请问:多糖疫苗的鉴定是如何做的?听说需要用到蛋白层析仪的。具体是怎么用呢?
核酸蛋白检测仪是层析分析的主要装置,核酸蛋白检测仪配上层析柱、恒流泵、部分收集器、层析谱分析系统(根据需要选配)和电脑打印设备即构成一套完整的核酸蛋白检测仪分离层析系统。它是当今从事生命科学研究、药物测定、化工、食品科学及医学研究等行业的现代分析实验仪器。核酸蛋白检测仪分析系统广泛用于工业、农业、科研和大专院校的科学研究和教学实验。其原理是根据物质(样品)对紫外光有明显吸收的特征,实现对样品成份含量比对分析,以便进行样品蛋白、核酸物质识别检测和含量测定。在生化分析、环保科学、食品研究、毒理研究、新药开发等领域中对核酸、蛋白检测、纯化和提取提供了一种独特的分析手段。
主要是做反应中间产物的分离和鉴定。把反应体系中的有机物提出来,进行核磁、红外等分析,确定最后的物质结构。需要的量不多,我想也就是几十毫克,顶多100毫克级别的吧。查了下文献,发现可以用半制备色谱,也有用自动层析仪的。由于对这些仪器都没有什么概念,也不知道如何选择。自动层析仪好像也就2-3万左右,我们这有一台闲置的LC100分析性液相色谱,如果要改造成半制备性,可能也要往里投钱。所以想请有经验的能否指导一二。非常感谢!
主要是做反应中间产物的分离和鉴定。把反应体系中的有机物提出来,进行核磁、红外等分析,确定最后的物质结构。需要的量不多,我想也就是几十毫克,顶多100毫克级别的吧。查了下文献,发现可以用半制备色谱,也有用自动层析仪的。由于对这些仪器都没有什么概念,也不知道如何选择。希望这个功能实现,比较方便,不用操作那么麻烦。因为我们的主要核心研究不是 这个有机物提取。我们主要做有机物的质谱分析的。自动层析仪好像也就2-3万左右,我们这有一台闲置的LC100分析性液相色谱,如果要改造成半制备性,可能也要往里投钱。所以想请有经验的能否指导一二。
请问一下,有没有用过国产液相色谱层析仪来纯化蛋白质的?仪器的性能如何?上海沪析好象有,但以前用的是pharmacia的AKTA,不知道国产的能不能用,不敢买,大家给提供一下意见吧
目的要求(1)了解克隆基因表达的方法和意义。(2)了解重组蛋白亲和层析分离纯化的方法。实验原理克隆基因在细胞中表达对理论研究和实验应用都具有重要的意义。通过表达能探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理,同时克隆基因表达出所编码的蛋白质可供作结构与功能的研究。大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统,其表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统,表达的目的蛋白量甚至能超过细菌总蛋白量的80%。本实验中,携带有目标蛋白基因的质粒在大肠杆菌BL21中,在 37℃,IPTG诱导下,超量表达携带有6个连续组氨酸残基的重组氯霉素酰基转移酶蛋白,该蛋白可用一种通过共价偶连的次氨基三乙酸(NTA)使镍离子(Ni2+)固相化的层析介质加以提纯,实为金属熬合亲和层析(MCAC)。蛋白质的纯化程度可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。试剂和器材一、试剂 LB液体培养基:Trytone 10g, yeast extract 5g, NaCl 10g, 用蒸馏水配至1000mL. 氨苄青霉素:100mg/mL 上样缓冲液:100 mM NaH2PO4, 10 mMTris, 8M Urea, 10 mM2-ME, pH8.0 Washing Buffer:100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris, 8 M Urea, pH6.3 Elution Buffer:100 mM NaH2PO4, 10 mMTris, 8M Urea, 500 mM Imidazole, pH8.0 IPTG二、器材摇床,离心机,层析柱(1′10 cm)操作方法一、氯霉素酰基转移酶重组蛋白的诱导1. 接种含有重组氯霉素酰基转移酶蛋白的大肠杆菌BL21菌株于5mL LB液体培养基中(含100ug/mL 氨苄青霉素),37℃震荡培养过夜。2. 转接1mL过夜培养物于100mL(含100ug/mL 氨苄青霉素)LB液体培养基中,37℃震荡培养至OD600 = 0.6 - 0.8。取10ul 样品用于SDS-PAGE 分析。3. 加入IPTG至终浓度0.5 mmol/l, 37℃继续培养1-3h.4. 12,000rpm 离心10 min, 弃上清,菌体沉淀保存于-20℃或-70℃冰箱中。二、氯霉素酰基转移酶重组蛋白的分离、纯化1. NTA层析柱的准备:在层析柱中加入1mL NTA介质,并分别用8mL 去离子水,8mL上样缓冲液洗涤。2. 重组蛋白的变性裂解:在冰浴中冻融菌体沉淀,加入5mL上样缓冲液, 用吸管抽吸重悬,超声波破裂菌体,用振荡器等轻柔的混匀样品60min, 4℃ 12000rpm 离心 30 min, 将上清吸至一个干净的容器中,并弃沉淀。取10ul 上清样品用于SDS-PAGE 分析。3. 上清样品以10-15mL/h 流速上Ni2+-NTA柱,收集流出液,取10ul样品用于SDS-PAGE 分析。4. 洗脱杂蛋白:用Washing Buffer以10-15mL/h流速洗柱,直至OD280 = 0.01.分步收集洗脱液,约3-4h,取10ul洗脱开始时的样品用于SDS-PAGE 分析。5. 洗脱目标蛋白:用Elution Buffer洗柱,收集每1 mL 级分,分别取10ul样品用于SDS-PAGE 分析。
[font=宋体][font=宋体]亲和层析是应用生物高分子与配基可逆结合的原理,将配基通过共价键牢固结合于载体上而制得的层析系统。这种可逆结合的作用主要是靠生物高分子对它的配基的空间结构的识别。常用的生物亲和关系有酶[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]底物、底物类似物、抑制剂、激活剂、辅因子,抗体[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]抗原,激素[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]受体蛋白、载体蛋白,外源凝集素[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]多糖、糖蛋白、细胞表面受体,核酸[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]互补核苷酸序列、组蛋白、核酸结合蛋白等,具有高效、简单、快速的优点,是当前最为理想的分离纯化蛋白的方法。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]亲和层析纯化步骤:[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1[/font][font=宋体]、捕获阶段[/font][/font][font=宋体]在样品捕获阶段,通过将速度和容量进行优化组合,使样品中的目标产物被有效的分离、浓缩和稳定化处理。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]捕获阶段一般选择亲和层析,离子交换层析或者疏水层析,通过吸附作用使样品和杂质实现分离。如果样品带有标签,第一步可以选择标签蛋白亲和层析;如果样品不带有标签,可以考虑使用离子交换[/font][font=Calibri]/[/font][font=宋体]疏水层析。由于捕获阶段一般样品量较大,杂质较多,所以捕获阶段分辨率不是特别主要考虑的因素,可以主要考虑增加上样量和速度。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]、中度纯化阶段[/font][/font][font=宋体]在中度纯化阶段,应将注意力集中于将目标样品和大多数大体积的杂质分开。在中度纯化阶段,速度不是最重要的因素,因为经过捕获阶段样品体积会缩减。中度纯化阶段一般建议使用离子交换层析或者疏水层析进一步提高样品的纯度。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]3[/font][font=宋体]、精细纯化阶段[/font][/font][font=宋体]在精细纯化阶段,关注的重点就是如何达到高分辨率,从而完成最终的纯化。在此前的步骤中已经去除了大部分的污染物和杂质。如果需要达到较高的分辨率,可能会在此步骤造成一些回收率的损失。精细纯化阶段一般建议使用高分辨率的分子筛或者高分辨率的离子交换层析柱。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]亲和层析纯化优缺点:[/b][/font][font=宋体][font=Calibri]1. [/font][font=宋体]亲和层析法是分离蛋白质的一种极为有效的方法,它经常只需经过一步处理即可使某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出来,而且纯度很高。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]2. [/font][font=宋体]是最有效的生物活性物质纯化方法,它对生物分子选择性的吸附和分离,可以取得很高的纯化倍数。此外蛋白在纯化过程中得到浓缩,结合到亲和配基后,性质更加 稳定,其结果提高了活性回收率。此外它可以减少纯化步骤,缩短纯化时间,对不稳定蛋白的纯化十分有利。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]3. [/font][font=宋体]除特异性的吸附外,仍然会因分子的错误认别和分子间非选择性的作用力而吸附一些杂蛋白质,另洗脱过程中的配体不可避免的脱落进入分离体系。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]4. [/font][font=宋体]载体较昂贵,机械强度低,配基制备困难,有的配基本身要经过分离纯化,配基与载体耦联条件激烈等。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]更多详情可以参看义翘神州[url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-by-ac][b]亲和层析纯化蛋白[/b][/url]:[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-by-ac[/font][/font]
[font=宋体]蛋白纯化介质主要应用于研究目的蛋白的结构、功用以及相互作用的和过程中。比如:在蛋白纯化过程中,由于[url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-by-ac][b]亲和层析法[/b][/url]的选择性和结合力较强,分辨率也高。所以,亲和层析法是一种常用的蛋白、抗体纯化方法,天地人和生物多种简单易用的亲和纯化介质,适用于批量或利用重力进行纯化,可以高效、便捷、可靠地从品中分离蛋白和抗体,为下游应用提供有力保证。[/font][font=宋体][b]亲和层析法的原理:[/b][/font][font=宋体][font=宋体]亲和层析是应用生物高分子与配基可逆结合的原理,将配基通过共价键牢固结合于载体上而制得的层析系统。这种可逆结合的作用主要是靠生物高分子对它的配基的空间结构的识别。常用的生物亲和关系有酶[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]底物、底物类似物、抑制剂、激活剂、辅因子,抗体[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]抗原,激素[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]受体蛋白、载体蛋白,外源凝集素[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]多糖、糖蛋白、细胞表面受体,核酸[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]互补核苷酸序列、组蛋白、核酸结合蛋白等,具有高效、简单、快速的优点,是当前最为理想的分离纯化蛋白的方法。[/font][/font][b][font=宋体][font=宋体]亲和层析的操作步骤[/font][font=Calibri]:[/font][/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]在亲和层析中,蛋白在影响蛋白[/font][font=Calibri]([/font][font=宋体]或标签[/font][font=Calibri])[/font][font=宋体]与其配体之间结合的条件下被加载到柱子上。在不破坏特定相互作用但能破坏污染蛋白与固定相之间任何非特异性相互作用的条件下洗涤结合的蛋白。然后用含有竞争性分子的缓冲液或破坏所有蛋白[/font][font=Calibri]/[/font][font=宋体]蛋白相互作用的条件洗脱结合的蛋白。竞争分子与配体结合,取代目标蛋白,这种竞争分子通常通过另一种色谱流程或透析法从目标蛋白中去除。