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张韧,王建超,陈文庆,刘华杰,高飞,徐舸辰,林龙飞(北京清大天一科技有限公司,北京102200) 反应器悬浮培养技术是目前国内外疫苗生产的热点之一,它可以极大提高疫苗的质量和生产率。介绍了该技术在国内外疫苗生产中的研发和应用现状,表明国内该技术目前已经在口蹄疫疫苗生产中获得成功应用,利用MDCK、Vero等细胞培养生产禽流感疫苗的技术也正在积极研发中,并将逐步替代传统的鸡胚生产工艺。积极推广和应用这一新型疫苗生产技术将是我国兽用生物制品行业升级换代的必然趋势。 生物反应器;悬浮培养;微载体培养;口蹄疫;禽流感 在我国,细胞反应器悬浮培养和微载体培养技术在动物疫苗生产领域的研发和应用正成为行业技术革新、产业升级的重要内容。农业部公告第1708号中明确规定,自2012年2月1日起,各省级兽医行政管理部门停止转瓶培养生产方式的兽用细胞苗生产线项目兽药GMP验收申请。该公告对动物疫苗生产技术升级做出了强制性规定。本文就反应器细胞悬浮培养和微载体培养技术在口蹄疫疫苗和禽流感疫苗生产中的国内外应用和发展进行了综述,分析了动物疫苗产业发展趋势和我国疫苗产业技术升级所面临的机遇和挑战。1 反应器悬浮培养技术在口蹄疫疫苗生产中的应用口蹄疫被认为家畜传染性疾病中传染性最强的一种疾病,国际兽医局(OIE)将之列为A类传染病。2010和2011年,在亚洲、非洲都有口蹄疫局部的爆发。接种安全、高效的疫苗是预防口蹄疫疫情发生的最有效策略之一。通常主要通过浓缩技术提高口蹄疫疫苗的有效抗原量来实现其高效性;通过病毒纯化工艺、有效的病毒灭活工艺来保证疫苗的安全性。反应器悬浮培养BHK21细胞生产口蹄疫病毒能显著提高口蹄疫病毒抗原浓度。国际上先进的口蹄疫疫苗的生产工艺都采用反应器悬浮培养BHK21细胞技术、有效的病毒纯化工艺及二次病毒灭活工艺。当前,面对国内外严峻的口蹄疫防控形势,高质量的口蹄疫疫苗必将在口蹄疫防控中发挥关键作用。1.1 国外应用现状和发展趋势 BHK21细胞是繁殖口蹄疫病毒的理想宿主。20世纪60年代,许多国家实验室建立起了转瓶培养BHK21细胞繁殖口蹄疫病毒的生产系统。1962年BHK21细胞悬浮培养成功,细胞增殖迅速,并成功应用于口蹄疫病毒的生产。反应器悬浮培养BHK21细胞生产口蹄疫病毒也就成为最普遍的口蹄疫疫苗生产方式,主要集中在印度、土耳其、巴西、阿根廷等国家(表1)。印度口蹄疫生产企业使用8000L反应器生产口蹄疫疫苗,南美口蹄疫疫苗生产企业一般采用3000~5000 L反应器生产口蹄疫疫苗,口蹄疫病毒抗原146S浓度大约在2 μg/mL。因为口蹄疫疫苗保护力与146S有正相关性,这些企业根据口蹄疫病毒146S来配制疫苗有效地保证了疫苗的质量。表1 国外部分悬浮培养BHK21细胞生产口蹄疫疫苗企业及其生产工艺http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2013/08/A1375859824_small.jpg*来自作者所属公司的客户信息调查但是,这种20世纪60年代开发的口蹄疫疫苗生产工艺延续至今,存在许多技术上的缺陷。国外口蹄疫疫苗生产使用的BHK21细胞培养液是添加磷酸肉汤(Tryptosephosphate broth, TPB)或水解乳蛋白(Lactalbumin hydrolysate, LAH)的GMEM及EMEM,再补加5%~10%牛血清(表1)。不同批次间血清质量差异引起细胞培养效果不稳定,导致影响疫苗生产工艺的稳定性和疫苗质量。疫苗中残留的血清蛋白使接种动物过敏反应升高,一定程度上影响疫苗的安全性。在口蹄疫强制免疫的国家,牛血清中存在含有抗口蹄疫病毒抗体的可能性,不仅影响病毒繁殖,而且可能导致口蹄疫病毒在抗体压力下选择性变异。牛血清中潜在污染朊病毒或疯牛病病毒可给动物疫苗带来潜在的生物危害,TPB或LAH等动物来源成份也存在安全隐患。为提升产品质量及安全性,目前国外多数口蹄疫疫苗生产厂家急于将现使用的含血清生产工艺升级为不含血清生产工艺。自从20世纪的80年代起,细胞培养基(液)发展迅速,低血清细胞培养基、无血清细胞培养基、无血清无动物来源成分细胞培养基已商品化,为疫苗生产中少使用或不使用血清奠定了物质基础。1.2 国内应用现状 默克密理博北京清大天一科技有限公司(以下简称“清大天一”)在国内较早开发了BHK21低血清细胞培养基和BHK21无血清无动物来源成分细胞培养基。2008年,清大天一开发了BHK21低血清细胞培养基及反应器悬浮培养BHK21技术,并于2009年成功应用到国内一家口蹄疫疫苗生产企业中。