离子交换层析图谱采集分析仪

[font=宋体]离子交换层析是一种在生物化学和生物技术领域中广泛使用的分离和纯化技术。它基于离子间的相互作用，特别是离子与固定在层析介质上的带电基团之间的相互作用，从而实现对混合物中不同离子的分离。以下将详细介绍离子交换层析的步骤及其作用。[/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]一、步骤[/font][/b][font=宋体][font=Calibri]1[/font][font=宋体]、预处理：在开始离子交换层析之前，通常需要对样品进行预处理，以去除大颗粒杂质和不需要的成分。这通常包括离心、过滤和可能的浓缩步骤。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]、选择合适的离子交换剂：离子交换剂是层析过程的核心。根据待分离离子的性质（如电荷、大小和与交换剂的亲和力）选择合适的离子交换剂。常见的离子交换剂包括阳离子交换剂和阴离子交换剂。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]3[/font][font=宋体]、平衡离子交换剂：在将样品加载到离子交换柱之前，需要用适当的平衡溶液（通常是水或盐溶液）冲洗离子交换剂，以去除可能存在的杂质并确保离子交换剂处于最佳状态。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]4[/font][font=宋体]、加载样品：将预处理过的样品加载到离子交换柱上。样品中的离子会与离子交换剂上的带电基团发生相互作用。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]5[/font][font=宋体]、洗脱：用洗脱液（通常是盐溶液，其浓度逐渐增加）将结合的离子从离子交换剂上洗脱下来。这一步骤是离子交换层析中最为关键的一步，因为它决定了不同离子之间的分离效果。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]6[/font][font=宋体]、收集和分析：收集洗脱下来的各个组分，并进行分析，以确定每个组分中包含的离子种类和浓度。常见的分析方法包括电导率测量、紫外[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]可见光谱和质谱等。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]7[/font][font=宋体]、后处理：根据需要对收集到的组分进行进一步的处理，如浓缩、脱盐或重新配制等。[/font][/font][b][font=宋体] [/font][font=宋体]二、作用[/font][/b][font=宋体]离子交换层析在生物化学和生物技术领域有着广泛的应用，主要作用包括：[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1[/font][font=宋体]、分离和纯化蛋白质：离子交换层析可用于从复杂的混合物中分离和纯化蛋白质，这对于后续的生物化学研究和药物开发至关重要。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]、去除杂质：离子交换层析能够有效地去除样品中的离子杂质，提高样品的纯度。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]3[/font][font=宋体]、样品制备：在进行其他分析或实验之前，离子交换层析可用于样品的制备和预处理。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]4[/font][font=宋体]、研究蛋白质与离子的相互作用：通过离子交换层析，可以研究蛋白质与不同离子之间的相互作用和亲和力，这对于理解蛋白质的生物学功能和调控机制具有重要意义。[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=宋体]三[/font] [font=宋体]、应用领域[/font][/font][/b][font=宋体]离子交换层析法在许多领域得到广泛应用：[/font][font=宋体]●生物制药：用于药物蛋白质的纯化，确保生物制剂的质量和稳定性。[/font][font=宋体]●生物学研究：在分离和纯化特定电荷性质的蛋白质时被广泛使用，尤其在基因表达和蛋白质互作研究中。[/font][font=宋体]●食品工业：用于提取和纯化食品中的蛋白质，改善食品的质地和口感。[/font][font=宋体]●环境监测：可用于从环境样品中分离和检测特定蛋白质，例如水体中的生物标志物。离子交换层析法凭借其良好的选择性和高效性，是生物分离和纯化领域不可或缺的重要工具。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]更多详情可以关注：[url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-by-iec][b]离子交换层析蛋白纯化[/b][/url][/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-by-iec[/font][/font][b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州：蛋白与抗体的专业引领者，欢迎通过百度搜索[/font][font=宋体]“义翘神州”与我们取得联系。[/font][/font][/b]

[font=宋体][font=宋体]离子交换层析[/font][font=Calibri](IEX)[/font][font=宋体]是一种主要基于蛋白净电荷的色谱分离方法，通常用于追踪脱酰胺和琥珀酰亚胺的形成。[/font][font=Calibri]IEX[/font][font=宋体]有两种类型：阳离子交换和阴离子交换层析法。当缓冲液[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值高于此[/font][font=Calibri]IP[/font][font=宋体]时，蛋白带负电（阴离子）；当[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值低于此[/font][font=Calibri]IP[/font][font=宋体]时，蛋白带正电（阳离子）。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]所有蛋白都表现出净电荷，这取决于蛋白氨基酸组成和任何共价连接的修饰。蛋白净电荷受溶解它的溶剂[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]所影响，因为溶剂会与蛋白进行氢离子交换。通常情况下，蛋白与[/font][font=Calibri]IEX[/font][font=宋体]的结合必须通过反复试验来确定，使用一系列[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值的溶剂以确定蛋白保留的最佳[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]。通常溶剂的[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值与[/font][font=Calibri]pI[/font][font=宋体]相差约一个[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]单位就足以实现蛋白结合。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]离子交换层析优缺点介绍：[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]离子交换层析法是一种常用的分离分析技术，具有分离效率高、操作简单、可靠性高、灵敏度高等优点。其优点如下：[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]分离效率高：离子交换层析法可以快速、有效地分离各种生物分子和配体，对于复杂的生物样品可以获得较高的分离效果。[/font][font=宋体]操作简单：离子交换层析法的操作相对简单，不需要过多的手动操作，可以自动化进行，减少了人为误差。[/font][font=宋体]可靠性高：离子交换层析法的分离过程相对稳定，分离结果重现性好，可以用于大规模的分离分析。[/font][font=宋体]灵敏度高等优点：离子交换层析法对于低浓度的样品也能够获得较好的分离效果，对于痕量物质的分离和鉴定具有重要意义。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体]但是，离子交换层析法也存在一些缺点：[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]生产率低：离子交换层析法的生产率相对较低，对于大规模的分离分析可能不太适合。[/font][font=宋体]需要使用大量的缓冲液和洗脱液：离子交换层析法需要使用大量的缓冲液和洗脱液，对于环境保护有一定的影响。[/font][font=宋体]对样品条件要求严格：离子交换层析法对于样品的条件要求比较严格，对于不同性质的样品需要使用不同的离子交换剂和分离条件。[/font][font=宋体]总的来说，离子交换层析法是一种有效的分离分析方法，但是也存在一些缺点，需要根据具体的实验条件和要求进行选择和使用。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]更多关于[url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/chromatography-purification]蛋白层析纯化[/url]详情可以关注：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/chromatography-purification[/font][/font]

[font=宋体][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-by-iec][b]离子交换层析[/b][/url][/font][font=Calibri](IEX)[/font][font=宋体]是一种主要基于蛋白净电荷的色谱分离方法，通常用于追踪脱酰胺和琥珀酰亚胺的形成。[/font][font=Calibri]IEX[/font][font=宋体]有两种类型：阳离子交换和阴离子交换层析法。当缓冲液[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值高于此[/font][font=Calibri]IP[/font][font=宋体]时，蛋白带负电（阴离子）；当[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值低于此[/font][font=Calibri]IP[/font][font=宋体]时，蛋白带正电（阳离子）。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]所有蛋白都表现出净电荷，这取决于蛋白氨基酸组成和任何共价连接的修饰。蛋白净电荷受溶解它的溶剂[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]所影响，因为溶剂会与蛋白进行氢离子交换。通常情况下，蛋白与[/font][font=Calibri]IEX[/font][font=宋体]的结合必须通过反复试验来确定，使用一系列[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值的溶剂以确定蛋白保留的最佳[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]。通常溶剂的[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值与[/font][font=Calibri]pI[/font][font=宋体]相差约一个[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]单位就足以实现蛋白结合。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][font=宋体]离子交换层析（[/font][font=Calibri]IEX[/font][font=宋体]）具体操作步骤：[/font][/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]平衡[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]第一步是固定相的平衡。当达到平衡时，所有的固定相带电基团都与可交换的平衡离子结合，如氯或钠。选择起始缓冲液的[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]和离子强度，以确保目标蛋白与介质的结合。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]上样和清洗[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]第二步的目标是结合目标分子，并清洗出所有未结合的物质。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]洗脱[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]随着离子强度的增加，在选定的[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值下净电荷最低的蛋白将最先从柱子上洗脱。同样地，在一定[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值下电荷最高的蛋白被保留得最牢固，并且在最后被洗脱。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]再生[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]最后用高离子强度的缓冲液进行最后一次清洗，使色谱柱再生，并去除任何仍结合的分子。然后在开始下一次运行之前，色谱柱需要在起始缓冲液中重新平衡。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]以上是对离子交换层析原理和步骤的详解，具体来源可参看：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-by-iec[/font][/font][font=宋体] [/font]

