个角静态激光光散射检测器

[list][*][b]凝胶初辟本相对，打破传统需散射[/b][/list]终于写到了光散射部分，辉博士还是很兴奋的，毕竟搞了这些年色谱和光散射，很多陈谷子烂芝麻的往事和经验。静态光散射原理的发展快有一个世纪了吧，这项技术和GPC开始联用可以追溯到上个世纪八十年代，那是很多种新技术百花齐放、争相斗艳的年代。当然百花齐放不意味着每一朵花都能盛开到最后。国外很多公司设计出基于静态光散射和色谱连用技术的设备，有基于多角度外推的技术MALS（multi angle light scattering），也有基于小角度直接检测的技术LALS (low angle light scattering)。后来，呵呵，后来故事太多了，有些公司被收购，有些公司消失了，还有一些公司成长成为业内的翘楚！博士对于开发这些技术的先驱们一直充满了崇敬之情，因为如果不是当年他们面对困难所付出的勇气和努力，对了还有智慧（智慧最重要，呵呵），就没有今天我们坐在这里侃侃而谈。前面谈到单RI检测器通过校正只能得到相对分子量信息，对于想要了解高分子真实性能的科研工作者，这是远远不够的。在线光静态散射技术，不需要通过标准样品进行色谱柱校正，可以直接检测绝对分子量的结果，而高分子的绝对分子量直接决定了高分子的物理性能。在这一部分，我们聊聊在线光散射技术的原理和其功能。在线静态光散射检测器通常和RI检测器在GPC中连用，某些行业中，如蛋白质检测，光散射则和紫外检测器连用也经常用到。[b]静态光散射原理[/b][img=,578,325]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/09/201909060943550725_4845_3200617_3.png!w578x325.jpg[/img]当一束光撞击到大分子或者颗粒的时候，一部分光会被吸收，并被重新向各个方向发射出去。当一个光子撞击到大分子的时候，光子的部分能量会引发大分子内部的偶极震荡。这部分能量随后以光的形式，向各个方向被重新发射出去。我们每天都可以见到这种现象，例如白云，日落，或者灰尘经过一束阳光或者投影。光散射方面的定律可以帮助我们测量很多和大分子相关的物理量。瑞利理论描述了散射光强度与大分子的尺寸和分子量的关系，定义了发生散射的大分子和颗粒对散射光的强度的影响[img=,230,74]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/09/201909060944369098_7516_3200617_3.png!w230x74.jpg[/img]其中C为样品的浓度，θ为测量的角度（散射角），Rθ 为θ角方向的瑞利散射比（散射光与入射光的强度比），Mw 为重均分子量，A2 为第二维里系数，K和Pθ的定义式为[img=,191,65]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/09/201909060945059868_192_3200617_3.png!w191x65.jpg[/img]其中λ0 为真空中激光的波长，NA 为阿伏加德罗常数，n0 为溶剂的折光指数，dn/dc为样品在溶剂中的折光指数随浓度增量[img=,253,54]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/09/201909060945425178_8444_3200617_3.png!w253x54.jpg[/img]其中Rg 为大分子的旋转均方半径。瑞利散射方程阐述了一定的角度下散射光强度与几个因素有关，其中包扩分子量和分子尺寸，请注意是两个未知数哦。同时也可以发现，较大的分子量和分子尺寸会产生更强的散射光。散射光强的增加与分子量的增加成线性关系，但是不与分子尺寸成线性关系。[b]散射光的角度依赖性[/b]当分子具有较大的尺寸的时候，散射光的强度会随着散射角度的不同发生变化，这就是角度依赖性。瑞利散射方程中，P[sub]θ[/sub]是高分子的形状因子，是未知项，不同的光散射技术对它的处理也不相同。我们再次看看P[sub]θ[/sub]的定义：[img=,253,54]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/09/201909060946211678_3558_3200617_3.png!w253x54.jpg[/img]其中n[sub]0[/sub]为溶剂的示差折光指数，R[sub]g[/sub]为大分子的旋转均方半径，λ[sub]0[/sub]为激光在真空中的波长，θ为散射角。从定义式中可知，1/P[sub]θ[/sub]受很多参数的影响，既包扩样品也包括实验条件，如溶剂的示差折光指数（n[sub]0[/sub]），激光在真空中的波长（λ[sub]0[/sub]）散射角（θ）和大分子的旋转均方半径（Rg）。