[/font][/font][font=宋体] [/font][table][tr][td][b][font=微软雅黑][color=#232323]亲和层析配体和洗脱条件[/color][/font][/b][/td][td][font=微软雅黑] [/font][/td][td][font=微软雅黑] [/font][/td][/tr][tr][td][b][font=微软雅黑][color=#232323]需纯化的蛋白[/color][/font][/b][/td][td][b][font=微软雅黑][color=#232323]配体[/color][/font][/b][/td][td][b][font=微软雅黑][color=#232323]洗脱条件[/color][/font][/b][/td][/tr][tr][td][font=微软雅黑][color=#232323]抗体(抗原特异性)[/color][/font][/td][td][font=微软雅黑][color=#232323]抗原肽[/color][/font][/td][td][font=微软雅黑][color=#232323]游离肽[/color][/font][/td][/tr][tr][td][font=微软雅黑][color=#232323]多聚组氨酸标签蛋白[/color][/font][/td][td][font=微软雅黑][color=#232323]Ni2+或Co2+[/color][/font][/td][td][font=微软雅黑][color=#232323]咪唑或游离组氨酸[/color][/font][/td][/tr][tr][td][font=微软雅黑][color=#232323]FLAG标签蛋白[/color][/font][/td][td][font=微软雅黑][color=#232323]FLAG特异性抗体[/color][/font][/td][td][font=微软雅黑][color=#232323]FLAG肽或低pH值[/color][/font][/td][/tr][tr][td][font=微软雅黑][color=#232323]GST标签蛋白[/color][/font][/td][td][font=微软雅黑][color=#232323]还原型谷胱甘肽[/color][/font][/td][td][font=微软雅黑][color=#232323]游离谷胱甘肽[/color][/font][/td][/tr][tr][td][font=微软雅黑][color=#232323]Myc标签蛋白[/color][/font][/td][td][font=微软雅黑][color=#232323]Myc特异性抗体[/color][/font][/td][td][font=微软雅黑][color=#232323][font=微软雅黑]低[/font][font=微软雅黑]pH[/font][/color][/font][/td][/tr][tr][td][font=微软雅黑][color=#232323]抗体(类特异性)[/color][/font][/td][td][font=微软雅黑][color=#232323][font=微软雅黑]蛋白[/font][font=微软雅黑]A、G和L或精蛋白[/font][/color][/font][/td][td][font=微软雅黑][color=#232323]pH极端值[/color][/font][/td][/tr][tr][td][font=微软雅黑][color=#232323]DNA结合蛋白[/color][/font][/td][td][font=微软雅黑][color=#232323]肝素[/color][/font][/td][td][font=微软雅黑][color=#232323]高离子强度[/color][/font][/td][/tr][/table][font=宋体][font=宋体]更多详情可以关注:[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-by-ac[/font][/font]
[font=宋体][font=宋体]离子交换层析[/font][font=Calibri](IEX)[/font][font=宋体]是一种主要基于蛋白净电荷的色谱分离方法,通常用于追踪脱酰胺和琥珀酰亚胺的形成。[/font][font=Calibri]IEX[/font][font=宋体]有两种类型:阳离子交换和阴离子交换层析法。当缓冲液[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值高于此[/font][font=Calibri]IP[/font][font=宋体]时,蛋白带负电(阴离子);当[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值低于此[/font][font=Calibri]IP[/font][font=宋体]时,蛋白带正电(阳离子)。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]所有蛋白都表现出净电荷,这取决于蛋白氨基酸组成和任何共价连接的修饰。蛋白净电荷受溶解它的溶剂[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]所影响,因为溶剂会与蛋白进行氢离子交换。通常情况下,蛋白与[/font][font=Calibri]IEX[/font][font=宋体]的结合必须通过反复试验来确定,使用一系列[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值的溶剂以确定蛋白保留的最佳[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]。通常溶剂的[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值与[/font][font=Calibri]pI[/font][font=宋体]相差约一个[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]单位就足以实现蛋白结合。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]离子交换层析优缺点介绍:[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]离子交换层析法是一种常用的分离分析技术,具有分离效率高、操作简单、可靠性高、灵敏度高等优点。其优点如下:[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]分离效率高:离子交换层析法可以快速、有效地分离各种生物分子和配体,对于复杂的生物样品可以获得较高的分离效果。[/font][font=宋体]操作简单:离子交换层析法的操作相对简单,不需要过多的手动操作,可以自动化进行,减少了人为误差。[/font][font=宋体]可靠性高:离子交换层析法的分离过程相对稳定,分离结果重现性好,可以用于大规模的分离分析。[/font][font=宋体]灵敏度高等优点:离子交换层析法对于低浓度的样品也能够获得较好的分离效果,对于痕量物质的分离和鉴定具有重要意义。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体]但是,离子交换层析法也存在一些缺点:[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]生产率低:离子交换层析法的生产率相对较低,对于大规模的分离分析可能不太适合。[/font][font=宋体]需要使用大量的缓冲液和洗脱液:离子交换层析法需要使用大量的缓冲液和洗脱液,对于环境保护有一定的影响。[/font][font=宋体]对样品条件要求严格:离子交换层析法对于样品的条件要求比较严格,对于不同性质的样品需要使用不同的离子交换剂和分离条件。[/font][font=宋体]总的来说,离子交换层析法是一种有效的分离分析方法,但是也存在一些缺点,需要根据具体的实验条件和要求进行选择和使用。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]更多关于[url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/chromatography-purification]蛋白层析纯化[/url]详情可以关注:[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/chromatography-purification[/font][/font]
[font=宋体]在生物科学领域,蛋白质纯化是一项关键的技术,它对于研究生物分子的结构和功能至关重要。凝胶过滤层析是一种常用的蛋白质纯化技术,它具有分辨率高、分离效果好的优点。本文将介绍用凝胶过滤层析进行蛋白纯化的流程,包括实验准备、样品处理、层析柱的制作和上样、洗脱和收集等步骤。通过学习本文,读者可以了解凝胶过滤层析在蛋白纯化中的应用及其优缺点,为后续的实验和研究提供参考。[/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]用凝胶过滤层析进行蛋白纯化的流程,主要分为以下步骤:[/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体]准备凝胶柱:选择适当的凝胶材料和柱子,根据待纯化蛋白的分子大小选择合适的孔径。[/font][font=宋体]杂质去除:使用缓冲液预先洗脱凝胶,去除其中的杂质和阻塞物。[/font][font=宋体]样品加载:将待纯化的蛋白溶液加载到凝胶柱中,注意保持柱子的垂直姿势,防止样品泄漏。[/font][font=宋体]洗脱:使用缓冲液进行洗脱,以去除非目标蛋白和杂质。[/font][font=宋体]收集纯化蛋白:收集洗脱液,进行后续的分析或使用。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]以上步骤只是粗略的概述,实际操作时还需要注意许多细节和技巧。例如,选择合适的凝胶类型和柱子对纯化效果有很大影响;样品加载时需要防止样品泄漏;洗脱时需要选择合适的缓冲液等。因此,建议在进行实验前仔细阅读相关文献和资料,并请教有经验的实验人员。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][font=宋体]凝胶过滤层析([/font][font=Calibri]Gel Permeation Chromatography[/font][font=宋体],[/font][font=Calibri]GPC[/font][font=宋体])具有以下优点:[/font][/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]①操作条件温和:[/font][font=Calibri]GPC[/font][font=宋体]不需要使用有机溶剂等强烈的条件,因此对样品的活性影响较小。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]②高分离效果:[/font][font=Calibri]GPC[/font][font=宋体]可以分离不同分子量的蛋白质,且分辨率较高,能够实现样品的较纯分离。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]③重复性好:[/font][font=Calibri]GPC[/font][font=宋体]的层析柱可以重复使用,分离效果稳定,有利于提高实验的可重复性和数据可靠性。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]④适用范围广:[/font][font=Calibri]GPC[/font][font=宋体]可用于各种生化物质,如肽类、激素、蛋白质、多糖、核酸等的分离纯化、脱盐、浓缩以及分析测定等。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]在应用方面,[/font][font=Calibri]GPC[/font][font=宋体]被广泛应用于蛋白质和其他生物分子的分离纯化。例如,从混合物中分离纯化蛋白质、去除蛋白质中的盐和缓冲剂、脱去多糖和脂质等杂质、对蛋白质进行分子量测定等。此外,[/font][font=Calibri]GPC[/font][font=宋体]还可以用于分离合成多肽和基因克隆产物的纯度鉴定等。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]总之,凝胶过滤层析具有温和的操作条件、高分离效果、重复性好等优点,被广泛应用于蛋白质和其他生物分子的分离纯化。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]详情可以关注:义翘神州[url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/chromatography-purification][b]蛋白层析纯化[/b][/url][/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/chromatography-purification[/font][/font]
[font=宋体]层析法无疑是下游处理中主要和常用的操作,因为层析法相比其他单元操作具有某些优势。例如层析法支持高分辨率的效率,可以分离分子性质非常相似的复杂粗制混合物。此外,层析法是生物工艺中遇到的稀释溶液中捕获分子的理想选择。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]柱色谱法[/font][font=Calibri]([/font][font=宋体]层析法[/font][font=Calibri])[/font][font=宋体]的原理是将一个大的蛋白池分离成许多小的蛋白池,其中一些富集了目标蛋白。虽然柱色谱法有昂贵的专业设备,但只需要基本的设备就可以了。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体]在所有色谱技术中,亲和层析法占主要地位。事实上,亲和层析是最特异、最有效的蛋白纯化技术,为靶蛋白纯化提供了合理的依据。它利用了生物分子识别的原理,即生物活性大分子与亲和配体形成特定的可逆复合物的能力。随着高价值蛋白的传统纯化方案被基于亲和色谱等先进的方法所取代,人们的关注重点转向了设计和选择具有高亲和力和特异性的配体。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]从用于生化表征的浓缩蛋白提取物的制备到治疗性重组蛋白的大规模生产,任何纯化过程都需要经济且足量地获得纯化蛋白。因此,下游处理面临的挑战是高产能、高分辨率和高成本效率。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]亲和层析法适用于基于高特异性相互作用的生化混合物的分离。在纯化过程中可以利用具有明确特性的靶蛋白。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-by-iec][b]离子交换层析法[/b][/url]是一种常见的蛋白纯化方法,该方法基于与离子交换器的亲和力分离离子和极性分子。可溶性分子在通过色谱柱时与带相反电荷的不溶性固定相结合。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]尺寸排阻色谱法,根据分子的大小和分子量分离分子。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]疏水作用层析分离表面有疏水氨基酸侧链的靶蛋白,与疏水基团相互作用并结合在一起。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]蛋白纯化的原理为:不同蛋白质的氨基酸序列及空间结构不同,导致其在物理、化学、生物学等性质上存在差异,利用待分离蛋白质与其它蛋白质性质上的差异,即可以设计出一套合理的蛋白纯化方案。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]蛋白的纯化大致分为粗分离阶段和精细纯化阶段两个阶段。粗分离阶段主要将目的蛋白和其他细胞成分如[/font][font=Calibri]RNA[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]等分开,常用的方法为硫酸铵沉淀法。精细纯化阶段的目的是把目的蛋白与其他大小及理化性质接近的蛋白区分开来,[b]常用的方法有:凝胶过滤层析、离子交换层析、疏水层析、亲和层析等。