请问关于“离子交换层析”中的问题，在玻璃层析柱中阳离子交换层析剂——羧甲基纤维素是以什么状态存在？凝胶状还是颗粒状？其在装柱的时候容易产生气泡，请问如何除泡？

[font=宋体][b]离子交换层析基本原理：[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]离子交换层析法是蛋白纯化的一种方式，通过带电的溶质分子与离子交换层析介质中可交换离子进行交换，从而达到分离纯化的目的。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]离子交换层析法主要依据电荷间的相互作用，利用带电分子中电荷的微小差异而进行分离，具有较高的分离容量。几乎所有的生物大分子都是极性的，都可使其带电，所以离子交换层析法的应用很广泛。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]离子交换层析的介质：[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]有许多离子交换介质都已经商品化，但不存在一种神奇的介质其最适合各种蛋白质的纯化。选择离子交换介质的标准包括应用的特异性需要、样品成分的等电点和分子大小（即目的蛋白和污染物），以及可得到的装备（如泵和柱子）。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]首先需要选择阴离子或阳离子介质，如果目的蛋白的等电点已知，选择阴离子介质且操作的[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]高于目的蛋白的[/font][font=Calibri]pI[/font][font=宋体]，或选择阳离子介质且操作[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]低于目的蛋白的[/font][font=Calibri]pI[/font][font=宋体]。如果靶蛋白的[/font][font=Calibri]pI[/font][font=宋体]未知，开始之前最好先测定它。最佳操作[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]可根据经验确定。因为大多数蛋白质的[/font][font=Calibri]pI[/font][font=宋体]低于[/font][font=Calibri]7[/font][font=宋体]，选择阴离子交换和操作[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]为[/font][font=Calibri]8.5[/font][font=宋体]开始是合理的，然后根据估计结果和优化条件。知道蛋白质溶液中污染物[/font][font=Calibri]pI[/font][font=宋体]和结合特征也是有用的。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]离子交换层析应用：[/b][/font][font=宋体][font=宋体]离子交换层析法是生物纯化中应用最广泛的色谱模式，应用于大多数下游处理平台。在[/font][font=Calibri]IEX[/font][font=宋体]中结合目标蛋白、洗脱柱子和洗脱目标蛋白的典型方案被称为“结合[/font][font=Calibri]/[/font][font=宋体]洗脱模式”，经常应用于中间纯化步骤如抗体的下游处理。阴离子交换层析是大多数血浆蛋白纯化平台的组成部分如凝血因子[/font][font=Calibri]VIII[/font][font=宋体]的纯化。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][font=宋体]离子交换层析（[/font][font=Calibri]IEX[/font][font=宋体]）具体操作步骤：[/font][/b][/font][font=宋体]平衡[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]第一步是固定相的平衡。当达到平衡时，所有的固定相带电基团都与可交换的平衡离子结合，如氯或钠。选择起始缓冲液的[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]和离子强度，以确保目标蛋白与介质的结合。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]上样和清洗[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]第二步的目标是结合目标分子，并清洗出所有未结合的物质。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]洗脱[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]随着离子强度的增加，在选定的[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值下净电荷最低的蛋白将最先从柱子上洗脱。同样地，在一定[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值下电荷最高的蛋白被保留得最牢固，并且在最后被洗脱。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]再生[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]最后用高离子强度的缓冲液进行最后一次清洗，使色谱柱再生，并去除任何仍结合的分子。然后在开始下一次运行之前，色谱柱需要在起始缓冲液中重新平衡。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-by-iec][b]离子交换层析蛋白纯化[/b][/url]详情可以关注：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-by-iec[/font][/font]

[color=#dc143c]最近版里原创热风呼呼的刮~~于是我也特来跟风积极参与！近来一直在做包涵体的复性与纯化，就特来与大家分享，希望大家多多支持、指点[em09511][/color][b]1.包涵体的分离纯化[/b] 蛋白质的纯化是基因工程下游的关键内容，以包涵体形式表达的重组蛋白质的纯化研究一直是重组基因工程药物研究中的热点和难点。重组蛋白在宿主系统中高水平表达时，无论是用原核表达体系或酵母表达体系甚至高等真核表达体系，都可形成包涵体。蛋白表达后的分离纯化对蛋白的规模化生产也是至关重要的，所以本实验通过采用稀释复性、透析复性、离子交换层析、凝胶过滤层析等实验方法，研究探讨对分离纯化以及蛋白复性的最佳方法和条件。[b]1.2.1包涵体的复性[/b] 重组蛋白质在分离纯化的过程中, 必须维持一定的浓度和生物活性形式, 以及防止被降解。从包涵体中获得有生物活性的蛋白，需要寻找一种简单而有效的复性方法。在小规模的蛋白复性研究及其进一步的纯化中，稀释复性是最常用的方法。但是稀释复性在商业规模生产中具有一定的缺陷，如需要较大体积的复性液，以及需要附加的浓缩步骤。许多其他方法也已发展起来，例如：透析、渗透、低分子量辅助物添加复性、离子和无离子表面活性剂辅助复性、聚乙烯乙二醇辅助复性等方法。 在折叠反应中，从伸展态到中间体的速度是非常快的，只需要几毫秒，但从中间体转变为天然态的过程比较缓慢，是一个限速过程。聚集过程与复性过程相互竞争，故而应尽量避免聚集体的产生。一般认为，蛋白质在复性过程中涉及两种疏水作用，一是分子内的疏水相互作用，可促进蛋白质正确折叠 一是部分折叠的肽链分子间的疏水相互作用，在复性过程中，部分折叠的中间体的疏水簇外露，分子间的疏水相互作用会导致蛋白质聚集。蛋白质的立体结构虽然由其氨基酸的顺序决定，然而伸展肤链折叠为天然活性结构的过程还受到周围环境的影响，如温度、pH值、离子强度、复性时间等因素的影响。[b]1.2.2包涵体离子交换层析纯化[/b] 为了获得高纯度的活性蛋白, 需要对复性的蛋白质进行进一步纯化。根据分离目标蛋白的特点(如P I、疏水性、氨基酸组成, 分子量大小、表面电荷的分布状况) , 然后确定分离方法, 从而正确选择最有效的分离介质,本实验采用SP Sepharose F.F 阳离子交换层析分离纯化重组蛋白 离子交换层析是以蛋白质分子净电荷和表面电荷分布为分离基础的。具体说就是利用蛋白质带电性的差异,在离子吸附剂上静电吸附能力不同,用不同的pH 离子强度洗脱液洗脱,从而使蛋白质分离的柱层析方法。离子交换又分为阴离子交换和阳离子交换。离子交换剂又有强弱之分,强的离子交换剂在整个pH 范围内都是离子化的,而弱的离子交换剂通常仅在pH6～9 之间是离子化状态,因而后者对所适用的pH 范围又有了进一步的限制。 在洗脱方式上,阳离子交换主要是改变pH ,它主要应用于等电点大于5 的蛋白质。20 种氨基酸中,大部分带正电或负电,这是IEC 应用范围广的原因。离子交换层析处理量大,附载系数高,一步缩小样品体积很多。离子交换层析去除杂质能力强,如对热原质,核酸、及电荷性有差别的蛋白均可去除。它还有一个特点,利用蛋白质在不同pH 和盐浓度下带电性的不同,通过不同条件下应用同种类型或不同类型介质,分步使目标蛋白质达到提纯目的,这是除亲和柱层析外,别的柱层析达不到的分离能力。离子交换层析原则上可放在纯化工艺的任何一步,它属吸附型层析,单步损失也较大。

