂解，产生一系列碎片离子，在反射器的作用下，最终可以得到一张连续的碎片离子图谱。经特定的软件分析后，即可在数据库中检索到肽段的氨基酸序列。利用PSD分析技术，还可以对磷酸化，糖基化等翻译后修饰进行定位分析，同样也可以鉴定产生翻译后修饰肽段的蛋白质。Neville et al.（1997）将这一方法成功的用于磷酸肽的序列分析。作为重要的蛋白质鉴定手段之一，PS1的精确度可以达到10 ppm，灵敏度为fmol，分子量检测范围可达到500 kDa，每天可自动分析40-100个样品，适用于大规模“蛋白质组学”研究。

蛋白质是生物体中含量最高，功能最重要的生物大分子，存在于所有生物细胞，约占细胞干质量的50%以上， 作为生命的物质基础之一，蛋白质在催化生命体内各种反应进行、调节代谢、抵御外来物质入侵及控制遗传信息等方面都起着至关重要的作用，因此蛋白质也是生命科学中极为重要的研究对象。关于蛋白质的分析研究，一直是化学家及生物学家极为关注的问题，其研究的内容主要包括分子量测定，氨基酸鉴定，蛋白质序列分析及立体化学分析等。随着生命科学的发展，仪器分析手段的更新，尤其是质谱分析技术的不断成熟，使这一领域的研究发展迅速。 自约翰.芬恩(JohnB.Fenn)和田中耕一(Koichi.Tanaka)发明了对生物大分子进行确认和结构分析的方法及发明了对生物大分子的质谱分析法以来，随着生命科学及生物技术的迅速发展，生物质谱目前已成为有机质谱中最活跃、最富生命力的前沿研究领域之一[1]。它的发展强有力地推动了人类基因组计划及其后基因组计划的提前完成和有力实施。质谱法已成为研究生物大分子特别是蛋白质研究的主要支撑技术之一，在对蛋白质结构分析的研究中占据了重要地位[2]。 1．质谱分析的特点 质谱分析用于蛋白质等生物活性分子的研究具有如下优点：很高的灵敏度能为亚微克级试样提供信息，能最有效地与色谱联用，适用于复杂体系中痕量物质的鉴定或结构测定，同时具有准确性、易操作性、快速性及很好的普适性。 2．质谱分析的方法 近年来涌现出较成功地用于生物大分子质谱分析的软电离技术主要有下列几种：1)电喷雾电离质谱；2)基质辅助激光解吸电离质谱；3)快原子轰击质谱；4)离子喷雾电离质谱；5)大气压电离质谱。在这些软电离技术中，以前面三种近年来研究得最多，应用得也最广泛[3]。 3．蛋白质的质谱分析 蛋自质是一条或多条肽链以特殊方式组合的生物大分子，复杂结构主要包括以肽链为基础的肽链线型序列[称为一级结构]及由肽链卷曲折叠而形成三维[称为二级，三级或四级]结构。目前质谱主要测定蛋自质一级结构包括分子量、肽链氨基酸排序及多肽或二硫键数目和位置。 3.1蛋白质的质谱分析原理 以往质谱(MS)仅用于小分子挥发物质的分析，由于新的离子化技术的出现，如介质辅助的激光解析/离子化、电喷雾离子化，各种新的质谱技术开始用于生物大分子的分析。其原理是：通过电离源将蛋白质分子转化为[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]气相[/url]离子，然后利用质谱分析仪的电场、磁场将具有特定质量与电荷比值(M/Z值)的蛋白质离子分离开来，经过离子检测器收集分离的离子，确定离子的M/Z值，分析鉴定未知蛋白质。 3.2蛋白质和肽的序列分析 现代研究结果发现越来越多的小肽同蛋白质一样具有生物功能，建立具有特殊、高效的生物功能肽的肽库是现在的研究热点之一。因此需要高效率、高灵敏度的肽和蛋白质序列测定方法支持这些研究的进行。现有的肽和蛋白质测序方法包括N末端序列测定的化学方法Edman法、C末端酶解方法、C末端化学降解法等，这些方法都存在一些缺陷。例如作为肽和蛋白质序列测定标准方法的N末端氨基酸苯异硫氰酸酯(phenylisothiocyanate)PITC分析法(即Edman法，又称PTH法)，测序速度较慢(50个氨基酸残基/天)；样品用量较大(nmol级或几十pmol级)；对样品纯度要求很高；对于修饰氨基酸残基往往会错误识别，而对N末端保护的肽链则无法测序[4]。C末端化学降解测序法则由于无法找到PITC这样理想的化学探针，其发展仍面临着很大的困难。在这种背景下，质谱由于很高的灵敏度、准确性、易操作性、快速性及很好的普适性而倍受科学家的广泛注意。在质谱测序中，灵敏度及准确性随分子量增大有明显降低，所以肽的序列分析比蛋白容易许多，许多研究也都是以肽作为分析对象进行的。近年来随着电喷雾电离质谱(electrospray ionisation，ESI)及基质辅助激光解吸质谱(matrix assisted laser desorption/ionization，MALDI)等质谱软电离技术的发展与完善，极性肽分子的分析成为可能，检测限下降到fmol级别，可测定分子量范围则高达100000Da，目前基质辅助的激光解吸电离飞行时间质谱法(MALDI TOF MS)已成为测定生物大分子尤其是蛋白质、多肽分子量和一级结构的有效工具，也是当今生命科学领域中重大课题——蛋白质组研究所必不可缺的关键技术之一 [5] 。目前在欧洲分子生物实验室(EMBL)及美国、瑞士等国的一些高校已建立了MALDI TOF MS蛋白质一级结构(序列)谱库，能为解析FAST谱图提供极大的帮助，并为确证分析结果提供可靠的依据[6]。

