质谱检测蛋白磷酸化位点方法

磷酸化蛋白质及多肽相关研究的技术进展 摘要磷酸化修饰是一种重要的蛋白质化学修饰,对蛋白质功能的完成或改变起到重要作用。该领域的研究存在很多技术难点,对该领域研究形成了挑战。近年来相关技术有了很多突破,磷酸化研究也取得了很多新的成就。文章将从磷酸化蛋白的检出、磷酸化蛋白质和肽段的富集、生物质谱技术的改进以及磷酸化蛋白和多肽的定量与比较几个方面介绍该研究领域的技术进展。关键词磷酸化蛋白磷酸化肽生物质谱定量分析生命活动与蛋白质的动态变化密切 摘要 磷酸化修饰是一种重要的蛋白质化学修饰, 对蛋白质功能的完成或改变起到重要作用。该领域的研究存在很多技术难点, 对该领域研究形成了挑战。近年来相关技术有了很多突破, 磷酸化研究也取得了很多新的成就。文章将从磷酸化蛋白的检出、磷酸化蛋白质和肽段的富集、生物质谱技术的改进以及磷酸化蛋白和多肽的定量与比较几个方面介绍该研究领域的技术进展。 关键词 磷酸化蛋白 磷酸化肽 生物质谱 定量分析

生命活动与蛋白质的动态变化密切相关, 很多情况下某些蛋白质是通过各种翻译后修饰来完成或改变其功能。在数量众多的蛋白质翻译后修饰中，蛋白质磷酸化修饰无疑是最重要的一类，它是指通过蛋白激酶（Protein kinase，PK）介导的酶促反应把磷酸基团从一个化合物转移到另一个化合物上的过程（Figure 1所示），是生物体内存在的一种普遍的调节方式。现今发现的所有人类蛋白质中超过30%可被磷酸化修饰，这一修饰在细胞信号的传递过程中占有极其重要的地位，与生命活动的许多过程都密切相关，对此的研究已经成为蛋白质科学的热点之一。 http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2012/09/1346918444_small.jpg磷酸化多肽（主要指肽链中的酪氨酸、丝氨酸和苏氨酸残基的侧链羟基被磷酸化生成酸式磷酸酯的修饰多肽）是研究蛋白质磷酸化过程的必不可少的工具，它可作为磷酸酶模型底物，或作为可产生抗磷酸化蛋白抗体的抗原，也可以在确定磷酸化蛋白的物理参数时作为参考化合物等。因此磷酸化多肽的合成在过去的几年中吸引了相当大的兴趣，目前已确定了较为成熟的合成路线，使磷酸化多肽的合成趋于常规。目前磷酸化多肽的合成主要有两个策略：后磷酸化法（Global phosphorylation）和单体法（Building block approach），如Figure 2所示。前者是在多肽序列合成结束后再在固相载体上对丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸的侧链羟基进行磷酸化，可以在同一次合成中同时得到带有和不带有磷酸化位点的多肽；而后者则将适当保护的磷酸化氨基酸直接引入到多肽序列中，操作较前者更为简单，现已成为磷酸化多肽合成的首选策略。在采用单体法构建磷酸化多肽时，目前广泛采用的原料为侧链单苄基保护的氨基酸：Fmoc-AA(PO(OBzl)OH)-OH (AA = Ser, Thr or Tyr)。这类保护的磷酸化位点由于侧链磷酸化基团的离子化而产生较大的位阻效应，并且磷酸化位点的引入往往能促进肽链二级结构的形成，故而磷酸化位点及其后的氨基酸的引入会比较困难。这些问题在合成含有多个磷酸化位点的多肽时将会变得尤为严重，往往会使最终产物的组成非常复杂，难以进行纯化，甚至直接导致合成的失败。http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2012/09/1346918477_small.jpg一般来讲，增加投料量和延长反应时间都能促使连接反应趋于完全，但增加投料量无疑会提高合成成本，对于较昂贵的带有保护的磷酸化氨基酸更是这样，而延长反应时间则可能增加其它副反应发生的风险，故而在合成磷酸化多肽时，需要对氨基酸投料量、反应方法以及反应时长等进行优化调整以期达到更理想、更经济的合成效果。我们有针对性地对磷酸化多肽合成条件进行了探索和调整，采用最终的优化条件成功合成了含有多达六个磷酸化丝氨酸残基的多肽：FAM-Ahx-X(pS)XX(pS)X(pS)X(pS)XX(pS)X(pS)-NH2（客户肽，详细序列未给出；其氨基端标记FAM以进行荧光检测），经过RP-HPLC纯化后最终纯品的纯度高达95%（见Figure 3）。http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2012/09/1346918493_small.jpg参考文献：1. P. Cohen, “The Role of Protein Phosphorylation in Neural and Hormonal Control of Cellular Activity”, Nature, 1982, 296 (5858): 613-620.2. From: http://en.wikipedia.org/wiki/Protein_kinase.3. L. A. Pinna, A. Donella-Deana, “Phosphorylated Synthetic Peptides as Tools for Studying Protein Phosphatases”, Biochim. Biophys. Acta., 1994, 1222 (3): 415-431.4. W. C. Chan, P. D. White, “Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis-A Practical Approach” (2000), Oxford University Press.

[font=宋体]磷酸化抗体是一种特殊的抗体，能够识别并结合到已经被磷酸化的蛋白质。磷酸化是一种重要的蛋白质修饰方式，通过将磷酸基团结合到特定的氨基酸残基上，可以改变蛋白质的结构和功能。在许多生物学过程中，磷酸化都扮演着重要的角色，因此磷酸化抗体成为了研究生物学和生物化学的重要工具。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]蛋白质磷酸化是指蛋白在激酶作用下在特定氨基酸位点（最常见的是丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸残基）发生磷酸化的过程。蛋白磷酸化是极其重要的翻译后修饰，其动态调控是信号转导中不可或缺的一环，调控着细胞生长、分化、代谢、凋亡等等过程。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]磷酸化抗体主要是针对磷酸化位点制备的，可以特异性识别磷酸化氨基酸位点，对磷酸化蛋白进行定性、定量分析，检测蛋白受刺激后磷酸化水平变化情况。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州可以为客户提供一系列具有高特异性（经内源性、磷酸化特异性等多方面验证）、高灵敏度（[/font][font=Calibri]1:200000[/font][font=宋体]稀释度）特点的磷酸化抗体，满足[/font][font=Calibri]WB[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]IHC[/font][font=宋体]等应用。同时我们还可以为客户提供定制化的磷酸化抗体定制服务。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]义翘神州磷酸化抗体服务优势：[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]①专业高效的多肽设计软件及高效偶联方法，保证多肽免疫成功率[/font][font=Calibri]95%[/font][font=宋体]以上。[/font][/font][font=宋体]②多种纯化策略，正负筛选平台，确保得到高特异识别指定磷酸化位点的抗体。[/font][font=宋体]③竞争性的价格[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州提供多种生物的制备服务，包括磷酸化兔多克隆抗体制备服务、磷酸化鼠单克隆抗体制备服务、磷酸化兔单克隆抗体制备服务[/font][font=宋体]……详情可以关注[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/phospho-specific-antibody-service[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]总之，义翘神州[url=https://cn.sinobiological.com/services/phospho-specific-antibody-service][b]磷酸化抗体定制服务[/b][/url]能够满足您的个性化需求，帮助您在研究领域获得更多的突破。我们致力于为您提供高质量、高效率的抗体定制服务，助力您的科研事业更上一层楼。[/font]

合肥国肽生物科技有限公司（简称：国肽生物TM）成立于2014年，是一家专业从事多肽产品的研发、生产和销售以及多肽技术转让的高新技术企业。BP公司成立之初，便成功收购了国内几家多肽、抗体公司，是目前国内的专业多肽合成、抗体制备、蛋白表达的规模型生产企业。国肽生物专长于荧光标记肽、同位素标记肽、人工胰岛素、药物肽、化妆品肽、长肽困难肽等产品的合成与研发，致力于学术水平的科研提升，搭建学术交流平台，促进前沿、专业的学术知识推广，推动多肽在生物医学材料等领域的研究与应用。公司产品广泛应用于药物研发，抗体的制备（包括单抗与双抗），荧光分子探针的构建以及细胞透膜研究、活体成像、新型材料研发和质谱分析等研究领域国肽生物按照客户定制要求供应高品质普通多肽。我们拥有成熟的多肽合成纯化方法，利用SPPS方法和液相合成方法为客户提供高品质多肽。我们的服务特点是:1. 纯度：我们提供粗品肽和纯度纯度为70%，75%，80%,85%,90%,95%,98%,99%的纯品多肽。2.脱盐和转盐：根据客户要求，我们可以对多肽进行脱TFA盐处理，也可以转为醋酸盐。3.交货期限：30个氨基酸之内，一般2-3周，最快1-2周。4.质量控制：每条多肽都免费提供合格的HPLC，MS和COA文件。5.售后服务：1-2周内可以提出异议，我们免费复测，不合格免费退货，1-3个月内使用不合格可以免费提供复测，样品免费保存3个月。国肽生物根据客户要求，供应各种修饰型多肽。1.磷酸化的Ser、Tyr和Thr修饰的多肽：我们提供单磷酸化和多磷酸化多肽服务，目前我们已经能够提供四个磷酸化位点修饰的多肽。2.5(6)-FAM，FITC，CY5，RhodamineB，PNA，EDNAS/dabcyl等荧光标记修饰的多肽：荧光标记修饰多肽技术是我们国肽生物的代表性多肽合成技术，我们的这项技术已经相当成熟。3.生物素Biotin，Lys(Biotin)修饰的多肽：生物素是维生素B2的组成部分，Biotin，Lys(Biotin)修饰的多肽也是客户经常定制的多肽。我们提供生物素修饰的多肽已经有将近100%的成功率。4.含有一对或多对二硫键修饰的多肽：二硫键在蛋白质的结构稳定中起到重要作用，目前我们已经能够为客户提供四对二硫键修饰的多肽。5.含有同位素C13，N15修饰的多肽：同位素标记的多肽主要应用于医学和生物学领域，通常价格较高，为了满足客户需要，我们接受微克级的同位素多肽定制。6.含有特殊氨基酸修饰的多肽：例如，D型氨基酸，氨基酸衍生物，脂肪族羧酸等等，都在我们接受的定制范围内。国肽生物提供150个氨基酸以内的长肽合成服务。多肽合成过程中，肽链过长时，经常会出现缺残基，氨基酸缩合困难等情况，基于这些现象，我们开发了三种有效提高反应成功率的方案：1. 微波合成法：对于合成过程中出现的一些难以缩合的氨基酸，我们采用微波法进行合成，该方法效果显著，并且大大缩短了反应时间。2. 片段合成法：当某些多肽用常规合成方法合成困难，我们也会采用将多肽中某一段的某几个氨基酸缩合之后作为一个整体缩合到肽链上去，这种方法也能够解决许多合成中存在的问题。3.酰肼合成法：酰肼法合成多肽的方法是将固相合成的 N末端Cys 多肽和 C末端多肽酰肼之间的化学选择性反应形成酰胺键而实现多肽的连接，该方法根据肽链中Cys的位置，将整条肽链分成多条序列分别合成，最终经过液相缩合反应得到目标肽，显著地提高了最终产物纯度，广泛适用于含有Cys的长链多肽的合成。国肽生物拥有成熟的长肽合成工艺，能够根据客户定制的多肽序列，快速有效地设计合成方案并迅速开始合成，更快更好的为客户提供所需的服务是我们不变的坚持。详情请咨询合肥国肽生物www.bankpeptide.com

