液相色谱避免样品析出办法

[align=center][b]如何避免液相色谱柱的损坏呢？[/b][/align]在高效液相色谱的使用中，我们会发现很多实验室会面临色谱柱频繁损坏的问题。[b]损坏的来源[/b]首先，需要来了解一下色谱柱的损坏来源于哪些方面：1、泵头密封圈的磨损2、进样阀转子密封圈的磨损3、析出的缓冲盐4、样品中的复杂易吸附基质其实，在工作过程中大多数的颗粒物堵塞导致的色谱柱背压升高问题是体现在柱头堵塞。而样品的易吸附机制也可能会和柱前端的硅胶表面游离的硅醇基发生作用导致色谱柱背压升高。但是这种情况在较低的PH系统中会有所改善，因为较低的PH系统会降低硅胶表面的硅醇基发生解离。[b]预防措施[/b]为了降低色谱柱的损伤问题，我建议大家在使用色谱柱时可以做一些预防。例如：[b]1在液相系统中加入在线过滤器[/b]在线过滤器的内部颗粒空隙一般是0.5微米，对于UHPLC会选择0.2微米空隙的在线过滤器。这个空隙尺寸和柱头的过滤筛板尺寸接近或者略小。所以，在线过滤器能够有效的阻隔来自样品、泵头密封垫、自动进样器的转子密封垫的颗粒物，以防止柱头过滤筛板的堵塞。注意：但是对于非常低死体积的液相系统，在线过滤器的加入可能会导致系统死体积增大峰展宽变严重的问题。而对于大多数的液相系统而言，色谱图不会有太大变化。[b]2在柱子前端使用保护柱[/b]保护柱有很多种，通用型、一体式、卡套式，但是它其实是一个和分析柱固定相相同的10-20mm的小柱子。因为它具有和分析柱相同的内部填料，所以保护柱不仅可以阻隔颗粒物，还可以阻隔易吸附的样品基质组分。注意：由于保护柱中可能有大量的强保留组分，在用强溶剂清洗系统时请取下保护柱，以防止这些强保留组分被洗脱进分析柱。保护柱如果出现吸附饱和也可能会对分离效果有影响，[b]3对样品进行净化处理[/b]有一些液相的分析方法没有明确标注样品的净化，但我希望大家在做分析时都能够考虑样品的净化，常用的方案是对样品进行过滤。[b]色谱柱的储存[/b]在实际工作中，色谱柱的储存也会影响柱子的使用寿命。那么对于色谱柱的储存，也有以下建议：[b]短期储存时[/b]应该保存在最接近常用的流动相条件下。并且，一定要移除系统中的缓冲盐、酸等。[b]长期储存时[/b]将色谱柱按照说明书的要求保存在对应的溶剂中，并且将色谱柱从系统中取下两头用堵头堵死。本文来源于微信公众号《色谱学堂》，本文对内容进行了部分修改

在进行[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]分析时，确保样品的稳定性以及避免维生素C的降解非常重要。以下是一些具体的方法和注意事项： 样品采集与处理：样品采集后要尽快进行处理和分析，以减少维生素C的暴露时间和降解机会。在处理过程中，要轻柔操作，避免剧烈搅拌或高温处理，这些都可能加速维生素C的降解。 使用合适的保存条件：将样品存放在低温环境中，如冰箱（4°C），可以显著减缓维生素C的降解速率。另外，避免样品暴露在阳光下或强光下，因为光照也会加速维生素C的分解。 添加稳定剂：在样品中加入适量的稳定剂，如抗坏血酸（维生素C本身）或其他抗氧化剂，可以帮助保护维生素C不被氧化。此外，使用一些酸性缓冲液（如磷酸盐缓冲液）调节样品的pH值至酸性范围（pH 2-4），也能有效抑制维生素C的降解。 选择合适的样品瓶和密封盖：使用高质量的样品瓶和密封盖，确保样品的密封性，防止空气和水分的侵入，从而避免维生素C的氧化降解。优选使用具有良好密封性能的聚丙烯或氟塑料材质的样品瓶。 控制进样量：在[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]分析过程中，要精确控制进样量，避免进样过多或过少影响分析结果的准确性。同时，尽量减少样品在进样器中的停留时间，以减少维生素C的降解。 定期校准和维护仪器：定期对[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱仪[/color][/url]进行校准和维护，确保仪器的稳定性和准确性。在分析过程中，要保持仪器的清洁和良好的工作状态，避免因仪器问题导致的分析误差。 总之，在进行[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]分析时，要综合考虑样品的采集、处理、保存、进样以及仪器维护等多个环节，采取有效的措施确保样品的稳定性，避免维生素C的降解，从而获得准确可靠的分析结果。

液相色谱柱在使用过程中易出现的问题和解决办法色谱柱在使用中最常见的问题就是柱压升高，如果柱压是在长时间使用过程中缓慢增加，属于正常现象。但柱压在使用过程中突然升高（系统管路堵塞及压力传感器故障除外），可能的原因有如下几点： （1）、色谱柱头的过滤筛板堵塞或污染； （2）、色谱柱头的填料被样品污染； （3）、色谱柱内缓冲液中的盐遇到高浓度的甲醇或其他有机溶剂，形成结晶析出； （4）、流动相PH值过大或过小使固定相结构破坏或溶解。解决办法如下： （1）、如确定是色谱柱头的过滤筛板被污染，可以将色谱柱反方向用甲醇冲洗至正常压力，或者卸下色谱柱头，将其放在10％的稀硝酸内超声清洗10分钟，后再用纯水超声10分钟，重新装入色谱柱。 （2）、如确定色谱柱头的填料被污染，将柱头螺丝卸下，挖出柱内前段被污染的填料，用相同的柱填料重新填入，仔细修复后，重新安装上柱头螺丝。 （3）、如确定定是盐结晶，用10%的甲醇/水冲洗色谱柱使柱内盐全部溶解，再换高浓度甲醇。 （4）、如果因PH值使用不当，很难恢复。

求教 液相色谱仪泵上有两个后冲洗出入口，有什么作用 。 有的时候会有液体在上面流出

液相色谱最大的故障是漏液问题 液相色谱现在在分析实验室应用的很多，对样品分析分析做出了巨大的贡献。当然由于这种仪器的固有特性（高压或超高压），在实验过程中也可能会出现很多故障问题，给实验带来很多麻烦，给操作者带来很多烦恼。 液相色谱在使用中可能会出现很多问题，其中最常见的故障那肯定是漏液问题了。由于系统长期处于高压状态，那很多部件漏液就在所难免了。再就是液相泵是在线输液，在高压状态下动态工作也是漏液的有一大因素。另外液相可能会用到酸碱盐溶液，这些溶液可能会对系统造成污染或堵塞等，这就使得系统的压力更高，造成漏液。 液相色谱溶液漏的地方有泵头处（密封圈或柱塞杆损伤所致），单向阀处，阻尼器处，混合器处，进样阀处，放空阀处，色谱柱处，检测池处，接头处等等。 漏液是液相常见的问题，不够是进口仪器还是国产仪器，只要是液相仪器就都可能会漏液，只是漏液的程度和频率问题。这个问题我们只能是竭力控制或减少缺很难彻底解决，尤其是寿命较长的老仪器，那就更难避免了。 其实漏液、漏气问题在其它分析类产品中也可能会出现，只是可能没有液相这么严重。 液相色谱漏液问题解决办法一般都是换件，比如密封圈、密封垫、柱塞杆，刃环、滤片、接头等。另外清洗、疏通管路、液路也是常见的解决办法。