这意味着对于大分子，散射光的强度与测试角度相关，这就是角度依赖性。产生角度依赖性的原因，是当分子的尺寸增加后，散射光的光子彼此之间会发生干涉等相互作用，如下图[img=,690,234]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/09/201909060947188008_3081_3200617_3.png!w690x234.jpg[/img][list][*]各向同性的散射体的尺寸相对于激光的波长来说较小，各向散射光均匀分布。各向异性散射体的尺寸相对于入射激光的波长明显较大，各个方向的散射光强度不等。[*]当大分子的尺寸相对于激光的波长来说较小的时候，如上，散射的形式表现为单点散射，这时各个方向的散射光的强度相同，这样的大分子被称为各向同性散射体。[/list]当大分子的尺寸相对于激光的波长来说明显变大的时候，分子的尺寸和结构开始变得重要。来自激光的光子会在大分子中的不同部位发生散射。这种情况与大分子的Rg有关。这些发生散射的光子彼此之间相互作用，导致测量的光强受观测位置影响。这样的大分子被称为各向异性散射体。在各向异性散射中，所有的相互作用都是造成衰减的，因此散射光的强度相比于各向同性的散射是降低的。如果我们用这个散射强度去计算分子量，我们就会得到偏低的结果。那么怎么办呢？瑞利散射方程告诉我们如果可以在0度角测量散射光强度，那么sin[sup]2[/sup](θ/2)就等于0，1/Ｐ[sub]θ[/sub]的值就是1。不过由于0度存在强度很高的入射激光，所以我们很难分辨出单独的0度角高分子散射光的强度。由于不能够直接在0度角测量，我们需要一种替代的手段。于是就出现了市场上的两种技术，即多角光散射MALS和小角光散射LALS。万变不离其宗，他们的目的都是为了检测0度角附近的散射光强，从而得到准确的大分子的分子量的信息，只不过，MALS利用的是外推的方式，LALS直接在0度角附近检测而免除了外推的过程。总结：[list][*]Rg小于12nm（~入射激光波长1/40）的分子，散射光表现为各向同性，几乎不表现出角度依赖性，那么这时候任何角度检测的结果都是正确的，不需要多角MALS也不需要小角LALS，实际上一个单90度角得到的结果是非常好的[*]Rg大于12nm（~入射激光波长1/40）的分子，散射光表现出各向异性，散射光的强度与散射角有关，需要0度角的散射光强来准确计算分子量，此时需要多角MALS或者小角LALS技术[/list][b] 旋转均方半径Rg的计算[/b][img=,690,357]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/09/201909060948475418_2265_3200617_3.png!w690x357.jpg[/img][align=center][b]Guinier图表示KC/R[sub]θ[/sub]对应sin[sup]2[/sup]（θ/2）的函数关系。其截距为1/Mw，起始部分的斜率与Rg有关[/b][/align][b] [/b][list][*]Rg可以从角度依赖性曲线（Guinier 图）中起始部分的斜率中计算[*]必须要足够显著的角度依赖性来计算曲线的斜率[/list]曲线起始部分的斜率可以表示为[img=,139,51]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/09/201909060949118845_5780_3200617_3.png!w139x51.jpg[/img]Rg可以从这个公式中得到，然而，对于较小的大分子，曲线的斜率可能非常小，甚至淹没在噪音当中。只有当大分子的尺寸相对入射光波长非常显著的时候，曲线的斜率才会被精确的计算，从而获得可信的Rg。入射波长为633nm激光可以计算的Rg的下限约为12nm左右。但是，绝对的下限可能高于或低于12nm，这与样品，溶剂和测试条件都有关系。很多MALS仪器制造商提出的Rg下限为10nm（甚至更低），这通常是对于标准样品或者具有较高dn/dc或者浓度的样品的理想情况。实际使用的过程中，很多样品无法达到这样的下限。另外极端条件如样品的dn/dc很低或者不在理想条件下，其Rg的下限都会远高于12nm的理论值。[b] GPC/SEC与静态光散射连用[/b][img=,690,60]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/09/201909060949352365_2620_3200617_3.png!w690x60.jpg[/img]GPC/SEC可以使我们轻松的将光散射数据和浓度检测器提供的数据联系起来进行计算。