6 质谱仪的最新进展用质谱检测蛋白，首先考虑到用PMF与 MALDI-TOF联用，如果无法检测，下一步就用ESI-MS/MS创建序列标签。在PMF分析中，MALDI的平板中只需一小部分样本就足以检测，剩下的样本就可以用来创建序列标签。并且，在MALDI-TOF仪器上，用一种叫做“源后延迟”的方法可以对只有部分序列的肽段进行检测。然而，用这个方法产生的质谱图比较难说明，精确性也很差。最近，用MALDI联合四级杆-时间质谱分析器[30，31]以及原始的MALDI-TOF/TOF[32]方法产生了。因此同一份标本可以首先考虑用PMF检测蛋白[33]，如果有必要的话，再用MS/MS创建序列标签。MALDI联合四级杆-TOF检测高通量蛋白是有希望的[31]。7 蛋白质组研究中的转录后修饰分析蛋白组分析很重要的一点就是能对蛋白表达水平以及转录后修饰，如磷酸化和糖基化进行研究。蛋白质的磷酸化是很有趣的，因为在信号转导途径中它扮演了重要的角色。最早检测蛋白质表达水平的方法是进行2-DE之前用35S-Met对样本进行代谢性标记，再在2-DE上进行放射自显影[34-36]。在凝胶中，不同蛋白的磷酸化和糖基化位点通常在凝胶中显示一连串蛋白质点，但是还需要做更详细的分析来确定修饰类型。蛋白质磷酸化的改变既可以用32P标记细胞，也可以用特异性磷酸化抗体做western blotting进行研究。如果用32P标记的方法，仍然需要做2-DE。经过凝胶比较后，把感兴趣的点从胶上切下来，然后用质谱鉴定[36]。Soskic使用的是印迹法，两个2-DE同时进行，一个用于做特异的磷酸化抗体实验，另一个做常规染色。蛋白质磷酸化和糖基化更为详细的特性可以用质谱来检测，但是需要更多的起始材料而不仅仅是二维凝胶上的一个点。另外这些分析不能产生直接的序列信息，技术上也比用质谱检测蛋白要难的多。在蛋白上查找磷酸化位点有很多种方法。为了检测消化后的混和肽中哪一个是磷酸化的，可以用MALDI-MS在磷酸化前后对混合肽做PMF分析：经过磷酸酯酶处理后，磷酸化的肽将会失去一个磷酸基团，分子量将比处理前小80Da.糖基化研究中，多聚糖从蛋白中释放出来，对多聚糖结构的检测就是从这些游离的多聚糖中得到的。一般把MALDI仪和外源性糖苷酶[37-40]联合使用进行检测。如果需要更为详细的信息，可以用ESI-MS联合使用前体离子扫描仪[41-44]。到目前为止，能够用电泳分离后的蛋白进行糖蛋白结构检测的报道很少。其中有一项研究是N端糖蛋白酶切以后用一维SDS-PAGE分离，然后用MALDI-MS以及外源性的糖苷酶进行结构分析[45]。8 用质谱研究蛋白-蛋白之间的作用经典的蛋白组学着重于研究蛋白质在何时何处表达。因为大部分的细胞功能都是由蛋白质复合体而不是由单个蛋白来执行的，所以鉴定蛋白质的成分和相互作用是非常重要的。这个过程可以用生物化学方法纯化蛋白质后用质谱来鉴定不同的成分，如人类剪接体的成分，酵母的核孔复合体[46]以及核蛋白体等都可以用此策略检测出来。一般的蛋白复合体是用亲和层析的方法纯化和分离，如免疫沉淀反应[47，48]。 DNA结合蛋白可以用同它们有特异性亲和力的核酸来分离，然后用质谱来鉴定[49]。Rigaut等人在串联层析的基础上，建立了一种通用的蛋白质复合体纯化方法[50]。在这个方法中，一种TAP标签和靶蛋白融合在一起，然后把蛋白转移到宿主细胞或者组织中，融合蛋白在宿主细胞和组织中能持续表达。TAP标签包括一种A蛋白和一种钙调蛋白，在标签之间有一个TEV蛋白酶切位点。用串联亲和层析法能将融合蛋白及与它相互作用的蛋白成分从细胞提取物中有效的分离，纯化出来。Rappsiber等人分别用亲和层析，交叉耦合以及质谱等方法[51]对酵母的核孔复合物Nup85p的亲和性进行研究。经过层析以后，用一维SDS-PAGE方法就可以分离蛋白复合体中的各个成分，因此二维电泳的不足之处就可以避免。同样也有可能直接用[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LC-MS[/color][/url]方法分析大分子量蛋白质复合体[52]。蛋白组分析的优越之处主要是用于蛋白和蛋白之间的相互作用以及蛋白的转录后修饰的研究，同时也可以用于基因表达水平的研究。质谱对于蛋白组分析来说是一项非常重要的技术，近年来仪器以及数据库软件的发展使得质谱成为能力更强大的工具。参考文献[1] O’Farrell PH. 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请问从sigma购买货号为C6780 的α-casein（α-酪蛋白）中，磷酸化的比例是多少？希望大家可以提供帮助，谢谢