褚福亮,王福生, 中国人民解放军第302医院全军艾滋病与病毒性肝炎重点实验室 北京市 100039项目负责人 王福生, 100039 ,北京市丰台路26号, 中国人民解放军第302医院全军艾滋病与病毒性肝炎重点实验室. fswang@public.bta.net.cn电话:010-66933332 传真:010-63831870收稿日期 2002-08-15 接受日期 2002-09-03摘要新近广泛应用蛋白质芯片（ProteinChipâ Array）系统成功鉴定出了一些重要疾病（如肿瘤和危害性较大的传染病）新的、特异性的生物标记（biomarkers）,后者不仅在生物医学的基础方面具有重要的科学价值,而且在临床疾病的诊断、治疗和预防发挥重要的指导作用,显示了良好的发展前景.本文就表面增强的激光解析电离-飞行时间-质谱（SELDI-TOF-MS）相关的原理、特点、在临床和基础研究中的应用新进展和未来的发展趋势做一综述.此外,我们就蛋白质谱分析技术在病毒性肝炎、肝硬化和肝癌等一系列肝病方面的应用策略和前景进行了分析.褚福亮,王福生. 蛋白质谱分析方法特点及其在蛋白组学研究领域中的应用.世界华人消化杂志 2002 10(12):1431-14350 引言人类基因组计划已经进入后基因组时代-即功能基因组时代[1]，作为基因功能的直接体现者-蛋白质，及其之间的相互作用越来越引起基础和临床科学家们的关注[2-6] .因为要彻底了解生命的本质，只把基因测出来还是不够的，还必须要了解其在生物生长、发育、衰老和整个生命过程中的功能、不同蛋白质之间的相互作用以及他们与疾病发生、发展和转化的规律[7-14] .正因为如此，有关上述问题的蛋白质组学研究成了今天生命科学最重要的焦点之一[15] .为了阐明蛋白质在上述生命现象中的作用和相关机制，人们设计了许多新的方法技术，如：二维电泳、质谱分析、微距阵列、酵母双杂交和噬菌体展示等，这些方法在一些特定的情况下，虽然显示出了他们各自不同的优点，但是同样也存在着较大的局限性，难以开展大规模、超微量、高通量、全自动筛选蛋白质等方面的分析，因而设计更全面、同时研究多种蛋白质相互作用的技术，在功能基因组和蛋白组学的研究中建立一个更有效的技术平台，成为本领域中优先关注的问题[16] .近来，美国Ciphergen（赛弗吉）公司研制的ProteinChipâ Array的仪器，并建立了一种新的蛋白质飞行质谱-表面增强的激光解析离子化-飞行时间-质谱（surface-enhanced laser desorption/inionation-time of flight-mass spectra， SELDI-TOF-MS），已取得可喜的进展，筛选出了许多与疾病相关的新型生物标志，不仅为临床疾病的诊断和治疗等提供了新的选择，而且在基础科学、新药研制和疾病预防等方面具有广泛的应用前景[16-18] .本文就SELDI-TOF-MS相关的原理、特点、在临床和基础研究中的应用新进展和未来的发展趋势做一综述.1 ProteinChipâ Array系统和SELDI-TOF-MS的特点1.1 蛋白质芯片系统的组成和原理 蛋白质芯片系统由三部分组成：蛋白质芯片、芯片阅读器和芯片软件.供研究用芯片上有6-10芯池，不同的芯片表面上的化学物质不同，芯片表面分为两大类：一类为化学类表面，包括经典的色谱分析表面，如：结合普通蛋白质的正相表面，用于反相捕获的疏水表面，阴阳离子交换表面和捕获金属结合蛋白的静态金属亲合捕获表面；另一类称为生物类，特定的蛋白质共价结合于预先活化的表面阵列，可以用来研究传统的抗体一抗原反应，DNA和蛋白质作用，受体、配体作用和其他的一些分子之间的相互作用[19] . 根据检测目的不同，可以选用不同的芯片，或者自己设计芯片.将样本和对照点到芯池上以后，经过一段时间的结合反应，用缓冲液或水洗去一些不结合的非特异分子，再加上能量吸收分子（energy absorbing molelule，EAM）溶液，使样本固定在芯片表面.当溶液干燥后，一个含有分析物和大量能量吸收分子“晶体”就形成了.能量吸收分子对于电离来说非常重要.经过以上步骤，就可经把芯片放到芯片阅读器中进行质谱分析. 在阅读器的固定激光束下，芯片上、下移动，使样本上每一个特定点都被“读”到.激光束的每一次闪光释放的能量都聚集在该区一个非常小的点上（focused laser beam，聚焦激光束）.这样，每个区都含有丰富的，可寻址（addressable）的位置.蛋白质芯片处理软件精确控制激光寻读过程.当样本受到激发，就开始电离和解除吸附.不同质量的带电离子在电场中飞行的时间长短不同，计算检测到的不同时间，就可以得出质量电荷比,把他输入电脑,形成图像[19].Ball et al [20]采用一种称为人工神经网络（artifical neural network,ANN）的算法处理出现的成千上万的峰，鉴定出三个分子量为13 454、13 457和14 278的生物标记分子，使疾病预测率达到97.1 %.1.2 ProteinChipâ Array芯片和SELDI-TOF-MS的特点 新型蛋白芯片与以往的蛋白芯片不同之处：SELDI-TOF-MS，他是在MALDI（matrix-assisted laser desorption/inionation）［21,22］基础上，改进后实行表面增强的飞行质谱.SELDI-TOF-MS优于MALDI-TOF表现为他不会破坏蛋白质，或使样本与可溶的基质共结晶来产生质谱信号.对SELDI-TOF来说，可以直接将血清、尿液、组织抽取物等不需处理直接点样检测[40] 由于一部分非特异结合的分析物被洗去，因而出现的质峰非常一致，有利于后期分析[23,24] . 与二维电泳相比：二维电泳分析蛋白质的分子量在30 KDa以上时电泳图谱较清楚，对在组织抽提物中占很大比例的低丰度的蛋白质不能被检出；其次，二维电泳胶上的蛋白质斑点很大一部分包含一种以上的蛋白质；而且，二维电泳耗时长，工作量大，对象染色转移等技术要求高，不能完全实现自动化.而SELDI-TOF在200 Da-500 KDa区间都可以给出很好的质谱，对一个样本的分析在几十分钟内就可以完成[19]，处理的信息量远远大于二维电泳；对于低丰度物质，即使浓度仅attomole(10-18)的分子，只要与表面探针结合，就可以检测到，这也是二维电泳所不具备的[24,25] . 对于微距阵蛋白芯片来说，需要一种不破坏折叠的蛋白质构象的固定技术，再与另外的蛋白质反应，经检测莹光来观察蛋白质之间的作用[26] .而基于SELDI-TOF-MS的ProteinChip分析蛋白质不需溶解、不需染色、廉价、针对性强. 因而蛋白质芯片仪具有以下优势：(1)可直接使用粗样本，如：血清、尿液、细胞抽提物等[27] .(2)使大规模、超微量、高通量、全自动筛选蛋白质成为可能；(3)他不仅可发现一种蛋白质或生物标记分子，而且还可以发现不同的多种方式的组合蛋白质谱，可能与某种疾病有关[28] (4)推动基因组学发展，验证基因组学方面的变化，基于蛋白质特点发现新的基因.可以推测疾病状态下，基因启动何以与正常状态下不同，受到那些因素的影响，从而跟踪基因的变化[2,14,15] . 其存在的问题：对于不同的样本，根据检测的目标采取或者设计几种芯片，理论上可以把所有的相同性质蛋白质捕获，但是实际上仍有少量的分子没与表面探针结合.使用SELDI-TOF-MS，仅能给出蛋白质的分子量，不能给出C端、N端的序列，也没法知道蛋白质的构型，因此需要将蛋白质充分纯化后，用蛋白酶消化芯片上的蛋白质，分析肽段，再用生物信息学方法鉴定蛋白质序列[18,24] .另外，在国内，该芯片费用较高，分析质谱需要大量后续工作支持.