最常用的浓度检测器是示差折光检测器RI或者紫外检测器UV。现在常用的静态光散射仪器有2种，分别RALS与LALS联用，和多角光散射MALS。[b] 光散射检测器1 - RALS/LALS直角和小角联用光散射检测器[/b]RALS与LALS具有一定的互补性的。RALS灵敏度高，适合测量散射光各向同性的样品，LALS适用于测量散射光各向异性的样品，可以提供非常准确的结果。如下图，RALS/LALS联用检测器将两种检测器整合在一个流通池当中。在Zimm图上，RALS主要测试分子尺寸小于临界半径12nm的各向同性散射体，LALS则精确测试分子尺寸大于临界半径12nm的各向异性散射体。软件会自动根据检测器的信号在RALS与LALS之间进行切换。对于各向异性散射体，两个检测器计算的分子量的比值可以用于估计Ｐθ，这样再对分子结构进行假设（无规线团或刚性球），就可以估计分子的Rg了。[img=,687,252]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/09/201909060950302655_7653_3200617_3.png!w687x252.jpg[/img][b]左图，RALS/LALS联用检测器结构与流通池流路。激光从流通池末端进入，检测器布置在90度和小角度方向。右图，使用RALS/LALS联用时，对应的Zimm图为两个点，其中RALS为各向同性散射体提供高灵敏度的检测，LALS为各向异性散射体提供高精确度的检测[/b]RALS/LALS联用的特点：[list][*]对于分子体积不大的大分子，RALS可以提供最高的灵敏度[*]对于分子体积较大的大分子，LALS可以提供最好的准确性[*]可以比较两个角度的散射光强度[*]对两个角度的数据进行分析，可以计算Zimm曲线的斜率，进而计算Rg，当然这个Rg的准确程度比MALS得到的Rg要差一些，毕竟只有两个点的外推[*]RALS/LALS联用检测器具有很小的流通池，这其实是相对MALS检测池的优势之一，毕竟检测池小了，扩散效应会降低很多[b][/b][/list][b]光散射检测器2 - 多角光散射MALS[/b]如名称所示，MALS检测器在多个角度检测散射光的强度，如下图。将这些角度的数据点添加在Zimm图中，通过最合理的拟合曲线外推至0度角，就可以计算分子量。曲线起始部分的斜率可以精确的计算分子尺寸Rg。[img=,686,252]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/09/201909060951288805_6810_3200617_3.png!w686x252.jpg[/img][align=left][b]左图：MALS检测器结构与流通池流路。激光从流通池末端进入，检测器布置在多个角度方向上 。右图：使用MALS时，可以得到一条完整的拟合曲线 ，这条曲线外推至0度可以计算大分子的分子量，曲线起始部分的斜率可以计算Rg[/b][/align][b] 多角光散射的外推模型小分子[/b] 小分子线团、蛋白质、单克隆抗体等样品为均匀散射，不需要外推。[b] 大分子[/b] 外推模型包括： [list][*]Zimm外推，Kc/R[sub]θ[/sub]对于 sin[sup]2[/sup](θ/2)外推拟合，适用于适用于适中分子大小 Rg ~ 20-50 nm的分子线团 [*]Deby外推，R[sub]θ[/sub]/Kc 对于 sin[sup]2[/sup](θ/2)外推拟合，在一个比较宽的Rg范围内使用，是一种广谱的拟合模型，其适合范围比Zimm模型更加宽泛 [*]Berry外推，（Kc/R[sub]θ[/sub]）[sup]0.5[/sup]对于 sin[sup]2[/sup](θ/2)外推拟合，适用于比较大的分子 Rg 50 nm[/list][img=,634,189]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/09/201909060951554498_5952_3200617_3.png!w634x189.jpg[/img][b]左图：为小分子量聚合物的Zimm曲线，散射光为均匀散射，没有角度依赖性右图：为高分子量聚合物的Zimm曲线，散射光为非均匀散射，具有角度依赖性，需要外推得到0度角的散射光[/b] 其中在拟合过程中，用户可以适当删除一些与拟合曲线偏差较大的光散射数据点，以及使用1-5阶指数拟合方式（线形好尽可能用低阶指数），以达到更好的拟合效果。