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一、 前言基因工程已令人难以置信的扩展了我们关于有机体DNA序列的认识。但是仍有许多新识别的基因的功能还不知道，也不知道基因产物是如何相互作用从而产生活的有机体的。功能基因组试图通过大规模实验方法来回答这些问题。但由于仅从DNA序列尚不能回答某基因的表达时间、表达量、蛋白质翻译后加工和修饰的情况、以及它们的亚细胞分布等等，因此在整体水平上研究蛋白质表达及其功能变得日益显得重要。这些在基因组中不能解决的问题可望在蛋白质组研究中找到答案。蛋白质组研究的数据与基因组数据的整合，将会在后基因组研究中发挥重要作用。目前蛋白质组研究采用的主要技术是双向凝胶电泳和质谱方法。双向凝胶电泳的基本原理是蛋白质首先根据其等电点，第一向在pH梯度胶内等电聚焦，然后转90度按他们的分子量大小进行第二向的SDS-PAGE分离。质谱在90年代得到了长足的发展，生物质谱当上了主角，蛋白质组学又为生物质谱提供了一个大舞台。他们中首选的是MALDI-TOF，其分析容量大，单电荷为主的测定分子量高达30万，干扰因素少，适合蛋白质组的大规模分析。其次ESI为主的LC-MS联机适于精细的研究。本文将简介几种常用的生物质谱技术，并着重介绍生物质谱技术在蛋白质组学各领域的应用。二、 生物质谱技术1．电喷雾质谱技术（ESI）电喷雾质谱技术( Electrospray Ionization Mass Spectrometry , ESI - MS) 是在毛细管的出口处施加一高电压,所产生的高电场使从毛细管流出的液体雾化成细小的带电液滴,随着溶剂蒸发,液滴表面的电荷强度逐渐增大,最后液滴崩解为大量带一个或多个电荷的离子,致使分析物以单电荷或多电荷离子的形式进入气相。电喷雾离子化的特点是产生高电荷离子而不是碎片离子, 使质量电荷比(m/ z) 降低到多数质量分析仪器都可以检测的范围,因而大大扩展了分子量的分析范围,离子的真实分子质量也可以根据质荷比及电荷数算出。2．基质辅助激光解吸附质谱技术（MOLDI）基质辅助激光解析电离（MOLDI）是由德国科学家Karas和Hillenkamp发现的。将微量蛋白质与过量的小分子基体的混合液体点到样品靶上，经加热或风吹烘干形成共结晶，放入离子源内。当激光照射到靶点上时，基体吸收了激光的能力跃迁到激发态，导致蛋白质电离和汽化，电离的结果通常是基体的质子转移到蛋白质上。然后由高电压将电离的蛋白质从离子源转送到质量分析器内，再经离子检测器和数据处理得到质谱图。TOF质量分析器被认为是与MALDI的最佳搭配，因为二者都是脉冲工作方式，在质量分析过程中离子损失很少，可以获得很高的灵敏度。TOF质量分析器结果简单，容易换算，蛋白质离子在飞行管内的飞行速度仅与他的(m/z)-1/2成正比，因此容易通过计算蛋白质离子在飞行管内的飞行时间推算出蛋白质离子的m/z值。与传统质量分析器相比，更易得到高分辨率和高测量精度；速度快，离子飞行时间仅为几个μs和约100μs之间；质量范围宽，可以直接检测到几十万道尔顿的单电荷离子。飞行时间质量分析器被认为是21世纪最有应用前景的质量分析器。3．傅立叶变换－离子回旋共振质谱（FT-ICR MS）傅立叶变换-离子回旋共振质谱法(FT-ICR MS)是离子回旋共振波谱法与现代计算机技术相结合的产物。傅立叶变换-离子回旋共振质谱法是基于离子在均匀磁场中的回旋运动, 离子的回旋频率、半径、速度和能量是离子质量和离子电荷及磁场强度的函数, 当对离子施加与其回旋频率相同的射频场作用时, 离子将同相位加速到一较大的半径回旋, 从而产生可被接受的类似电流的信号。傅立叶变换-离子回旋共振质谱法所采用的射频范围覆盖了欲测定的质量范围,所有离子同时被激发, 所检测的信号经过傅立叶变换, 转换为质谱图。其主要优点有：容易获得高分辨；便于实现串极质谱分析；便于使用外电离源并与色谱仪器联用。此外，他还有灵敏度高，质量范围宽，速度快，性能可靠等优点。4．快原子轰击质谱技术（FABMS）快原子轰击质谱技术( Fast Atom Bomebardment Mass Spectrometry , FABMS) 是一种软电离技术,是用快速惰性原子射击存在于底物中的样品,使样品离子溅出进入分析器,这种软电离技术适于极性强、热不稳定的化合物的分析,特别适用于多肽和蛋白质等的分析研究。FABMS能提供有关离子的精确质量,从而可以确定样品的元素组成和分子式。而FABMS -MS 串联技术的应用可以提供样品较为详细的分子结构信息,从而使其在生物医学分析中迅速发展起来。三、蛋白质的分析鉴定随着质谱技术的发展，分子量的测定已从传统的有机小分子扩展到了生物大分子。MALDI-MS技术以其极高的灵敏度、精确度在蛋白质分析中得到了广泛的应用。该技术不仅可测定各种疏水性、亲水性和糖蛋白的分子量，还可直接测定蛋白质混合物的分子量。这可认为是蛋白质分析领域的一项重大突破。蛋白质组的研究是从整体水平上研究细胞或有机体内蛋白质的组成及其活动规律。质谱技术作为蛋白质组研究的三大支撑技术之一，除了用于多肽，蛋白质的分子量测定外，还广泛的应用于肽指纹图谱测定及氨基酸序列测定。肽指纹图谱(Peptide Mass Fingerprinting, PMF)测定是对蛋白酶解或降解后所得多肽混合物进行质谱分析的方法。质谱分析所得肽断与多肽蛋白数据库中蛋白质的理论肽断进行比较，判断出所测蛋白是已知还是未知。由于不同的蛋白质具有不同的氨基酸序列，不同蛋白质所得肽断具有指纹特征。采用肽指纹谱的方法已对酵母、大肠杆菌、人心肌等多种蛋白质组进行了研究。对肽序列的测定往往要应用串连质谱技术，采用不同的技术选择特定质核比的离子，并对其进行碰撞诱导解离，通过分析肽段的断裂情况推导出肽序列。四、后转录修饰的蛋白质的检测和识别在蛋白质组的研究中，蛋白质和多肽的序列分析已不局限于阐明蛋白质的一级结构，对翻译后的修饰的进一步分析也是蛋白质化学的一项重要任务。这种修饰对于蛋白质的功能非常重要，如：细胞识别中的蛋白质相互作用，信号传导和蛋白质定位。1． 蛋白质的糖基化糖蛋白在细胞内部，细胞膜和细胞外均有发现，实际上大部分蛋白质是糖蛋白。对糖蛋白的检测和分析发现，糖蛋白中糖组分的结构和功能具有多样性。糖蛋白中的糖通常是不同种类的，而且是由一些可控数量的单糖组成。糖基化的多样性与细胞周期，细胞分化和发展的状态有关。在蛋白组时代中，蛋白质的修饰会引起其理化性质的改变，因此是不容忽视的。从1D或2D凝胶得到的糖基化蛋白的识别，一般是进行MALDI-MS指纹分析， 或是对MALDI-PAD或ESI-MS/MS得到的碎片谱进行分析。对完整的糖蛋白的研究是非常困难的，所有已知的离子化技术都有其局限性。目前，人们主要研究糖肽，其好处之一就是质量减小了，这就会得到更好的分辨率，而且糖肽仍保留了糖基化位点。将分离的糖蛋白用不同的蛋白酶消化后就可进行糖肽的研究。一旦糖肽被识别出，就可以用串连质谱(ESI-MS/MS)来阐明肽序列。当蛋白的序列已知时，计算质量差就可推出其上附着的寡糖的质量。要将糖部分从糖蛋白中释放出来，可用化学切割或酶切割（流程图见图1）。目前，连有结构专一性糖苷酶的质谱在提供序列，分支和链接数据方面是最有力的技术。对于N糖基化常用的糖苷内切酶有PNGase-F, PNGase-A, EndoF和EndoH。化学切割也可以用来释放O-连接和N-连接的多糖，但经常出现的缺点是他会完全破坏所有的肽键，因而丢失了关于糖附着位点的信息。而且这些切割不能从糖肽中连续释放单糖。用肼的化学切割可以除去两种类型的糖基化。在60℃可专一性的释放O-连接的糖，而在95℃能释放N-连接的糖。释放O-原子更常用的方法是用碱进行β消除。通常，糖基中加入金属离子在MALDI和ESI中离子化。用MALDI-MS分析糖类的一个好的选择是将之与其他一些化合物混合，这样可以进一步提高灵敏度和分辨率。不同的质谱方法可以产生多糖的源后裂解(PSD)和碰撞诱导解离 (CID)谱，这可以给出有关糖的序列，分支及糖间的连接等信息。2． 蛋白质的磷酸化蛋白质中氨基酸的磷酸化在生命系统中起重要的作用。磷酸化经常作为分子开关控制不同过程蛋白质的活性，如新陈代谢，信号传导，细胞分裂等过程。因此，蛋白质中磷酰氨基酸的识别在蛋白质分析中是一项重要的工作。已知的磷酰氨基酸的类型有四种：1．O-磷酸盐，通过羟氨酸的磷酸化形成的，如丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸。2．N-磷酸盐，通过精氨酸，赖氨酸或组氨酸中的氨基的磷酸化形成的。3．乙酰磷酸盐，通过天冬氨酸或谷氨酸的磷酸化形成的。4．S-磷酸酯，通过半胱氨酸的磷酸化形成的。

【题名】毛细管区带电泳测定酪蛋白磷酸肽方法的研究【期刊名】中国食品学报【年、卷、页】2002年2卷第二期【作者】牟光庆【正文】摘要：用毛细管区带电泳(CZE )时酪蛋白磷酸肤(CPP)进行了分离和测定。研究出的适宜电泳操作条件为:工作电压30KV、柱温259C、毛细管长度50cm、内径70prn、进样量5sec(气压进样)、紫外检测波长200nm,缓冲液pH值9.20测定不同N/P样品的CPP含量分别为42.2%, 50.0%, 51.0%.见附件主要问题：1、毛细管区带电泳法测蛋白质含量是否准确？2、一般都可以测什么类型的蛋白质？

PS1利用基质辅助激光解吸电离-飞行时间（MALDI-TOF）技术来表征生物分子。样品溶于固定的底物中形成晶体，用激光脉冲使其离子化，离子被加速后通过飞行管时分离，所有离子均可被检测。系统包括三个组成部件：样品点样制备工作站（SymBiot 1）、生物质谱工作站（Voyager-DE PRO）和自动化分析软件（AutoMS-Fit）。SymBiot1 是一个自动样品处理系统，支持亚微升级微量点样，具有快速省时、重现性好的特点；Voyager-DE PRO是为蛋白质组研究专门设计的自动飞行时间质谱分析系统，配有AB公司之专利—延迟检测技术，具有高分辨率、质荷比宽等特点；AutoMS软件可以批处理方式或实时动态方式检索Protein Prospector蛋白数据库或您指定的蛋白数据库，查询参数可以任意设定，检索结果以Microsoft Access格式分类编号及储存。 PS 1技术平台建立伊始便受到了许多蛋白质课题研究组的关注。中国科学院上海生物化学研究所戚正武院士课题组从猪肝中提取某一活性蛋白组分，该组分理化性质不清楚，天然含量十分低，并无相关文献报道。用HPLC分离以后对活性组分的成分不能确定。上海基康生物技术有限公司运用PS 1系统对HPLC分离后的活性组分作了质谱分析，仅在一个工作日内就精确确定该组分由分子量极为相近的几种蛋白质构成，分子量精确度达到10 ppm。后经HPLC再次细分（洗脱梯度增加了2.5倍），证实了质谱的结论。此活性组分曾滤过1kD分子筛，基康的质谱数据纠正了研究人员过去对该活性组分分子量的误判，为研究人员明确实验方向、优化实验步骤提供了强有力的依据。 PS1除了可以进行生物大分子的精确分子量测定，还可用于蛋白的肽指纹图谱分析(peptide mass fingerprint，PMF)，提供相关生物信息学服务，并且还可以利用源后衰变（Post Source Decay，PSD）技术来获得样品的MS/MS数据，以得到一级结构信息。PSD方法通常增加了激发激光的功率，使其超过产生一般肽指纹谱图所需功率的阈值，过剩的能量使前体离子在源内离子化之后发生裂解，产生一系列碎片离子，在反射器的作用下，最终可以得到一张连续的碎片离子图谱。经特定的软件分析后，即可在数据库中检索到肽段的氨基酸序列。利用PSD分析技术，还可以对磷酸化，糖基化等翻译后修饰进行定位分析，同样也可以鉴定产生翻译后修饰肽段的蛋白质。Neville et al.（1997）将这一方法成功的用于磷酸肽的序列分析。作为重要的蛋白质鉴定手段之一，PS1的精确度可以达到10 ppm，灵敏度为fmol，分子量检测范围可达到500 kDa，每天可自动分析40-100个样品，适用于大规模“蛋白质组学”研究。