新手，测定完某酶的圆二色谱，希望计算其二级结构中α-螺旋、β-折叠、β-转角、无规卷曲等二级结构的百分含量，但是苦于没有蛋白质二级结构分析软件如selcon3等，希望哪位前辈或仁兄能够共享？非常感谢。

向大家请教几个问题1. 在使用MALDI-TOF的时候，为什么大分子量的蛋白质可以被有效分析，而大于80bp的DNA分析的效果不好？2. Electrospray-TOF和MALDI-TOF在分析蛋白质的时候有那些区别？3. 质谱用于蛋白质测序中的几种方法及原理？先道谢！本人对蛋白质分析实在是不熟悉。请解答的详细一些！再次致谢！

2003年人类基因组精细图绘制完成，是人类科学史上一个里程碑式的事件。后基因组时代的研究重点自然落在了蛋白质头上。为啥？因为中心法则告诉我们，基因的产物——蛋白质，是生命活动的最终执行者。与基因组类比，研究生物体内全套蛋白质的科学，就是蛋白质组学。基因组计划完成的同年，人类蛋白质组计划启动，令人激动的是，2014年人类蛋白质组的草图也完成了。而蛋白质组学能够飞速发展的最大功臣非质谱莫属。质谱的应用范围非常广泛，但这里只讨论蛋白质组学中的质谱。简单地说，质谱法（mass spectrometry）就是对肽段离子的重量（质荷比，m/z）进行测量的分析方法。样品经质谱仪（mass spectrometer）检测得到质谱图（mass spectrum），通过对质谱图的分析就可以对样品中的蛋白进行鉴定、定量。亲，图1的这种典型的蛋白质组学流程都很熟悉吧。蛋白首先都要被特异性的酶（通常为Trypsin）切割为肽段，再进行后续分析，这在蛋白质组学中被称为“自下而上”的研究策略（Bottom-up proteomics）。我们平时见到的质谱分析基本都是这种类型。提到蛋白质组，即会联想到一系列高大上的名词，iTRAQ、SWATH、SILAC、Shotgun、Label-free等等。很多概念容易弄混淆，下面我们就来理理清楚。图1. 典型的蛋白质组学流程大体上，质谱研究蛋白主要是鉴定和定量。通过二级质谱图（MS2或者MS/MS）进行数据库搜索匹配鉴定蛋白。通过各种标记或非标记的手段对不同样品中的蛋白进行比较就是定量。蛋白定量比较是质谱最重要的用途，图2是对定量方法的一个简单总结。非标定量（Label-free）不需要标记，不同样品分别处理、分别进质谱检测；优点是处理简单、无需标记、价格便宜、可以比较很多组样品，缺点是对操作步骤、LC、质谱稳定性要求严格。SILAC是在细胞培养基中加入稳定同位素标记的氨基酸，在代谢水平标记蛋白，一级质谱图进行定量，可以做到三组样品混合后进行比较，定量准确，但是不能标记组织样本，养细胞成本也较贵。双甲基化标记是通过化学反应的办法在肽段水平进行标记，一级质谱定量，也可以三组对比，标记试剂都比较便宜，而且可以标记任何来源的样品。iTRAQ和TMT是商品化的试剂盒，肽段水平标记，二级质谱定量；分别可以做到最多8组和10组样品间蛋白质组的比较。图2. 质谱定量方法以上这几个是一家的，还有几个名词是属于另外一家，比如Shotgun (DDA)、SWATH/DIA、SRM (MRM)、MRMHR/PRM。质谱进行数据采集的方式大致分为三种：鸟枪法（Shotgun）、选择反应监控（SRM）和全景式的SWATH/DIA。下面对照图3再来简单介绍一下。图3. 质谱扫描方式DDA、IDA、Shotgun和鸟枪法说的是相同的东西，意思是质谱在每个循环的中从一级里挑选丰度高的TopN个肽段去打碎做二级扫描，得到的结果通过与已知数据库中的理论蛋白进行匹配。DDA简单有效，分析流程比较成熟，也是目前质谱分析的主流方式。DDA也有其固有的缺陷，即具有一定的随机性，偏向于检测丰度较高的肽段，而抑制了低丰度肽段的检测。靶向策略被称为质谱领域的Western blot。质谱只去采集目标肽段大小的离子信息，因而提高了灵敏度和特异性。这种方法用来研究感兴趣的特定蛋白，定量准确，但是通量很有限。SWATH/DIA这种全景式的数据采集方式在最近几年突然火了起来，被认为在不远的未来可能会取代DDA的主流位置。该方法采取的策略是将扫描范围内的所有肽段按照质荷比分为若干个窗口，再对每个窗口里所有的肽段一起打碎，采二级，数据分析时通过抽提蛋白的子离子信息进行定量。SWATH/DIA解决了DDA中随机性选择肽段的缺陷，所以重复性更好，定量的准确性基本达到了SRM的水平，而且可以实现大规模定量。借用听来的一个比喻来说明：DDA就像机关枪扫射，数量多、体积大的目标命中的概率要大一些。靶向扫描（SRM或PRM）就像精准狙击，排除干扰，目标明确，每一枪直指目标，但是难以大规模消灭敌人。SWATH/DIA就是地毯式轰炸，只要暴露在我方攻击范围内的敌人，不管三七二十一，全部炸完。图4. 定量方法与采集方式结合如果将上述的定量方法（图2）和质谱数据采集方式（图3）结合起来，就得到了现在基于质谱的蛋白质组学研究的各种策略（图4）。再打个比方，保证吃货们一听就懂：鸡、鱼、肉、蛋、蔬菜要通过炒锅、烤箱、高压锅、微波炉等烹调之后才能变为美食，填饱肚子。同样的，各种定量方法（非标的和标记的）处理的样品，要通过质谱各种采集方式变为电脑中的数据，才能分析并从中得到蛋白的信息。本次的介绍就先到这里了，如果其中有什么问题，欢迎您批评和建议，我们会努力变得更好；如果需要跟我们进行技术交流和讨论，欢迎大家联系武汉金开瑞。后续我们还会继续推出对质谱技术各方面进行解析的文章，敬请期待。ReferencesA draft map of the human proteome. Nature 509: 575–581 (2014)Mass-spectrometry-based draft of the human proteome. Nature 509: 582–587 (2014)A review: Annu. Rev. Biochem. 80: 273–99 (2011)SILAC: Molecular & Cellular Proteomics 1: 376-386 (2002)iTRAQ: Molecular & Cellular Proteomics 343: 91–99 (2010)SRM: Nature Methods 9: 555–566 (2012)SWATH: Molecular & Cellular Proteomics 11: 1–17 (2012)