常用的层析分析方法coolautumn 　　在分离分析特别是蛋白质分离分析中，层析是相当重要、且相当常见的一种技术，其原理较为复杂，对人员的要求相对较高，这里只能做一个相对简单的介绍。　　一、 吸附层析　　1、 吸附柱层析　　吸附柱层析是以固体吸附剂为固定相，以有机溶剂或缓冲液为流动相构成柱的一种层析方法。 　　2、 薄层层析　　薄层层析是以涂布于玻板或涤纶片等载体上的基质为固定相，以液体为流动相的一种层析方法。这种层析方法是把吸附剂等物质涂布于载体上形成薄层，然后按纸层析操作进行展层。 　　3、 聚酰胺薄膜层析　　聚酰胺对极性物质的吸附作用是由于它能和被分离物之间形成氢键。这种氢键的强弱就决定了被分离物与聚酰胺薄膜之间吸附能力的大小。层析时，展层剂与被分离物在聚酰胺膜表面竞争形成氢键。因此选择适当的展层剂使分离在聚酰胺膜表面发生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的连续过程，就能导致分离物质达到分离目的。 　　二、 离子交换层析　　离子交换层析是在以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的。离子交换剂是由基质、电荷基团和反离子构成的。离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行，或借助离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行。` 　　三、 凝胶过滤　　凝胶过滤又叫分子筛层析，其原因是凝胶具有网状结构，小分子物质能进入其内部，而大分子物质却被排除在外部。当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同分子量筛分开了。 　　四、 亲和层析 　　亲和层析的原理与众所周知的抗原一抗体、激素一受体和酶一底物等特异性反应的机理相类似，每对反应物之间都有一定的亲和力。正如在酶与底物的反应中，特异的废物（S'）才能和一定的酶（E）结合，产生复合物（E－S'）一样。在亲和层析中是特异的配体才能和一定的生命大分子之间具有亲和力，并产生复合物。而亲和层析与酶一底物反应不同的是，前者进行反应时，配体（类似底物）是固相存在；后者进行反应时，底物呈液相存在。实质上亲和层析是把具有识别能力的配体L（对酶的配体可以是类似底物、抑制剂或辅基等）以共价键的方式固化到含有活化基团的基质M（如活化琼脂糖等）上，制成亲和吸附剂M－L，或者叫做固相载体。而固化后的配体仍保持束缚特异物质的能力。因此，当把围相载体装人小层析柱（几毫升到几十毫升床体积）后，让欲分离的样品液通过该柱。这时样品中对配体有亲和力的物质S就可借助静电引力、范德瓦尔力，以及结构互补效应等作用吸附到固相载体上，而无亲和力或非特异吸附的物质则被起始缓冲液洗涤出来，并形成了第一个层析峰。然后，恰当地改变起始缓冲 液的PH值、或增加离子强度、或加人抑③剂等因子，即可把物质S从固相载体上解离下来，并形成了第M个层析峰（见图6－2）。显然，通过这一操作程序就可把有效成分与杂质满意地分离开。如果样品液中存在两个以上的物质与固相载体具有亲和力（其大小有差异）时，采用选择性缓冲液进行洗脱，也可以将它们分离开。用过的固相载体经再生处理后，可以重复使用。 　　上面介绍的亲和层析法亦称特异性配体亲和层析法。除此之外，还有一种亲和层析法叫通用性配体亲和层析法。这两种亲和层析法相比，前者的配体一般为复杂的生命大分子物质（如抗体、受体和酶的类似底物等），它具有较强的吸附选择性和较大的结合力。而后者的配体则一般为简单的小分子物质（如金属、染料，以及氨基酸等），它成本低廉、具有较高的吸附容量，通过改善吸附和脱附条件可提高层析的分辨率。 　　五、 聚焦层析　　聚焦层析也是一种柱层析。因此，它和另外的层析一样，照例具有流动相，其流动相为　多缓冲剂，固定相为多缓冲交换剂。 　　聚焦层析原理可以从PH梯度溶液的形成、蛋白质的行为和聚焦效应三方面来阐述。 　　1、PH梯度溶液的形成　　在离子交换层析中，PH梯度溶液的形成是靠梯度混合仪实现的。例如，当使用阴离子 剂进行层析时，制备PH由高到低呈线性变化的梯度溶液的方法是，在梯度仪的混合室（这层析柱者）中装高PH溶液，而在另一室装低PH极限溶液，然后打开层析柱的下端出口，让洗脱液连续不断地流过柱体。这时从柱的上部到下部溶液的PH值是由高到低变化的。而在聚焦层析中，当洗脱液流进多缓冲交换剂时，由于交换剂带具有缓冲能力的电荷基团，故PH梯度溶液可以自动形成。例如，当柱中装阴离子交换剂PBE94（作固定相）时，先用起始缓冲液（配方见表了一2）平衡到PHg，再用含PH6的多缓冲剂物质（作流动相）的淋洗液通过柱体，这时多缓冲剂中酸性最强的组分与碱性阴离子交换对结合发生中和作用。随着淋洗液的不断加人，住内每点的PH值从高到低逐渐下降。照此处理J段时间，从层析柱顶部到底部就形成了PH6～9的梯度。聚焦层析柱中的PH梯度溶液是在淋洗过程中自动形成的，但是随着淋洗的进行，PH梯度会逐渐向下迁移，从底部流出液的PH却由9逐渐降至6，并最后恒定于此值，这时层析柱的PH梯度也就消失了。 　　2．蛋白质的行为　　蛋白质所带电荷取决于它的等电点（PI）和层析柱中的PH值。当柱中的PH低于蛋白质的PI时，蛋白质带正电荷，且不与阴离于交换剂结合。而随着洗脱剂向前移动，固定相中的PH值是随着淋洗时间延长而变化的。当蛋白质移动至环境PH高于其PI时，蛋白质由带正电行变为带负电荷，并与阴离子交换剂结合。由于洗脱剂的通过，蛋白质周围的环境PH 再次低于PI时，它又带正电荷，并从交换剂解吸下来。随着洗脱液向柱底的迁移，上述过程将反复进行，于是各种蛋白质就在各自的等电点被洗下来，从而达到了分离的目的。 　　不同蛋白质具有不同的等电点，它们在被离子交换剂结合以前，移动之距离是不同的，洗脱出来的先后次序是按等电点排列的。