使用该工艺生产的口蹄疫抗原146S浓度可以达到3 μg/mL左右,工艺全过程管道化操作,产品内毒素含量低,口蹄疫疫苗生产和质量显著提高,同时生产成本下降30%。2009年,清大天一成功开发了BHK21无血清无动物来源成分培养基和反应器无血清悬浮培养BHK21细胞技术,并 2010年成功应用到国内某口蹄疫生产企业。相比于含血清悬浮培养工艺,无血清悬浮培养工艺具有巨大的技术优势。从种子库复苏BHK21细胞开始,到口蹄疫病毒繁殖、直至收获的全过程,不添加任何的血清和动物来源成分,消除了血清抗体对病毒繁殖的干扰,同时减轻了纯化压力。无血清悬浮培养BHK21细胞的细胞密度可以达到5×106~6×106/mL以上,为生产高浓度口蹄疫疫苗奠定了技术基础。图1是反应器无血清培养BHK21细胞生产口蹄疫病毒的工艺流程图,相比于含血清口蹄疫病毒生产工艺,因实现细胞无血清培养,工艺过程无需沉降换液。 http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2013/08/A1375859832_small.jpg 图1 4000L反应器无血清悬浮培养BHK21细胞生产口蹄疫病毒工艺流程目前国内某企业使用该工艺生产的口蹄疫疫苗正处于报批阶段,其他多家口蹄疫疫苗生产企业及研究单位也在研发或寻求无血清悬浮培养生产口蹄疫疫苗的工艺。
[b]背景[/b] 原油蒸气压VPCR(vapor pressure of crude oil)是原油储存、运输和装卸的重要安全参数。在石油工业中,对高蒸汽压原油的检测尤其重要。 GB/T 11059测量原油蒸气压的过程是:将试样引入测量单元,活塞在真空下膨胀,调整汽液比4:1,温度调节至37.8°C。等到测量室与试样间温度达到平衡后,每隔(30士5)s观测一次总压力,当连续三次的总压力读数相差均在0.3 kPa以内时,记录此时的蒸气压,即为原油蒸气压VPCR。 与简单的火花点火燃料或其他石油基最终产品相比,原油的成分要复杂得多,其挥发性(蒸汽压)可能从1 kPa到大气压甚至更高。此外,原油的其它参数如粘度等对蒸汽压的测量也起着重要作用。较高的粘度会显著影响脱气过程并延迟热力学压力平衡的形成。因此,为了提高重复性和加快测量速率,GB/T 11059要求在测量过程中应有摇动试样的装置。 市场上的第一台原油蒸汽压测量仪只能以每秒1.5个周期(1.5c/s)的速率振荡摇晃样品,因此GB/T 11059(ASTM D6377)当初在制定的时候要求最低摇动频率为每秒1.5个周期。而如今,培安公司的原油蒸气压测量仪ERAVAP,可以达到更高的振荡速率-每秒6个周期(6.0c/s),从而加快振荡速率并促进GB/T 11059的测量精度。本文旨在说明以下问题:振荡速率的变化如何影响VPCR结果?[list][*][*]VPCR和“平衡蒸气压结果”之间是否存在偏差?偏差是否取决于振荡速率?较高的振动速率是否会缩短测量时间?是否存在一个最佳的振荡速率?实验 以下测量是在带有集成密度计的ERAVAP上进行的。该仪器可以同时测定每个原油样品的密度(符合SH/T 0604)和蒸汽压(符合GB/T 11059)。 为了证明振荡速率对测量时间的影响,在37.8°C以及气液比比为4:1的条件下测量了两种不同的原油。原油1(ρ=0.8364 g/cm3)含有相当多的挥发物,储存在背压为300 kPa的浮式活塞筒中。原油2(ρ=0.8374 g/cm3)可视为“稳定原油”,使用标准进样管从开口的样品容器中取样。两种原油都在不同的振荡速率下进行测量,从0到6周期/秒(6 c/s),每次测量重复2次以验证结果。[/list] 为了扩大研究范围,又对来自加拿大的两种原油进行了实验,因为有报告显示,这些原油对振荡速率特别敏感。原油3(ρ=0.9274 g/cm3)的粘度明显高于前两个样品,蒸汽压力与原油1相当。原油4(ρ=0.8193 g/cm3)粘度较低,但其蒸气压高于其他任何样品。两种原油都保存在浮式活塞筒中,在1.5周期/秒(1.5 c/s)到4.5周期/秒(4.5 c/s)的振荡速率下测定蒸汽压。 测量曲线(图1-8)描述了根据施加不同的振荡速率进行原油蒸气压测量的过程,GB/T 11059中规定的稳定性标准由圆形标记如下: [img]https://www.bio-equip.com/imgatl/2020/2020101640843308.jpg[/img]图1:原油1的测量:气液比为4:1,振荡速率介于1.5 c/s到6 c/s之间。平衡点为圆形标记。