http://img.dxycdn.com/trademd/upload/asset/meeting/2013/09/06/A1378379551.jpg 氨基酸是蛋白质的基础组成单位，通过研究蛋白质中氨基酸的性质和组成来预测蛋白质的结构和功能，蛋白质氨基酸残基组成分析主要是通过氨基酸分析仪来完成的，本文推荐了2个基于氨基酸组成进行蛋白质预测软件。基于氨基酸组成的蛋白质预测软件根据组成蛋白质的20种氨基酸的物理和化学性质可以辨析电泳等实验中的未知蛋白质，也可以分析已知蛋白质的物化性质。ExPASy工具包包涵的程序：AACompIdent：与把氨基酸序列在SWISS-PROT库中搜索不同，AACompIdent工具利用未知蛋白的氨基酸组成去确认具有相同组成的已知蛋白。该程序分析时需提交的相关信息包括：蛋白质的氨基酸组成、等电点pI和分子量(如果知道)、正确的物种分类及特别的关键词。此外，用户还需在六种氨基酸“组合”中作出选择，这影响到分析如何进行。例如，某种“组合”会把残基Asp/Asn(D/N)和Gln/Glu(Q/E)组合成 Asx(B)和Glx(Z);或者某种残基会在分析中被完全除去。对数据库中的每一个蛋白序列，算法会对其氨基酸组成与所查询的氨基酸组成的差异打分。由电子邮件返回的结果被组织成三级列表：第一张列表中的蛋白都基于特定的物种分类而不考虑pI和分子量;第二张列表包含了不考虑物种分类、pI和分子量的全体蛋白;第三张列表中的蛋白不但基于特定物种分类，并且将 pI和分子量也考虑在内。虽然计算所得结果各不相同，但零分表明了该序列与提出的组成完全相符。AACompSim：AACompIdent的一个变种，AACompSim提供类似的分析，但与前者以实验所得的氨基酸组成为依据进行搜索不同，后者使用SWISS-PROT中的序列为依据。有报道称，氨基酸组成在物种之间是十分保守的(Cordwell等，1995)，并且通过分析氨基酸的组成，研究者能从低于25%序列相似性的蛋白之间发现弱相似性(Hobohm和Sander，1995)。因此，在“传统的”数据库搜索基础上辅以组成分析，能为蛋白质之间关系提供更多见解。PROSEARCH：PROPSEARCH也提供基于氨基酸组成的蛋白质辨识功能。用144种不同的物化性质来分析蛋白质，包括分子量、巨大残基的含量、平均疏水性、平均电荷等，把查询序列的这些属性构成的“查询向量”与SWISS-PROT和PIR中预先计算好的各个已知蛋白质的属性向量进行比较。这个工具能有效的发现同一蛋白质家族的成员。可以通过Web使用这个工具，用户只需输入查询序列本身。分子量搜索(MOWSE)分子量搜索(MolecularWeightSearch，MOWSE)算法利用了通过质谱(MS)技术获得的信息。利用完整蛋白质的分子量及其被特定蛋白酶消化后产物的分子量，一种未知蛋白质能被准确无误地确认，给出由若干实验才能决定的结果。由于未知蛋白无需再全部或部分测序，这一方法显著地减少了实验时间。MOWSE的输入是一个纯文本文件，包含一张实验测定的肽段列表，分子量范围在0.7到4.0Kda之间。计算过程基于在OWL非冗余蛋白质序列库中包含的信息。打分基于在一定分子量范围内蛋白中一个片段分子量出现的次数。输出的结果是得分最佳的30个蛋白的列表，包括它们在OWL中的条目名称、相符肽段序列、和其它统计信息。模拟研究得出在使用5个或更少输入肽段分子量时，准确率为99%。该搜索服务可通过向mowse@daresburg.ac.uk发送电子邮件实现。为获得更多关于查询格式的细节信息，可以相该地址发送电子邮件，并在消息正文中写上“help”这个词。蛋白质氨基酸组成分析用盐酸在110 ℃将蛋白或多肽水解成游离的氨基酸，用氨基酸分析仪测定各氨基酸的含量。采用经典的阳离子交换色谱分离、茚三酮柱后衍生法，对蛋白质水解液及各种游离氨基酸的组分含量进行分析。仪器基本结构同普通HPLC相似，但针对氨基酸分析进行了细节优化(例如氮气保护、惰性管路、在线脱气、洗脱梯度及柱温梯度控制等等)通常细分为两种系统：蛋白水解分析系统(钠盐系统)和游离氨基酸分析系统(锂盐系统)，利用不同浓度和pH值的柠檬酸钠或柠檬酸锂进行梯度洗脱。其中钠盐系统一次最多分析约25种氨基酸，速度较快，基线平直度好;锂盐系统一次最多分析约50种氨基酸，速度较慢，基线一般不如钠盐系统好。分析效果：从目前已知的氨基酸分析方法比较来看，除灵敏度(即最低检测限)比HPLC柱前衍生方法稍低以外(HPLC：0.5 pmol;氨基酸分析仪：10 pmol)，其他如分离度、重现性、操作简便性、运行成本等方面，都优于其他分析方法。蛋白质氨基酸残基组成分析的主要步骤包括：首先是蛋白被水解为氨基酸，其次是采用离子色谱等方法进行游离的氨基酸含量和组成的分析。总之利用蛋白可以分析氨基酸，利用氨基酸也可以研究蛋白质。