1、液相色谱仪—气泡溢出 流动相内有气泡,关闭泵,打开泄压阀,打开purg键,清洗脱气,气泡不断从过滤器冒出,进入流动相,无论打开purge键几次,都无法清除不断产生的气泡。原因过滤器长期沉浸于乙酸铵等缓冲液内,过滤器内部由于霉菌的生长繁殖,形成菌团,阻塞了过滤器,缓冲液难以流畅地通过过滤器,空气在泵的压力作用下经过滤器进入流动相。处理过滤器浸泡于5%硝酸溶液中,超声清洗几分钟即可;亦可将过滤器浸泡于5%硝酸溶液中12～36小时,轻轻震荡几次,再将过滤器用纯水清洗几次,打开泄压阀,打开purge键清洗脱气,如仍有气泡不断从过滤器冒出,继续将过滤器浸泡于5%硝酸溶液中,如没有气泡不断从过滤器中冒出,说明过滤器内部的霉菌菌团已被硝酸破坏,流动相可以流畅地通过过滤器。打开泄压阀,打开泵,流速调至1.0～3.0ml/min,纯水冲洗过滤器1小时左右。即可将过滤器清洗干净。关闭泄压阀,纯甲醇冲洗半小时即可。 2、液相色谱仪—柱压高原因 (1)缓冲液盐分如(乙酸铵等)沉积于柱内; (2)样品污染沉积。处理对于第一种情况先用40～50℃的纯水,低速正向冲洗柱子,待柱压逐渐下降后,相应提高流速冲洗,柱压大幅度下降后,用常温纯水冲洗,之后用纯甲醇冲洗柱子30分钟;对于第二种情况,由样品的沉积引起污染的C18柱,和纯水反向冲洗柱子,然后换成甲醇冲洗,接着用甲醇+异丙醇(4+6)冲洗柱子(冲洗时间的长短由样品污染的情况而定),再用换成甲醇冲洗,然后用纯水冲洗,最后甲醇冲洗正向冲洗柱子30分钟以上。 3、液相色谱仪—既无压力指示,又无液体流过 (1)泵密封垫圈磨损; (2)大量气泡进入泵体。处理对于第一种情况,更换密封垫圈;对于第二种情况,在泵作用的同时,用一个50ml的玻璃针筒在泵的出口处帮助抽出空气。 4、液相色谱仪—压力波动大,流量不稳定 原因系统中有空气或者单向阀的宝石球和阀座之间夹有异物,使得两者不能密封。处理工作中注意观察流动相的量,保证不锈钢滤器沉入储液器瓶底,避免吸入空气,流动相要充分脱气。如为单向阀和阀座之间夹有异物,拆下单向阀,放入盛有丙酮的烧杯用超声波清洗。 5、液相色谱仪—出峰不佳,峰分叉 (1)色谱柱被污染; (2)柱头填料塌陷。处理对于第一种情况,先用纯水反向冲洗柱子,然后换成甲醇冲洗,接着用甲醇+异丙醇(4+6)冲洗柱子(冲洗时间的长短由样品污染的情况而定),再换成甲醇冲洗,然后用纯水冲洗,最后甲醇冲洗正向冲洗柱子30分钟以上。如冲洗后依然出峰不佳,则考虑第二种情况。对于第二种情况,拧开柱头,检查柱填料是否硬结或塌陷。去除硬结部分(污染的填料),装入新填料,滴一滴甲醇,填料下陷,再填,用与柱内径相同的顶端平滑的不锈钢杆压紧,再填平,滴甲醇,再压紧反复几次,直至装满填平。柱头用甲醇冲洗干净,擦净柱外壁的填料,拧紧柱头,用纯甲醇冲洗30分钟以上。 6、液相色谱仪—峰面积重复性不佳 (1)进样阀漏液; (2)加样针不到位。 (3)液量不足. 处理对于第一种情况更换进样阀垫圈;对于第二种情况保证加样针插到底,注射样品溶液后须快速、平稳地从LOAD状态转换到INJECT状态,以保证进样量的准确。日常工作中,液相色谱仪的保养非常重要,如要注意不要让空气进入输液系统和高压泵中,储液器内的溶液如长时间未用应清洗储液器并更换溶液,每次用完色谱仪后缓冲液要用纯水冲洗干净,防止无机盐析出或沉积;样品的前处理也很重要,任何样品都要尽可能地去除杂质,完全溶解,尽量减少对色谱柱的污染,以延长色谱柱的使用寿命,同时避免注射过浓的样品溶液,以免残留液在进样阀内析出固体引起堵塞;色谱柱作好标记,用于不同分析目的的色谱柱不要混用等。

高效液相色谱的使用和维护 随着现代化社会的不断进步和需求，科学技术的不断发展和提升，各种高尖端产品及技术如春雨后竹笋般蓬勃发展。高效液相色谱产品及高效液相色谱技术就是为了适应和满足这种社会需要悄然而生，并逐渐成长发展直至壮大起来。 作为先进、精密的仪器，高效液相色谱仪是用于尖端的科学研究，用于复杂的化学分析，用于关于民生问题的监测、检测等。仪器的正常运行，准确的结果数据是每个操作者所期待并向往的。那么仪器的正确使用和正确维护就显得尤为重要。 下面就一一介绍下高效液相色谱使用和维护中的几个重要环节吧。实验前的准备工作1. 过滤流动相。为了保证流动相洁净，流动相使用前都必须微膜过滤。2. 流动相脱气。为了避免流动相中气泡对仪器（气泡可能会对仪器及相关设备的正常使用及寿命产生一定影响）及分析结果的影响。3. 运行液相泵前尽量先清洗泵柱塞部件。清洗液一般采用10%甲醇溶液，也有采用10%异丙醇溶液（5%甲醇或异丙醇等有机相溶液能避免微生物污染，但浓度不能太高，高于20%缓冲液可能会导致盐结晶析出，碰到酸碱类物质可能会有比较强烈的反应；另外异丙醇粘度较大，清洗能力较强；也有采用纯水清洗的，这样如果仪器每天使用还行，如果长期不用，为了防止微生物繁殖，纯水还得用含有有机相的清洗液置换出去）冲洗，这是为了保护泵柱塞和密封圈等部件在泵运行时不被结晶盐等磨损而导致泵头漏液。4. 每天运行仪器前先排气。一般的液相色谱仪都有排气功能，没有的可以不接色谱柱开机运行几分钟排气。5. 泵运行时尽量不采用大流量模式（主要是换流动相或排气泡等，流量尽量设为3.0ml/min以内，这样更有利于保护泵柱塞杆和密封圈等部件的寿命）。6. 分析前先对色谱系统（整个流路）进行冲洗及平衡，尤其是色谱柱。先用纯甲醇冲洗30分钟，再换10%甲醇水溶液冲洗30分钟，最后换含缓冲盐或酸碱类物质的流动相平衡30分钟。色谱柱如果长期没用，每一步冲洗、平衡量尽量为色谱柱柱容量20倍以上）。如果流动相中不含缓冲盐或酸碱类物质，纯甲醇冲洗完可直接换为流动相。使用色谱柱前知道或怀疑色谱柱中残留有或酸碱盐类物质，在用纯甲醇冲洗前增加一步10%甲醇水溶液冲洗。7. 如果色谱柱需要控温（升温），要先运行泵后再设柱温箱温度。8. 待仪器运行稳定后（基线基本走平后，这个是经验值），方可进样。样品前处理1.样品浓度不要太大，杂质不要太多，否则色谱柱处理起来压力很大。2.进样前样品一定得先经微膜（一般采用0.22um或0.45um微膜）过滤。实验过程中注意事项1.为了避免进样器残留影响，进样前先对进样器进行清洗（这个不是必须的，但最好是每进一针样品或标准品前都清洗进样器和进样针，当然同一样品也可以不洗，不同样品尽量洗），清洗顺序为纯水、甲醇、流动相。2.每进一针样品后要对系统进行一次冲洗、平衡后再进下一针样品（等度要求不高，梯度要求相对高，主要是冲洗色谱柱中残留的强保留物质）。[s