MALS特点：[list][*]由于可以获得多个角度的散射光强度，使用者可以通个比较相邻的角度的数据更好的确定结果的准确性[*]MALS可以测量各种大分子的分子量，因为计算过程已经将角度依赖性考虑在其中了[*]通过多个角度的数据，可以精确的计算Rg[*]根据Zimm曲线的形状，MALS可以洞察散射光的角度依赖性的情况[*]需要选择合适的模型，这点非常重要，毕竟Zimm，Debby，Berry的最适合的范围不同[*]如果某个角度的数据不合理或者噪音太高，计算过程中可以将其去掉，这样做不会对结果造成太大的影响[*]光学元件的设计导致散射池体积较大，这会造成比较大的扩散效应[/list]当使用MALS时候，最为关键的一点是能不能确定拟合曲线的类型，而精确的拟合曲线主要是由精确的低角度的数据的数量决定的。因此一台MALS应该配置尽可能多的低角度接收器，这有助于提高外推至0度角的准确性。总体上对于不同类型的MALS而言，角度越多，外推过程的准确性就越好。[b]趣谈1 光散射检测器角度越多分子量检测越准？[/b]这真的是一个需要很多前提条件的论断。首先，12nm以下的小分子散射是均匀的，任何一个信噪比良好的角度得到的散射光强计算分子量都可以得到准确的结果，不必需要0度角的信号意味着既不需要多角度MALS的外推也不必需小角度LALS的信号。这在众多通过90度角单角度检测蛋白（如人学白蛋白HA，单克隆抗体）的用户实际检测中得到了验证。不但单抗单体150KDa检测极为精确，而且其他的寡聚体峰，如二聚体300KDa，三聚体450KDa都没有任何问题。而在检测大分子的过程中，小角光散射LALS的准确度并不比多角差。实际上，因为不需要像MALS一样选择模型进行外推（外推过程中的选点，选模型，选择拟合阶次都是具有一定主观性的），在检测分子量的角度，小角度的准确性甚至更高。很多GPC的专业书籍都对此有所描述：[img=,690,338]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/09/201909060952216648_8096_3200617_3.png!w690x338.jpg[/img] 所以，我的观点是只有当您：1选择了多角光散射MALS作为检测器，2检测大分子的时候，角度越多分子量越准。毕竟角度越多越有利于外推的准确性。但是话说回来，如果您特别在意Rg的检测的话，那么多角度还有有其优势的。 [b]趣谈2光散射检测器不需要校正[/b] 很多厂商都是这么说的，但是，实际上完整的表述是，光散射检测器不需要做传统校正曲线！在不同的流动相下，其光散射检测器的光学常数不同，这个光学常数以及检测器之间的保留体积需要通过一个窄分布的标准样品校正出来，而一旦校正出来常数，做任何样品都是一样的。据博士所知，所有厂商都是如此！！！[align=left][b]趣谈3装了光散射检测器的GPC是不是所有样品都可以检测？[/b][/align]光散射检测器不是万能的，也有其限制。限制1. 分子量或者dn/dc极低的样品。这时候散射光强会很弱，有可能散射信号的信噪比很差，此时光散射结果会有较大偏差限制2. 多组分混合物，这里指的是不同化学结构单元的混合物，如聚苯乙烯PS和聚氯乙烯PVC的混合物。由于不同组分的dn/dc不同，而软件只能输入一个dn/dc值，所以检测出来的数据必定不那么“绝对”。一个例子就是沥青的分子量检测，其标准方法就是相对分子量，因为成分太复杂了，没法符合光散射的基本要求。限制3. 荧光样品。具有荧光发射的样品对于散射光信号是一种干扰，如木质素，通常会使得散射光增强，也就是分子量偏高。一个治标不治本的方法是在检测器前加入荧光滤光片，然而，先不谈荧光滤光片会降低检测器的灵敏度，其得到的散射光强也是有偏差的。解决之道是使用RI和粘度检测器连用，进行普适校正，这个后面我们到粘度检测器再慢慢聊。 [b]趣谈4光散射检测器好贵呀，我一定要检测绝对分子量吗？[/b]当然不是。每一种检测方式都有其存在的必然。如果您面对的工作是工厂中的QAQC，或者研发中的初步判断和比较，应该传统校正的相对分子量就够了。但是如果您面对的工作是高端的研发，以及需要分子量和其他物理化学性能相关联，那么绝对分子量无疑会更好。最近会写一个番外篇，也是一个预告：[b]为什么凝胶渗透色谱需要光散射技术[/b] 好了，先聊到这里，开学了，家长和孩子们的惊悚大片即将上映，祝大家心平气和！

近期，实验室买了套美国怀雅特技术公司的多角度激光光散射仪。刚开始安装完后，挺会用的，后来丢了段时间全忘光了。 在自己做样品的时候遇到了很多麻烦，尤其是里面的几个参数，都不知道到底是干什么用的。反正是一塌糊涂。 后来跟wyatt的工程师互通几次email，觉得其实仪器还是蛮好用的，功能也挺强大。现分享经验如下： 1关于HELEOS十八角激光光散射仪 首先是zimm图，首先将样品配制成一系列浓度（至少5个浓度梯度），依次注入到检测器中，根据浓度，角度的拟合， 得到重均分子量（平均值），均方根旋转半径，以及第二维利系数（软件中的help文件告诉你如何得到分子量和半径， 好像是Globe Fitting技术）。 