离子交换色谱法教程Sober和Peterson于1956年首次将离子交换基团结合到纤维素上，制成了离子交换纤维素，成功地应用于蛋白质的分离。从此使生物大分子的分级分离方法取得了迅速的发展。离子交换基团不但可结合到纤维上，还可结合到交联葡聚糖（S-ephadex）和琼脂糖凝胶（Sepharose）上。近年来离子交换色谱技术已经广泛应用于蛋白质、酶、核酸、肽、寡核苷酸、病毒、噬菌体和多糖的分离和纯化。它们的优点是:⑴具有开放性支持骨架，大分子可以自由进入和迅速扩散，故吸附容量大。⑵具有亲水性，对大分子的吸附不大牢固，用温和条件使可以洗脱，不致引起蛋白质变性或酶的失活。⑶多孔性，表面积大、交换容量大，回收率高，可用于分离和制备。一、基本理论　　离子交换剂通常是一种不溶性高分子化合物，如树脂，纤维素，葡聚糖，醇脂糖等，它的分子中含有可解离的基团，这些基因在水溶液中能与溶液中的其它阳离子或阴离子起交换作用。虽然交换反应都是平衡反应，但在层析柱上进行时，由于连续添加新的交换溶液，平衡不断按正方向进行，直至完全。因此可以把离子交换剂上的原子离子全部洗脱下来，同理，当一定量的溶液通过交换柱时，由于溶液中的离子不断被交换而波度逐减少，因此也可以全部被交换并吸附在树脂上。如果有两种以上的成分被交换吸着在离子交换剂上，用洗脱液洗脱时，在被洗脱的能力则决定于各自洗反应的平衡常数。蛋白质的离子交换过程有两个阶段──吸附和解吸附。吸附在离子交换剂上的蛋白质可以通过改变pH使吸附的蛋白质失去电荷而达到解离但更多的是通过增加离子强度，使加入的离子与蛋白质竞争离子交换剂上的电荷位置，使吸附的蛋白质与离子交换剂解开。不同蛋白质与离子交换剂之间形成电键数目不同，即亲和力大小有差异，因此只要选择适当的洗脱条件便可将混合物中的组分逐个洗脱下来，达到分离纯化的目的。二、离子交换的分类及常见种类（一）分类离子交换剂分为两大类，即阳离子交换剂和阴离子交换剂。各类交换剂根据其解离性大小，还可分为强、弱两种，即 强酸剂　阳离子交换剂 　弱酸剂　强硷型　阴离子交换剂　弱硷型。1.阳离子交换剂　　阳离子交换剂中的可解离基因是磺酸（-SO3H）、磷酸（-PO3H2）、羧酸（COOH）和酚羟基（-OH）等酸性基。某些交换剂在交换时反应如下：强酸性：R-SO3-H+＋Na+ R-SO3- Na+H+弱酸性：R-COOH＋Na+ R-COONa＋H+国产树脂中强酸1×7（上海树脂＃732）和国外产品Dowex 50、Zerolit 225等都于强酸型离子交换剂。2.阴离子交换剂　　阴离子交换剂中的可解离基因是伯胺、（-NH2）、仲胺（-NHCH3）、叔胺[N-（CH3）2]和季胺[-N（CH3）2]等硷性基团。某些交换反应如下：强硷性：R-N+（CH3）2 HOH-＋Cl R-N+（CH3）2 Cl＋OH-弱硷性：R-N+（CH3）2 HOH-＋Cl R-N+（CH3）2 HCl＋OH-强硷性＃201号国产树脂和国外Dowex1、Dowex2、ZerolitFF等都属于强硷型阴离子交换剂。（二）种类1.纤维素离子交换剂：阳离子交换剂有羟甲基纤维素（CM-纤维素），阴离子交换剂有氯代三乙胺纤维纱（DESE-纤维素）。2.交联葡聚糖离子交换剂：是将交换基因连接到交联葡聚糖上制成的一类交换剂，因而既具有离子交换作用，又具有分子筛效应，是一类广泛应用的色谱分离物质。常用的Sephadex离子交换剂也有阴离子和阳离子交换剂两类。阴离子交换剂有DEAE-Sephadex A-25，A-50和QAE- Sephadex A25，A50； 阳离子交换剂有CM-Sephaetx C-50，C-50和Sephadex C-25，C-50。阴离子交换剂用英文字头A，阳离子交换剂的英文字头是C。英文字后面的数字表示Sephadex型号。3.琼脂糖离子离交换剂：是将DESE-或CM-基团附着在Sepharose CL-6B上形成，DEAE-Sephades（阴离子）和CM-Sepharose（阳离子），具有硬度大，性质稳定，凝胶后的流速好，分离能力强等优点。三、实验操作（一）交换剂的处理，再生与转型　　新出厂的树脂是干树脂，要用水浸透使之充分吸水膨胀。因其含有政绩一些杂质，所要要用水、酸、硷洗涤。一般手续如下：新出厂干树脂用水浸泡2小时后减抽压去气泡，倾去水，再用大量无离子水洗至澄清，去水后加4倍量2N HCl搅抖4小时，除去酸液，水洗到中性，再加4倍量2N NaOH搅抖4小时，除硷液，水洗到中性备用。将树脂带上所希望的某种离子的操作称为转型。如希望阳树脂带Na+，则用4倍量NaOH搅拌浸泡2小时以上；如希望树脂带H+，可用HCl处理。阴树脂转型也同样，若希望带Cl-则用HCl，希望带OH-则用NaOH。用过的树脂使其恢复原状的方法称为再生。并非每次再一都用酸、硷液洗涤，往往只要转型处理就行了。（二）柱上操作⑴交换剂装柱最简单的交换层析柱可用硷式滴定管代替。处理过的树脂放入烧杯，加少量水边搅拌边倒入保持垂直的层析管中，使树脂缓慢沉降。交换剂在柱内必须分布均匀。⑵上样向层析柱内倾入样品液⑶洗脱与收集　　不同样品选用的洗脱液不同。原则是用一种比吸着物质更活泼的离子，把吸着物交换出来。由于被吸着的物质往往不是我们所要求的单一物质，因此除了正确选择洗脱液外还采控制流速和分布收集的方法来获得所需的单一物质。来源：中国色谱网[em61]

不好意思提个弱弱的问题：紫外检测器和PDA检测器层析图纵坐标单位不一样吗？我用的waters的仪器，msslynx V4.0 我见到的纵坐标单位是%和AU，但是看贴的时候发现还有mV的，所以就晕了[em0716] ，期待高手给我解释一下，万分感激！