高效液相色谱具有分离效率高、分析速度快和应用范围广等特点,特别适合于高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的化合物的分离分析。目前高效液相色谱已成为化学、生化、医学、工业、农业、环保、商检和法检等学科领域中重要的分离技术,是分析化学家和生物化学家手中用于解决他们面临的各种实际分析和分离课题必不可少的工具之一。虽然在检测分析中使用了昂贵的、性能优越的高档精密仪器,但是由于在样品的前处理,标准溶液的制备,样品液的测定,分析中的污染,仪器常见故障等等问题上的不注意,而引起大的系统误差,使整个测定分析失败。现就液相色谱分析的应用中样品预处理注意的几个环节,作简要分析,以达到更好的检测效果。1 　样品预处理方法样品预处理应包括进样前的一切操作。除了称重、溶解、稀释等步骤外,样品需要: ①过滤 ②萃取 ③衍生化(柱前衍生) ④液相色谱(低压柱层析) 。这些操作可以是手工进行或实行自动化操作。样品预处理的目的是除去干扰物、增加检测器灵敏度(富集) 、保护色谱柱等。样品预处理同时也是为了避免色谱分离故障,其中样品萃取是关键的一步,要从大量的干扰物中萃取出微量组分难度极大。有些样品经预处理后还不能作进样分析,需进行衍生化处理,使一些无紫外吸收或无荧光的组分,经过衍生化后能用紫外和荧光检测器检测,这样既提高了灵敏度,又改善了分离度(质量变化) 。样品预处理的同时也会带来一些问题,如样品损失、样品被污染、衍生化反映不完全或多种反应物生成等。衍生反应常会影响试验的精确度,或者在整个样品预处理过程中带来误差。用于液相色谱分析的样品溶液必须均匀而无颗粒,有颗粒会损坏进样器并阻塞柱头。处理好的样品在准备上柱前应对准光线摇动,检查样品溶液中有无颗粒。只要看到颗粒、混浊或乳化,就应过滤一下,过滤膜要能截留住015μm 以上的颗粒,样品过滤的过程中可能引起:样品被污染,因过滤吸附降低样品组分的含量,样品溶剂挥发引起误差。萃取的目的是从共溶的样品介质中分离出被分析的组分,或者减少损坏柱的物质(如蛋白质等)和干扰物。一般采用有机溶剂萃取,要求萃取用的溶剂毒性低、挥发性好、杂质少、对待测样品有良好的溶解度且又与水不相混溶。常用的有乙醚、醋酸乙酯、二氯甲烷、氯仿、苯或者两种以上的混合溶剂。萃取后一般可直接进样,有时需要浓缩或吹干浓缩,再用定体积的液体或流动相溶解进样。这样增加了样品浓度,提高了灵敏度,同时避免了溶剂峰对样品峰的干扰。在萃取是要考虑样品分子的溶解能力。除了脂溶性和水溶性组分外,还有用脂溶性的组分制成水溶性的盐。萃取方法如下:111 　水溶性样品(1) 酸性组分及生成的盐萃取方法:有机溶剂萃取杂质后调成酸性,再加有机溶剂萃取或进样,或在N2 流下吹干,用适当的溶剂解后进样。(2) 碱性组分及生成的盐萃取方法:有机溶剂萃取杂质后调成碱性,再加有机溶剂萃取或进样,或在N2 流下吹干,用适当的溶剂溶解后进样。(3) 中性组分萃取方法:有机溶剂萃取杂质后,直接用反相色谱法分析。112 　脂溶性组分萃取方法:有机溶剂萃取或进样,或在N2 流下吹干,用适当的溶剂溶解后进样。2 　分析中的污染一般检测的环境、容器、试剂都是影响测定结果的因素。211 　环境污染仪器室的有害气体、气溶液、灰尘等等都能造成污染,影响检测结果,这种污染很难校正。因此,仪器室与其他实验室应隔离,保持清洁,仪器室内应安装空调,注意防潮、防腐、防震、空[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]气相[/url]对湿度应小于70 %为宜。212 　容器实验室常用的器皿有玻璃类、瓷类、石英类、塑料类等,在进行分析时,应按照待则样品的要求来选则器皿,不管使用哪种器皿,容器的洗条清洁都是很重要的,也是取得好的检测结果的基本保证。213 　试剂在液相色谱分析中,所选用的试剂必须是色谱纯、优级纯或分析纯,如果用含量有杂质的试剂,则会出现杂峰而影响测定结果。3 　标准溶液的配置在配置标准溶液时,先要配置现定浓度的内标溶液,在标准溶液和样品溶液中最好使用同一批次配制的内标溶液以减少误差。(1) 配制标准溶液的物质应当是色谱纯的、性质稳定。(2) 常用的标准溶液应存放在棕色溶液瓶中低温保存。(3) 在配制维生素类标准品时,要放置在棕色容量瓶中或避光放置以免分解。4 　样品预处理过程中的主要故障与解决办法(1) 色谱图中出现无关的峰,原因有可能是样品过滤器带来污染,解决方法如下:①将过滤器浸泡在样品溶剂中并进样试验 ②改变过滤器类型 ③采用交替清洗技术。(2) 一些或全部化合物的峰比预期的小,尤其是低浓度的样品,原因可能是样品过滤器表面吸附下降,解决方法如下:①改变过滤器类型 ②严格按相同条件处理所用样品 ③采用交替清洗技术。(3) 回收率太低或差,原因可能是萃取不完全,解决方法如下:①增加萃取时间,使用热溶剂 ②修改清洗方法。(4) 色谱峰变宽,柱寿命缩短,原因可能是样品带来的干扰与污染,应改进清洗方法。(5) 精度差,原因可能是回收不完全,解决方法如下:①改进或替换衍生化、分离、萃取或其他条件 ②用自动化处理装置提高精度。总之,对分析仪器来说,避免故障的最主要的做法是正确的操作和调节,切忌盲目操作,对核心部位如离子室、微电流放大器等减少震动和碰撞,保证绝缘,并减少各种系统误差要注意以上要点,但还要注意日常的仪器保养,色谱柱子的维护,仪器室保持清洁,这样才能使液相色谱处于最佳工作状态,在分析中发挥其重要的作用。

在液相色谱分析过程中，我们经常遇到的问题主要有二种，一种与液相色谱仪器本身因素有关，如液相色谱的阀门、混合器、检测器的光源以及其它的一些硬件设备。出现这类问题后，如果能找出问题根源，解决起来一般很简单，而且这类问题可以通过对仪器的精心维护来避免;而另一类问题则是分析方法本身造成的问题，如出现色谱峰形状不好、峰与峰之间不能分开、基线飘移等等。不幸的是，如果出现这类问题，看起来似乎很明显，但是要找出原因并解决这类问题却非常困难。为了减少出现这一类型的问题，就必须在分析之前，仔细研究并选择一个好的分析方法，有了一个好的分析方法，就很容易获得理想的分离效果，而且在出现问题是也很便于找出原因。要选择一个好的分析方法，就必须对液相色谱分析的一些基本原则要有一个很深的了解。下面是我们实验室对色谱分析人员进行技能培训的一些基本知识。　　一：分析方法选择的基本原则　　假如你想做一顿丰盛的晚餐，首先必须看一下食谱，然后检查一下你所需的东西是否齐全，如果少了配料还必须去商店购买，这样你才可能做出一顿可口的晚餐。同样进行液相色谱分析时，也必须按照一定的程序进行，首先你必须要有专门的仪器和试剂，然后有目的地选择分析方法，这样你才可能得到好的分析结果，避免走一些弯路。　　二：柱子的选择　　在液相色谱分析方法中最重要的就是色谱柱的选择，色谱分析人员面对几百种色谱柱，你从何入手呢?我采取的方法就是订阅 LCGC亚太版中RonMajors 的“色谱柱观察”这一专栏，自1984（1）年以来，RonMajors在这一专栏中介绍许多新柱子、色谱柱新技术、色谱柱使用方法等方面的信息。　　现在大部分液相色谱分析都是使用反相液相色谱柱，其中以C18 和C8柱最为流行。然而色谱分析并不是流行歌曲，这两种色谱柱之所以运用广泛是因为在大多数情况下，使用这两种柱子都能获得理想的分离效果。尽管一些样品的分离并不是这两种柱子（如表一所示），但 C18和C8经常是最好的固定相，C18和C8柱两者之间并无明显的差别，但在我们实验室中以常使用的是C8柱。　　色谱分析人员遇到的多数样品需要利用反相色谱柱进行分析，但一些样品可能需要其它的分析技术才能成功地分离，这些样品及分离方法在表一中作了简要的叙述，在以后的章节中将进一步阐述。　　表一：样品及分析方法[color=bla

对于液相色谱柱而言，每根色谱柱在装运之前都经过了测试，并存放在测试洗脱液中进行运输。因此，在首次使用时，没有必要用水进行冲洗，只要用流动相彻底地平衡色谱柱即可。如果使用流动相添加剂（如缓冲液或离子对试剂），建议使用含原有比例但不含这些添加剂的流动相进行中间过渡。使用10至20个色谱柱体积进行冲洗将有助于过渡到流动相。对于具有较短化学链（例如C8、苯基、CN）键合相的色谱柱，应小心确保在使用色谱柱之前对其进行彻底的平衡。这样可确保重复性，并有助于防止保留时间的漂移。正相溶剂和反相溶剂是不互溶的，这一点不能忽略。对于新购柱子，首先请注意打开分析测试说明书，了解柱子的保存溶剂。如果保存溶剂与你将要使用的流动相不互溶，请先用异丙醇过渡。过渡过程中注意因异丙醇粘度较大，会导致柱压升高，适当调低流速。如果流动相中含有缓冲盐类，先用不含缓冲盐的同比例流动相过渡，避免缓冲盐的析出。

[color=#444444]有个样品，溶于甲醇中，但是一旦遇水，就会析出，那用甲醇水流动相可以测吗？会不会析出堵柱子呢？[/color]

对于液相色谱柱而言，每根色谱柱在装运之前都经过了测试，并存放在测试洗脱液中进行运输。因此，在首次使用时，没有必要用水进行冲洗，只要用流动相彻底地平衡色谱柱即可。如果使用流动相添加剂（如缓冲液或离子对试剂），建议使用含原有比例但不含这些添加剂的流动相进行中间过渡。使用10至20个色谱柱体积进行冲洗将有助于过渡到流动相。对于具有较短化学链（例如C8、苯基、CN）键合相的色谱柱，应小心确保在使用色谱柱之前对其进行彻底的平衡。这样可确保重复性，并有助于防止保留时间的漂移。 正相溶剂和反相溶剂是不互溶的，这一点不能忽略。对于新购柱子，首先请注意打开分析测试说明书，了解柱子的保存溶剂。如果保存溶剂与你将要使用的流动相不互溶，请先用异丙醇过渡。过渡过程中注意因异丙醇粘度较大，会导致柱压升高，适当调低流速。如果流动相中含有缓冲盐类，先用不含缓冲盐的同比例流动相过渡，避免缓冲盐的析出。