[/b][/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]凝胶过滤层析[/b][/font][font=宋体]凝胶过滤(也叫排阻层析或分子筛)是一种根据分子大小从混合物中分离蛋白质的方法。不同蛋白的形状及分子大小存在差异,在混合物通过含有填充颗粒的凝胶过滤层析柱时,由于各种蛋白的分子大小不同,扩散进入特定大小孔径颗粒内的能力也各异,大的蛋白分子会被先洗脱出来,分子越小,越晚洗脱,从而达到分离蛋白的目的。一般来说,凝胶过滤层析柱越细、越长纯化的效果越好。凝胶过滤层析详细介绍[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]凝胶过滤层析所能纯化的蛋白分子量范围很宽,纯化过程中也不需要能引起蛋白变性的有机溶剂。缺点是所用树脂有轻度的亲水性,电荷密度较高的蛋白容易吸附在上面,不适宜纯化电荷密度较高的蛋白。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]离子交换层析[/b][/font][font=宋体][font=宋体]离子交换层析是一种依据蛋白表面所带电荷量不同进行蛋白分离纯化的技术。蛋白表面通常会带有一定的电荷,电荷的氨基酸残基均匀地分布在蛋白质的表面,在一定条件下可以与阳离子交换柱或阴离子交换柱结合。这种带电分子与固定相之间的结合作用是可逆的,在改变[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]或者用逐渐增加离子强度的缓冲液洗脱时,离子交换剂上结合的物质可与洗脱液中的离子发生交换而被洗脱到溶液中。由于不同物质的电荷不同,其与离子交换剂的结合能力也不同,所以被洗脱到溶液中的顺序也不同,从而达到分离的效果。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]亲和层析[/b][/font][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-by-ac][b]亲和层析纯化[/b][/url]是利用生物大分子物质具有与某些相应的分子专一性可逆结合的特性进行蛋白纯化的技术。该方法适用于从成分复杂且杂质含量远大于目标物的混合中提纯目标物,具有分离效果好、分离条件温和、结合效率高、分离速度快的优点。亲和层析技术可以利用配基与生物分子间的特异性吸附来分离蛋白,也可以在蛋白上加入标签,利用标签与配基之间的特异性结合来纯化蛋白。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]疏水作用层析[/b][/font][font=宋体][font=宋体]疏水作用层析是利用盐[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]水体系中样品分子的疏水基团和层析介质的疏水配基之间疏水力的不同而进行分离的一种层析方法。该法利用了蛋白的疏水性,蛋白经变性处理或处于高盐环境下疏水残基会暴露于蛋白表面,不同蛋白疏水残基与固定相的疏水性配体之间的作用强弱不同,依次用从高至低离子强度洗脱液可将疏水用作由弱至强的组分分离。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]更多详情可以关注:[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/chromatography-purification[/font][/font]
希望大家能给点儿关于硅胶柱层析方面的知识及自动液相层析仪的使用方法,谢谢~~
计划购买一台中压层析仪,不知道哪些牌子的好点,主要做天然药物分离
ZHD型紫外蛋白核酸检测仪使用说明 一、系统简介 蛋白核酸检测仪是层析分析的主要装置,配上层析柱、恒流泵、部分收集器(根据需要选配)和电脑打印设备即构成一套完整的液相色谱分离系统。它是当今从事生命科学研究、药物测定、化工、食品科学及医学研究等行业的现代分析实验仪器。广泛用于工业、农业、科研和大专院校的科学研究和教学实验。其原理是根据物质(样品)对紫外光有明显吸收的特征,实现对样品成份含量比对分析,以便进行样品蛋白、核酸物质识别检测和含量测定。然而,目前国内生产的蛋白检测仪虽然种类繁多,但均采用记录仪描谱且预热时间较长。 ZHD型紫外蛋白核酸检测仪的研制成功,为科研和实验人员利用电脑系统实现核酸蛋白检测和分析提供了一种先进的手段,其特点是系统稳定、操作简便、电脑显示谱图、数据分析和打印谱图。 二、系统特点 本系列检测仪有别于其他检测仪,主要有以下特点: 1、预热时间短,一般做实验只要预热10分钟左右。 2、稳定性高,预热后每小时漂移一般小于0.001。 3、操作简洁,开机后仪器自动调整透光率(T)到100%,吸光度(A)调整到0.000。 4、透光率(T)和吸光度(A)对应准确,点两者误差小于1%。 5、双数据显示,仪器适时显示吸光度(A)和透光率(T)。 6、仪器带有电脑接口和记录仪接口(吸光度0—200mv)。 7、工作软件提供谱图采集、分析计算、保存、打印等功能,可将谱图插入文档(word)文件中。 8、一台电脑可配多台检测仪(由电脑有效端口数决定)。 三、 技术性能 1、通过测量选择菜单,在电脑屏幕上可描出吸光度(A)谱图,透过率(T%)谱图以及A-T%谱图。 2、通过图形平移、复读伸缩和压缩选择等菜单,可对谱图并进行幅度、宽度调整和谱图参数计算,预览满意后打印输出。 3、在描谱过程中,电脑会自动将图形左移(也可人工调整),电脑描谱最长时间为20小时。 4、采集数据自动保存。 四、主要参数: 1、波长:254nm,280nm(可根据用户需要调配)。 2、样品池100ul,光程3mm。 3、量程:吸光度(A):0--2.000 透光率(T):1%—100%。 4、分辩率:吸光度(A):0.001 透光率(T):0.1%。 5、电脑分析参数:峰高、峰宽、峰面积、峰面积比、保留时间、面积含量(归一化)、层析柱分辩率等。 6、电源220V±10%,50HZ。 7、主机重量:约3.5Kg。 五、系统安装与操作步骤 1、将仪器背板上的输出端通过一根串行口连接电缆与电脑主机的COM1或COM2串行口相连。 2、打开紫外蛋白核酸检测仪电源,仪器预热10分钟左右。 3、打开电脑后,将应用软件(ZHD.exe)复制到硬盘上。钦一下仪器面板上的复位按钮,待仪器显示0.000A和100%T后,双击ZHD.exe启动应用软件,系统进入采集(分析)状态。 4、在“测量选择”菜单下,用鼠标选择检测项目。 5、在“检测操作”菜单下点击“测量开始”,电脑开始采集。 6、要停止采集,点击“检测操作”下的“测量结束”菜单,然后关闭紫外蛋白酸检检测仪。 六、层析普工作站软件使用 1、 对硬件的基本要求: a、电脑在简体中文Windowsxp操作系统上运行; b、显示器分辩率为1024*768,小字体,256色配置; c、图形打印机; d、电脑系统必须正常工作,并保证串行口(COM2或COM1)有效; 2、系统连接无误后先让检测仪工作,再执行应用软件ZHD.exe; 3、 点击文件操作菜单下的“打开谱图”,出现文件操作对话框,打开随机盘上的数据文件(.ran),图形被打开,熟悉菜单操作。菜单介绍如下: a、“文件操作”菜单下有打开谱图、保存谱图、打印谱图、打印预览等; b、“检测操作”菜单下有测量开始、测量结束(测量结束后,系统在应用程序目录下生成“文件名.TXT”文件,此格式文件可在Excel软件中打开,并可转贴到Word文档中使用); c、“灵敏度选择”菜单下有A、T%、A-T%选项; d、“谱图平移”菜单后有向左慢移动 []和向右快移动[]; e、“谱图重绘”菜单:从起始点描谱;清理屏幕;释放压缩; f、“谱图全貌”菜单:在屏幕上观察全部谱图。 g、“参数选择”菜单:可对谱图进行参数分析计算。方法如下:在吸光度状态下,点击鼠标左键选取基线及时间范围(第一次点击选取第一点,第二次点击选取第二点),点击“选择参数”下拉菜单的峰高、标准差、半峰宽、峰底宽、峰面积、峰面积比、面积含量及保留时间等参数进行计算,还可间接计算出层析柱分辨率;双击鼠标左键,即可取消本次计算。 h、在吸光度(A)或透光率(T%)状态下,单击鼠标右键,屏幕显示该鼠标点的数值;双击鼠标右健,擦除屏幕显示数值。 七、注意事项: a、 更改波长方法:打开样品池挡板后,可见到滤光片的燕尾型支架和印字(245或280代表当前所使用的波长),用手将其轻轻抽出,换向后插入原位,再将样品池挡板装上,拧紧固定螺钉即可。 b、 在检测仪和电脑正常工作后才能运行应用软件; c、 应用软件执行后,十秒钟后不出现采集分析界面,说明电脑未收到数据,需检查系统连接是否正常; d、 在A—T%描谱过程中,开始1小时内,T%谱以实蓝线表示;1小时后(或点击“图形重绘” ),已描过的T%谱会以虚蓝线表示; e、 测量开始后(特别是出峰以后)不要按复位按钮。 f、 要停止采集,请点击“测量结束”后,先点击“EXIT”,再关闭检测仪。 g、 开始测量时,屏幕会弹出保存文件对话框,要求输入数据文件名及存放路径;之后,电脑自动保存数据。 I、基线选取要保证基线与所选峰必须要有两个焦点,并与其他峰无焦点。
一、实验目的1. 了解凝胶层析的原理及其应用。2. 通过测定蛋白质分子量的训练,初步掌握凝胶层析技术。二、实验原理凝胶层析又称排阻层析,凝胶过滤,渗透层析或分子筛层析等。它广泛地应用于分离、提纯、浓缩生物大分子及脱盐、去热源等,而测定蛋白质的分子量也是它的重要应用之一。凝胶是一种具有立体网状结构且呈多孔的不溶性珠状颗粒物质。用它来分离物质,主要是根据多孔凝胶对不同半径的蛋白质分子(近于球形)具有不同的排阻效应实现的。亦即它是根据分子大小这一物理性质进行分离纯化的。分离原理参见“理论部分的凝胶层析一节”。对于某种型号的凝胶,一些大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全被排阻在外,只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外;而一些小分子不被排阻,可自由扩散,渗透进入凝胶内部的筛孔,尔后又被流出的洗脱液带走。分子越小,进入凝胶内部越深,所走的路程越多,故小分子最后流出柱外,而大分子先从柱中流出。一些中等大小的分子介于大分子与小分子之间,只能进入一部分凝胶较大的孔隙,亦即部分排阻,因此这些分子从柱中流出的顺序也介于大、小分子之间。这样样品经过凝胶层析后,分子便按照从大到小的顺序依次流出,达到分离的目的。凝胶层析分离原理示意动画。对于任何一种被分离的化合物在凝胶层析柱中被排阻的范围均在0~100%之间,其被排阻的程度可以用有效分配系数Kav(分离化合物在内水和外水体积中的比例关系)表示,Kav值的大小和凝胶柱床的总体积(Vt)、外水体积(V0)以及分离物本身的洗脱体积(Ve)有关:Kav = (Ve-V0)/(Vt-V0) ----------- (1)在限定的层析条件下,Vt和V0都是恒定值,而Ve是随着分离物分子量的变化而改变。分子量大,Ve值小,Kav值也小。反之,分子量小Ve值大,Kav值大。有关凝胶层析柱中凝胶自身(基质)体积(Vg)、外水体积(V0)、内水体积(Vi)及柱床总体积(Vt)的参见示意图。凝胶层析柱中的几种层析峰。有效分配系数Kav是判断分离效果的一个重要参数,同时也是测定蛋白质分子量的一个依据。在相同层析条件下,被分离物质Kav值差异越大,分离效果越好。反之,分离效果差或根本不能分开。在实际的实验中,我们可以实测出Vt、V0及Ve的值,从而计算出Kav的大小。对于某一特定型号的凝胶,在一定的分子量范围内,Kav与logMw (Mw表示物质的分子量) 成线性关系:Kav =-b logMw + C --------- (2)其中 b,C为常数。同样可以得到:Ve =-b'logMw + C' --------- (3)其中 b', C'为常数。即 Ve 与 logMw 也成线性关系。我们可以通过在一凝胶柱上分离多种已知分子量的蛋白质后,并根据上述的线性关系绘出标准曲线,然后用同一凝胶柱测出其它未知蛋白的分子量。三、器材与试剂(一)器材1. 玻璃层析柱((20mm×60cm)2. 恒流泵(或下口恒压贮液瓶)3. 自动部分收集器4. 紫外分光光度计5. 100ml试剂瓶6. 1000ml量筒7. 250ml烧杯8. 50ml、100ml烧杯9. 10ml(或5ml)刻度试管(二)试剂1. 标准蛋白(1)牛血清白蛋白:Mw=67,000(上海生化所)(2)鸡卵清清蛋白:Mw=45,000(美国SIGMA公司)(3)胰凝乳蛋白酶原A:Mw=24,000(美国SIGMA公司)(4)溶菌酶:Mw =14,3002. 未知蛋白质样品:由实验室准备3. 0.025M KCl-0.1M HAC(乙酸)(洗脱液1000ml)4. 蓝色葡聚糖-2000
[font=宋体][b]离子交换层析基本原理:[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]离子交换层析法是蛋白纯化的一种方式,通过带电的溶质分子与离子交换层析介质中可交换离子进行交换,从而达到分离纯化的目的。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]离子交换层析法主要依据电荷间的相互作用,利用带电分子中电荷的微小差异而进行分离,具有较高的分离容量。几乎所有的生物大分子都是极性的,都可使其带电,所以离子交换层析法的应用很广泛。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]离子交换层析的介质:[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]有许多离子交换介质都已经商品化,但不存在一种神奇的介质其最适合各种蛋白质的纯化。选择离子交换介质的标准包括应用的特异性需要、样品成分的等电点和分子大小(即目的蛋白和污染物),以及可得到的装备(如泵和柱子)。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]首先需要选择阴离子或阳离子介质,如果目的蛋白的等电点已知,选择阴离子介质且操作的[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]高于目的蛋白的[/font][font=Calibri]pI[/font][font=宋体],或选择阳离子介质且操作[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]低于目的蛋白的[/font][font=Calibri]pI[/font][font=宋体]。如果靶蛋白的[/font][font=Calibri]pI[/font][font=宋体]未知,开始之前最好先测定它。最佳操作[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]可根据经验确定。因为大多数蛋白质的[/font][font=Calibri]pI[/font][font=宋体]低于[/font][font=Calibri]7[/font][font=宋体],选择阴离子交换和操作[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]为[/font][font=Calibri]8.5[/font][font=宋体]开始是合理的,然后根据估计结果和优化条件。