[font=宋体][font=宋体]离子交换层析[/font][font=Calibri](IEX)[/font][font=宋体]是一种主要基于蛋白净电荷的色谱分离方法，通常用于追踪脱酰胺和琥珀酰亚胺的形成。[/font][font=Calibri]IEX[/font][font=宋体]有两种类型：阳离子交换和阴离子交换层析法。当缓冲液[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值高于此[/font][font=Calibri]IP[/font][font=宋体]时，蛋白带负电（阴离子）；当[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值低于此[/font][font=Calibri]IP[/font][font=宋体]时，蛋白带正电（阳离子）。下面主要介绍离子交换色谱操作中应注意的一些具体问题。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]1.[/font][font=宋体]色谱柱[/font][/font][font=宋体][font=宋体]离子交换色谱应根据分离样品的数量选择合适的色谱柱，用于离子交换的色谱柱一般又厚又短，不宜过长。直径和柱长的比例通常在[/font][font=Calibri]1:10[/font][font=宋体]到[/font][font=Calibri]1:50[/font][font=宋体]之间，色谱柱应垂直安装。安装立柱时，立柱应平整，不得有气泡。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]2.[/font][font=宋体]平衡缓冲器[/font][/font][font=宋体][font=宋体]离子交换色谱的基本反应过程是离子交换剂与待分离物质和缓冲液中离子的交换，因此离子交换色谱中平衡缓冲液和洗脱缓冲液的离子强度和[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]的选择对分离效果有很大影响。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]平衡缓冲液是指离子交换柱加载后和样品加载后用于平衡离子交换柱的缓冲液。选择平衡缓冲液的离子强度和[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]首先确保待分离的单个物质（如蛋白质）的稳定性。其次，要使每种待分离物质与离子交换剂有适当的组合，并尽量使样品与待分离杂质与离子交换器的组合有更大的差异。通常，待分离的样品与离子交换器具有更稳定的组合。并尽量使杂质不与离子交换剂结合或结合不稳定。在某些情况下（如污水处理），杂质可以与离子交换器牢固结合，样品与离子交换器结合不稳定，也可以达到分离的目的。另外，要注意平衡缓冲液不能与离子交换剂离子有很强的结合力，否则会大大降低交换容量，影响分离效果。选择合适的平衡缓冲液可以直接去除大量杂质。并使以下洗脱具有良好的效果。如果平衡缓冲液不合适，可能会给后续洗脱带来困难，无法获得良好的分离效果。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]3.[/font][font=宋体]样品交付[/font][/font][font=宋体][font=宋体]负载离子交换色谱时，应注意样品液的离子强度和[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值，负载量不宜过大，一般以[/font][font=Calibri]1-5%[/font][font=宋体]的柱床体积为宜，这样样品才能吸附在色谱柱的上层，分离效果更好。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]4.[/font][font=宋体]洗脱缓冲液[/font][/font][font=宋体][font=宋体]梯度洗脱通常用于离子交换色谱，通常有两种方法来改变离子强度和改变[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]。改变离子强度通常是通过在洗脱过程中逐渐增加离子强度来实现的，从而洗脱掉与离子交换剂结合的各种组分；对于[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]变化的洗脱，阳离子交换剂通常为从低到高的[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]洗脱，阴离子交换剂通常是从高到低的[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]洗脱。由于[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]可能对蛋白质稳定性有很大影响，因此通常使用具有不同离子强度的梯度洗脱。梯度洗脱装置介绍较早，可以有线性梯度、凹梯度、凸梯度和分级梯度洗脱方法。通常，线性梯度洗脱具有更好的分离效果，因此通常使用线性梯度洗脱。[/font][/font][font=宋体]洗脱液的选择也是为了确保所有待分离的组分在整个洗脱液梯度范围内是稳定的。第二种是使结合到离子交换器的所有分离的组分能够在洗脱液梯度范围内洗脱。此外，梯度范围可以尽可能小以提高分辨率。[/font][font=宋体][font=Calibri]5.[/font][font=宋体]洗脱速度[/font][/font][font=宋体]洗脱液的流速也影响离子交换色谱的分离效果，洗脱速率通常保持恒定。一般来说，慢洗脱速度要好于快分辨率，但洗脱速度太慢会造成分离时间长、样品扩散、光谱峰宽、分辨率降低等副作用，因此根据实际情况选择合适的洗脱速度。如果洗脱峰相对集中在某个区域，则应减小梯度范围或降低洗脱速度以提高分辨率。如果分辨率良好，但洗脱峰太宽，则可以适当地提高洗脱速度。[/font][font=宋体][font=Calibri]6.[/font][font=宋体]样品的浓缩和脱盐[/font][/font][font=宋体]通过离子交换色谱法获得的样品通常具有较高的盐浓度、较大的体积和较低的样品浓度。因此，通过离子交换色谱法获得的样品应进行浓缩和脱盐。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]离子交换色谱法的应用[/b][/font][font=宋体]离子交换色谱法有着广泛的应用，主要在以下几个方面。[/font][font=宋体][font=Calibri]1.[/font][font=宋体]水处理[/font][/font][font=宋体][font=宋体]离子交换色谱法是一种简单有效的去除水中杂质和离子的方法。聚苯乙烯树脂广泛应用于高纯水的制备、硬水软化和污水处理。纯水可以通过蒸馏制备，但它消耗大量能量，而且制备量小、速度慢、纯度不高。通过离子交换色谱法可以快速、大量地制备高纯水。通常，水依次通过[/font][font=Calibri]H+[/font][font=宋体]型强阳离子交换器，以去除吸附在阳离子交换器上的各种阳离子和杂质；然后，通过[/font][font=Calibri]OH[/font][font=宋体]型强阴离子交换剂，去除阴离子交换剂吸附的各种阴离子和杂质，得到纯水。经过弱阳离子和阴离子交换剂的进一步纯化，可以获得高纯度的纯水。离子交换器在使用一段时间后可以通过再生处理进行再利用。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]2.[/font][font=宋体]小分子的分离和纯化[/font][/font][font=宋体][font=宋体]离子交换色谱法还广泛应用于无机离子、有机酸、核苷酸、氨基酸、抗生素等小分子的分离纯化。例如，分析氨基酸，使用强酸性阳离子聚苯乙烯树脂，将氨基酸混合物置于[/font][font=Calibri]pH2~3[/font][font=宋体]柱上。此时，氨基酸在树脂上结合，然后逐渐提高洗脱液的离子强度和[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]，从而使各种氨基酸以不同的速率洗脱，并可以分离和鉴定。提供所有自动氨基酸分析仪。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]3.[/font][font=宋体]生物大分子的分离纯化[/font][/font][font=宋体]离子交换色谱法是根据物质带电性质的不同，分离纯化蛋白质等生物大分子的重要手段。由于生物样品中蛋白质的复杂性，仅用一次离子交换色谱法通常很难达到高纯度，并且经常与其他分离方法结合使用。离子交换色谱法分离样品应充分利用根据带电性质进行分离的特点，只要选择合适的条件，离子交换色谱可以获得满意的分离结果。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]更多[url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-by-iec][b]离子交换层析蛋白纯化[/b][/url]详情可以关注：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-by-iec[/font][/font]

薄层层析是把支持物均匀涂布于支持板(常用玻璃板，也可用涤纶布等)上形成薄层，然后用相应的溶剂进行展开。薄层层析可根据作为固定相的支持物不同，分为薄层吸附层析(吸附剂)、薄层分配层析(纤维素)、薄层离子交换层析(离子交换剂)、薄层凝胶层析(分子筛凝胶)等。一般实验中应用较多的是以吸附剂为固定相的薄层吸附层析。　　吸附是表面的一个重要性质。任何两个相都可以形成表面，吸附就是其中一个相的物质或溶解于其中的溶质在此表面上的密集现象。在固体与气体之间、固体与液体之间、吸附液体与气体之间的表面上，都可能发生吸附现象。　　物质分子之所以能在固体表面停留，这是因为固体表面的分子(离子或原子)和固体内部分子所受的吸引力不相等。在固体内部，分子之间相互作用的力是对称的，其力场互相抵消。而处于固体表面的分子所受的力是不对称的，向内的一面受到固体内部分子的作用力大，而表面层所受的作用力小，因而气体或溶质分子在运动中遇到固体表面时受到这种剩余力的影响，就会被吸引而停留下来。吸附过程是可逆的，被吸附物在一定条件下可以解吸出来。在单位时间内被吸附于吸附剂的某一表面积上的分子和同一单位时间内离开此表面的分子之间可以建立动态平衡，称为吸附平衡。吸附层析过程就是不断地产生平衡与不平衡、吸附与解吸的动态平衡过程。　　例如用硅胶和氧化铝作支持剂，其主要原理是吸附力与分配系数的不同，使混合物得以分离。当溶剂沿着吸附剂移动时，带着样品中的各组分一起移动，同时发生连续吸附与解吸作用以及反复分配作用。由于各组分在溶剂中的溶解度不同，以及吸附剂对它们的吸附能力的差异，最终将混合物分离成一系列斑点。如作为标准的化合物在层析薄板上一起展开，则可以根据这些已知化合物的Rf值（后面介绍Rf值）对各斑点的组分进行鉴定，同时也可以进一步采用某些方法加以定量。