[img]https://www.bio-equip.com/imgatl/2020/2020101640873000.jpg[/img]图2:原油1的测量:气液比为4:1,振荡速率介于1.5 c/s到4.5 c/s之间,时间1800秒。平衡点为圆形标记。[img]https://www.bio-equip.com/imgatl/2020/2020101640900252.jpg[/img]图3:原油2的测量:气液比为4:1,振荡速率介于1.5 c/s到6 c/s之间。平衡点为圆形标记。[img]https://www.bio-equip.com/imgatl/2020/2020101640925132.jpg[/img]图4:原油2的测量:气液比为4:1,振荡速率介于1.5 c/s到4.5 c/s之间,时间1800秒。平衡点为圆形标记。[img]https://www.bio-equip.com/imgatl/2020/2020101640988760.jpg[/img]图5:原油3的测量:气液比为4:1,振荡速率介于1.5 c/s到4.5 c/s之间。平衡点为圆形标记。[img]https://www.bio-equip.com/imgatl/2020/2020101641023524.jpg[/img]图6:原油3的测量:气液比为4:1,振荡速率介于1.5 c/s到4.5 c/s之间,时间1800秒。平衡点为圆形标记。[img]https://www.bio-equip.com/imgatl/2020/2020101641070336.jpg[/img]图7:原油4的测量:气液比为4:1,振荡速率介于1.5 c/s到4.5c/s之间。平衡点为圆形标记。 [img]https://www.bio-equip.com/imgatl/2020/2020101641092936.jpg[/img]图8:原油4的测量:气液比为4:1,振荡速率介于1.5 c/s到4.5 c/s之间,时间1800秒。平衡点为圆形标记。[b]讨论[/b] 图1-8所示的四种不同原油的测量结果都表明了振荡速率对蒸汽压力测量有着强烈的影响。振荡速率越高,测得的蒸气压就越高。此外,较高的振荡速率可以显著加快稳定压力的形成:[img]https://www.bio-equip.com/imgatl/2020/2020101641166912.jpg[/img]表1: 达到0.3 kPa/30 s(GB/T 11059)的稳定性标准时的时间和压力读数,偏差是与最终压力相比。 表1包含时间和VPCR结果(即达到GB/T 11059规定的稳定性标准时的压力读数)。振荡速率为1.5 c/s和4.5 c/s时,VPCR偏差值为1.9 kPa(对于原油1)到7.7 kPa(对于原油3)。同样重要的是测量时间的差异。达到GB/T 11059稳定标准的时间与振荡速率和粘度有关:对于原油3,在最小频率即1.5c/s时压力稳定性在584s后达到,而在4.5c/s时仅需342s。 在1.5 c/s的最小振荡速率下,即使达到GB/T 11059的稳定性标准,压力仍会显著升高。这导致VPCR结果与平衡蒸气压之间存在较大差异。当最小摇动速度为1.5c/s时,VPCR与实际平衡蒸气压结果(1800 s,振荡速率为4.5c/s时的压力)之间的偏差可高达8.6kpa。对于4.5 c/s的振荡速率,该偏差明显较小,这意味着这些测量的精度更高。 四种原油在4.5c/s(或更高)的振荡速率下,蒸汽压力最终不再变化。在这一点上可以证明蒸汽压达到了热力学平衡。因此,可将4.5 c/s的振动频率视为临界阈值。当使用较慢的振荡速率时,在合理的测量时间内无法观察到热力学蒸气压平衡的形成。另一方面,使用高于4.5 c/s的振荡速率时不会再改变最终的VPCR结果,即使达到最终压力水平的速度会稍快一些。 结论振荡频率越高,得到的原油蒸气压值(VPCR)越高。振荡速率为1.5 c/s和4.5 c/s时获得的VPCR结果之间的差异最大可达7.7kPa。施加4.5 c/s或以上的振荡速率,最终会形成热力学平衡蒸汽压。在较高振荡速率(4.5c/s或以上)下获得的VPCR结果更接近(或等于)实际热力学平衡蒸气压,这意味着该结果更准确。提高振荡速率可显著缩短GB/T 11059的测量时间。对于ERAVAP,4.5 c/s为GB/T 11059测量的最佳振荡速率设置。建议始终以尽可能最高的振荡频率搅动样品。这会使VPCR更接近(或达到)实际的热力学平衡蒸气压。在比较或报告原油蒸气压结果时,应包含使用的振荡频率。许多蒸汽压测试仪仅提供有限的振荡频率(4.5 c/s),无法达到热力学平衡蒸气压,因此报告的VPCR结果会过低。[list][*][/list]