在这个试验中，有几个地方不容易处理好： 浓度如何配准：用容量瓶定容，然后再用重量法稀释配制不同浓度梯度的溶液；或者全部用容量瓶定容； 梯度如何选择：以1或0.5为稀释单位就可以。 手动进样费力：利用注射泵或液相泵进样。 归一化：因为归一化的操作与溶剂有关，因此，只要是跟换溶剂了就必须重新做归一化（这个上面我犯了好几次错误，呵呵）。 做完后就可以保存为模板了，以后在这种条件下，直接打开就可以了。 另外，还有个debye模式，该模式下，能对每一个浓度都能测得其分子量和半径。我在文献中面看到有人将不同聚合反应时间 的聚合产物经过纯化后，测分子量对浓度作图，得到反应动力学方程。 其实，利用wyatt的软件还可以将两种模式中任何一种模式的数据应用到另一种模式下。但不知道怎么弄，希望高手们指点 下子，现谢谢啦！ 2.关于Optilab rEX示差检测器 据wyatt工程师说，这个示差检测器是专门为光散射仪生产的，因为在利用光散射测分子量的时候需要输入dndc值，具体的测定 方法和HELEOS测zimm图是一样的。 那么dndc值到底作用是什么呢？dndc值又称为折射率增量，高分子的分子量与该值的倒数平方成正比；另外，示差检测器在测定 物质浓度的时候也需要该值，样品的测定浓度与dndc值成反比。因此dndc值的准确性直接影响分子量及浓度的准确性。而且该检 测器实际上也是浓度型检测器，能与普通HPLC联用，测定物质的浓度。我还用它测定了多糖的含量，也是先做标准曲线那种。 3 HELEOS十八角激光光散射仪，Optilab rEX示差检测器，GPC/SEC联用 个人觉得该检测器联用，能实现功能最大化，也很方便，就像HPLC一样。联机的话能测定大分子的分子量（Mw，Mn，Mz，Mp）， 均方根旋转半径半径（Rw，Rn，Rz），分子量分布，多分散性，高分子在溶液中的聚集态等信息。 对菜鸟可能遇到分子量测不准的情况，遇到这种情况可以按照下面几种办法解决： 检查仪器常数是否正确，默认值为1.0e-4； dndc值是否正确，默认值有可能是0.185哦； 归一化是否做了，一般没做归一化，结果报告中数据后面的误差较大。 最后就是看柱子的分子效果，要是样品中含有的物质较多，且峰又拖尾的话，数据一般偏大，这个大家可以中debye的切片图 里边的小滑块看出来。 如何定峰：定峰的三原则：第一条，激光和示差都有信号；第二条，峰的起始点和结束点为基线高度的三倍；第三，遇到没有 完全分离开的峰，可以单独分开定。 数据基本分析：GPC/SEC分离大分子的原理是大分子先洗脱出来，小分子的后洗脱出来；反映到激光信号上面就是这样子，峰曲 线从左到右分子量依次减小，激光对大分子信号高；而示差检测器只对折射率有反应，信号高，则对应物质浓度就高。这样子就 可以了解到高分子中不同组分的信息。 最后，听说该仪器可以跟紫外联用，自己没用过，要是有高手用过，告诉我下，谢谢[img]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2009/11/200911191957_185471_1911151_3.jpg[/img][img]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2009/11/200911191957_185472_1911151_3.jpg[/img][img]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2009/11/200911191957_185475_1911151_3.jpg[/img]

介绍过传统校正对于相对分子量的检测方法，以及光散射技术对于绝对分子量的检测原理，下面我们通过检测概念、标准样品影响、保留时间影响、对于分布检测的准确性、测试质量判断、对于团聚物的检测以及检测效率几个方面来了解一下GPC技术需要和光散射技术联合使用。[b]检测概念[/b][img=,690,331]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/09/201909091020170531_1340_3200617_3.jpg!w690x331.jpg[/img][b]光散射法和传统法色谱信号区别[/b]通过RI和光散射检测器连用，凝胶渗透色谱GPC/SEC在一个测试过程中同时收集RI和光散射信号，得到绝对分子量Mw、Mn、Mz，分子量分布，均方旋转半径和第二维利系数。而通过传统校正在一个测试过程中收集RI信号，得到相对分子量Mw、Mn、Mz，分子量分布。相对分子量的检测的准确性依赖于很多条件，但最关键的一点是溶解在溶剂中的高分子线团的流体力学体积，因为流体力学体积的大小和分布决定了样品的流出时间也就决定了所得到的相对分子量的数值和重复性。