Agilent 1260液相色谱，走盐溶液的通道有絮状物析出，不知道如何处理，各位有什么好办法？

液相色谱分析条件的选择字体: 小 中 大 | 打印 发布: 2010-09-14 14:46:32 来源: 上海禾工科学仪器有限公司 在液相色谱分析过程中，我们经常遇到的问题主要有二种，一种与液相色谱仪器本身因素有关，如液相色谱的阀门、混合器、检测器的光源以及其它的一些硬件设备。出现这类问题后，如果能找出问题根源，解决起来一般很简单，而且这类问题可以通过对仪器的精心维护来避免;而另一类问题则是分析方法本身造成的问题，如出现色谱峰形状不好、峰与峰之间不能分开、基线飘移等等。不幸的是，如果出现这类问题，看起来似乎很明显，但是要找出原因并解决这类问题却非常困难。为了减少出现这一类型的问题，就必须在分析之前，仔细研究并选择一个好的分析方法，有了一个好的分析方法，就很容易获得理想的分离效果，而且在出现问题是也很便于找出原因。要选择一个好的分析方法，就必须对液相色谱分析的一些基本原则要有一个很深的了解。下面是我们实验室对色谱分析人员进行技能培训的一些基本知识。　　一：分析方法选择的基本原则　　假如你想做一顿丰盛的晚餐，首先必须看一下食谱，然后检查一下你所需的东西是否齐全，如果少了配料还必须去商店购买，这样你才可能做出一顿可口的晚餐。同样进行液相色谱分析时，也必须按照一定的程序进行，首先你必须要有专门的仪器和试剂，然后有目的地选择分析方法，这样你才可能得到好的分析结果，避免走一些弯路。　　二：柱子的选择　　在液相色谱分析方法中最重要的就是色谱柱的选择，色谱分析人员面对几百种色谱柱，你从何入手呢?我采取的方法就是订阅 LCGC亚太版中RonMajors 的“色谱柱观察”这一专栏，自1984（1）年以来，RonMajors在这一专栏中介绍许多新柱子、色谱柱新技术、色谱柱使用方法等方面的信息。　　现在大部分液相色谱分析都是使用反相液相色谱柱，其中以C18 和C8柱最为流行。然而色谱分析并不是流行歌曲，这两种色谱柱之所以运用广泛是因为在大多数情况下，使用这两种柱子都能获得理想的分离效果。尽管一些样品的分离并不是这两种柱子（如表一所示），但[font=

[b]液相色谱使用中样品预处理注意的几个环节[/b]　高效液相色谱具有分离效率高、分析速度快和应用范围广等特点,特别适合于高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的化合物的分离分析。目前高效液相色谱已成为化学、生化、医学、工业、农业、环保、商检和法检等学科领域中重要的分离技术,是分析化学家和生物化学家手中用于解决他们面临的各种实际分析和分离课题必不可少的工具之一。虽然在检测分析中使用了昂贵的、性能优越的高档精密仪器,但是由于在样品的前处理,标准溶液的制备,样品液的测定,分析中的污染,仪器常见故障等等问题上的不注意,而引起大的系统误差,使整个测定分析失败。现就液相色谱分析的应用中样品预处理注意的几个环节,作简要分析,以达到更好的检测效果。1 　样品预处理方法样品预处理应包括进样前的一切操作。除了称重、溶解、稀释等步骤外,样品需要: ①过滤 ②萃取 ③衍生化(柱前衍生) ④液相色谱(低压柱层析) 。这些操作可以是手工进行或实行自动化操作。样品预处理的目的是除去干扰物、增加检测器灵敏度(富集) 、保护色谱柱等。样品预处理同时也是为了避免色谱分离故障,其中样品萃取是关键的一步,要从大量的干扰物中萃取出微量组分难度极大。有些样品经预处理后还不能作进样分析,需进行衍生化处理,使一些无紫外吸收或无荧光的组分,经过衍生化后能用紫外和荧光检测器检测,这样既提高了灵敏度,又改善了分离度(质量变化) 。样品预处理的同时也会带来一些问题,如样品损失、样品被污染、衍生化反映不完全或多种反应物生成等。衍生反应常会影响试验的精确度,或者在整个样品预处理过程中带来误差。用于液相色谱分析的样品溶液必须均匀而无颗粒,有颗粒会损坏进样器并阻塞柱头。处理好的样品在准备上柱前应对准光线摇动,检查样品溶液中有无颗粒。只要看到颗粒、混浊或乳化,就应过滤一下,过滤膜要能截留住015μm 以上的颗粒,样品过滤的过程中可能引起:样品被污染,因过滤吸附降低样品组分的含量,样品溶剂挥发引起误差。萃取的目的是从共溶的样品介质中分离出被分析的组分,或者减少损坏柱的物质(如蛋白质等)和干扰物。一般采用有机溶剂萃取,要求萃取用的溶剂毒性低、挥发性好、杂质少、对待测样品有良好的溶解度且又与水不相混溶。常用的有乙醚、醋酸乙酯、二氯甲烷、氯仿、苯或者两种以上的混合溶剂。萃取后一般可直接进样,有时需要浓缩或吹干浓缩,再用定体积的液体或流动相溶解进样。这样增加了样品浓度,提高了灵敏度,同时避免了溶剂峰对样品峰的干扰。在萃取是要考虑样品分子的溶解能力。除了脂溶性和水溶性组分外,还有用脂溶性的组分制成水溶性的盐。萃取方法如下:

高效液相色谱柱的故障分析色谱柱是有使用寿命的。一根正常的商品柱一般可以正常使用2000~5000次进样；保护良好的柱子可达10000次以上，但是有时候即使是一次不当使用就可能使柱子发生严重的损害。柱子受损害后，可表现为柱压升高、柱效下降、峰形异常等现象。 1. 柱压升高 造成柱压升高的可能原因有很多。一般是由于柱床内产生了异常的占位性物体，造成流体阻力加大所引起的。 （1）流动相过滤不良 这往往是由于流动相没有过滤，或者虽然已经过滤但滤膜孔径过大或滤片损坏，使得固体杂质滞留于滤板上所造成的。致使柱的进口滤片处堵塞，压力升高。 （2）霉菌生长 霉菌在流动相中、管路中或柱子进口处繁殖、生长，堵塞滤板，导致压力升高。这种现象在夏天，尤其是使用磷酸盐缓冲液为流动相时更易发生。在夏季使用磷酸盐缓冲液时一般要现配现用。即使保存在冰箱中，一般也不要超过两天。否则，即使不堵塞滤板，也会因细菌或霉菌孳生而产生的代谢物造成对样品的干扰。 （3）非特异性吸附 当溶质在柱子上有较强的非特异性吸附，且当前所用的流动相难以将它们洗脱时，累积的未洗脱溶质也会造成阻力增大和压力升高。 （4）更换流动相时置换不彻底 致使流动相不互溶 （5）盐晶体的析出 更换流动相后，缓冲液在新的流动相体系溶解度低而析出 （6）样品的沉淀 配制样品的溶剂与流动相不一致时，样品进入柱中溶解度可能降低而析出 （7）压力脉冲 运行过程中，有时会产生系统内压力的突然升降。如，转动进样阀时动作过缓，造成液流堵塞再瞬间释放；开机瞬间压差较高等。压力脉冲会造成多孔填料的崩坏和柱床结构的微小变化。填料微屑的长期累积可能会使柱床阻力增大。 2. 柱效下降 柱子在使用过程中分离性能逐步降低是正常现象。但是如果发生突然降低或改变，属于异常现象。此时，应分析原因，有针对的采取措施，避免这种情况发生，或及时进行柱子再生，以求尽可能地恢复其性能。造成柱效下降的原因有很多，但最基本的原因是使用不当，造成填料特性或柱床结构的改变所致。 （1）pH值 流动相的pH值是柱子使用中最需要注意的参数。以硅胶为基质的色谱填料通常仅适于在pH值2~8的范围内使用。过低过高的pH值都会造成填料配基脱落或基质的溶解。有时，仅仅是样品溶液的pH值影响，也会使柱子性能极大地破坏。 （2）非特异性吸附 样品中强极性或具有强非特异性吸附的物质有可能吸附于填料表面，形成非特异性吸附层，改变柱子的表面活性，使分离性能发生变化，并使柱效降低。例如，有些植物色素经常会吸附于柱头，使柱子进口端颜色加深，整体柱效下降；有些蛋白质成分会在柱头变性而沉淀下来。