最近要买根反相色谱柱，用于分析蛋白质样品，分子量15~30kd，中等疏水性，成品比较纯了。问题一，选择柱子应该是C4、C8还是C18？问题二，因为样品含量不高，15~30μg/ml，选用碳载量大的还是低点的比较好？问题三，刚看到phenomenon的介绍，有一个核-壳技术，可信么？

色谱CHINESE JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY2005 Vol.23 No.1 P.12-17 高速逆流色谱双水相体系分离蛋白质Separation of Proteins in Aqueous Two-Phase Systems with High-Speed Counter-Current Chromatography郅文波　 邓秋云　 宋江楠　 顾铭　 欧阳藩　 摘　要：利用多分离柱高速逆流色谱仪,研究了聚乙二醇1000(PEG1000)-磷酸盐双水相体系的固定相保留率及该体系对蛋白质混合物和鸡蛋清样品的分离.以14.0%PEG1000-16.0%磷酸盐体系的上相为固定相,在流速0.6mL/min和转速900 r/min的条件下,固定相的保留率达到33.3%.在pH 9.2的PEG1000-磷酸盐双水相体系中,细胞色素C、溶菌酶和血红蛋白的分配系数差异最大,采用该pH值的14.0%PEG1000-16.0%磷酸钾盐双水相体系,在流速1.0 mL/min和转速850 r/min的条件下,成功地分离了这3种蛋白质的混合物.鸡蛋清中的主要蛋白质成分--卵转铁蛋白、卵白蛋白和溶菌酶在pH 9.2的15.0%PEG1000-17.0%磷酸钾盐体系中也具有最大的分配系数差异.采用该体系,在流速1.0 mL/min和转速850 r/min的条件下,成功地分离了鸡蛋清样品,得到的卵白蛋白、溶菌酶和卵转铁蛋白的电泳纯度分别为100%,100%和60%,收率均大于90%.关键词：高速逆流色谱 双水相体系 蛋白质 分离纯化分类号：O658 　文献标识码：A文章编号：1000-8713(2005)01-0012-06 作者简介：郅文波,男,博士研究生,E-mail:zhiwenbo@163.com.通讯联系人:欧阳藩,男,教授,Tel:(010)82627061,Fax:(010)62561822,E-mail:fouyang@home.ipe.ac.cn. 作者单位：郅文波（中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室,北京,100080）　　　　　　邓秋云（上海同田生化技术有限公司,上海,200122）　　　　　　宋江楠（中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室,北京,100080）　　　　　　顾铭（中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室,北京,100080）　　　　　　欧阳藩（中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室,北京,100080）　 [img]http://www.instrument.com.cn/bbs/images/affix.gif[/img][url=http://www.instrument.com.cn/bbs/download.asp?ID=23113]高速逆流色谱双水相体系分离蛋白质[/url]

最近做蛋白质分析，用的是AB的Qtrap 5500.方法设置如下：EMSIDAEPI得到的谱图有多个峰，我想如何得到我蛋白质的二级谱图。

如题，我想用C8的色谱柱跑液相色谱看一下发酵液中的蛋白质变化，但是发酵液里面较复杂，如何前处理纯化蛋白质，来达到能够上机的要求？ 如果用三氯乙酸或有机相使蛋白质变性沉淀，弃去上清，还能否将沉淀溶解？我看到这类方法多用在电泳上面，那液相色谱该用上面方法呢？期待高手指点~

[img]http://www.instrument.com.cn/bbs/images/affix.gif[/img][url=http://www.instrument.com.cn/bbs/download.asp?ID=171584]蛋白质的多维色谱分离[/url]蛋白质的多维色谱分离通常生物体内提取的蛋白质样品成分复杂，应用多维色谱进行分离的方法必将流行。文章简单介绍了多维色谱分离的理论，算是一个入门材料吧。

近期，第三军医大学西南医院全军消化病研究所陈瑶等研究了拉曼光谱分析癌变胃黏膜组织中蛋白质改变，研究发现，拉曼光谱是研究癌变胃黏膜组织中蛋白质分子的生化改变的新型有效手段,有助于胃癌的基础机制及临床诊疗研究。该文章发表于2014年29期《重庆医药》上。该文章旨在研究正常和癌变胃黏膜组织中蛋白质的拉曼特征峰的差异及其意义。 研究者们提取12例正常和癌变胃黏膜组织的蛋白质相关特征峰进行对比分析,结合统计学方法,观察癌变胃黏膜组织中蛋白质构型构象、氨基酸组成等改变。 结果显示，和正常胃黏膜组织比较,癌变胃黏膜组织中蛋白质相关拉曼特征峰758cm-1、879cm-1、938cm-1、1271cm-1、1660cm-1等发生了不同程度的移位,蛋白质的氨基酸组成及空间构象等出现了改变;结合蛋白质特征峰的相对峰强进行Fisher判别分析,建立判别函数获得了91.7%准确判别率。