[img=,519,654]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/09/201909091021073771_7920_3200617_3.jpg!w519x654.jpg[/img][b]光散射信号和RI信号对于聚苯乙烯及其溴化聚苯乙烯的响应[/b]上面的一个例子中，通过两种不同的检测方法检测了两个样品。一个是聚苯乙烯，另外一个是溴化聚苯乙烯。溴元素是质量很大但是体积很小的元素，溴化的聚苯乙烯和没有溴化的聚苯乙烯相比分子量有明显的升高，但是分子体积基本不变。通过测试我们发现，传统校正下，对于聚苯乙烯和溴化聚苯乙烯的RI信号几乎没有区别，因此传统校正得到的结论是相对分子量没有改变，而通过光散射检测器我们可以看到，溴化之后的散射光强明显加强，说明分子量增大。光散射得到的绝对分子量告诉我们，溴化后的聚苯乙烯分子量是62万，而没有溴化的聚苯乙烯的分子量是25万！ 我们再来看一个蛋白质测试的例子。蛋白质样品本身是多肽的四级堆积结构，分子密度较高，而不同聚集态的蛋白团聚物之间的分子密度差别很大，这就导致了相对分子量和其真实分子量之间差别很大。[img=,589,229]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/09/201909091022290190_9869_3200617_3.png!w589x229.jpg[/img]这个例子中我们首先使用一系列蛋白进行了传统校正曲线的绘制，如上图[img=,690,157]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/09/201909091022557007_3603_3200617_3.png!w690x157.jpg[/img][align=left]利用传统校正曲线检测BSA牛血清白蛋白样品（单体分子量66.4KDa），如上图我们可以看到，其二聚体和三聚体Mw分别得到202KDa和345 Da，这些寡聚体的分子量与其真实值有着明显的偏差。[/align][img=,525,418]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/09/201909091024147031_8985_3200617_3.png!w525x418.jpg[/img][b][/b]而通过光散射检测器得到的结果单体66 K Da，二聚体133 K Da，三聚体201 K Da，这与其真实值具有高度的一致性！[b]标准样品影响[img=,650,616]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/09/201909091027005812_621_3200617_3.jpg!w650x616.jpg[/img][/b]LS = K[sub]LS[/sub]• (dn/dc)^2• M• CRI = K[sub]RI[/sub]• （dn/dc）• C通过光散射检测器检测绝对分子量只需要仪器常数K[sub]LS[/sub]和K[sub]RI[/sub]，而仪器常数只取决于流动相的种类、检测温度，不取决于任何标准样品以及标准样品的种类。而对于传统校正而言，其计算结果严重依赖于标准样品的种类和来源！相对分子量的计算取决于校正曲线，所有影响校正曲线的因素将对于计算结果造成影响，而标准样品是影响校正曲线的重要因素之一。使用不同高分子标准样品由于分子密度的差异，得到不同的标准曲线。即使使用同一种标准样品，相同供应商的不同批次，校正曲线也会有所差异，导致分子量结果不同[b]保留时间影响[/b][img=,690,264]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/09/201909091027389110_208_3200617_3.jpg!w690x264.jpg[/img][b][/b][align=center][b]保留时间对于光散射检测和传统检测的意义[/b][/align]通过光散射检测器检测绝对分子量不依赖于样品信号保留时间！分子量结果和重复性只与RI和光散射信号强度相关，与保留时间无关，因而可以得到极高的准确性和重复性。传统校正严重依赖于样品信号保留时间！由于色谱柱老化，色谱泵不稳定，测试温度波动造成的样品RI信号保留时间的改变会造成分子量结果的明显差异。[b]对分子量分布的检测准确性[/b][img=,690,313]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/09/201909091029080971_12_3200617_3.jpg!w690x313.jpg[/img]高分子分布信息的准确性取决于分子量检测的准确性。对于窄分布样品如蛋白质，光散射得到的绝对分子量能够正确地表征样品的分布信息。