液相色谱仪的故障问题也存在好几种现象，不同的现象有不同的处理方法：　　　第一、峰面积重复性不佳　　(1)进样阀漏液;(2)加样针不到位。(3)液量不足.处理对于第一种情况更换进样阀垫圈;对于第二种情况保证加样针插到底,注射样品溶液后须快速、平稳地从LOAD状态转换到INJECT状态,以保证进样量的准确。日常工作中,液相色谱仪的保养非常重要,如要注意不要让空气进入输液系统和高压泵中,储液器内的溶液如长时间未用应清洗储液器并更换溶液,每次用完色谱仪后缓冲液要用纯水冲洗干净,防止无机盐析出或沉积;样品的前处理也很重要,任何样品都要尽可能地去除杂质,完全溶解,尽量减少对色谱柱的污染,以延长色谱柱的使用寿命,同时避免注射过浓的样品溶液,以免残留液在进样阀内析出固体引起堵塞;色谱柱作好标记,用于不同分析目的的色谱柱不要混用等。第二、既无压力指示,又无液体流过　　(1)泵密封垫圈磨损;像这种情况,就应该更换密封垫圈;(2)大量气泡进入泵体。而针对这种情况,在泵作用的同时,用一个50ml的玻璃针筒在泵的出口处帮助抽出空气。　　　　第三、压力波动大,流量不稳定　　原因系统中有空气或者单向阀的宝石球和阀座之间夹有异物,使得两者不能密封。处理工作中注意观察流动相的量,保证不锈钢滤器沉入储液器瓶底,避免吸入空气,流动相要充分脱气。如为单向阀和阀座之间夹有异物,拆下单向阀,放入盛有丙酮的烧杯用超声波清洗。　　第四、出峰不佳,峰分叉　　(1)色谱柱被污染;处理这种情况时,先用纯水反向冲洗柱子,然后换成甲醇冲洗,接着用甲醇+异丙醇(4+6)冲洗柱子(冲洗时间的长短由样品污染的情况而定),再换成甲醇冲洗,然后用纯水冲洗,最后甲醇冲洗正向冲洗柱子30分钟以上。如冲洗后依然出峰不佳,则考虑第二种情况。(2)柱头填料塌陷。针对这样的现象，要拧开柱头,检查柱填料是否硬结或塌陷。去除硬结部分(污染的填料),装入新填料,滴一滴甲醇,[/fon

1.液相色谱柱的使用说明：(1)液相色谱柱色谱柱使用前注意事项：液相色谱柱的储存液无特殊说明，均为评价报告所示的流动相。在使用前，一定要注意液相色谱柱的储存液与要分析样品的流动相是否互溶。在反相色谱中，如用高浓度的盐或缓冲液作洗脱剂，应先用10%左右的低浓度的有机相洗脱剂过渡一下，否则缓冲液中的盐在高浓度的有机相中很容易析出，堵塞色谱柱。(2)流动相：流动相中所使用的各种有机溶剂要尽可能使用色谱纯，配流动相的水最好是超纯水或全玻璃器皿的双蒸水。如果将所配得流动相再经过0.45μm 的滤膜过滤一次则更好，尤其是含盐的流动相。另外，装流动相的容器和色谱系统中的在线过滤器等装置应该定期清洗或更换。以常规硅胶为基质的键合相填料通常的pH值适用范围是2.0-8.0。当必须要在pH值适用范围的边界条件下使用色谱柱时，每次使用结束后立即用适合于色谱柱储存并与所使用的流动相互溶的溶剂清洗，并完全置换掉原来所使用的流动相。(3)样品：样品也要尽可能清洁，可选用样品过滤器或样品预处理柱（spe）对样品进行预处理；若样品不便处理，要使用保护柱。在用正相色谱法分析样品时，所有的溶剂和样品应严格脱水。2.色谱柱的保存(1)反相液相色谱柱色谱柱每天实验后的保养：使用缓冲液或含盐的流动相，实验完成后应用10%的甲醇/水冲洗30分钟，洗掉色谱柱中的盐，再用甲醇冲洗30分钟。注意：不能用纯水冲洗柱子，应该在水中加入10%的甲醇，防止将填料冲塌陷。(2)长期保存色谱柱：如色谱柱要长时间保存，必须存于合适的溶剂下。对于反相柱可以储存于纯甲醇或乙腈中，正相柱可以储存于严格脱水后的纯正己烷中，离子交换柱可以储存于水（含防腐剂叠氮化钠或柳硫汞）中，并将购买新色谱柱时附送的堵头堵上。储存的温度最好是室温。3.色谱柱在使用过程中易出现的问题和解决办法色谱柱在使用中最常见的问题就是柱压升高，如果柱压是在长时间使用过程中缓慢增加，属于正常现象。但柱压在使用过程中突然升高（系统管路堵塞及压力传感器故障除外），可能的原因有如下几点：(1)色谱柱头的过滤筛板堵塞或污染；(2)色谱柱头的填料被样品污染；(3)色谱柱内缓冲液中的盐遇到高浓度的甲醇或其他有机溶剂，形成结晶析出；(4)流动相pH值过大或过小使固定相结构破坏或溶解。解决办法如下：(1)如确定是色谱柱头的过滤筛板被污染，可以将色谱柱反方向用甲醇冲洗至正常压力，或者卸下色谱柱头，将其放在10%的稀硝酸内超声清洗10分钟，后再用纯水超声10分钟，重新装入色谱柱。(2)如确定色谱柱头的填料被污染，将柱头螺丝卸下，挖出柱内前段被污染的填料，用相同的柱填料重新填入，仔细修复后，重新安装上柱头螺丝。(3)如确定定是盐结晶，用10%的甲醇/水冲洗色谱柱使柱内盐全部溶解，再换高浓度甲醇。(4)如果因pH值使用不当，很难恢复。【来源：实验与分析】

[align=center]液相色谱常见故障的维护与保养（洗洗更健康）[/align][align=center]西安国联质量检测技术股份有限公司[/align][align=center]食品事业部：牛晓[/align]在当今社会中我们能够接触到的食品种类之多，一般食品基质比较复杂，因此我们在日常检测中用到的精密仪器高效液相色谱仪也就显的格外较弱，在使用过程中稍不注意便发脾气罢工，其最常见的症状便是柱压问题、漂移问题、峰型异常问题，在此情况下你还hold住不？高效液相色谱仪一般由贮液瓶、泵、进样器、色谱柱、柱温箱、检测器、数据处理系统组成，对于整个系统而言，泵、色谱柱、检测器是核心部件，同时也是平常最易出问题的部位。一、柱压问题一般所指的压力稳定并不是指压力稳定于一个恒定值，而是压力波动范围在2Mpa左右，压力过高或过低都属于柱压问题。1、 柱压过高一般是由于流路堵塞或色谱柱在堵塞造成。1）、首先断开色谱柱，如果系统压力超过1.0Mpa则流路堵塞，此时要分段检查。处理办法：A、先打开Purge阀，如果压力没有明显下降，则是过滤头脏了，将过滤头取出用异丙醇超声清洗10min。B、设流速1.0mL/min，系统压力在走纯水时超过0.3Mpa时，则泵流出口的密封垫脏了，拆洗柱塞密封垫、主单向阀密封垫和辅单向阀密封垫均取出用异丙醇超声清洗半小时。2）、其次是如果系统流路压力正常则是色谱柱堵塞，一般将预柱和色谱柱分开，色谱柱用10%甲醇（或10%乙腈）小流速冲洗过夜，预柱用50%甲醇（50%乙腈）大流速冲洗2到3个小时。2、压力过低处理办法：1）、系统漏液，将漏液部分拧紧即可。2）、泵里进了空气，此时一般表现为压力不稳，忽高忽低，打开purge阀，用5.0mL/min的流速进行排气，如果还不行，则要用专用针筒在排气阀出借助外力吸出气泡。3）、由于操作时的大马虎而未关闭参比阀，此时将流速设为小流速后关闭参比阀即可。二、基线问题基线一般在开机后大概要平衡30min，如果用用到缓冲液或缓冲盐之类，还有在低于220nm下平衡时时间要相对较长，如果出现基线漂洗，则可能是以下方面的原因。处理办法：1、 柱温波动，即使很小的温度变化也会引起基线的波动的，通常影响示差检测器、电导检测器、较低灵敏度的紫外检测器或其它光电类检测器，一般要控制好柱温和流动相温度，室温便可避免这类情况的发生。2、 流通池污染或有气体，用甲醇冲洗流通池（断开柱子）。3、 紫外灯能量不足，更换新的紫外灯。4、 流动相污染、变质或由于使用低品质的溶剂，流动相必须现用现配，使用高品质的化学试剂及HPLC级的试剂，对贮液瓶要定期的用异丙醇清洗。三、峰型异常峰型问题是液相的主要问题，我们在操作过程中需要变换不同条件来改善不好的峰型。处理办法：1、 色谱图中未出峰：系统未进样或样品分解；泵未输液或流动相使用不正确；检测器设置不正确；针对以上情况成因最相对应的调整即可。2、 所有峰均为负峰：信号电缆接反或检测器输出极性设置颠倒；光学装置尚未达到平衡。3、 所有峰均为宽峰：系统未达到平衡；溶解样品的溶剂极性比流动相差很多；色谱柱尺寸及类型选择不正确；色谱柱或保护柱被污染或柱效降低；温度变化造成的影响。4、 所有峰比预想的小：样品粘度过大；进样品故障或进样体积误差；检测器设置不正确，定量体积不正确；检测池污染；检测器灯出现问题。5、 出现双肩峰：进样量过大；样品浓度过高；保护住或色谱柱柱头堵塞；保护柱或色谱柱污染或失效；柱塌陷。6、 前伸峰：进样量或样品浓度高（可以减低样品量来解决），溶解样品的溶剂较流动相极性强（使用流动相作为样品溶剂）；保护柱或色谱柱污染或失效（更换色谱柱）；柱温低（升高柱温）。7、 拖尾峰：柱超载，降低样品量；增加柱直径采用较高容量的固定相；峰干扰，对样品进行清洁过滤；调整流动相；柱效下降，更换新的色谱柱。8、 出现平头峰：检测器设置不正确；进样体积太大或样品浓度高9、 出现鬼峰：进样阀残余峰，可能为上次样品的残余，在每次进完样后用充足的时间来平衡和清洗系统；样品中存在未知物，改进样品的前处理；流动相污染，更换流动相（一般要求现用现配）；流路中有小气泡，打开purge阀，加大流速排气。10、峰分叉：保护柱或分析柱污染(取下保护柱再进行分析，如果必要时更换保护住，分析柱堵塞，拆下来清洗)；样品溶剂不溶于流动相改变样品溶剂，如果可能采取流动相作为溶剂。11、峰变形：样品过载，减少进样体积。 以上只是最常见的问题，以我多年的操作经验来看，想要液相好好地工作，就需要我们平时对其做好相对应的维护与保养，常言道：洗洗更健康，做好平时的维护与保养可以为我们长久的使用高效液相色谱仪节省大量的时间，提高工作量，愿大家的老伙计（高效液相色谱仪）能够健康工作。