[font=宋体]层析法无疑是下游处理中主要和常用的操作，因为层析法相比其他单元操作具有某些优势。例如层析法支持高分辨率的效率，可以分离分子性质非常相似的复杂粗制混合物。此外，层析法是生物工艺中遇到的稀释溶液中捕获分子的理想选择。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]柱色谱法[/font][font=Calibri]([/font][font=宋体]层析法[/font][font=Calibri])[/font][font=宋体]的原理是将一个大的蛋白池分离成许多小的蛋白池，其中一些富集了目标蛋白。虽然柱色谱法有昂贵的专业设备，但只需要基本的设备就可以了。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体]在所有色谱技术中，亲和层析法占主要地位。事实上，亲和层析是最特异、最有效的蛋白纯化技术，为靶蛋白纯化提供了合理的依据。它利用了生物分子识别的原理，即生物活性大分子与亲和配体形成特定的可逆复合物的能力。随着高价值蛋白的传统纯化方案被基于亲和色谱等先进的方法所取代，人们的关注重点转向了设计和选择具有高亲和力和特异性的配体。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]从用于生化表征的浓缩蛋白提取物的制备到治疗性重组蛋白的大规模生产，任何纯化过程都需要经济且足量地获得纯化蛋白。因此，下游处理面临的挑战是高产能、高分辨率和高成本效率。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]亲和层析法适用于基于高特异性相互作用的生化混合物的分离。在纯化过程中可以利用具有明确特性的靶蛋白。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-by-iec][b]离子交换层析法[/b][/url]是一种常见的蛋白纯化方法，该方法基于与离子交换器的亲和力分离离子和极性分子。可溶性分子在通过色谱柱时与带相反电荷的不溶性固定相结合。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]尺寸排阻色谱法，根据分子的大小和分子量分离分子。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]疏水作用层析分离表面有疏水氨基酸侧链的靶蛋白，与疏水基团相互作用并结合在一起。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]蛋白纯化的原理为：不同蛋白质的氨基酸序列及空间结构不同，导致其在物理、化学、生物学等性质上存在差异，利用待分离蛋白质与其它蛋白质性质上的差异，即可以设计出一套合理的蛋白纯化方案。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]蛋白的纯化大致分为粗分离阶段和精细纯化阶段两个阶段。粗分离阶段主要将目的蛋白和其他细胞成分如[/font][font=Calibri]RNA[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]等分开，常用的方法为硫酸铵沉淀法。精细纯化阶段的目的是把目的蛋白与其他大小及理化性质接近的蛋白区分开来，[b]常用的方法有：凝胶过滤层析、离子交换层析、疏水层析、亲和层析等。[/b][/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]凝胶过滤层析[/b][/font][font=宋体]凝胶过滤（也叫排阻层析或分子筛）是一种根据分子大小从混合物中分离蛋白质的方法。不同蛋白的形状及分子大小存在差异，在混合物通过含有填充颗粒的凝胶过滤层析柱时，由于各种蛋白的分子大小不同，扩散进入特定大小孔径颗粒内的能力也各异，大的蛋白分子会被先洗脱出来，分子越小，越晚洗脱，从而达到分离蛋白的目的。一般来说，凝胶过滤层析柱越细、越长纯化的效果越好。凝胶过滤层析详细介绍[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]凝胶过滤层析所能纯化的蛋白分子量范围很宽，纯化过程中也不需要能引起蛋白变性的有机溶剂。缺点是所用树脂有轻度的亲水性，电荷密度较高的蛋白容易吸附在上面，不适宜纯化电荷密度较高的蛋白。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]离子交换层析[/b][/font][font=宋体][font=宋体]离子交换层析是一种依据蛋白表面所带电荷量不同进行蛋白分离纯化的技术。蛋白表面通常会带有一定的电荷，电荷的氨基酸残基均匀地分布在蛋白质的表面，在一定条件下可以与阳离子交换柱或阴离子交换柱结合。这种带电分子与固定相之间的结合作用是可逆的，在改变[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]或者用逐渐增加离子强度的缓冲液洗脱时，离子交换剂上结合的物质可与洗脱液中的离子发生交换而被洗脱到溶液中。由于不同物质的电荷不同，其与离子交换剂的结合能力也不同，所以被洗脱到溶液中的顺序也不同，从而达到分离的效果。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]亲和层析[/b][/font][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-by-ac][b]亲和层析纯化[/b][/url]是利用生物大分子物质具有与某些相应的分子专一性可逆结合的特性进行蛋白纯化的技术。该方法适用于从成分复杂且杂质含量远大于目标物的混合中提纯目标物，具有分离效果好、分离条件温和、结合效率高、分离速度快的优点。亲和层析技术可以利用配基与生物分子间的特异性吸附来分离蛋白，也可以在蛋白上加入标签，利用标签与配基之间的特异性结合来纯化蛋白。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]疏水作用层析[/b][/font][font=宋体][font=宋体]疏水作用层析是利用盐[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]水体系中样品分子的疏水基团和层析介质的疏水配基之间疏水力的不同而进行分离的一种层析方法。该法利用了蛋白的疏水性，蛋白经变性处理或处于高盐环境下疏水残基会暴露于蛋白表面，不同蛋白疏水残基与固定相的疏水性配体之间的作用强弱不同，依次用从高至低离子强度洗脱液可将疏水用作由弱至强的组分分离。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]更多详情可以关注：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/chromatography-purification[/font][/font]

用阴离子交换色谱分析多糖中的单糖组成，标准是N-乙酰半乳糖（以PPM为单位的标准曲线），但是由于多糖水解，标准会去乙酰化，变成氨基半乳糖，样品中也是N-乙酰半乳糖，所以水解后都变成氨基半乳糖，峰的对应性很好，那我想请教大家，最后定量出来的还是样品中N-乙酰半乳糖的含量吧（自己有点绕） 还请大家指点 谢谢了

急求、DEAE Sephadex A-25阴离子交换色谱法所需仪器和方法。在校学生一名，导师要求查阅该方法，而我查阅的文献方法，基本上就简单说的“使用GE公司的DEAE Sephadex A-25阴离子交换层析柱进行纯化处理”。这太简洁了啊，想弄清楚柱子需要安在相应的仪器上，然后上样分离？？还是直接手工人为分离过滤就行了？？？需要用到什么器材呢？ 如果只用买一个柱子然后人工手动分离的话，在我们学校就可行。如果是需要安放在什么很贵的仪器上估计就悬了，学校还要现采购，估计导师不会让我做这个方向了。所以各位大神求帮忙解惑

上世纪60、70年代是色谱/层析技术快速发展的时代，首先是层析介质有了飞速的发展，各种人工合成的介质出现，如硅胶、聚苯乙烯二乙烯基树脂、琼脂糖、葡聚糖、聚丙烯酰胺等树脂或凝胶的出现，极大地拓展了层析技术的应用领域和范围，基于不同介质的层析方法也如雨后春笋般不断涌现。如Bio-Rad公司于上世纪50年初推出的分析级离子交换树脂AG系列，广泛用于各种分子物质的分离纯化，包括无机离子、有机酸、核酸以及糖类等。值得一提的是，上世纪4、50年代正是DNA、RNA研究如火如 荼的时期，而Bio-Rad推出的AG系列树脂在核酸纯化方面具有极其出色表现，受到众多研究人员的欢迎与好评。 http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2014/01/A1388734846.JPG_small.jpg http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2014/01/A1388734847.JPG_small.jpg Bio-Rad AG系列树脂 此外，因为马丁（Martin）和辛格（Synge）的钻研与畅想，他们的预言分别在1952年及20世纪60年代被人们所应证。而马丁（Martin）和辛格（Synge）两人也于1952年被授予诺贝尔化学奖。 http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2014/01/A1388734849.JPG_small.jpg Bio-Rad专家介绍：其中设想1“流动相可用气体代替液体，因为与液体相比，分离时候，物质间作用力更小，对分离也就更有好处”也就是气相色谱仪(GC)，即以气体作为流动相的色谱法，1952年诞生，目前，该法已被广泛应用于分离和分析复杂的多组分混合物。特别是挥发性物质，我们都知道挥发性物质在实验或分离时会受到干扰，而气相色谱仪的产生给挥发性的化合物的分离测定带来了划时代的变单。 http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2014/01/A1388734850.JPG_small.jpg 设想2“若能够使用非常细的颗粒填料，并在色谱柱两端施加较大的压差，从而增加了理论培板数，这将会大大提高分离效率。”也就是高效液相色谱HPLC，20世纪60年代末诞生，现在高效液相色谱HPLC已成为化学、生物化学与分子生物学、医药学、农业、环保、商检、药检、法检等学科领域与专业最为重要的分离分析技术，是分析化学家、生物化学家等用以解决他们面临的各种实际分离分析课题必不可少的工具。高效液相色谱的优点是：检测的分辨率和灵敏度高，分析速度快，重复性好，定量精度高，应用范围广。适用于分析高沸点、大分子、强极性、热稳定性差的化合物。其缺点是：不能很好地兼容生物缓冲系统，因为HPLC系统通常采用不锈钢材质，因此具有良好的有机溶剂耐受性以及高压力承受。但是生物缓冲系统往往涉及到各种不同浓度的盐溶液，比如最常用的磷酸盐缓冲液等，而不锈钢系统不能耐受盐腐蚀，因此为了满足生物研究中样品的快速分析、分离，蛋白质快速层析技术应运而生。蛋白质快速液相层析（Fast Protein Liquid Chromatography），基于HPLC技术，但又有别于HPLC，它的主要液体接触部件均采用生物盐溶液耐受的塑料或者橡胶，这样能够极大地降低缓冲盐对系统的腐蚀，如Bio-Rad最早一代层析系统Biological LP，正是为了满足70-80年代间快速发展的生命科学领域内对未知组分、物质的分离、纯化的需求应运而生。在其诞生之初，风靡北美。下期，伯乐生命bio-rad专家将为大家带来21世纪层析法特点及先进层析系统，敬请关注！如今的色层分析法经常用于分析、分离无色的物质，已没有颜色这个特殊的含义，但色谱法或色层分析法这个名字仍保留下来沿用。http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2014/01/A1388734851.JPG_small.jpg 现在我们简称为色谱法、层析法或色谱技术、层析技术。