知道蛋白质溶液中污染物[/font][font=Calibri]pI[/font][font=宋体]和结合特征也是有用的。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]离子交换层析应用:[/b][/font][font=宋体][font=宋体]离子交换层析法是生物纯化中应用最广泛的色谱模式,应用于大多数下游处理平台。在[/font][font=Calibri]IEX[/font][font=宋体]中结合目标蛋白、洗脱柱子和洗脱目标蛋白的典型方案被称为“结合[/font][font=Calibri]/[/font][font=宋体]洗脱模式”,经常应用于中间纯化步骤如抗体的下游处理。阴离子交换层析是大多数血浆蛋白纯化平台的组成部分如凝血因子[/font][font=Calibri]VIII[/font][font=宋体]的纯化。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][font=宋体]离子交换层析([/font][font=Calibri]IEX[/font][font=宋体])具体操作步骤:[/font][/b][/font][font=宋体]平衡[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]第一步是固定相的平衡。当达到平衡时,所有的固定相带电基团都与可交换的平衡离子结合,如氯或钠。选择起始缓冲液的[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]和离子强度,以确保目标蛋白与介质的结合。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]上样和清洗[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]第二步的目标是结合目标分子,并清洗出所有未结合的物质。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]洗脱[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]随着离子强度的增加,在选定的[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值下净电荷最低的蛋白将最先从柱子上洗脱。同样地,在一定[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值下电荷最高的蛋白被保留得最牢固,并且在最后被洗脱。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]再生[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]最后用高离子强度的缓冲液进行最后一次清洗,使色谱柱再生,并去除任何仍结合的分子。然后在开始下一次运行之前,色谱柱需要在起始缓冲液中重新平衡。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-by-iec][b]离子交换层析蛋白纯化[/b][/url]详情可以关注:[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-by-iec[/font][/font]
[font=宋体]亲和层析依赖于蛋白对基质结合配体的特异性和可逆性结合。该配体可以直接与目的蛋白结合或共价连接到蛋白的标签上。亲和层析通常是最有效的纯化方法,通常用在纯化方案的早期阶段。这种特定的亲和相互作用能够捕获目标蛋白,同时去除溶液中的污染物或其他分子,并一步富集或纯化目标分子,使其与其他不能结合配体的分子分离。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]除了理论上蛋白能够通过免疫亲和层析纯化之外,亲和法仅限于具有特异结合特性的蛋白,而免疫亲和层析是所有亲和技术中特异性最强的。[font=宋体]下面是关于亲和层析纯化蛋白的注意事项![/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][font=宋体]一、[/font][font=Calibri]Ni[/font][font=宋体]柱进行蛋白纯化时注意点:[/font][/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri](1)[/font][font=宋体]避免缓冲液中有高浓度的电子供体基团,比如:[/font][font=Calibri]NH4[/font][font=宋体],甘氨酸,精氨酸,等等;[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](2)[/font][font=宋体]各种缓冲液中不能有强螯合剂,如[/font][font=Calibri]EDTA[/font][font=宋体],[/font][font=Calibri]EGTA[/font][font=宋体],等等;[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](3)[/font][font=宋体]各种缓冲液里不能有高浓度的强还原剂,,比如[/font][font=Calibri]DTT[/font][font=宋体],防止二价[/font][font=Calibri]Ni[/font][font=宋体]被还原;[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](4) [/font][font=宋体]不能含离子型的去垢剂,比如[/font][font=Calibri]SDS[/font][font=宋体],防止[/font][font=Calibri]Ni[/font][font=宋体]流失;[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](5)[/font][font=宋体]在破碎细胞的时候建议加入蛋白酶抑制剂,比如[/font][font=Calibri]0.1-1mM[/font][font=宋体]的[/font][font=Calibri]PMSF[/font][font=宋体],防止目的蛋白被降解;[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](6)[/font][font=宋体]缓冲液里可以加入甘油,防止蛋白之间由于疏水相互作用而发生聚集沉淀,甘油浓度最高可达[/font][font=Calibri]50%[/font][font=宋体]([/font][font=Calibri]v/v[/font][font=宋体])[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](7)[/font][font=宋体]应避免含碳酸氢钠,柠檬酸等物质;[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](8)[/font][font=宋体]缓冲液里[/font][font=Calibri]NaCl[/font][font=宋体]的浓度应在[/font][font=Calibri]300mM[/font][font=宋体]到[/font][font=Calibri]2M[/font][font=宋体]之间;[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](9)[/font][font=宋体]可加入变性剂促溶,盐酸胍(最高可[/font][font=Calibri]6M[/font][font=宋体]),尿素(最高可[/font][font=Calibri]8M[/font][font=宋体])[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](10)[/font][font=宋体]可加入非离子型去垢剂,如[/font][font=Calibri]Triton[/font][font=宋体],[/font][font=Calibri]Tween[/font][font=宋体],[/font][font=Calibri]NP40[/font][font=宋体]等,最高[/font][font=Calibri]2%[/font][font=宋体],可以减少背景蛋白污染和去除核酸污染;[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][font=宋体]二、[/font] [font=Calibri]gst[/font][font=宋体]柱进行蛋白纯化时注意点[/font][/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri](1)[/font][font=宋体]在细胞裂解时,加入终浓度[/font][font=Calibri]1[/font][font=宋体]–[/font][font=Calibri]10 mM DTT[/font][font=宋体]可以显著提高[/font][font=Calibri]GST[/font][font=宋体]融合蛋白的结合效率, 在[/font][font=Calibri]Binding Buffer[/font][font=宋体]和[/font][font=Calibri]Elution Buffer[/font][font=宋体]中加入[/font][font=Calibri]1[/font][font=宋体]–[/font][font=Calibri]10 mM DTT[/font][font=宋体],可以提高蛋白纯度,但是会导致其产率降低[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](2)[/font][font=宋体]超声太剧烈或时间过长会引起蛋白变性,导致蛋白不能与介质结合。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](3)[/font][font=宋体]在[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值低于[/font][font=Calibri]6.5[/font][font=宋体]或高于[/font][font=Calibri]8.0[/font][font=宋体]结合效率会降低,使用前需用[/font][font=Calibri]pH6.5[/font][font=宋体]~[/font][font=Calibri]8.0[/font][font=宋体]的[/font][font=Calibri]Buffer[/font][font=宋体]如[/font][font=Calibri]PBS[/font][font=宋体]进行平衡;[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](4)[/font][font=宋体]增大[/font][font=Calibri]Elution Buffer[/font][font=宋体]的[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值。[/font][font=Calibri]Elution Buffer[/font][font=宋体]的[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值调至[/font][font=Calibri]pH 8[/font][font=宋体]–[/font][font=Calibri]9[/font][font=宋体]可以提高洗脱效率而不需要增加[/font][font=Calibri]glutathione[/font][font=宋体]的浓度;[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](5)[/font][font=宋体]增加[/font][font=Calibri]Elution Buffer[/font][font=宋体]的离子强度。加入[/font][font=Calibri]0.1[/font][font=宋体]–[/font][font=Calibri]0.2 M NaCl[/font][font=宋体]能提高洗脱效率;[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](6)Elution Buffer[/font][font=宋体]中加入非离子型变性剂。非特异性的疏水作用可能会阻碍[/font][font=Calibri]GST[/font][font=宋体]融合蛋白从介质上增溶和洗脱。加入[/font][font=Calibri]0.1% Triton X-100 or 2% N-octylglucoside[/font][font=宋体]可以显著增加洗脱效率[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][font=宋体]三、[/font] [font=Calibri]proteinA[/font][font=宋体]柱进行蛋白纯化时注意点[/font][/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri](1)[/font][font=宋体]介质的选择[/font][font=Calibri]A,G or [/font][font=宋体]其他,其结合能力的选择[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](2)[/font][font=宋体]上样流速尽量小,让[/font][font=Calibri]Protein G[/font][font=宋体]和抗体有充分的结合时间[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](3)[/font][font=宋体]在低[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值洗脱后,快速中和。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](4)[/font][font=宋体]长时间保存加入[/font][font=Calibri]0.02-0.05[/font][font=宋体]%叠氮钠;[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](5)[/font][font=宋体]加入[/font][font=Calibri]10%[/font][font=宋体]甘油,可有效防止疏水作用引起的聚集。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](6)[/font][font=宋体]抗体纯度不够,杂蛋白含量高,易引起蛋白的沉淀。 [/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]四、亲和层析配体和洗脱条件[/b][/font][align=center][font=宋体][b][img=亲和层析配体和洗脱条件,690,224]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2023/09/202309061557423472_5868_5907840_3.png!w690x224.jpg[/img][/b][/font][/align][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]更多详情[url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-by-ac][b]亲和层析纯化蛋白[/b][/url]参看:[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-by-ac[/font][/font]