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欢迎大家讨论一下自己做质谱的经验心得，在医疗领域和其他众多领域质谱无疑是以后发展的科研和临床应用的主流方向，其配套仪器业发展的很快，如气象色谱、液相色谱、毛细管电泳等等。因为应用领域广，讨论的范围肯定很大，大家可以各抒己见啊。我是做蛋白磷酸化修饰的，也是刚跟质谱打交道，所以很想听听各位高手的高见啊，欢迎，O(∩_∩)O谢谢。

在婴幼儿配方乳粉中常见一添加剂-酪蛋白磷酸肽CPP，欢迎跟帖讨论。

生物质谱技术在细胞生物学中的应用桑志红 王红霞 综述　概 论 蛋白分离与显色 蛋白质鉴定 数据库查寻 灵敏度 具体示例 展望未来（相关文献）摘 要 基因组计划的飞速发展使我们提早进入"后基因组时代"，而质谱技术的重要进展使得通过酶解、质量分析、序列分析及其数据库检索对蛋白质进行高通量快速鉴定的技术方法应运而生，并成为"后基因组时代"的关键核心技术。这种技术的应用范围已经从细胞,组织以及整个有机体中蛋白质的表达到蛋白质翻译后修饰等等方面。本文简要综述生物质谱技术在细胞生物学等学科中的应用。　 过去的十年经历并见证了生命科学革命性的变化. 大规模基因组测序技术的问世使人类基因组计划最终目标的实现比预期一再提前。与此同时，近几年间已有10余种模式生物的基因组序列测定告罄，3年内还将有40种左右生物的基因组全序列问世。因此大多数人同意我们现在已经提早进入"后基因组时代"（post-genome era）, 目前我们所面临的挑战是如何破解基因组计划已获得的大量序列信息并加以应用。这个问题的关键是基因的生物学功能不能只通过对核酸一级结构(序列)的检测来确定。研判一个未知基因的功能、与其他基因产物及其亚细胞结构之间的功能联系, 最终都必须通过在蛋白水平对基因产物的研究才能确定。蛋白质组这个名词是近几年才提出来的，它用来描述一个细胞的全部蛋白质,而在蛋白水平上进行大规模的研究引出了新的术语蛋白质组学。蛋白质表达图谱是依靠蛋白质显示技术和精确定量技术对细胞或组织中蛋白质表达总况进行比较（2）, 这个领域最近已有综述（11）。细胞图谱蛋白质组学是指应用生物质谱技术鉴定蛋白质及其相互作用并确定在亚细胞中的定位。本文的目的是 简要综述生物质谱技术在细胞生物学领域中越来越多的应用，并为该领域正考虑应用这种技术的研究者提供一些的有用的信息。 作为一个新的研究领域，蛋白质组学发展的关键是近年来质谱技术的革新。这种革新极大地促进了质谱技术在生命科学研究中的应用。质谱现在可以作为将各种蛋白质与序列数据库联系起来的桥梁。生物质谱根据质量数和所载电荷数不同的多肽片断在磁场中产生不同轨道而以质荷比（m/z）方式来分离它们。80年代末，随着两种崭新的尤其适合蛋白质研究的软电离方式ESI（电喷雾电离）和MALDI（基质辅助激光解吸附电离）的出现，质谱成为现代蛋白质科学中最重要和不可缺少的组成部分。 生物质谱最强大的应用功能之一是能够鉴定蛋白质复合物的组成成分（19）。细胞中一些最重要的生命过程都是通过多蛋白质复合体来执行和调节的，但由于蛋白质鉴定的困难，大多数上述蛋白复合体都是未知的。生物质谱灵敏度的不断提高显著地促进了对具有生物学功能和治疗潜力的蛋白复合体的鉴定，例如，NF-k B信号通路，CD95（FAS/APO-1）介导的细胞死亡途径，和核受体介导的转录信号传导过程中形成的蛋白复合体。在某些情况下，复合物可通过常规蛋白纯化的方法进行纯化，如剪接体复合（25），酵母纺锤体复合物（29）及VHL肿瘤抑制复合物（18）。然而，更常见的是，复合物中的组成成分通过一步免疫沉淀或免疫亲和步骤后就可纯化，这种方法甚至可以用于鉴定那些用常规蛋白纯化和鉴定技术所不及的一些过渡态或不稳定的复合物。因为生物质谱技术的介入，现在已经不再需要通过抗体进行免疫印迹实验，而是通过生物质谱技术对免疫沉淀获得的蛋白复合体组分直接进行蛋白序列分析。以酵母P24复合物鉴定为例，应用上游表位标签策略有可能不需制备抗目标蛋白的抗体就能对蛋白质复合物进行鉴定（13）。这种方法（36）对于基因组序列已完全清楚和遗传稳定的生物（如芽殖酵母,啤酒酵母）尤为简便, 例如对RENT复合物和促有丝分裂后期复合物（49）。因为这种方法的成功应用，使人们对上游表位标签策略－蛋白纯化－生物质谱分析的方法兴趣倍增。值得一提的是，将能被特殊蛋白酶切除的连接子（接头）掺入表位标签是尤为有利的（如下所述）。 上述方法是通过识别蛋白复合物中相互作用和配对的各组分而达到对蛋白鉴定的目的，另一种策略则是通过对分离纯化的细胞器蛋白组成进行鉴定而在亚细胞水平对蛋白质定位.　用这种方法确定蛋白质位置,　对评价蛋白质潜在的功能将是大有帮助的.　应用这种方法，我们称为细胞器蛋白质组学,　已经发现正常工作状态下的细胞器含有比我们以前所知道的数量多得多的蛋白种类。然而实际上，由于质谱极高的分辨率和灵敏度，纯化后的细胞器组分即使只有微量的混杂，也能被质谱分辨并误认为是细胞器的组成部分。因此，如何充分的纯化以保证至少绝大多数被鉴定的蛋白质都来自同一种细胞器，成为制约上述工作的瓶颈。 蛋白质翻译后修饰也是蛋白鉴定工作中的一个重要方面。根据DNA序列信息并不能可靠预测或推导出蛋白质翻译后的修饰。而质谱技术已经被证明对研究蛋白质翻译后的修饰（例如磷酸化和糖基化）是极为有用的，特别是对序列已知的蛋白的鉴定。例如:Betts等人（1a）用这种方法成功地鉴定了从小鼠大脑中分离的神经纤维蛋白体内磷酸化位点。同样方法, Wong等人（45）确定了钙联蛋白质（calnexin)C未端的磷酸化位点。在糖基化的例子中, Carr等人（5）采用液相色谱与质谱联用技术选择性地鉴定了糖蛋白中N- 和O-联接的寡糖. 稍后, 本文将会通过对E-选择素中糖基化位点的鉴定来进一步说明这种方法.

请问Q-TOF和MALDI-TOF的区别？这两种质谱的特点，能不能检测出蛋白的磷酸化位点，谢谢！！！

蛋白质分子量肌球蛋白甲状腺球蛋白β-半乳糖苷酶副肌球蛋白磷酸化酶a血清白蛋白L-氨基酸氧化酶地氧化氢酶丙酮酸激活酶谷氨酸脱氢酶亮氨酸氨肽酶γ-球蛋白，H链延胡索酸酶（反丁烯二酸酶）卵白蛋白醇脱氢酶（肝）烯醇酶醛缩酶肌酸激酶胃蛋白酶原D-氨基酸氧化酶醇脱氢酶（酵母）甘油醛磷酸脱氢酶原肌球蛋白乳酸脱氢酶胃蛋白酶转磷酸核糖基酶天冬氨酸氨甲酰转移酶，C链羧肽酶 A碳酸酐酶枯草杆菌蛋白酶γ-球蛋白，L链γ-blobulin,L chain糜蛋白酶原（胰凝乳蛋白酶原）木瓜蛋白酶（羧甲基）β-乳球蛋白[font=Tim

[color=#444444]样品是磷酸化多肽，我们的仪器是[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]液质联用[/color][/url]的ESI质谱，老师说拿测出来的质谱图和MALDI质谱测出来的图对照，如果找到相应的峰（去卷积后的数值和maldi的数值减去1相同），就说明测到了磷酸化多肽，我一直想不明白，有没有大神替我解释一下这是为什么？[/color]