[b][font=宋体]问题描述：现有一个分子量[/font]7[font=宋体]万左右的蛋白，普通的[/font]C[sub]18[/sub][font=宋体]色谱柱（非蛋白专用柱）能否用于分析此样品？[/font][font=宋体]解答：[/font][/b][font=宋体]（[/font]1[font=宋体]）采用分析型[/font]C[sub]18[/sub][font=宋体]液相色谱柱分离蛋白质样品时，蛋白质分子量不能太大，否则容易造成色谱柱堵塞，压力增加。[/font][font=宋体]（[/font]2[font=宋体]）采用反相硅胶色谱柱分离蛋白质样品，通常[/font]60?[font=宋体]的硅胶柱，蛋白质分子量一般最大只能到[/font]2000[font=宋体]；[/font]100?[font=宋体]的硅胶柱，蛋白质分子量能到[/font]5000~7000[font=宋体]；[/font]300?[font=宋体]的硅胶柱，蛋白质分子量能到[/font]20000~30000[font=宋体]；再大分子的蛋白，就不能用反相硅胶柱来分离了。[/font][font=宋体]（[/font]3[font=宋体]）分离分子量较大的蛋白质时，建议使用蛋白质专用柱或使用体积排阻色谱（凝胶色谱，[/font]GPC[font=宋体]）进行分析。[/font][font='微软雅黑','sans-serif'][color=black][back=white]领取更多《实战宝典》请进：[url]http://instrument-vip.mikecrm.com/2bbmrpI[/url][/back][/color][/font][font='微软雅黑','sans-serif'][color=black][back=white] [/back][/color][/font]

我们学习分离血红蛋白时，书上提到凝胶色谱法分离蛋白质原理是蛋白质分子量大小不同导致有些蛋白质能进入凝胶颗粒，另一些不能，所以迁移速度不同，将分子量不同的蛋白质分离。既然这样，那为什么不是因为蛋白质分子大小不同呢？ [b]问题补充：[/b]关键在于为什么是根据蛋白质分子量大小而不是蛋白质分子大小（所占空间）分离呢 小分子蛋白可以在小孔内穿过 从而增加了分离时所走的路程 最后被分离。大分子蛋白主要是通过凝胶颗粒之间的空隙通过 因此路线相对较短最先被分离。 只是做题时这一题选分子量而不选分子大小

蛋白质化学与蛋白质组学夏其昌 曾嵘 等编著2004年4月出版ISBN 7-03-012401-4/Q.133116开，平装，580页定价: 75.00元 本书系统论述了蛋白质化学基础理论和实验技巧，也反映了蛋白质组学研究的最新成果。内容包括：蛋白质的表征，蛋白质的组成分析和序列测定，与此相关的实验方法，包括各种色谱、电泳、质谱技术等，以及应用在蛋白质表征研究和基因工程产品的质检方面的实际范例。在蛋白质组学领域介绍了基本概念、样品制备、双向凝胶电泳的图像分析和定量分析、质谱等常规方法，并介绍了国际上最新的多维技术在研究中的应用；同时充分体现了生物信息学在蛋白质组研究中的重要性。 本书可作为生物学、医学、化学专业大学生，研究生和教学人员的参考书，也是从事生物化学、分子生物学、医学等领域中分离分析工作人员的参考书。

基于高通量的质谱技术方法，目前，各种疾病相关的差异蛋白质组数据高速增长。但是要从这些数据中发现生物学规律，挖掘得到疾病相关的生物标记物，以及发现潜在的疾病药物靶标，还有很艰难的数据分析任务需要完成。需要借助生物信息学的工具，去综合现有数据库数据及文献数据的知识，对这些蛋白质进行综合分析。发表于蛋白质组学杂志上的一篇综述From proteome lists to biological impact-tools and strategies for the analysis of large MS data sets. （Rainer et.al,. Proteomics 2010,10.1270-1283）很好地概括了面对海量的蛋白质组数据这个艰巨的任务时，生物学家和生物信息学家共同发展的数据分析策略和方法，从而数据中挖掘出隐藏的生物学知识。文章介绍了数据预处理过程（如ID转换）、功能富集分析、网络分析及蛋白质性质分析（如PTM, domain，motif）等工具；另外，还介绍了随着实验数据增长起来的文献数据的文本挖掘方法。

牛奶蛋白质分析仪的原理主要基于光学测量技术，特别是光谱分析法。具体地说，它采用红外光谱法来测量牛奶中乳清蛋白和酪蛋白的含量。首先，将牛奶样品制成透明薄片，然后使用近红外光电传感器和光源对其进行扫描。牛奶中的蛋白质对特定波长的红外光有特定的吸收特性，通过测量这些吸收特性，可以分析出牛奶中蛋白质的种类和含量。此外，仪器会将牛奶光谱与事先建立的标准光谱进行比较，通过复杂的算法处理，从而得出各种蛋白质形态的含量。这种比较和计算过程确保了测量结果的准确性和可靠性。总的来说，牛奶蛋白质分析仪通过光学测量和光谱分析技术，能够快速、准确地测定牛奶中蛋白质的含量和种类，为乳制品生产、质量控制和科学研究提供了有力的支持。[img=,690,690]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2024/04/202404291701212298_2595_6238082_3.jpg!w690x690.jpg[/img]

[font='Times New Roman'][font=宋体]蛋白质是复杂的含氮有机化合物，不同蛋白质的含氮量不同，测定蛋白含量一般采用凯氏定氮法，但该方法操作步骤繁琐，消耗试剂（如浓硫酸、氢氧化钠等），检测时间长。近年来多采用蛋白质分析仪进行测定，但仍需要对样品做复杂的预处理，费时费力。采用[/font][/font][font=宋体][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/1p][color=#3333ff]近红外光谱[/color][/url]分析技术[/font][font='Times New Roman'][font=宋体]可缩短检测时间，可快速预测发酵产物中的蛋白质含量，不仅可以避免因为时效性差而引起的目标产物产量不稳定，还可以防止因为外界环境变化引起的蛋白质失活变性。同理，发酵的其他目标产物，如抗生素、维生素、有机酸等，也可以利用[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/1p][color=#3333ff]近红外光谱仪[/color][/url]来快速预测目标产物含量。[/font][/font]