[color=#d801e5][color=#dc143c][size=2]维权声明:本文为lily002原创作品,本作者与仪器信息网是该作品合法使用者,该作品暂不对外授权转载。其他任何网站、组织、单位或个人等将该作品在本站以外的任何媒体任何形式出现的,均属侵权违法行为,我们将追究法律责任。[/size][/color]大家好,我是凝胶色谱一名新手,以前常常在咱们论坛中学习和下载资料,看到论坛中轰轰烈烈的第三届原创大赛开始了,还有各位达人们的攻略、帮助,心里有点小激动呢~~~于是就拿出自己的一些实验和研究的东东来与大家分享!!说实话拿出来有点小担心,毕竟自己的水平不高拿出来有点献丑了!本着分享第一荣誉第二的原则,就硬着头皮绣出来了!!也希望大家轻拍哦![/color][align=center][color=#d40a00]===================================Show Time========================================[/color][/align] 我在本次试验中研究的是金属硫蛋白(Metallothionein, MT)又名金属组氨酸甲基内盐,是分子量较小,富含半胱氨酸的非酶蛋白质,其内含有镉、铜、锌、汞等金属元素,不含芳香组胺酸残基。MT与微量元素代谢、重金属解毒、自由基清除以及应急反应有关。是一种广泛存在于各种组织的蛋白质。这些蛋白具有很高的结构稳定性。分析不同的动物和不同的组织器官,发现MT氨基酸组成差异很小。在真菌和动物体内,MT能够缓解镉、汞等有害元素的毒害并在不同应激条件保护机体,被认为是和生物体解毒有关的蛋白,在脊椎动物,MT则被更多地认为和锌的储藏和代谢有关。最显著的功能是可消除体内过量的自由基、重金属及有害物质的污染。在如今环境污染日趋严重的情况下,这种能增强自 身抗污染能力的产品,将越来越为人们所需要。香菇多糖、糖蛋白及 其衍生物具有较强的保肝、抗衰老、增食欲等功效,它是一种有效的免疫激活剂和调节剂,能通过提高机体免疫功能,抑制癌细胞的生长 和扩大。 聚丙烯酰胺是以丙烯酰胺和甲撑双丙烯酰胺聚合而成的具有三维网状结构的凝胶,其孔径可调,性质稳定,无色透明。用聚丙烯酰胺凝胶作为电泳的支持物分离蛋白,具有分辨力高、酶活性影响小、显带效果好等优点,因此应用广泛。 近年来,河流湖泊及近海海域不同程度受到重金属的污染,镉被美国毒理委员会列为第6位危及人体健康的有害物质。镉(Cd)是人体非必需元素,在自然界中常以化合物状态存在,一般含量很低,在正常环境下,不会影响人体健康。镉被人体吸收后在体内形成了镉硫蛋白,选择性地储存于肾、肝中,其中肾脏可吸收进入人体近1/3的镉,是镉 中毒的“靶器官”。其它如脾、胰、甲状腺和毛发等也有一定量的积蓄。镉在体内可与含羟基、氨基、硫基的蛋白质分子结合,使许多酶系统受到抑制,从而影响到肝、肾器官中酶系统的正常功能。由于镉损伤肾小管,病者出现糖尿、蛋白尿和氨基酸尿,特别是使骨骼的代谢受阻,造成骨质酥松,萎缩,变形等症状。 本实验通过体外暴露氯化镉染毒法处理长江华溪蟹,对华溪蟹的蛋白进行SDS-PAGE电泳,得到相应的分子量,并通过紫外分光光度计对华溪蟹体内的金属硫蛋白进行鉴定。 [b]一、实验材料和仪器[/b] 1.材料:华溪蟹于家门口的水场市场购回,先在实验室的饲养池中用清水驯养数天,不喂任何食物,选取大小均等、重量相似的个体进行染毒处理。 2.部分主要仪器:高速冷冻离心机Centrifuge 5804R(eppendorf),高速台式离心机 Centrifuge 5415D(eppendorf),恒温水浴锅,循环水式多用真空泵,超低温冰箱MDF-U50V(日本SANYO),国产凝胶柱(上海华美实验仪器厂,26*100),SephadexG-50(Amerchsham),AKTA Prime蛋白纯化系统(Amersham),UV-2102 PC型紫外可见分光光度计(UNICOTM) [b]二、 实验过程:[/b] 1.体外镉暴露法染毒 因为镉对金属硫蛋白有高度的诱导作用,所以在的、高镉环境中可以诱导华溪蟹的金属硫蛋白的产生。[14] 通过查阅资料及进行预实验,最终确定染毒的镉溶液浓度为58mg/l染毒时间为30h提取组织为肝胰腺。实验华溪蟹的解剖,用镊子将华溪蟹从染毒缸中取出,用清水冲洗干净,在解剖盘中先将其附肢剪掉,然后打开蟹壳,腮为半片状,分布在两侧,可以很轻易的取出,卵巢分布在中后部,颜色为亮黄色,颗粒状,用镊子可以方便取出,肝胰腺在卵巢和心脏的下面,将心脏剥离后向下夹入便可夹出整个肝胰腺,其呈暗黄色,絮状,从华溪蟹的螯中取出肌肉,先将其剪开,再用手术刀从螯壁上刮下肌肉组织,其半透明粘性大。 2. MT粗提取的制备 取染毒华溪蟹的肝胰腺,按每克湿组织用3ml0.02mol/lTris-Hcl缓冲液(pH8.6)在玻璃研钵中充分匀浆,将匀浆液放入-800C的冰箱中保存备用。 3. Sephadex G-50凝胶柱的制备 (1)凝胶柱的清洗 将购买国产凝胶柱(26*100)用70%浓盐酸浸泡过夜,用洗衣粉水浸泡,冲洗,最后用去离子水冲洗干净。 (2)凝胶填料的溶胀 商品凝胶是干燥的颗粒状固体,将凝胶均匀铺洒在干净并且干燥的烧杯内,缓缓家入超纯水,使其溶胀.待凝胶体积超过烧杯容积1/2后,将一般凝胶转移至另一干净烧杯,防止凝胶溢出.用封口膜封住烧杯放2d,然后将烧杯放入真空泵抽滤2d,排除凝胶中的气泡. (注意在凝胶溶胀和处理凝胶悬浮液的整个过程中,不能进行激烈的搅拌,这样会使凝胶颗粒破碎而产生碎片,以至影响层析的流速,在处理凝胶时,严禁使用电磁搅拌,它会象磨一样,在很短时间内把凝胶碾碎.) (3)凝胶柱的装填 把凝胶柱竖直固定好(有滤膜的一端为底部),用Ph8.6Tris-Hcl缓冲液润洗后加入柱体积1/3Tris-Hcl缓冲液,将少量凝胶转移至小烧杯中家Tris-Hcl缓冲液,用玻璃棒轻轻搅拌均匀,并观察凝胶是否有不均匀处(若有不均匀处,可将不均匀凝胶重新搅拌使重新沉降),然后用玻璃帮引流到凝胶柱内并不停地轻轻搅拌使凝胶均匀沉降,直至凝胶沉降至柱顶约10cm处,加Tris-Hcl缓冲液至柱顶,盖好柱顶螺帽,并将凝胶柱与蛋白纯化系统连接好,用Tris-Hcl缓冲液反复洗脱. (4)Sephadex G50 凝胶层析分离纯化MT 将装着已提取的染毒华溪蟹组织的EP管从冰箱中取出解冻,把组织倒入研钵加入1.5mlTris-Hcl缓冲液,充分研磨,将样品转至5mlEP管中,把EP管插在漂浮板上,放入80℃恒温水浴锅5min,取出后抽去表层脂肪,上样. (5)洗脱峰紫外光谱扫描分析 (6)洗脱峰SDS-PAGE分析 [b]三、实验结果与分析[/b] 1.SephdexG50凝胶层析分离纯化MT[img]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2010/07/201007291845_233096_1917139_3.jpg[/img] 图1为匀浆热沉淀处理上样经SephadexG-50凝胶柱层析图,洗脱液为0.01mol/L Tris-Hcl缓冲液,pH为8.60,洗脱速度为0.5ml/min,在254nm处检测吸光度,结果显示,层析后样品分为Ⅰ,Ⅱ两个峰. 2. 洗脱峰紫外光谱扫描分析 由于金属硫蛋白中不含有芳香族氨基酸,所以在紫外不能形成280nm特征光谱.但是由于金属硫蛋白在二级结构中形成特征性的巯基金属簇,而导致在紫外光谱中出现对应于金属簇结构的特殊吸收峰,吸收峰的位置主要决定于金属的种类,如:镉硫金属簇的吸收位于250nm附近,而锌硫金属簇的吸收峰位于225nm附近. 将接收峰Ⅰ,Ⅱ分别在190nm-300nm扫描。[img]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2010/07/201007291848_233097_1917139_3.jpg[/img] 图2,3分别为匀浆热沉淀处理上样洗脱峰Ⅰ,Ⅱ稀释8倍后在190nm-300nm间紫外吸收光谱.结果显示,洗脱峰Ⅰ在280nm处都有一个高的吸收峰,而洗脱峰Ⅱ在250nm附近具有一个高的吸收峰,在280nm处急剧下降,据此分析MT主要存在于峰Ⅱ中. 3.洗脱峰SDS-PAGE分析[img]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2010/07/201007291856_233100_1917139_3.jpg[/img] 图4,5为匀浆上样后洗脱峰SDS-PAGE电泳图谱,如图8所示峰2峰3蛋白浓度过低,经冷冻干燥浓缩再次上样,图9显示MT存在于峰Ⅱ中但未能得到完全纯化,还需进一步上离子交换柱层析分离.
[font=宋体]离子交换层析是一种在生物化学和生物技术领域中广泛使用的分离和纯化技术。它基于离子间的相互作用,特别是离子与固定在层析介质上的带电基团之间的相互作用,从而实现对混合物中不同离子的分离。以下将详细介绍离子交换层析的步骤及其作用。[/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]一、步骤[/font][/b][font=宋体][font=Calibri]1[/font][font=宋体]、预处理:在开始离子交换层析之前,通常需要对样品进行预处理,以去除大颗粒杂质和不需要的成分。这通常包括离心、过滤和可能的浓缩步骤。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]、选择合适的离子交换剂:离子交换剂是层析过程的核心。根据待分离离子的性质(如电荷、大小和与交换剂的亲和力)选择合适的离子交换剂。常见的离子交换剂包括阳离子交换剂和阴离子交换剂。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]3[/font][font=宋体]、平衡离子交换剂:在将样品加载到离子交换柱之前,需要用适当的平衡溶液(通常是水或盐溶液)冲洗离子交换剂,以去除可能存在的杂质并确保离子交换剂处于最佳状态。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]4[/font][font=宋体]、加载样品:将预处理过的样品加载到离子交换柱上。样品中的离子会与离子交换剂上的带电基团发生相互作用。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]5[/font][font=宋体]、洗脱:用洗脱液(通常是盐溶液,其浓度逐渐增加)将结合的离子从离子交换剂上洗脱下来。这一步骤是离子交换层析中最为关键的一步,因为它决定了不同离子之间的分离效果。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]6[/font][font=宋体]、收集和分析:收集洗脱下来的各个组分,并进行分析,以确定每个组分中包含的离子种类和浓度。常见的分析方法包括电导率测量、紫外[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]可见光谱和质谱等。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]7[/font][font=宋体]、后处理:根据需要对收集到的组分进行进一步的处理,如浓缩、脱盐或重新配制等。[/font][/font][b][font=宋体] [/font][font=宋体]二、作用[/font][/b][font=宋体]离子交换层析在生物化学和生物技术领域有着广泛的应用,主要作用包括:[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1[/font][font=宋体]、分离和纯化蛋白质:离子交换层析可用于从复杂的混合物中分离和纯化蛋白质,这对于后续的生物化学研究和药物开发至关重要。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]、去除杂质:离子交换层析能够有效地去除样品中的离子杂质,提高样品的纯度。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]3[/font][font=宋体]、样品制备:在进行其他分析或实验之前,离子交换层析可用于样品的制备和预处理。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]4[/font][font=宋体]、研究蛋白质与离子的相互作用:通过离子交换层析,可以研究蛋白质与不同离子之间的相互作用和亲和力,这对于理解蛋白质的生物学功能和调控机制具有重要意义。[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=宋体]三[/font] [font=宋体]、应用领域[/font][/font][/b][font=宋体]离子交换层析法在许多领域得到广泛应用:[/font][font=宋体]●生物制药:用于药物蛋白质的纯化,确保生物制剂的质量和稳定性。[/font][font=宋体]●生物学研究:在分离和纯化特定电荷性质的蛋白质时被广泛使用,尤其在基因表达和蛋白质互作研究中。[/font][font=宋体]●食品工业:用于提取和纯化食品中的蛋白质,改善食品的质地和口感。[/font][font=宋体]●环境监测:可用于从环境样品中分离和检测特定蛋白质,例如水体中的生物标志物。离子交换层析法凭借其良好的选择性和高效性,是生物分离和纯化领域不可或缺的重要工具。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]更多详情可以关注:[url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-by-iec][b]离子交换层析蛋白纯化[/b][/url][/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-by-iec[/font][/font][b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州:蛋白与抗体的专业引领者,欢迎通过百度搜索[/font][font=宋体]“义翘神州”与我们取得联系。[/font][/font][/b]
层析柱过滤蛋白的 它的过滤膜怎么选择?