[font=system-ui, -apple-system, &][size=16px][color=#333333]（1）磷酸化修饰。[/color][/size][/font] [font=system-ui, -apple-system, &][size=16px][color=#333333]蛋白质磷酸化是由蛋白激酶催化的磷酸基转移反应，是最常见、最重要的蛋白质修饰方式之一。[/color][/size][/font] [font=system-ui, -apple-system, &][size=16px][color=#333333]蛋白质磷酸化修饰的具体生物效应包括：改变被修饰蛋白质的活性、改变蛋白的亚细胞内定位、改变蛋白与其他蛋白或其他生物分子的相互作用。[/color][/size][/font] [font=system-ui, -apple-system, &][size=16px][color=#333333]①催化蛋白质磷酸化的蛋白激酶，根据底物的磷酸化位点可分为三大类，蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶、蛋白质酪氨酸激酶、双专一性蛋白激酶。[/color][/size][/font] [font=system-ui, -apple-system, &][size=16px][color=#333333]②催化蛋白质去磷酸化的蛋白磷酸酶，根据磷酸化的氨基酸残基不同可分为两类，蛋白质丝氨酸/苏氨酸磷酸酶和蛋白质酪氨酸磷酸酶。[/color][/size][/font] [font=system-ui, -apple-system, &][size=16px][color=#333333]（2）甲基化修饰。[/color][/size][/font] [font=system-ui, -apple-system, &][size=16px][color=#333333]蛋白质甲基化是指在甲基转移酶催化下，甲基基团由S-腺苷甲硫氨酸转移至相应蛋白质的过程。[/color][/size][/font] [font=system-ui, -apple-system, &][size=16px][color=#333333]蛋白质甲基化修饰可产生多种不同的生物效应，包括影响蛋白质间的相互作用、蛋白质和RNA间的相互作用、蛋白质的定位、RNA加工、细胞信号转导等。[/color][/size][/font] [font=system-ui, -apple-system, &][size=16px][color=#333333]催化蛋白质甲基化的酶：甲基转移酶。[/color][/size][/font] [font=system-ui, -apple-system, &][size=16px][color=#333333]（3）乙酰化修饰。[/color][/size][/font] [font=system-ui, -apple-system, &][size=16px][color=#333333]蛋白质乙酰化是指在乙酰基转移酶的催化下，在蛋白质特定的位置添加乙酰基的过程。蛋白质乙酰化修饰所产生的生物效应，主要包括促进基因转录、诱导细胞自噬、调节代谢酶的活性及代谢通路。[/color][/size][/font] [font=system-ui, -apple-system, &][size=16px][color=#333333]催化蛋白质乙酰化的酶：组蛋白乙酰基转移酶。[/color][/size][/font] [font=system-ui, -apple-system, &][size=16px][color=#333333]（4）类泛素化修饰。[/color][/size][/font] [font=system-ui, -apple-system, &][size=16px][color=#333333]小泛素相关修饰物（SUMO）是类泛素蛋白家族的重要成员之一，可与多种蛋白结合发挥相应的功能。SUMO化修饰可参与转录调节、核转运、维持基因组完整性及信号转导等多种细胞内活动。[/color][/size][/font] [font=system-ui, -apple-system, &][size=16px][color=#333333]①SUMO的分类：SUMO蛋白分布广泛，人类基因组编码了4种不同SUMO蛋白，分别为：SUMO1、SUMO2、SUMO3和SUMO4。其中，SUMO1-3在各种组织中均有表达，而SUMO4则主要在肾脏、淋巴结和脾脏中表达。[/color][/size][/font] [font=system-ui, -apple-system, &][size=16px][color=#333333]②催化蛋白质SUMO化修饰的酶。SUMO化修饰需要一系列酶的参与，包括E1活化酶，E2结合酶以及E3连接酶。[/color][/size][/font] [font=system-ui, -apple-system, &][size=16px][color=#333333]（5）巴豆酰化修饰。[/color][/size][/font] [font=system-ui, -apple-system, &][size=16px][color=#333333]作为一种新型组蛋白翻译后修饰方式，蛋白质巴豆酰化是一种进化上高度保守，且在细胞生物学功能上完全不同于组蛋白赖氨酸乙酰化的蛋白质修饰方式。[/color][/size][/font] [font=system-ui, -apple-system, &][size=16px][color=#333333]蛋白质巴豆酰化是指在巴豆酰基转移酶的催化下，在蛋白质特定的位置添加巴豆酰基的过程。组蛋白赖氨酸巴豆酰化修饰与基因的活化密切相关。此外，催化蛋白质巴豆酰化的酶是巴豆酰基转移酶。[/color][/size][/font]

食品安全国家标准 食品营养强化剂 酪蛋白磷酸肽

褚福亮,王福生, 中国人民解放军第302医院全军艾滋病与病毒性肝炎重点实验室 北京市 100039项目负责人 王福生, 100039 ,北京市丰台路26号, 中国人民解放军第302医院全军艾滋病与病毒性肝炎重点实验室. fswang@public.bta.net.cn电话:010-66933332 传真:010-63831870收稿日期 2002-08-15 接受日期 2002-09-03摘要新近广泛应用蛋白质芯片（ProteinChipâ Array）系统成功鉴定出了一些重要疾病（如肿瘤和危害性较大的传染病）新的、特异性的生物标记（biomarkers）,后者不仅在生物医学的基础方面具有重要的科学价值,而且在临床疾病的诊断、治疗和预防发挥重要的指导作用,显示了良好的发展前景.本文就表面增强的激光解析电离-飞行时间-质谱（SELDI-TOF-MS）相关的原理、特点、在临床和基础研究中的应用新进展和未来的发展趋势做一综述.此外,我们就蛋白质谱分析技术在病毒性肝炎、肝硬化和肝癌等一系列肝病方面的应用策略和前景进行了分析.褚福亮,王福生. 蛋白质谱分析方法特点及其在蛋白组学研究领域中的应用.世界华人消化杂志 2002 10(12):1431-14350 引言人类基因组计划已经进入后基因组时代-即功能基因组时代[1]，作为基因功能的直接体现者-蛋白质，及其之间的相互作用越来越引起基础和临床科学家们的关注[2-6] .因为要彻底了解生命的本质，只把基因测出来还是不够的，还必须要了解其在生物生长、发育、衰老和整个生命过程中的功能、不同蛋白质之间的相互作用以及他们与疾病发生、发展和转化的规律[7-14] .正因为如此，有关上述问题的蛋白质组学研究成了今天生命科学最重要的焦点之一[15] .为了阐明蛋白质在上述生命现象中的作用和相关机制，人们设计了许多新的方法技术，如：二维电泳、质谱分析、微距阵列、酵母双杂交和噬菌体展示等，这些方法在一些特定的情况下，虽然显示出了他们各自不同的优点，但是同样也存在着较大的局限性，难以开展大规模、超微量、高通量、全自动筛选蛋白质等方面的分析，因而设计更全面、同时研究多种蛋白质相互作用的技术，在功能基因组和蛋白组学的研究中建立一个更有效的技术平台，成为本领域中优先关注的问题[16] .近来，美国Ciphergen（赛弗吉）公司研制的ProteinChipâ Array的仪器，并建立了一种新的蛋白质飞行质谱-表面增强的激光解析离子化-飞行时间-质谱（surface-enhanced laser desorption/inionation-time of flight-mass spectra， SELDI-TOF-MS），已取得可喜的进展，筛选出了许多与疾病相关的新型生物标志，不仅为临床疾病的诊断和治疗等提供了新的选择，而且在基础科学、新药研制和疾病预防等方面具有广泛的应用前景[16-18] .本文就SELDI-TOF-MS相关的原理、特点、在临床和基础研究中的应用新进展和未来的发展趋势做一综述.1 ProteinChipâ Array系统和SELDI-TOF-MS的特点1.1 蛋白质芯片系统的组成和原理 蛋白质芯片系统由三部分组成：蛋白质芯片、芯片阅读器和芯片软件.供研究用芯片上有6-10芯池，不同的芯片表面上的化学物质不同，芯片表面分为两大类：一类为化学类表面，包括经典的色谱分析表面，如：结合普通蛋白质的正相表面，用于反相捕获的疏水表面，阴阳离子交换表面和捕获金属结合蛋白的静态金属亲合捕获表面；另一类称为生物类，特定的蛋白质共价结合于预先活化的表面阵列，可以用来研究传统的抗体一抗原反应，DNA和蛋白质作用，受体、配体作用和其他的一些分子之间的相互作用[19] . 根据检测目的不同，可以选用不同的芯片，或者自己设计芯片.将样本和对照点到芯池上以后，经过一段时间的结合反应，用缓冲液或水洗去一些不结合的非特异分子，再加上能量吸收分子（energy absorbing molelule，EAM）溶液，使样本固定在芯片表面.当溶液干燥后，一个含有分析物和大量能量吸收分子“晶体”就形成了.能量吸收分子对于电离来说非常重要.经过以上步骤，就可经把芯片放到芯片阅读器中进行质谱分析. 在阅读器的固定激光束下，芯片上、下移动，使样本上每一个特定点都被“读”到.激光束的每一次闪光释放的能量都聚集在该区一个非常小的点上（focused laser beam，聚焦激光束）.这样，每个区都含有丰富的，可寻址（addressable）的位置.蛋白质芯片处理软件精确控制激光寻读过程.当样本受到激发，就开始电离和解除吸附.不同质量的带电离子在电场中飞行的时间长短不同，计算检测到的不同时间，就可以得出质量电荷比,把他输入电脑,形成图像[19].Ball et al [20]采用一种称为人工神经网络（artifical neural network,ANN）的算法处理出现的成千上万的峰，鉴定出三个分子量为13 454、13 457和14 278的生物标记分子，使疾病预测率达到97.1 %.1.2 ProteinChipâ Array芯片和SELDI-TOF-MS的特点 新型蛋白芯片与以往的蛋白芯片不同之处：SELDI-TOF-MS，他是在MALDI（matrix-assisted laser desorption/inionation）［21,22］基础上，改进后实行表面增强的飞行质谱.SELDI-TOF-MS优于MALDI-TOF表现为他不会破坏蛋白质，或使样本与可溶的基质共结晶来产生质谱信号.对SELDI-TOF来说，可以直接将血清、尿液、组织抽取物等不需处理直接点样检测[40] 由于一部分非特异结合的分析物被洗去，因而出现的质峰非常一致，有利于后期分析[23,24] . 与二维电泳相比：二维电泳分析蛋白质的分子量在30 KDa以上时电泳图谱较清楚，对在组织抽提物中占很大比例的低丰度的蛋白质不能被检出；其次，二维电泳胶上的蛋白质斑点很大一部分包含一种以上的蛋白质；而且，二维电泳耗时长，工作量大，对象染色转移等技术要求高，不能完全实现自动化.而SELDI-TOF在200 Da-500 KDa区间都可以给出很好的质谱，对一个样本的分析在几十分钟内就可以完成[19]，处理的信息量远远大于二维电泳；对于低丰度物质，即使浓度仅attomole(10-18)的分子，只要与表面探针结合，就可以检测到，这也是二维电泳所不具备的[24,25] . 对于微距阵蛋白芯片来说，需要一种不破坏折叠的蛋白质构象的固定技术，再与另外的蛋白质反应，经检测莹光来观察蛋白质之间的作用[26] .而基于SELDI-TOF-MS的ProteinChip分析蛋白质不需溶解、不需染色、廉价、针对性强. 因而蛋白质芯片仪具有以下优势：(1)可直接使用粗样本，如：血清、尿液、细胞抽提物等[27] .(2)使大规模、超微量、高通量、全自动筛选蛋白质成为可能；(3)他不仅可发现一种蛋白质或生物标记分子，而且还可以发现不同的多种方式的组合蛋白质谱，可能与某种疾病有关[28] (4)推动基因组学发展，验证基因组学方面的变化，基于蛋白质特点发现新的基因.可以推测疾病状态下，基因启动何以与正常状态下不同，受到那些因素的影响，从而跟踪基因的变化[2,14,15] . 其存在的问题：对于不同的样本，根据检测的目标采取或者设计几种芯片，理论上可以把所有的相同性质蛋白质捕获，但是实际上仍有少量的分子没与表面探针结合.使用SELDI-TOF-MS，仅能给出蛋白质的分子量，不能给出C端、N端的序列，也没法知道蛋白质的构型，因此需要将蛋白质充分纯化后，用蛋白酶消化芯片上的蛋白质，分析肽段，再用生物信息学方法鉴定蛋白质序列[18,24] .另外，在国内，该芯片费用较高，分析质谱需要大量后续工作支持.