4. 1　柱的安装与拆卸　色谱柱属易耗品,需要不断更换。高效液相色谱柱的安装是一项经验性很强的工作,在安装之前一定要仔细清洁密封卡套和接头端面,不能残留固体颗粒。要保证管道端面与柱头端面的良好结合,不能留有死体积。接头等组件不要拧的过紧,适当上紧后开机试验,以恰好不泄漏为宜,防止用力过大而导致管道变形或用力不足而发性泄漏,若用力过大锥形卡套已将管道挤压变形,可将管道前端连同卡套切割掉,再用金钢锉小心磨平端面,洗净锉屑和毛刺后重新连接。目前多数在用高效液相色谱仪柱前流路系统为金属材质,柱接头采用固定板手紧固,在紧固螺母时不要一下用力过猛,防止锥形卡套卡死在阴接头内无法取出。为避免这种现象,有些厂家(如安捷伦公司) 已使用有固定接头的PEEK管代替金属管,用手动紧固代替板手紧固,但要特别注意接头尺寸(口径和接口深度)的匹配。大连物化所色谱中心生产的一种通用接头可适用于不同内径的管道,而且采用手动紧固,非常方便。即使不同厂商标示的接头规格相同,也最好使用同一厂家的色谱柱和接头,以确保连接的可靠性。柱后端为低压连接,无论板连接还是手动连接,稍用力即可保证不漏。4. 2　柱污染的处理　常见的柱污染有柱头烧结滤板堵塞、柱头内填料污染和柱内有盐结晶析出。柱污染的常见症状是柱压突然升高及出现鬼峰,简单的处理是选择能溶解污染物的流动相,将色谱柱反接后进行冲洗,冲洗时柱出口端与检测器断开以防污染检测器,冲洗液体积约为20～30 倍色谱柱容积。对于一些保留强的污染物,如脂类可用四氢呋喃、乙腈或甲醇冲洗 蛋白质类可用乙腈、丙醇和1%三氯乙酸进行梯度洗脱 高疏水性化合物可用乙腈或甲醇洗脱。另外,有些文献提出了各种填料色谱柱的再生方法[ 5 ] ,可参照使用。上述方法无效时,可尝试拆洗烧结滤板或挖补柱头处填料的方法处理,但这两种方法都需打开柱头,会破坏柱床的整体均匀性,一般不轻易使用。当确定是柱内盐结晶析出时,可用纯水或低甲醇含量( 5% )的甲醇2水混合液冲洗至基线稳定。4. 3　柱塌陷的处理　色谱柱经一段时间使用后,特别是流动相压力变化过大或酸碱度不当时,会发性柱头塌陷,使峰形异常(分岔) 。其处理方法是打开柱头,拆下烧结滤器,用工具小心刮平柱床端面(可同时除去少量柱头被污染的填料) ,用甲醇与填料混合成均浆液,将均浆液滴在柱头上,靠重力排除甲醇液,直到柱头凹陷处平整,再小心复原柱头。带有柱套的色谱柱柱端烧结滤器是镶嵌在柱端封口塑料塞的内侧,封口塑料塞直接挤压进柱管,在拆卸时,应从侧面用金属薄片插入缝中小心撬开,不可直接用钳子拨出,以防止塑料塞受挤压而变形。不带柱套的色谱柱由螺母直接将分配器和烧结滤片压在柱端,在取下和装上烧结滤片时一定要沿轴向进行,轻轻放入后不可再转动,以免破坏柱床。4. 4　柱的贮存与管理　色谱柱长期不用时,应进行适当的处理后保存。首先应用适合于柱填料的溶剂充分冲洗柱子,极性填料色谱柱可用二氯甲烷冲洗 键合相填料色谱柱用甲醇冲洗 阴离子交换色谱柱用0. 002%洗必泰的缓冲液冲洗 阳离子交换色谱柱用0. 005%硫柳汞缓冲液冲洗 凝胶色谱柱用缓冲液中加0. 02%叠氮化钠或用20%乙醇冲洗,然后用随柱所配的封头螺帽将柱两端密封,以防止柱内溶剂蒸发[ 2 ] 。除了正确的使用外,还应建立严格的管理制度,应给每一根新购色谱柱建立柱档案,包括生产厂家、柱编号、填料类型、购进时间、启用时间、保护液名称等。在色谱柱的使用过程中,也应记录每批样品的柱压、柱效(理论板数) 、每日进样次数等,以便动态的掌握色谱柱的性能变化。有条件的单位最好一根柱子只用于分析某一类结构相似的物质,如化学组成明确的样品与含有未知组分的样品分开,中药样品与西药样品分开,生物合成样品与人工合成样品分开等,这样可避免样品对色谱柱的交叉污染,延长柱使用寿命。对于柱效确已降

液相色谱对样品定量分析，偶尔有一针标样的峰面积不重现液相色谱对样品进行定量分析，在进样的过程中，为什么偶尔会出现一针标样的峰面积不重现呢？

液相色谱工作中和色谱柱有关的故障及解决办法1.保留时间漂移A 温度变化 设定一个恒定的温度，而且当室温较所需温度低时要注意提高柱温的设定值。B 流动相的问题使用预混合则要注意每次配液的准确性、精密度与pH值的变化；流动相被污染或加入添加剂后可能对待测组分存在干扰。流动相的pH值和样品的pK值太接近，即便是使用有缓冲盐的流动相也会引起保留时间的波动，流动相的pH值比待分离组分的pK值至少相差2个pH单位2.异常的色谱峰A 出现一个或几个负峰 流动相吸收本底高；进样过程中进入空气；由于样品中的某个组分的紫外吸收低于流动相的紫外吸收。B 均为负峰信号电缆接反或检测器输出极性设置颠倒；光学装置尚未达到平衡。C 均为宽峰系统未达到平衡；溶解样品的溶剂极性在于流动相极性；色谱柱尺寸及类型选择不正确；色谱柱或保护柱被污染或柱效降低；由于温度变化所产生样品粘度过大；进样器故障或进样体积误差；检测器设置不正确，定量环体积不正确；检测池污染；检测器灯出现故障。D 出现双峰或肩峰进样量或样品浓度过高；溶解样品的溶剂极性较流动相极性强；保护柱或色谱柱污染或失效或堵塞；过滤器堵塞；分析柱“柱头塌陷”。E 拖尾峰检测器设置不正确；进样体积太大或样品浓度太高。较早流出的峰拖尾，柱外效应引起的（检查液相色谱系统的毛细连接、毛细管及检测池）；较晚流出的峰拖尾，待分离化合物和固定相表面非特异性相互作用（在流动相中加入三乙胺或醋酸盐或者选择合适的固定相可以改善）F 出现平头峰出现鬼峰可能为上次样品的残余。在每次进完样后需要用充足的时间来平衡和清洗整个系统；样品中存在未知物，改进样品的预处理；流动相污染，更换新流动相，尽可能做到流动相现配现，隔夜的流动相应放入冰箱储存再次使用时要进行过滤，尽可能使用HPLC级试剂。贴心提示： ①保留时间没有规律的变化说明色谱柱没有充分平衡。随着色谱柱使用时间的增加，保留时间会前移，特别是当流动相的pH值为酸性时（pH≤2）。如果突然发生明显变化，一般由于系统的问题。②以上的问题只是工作中常见的部分问题，如有未提及的问题出现，请咨询您的供应商或厂家技术服务人员。③液相色谱故障排除时不应以问题的表征消失而告终，应该着重于在众多可能的因素中找出问题的根源、每次仅改变一个因素，系统地将问题定位，直至最终筛选出真正产生故障的因素④将换下来的有问题的部件扔掉，以免和其他好的混淆。保留的旧部件请用标签做好标记。⑤实验室应该具有优良的预防性的维护措施合严格周密的记录。对于常规分析，我们应该大致了解一根柱子/预柱可以进样多少针，这样可以将问题发生的频率最小化。