[font=宋体]蛋白质是包括人类在内的各种生物有机体的重要组成成分,是生命的物质基础之一。生物体的生长、发育、遗传和繁殖等一切生命活动都离不开蛋白质。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]随着分子生物学、结构生物学、基因组学等研究的不断深入,人们意识到仅仅依靠基因组的序列分析来试图阐明生命活动的现象和本质是远远不够的。只有从蛋白质组学的角度对所有蛋白质的总和进行研究,才能更科学地掌握生命现象和活动规律,更完善地揭示生命的本质。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]由此许多学者将生命科学领域的研究焦点从基因转向蛋白质,使蛋白质成为揭示生命活动现象和分子生物学机理的重要研究对象。研究蛋白质首要的步骤是将目的蛋白从复杂的大分子混合物中分离纯化出来,得到高纯度具有生物学活性的目的物。因此,高效的纯化技术和手段是蛋白质研究的重要基础和关键之一。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=宋体]蛋白纯化的目的[/font] [/font][/b][font=宋体][font=宋体]蛋白纯化的目的是将目标蛋白质从细胞裂解液的全部组分中分离出来,同时仍保留蛋白的生物学活性及化学完整性。蛋白质的分离和提纯工作是一项艰巨而繁重的任务,需根据蛋白的特性选择合适的纯化方法来提高获得的蛋白制品的纯度。[/font] [/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=宋体]蛋白纯化的原理[/font] [/font][/b][font=宋体][font=宋体]不同蛋白质的氨基酸序列及空间结构不同,导致其在物理、化学、生物学等性质上存在差异,利用待分离蛋白质与其它蛋白质性质上的差异,即可以设计出一套合理的蛋白纯化方案。蛋白的纯化大致分为粗分离阶段和精细纯化阶段两个阶段。粗分离阶段主要将目的蛋白和其他细胞成分如[/font] [font=Calibri]RNA[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]DNA [/font][font=宋体]等分开,常用的方法为硫酸铵沉淀法。精细纯化阶段的目的是把目的蛋白与其他大小及理化性质接近的蛋白区分开来,[/font][/font][b][font=宋体][font=宋体]常用的方法有:凝胶过滤层析、离子交换层析、疏水层析、亲和层析等。[/font] [/font][/b][font=宋体] [/font][b][font=宋体]①[/font][font=宋体]凝胶过滤层析[/font][/b][font=宋体]凝胶过滤层析(又叫做分子筛)是根据样品的分子大小对样品进行分离的一种简单温和的层析技术。凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析,是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用,根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。不同于离子交换层析和亲和层析,凝胶过滤的层析样品不与层析柱料结合,因此,缓冲液成分不直接影响分辨率。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]原理:层析柱中的填料是球状颗粒的惰性的多孔网状结构的柱料,多是交联的聚糖[/font][font=Calibri]([/font][font=宋体]如葡聚糖或琼脂糖[/font][font=Calibri])[/font][font=宋体]类物质。在加入样品之后,样品中的小分子物质能进入球状填料内部,在柱子中停留时间较长;而大分子物质不能进入球状填料内部,停留时间较短。所以当样品经过凝胶过滤层析柱分离后,样品中的不同分子大小的物质就可以被分离开了。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]特点:[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]根据分子大小和形状进行分离[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]是一种非吸附的分离方式[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]缓冲液成分不直接影响分辨率,只需要一种缓冲液[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]操作便捷[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]②[/font][font=宋体]离子交换层析[/font][/b][font=宋体]离子交换层析是目前蛋白质分离纯化中应用最广泛的方法之一。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]原理:不同蛋白等电点差异,分子大小差异,在同一个流动相中电荷密度分布不同,电荷量不等,与具有相反电荷的离子交换介质结合强度不同,在流动相洗脱时保留时间不同,从而得以分离。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体]特点:[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]根据分子大小和等电点差异进行分离[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]灵敏度高,重复性,选择性好,分析速度快[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]③[/font][font=宋体]疏水层析[/font][/b][font=宋体]原理:疏水层析是依据蛋白质疏水性差异分离的。即根据蛋白质和疏水介质表面的疏水基团的可逆相互作用进行分离。蛋白的疏水性在高离子强度下被增强,因此在高离子强度环境中结合,通常采用降低离子强度的方式进行洗脱。独特的吸附分离模式使得疏水层析成为硫酸铵盐析后或离子交换高盐洗脱后理想的纯化方式。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]特点:[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]采用了盐的水溶液作为流动相,色谱条件温和,生物大分子的活性回收率很高。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]蛋白质在[/font][font=Calibri]HIC[/font][font=宋体]操作过程中是高盐上样,低盐洗脱(高盐浓度的样品不必作处理就可直接上样)。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]在一次色谱中可同时实现出去盐酸胍、蛋白质复性和分离三个目的。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]温度升高,蛋白质天然折叠伸展,暴露出更多内部疏水集团,使蛋白质的[/font][font=Calibri]HIC[/font][font=宋体]保留发生变化。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]色谱填料稳定性好,盐水体系作流动相无环境污染。[/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]④[/font][font=宋体]亲和层析[/font][/b][font=宋体][font=宋体]原理:[url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-by-ac][b]亲和层析[/b][/url]是应用生物高分子与配基可逆结合的原理,将配基通过共价键牢固结合于载体上而制得的层析系统。这种可逆结合的作用主要是靠生物高分子对它的配基的空间结构的识别。常用的生物亲和关系有酶[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]底物、底物类似物、抑制剂、激活剂、辅因子,抗体[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]抗原,激素[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]受体蛋白、载体蛋白,外源凝集素[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]多糖、糖蛋白、细胞表面受体,核酸[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]互补核苷酸序列、组蛋白、核酸结合蛋白等,具有高效、简单、快速的优点,是当前最为理想的分离纯化蛋白的方法。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]更多详情可以参看蛋白纯化技术[/font][font=Calibri]/[/font][font=宋体]方法:[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-techniques[/font][/font][font=Calibri] [/font]
我今年研一,做的乳清蛋白方面的研究,分离是利用凝胶层析柱,分离得到的蛋白用高效液相还是走电泳测定蛋白纯度精确,求大神支招
请教:疏水层析和反相层析相比对蛋白质吸附能力较弱??原文大意如下——疏水等系和反相层析的原理都是利用疏水作用分离蛋白质、多肽的但是二者使用的介质和流动相有一定的差别其中疏水层析介质的极性反相层析介质的极性所以疏水层析的介质对于蛋白质的吸附能力较弱 可以使用温和的盐水就可以洗脱但是反相层级的介质极性较弱 需要更强的有机溶剂洗脱之【问题是——蛋白质应该是水溶性的啊? 应该是和极性更强的疏水层析介质接近 继而疏水层析介质对蛋白质的吸附能力更强?????????????????????】 [em0808]
[font=宋体][font=宋体]不同的蛋白具有不同的氨基酸序列和空间结构,从而导致其在物理、化学和生物学特性中存在差异。考虑到细胞提取物中重组蛋白的相对丰度较高,开发生产纯蛋白([/font][font=Calibri]SDS-PAGE[/font][font=宋体]显示单一条带)的实验室规模纯化方案应该相对简单。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]下游处理方案中的各个步骤可分离混合物中的蛋白和非蛋白部分,最终将所需的蛋白与所有其他蛋白分离,同时保留多肽的生物活性和化学完整性。分离步骤会利用粗混合物中目标蛋白与其他蛋白之间的化学[/font][font=Calibri]/[/font][font=宋体]结构[/font][font=Calibri]/[/font][font=宋体]功能特性的差异。这些性质包括大小、形状、电荷、等电点、电荷分布、疏水性、溶解性、密度、配体结合亲和力、金属结合、可逆结合、翻译后修饰以及特定的序列或结构。下面是针对蛋白分离纯化方法做了以下汇总:[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][font=Calibri]1.[/font][font=宋体]根据蛋白质溶解度的差别分离[/font][/b][/font][font=宋体]蛋白质的溶解度具有显著的特性,可以根据其溶解度的差异进行分离。其中,等电点沉淀法、盐析和盐溶、有机溶剂沉淀以及重金属盐沉淀是常用的方法。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]①等电点沉淀法:蛋白质在等电点附近溶解度最小,易沉淀析出。利用不同蛋白质等电点的不同,将蛋白质从混合溶液中分开[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]②盐析和盐溶:[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]盐析:大量的中性盐溶液可以降低蛋白质的溶解度,使蛋白质沉淀析出的现象[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]盐溶:低浓度的中性盐溶液促进某些蛋白质的溶解,从而与其他组分分开[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]③有机溶剂沉淀:亲水性有机溶剂如乙醇、丙酮等能使蛋白质在水中的溶解度降低,从而沉淀析出[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]④重金属盐沉淀:重金属盐带正电荷,可以与蛋白质负离子结合而形成不溶性蛋白质沉淀可利用此性质以大量清蛋白抢救重金属盐中毒的人[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][font=Calibri]2.[/font][font=宋体]根据蛋白质分子大小的不同分离[/font][/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]①透析:利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质,使蛋白质和其他小分子物质如无机盐、单糖等分开,本质是以浓度差为推动力的膜分离过程。主要应用是血液(人工肾)的解毒[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]②超滤:通过加压、抽滤、离心等多种方式,使水和其他小分子溶质透过超滤膜,而蛋白质截留在膜上,以达到浓缩和脱盐的目的,本质是以静压力差为推动力的膜分离过程[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]③密度梯度离心:蛋白质颗粒的沉降速度取决于它的大小和密度,将蛋白质颗粒在具有密度梯度的介质中离心,质量和密度大的蛋白质比质量和密度小的蛋白质颗粒沉降得快,并且每种蛋白质颗粒沉降到与自身密度相等的介质梯度时,即停止不前,最后各组分在离心管中被分离成各自独立的区带[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]④凝胶过滤层析:当不同分子大小的蛋白质流经凝胶层析柱时,比凝胶珠孔径大的分子不能进入凝胶珠内部,只能随溶剂在凝胶珠之间的孔隙向下移动并最先流出体外;比凝胶珠孔径小的分子能不同程度的自由进出凝胶珠的内外。于是不同大小的分子所经的路径长短不同而得到分离,大分子先洗脱出来,小分子后洗脱出来[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]⑤超速离心:蛋白质溶液在强大离心场中会逐渐沉降,各种蛋白质沉降所需离心力场不同,可用超速离心法分离蛋白质并测定其分子量[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][font=Calibri]3.[/font][font=宋体]根据电荷不同的纯化方法[/font][/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]①电泳:在外电场作用下,带电颗粒将向着与其电性相反的电极移动,这种现象称为电泳。利用带点颗粒净电荷的差异分离混合物[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]②离子交换层析:在某一特定的[/font][font=Calibri]PH[/font][font=宋体]值,混合蛋白质溶液中各种蛋白质所带电荷数目及性质不同,事先在层析柱中装上离子交换剂,其所带电荷性质与蛋白质电荷性质相反,当蛋白质混合溶液流经层析柱时,即可被吸附于柱上,随后用与蛋白质带相同性质电荷的洗脱剂洗脱,蛋白质可被置换下来,由于各种蛋白质所带电荷不同,离子交换剂结合的紧密程度不同,带电量小的蛋白质先被洗脱下来,增加洗脱液离子强度,带电量多的也被洗脱下来,可将蛋白质分离[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][font=Calibri]4.