2003年人类基因组精细图绘制完成，是人类科学史上一个里程碑式的事件。后基因组时代的研究重点自然落在了蛋白质头上。为啥？因为中心法则告诉我们，基因的产物——蛋白质，是生命活动的最终执行者。与基因组类比，研究生物体内全套蛋白质的科学，就是蛋白质组学。基因组计划完成的同年，人类蛋白质组计划启动，令人激动的是，2014年人类蛋白质组的草图也完成了。而蛋白质组学能够飞速发展的最大功臣非质谱莫属。质谱的应用范围非常广泛，但这里只讨论蛋白质组学中的质谱。简单地说，质谱法（mass spectrometry）就是对肽段离子的重量（质荷比，m/z）进行测量的分析方法。样品经质谱仪（mass spectrometer）检测得到质谱图（mass spectrum），通过对质谱图的分析就可以对样品中的蛋白进行鉴定、定量。亲，图1的这种典型的蛋白质组学流程都很熟悉吧。蛋白首先都要被特异性的酶（通常为Trypsin）切割为肽段，再进行后续分析，这在蛋白质组学中被称为“自下而上”的研究策略（Bottom-up proteomics）。我们平时见到的质谱分析基本都是这种类型。提到蛋白质组，即会联想到一系列高大上的名词，iTRAQ、SWATH、SILAC、Shotgun、Label-free等等。很多概念容易弄混淆，下面我们就来理理清楚。图1. 典型的蛋白质组学流程大体上，质谱研究蛋白主要是鉴定和定量。通过二级质谱图（MS2或者MS/MS）进行数据库搜索匹配鉴定蛋白。通过各种标记或非标记的手段对不同样品中的蛋白进行比较就是定量。蛋白定量比较是质谱最重要的用途，图2是对定量方法的一个简单总结。非标定量（Label-free）不需要标记，不同样品分别处理、分别进质谱检测；优点是处理简单、无需标记、价格便宜、可以比较很多组样品，缺点是对操作步骤、LC、质谱稳定性要求严格。SILAC是在细胞培养基中加入稳定同位素标记的氨基酸，在代谢水平标记蛋白，一级质谱图进行定量，可以做到三组样品混合后进行比较，定量准确，但是不能标记组织样本，养细胞成本也较贵。双甲基化标记是通过化学反应的办法在肽段水平进行标记，一级质谱定量，也可以三组对比，标记试剂都比较便宜，而且可以标记任何来源的样品。iTRAQ和TMT是商品化的试剂盒，肽段水平标记，二级质谱定量；分别可以做到最多8组和10组样品间蛋白质组的比较。图2. 质谱定量方法以上这几个是一家的，还有几个名词是属于另外一家，比如Shotgun (DDA)、SWATH/DIA、SRM (MRM)、MRMHR/PRM。质谱进行数据采集的方式大致分为三种：鸟枪法（Shotgun）、选择反应监控（SRM）和全景式的SWATH/DIA。下面对照图3再来简单介绍一下。图3. 质谱扫描方式DDA、IDA、Shotgun和鸟枪法说的是相同的东西，意思是质谱在每个循环的中从一级里挑选丰度高的TopN个肽段去打碎做二级扫描，得到的结果通过与已知数据库中的理论蛋白进行匹配。DDA简单有效，分析流程比较成熟，也是目前质谱分析的主流方式。DDA也有其固有的缺陷，即具有一定的随机性，偏向于检测丰度较高的肽段，而抑制了低丰度肽段的检测。靶向策略被称为质谱领域的Western blot。质谱只去采集目标肽段大小的离子信息，因而提高了灵敏度和特异性。这种方法用来研究感兴趣的特定蛋白，定量准确，但是通量很有限。SWATH/DIA这种全景式的数据采集方式在最近几年突然火了起来，被认为在不远的未来可能会取代DDA的主流位置。该方法采取的策略是将扫描范围内的所有肽段按照质荷比分为若干个窗口，再对每个窗口里所有的肽段一起打碎，采二级，数据分析时通过抽提蛋白的子离子信息进行定量。SWATH/DIA解决了DDA中随机性选择肽段的缺陷，所以重复性更好，定量的准确性基本达到了SRM的水平，而且可以实现大规模定量。借用听来的一个比喻来说明：DDA就像机关枪扫射，数量多、体积大的目标命中的概率要大一些。靶向扫描（SRM或PRM）就像精准狙击，排除干扰，目标明确，每一枪直指目标，但是难以大规模消灭敌人。SWATH/DIA就是地毯式轰炸，只要暴露在我方攻击范围内的敌人，不管三七二十一，全部炸完。图4. 定量方法与采集方式结合如果将上述的定量方法（图2）和质谱数据采集方式（图3）结合起来，就得到了现在基于质谱的蛋白质组学研究的各种策略（图4）。再打个比方，保证吃货们一听就懂：鸡、鱼、肉、蛋、蔬菜要通过炒锅、烤箱、高压锅、微波炉等烹调之后才能变为美食，填饱肚子。同样的，各种定量方法（非标的和标记的）处理的样品，要通过质谱各种采集方式变为电脑中的数据，才能分析并从中得到蛋白的信息。本次的介绍就先到这里了，如果其中有什么问题，欢迎您批评和建议，我们会努力变得更好；如果需要跟我们进行技术交流和讨论，欢迎大家联系武汉金开瑞。后续我们还会继续推出对质谱技术各方面进行解析的文章，敬请期待。ReferencesA draft map of the human proteome. Nature 509: 575–581 (2014)Mass-spectrometry-based draft of the human proteome. Nature 509: 582–587 (2014)A review: Annu. Rev. Biochem. 80: 273–99 (2011)SILAC: Molecular & Cellular Proteomics 1: 376-386 (2002)iTRAQ: Molecular & Cellular Proteomics 343: 91–99 (2010)SRM: Nature Methods 9: 555–566 (2012)SWATH: Molecular & Cellular Proteomics 11: 1–17 (2012)