分子量测定： Q：为什么测定的结果跟理论的结果不一致？ A：因为机器测定会有一定的误差，如100000Da的蛋白质最大误差是100Da，如果测定的结果与理论值成倍数关系的可能原因是：0.3倍可能是三电荷峰，0.5倍可能是双电荷峰，原因是样品含碱氨基酸较多；2倍可能是二聚体，3倍可能是三聚体，原因可能是样品中含有过多的二硫键。 Q：为什么我的样品非常纯，但在主峰的附近会有一些小峰？同时在主峰一半或两倍的地方有一个小峰？ A：这是因为在激光的扫描的过程中可能会使样品分子损失一些离子，如H2O、NH3等，或者出现样品分子与基质的加合峰，正常的情况下MALDI-TOF单电荷峰占主要，所以有时会在主峰一半或两倍的地方有一个小峰，是双电荷峰和二聚体峰； Q：为什么我的样品纯度、浓度都很好，盐浓度也很低，却得不到结果？ A：这只能与蛋白质本身的结构有关，基质不能很好的分离样品，所以希望您能尽可能滇供样品其他的理化质，如酸、碱蛋白、糖蛋白等。的确，有时您的样品的所有质、状态都正常，还是不能得到您想要的结果，这种问题其实已经超出了我们能力的范围，我们仅仅是您整个实验的一个环节，能够做到的是向您提供一个准确的结果。 肽指纹图谱及数据库检索 Q：为什么考马斯染色的结果比银染的结果好。 A：主要是银染的灵敏度较高，得到的蛋白质量较少，再加上在处理样品的过程中银染要脱银，增加洗脱的次数，样品的损失较大，所以噪音和角蛋白污染对目的蛋白的影响较大，对最终的数据库检索也会产生影响 Q：我的PMF的峰值较少，为什么？这些片段数量及峰值是否达到最基本的数据库检索的要求？影响检索的结果吗？ A：因为我们用的是胰酶对蛋白质进行降解的，胰酶是一种专一较强的酶，只水解精氨酸、赖氨酸的C端，可能是你的样品的酶解的位点偏多或偏少，偏多酶解为小片段，峰值跟基质在一起难以分辨，偏少肽段的分子量偏大，胶内的样品滞留在胶内，在质谱图上体现不出来，溶液样品可以收集到，但是分子量越大检索的结果越不准确；理论上图谱的峰越多越好，要是都能匹配上那么蛋白的确定程度就更高，相反就越低；一般至少要拿到4个肽段。 Q：如何理解这些片段峰值大小意义，越高（纵坐标值大）越精确吗？以及这些酶解片段的数量及峰值一般应达到什么标准才算比较好？？ A：片段峰横坐标的大小的意义是酶解下来的肽段的质量大小，纵坐标表示的收集的该肽段的相对的信号的强度，左边是相对的，右边是绝对的，绝对的越高，抗干扰的能力越好，质谱的精确度由仪器来决定的。我们的仪器的精确度在10ppm以内。 Q：图谱上肽段多于8条，为什么选这8条？ A：至于提交检索的肽段的数量是根据肽段的信号强度来选取的，同时在软件处理的过程中会过滤一部分峰， 如胰酶的自解峰等； Q：数据库检索报告中m/zsubmitted，MH+matched两项是什么意思？ A：m/z submitted 的意思是您提交给数据库的m/z值（因为质谱仪用m/z来分离样品的）， MH+matched指的是与你提交数值相匹配数值，因为在样品在离子化过程中从基质中得到一个质子，所以它会加一个H Q：这两项的分子量和你们的图谱上相应分子量不一致。 A：因为在用图谱数据在数据库检索之前需要通过一个数据的校正和处理，所以图谱上的值与提交检索的值有区别图谱中的峰值是经过一个软件处理后的结果，主要是经同位素峰的合并图谱上的结果会不一至的，例如在你的图上读到的是1519.402，在看图的时候把它给放大处理（只有我这里的图谱处理的软件才能看到），就会发现存在1518.402、1520.402、1521.402、1522.402等相差1的质谱峰，这是由于在天然界中好多物质都存在同位素如O16、O17、O18等，所以在提交给数据库之前会用一个类似于碳水化合物的通式进行校正，所以图谱上读到的数可能会与提交的相差1，还在处理的过程的设置也会影响给出的峰值，但应该在0.1Da以内的；同时在还会进行胰酶自解峰的扣除和空白对照峰的扣除。

牛奶蛋白质分析仪可以用于检测乳蛋白制品。以下是详细解释和相关信息：　　功能与应用：牛奶蛋白质分析仪是一种专门用于分析牛奶及其制品中蛋白质含量的仪器。它基于先进的生化分析技术，如比色法、光谱法或电化学法等，能够准确、快速地检测样品中的蛋白质含量。　　乳蛋白制品的检测：乳蛋白制品，如奶粉、酸奶、奶酪等，其蛋白质含量是产品质量和营养价值的重要指标。牛奶蛋白质分析仪可以有效地检测这些乳蛋白制品中的蛋白质含量，为生产厂家提供准确的质量控制手段。　　优点与特点：　　准确性高：牛奶蛋白质分析仪具有高灵敏度和高准确性，能够确保测量结果的可靠性。　　快速便捷：该仪器操作简单，使用方便，可以快速得出测量结果，提高检测效率。　　适用范围广：除了牛奶及其制品外，还可以用于其他含蛋白质样品的检测，如豆类制品、肉制品等。　　在乳品工业中的重要性：随着乳品市场的不断扩大和消费者对乳制品质量要求的提高，牛奶蛋白质分析仪在乳品工业中的重要性日益凸显。它可以帮助乳品企业提高产品质量、降低生产成本，同时为消费者提供更加安全、健康的乳制品。　　综上所述，牛奶蛋白质分析仪是一种功能强大、应用广泛的检测仪器，完全可以用于检测乳蛋白制品中的蛋白质含量。[img=,690,690]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2024/05/202405271615421543_8284_6238082_3.jpg!w690x690.jpg[/img]