[/font][font=宋体]利用选择性吸附的纯化方法[/font][/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]吸附层析:利用待纯化的分子和杂质分子与吸附剂之间的吸附能力和解吸性质不同而达到分离目的[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][font=Calibri]5.[/font][font=宋体]利用对配体的特异生物学亲和力的纯化方法[/font][/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]亲和层析:把待纯化的某一蛋白质的特异配体通过适当的化学方法共价连接到载体分子上,当蛋白质混合物加到填有亲和介质的层析柱时,待纯化的蛋白质与配体特异性结合,而其他蛋白质则不被结合,通过洗涤除去,被特异结合的蛋白质可以用含游离的相应配体溶液把它从柱上洗脱下来[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][font=Calibri]6.[/font][font=宋体]高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url][/font][font=Calibri]HPLC[/font][font=宋体]和快速蛋白质[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相[/color][/url]层析[/font][font=Calibri]FPLC[/font][/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]HPLC[/font][font=宋体]:以液体为流动相,采用高压输液系统,将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱,在柱内各成分被分离后,进入检测器进行检测,从而实现对试样的分析[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]FPLC[/font][font=宋体]:是由经典的液体柱层析引入[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp][color=#3333ff]气相色谱[/color][/url]理论,并对相体进行改革,配用高压输液泵,采用高灵敏检测器、梯度洗脱装置、自动收集装置和微机等发展起来的现代[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]。适用各种层析技术,专门分离和纯化各类生物分子,包括天然蛋白质,重组和融合蛋白质、肽、寡核酸、质粒、病毒、抗生素、生物碱等等,操作肽图等精确分析和小量制备应用,具有快速、高分辨率、柱容量大、回收效率高及不易使生物大分子失活等特性。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]详情可以关注义翘神州[url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-techniques][b]蛋白纯化技术方法[/b][/url]:[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-techniques[/font][/font]
[size=18px] 汉邦全自动蛋白纯化系统是公司自主研发的一款高效、快速、可靠的全自动蛋白纯化系统。可用于微克到克级水平的蛋白、多肽和核酸等生物分子的快速高效纯化。该系统采用模块化设计、配套智能化软件并结合公司的各类层析柱,可满足实验室各类生物大分子的纯化需求。它的模块化设计、智能化软件并结合汉邦科技的各类层析柱,可以满足实验室中各类生物大分子的纯化挑战! 欢迎来电咨询:18952338196 [img=,690,469]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2022/05/202205261525020323_4695_2788731_3.jpg!w690x469.jpg[/img][/size]
[font=宋体][b]亲和层析技术的原理:[/b][/font][font=宋体][font=宋体]亲和分析是利用生物聚合物与基础可逆结合的原理,通过共价键将基础与载体牢固结合而成的分析系统。这种可逆结合的作用主要取决于生物聚合物对其基础的空间结构的识别。受体蛋白、载体蛋白、外源凝集素[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]多糖、糖蛋白、细胞表面受体、核酸[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]互补核苷酸序列、组蛋白、核酸结合蛋白等。它具有高效、简单、快速的优点,是目前分离纯化蛋白质最理想的方法。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]在亲和色谱中,在影响蛋白质(或标签)与其配体结合的情况下,将蛋白质装载在柱子上。在不破坏特定相互作用但能破坏污染蛋白质与固定相互作用的情况下,清洗组合蛋白质。然后用含有竞争性分子的缓冲液或破坏所有蛋白[/font][font=Calibri]/[/font][font=宋体]蛋白相互作用的条件洗脱结合的蛋白。竞争分子与配体结合,取代目标蛋白,这种竞争分子通常通过另一种色谱流程或透析法从目标蛋白中去除。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]亲和色谱配体和条件[/b][/font][font=宋体]需纯化的蛋白[/font][font=宋体]配体[/font][font=宋体]洗脱条件[/font][font=宋体]抗体(抗原特异性)[/font][font=宋体]抗原肽[/font][font=宋体]游离肽[/font][font=宋体]多聚组氨酸标签蛋白[/font][font=宋体][font=Calibri]Ni2+[/font][font=宋体]或[/font][font=Calibri]Co2+[/font][/font][font=宋体]咪唑或游离组氨酸[/font][font=宋体][font=Calibri]FLAG[/font][font=宋体]标签蛋白[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]FLAG[/font][font=宋体]特异性抗体[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]FLAG[/font][font=宋体]肽或低[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]GST[/font][font=宋体]标签蛋白[/font][/font][font=宋体]还原型谷胱甘肽[/font][font=宋体]游离谷胱甘肽[/font][font=宋体][font=Calibri]Myc[/font][font=宋体]标签蛋白[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]Myc[/font][font=宋体]特异性抗体[/font][/font][font=宋体][font=宋体]低[/font][font=Calibri]pH[/font][/font][font=宋体]抗体(类特异性)[/font][font=宋体][font=宋体]蛋白[/font][font=Calibri]A[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]G[/font][font=宋体]和[/font][font=Calibri]L[/font][font=宋体]或精蛋白[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]极端值[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]结合蛋白[/font][/font][font=宋体]肝素[/font][font=宋体]高离子强度[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]亲和纯化蛋白的注意点:[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]a. Ni[/font][font=宋体]柱进行蛋白纯化时注意点:[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri](1)[/font][font=宋体]避免缓冲液中有高浓度的电子供体基团,比如:[/font][font=Calibri]NH4[/font][font=宋体],甘氨酸,精氨酸,等等;[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](2)[/font][font=宋体]各种缓冲液中不能有强螯合剂,如[/font][font=Calibri]EDTA[/font][font=宋体],[/font][font=Calibri]EGTA[/font][font=宋体],等等;[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](3)[/font][font=宋体]各种缓冲液里不能有高浓度的强还原剂,,比如[/font][font=Calibri]DTT[/font][font=宋体],防止二价[/font][font=Calibri]Ni[/font][font=宋体]被还原;[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](4) [/font][font=宋体]不能含离子型的去垢剂,比如[/font][font=Calibri]SDS[/font][font=宋体],防止[/font][font=Calibri]Ni[/font][font=宋体]流失;[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](5)[/font][font=宋体]在破碎细胞的时候建议加入蛋白酶抑制剂,比如[/font][font=Calibri]0.1-1mM[/font][font=宋体]的[/font][font=Calibri]PMSF[/font][font=宋体],防止目的蛋白被降解;[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](6)[/font][font=宋体]缓冲液里可以加入甘油,防止蛋白之间由于疏水相互作用而发生聚集沉淀,甘油浓度最高可达[/font][font=Calibri]50%[/font][font=宋体]([/font][font=Calibri]v/v[/font][font=宋体])[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](7)[/font][font=宋体]应避免含碳酸氢钠,柠檬酸等物质;[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](8)[/font][font=宋体]缓冲液里[/font][font=Calibri]NaCl[/font][font=宋体]的浓度应在[/font][font=Calibri]300mM[/font][font=宋体]到[/font][font=Calibri]2M[/font][font=宋体]之间;[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](9)[/font][font=宋体]可加入变性剂促溶,盐酸胍(最高可[/font][font=Calibri]6M[/font][font=宋体]),尿素(最高可[/font][font=Calibri]8M[/font][font=宋体])[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](10)[/font][font=宋体]可加入非离子型去垢剂,如[/font][font=Calibri]Triton[/font][font=宋体],[/font][font=Calibri]Tween[/font][font=宋体],[/font][font=Calibri]NP40[/font][font=宋体]等,最高[/font][font=Calibri]2%[/font][font=宋体],可以减少背景蛋白污染和去除核酸污染;[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]b. gst[/font][font=宋体]柱进行蛋白纯化时注意点[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri](1)[/font][font=宋体]在细胞裂解时,加入终浓度[/font][font=Calibri]1[/font][font=宋体]–[/font][font=Calibri]10 mM DTT[/font][font=宋体]可以显著提高[/font][font=Calibri]GST[/font][font=宋体]融合蛋白的结合效率, 在[/font][font=Calibri]Binding Buffer[/font][font=宋体]和[/font][font=Calibri]Elution Buffer[/font][font=宋体]中加入[/font][font=Calibri]1[/font][font=宋体]–[/font][font=Calibri]10 mM DTT[/font][font=宋体],可以提高蛋白纯度,但是会导致其产率降低[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](2)[/font][font=宋体]超声太剧烈或时间过长会引起蛋白变性,导致蛋白不能与介质结合。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](3)[/font][font=宋体]在[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值低于[/font][font=Calibri]6.5[/font][font=宋体]或高于[/font][font=Calibri]8.0[/font][font=宋体]结合效率会降低,使用前需用[/font][font=Calibri]pH6.5[/font][font=宋体]~[/font][font=Calibri]8.0[/font][font=宋体]的[/font][font=Calibri]Buffer[/font][font=宋体]如[/font][font=Calibri]PBS[/font][font=宋体]进行平衡;[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](4)[/font][font=宋体]增大[/font][font=Calibri]Elution Buffer[/font][font=宋体]的[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值。[/font][font=Calibri]Elution Buffer[/font][font=宋体]的[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值调至[/font][font=Calibri]pH 8[/font][font=宋体]–[/font][font=Calibri]9[/font][font=宋体]可以提高洗脱效率而不需要增加[/font][font=Calibri]glutathione[/font][font=宋体]的浓度;[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](5)[/font][font=宋体]增加[/font][font=Calibri]Elution Buffer[/font][font=宋体]的离子强度。