[摘要] 质谱对于现代蛋白质化学研究是一项重要的技术。也可用于蛋白组分析,在同一时间监控上千种蛋白的表达情况。首先蛋白质混合物可以用双向凝胶电泳分开，再用质谱及随后的蛋白质数据库检索对单个蛋白进行鉴定和分析。最近几年，质谱领域取得了令人鼓舞的进展，使得全自动、高通量的蛋白检测成为可能。质谱也可以用来分析蛋白的转录后调节以及研究蛋白质复合体。本文将介绍目前蛋白组研究中质谱方法的应用并对其优缺点进行讨论。关键词: 质谱；二维电泳（2-DE）；蛋白组分析MALDI-TOF1 前 言蛋白组学是研究生物特定组织或细胞内表达的所有蛋白质成分，蛋白质组的一门学科。蛋白组分析一般是用双向凝胶电泳（2-DE），质谱（MS）以及数据检索来完成。2-DE要回顾到20世纪70年代初[1],但是用质谱技术对蛋白质进行鉴定和分析是在近十年内才成为可能。其中最重要的一个原因是新的软离子技术即基质辅助激光解析电离（MALDI）[2]和电喷雾电离（ESI）[3，4]技术的发展和应用，以及样本制备技术和质谱仪的发展等。从数据库中获得成指数上升的序列信息也促进了质谱技术的发展。跟转录组学中的全自动DNA微阵列技术相比，蛋白组分析需要更多的手工操作，尤其在2-DE上会出现很多问题[5，6]。尽管存在很多困难，蛋白组学的重要性还是公认的。DNA微阵列技术是建立在对mRNA稳定水平的检测上，然而蛋白组学研究的对象是细胞中最活跃的因子——蛋白质。最近有研究证明，mRNA的表达和蛋白的水平并非具有相关性[7，8]。蛋白质有转录后修饰过程，并会以不同的形式出现。而这些修饰过程是相应的DNA测序技术所不能预测的。质谱技术在蛋白质修饰分析过程中具有重要的作用。2 质谱对蛋白质的检测质谱仪是由离子源，质量分析，离子检测器，以及数据检索等单元组成。首先，被分析的分子在离子源中被离子化，然后在质量分析器里根据不同的质荷比分开，再对分开的离子进行检测。随着MALDI和EIS的出现，质谱技术已经广泛用来分析蛋白质。质量分析器有很多种，最常用的方法是将飞行时间检测器（TOF）与MALDI或三级四级串联质谱仪联用，或者将四级杆-TOF，离子阱等连接到ESI上。蛋白组分析中，可以用两种不同的方法检测电泳分离后的单个蛋白质。最简单的方法叫做肽指纹谱测定（PMF）[9～13]。这个方法是用特殊的酶对2-DE分离后的蛋白质点进行降解，产生的肽从凝胶中分离出来后再用质谱分析和检测肽的分子量。数据库检测能够产生所有蛋白质理论上的PMF，把它们和质谱分析所获得的肽片进行比较就可以得出结果。第二种方法是在质谱仪中把凝胶分离后的肽分解成片段，产生局部的氨基酸序列（序列标签）。那么就可以用分子量或者序列信息进行数据库检索[14，15]。PMF一般用MALDI-TOF来实现，序列标签可以用串联质谱技术MS-MS进行检测[16～18]。用质谱检测蛋白的灵敏性可以精确到飞摩的水平，甚至已有报道其精确度可以达到阿摩水平[19]。3 用MALDI-TOF进行肽指纹谱分析凝胶分离后的蛋白质鉴定以及肽指纹谱分析是目前质谱实验室常规使用的方法。在进行MALDI分析之前需要最优化的凝胶上消化[20～22]和脱盐过程。胰岛素是最常用的凝胶消化酶，因为它在赖氨酸和精氨酸位点能够特异性切割蛋白质，产生分子量在600～2500Da之间的小分子肽，并能够从凝胶上有效的分离出来。MALDI-TOF是质谱技术中相对简单并很容易使用的一种方式，对样本中的盐和其他污染物有很高的耐受性，这点优于ESI。提取的肽片混合物中较小的片段可以直接沉积在靶板上做PMF分析，剩下的样本可以储存起来作为以后的ESI-MS分析。如果经凝胶分离后所有的肽全用来做MALDI分析，那么样本经脱盐以后将会取得更好的结果。脱盐的过程可以用商品化的试剂盒ZipTip(Millipore)，或者在凝胶电泳仪的末端放置一个小的逆向塑料柱来实现[23,24]。PMF中非常重要的一个因素就是质谱测量分子量的准确度[25]。现代的MALDI-TOF仪都具有延迟取样反射器装置，用它们检测的肽段分子量可以精确到10～30ppm。这样的精确度使得4～5个肽段足以清楚的鉴定蛋白质的分子量。MALDI产生的大多数都是单电荷离子，所以它的图谱很容易解释。4 肽质指纹谱分析的自动化为了实现高通量蛋白检测，样本准备，质谱检测，资料分析和数据检索必须实现自动化操作。目前有些实验室用机器人对蛋白质进行自动化取点，凝胶上消化，样本脱盐以及对MALDI平板进行定点测定等。而且，现代化的MALDI-TOF仪完全能够让MALDI检测自动化。资料分析和数据检索过程同样可以自动化。在进行蛋白组分析时，如果在凝胶上不用单个分离就可以对所有蛋白质进行鉴定将是非常具有诱惑力的。为此，研究人员做了很多努力，由Hochestrasser及其同事建立了一套称作分子探测术的方法（molecular scanner）[26，27]。它是将整个2-ＤＥ胶上蛋白质样本同时酶解,并将酶解片段一起原位转移至另一张膜上,再直接用ＭＡＬＤＩ－ ＴＯＦ 质谱对膜上样本进行整体扫描,为实现蛋白质组学研究的自动化、规模化以及临床应用提供了一个崭新的思路和方法。这种思路的优点是显而易见的,不过按照目前的方法,要普及此种技术主要的难点是,质谱扫描一张图谱所需的时间过长,如用0.4ｍｍ的精度扫描一张4ｃｍ×4ｃｍ的膜需55个小时,这就意味着一张16ｃｍ×16ｃｍ的常用膜的扫描,至少需要36天不间断的工作和大约40Ｇ的磁盘空间存储如此庞大的原始数据。5 用ESI-MS/MS的方法创建序列标签只有当被消化的蛋白存在于已有的蛋白或基因组数据库中，并且能从MALDI分析器中得到四五个肽片的数据才能成功进行。如果在EST数据库中只有目的蛋白的部分序列，那么就需要知道肽片的序列信息。创建序列标签的优势在于，用肽的分子量和序列作为数据库检索对象比只用分子量作为检索对象具有更高的特异性。有了序列标签信息后，也可以用EST数据库进行检索[28]。通常来自于一个肽上的序列标签就足以鉴定蛋白质。同MALDI相比，纳升-ESI-MS/MS费时费力，而且在做ESI分析之前必须对样本进行脱盐处理。这些问题可以通过ESI-MS与HPLC联用得到解决。做ESI分析对样本浓度很敏感，用现代化的纳升-HPLC方法可以提供很高的局部肽片凝聚物，分离后的样本可以直接用于质谱分析，而不需要再分解。当分析混合物的时候，在质谱之前做LC分离尤其重要，因为它使得数据依赖的实验（DDE）成为可能,在DDE中，所有的离子都进入检测器进行测量，如果从HPLC到质谱之间出现一个峰的话，软件将自动从质谱转换到MS/MS模式并对产生的离子进行扫描。跟纳升-ESI相比，用这个方法可以从一份标本产生更多的MS/MS数据。Yates等已经详细叙述了如何进行[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LC-MS[/color][/url]/MS全自动蛋白检测的策略[29]。

蛋白质组学研究的一般工具与方法随着人类基因组计划取得巨大的成功和许多物种基因组测序的完成，仅仅靠基因组的序列来试图阐明生命现象是远远不够的，因此，研究重心已经开始从揭示生命的所有遗传信息转移到在分子整体水平对功能的研究上，生命科学已实质性地跨入了后基因组时代。 　　尽管现在已经有多个物种的基因组被测序，但这些基因组中通常有一半以上基因的功能是未知的。目前功能基因组研究中所采用的策略，如微阵列法（microarray）（Wodicka et al., 1997）、基因芯片（gene chips）（Ramsay et al., 1998）、基因表达序列分析（SAGE）（Velculescu et al., 1995）等，都是从细胞中mRNA的角度来考虑的。但事实上，从DNA、mRNA到蛋白质存在三个层次的调控，mRNA自身也存在着贮存、转运和降解等问题，从mRNA角度考虑，实际上仅包括了转录水平调控，并不能全面代表蛋白质表达水平。实验也证明，组织中mRNA丰度与蛋白质丰度的相关性并不好，尤其对于低丰度蛋白质来说，相关性更差。蛋白质复杂的翻译后修饰，蛋白质的亚细胞定位或迁移，蛋白质-蛋白质相互作用则几乎无法从mRNA水平来判断（曾嵘，夏其昌，2002）。新生肽链合成后存在多种加工、修饰过程，蛋白质间也存在类似于mRNA分子内的剪切、拼接，研究证明基本元件“intein”广泛存在于蛋白质中（Perler et al., 1997）。基因与其编码产物蛋白的线性对应关系只存在于新生肽链而不是最终的功能蛋白质中。 　　蛋白质是生理功能的执行者和生命现象的直接体现者，对蛋白质结构和功能的研究将直接阐明生命在生理或病理条件下的变化机制；蛋白质本身的存在形式和活动规律，如翻译后修饰、蛋白质间相互作用及蛋白质构象等问题，仍依赖于直接对蛋白质的研究来解决。因此要对生命的复杂活动有全面和深入的认识，必然要在整体、动态、网络的水平上对蛋白质进行研究（钱小红，贺福初，2003）。 　　 　　蛋白质组学研究中常用的技术体系 　　方法学上，二维凝胶电泳－质谱仍然是目前最流行和可靠的技术平台（Rabilloud et al., 2000）。其一般过程是：细胞或组织样品——样品制备——二维凝胶电泳（2D－PAGE）分离蛋白质——计算机辅助分析2D－PAGE图象——对感兴趣的蛋白质进行酶解——质谱分析——数据库检索——蛋白质鉴定——分析蛋白质在细胞与组织中的表达情况。 　　2-D PAGE 　　样品制备 　　2D－PAGE 的操作流程基本上实现了程序化。但是，样品制备是一个非常关键与复杂的过程。成功的2D－PAGE取决于对样品中蛋白质有效的抽提和它的溶解性。与核酸不同，目前没有一种通用的方法适用于所有的蛋白质，来源不同的蛋白质都受到自身蛋白质制备方法的挑战。 　　正确的样品制备方法从收集样品开始时就要防止样品的裂解和被蛋白水解酶降解（Rabilloud et al., 2000）。要尽可能溶解更多的蛋白，并且在2D－PAGE过程中保持它的溶解性，阻止蛋白质的人为修饰。在样品制备过程中，各个实验室也通过实验建立了更为可行的方法。目前通过建立分步提取方法可以有效地提取出更多的蛋白质（兰彦等，2001）。另一种对蛋白质采用预分离的方法称为“多间隔电解法(multi-compartment-electrolyser)”，采用这种方法后，分辨率和胶的质量均明显改善（Herbert et al., 2000）。 　　但是，由于生物样品的多样性和复杂性，目前所采用的样品制备方法具有局限性。其它物质对蛋白质样品制备存在干扰。核酸通过与蛋白质结合，增加样品黏度而干扰等点聚焦（IEF）分离的效果。当然，通过实验探索，采取一些措施可以减轻它的干扰。例如，在样品制备过程中加入非特异性的核酸酶或RNase与DNase的混合物，在等电聚焦时将每个胶条的电流限制在50mA以内通常可以消除其影响。脂类物质的影响可以通过利用有机溶剂的方法将其去除，但是这常常会导致蛋白质的不可逆沉淀。除了蛋白质的降解之外，糖基化是蛋白质的最重要的人工修饰，样品中的尿素在这一过程中起着非常重要的作用。样品中的尿素在降解的过程中会形成能够与蛋白质的氨基反应的氰酸盐，这种结果会导致蛋白质带有更多的正电荷。所以，在2D－PAGE中要用新鲜的尿素溶液，在等电聚焦过程中要控制温度不能太高（Beranova-Giorgianni, 2003）。但是，目前还没有一种简单有效的方法来去除样品中的多糖。 　　样品分离和分析 　　样品制备完成后运用IEF和SDS-PAGE电泳对它进行分离，常采用银染和考马斯亮兰染色即可观察到具有许多蛋白质斑点的凝胶图像。等电聚焦电泳与SDS-PAGE的具体操作步骤已经实现了程序化，均有详细操作流程参考，但是由于样品的不同，不同样品的具体条件还需要试验探索。第二相SDS-PAGE运行结束，染色完毕后，利用计算机软件对凝胶图像进行分析，如PD-QUEST软件，LIPS，HERMES，GEMINI等，对凝胶图像上的蛋白质斑点进行匹配，对图像进行数字化处理等分析（贾宇峰等，2001），对感兴趣的蛋白质采用质谱分析。 　　低丰度蛋白质的检测 　　低丰度蛋白在蛋白质组学研究中常常是人们非常感兴趣的，因为细胞或组织中的一些生物活性物质，如细胞分泌的一些活性物质，受体等表达量都非常低。按照一般电泳的上样量，这些小分子是根本看不到的，但如果单纯地增加上样量，细胞或组织中的大量表达的蛋白就会将其覆盖，而且上样量过大也会影响电泳结果。所以对这些低丰度的样品可以进行富集，富集的方法可以通过层析，如亲和层析，离子交换层析等方法，还可以通过利用样品等电点性质等方法将pH范围相近的蛋白质富集（Santoni et al., 2000; Beranova-Giorgianni, 2003）。