[b]一、液相色谱结构[/b]从液相色谱仪的硬件结构来看，按照流动相经过的顺序有以下组成部分：流动相溶剂瓶→高压泵→进样器→色谱柱→检测器→废液。[b]二、液相色谱维护[/b]1.流动相日常维护溶剂瓶是流动相的起点，通常是盛放水相溶液或是有机相溶液。（1）水相溶液对于水相溶液来说，首要的问题是防止污染。虽然液相用的水大都经过杀菌处理，但是细菌的生命力很顽强，在适当的温度和光照情况下，它们就会活跃起来，如果在流动相里加入磷酸盐一类的添加剂，它们更是如虎添翼。所以，对于溶剂瓶我们要做的非常重要的工作就是勤换流动相，常换常新。（2）有机相溶液对于有机相溶液，可以不用担心细菌繁殖的问题。但是有机相容易发生聚合，特别是乙腈在适宜的光照条件下极易发生聚合，瓶子里就会出现一些絮状的聚合沉淀物。为了防止聚合过程的发生，装乙腈时要用棕色的溶剂瓶，避免阳光直射，更换乙腈时应当弃去瓶底剩余的溶液。（3）清洗过滤溶剂瓶里的过滤头，其作用是为了防止溶液瓶中的颗粒杂质进入到仪器的流路系统中，它的材质通常分为玻璃烧结石英和不锈钢，如果不慎堵塞会造成流动相吸液不畅，因此必须进行清洗，玻璃材质的通常是用稀硝酸泡，而不锈钢材质的可以直接进行超声清洗。（4）流动相的脱气脱气的目的是为了除去流动相中溶解的气体，使色谱泵的输液准确，保留时间和色谱峰面积再现性提高 使基线稳定，信噪比增加，防止气泡引起尖峰，从而提高检测器性能 减少死体积，防止填料氧化，从而保护色谱柱。2.高压泵的保养（1）泵压力波动很多情况下，泵的问题反映在压力上，压力波动又是最常见的一类问题。泵正常的压力波动通常会在2%以内，且平稳规律 不正常的波动通常由气泡和盐造成。如果流动相中的气泡没有被脱气机除掉而到了泵以后，就会造成压力波动，通常我们可以通过重新清洗(purge)流路和再次脱气流动相加以解决。由盐造成的波动主要是因为流动相中加入了浓度较高的缓冲盐，在含盐流动相与有机相混合的时候，盐会有微小的析出，从而导致压力异常波动，解决这类问题可以考虑适当降低盐的浓度，或者使用甲醇取代乙腈有机相。如果一定要用到此类流动相，可以考虑在有机相中加入一定比例的水，然后适当提高梯度结束的终点。（2）过滤白头保养在泵的维护里还有一项常做的工作就是更换清洗阀上的过滤白头，通常判断的标准是纯水以5mL/min流速清洗的时候，如果压力超过1MPa则考虑更换。根据更换下来的过滤白头，可以大致判断仪器的使用状况。如果白头是白色的且不脏，但是堵，那有可能是流动相中有盐析出造成的 如果白头是灰黑色的，这是最常见的状况，是由于泵头密封垫磨损造成的；如果白头是黄色、绿色等怪异的颜色，仪器污染较严重，可能是流动相里的微生物造成的。[b]除此之外，在泵的使用过程中，常会遇到更换流动相的情况，这种更换是指从反相溶剂更换到正相溶剂或者反过来的过程。这个过程要考虑流动相的兼容性，常用的正反相色谱溶剂是不互溶的，所以在更换期间，一定要用异丙醇彻底冲洗系统，保证管路里所有的原有溶剂都被异丙醇替换掉后再更换流动相。[/b]3.进样器的保养(1) 防止交叉污染进样器分手动和自动两大类。自动进样器最常见的问题是交叉污染，交叉污染产生的原因很直接，样品残留在进样针内外表面，并随下一次进样进入色谱系统。要解决交叉污染，主要靠清洗。自动进样器都会有洗针的功能，如果样品浓度较高或者是吸附性比较强，一定要打开此功能；如果未打开洗针功能，污染可能已经残留在了针座或流通阀上，那么这两个部件需及时超声清洗。出现在自动进样器上的另外一个问题是峰面积重现性差，考虑可能与自动进样器吸取样品有关。首先观察样品的液面是不是足够高，以保证进样器可以吸到样品。排除这个问题后，再察看自动进样器的设置，对于一些粘度大的样品，要降低自动进样器的吸取速度。4.色谱柱的保养(1) 色谱柱不能够碰撞、弯曲或强烈振荡。安装时要保证阀件或管路的清洁；(2) 流动相在使用前必须进行脱气处理，尽量不使用或少使用高粘度的流动相；(3) 在满足灵敏度的情况下，尽可能使用小进样量。如果样品比较“脏”，要进行净化或提纯处理；(4) 分析结束后，要清洗进样阀中残留的样品，并用流动相或适当的溶剂清洗色谱柱；(5) 如色谱柱长期不用，应该用适当的有机溶剂保存并封闭或定期给柱子补充合适的流动相。对于反相柱可以储存于纯甲醇或乙腈中，正相柱可以存放于严格脱水后的纯正己烷中，离子交换柱可以储存于水中。5.检测器的保养(1) 光源部分检测器中非常重要的部件是光源，光源对发射能量有要求，一旦能量衰减到一定程度，就会出现基线噪声变大，灵敏度降低等一系列影响使用的问题，因此光源是一个消耗品。通常紫外灯的寿命是2000h，当到达这个时限的时候，我们就要特别关注灯的能量状况，可以通过仪器维护软件中自带的“灯能量测试”功能来判断，测试的结果会分别评估低、中、高三个波长段的能量，一旦某个波长段的测试结果显示失败，就表示需要更换灯。(2) 检测池检测器中另一个重要部件是检测池，也叫流通池。通常大家最关心的一个问题是检测池被堵掉，因为检测池通常不是很耐压，所以一旦被堵就很可能造成损坏。事实上检测池通常不太容易被堵，原因是几乎所有的颗粒杂质都会被色谱柱拦下了，所以堵塞检测器的东西基本都不是来自样品的，很可能是后来“产生”的，比如含盐流动相残留在检测池中导致盐析出。[b]三、知识拓展[/b]1.流动相中气泡的来源（1）液体对于气体都是有一定的溶解度。液体的压力越高，对于气体溶解度越好。（2）溶解气体的液体在振荡和运动过程中，也容易让气泡析出（3）如果你把一升甲醇倒进一生纯水里面，你可以看到大量的气泡出来。所以在不同溶剂混合的时候，也会有气泡析出，而且混合的体积竟然不是两升。（4）综上所述，溶解在液体里面的气体，在环境压力变低、振动和与其它流体混合的时候，都会产生气泡析出。2.目前常用的脱气方法有以下4种(1) 氦气脱气法:利用液体中氦气的溶解度比空气低，连续吹氦脱气，效果较好，但是成本高(2) 加热回流法:效果较好，但操作复杂，且有毒性挥发污染；(3) 真空脱气法(4) 超声脱气法:流动相放在超声波容器中，用超声波振荡10～15min，此方法效果较差，但操作简单。实际工作中，超声脱气法操作简单，仍被广泛应用，虽然此方法有时会引起气体溶解度的增加，但基本上能满足日常分析操作的要求。

液相色谱方法开发时经常会遇到两种情况： 1.在谱图的最末端会起一个高高的峰，但实际里面并不含物质。 2. 物质没有被检测出，溶剂峰后并没有出，改变方法后会出峰。 3. 梯度洗脱时基线出现漂移甚至跳跃？ 这种情况为何出现，如何避免？