层析技术层析技术的应用与发展，对于植物各类化学成分的分离鉴定工作起到重大的推动作用。如中药丹参的化学成分在30年代仅从中分离到3种脂溶性色素，分别称为丹参酮Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。但以后进一步的研究，发现除丹参酮Ⅰ为纯品外，Ⅱ、Ⅲ、均为混合结晶。此后通过各种层析方法，迄今已发现15种单体（其中有4种为我国首次发现）。目前新的层析技术不断发展，随着层析理论和电子学、光学、计算机等技术的应用，层析技术已日趋完善。　　一．层析法的基本原理：层析过程是基于样品组分在互不相溶的两“相”溶剂之间的分配系数之差（分配层析），组分对吸附剂吸附能力不同（吸附层析），和寓子交换，分子的大小（排阻层析）而分离。通常又将一般的以流动相为气体的称为[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]气相[/url]层析，流动相为液体的称为液相层析。　　一、 吸附层析法（AdsorptionChromatography）　　（一）吸附剂、溶剂与被分离物性质的关系：液一固吸附层析是运用较多的一种方法，特别适用于很多中等分子量的样品（分子量小于1，000的低挥发性样品）的分离，尤其是脂溶性成分一一般不适用于高分子量样品如蛋白质、多糖或离子型亲水住化合物等的分离。吸附层析的分离效果，决定于吸附剂、溶剂和被分离化合物的性质这三个因素。 　　1． 吸附剂：常用的吸附剂有硅胶、氧化铝、活性炭、硅酸镁、聚酰胺、硅藻土等。　　（1） 硅胶：层析用硅胶为一多孔性物质，分子中具有硅氧烷的交链结构，同时在颗粒表面又有很多硅醇基。硅胶吸附作用的强弱与硅醇基的含量多少有关。硅醇基能够通过氢键的形成而吸附水分，因此硅胶的吸附力随吸着的水分增加而降低。若吸水量超过17％，吸附力极弱不能用作为吸附剂，但可作为分配层析中的支持剂。对硅胶的活化，当硅胶加热至100～110℃时，硅胶表面因氢键所吸附的水分即能被除去。当温度升高至500℃时，硅胶表面的硅醇基也能脱水缩台转变为硅氧烷键，从而丧失了因氢键吸附水分的活往，就不再有吸附剂的性质，虽用水处理亦不能恢复其吸附活性。所以硅胶的活化不宜在较高温度进行（一般在170cC以上即有少量结合水失去）。　　硅胶是一种酸性吸附剂，适用于中性或酸性成分的层析。同时硅胶又是一种弱酸性阳离子交换剂，其表面上的硅醇基能释放弱酸性的氢离子，当遇到较强的碱注化台物，则可因离子交换反应而吸附碱性化合物。　　（2）氧化铝：氧化铝可能带有碱性（因其中可混有碳酸钠等成分），对于分离一些碱性中草药成分，如生物碱类的分离颇为理想。但是碱性氧化铝不宜用于醛、酮、醋、内酯等类型的化合物分离。因为有时碱性氧化铝可与上述成分发生次级反应，如异构化、氧化、消除反应等。除去氧化铝中绚碱性杂质可用水洗至中性，称为中性氧化铝。中性氧化铝仍属于碱性吸附剂的范畴，本适用于酸性成分的分离。用稀硝酸或稀盐酸处理氧化铝，不仅可中和氧化铝中含有的碱性杂质，并可使氧化铝颗粒表面带有NO3一或CI一的阴离子，从而具有离于交换剂的性质，适合于酸性成分的层析，这种氧化铝称为酸性氧化铝。供层析用的氧化铝，用于拄层析的，其粒度要求在100～160目之间。粒度大子100目，分离效果差：小于160目，溶浓流速大慢，易使谱带扩散。样品与氧化铝的用量比，一般在1：20～50之间层析柱的内径与柱长比例在1：10-20之向。　　在用溶剂冲洗柱时，流速不宜过快，洗脱液的流速一般以每半～1小时内流出液体的毫升数与所用吸附剂的重量（克）相等为合适。　　（3）活性炭：是使用较多的一种非极性吸附剂。一般需要先用稀盐酸洗涤，其次用乙醇洗，再以水洗净，于80℃干燥后即可供层析用。层析用的活性炭，最好选用颗粒活注炭，若为活性炭细粉，则需加入适量硅藻土作为助滤剂一并装柱，以免流速太慢。活性炭主要且于分离水溶性成分，如氨基酸、糖类及某些甙。活性炭的有为吸附作用，在水溶液中最强，在有机溶剂中则较低弱。故水的洗脱能力最弱，而有机溶剂则较强。例如以醇-水进行洗脱时，则随乙醇浓度的递增而洗脱力增加。活性炭对芳香族化合物的吸附力大于脂肪族化合物，对大分子化合物的吸附力大于小分子化合物。利用这些吸附性的差别，可将水溶性芳香族物质与脂肪族物质分开，单糖与多糖分开，氨基酸与多肽分开。　　2．溶剂：层析过程中溶剂的选择，对组分分离关系极大。在柱层析时所用的溶剂（单一剂或混合溶剂）习惯上称洗脱剂，用于薄层或纸层析时常称展开剂。洗脱剂的选择，须根据被分离物质与所选用的吸附剂性质这两者结合起来加以考虑在用极性吸附剂进行层析时，当被分离物质为弱极性物质，一般选用弱极性溶剂为洗脱剂；被分离物质为强极性成分，则须选用极性溶剂为洗脱剂。如果对某一极性物质用吸附性较弱的吸附剂（如以硅藻土或滑石粉代替硅胶），则洗脱剂的极性亦须相应降低。　　在柱层操作时，被分离样品在加样时可采用于法，亦可选一适宜的溶剂将样品溶解后加入。溶解样品的溶剂应选择极性较小的，以便被分离的成分可以被吸附。然后渐增大溶剂的极性。这种极性的增大是一个十分缓慢的过程，称为“梯度洗脱”，使吸附在层析柱上的各个成分逐个被洗脱。如果极性增大过诀（梯度太大），就不能获得满意的分离。溶剂的洗脱能力，有时可以用溶剂的介电常数（ε）来表示。介电常数高，洗脱能力就大。以上的洗脱顺序仅适用于极性吸附剂，如硅胶、氧化铝。对非极性吸附剂，如活性炭，则正好与上述顺序相反，在水或亲水住溶剂中所形成的吸附作用，较在脂溶性溶剂中为强。　　3．被分离物质的性质：被分离的物质与吸附剂，洗脱剂共同构成吸附层析中的三个要素，彼此紧密相连。在指定的吸附剂与洗脱剂的条件下，各个成分的分离情况，直接与被分离物质的结构与性质有关。对极性吸附剂而言，成分的极性大，吸附住强。 　　当然，中草药成分的整体分子观是重要的，例如极性基团的数目愈多，被吸附的住能就会更大些，在同系物中碳原子数目少些，被吸附也会强些。总之，只要两个成分在结构上存在差别，就有可能分离，关键在于条件的选择。要根据被分离物质的性质，吸附剂的吸附强度，与溶剂的性质这三者的相互关系来考虑。首先要考虑被分离物质的极性。如被分离物质极性很小为不含氧的萜烯，或虽含氧但非极性基团，则需选用吸附性较强的吸附剂，并用弱极性溶剂如石油醚或苯进行洗脱。但多数中药成分的极性较大，则需要选择吸附性能较弱的吸附剂（一般Ⅲ～Ⅳ级）。采用的洗脱剂极性应由小到大按某一梯度递增，或可应用薄层层析以判断被分离物在某种溶剂系统中的分离情况。此外，能否获得满意的分离，还与选择的溶剂梯度有很大关系。现以实例说明吸附层析中吸附剂、洗脱剂与样品极性之间的关系。如有多组分的混合物，象植物油脂系由烷烃、烯烃、舀醇酯类、甘油三酸醋和脂肪酸等组份。当以硅胶为吸附剂时，使油脂被吸附后选用一系列混合溶剂进行洗脱，油脂中各单一成分即可按其极性大小的不同依次被洗脱。 　　又如对于C-27甾体皂甙元类成分，能因其分字中羟基数目的多少而获得分离：将混合皂甙元溶于含有5％氯仿的苯中，加于氧化铝的吸附柱上，采用以下的溶剂进行梯度洗脱。如改用吸附性较弱的硅酸镁以替代氧化铝，由于硅酸镁的吸附性较弱，洗脱剂的极牲需相应降低，亦即采用苯或含5％氯仿的苯，即可将一元羟基皂甙元从吸附剂上洗脱下来。这一例子说明，同样的中草药成分在不同的吸附剂中层析时，需用不同的溶剂才能达到相同的分离效果，从而说明吸附剂、溶剂和欲分离成分三者的相互关系。