而传统校正由于其分子量是通过校正曲线得到，其分子量在不同的流出时间在校正曲线上有所差别，所以得到的分子量分布与样品的真实结果会有明显偏大。这将影响到检测者得到正确的结论。[img=,690,492]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/09/201909091029568798_241_3200617_3.jpg!w690x492.jpg[/img][b] 典型的蛋白质色谱流出曲线判断测试质量[/b][img=,690,233]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/09/201909091031060697_8566_3200617_3.jpg!w690x233.jpg[/img][align=center][b]绝对分子量分布和相对分子量分布对于信号质量的判断[/b][/align] 通过光散射和RI检测器的结合使用，还可以有效判断GPC的测试质量。在GPC检测过程中如果在错误的制备条件下检测样品，（意味着流动相、色谱柱种类错误），都可能造成高分子样品在色谱柱上的吸附。而高分子在色谱柱上的吸附将会造成GPC在分离过程中高分子材料不按照从大到小的顺序流出，这将导致错误的分子量和分子量分布结果。通过光散射检测器和RI检测结合，可以得知样品在色谱柱上有无吸附，判断依据如下：[list=disc][/list]1.绝对分子量是否随着保留时间增加2. 光散射检测器是否有脱尾，且其回归基线时间是否晚于RI回归基线时间[list=disc][/list]如果同时出现以上两种情况，则说明样品在色谱柱上有吸附，需要重新设定检测条件。传统校正的相对分子量由校正曲线得到，永远随保留时间下降，检测者无法得到样品检测条件是否正确的任何信息！[img=,690,322]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/09/201909091032150236_186_3200617_3.jpg!w690x322.jpg[/img][b]光散射检测器对于多糖分子的检测。左图测试条件下有吸附，分子量分布具有翘尾，右图条件下没有吸附[/b]上图显示了光散射检测器对于一个纤维素样品测试质量的判断。左图中纤维素样品的光散射信号具有拖尾，同时分子量随流出时间具有向上翘的现象，意味着样品在色谱柱中具有吸附，右图是在正确的色谱条件下检测，分子量随流出时间单相下降。[b]探测大颗粒或者聚集物[/b][img=,690,278]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/09/201909091033213723_7156_3200617_3.jpg!w690x278.jpg[/img][align=center][b]光散射信号对于少量团聚物的存在非常敏感，而RI或者UV检测器完全检测不到[/b][/align][color=#072e67] 光散射检测器信号正比于分子量的平方，因而对于大分子物质及其敏感，即使是微量存在的大颗粒或者团聚物，也可以得到较强信号。这对于生物领域尤其是蛋白质的研究工作者具有非常重要的意义。而RI检测器只对应于样品的浓度，对于微量存在的团聚物无法检测。[/color][img=,690,324]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/09/201909091033593471_645_3200617_3.jpg!w690x324.jpg[/img][b]光散射检测器可以检测到BSA团聚物存在，而RI和UV检测器没有信号检测效率[/b] 通过光散射检测器检测绝对分子量只需要得到仪器常数，无需色谱柱校准。在不更换溶剂的条件下，通常不需要测试标准样品。更换溶剂时需要得到新的仪器常数。而对于传统校正而言，需要经常检测标准样品已确定色谱柱、色谱泵、工作曲线是否正常。而每次标准曲线的测定则需要使用7-13个标准样品，极大地增加了使用者测定样品所需时间。最后我们通过一个表格归纳不同测试模式的特点[img=,690,583]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/09/201909091034241821_627_3200617_3.png!w690x583.jpg[/img]总结：在这个番外片中，我们聊到了GPC的两种检测方法的区别，以及在GPC中引入静态光散射检测器的意义。正如前几个帖子中所述，没有一种方法是万能的，所有样品都可以检测，光散射也是如此。但是光散射检测器为测试者带来了更多、更准确的信息，为GPC的检测质量提供了良好的依据好了，先聊到这里，祝大家中秋快乐，团圆安康！