液相色谱常见问题问答问：用HPLC进行分析时保留时间有时发生漂移，有时发生快速变化，原因何在?如何解决?答：关于漂移问题：1、仪器使用的环境温度变化大，解决方法是采用柱温箱装置，保持柱温恒定；2、流动相发生变化，解决办法是防止流动相发生蒸发、反应等；3、柱子未平衡好，需对柱子进行更长时间的平衡关于快速变化问题：1、流速发生变化，解决办法是重新设定流速，使之保持稳定；2、泵中有气泡，可通过排气等操作将气泡赶出；3、流动相不合适，解决办法为改换流动相。问：液相色谱中峰出现拖尾或出现双峰的原因是什么?答：1、筛板堵塞或柱失效，解决办法是反向冲洗柱子，替换筛板或更换柱子。2、存在干扰峰，解决办法为使用较长的柱子，改换流动相或更换选择性好的柱子问：HPLC灵敏度不够的主要原因及解决办法?答：1、样品量不足：解决办法为增加样品量；2、样品未从柱子中流出：可根据样品的化学性质改变流动相或柱子；3、样品与检测器不匹配：根据样品化学性质调整波长或改换检测器；4、检测器衰减太多：调整衰减即可；5、检测器时间常数太大：解决办法为降低时间参数；6、检测器流过池窗污染：解决办法为清洗池窗； 7、检测池中有气泡：解决办法为排气；8、流动相流量不合适：调整流速即可.问：做HPLC分析时，柱压不稳定，原因何在?如何解决?答：原因可能有：1、泵内有空气，解决的办法是清除泵内空气，对溶剂进行脱气处理；2、比例阀失效,更换比例阀即可。3、泵密封垫损坏，更换密封垫即可。4、溶剂中的气泡，解决的办法是对溶剂脱气，必要时改变脱气方法；5、系统检漏，找出漏点，密封即可。6、梯度洗脱，这时压力波动是正常的。问：我最近更换了另一种牌号的ODS柱，虽然分离情况仍可以，但保留时间不能重现，为什么?答：这是因为被分析物可能具有形成氢健的能力。尽管过去几年来，填料的制造技术有了极大的提高，但不同的厂商的ODS填料表面硅醇基的浓度不同。正是这些硅醇基可能与样品发生相互作用。因此，同一被分析物中的各组分在不同牌号的ODS柱上的相对保留时间就可能不同。在流动相中加入少量竞争物，如三乙基胺(TEA)，将会使硅醇基的成键能力饱和，从而保证不同牌号柱子上的相对保留时间具有较好的重现性。问：我购买的HPLC柱验收测试时柱压过高，请问为什么?答：柱压过高是HPLC柱用户最常碰到的问题。其原因有多方面，而且常常并不是柱子本身的问题，您可按下面步骤检查问题的起因。1、拆去保护柱，看柱压是否还高，否则是保护柱的问题，若柱压仍高，再检查；2、把色谱柱从仪器上取下，看压力是否下降，否则是管路堵塞，需清洗，若压力下降，再检查。3、将柱子的进出口反过来接在仪器上，用10倍柱体积的流动相冲洗柱子，(此时不要连接检测器，以防固体颗粒进入流动性)。这时，如果柱压仍不下降，再检查；4、更换柱子入口筛板，若柱压下降，说明你的溶剂或样品含有颗粒杂质，正是这些杂质将筛板堵塞引起压力上升。若柱压还高，请与厂商联系。一般情况下，在进样器与保护柱之间接一个在线过滤器便可避免柱压过高的问题，SGE提供的Rheodyne 7315型过滤器就是解决这一问题的最佳选择。

专家好：我用的是岛精双元泵液相色谱，最近泵头漏液，当温度升高时，又不漏，是不是密封圈热涨冷缩的缘故，怎样避免呢。

高效液相色谱仪的维护与保养）输液泵的维护1）试验室常用备件包括垫圈、0环、接头、凸轮、泵头、止回阀和连接件等。活塞和弹簧等不常换。2）腐蚀性溶剂或缓冲液在泵内存放不可过夜，否则溶剂会对泵起腐蚀作用。使用腐蚀性物质后要冲洗，先用水后用甲醇。3）每次更换溶剂都要有记录，若要搁置一段时间，则要记录最后一次所用的溶剂是什么。　　4）避免电机过热，带电机的泵要定期加油。　　5）不要使用挥发性很大的溶剂戊烷、乙醚），。这类溶剂在运行过程中易挥发而使系统产生气流泡。流动相在使用前要脱气，以免产生气泡。　　6）经常检查压力限制开关，检查流速。　　（2）输液泵常见故障及排除方法：　　1）既无压力指示，又无液体流过，可能是泵密封垫圈磨损，需更换，或有大量气泡进入泵体形成空穴，可泵工作的同时，用一个50ml的玻璃针筒在泵出口处抽气泡。　　2）压力波动大，流量不稳定，系统中有空气或单向阀浸入盛有丙酮的烧杯内，用超声波清洗。　　3）压力异常升高输液管被堵塞，如泵垫圈磨耗产生的细屑和缓冲液析出的盐等。多数在细径的管道和经过滤器处发生堵塞，需及时清除异物并彻底洗净。对流路系统中溶剂的置换，应以相混溶的溶剂逐步过渡，例如采取以下方式：缓冲溶液→←蒸馏水→←极性有机溶剂→←有机溶剂。　　4）压力降低：系统有泄漏，如进样阀的接头由于反复拆装使不锈钢垫圈出现刻痕，以致漏液。故凡有接头螺帽处均以拧至不漏液为度，不宜过分拧紧，以免损坏接合处的密封。　　（3）进样阀的维护：进行阀注射孔的导管内端是一个聚四氟乙烯材料做的钵形垫圈（或平垫圈），作用是保证样品液全部注入系统而不外汇。导管不宜审批权得太紧，否则垫圈被挤压过度而封死，无法进样。　　进样阀的通道十分微细，稍有脏物即易堵塞，所以，样品预先处理很重要。样品一定要溶解完全，同时避免注射浓深夜，以免残留液在进样阀内析出结晶引起堵塞，使系统压力异常上升。　　（4）色谱柱日常维护：　　1）每次开机时，流速和柱压要逐渐加强，突增压会使柱庆受到冲击引起紊乱，产生空隙，使柱头凹陷。　　2）在注射样品前要使色谱系统平衡。　　得不严重，可用皮肤是否有冷感加以判断。空气会从漏缝进入系统，引起基线漂移，影响峰高和峰面积的重复性。　　4）不要把柱头拧得太紧，过紧易损坏接头螺纹引起渗漏。拧螺丝时使用的搬手应短些，不宜太长。　　5）不要把柱子放在有气流的地方或直接放在阳光下，气流和阳光都会使柱子产生温度梯度，造成基线漂移。若怀疑基线漂移是由温度梯度造成的，可设法使柱子绝热，例如用恒温炉或恒湿水套使之恒温，也可用布或毛巾把柱子和接头包起来。　　6）若仪器用来作常规分析，可配制一根专用柱，这样有助于延长柱子的寿命。　　7）若所注样品会污染柱子，可用适当的溶剂（几百毫升）慢慢冲柱子过夜。使用再用流动相重新平衡柱子30分钟。　　8）装卸、更换、贮存需挪动柱子时，动作宜轻，不使其受到碰撞，以免柱床因震动而产生空隙或通道。　　9）使用硅胶为基底的柱子，流动相的pH值一般不应＞8或＜2，pH＞8会使硅胶骨架溶解；pH＜2则键合相化学键易剥离。　　（10）色谱柱在使用过程 中，柱压逐步升高，可能有两个原因：①柱子被污染或有固体析出造成流路堵塞，②固定相颗粒被碎或骨架被溶解。解决的办法：①在分析柱前加一根短保洗柱（内径4×50mm），里面的填料应与分析柱相同；②避免使用碱性强的流动相；③如果柱头部分被污染，可将柱头部分变色的固定相刮去，另加一些新的作为补充。　　11）柱要加标签，新旧分开，不要放大温差大的地方。　　（5）检测器的维护：　　常见故障如下：　　1）异常峰和噪音如图10-1所示，对于①、②的异常峰和方形峰以及④的噪声异常增大现象，表示光源灯已到极限，应更换并检查上述现象是否消失。若流动相被污染，也会出现①和②的情况。流动相内混有气泡可出现⑤的现象，气泡去除方法：一面由泵送液。一面用手指紧压流动池出口的连接管，使池内增压，如此反复3~4次，气泡即可冲走。注意不应使流动池压力增加太多，以免破裂。流动池漏液或池出口反压过大，环境温度起落大（如直接有风吹在示差折光检测器上），都可能发生⑥的现象。若流动池出口反压太大，可检查流路是事畅通，或更换内径粗一些的出口连接管。图10-1 异常峰与噪音图（1）异常峰（2）（3）方形峰（4）噪声电平异常增大（5）流动池内有气泡（6）流动池漏液，池出口反压过大及温差大　　2）基线漂移：样品池、参比池被污染，可用溶剂清洗检测池，但所用溶液和原来使用的流动相互溶，或采用溶剂过度的方式。若池子太脏，可用10%HNO3和蒸馏水清洗。另外，色谱柱污染，不断有杂质从柱上洗下，也会引起检测器讯号的噪音和漂移。环境温度变化也会引起漂移。　　3）紫外吸收响应值改变，同一个样品混合物用不同厂家生产的紫外吸收器测定，可得到不同的响应值。这是由于检测器的紫外吸收波长不一样，使每个组份的摩尔吸收度有变化，讯号响应值也发生了变化；有时，即使两个检测器的紫外吸收波长均为254nm，但由于灯源的波长带特性不一样，也会出现不同讯号响应值；改变紫外检测器灵敏度和流动池结构，也会导致组份响应值勤的增加或减小。　　4）紫外吸收响应值出现负峰在测定稀溶液中的痕量组成分时，样品的紫外吸收值低于流动相的相应值而出现负峰，此时应特别注意剂的纯度。