蛋白标准品质谱检测 什么都没有

耶鲁研究学者成功地对细菌的蛋白质合成机制进行遗传学改造 随着合成生物学的发展，科学家们已经掌握了相当的遗传学工具，他们已能够修改有机物的天然遗传密码，甚至重新谱写生命。在昨天的《科学》杂志上，耶鲁大学的研究学者发表论文说，他们已成功对细菌中的蛋白质合成机制进行遗传学改造。该论文的作者，细胞及分子生理学系的杰斯·莱因哈特（Jesse Rinehart）介绍说：“从本质上来说，我们已经扩展了大肠杆菌的遗传密码，这让我们能够合成以特殊形式，例如模拟天然状态或者疾病状态的蛋白质。”耶鲁研究小组的理念是, 通过修改遗传密码，用新的方式影响蛋白质的行为，使之能实现大多数的生命功能。他们并没有创造自然界不存在的东西，而是诱发了磷酸化作用（phosphorylation）。磷酸化作用是生命体中最常见的基本生理过程，它能显著改变蛋白的功能。通常，蛋白的磷酸化作用并不直接由DNA编码指导合成，而是在蛋白质合成之后才开始，而这正是耶鲁的研究人员们想要改写的：他们希望把磷酸化过程添加到大肠杆菌的遗传密码中，通过DNA第一时间就能指导蛋白磷酸化。过去，科学家们缺乏研究磷酸化状态蛋白的能力，致使对某些疾病的研究停滞不前，例如蛋白活性极高的癌症。而这项新技术实现了人类蛋白质的天然磷酸化体系，这对于理解疾病的发展至关重要。莱因哈特解释说：“我们现在做的就是运用蛋白开关——把蛋白机制打开或关闭，这让我们能以全新的方式研究疾病状态，并有望引导新药的研发。”莱因哈特他们现在打算创建与癌症、糖尿病以及高血压相关的磷酸化蛋白质，不过他们强调说，这种技术能够实现处理任何种类的蛋白质。

[b][font=宋体][color=#060607]前言[/color][/font][/b][font=宋体][font=宋体]在生物医学研究领域，蛋白质的功能性鉴定及其在各种生物过程中的作用机制一直是科研人员关注的焦点。近年来，质谱技术因其高分辨率和高灵敏度在蛋白质组学研究中发挥着越来越重要的作用。然而，传统的质谱策略在鉴定具有特定生物功能的蛋白质亚群时，常常受到标记物与非标记物区分困难的限制。为了解决这一问题，科学家们开发了一种名为[/font][font=宋体]“直接检测含生物素标签的蛋白质”（[/font][font=Calibri]Direct Detection of Biotin-containing Tags, DiDBiT[/font][font=宋体]）的新技术，显著提高了生物素化蛋白质的直接检测效率。[/font][/font][font=Calibri] [/font][b][font=宋体][font=Calibri]DiDBiT[/font][font=宋体]技术检测方法[/font][/font][/b][font=宋体][font=Calibri]DiDBiT[/font][font=宋体]主要是利用质谱技术（[/font][font=Calibri]MS/MS[/font][font=宋体]）来直接检测含生物素的肽段，无需额外的实验步骤即可直接鉴定生物素化蛋白质。与传统的生物素蛋白质鉴定方法相比，[/font][font=Calibri]DiDBiT[/font][font=宋体]技术显著提高了检测的灵敏度和效率。[/font][font=Calibri]DiDBiT[/font][font=宋体]技术通过优化样品的预处理和质谱分析步骤来提高生物素化肽段的检测灵敏度。首先对细胞裂解物进行蛋白质消化，然后使用[/font][font=Calibri]NeutrAvidin[/font][font=宋体]珠子富集含生物素的肽段，最后进行质谱分析。这种方法的关键在于通过降低样品复杂性，提高了生物素标记肽段的检出率。[/font][/font][font=Calibri] [/font][b][font=宋体][font=Calibri]DiDBiT[/font][font=宋体]技术的应用[/font][/font][/b][font=Calibri]Lucio Matias[/font][font=宋体][font=宋体]等人采用[/font][font=Calibri]DiDBiT[/font][font=宋体]技术，在啮齿动物的神经系统中标记新合成的蛋白质，结果表明使用[/font][font=Calibri]DiDBiT[/font][font=宋体]技术提高了生物素标记新合成蛋白质的检测，与传统方法相比，检测灵敏度提高了约[/font][font=Calibri]20[/font][font=宋体]倍。他们还成功地应用[/font][font=Calibri]DiDBiT[/font][font=宋体]技术在成年大鼠视网膜中直接检测新合成的蛋白质，显示出前所未有的时间分辨率，短至[/font][font=Calibri]3[/font][font=宋体]小时。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]此外，[/font][font=Calibri]DiDBiT[/font][font=宋体]技术具有高度的灵活性和可扩展性。它可以与其他蛋白质组学技术相结合，如蛋白质相互作用研究、蛋白质翻译后修饰分析等，从而为我们提供更为全面和深入的蛋白质功能信息。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]DiDBiT[/font][font=宋体]技术的应用展示了其在蛋白质组学研究中的广泛潜力，尤其是在快速鉴定特定细胞类型或生物学状态下新合成蛋白质的能力。此技术不仅提高了实验的准确性和效率，而且通过直接检测生物素化肽段，显著简化了实验流程，降低了实验的复杂性和成本。[/font][/font][font=Calibri] [/font][b][font=宋体]结论[/font][/b][font=宋体][font=Calibri]DiDBiT[/font][font=宋体]技术提供了一种强大的工具，用于在复杂生物样本中直接鉴定和分析含生物素的蛋白质。这种高灵敏度和高分辨率的策略适用于广泛的生物标记策略和样本准备，显著提高了从样本中区分真实候选物和污染物的能力。此技术特别适用于含量较少的生物素化蛋白质的研究，为蛋白质组学和细胞生物学提供了新的研究工具。[/font][/font][font=Calibri] [/font][font=宋体]本篇文章由义翘神州编辑整理，同时义翘神州提供[/font][url=https://cn.sinobiological.com/category/biotinylated-protein-elite][u][font=宋体][color=#0000ff][b]生物素标记蛋白[/b][/color][/font][/u][/url][font=宋体]，更多详情可以点击查看！[/font][font=宋体]参考文献：[/font][font=宋体][font=Calibri]Schiapparelli LM, McClatchy DB, Liu HH, Sharma P, Yates JR 3rd, Cline HT. Direct detection of biotinylated proteins by mass spectrometry. J Proteome Res. 2014 13(9):3966-3978. doi:10.1021/pr5002862[/font][/font]