哪位大仙做过红外分析蛋白质二级结构的，我十万火急需要您的指导！怎么具体的操作才能得到二级结构的光谱，得到了该咋分析！谢啦，谢啦！

蛋白质分析仪的校准

我想利用近红外分析一些蛋白质的组成，不需要分析氨基酸的成分，只想分析的蛋白亚基的程度，目前打算先做定标，有做过的朋友可不可以交流一下啊。我的邮箱：alex_qq@hotmail.com

主要介绍了浊点萃取法、置换色谱法、亲和层析法、亲和色谱法、凝胶电泳、双水相萃取等蛋白质的最新分离纯化技术，综和近年来国内外的一些研究结果，结合实际应用的例子，分析了各种分离纯化方法的优点，同时指出其不足之处。[img]http://www.instrument.com.cn/bbs/images/affix.gif[/img][url=http://www.instrument.com.cn/bbs/download.asp?ID=120204]浅述蛋白质分离纯化的新技术[/url]

如题，怎样对蛋白质拉曼光谱所获得的二级结构含量进行分析

蛋白质分析仪是否就是定氮仪？MW30-HHT-2400是哪家的品牌啊

蛋白质组学研究--生物质谱技术 对分离的蛋白质进行鉴定是蛋白质组研究的重要内容，蛋白质微量测序、氨基酸组成分析等传统的蛋白质鉴定技术不能满足高通量和高效率的要求，生物质谱技术是蛋白质组学的另一支撑技术。 生物质谱技术在离子化方法上主要有两种软电离技术，即基质辅助激光解吸电离(matrix—assisted laser desorption／ionization，MALDl)和电喷雾电离(electrospray ionization，ESl)。MALDI是在激光脉冲的激发下，使样品从基质晶体中挥发并离子化。ESI使分析物从溶液相中电离，适合与液相分离手段(如液相色谱和毛细管电泳)联用。MALDI适于分析简单的肽混合物，而液相色谱与ESI—MS的联用(LC—MS)适合复杂样品的分析。 软电离技术的出现拓展了质谱的应用空间，而质量分析器的改善也推动了质谱仪技术的发展。生物质谱的质量分析器主要有4种：离子阱(iontrap，IT)、飞行时间(TOF)、四极杆(quadrupole)和傅立叶变换离子回旋共振(Fourier transform ion cyclotron resonance，FTICR)。它们的结构和性能各不相同，每一种都有自己的长处与不足。它们可以单独使用，也可以互相组合形成功能更强大的仪器。 离子阱质谱灵敏度较高，性能稳定，具备多级质谱能力，因此被广泛应用于蛋白质组学研究，不足之处是质量精度较低。与离子阱相似，傅立叶变换离子回旋共振(FTICR)质谱也是一种可以“捕获”离子的仪器，但是其腔体内部为高真空和高磁场环境，具有高灵敏度、宽动态范围、高分辨率和质量精度(质量准确度可很容易地小于1mg／L)，这使得它可以在一次分析中对数百个完整蛋白质分子进行质量测定和定量。FTICR—MS的一个重要功能是多元串级质谱，与通常的只能选一个母离子的串级质谱方式不同，FTICR—MS可以同时选择几个母离子进行解离，这无疑可以大大增加蛋白质鉴定工作的通量。但是它的缺点也很明显，操作复杂、肽段断裂效率低、价格昂贵等，这些缺点限制了它在蛋白质组学中的广泛应用。MALDI通常与TOF质量分析器联用分析肽段的精确质量，而ESI常与离子阱或三级四极杆质谱联用，通过碰撞诱导解离(collision—induceddissociation，CID)获取肽段的碎片信息。 1. MALDI—TOF—MS (1)MALDI—TOF—MS的技术特点：①具有分离、鉴定双重功能，可用于混合物的分析；②测量范围宽，相对分子质量可达300 000；③精度高，蛋白质相对分子质量测定精度可达0．01％；④灵敏度高，所需样品量少，可达fmol级；⑤分析时间短，5～10rain可完成一次分析；⑥样品制备简便，操作易自动化；⑦对样品要求低，能忍耐较高浓度的盐、缓冲剂和非挥发性杂质，所以特别适合于鉴定二维凝胶电泳分离的蛋白质。 (2)MALDI—TOF—MS的技术改进：近年来MALDI—TOF—MS又有许多新的技术改进，以提高其检测灵敏性和准确度，增强其蛋白质鉴定的功能。如将MALDI离子源与四极杆—飞行时间—串联质谱对接，实现了同一样品在同一质谱仪上的肽指纹图谱与肽序列标签分析同时进行，提高于蛋白质鉴定的速度和准确性。还有MALDI—TOF—TOF—MS等。但这些技术共同的缺点是仪器非常昂贵。 (3)MALDI—TOF—MS的发展方向：①寻求新的基质(如混合基质、室温离子化液体等)和新的制样方法(如超微量进样，n1级)；②将新技术应用在分析中(如酶切技术、毫微升溶剂提取技术等)；③对质谱仪进行改进或与其他分析仪器联用，如MALDI与傅立叶转换离子回旋共振质谱(MALDI—FTMS)联用能得到更多的蛋白结构信息；④小型化、智能化、简易化及自动化已成为趋势。 2．ESI (1)ESI的优势：①检测范围宽，生物大分子经电喷雾后质荷比大大下降，因而可测相对分子质量高达十几万甚至更高的生物样品；②分辨率和灵敏度高，可达10-15—10-12mol；③不需要特定基质，避免子基质峰的干扰；④适用于结构分析，可分析生物大分子的构象及非共价相互作用，与串联质谱结合可分析蛋白质、多肽的一级结构和共价修饰位点等；⑤自动化程度高，可与液相色谱、毛细管电泳等高效分离手段在线联用；⑥MALDI是脉冲式离子化技术，而ESI是连续离子化技术，检测所需时间更短；⑦ESI常和四极杆质谱联用，仪器价格相对便宜。 (2)ESI的局限性：①对样品中的盐类耐受性差；②对混合物图谱的解析较复杂；③受溶剂的影响和限制很大。目前ESI主要用于亲水生物大分子的分析，较少用于疏水生物样品的分析。总体来说，MALDI和ESI各有长处，有各自的适用范围，是两种互补的技术。 (3)ESI的技术发展：近年来，ESI也有许多新的技术发展。液相色谱与电喷雾质谱连用(LC—ESI—