加入[/font][font=Calibri]0.1[/font][font=宋体]–[/font][font=Calibri]0.2 M NaCl[/font][font=宋体]能提高洗脱效率;[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](6)Elution Buffer[/font][font=宋体]中加入非离子型变性剂。非特异性的疏水作用可能会阻碍[/font][font=Calibri]GST[/font][font=宋体]融合蛋白从介质上增溶和洗脱。加入[/font][font=Calibri]0.1% Triton X-100 or 2% N-octylglucoside[/font][font=宋体]可以显著增加洗脱效率[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]c. proteinA[/font][font=宋体]柱进行蛋白纯化时注意点[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri](1)[/font][font=宋体]介质的选择[/font][font=Calibri]A,G or [/font][font=宋体]其他,其结合能力的选择[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](2)[/font][font=宋体]上样流速尽量小,让[/font][font=Calibri]Protein G[/font][font=宋体]和抗体有充分的结合时间[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](3)[/font][font=宋体]在低[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值洗脱后,快速中和。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](4)[/font][font=宋体]长时间保存加入[/font][font=Calibri]0.02-0.05[/font][font=宋体]%叠氮钠;[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](5)[/font][font=宋体]加入[/font][font=Calibri]10%[/font][font=宋体]甘油,可有效防止疏水作用引起的聚集。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](6)[/font][font=宋体]抗体纯度不够,杂蛋白含量高,易引起蛋白的沉淀。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]目前义翘神州提供[url=https://cn.sinobiological.com/services/recombinant-protein-expression-service]重组蛋白表达服务[/url],包含[/font][font=Calibri]VLP[/font][font=宋体]形式的膜蛋白表达服务、原核([/font][font=Calibri]E. coli[/font][font=宋体])蛋白表达服务、哺乳动物细胞瞬时表达服务、杆状病毒[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]昆虫细胞蛋白表达服务、稳定细胞系构建服务等,想咨询蛋白纯化服务的用户,可以直接[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/recombinant-protein-expression-service[/font][/font]
(一)原理凡盐析所获得的粗制蛋白质(盐析得到的IgG)中均含有硫酸铵等盐类,这类将影响以后的纯化,所以纯化前均应除去,此过程称为“脱盐”(desalthing)。脱盐常用透析法和凝胶过滤法,这两种方法各有利弊。前者的优点是透析后析品终体积较小,但所需时间较长,且盐不易除尽;凝胶过滤法则能将盐除尽,所需时间也短,但其凝胶过滤后样品体积较大。所以,要根据具体情况选择使用。前实验中样品体积较小,凝胶达滤后样品体积不会太增加,所以选用凝胶过滤法。(二)试剂与器材(1)Sephadex G-25。(2)0.0175mol/L,pH6.7磷酸盐缓冲液。(3)奈氏(Nessler)试剂:于500ml锥形瓶内加入碘化钾150g,碘110g,汞150g及蒸馏水100ml。用力振荡7~15min,至碘的棕色开始转变时,混合液温度升高,将此瓶浸于冷水内继续振荡,直到棕色的碘转变为带绿色的碘化钾汞液为止。将上清液倾入2000ml量筒内,加蒸馏水至2000ml,混匀备用。(4)20%(W/V)磺基水杨酸溶液。(5)1.5cm×20cm层析柱。(6)黑、白比色磁盘。
[font=宋体]蛋白纯化介质在研究目的蛋白的结构、功能以及相互作用过程中起着至关重要的作用。亲和层析法因其出色的选择性、结合力和分辨率,成为一种常用的蛋白和抗体纯化方法。义翘神州提供的多种亲和纯化介质,不仅简单易用,而且适用于批量操作或重力驱动的纯化过程。这些介质能够高效、便捷、可靠地分离蛋白和抗体,为下游应用提供了强有力的支持,确保实验结果的可靠性和重复性。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]亲和层析法的原理[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]亲和层析法是利用生物大分子与特定分子间特异性、可逆结合的特性,实现生物大分子的分离。作为蛋白质分离的有效手段,通常仅需一步操作,即可获得高纯度的蛋白质。在亲和层析中,蛋白质的分离基于其与特定配体的特异性相互作用,而非共价结合的能力。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]凝胶过滤层析,又称分子筛层析法,是一种独特的蛋白质分离和纯化技术。当样本流经葡聚糖凝胶或琼脂糖凝胶等介质时,这些介质根据蛋白质的大小和形状进行筛选。经过这一过程,目的蛋白得以纯化,为后续的下游应用提供了高质量的原料。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]亲和层析操作步骤:[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]在进行亲和层析时,需将蛋白在适宜的条件下加载至柱子上,确保蛋白(或标签)与其配体之间能够发生特异性结合。随后,通过洗涤步骤,清除与固定相发生非特异性结合的污染蛋白,同时保持蛋白与配体之间的特异性相互作用不受干扰。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]接下来,采用含有竞争性分子的缓冲液进行洗脱,竞争性分子能够与配体结合,从而将目标蛋白从柱子上取代下来。这一步中,竞争分子通常会在后续的色谱流程或透析处理中予以去除。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]通过以上步骤,亲和层析成功实现了目标蛋白的纯化和分离,为后续的实验和应用提供了高质量的原料。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]更多详情请关注:[url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-by-ac][b]亲和层析纯化蛋白[/b][/url][/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-by-ac[/font][/font][font=Calibri] [/font]
[color=#dc143c]最近版里原创热风呼呼的刮~~于是我也特来跟风积极参与!近来一直在做包涵体的复性与纯化,就特来与大家分享,希望大家多多支持、指点[em09511][/color][b]1.包涵体的分离纯化[/b] 蛋白质的纯化是基因工程下游的关键内容,以包涵体形式表达的重组蛋白质的纯化研究一直是重组基因工程药物研究中的热点和难点。重组蛋白在宿主系统中高水平表达时,无论是用原核表达体系或酵母表达体系甚至高等真核表达体系,都可形成包涵体。蛋白表达后的分离纯化对蛋白的规模化生产也是至关重要的,所以本实验通过采用稀释复性、透析复性、离子交换层析、凝胶过滤层析等实验方法,研究探讨对分离纯化以及蛋白复性的最佳方法和条件。[b]1.2.1包涵体的复性[/b] 重组蛋白质在分离纯化的过程中, 必须维持一定的浓度和生物活性形式, 以及防止被降解。从包涵体中获得有生物活性的蛋白,需要寻找一种简单而有效的复性方法。在小规模的蛋白复性研究及其进一步的纯化中,稀释复性是最常用的方法。但是稀释复性在商业规模生产中具有一定的缺陷,如需要较大体积的复性液,以及需要附加的浓缩步骤。许多其他方法也已发展起来,例如:透析、渗透、低分子量辅助物添加复性、离子和无离子表面活性剂辅助复性、聚乙烯乙二醇辅助复性等方法。 在折叠反应中,从伸展态到中间体的速度是非常快的,只需要几毫秒,但从中间体转变为天然态的过程比较缓慢,是一个限速过程。聚集过程与复性过程相互竞争,故而应尽量避免聚集体的产生。一般认为,蛋白质在复性过程中涉及两种疏水作用,一是分子内的疏水相互作用,可促进蛋白质正确折叠 一是部分折叠的肽链分子间的疏水相互作用,在复性过程中,部分折叠的中间体的疏水簇外露,分子间的疏水相互作用会导致蛋白质聚集。蛋白质的立体结构虽然由其氨基酸的顺序决定,然而伸展肤链折叠为天然活性结构的过程还受到周围环境的影响,如温度、pH值、离子强度、复性时间等因素的影响。[b]1.2.2包涵体离子交换层析纯化[/b] 为了获得高纯度的活性蛋白, 需要对复性的蛋白质进行进一步纯化。根据分离目标蛋白的特点(如P I、疏水性、氨基酸组成, 分子量大小、表面电荷的分布状况) , 然后确定分离方法, 从而正确选择最有效的分离介质,本实验采用SP Sepharose F.F 阳离子交换层析分离纯化重组蛋白 离子交换层析是以蛋白质分子净电荷和表面电荷分布为分离基础的。具体说就是利用蛋白质带电性的差异,在离子吸附剂上静电吸附能力不同,用不同的pH 离子强度洗脱液洗脱,从而使蛋白质分离的柱层析方法。离子交换又分为阴离子交换和阳离子交换。离子交换剂又有强弱之分,强的离子交换剂在整个pH 范围内都是离子化的,而弱的离子交换剂通常仅在pH6~9 之间是离子化状态,因而后者对所适用的pH 范围又有了进一步的限制。 在洗脱方式上,阳离子交换主要是改变pH ,它主要应用于等电点大于5 的蛋白质。20 种氨基酸中,大部分带正电或负电,这是IEC 应用范围广的原因。离子交换层析处理量大,附载系数高,一步缩小样品体积很多。离子交换层析去除杂质能力强,如对热原质,核酸、及电荷性有差别的蛋白均可去除。它还有一个特点,利用蛋白质在不同pH 和盐浓度下带电性的不同,通过不同条件下应用同种类型或不同类型介质,分步使目标蛋白质达到提纯目的,这是除亲和柱层析外,别的柱层析达不到的分离能力。离子交换层析原则上可放在纯化工艺的任何一步,它属吸附型层析,单步损失也较大。
[font=宋体]蛋白质的分离纯化是生物科学领域中的一项关键技术,它涉及到从复杂的混合物中分离并纯化出特定的蛋白质。这个过程通常包括多个步骤,每个步骤都需要精确的操作和优化,以确保最终得到的蛋白质具有高纯度和活性。下面我们将详细介绍蛋白质的分离纯化步骤。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]分离纯化某一特定蛋白质的一般程序可以分为前处理、粗分离、精细分离三个步骤。[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]①前处理[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]分离纯化某种蛋白质,首先要把蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来并保持原来的天然状态,不丢失生物活性。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]为此,动物材料应先剔除结缔组织和脂肪组织,种子材料应先去壳甚至去种皮以免受单宁等物质的污染,油料种子最好先用低沸点的有机溶剂如乙醚等脱脂。然后根据不同的情况,选择适当的方法,将组织和细胞破碎。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]动物组织和细胞可用电动捣碎机或匀浆机破碎或用超声波处理破碎。植物组织和细胞一般需要用石英砂或玻璃粉和适当的提取液一起研磨的方法或用纤维素酶处理也能达到目的。细菌细胞的破碎比较麻烦,破碎细菌细胞壁的常用方法有超声波破碎,与砂研磨、高压挤压或溶菌酶处理等。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]组织和细胞破碎后,选择适当的缓冲液把所要的蛋白提取出来。细胞碎片等不溶物用离心或过滤的方法除去。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]如果所要的蛋白主要集中在某一细胞组分,如细胞核、染色体、核糖体或可溶性细胞质等,则可利用差速离心的方法将它们分开,收集该细胞组分作为下步纯化的材料。如果碰上所要蛋白是与细胞膜或膜质细胞器结合的,则必须利用超声波或去污剂使膜结构解聚,然后用适当介质提取。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]②粗分离[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]当蛋白质提取液(有时还杂有核酸、多糖之类)获得后,选用一套适当的方法,将所要的蛋白与其他杂蛋白分离开来。一般这一步的分离用超滤、盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法。这些方法的特点是简便、处理量大,既能除去大量杂质,又能浓缩蛋白溶液。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]③精细分离[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]样品经粗分级分离以后,一般体积较小,杂蛋白大部分已被除去。进一步纯化,一般使用层析法包括离子交换层析、亲和层析、疏水层析以及分子筛等。必要时还可选择电泳法,包括区带电泳、等电点聚焦等作为最后的纯化步骤。用于细分级分离的方法一般规模较小,但分辨率很高。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]结晶是[url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification][b]蛋白质分离纯化[/b][/url]的最后步骤。尽管结晶过程并不能保证蛋白一定是均一的,但是只有某种蛋白在溶液中数量上占有优势时才能形成结晶。结晶过程本身也伴随着一定程度的纯化,而重结晶又可除去少量夹杂的蛋白。由于结晶过程中从未发现过变性蛋白,因此蛋白的结晶不仅是纯度的一个标志,也是断定制品处于天然状态的有力指标。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州提供[url=https://cn.sinobiological.com/services/recombinant-protein-expression-service][b]重组蛋白表达服务[/b][/url][/font][font=宋体],可以根据客户需求,选用不同表达[/font][font=Calibri]/[/font][font=宋体]纯化标签、表达宿主等,真正为客户实现深度私人定制。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]蛋白纯化详情:[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification[/font][/font]