农残检测的前处理中常涉及到柱层析法和固相萃取，我的问题是：[color=#DC143C][B]（1）[/B][/color]柱层析法是不是就是吸附柱色谱法[B]？[/B]（2）从文献上得知：柱层析法的基本原理是将提取液中的农药和杂质一起通过一根适宜的吸附柱, 使它们被吸附在表面活性的吸附剂上,然后用适当极性的溶剂来淋洗, 农药一般先被淋洗出来, 而脂肪、蜡质和色素等杂质持留在吸附柱上, 从而达到分离纯化的目的。层析柱有以下几种: ①弗罗里硅土柱 ②氧化铝柱 ③硅胶柱 ④活性炭柱 固相萃取( SPE) 法是由液固萃取和柱液相色谱技术相结合发展而来的,通过使样品在吸附剂与溶剂中溶解度及功能团的相互作用最佳化来影响样品的滞留与洗脱,从而达到分离目的,它是一种柱色谱分离过程,分离机理、固定相和淋洗溶剂的选择性等方面与高效液相色谱类似。SPE柱的种类有正相SPE柱,其填料主要为硅胶、氧化铝、硅镁吸附剂等,反相SPE柱填料主要为C18 ,还有离子交换柱等。 这样看来二者原理一样啊，只是农药被淋洗顺序先后不同，那为什么柱层析法的缺点是试剂消耗量大，手续繁琐费时，对装柱技术要求高。而固相萃取所消耗试剂量明显减少，在很多方面优于柱层析法呢，能不能将二者具体比较一下？感谢大家的帮忙啊，谢谢！！！

层析法又称色层分析法或色谱法（Chromatography），它是在1903-1906年由俄国植物学家M. Tswett首先系统提出来的。他将叶绿素的石油醚溶液通过CaCO3管柱，并继续以石油醚淋洗，由于CaCO3对叶绿素中各种色素的吸附能力不同，色素被逐渐分离，在管柱中出现了不同颜色的谱带或称色谱图（Chromatogram）。如图3－1 所示： 当时这种方法并没引起人们的足够注意，直到1931年将该方法应用到分离复杂的有机混合物，人们才发现了它的广泛用途。随着科学技术的发展以及生产实践的需要，层析技术也得到了迅速的发展。为此作出重要贡献的当推英国生物学家Martin和Synge。他们首先提出了色谱塔板理论。这是在色谱柱操作参数基础上模拟蒸馏理论，以理论塔板来表示分离效率，定量的描述、评价层析分离过程。其次，他们根据液－液逆流萃取的原理，发明了液－液分配色谱。特别是他们提出了远见卓识的预言：一、流动相可用气体代替液体，与液体相比，物质间的作用力减小了，这对分离更有好处；二、使用非常细的颗粒填料并在柱两端施加较大的压差，应能得到最小的理论塔板高(即增加了理论塔板数)，这将会大大提高分离效率。前者预见了[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]气相色谱[/url]的产生，并在1952年诞生了[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]气相色谱仪[/url]，它给挥发性的化合物的分离测定带来了划时代的变革；后者预见了高效液相色谱（HPLC）的产生，在60年代末也为人们所实现，现在HPLC已成为生物化学与分子生物学、化学等领域不可缺少的分析分离工具之一。因此, Martin和Synge于1952年被授予诺贝尔化学奖。如今的色层分析法经常用于分离无色的物质，已没有颜色这个特殊的含义。但色谱法或色层分析法这个名字仍保留下来沿用。现在我们简称为层析法或层析技术。 层析法的最大特点是分离效率高，它能分离各种性质极相类似的物质。而且它既可以用于少量物质的分析鉴定，又可用于大量物质的分离纯化制备。因此，作为一种重要的分析分离手段与方法，它广泛地应用于科学研究与工业生产上。现在，它在石油、化工、医药卫生、生物科学、环境科学、农业科学等领域都发挥着十分重要的作用。层析的基本理论 层析法是一种基于被分离物质的物理、化学及生物学特性的不同，使它们在某种基质中移动速度不同而进行分离和分析的方法。例如：我们利用物质在溶解度、吸附能力、立体化学特性及分子的大小、带电情况及离子交换、亲和力的大小及特异的生物学反应等方面的差异，使其在流动相与固定相之间的分配系数（或称分配常数）不同，达到彼此分离的目的。 对于一个层析柱来说，可作如下基本假设： 1. 层析柱的内径和柱内的填料是均匀的，而且层析柱由若干层组成。每层高度为H，称为一个理论塔板。塔板一部分为固定相占据，一部分为流动相占据，且各塔板的流动相体积相等，称为板体积，以Vm表示。 2. 每个塔板内溶质分子在固定相与流动相之间瞬间达到平衡，且忽略分子纵向扩散。 3. 溶质在各塔板上的分配系数是一常数，与溶质在塔板的量无关。 4. 流动相通过层析柱可以看成是脉冲式的间歇过程（即不连续过程）。从一个塔板到另一个塔板流动相体积为Vm。当流过层析柱的流动相的体积为V时，则流动相在每个塔板上跳越的次数为n:n = 5. 溶质开始加在层析柱的第零塔板上。根据以上假定，将连续的层析过程分解成了间歇的动作，这与多次萃取过程相似，一个理论塔板相当于一个两相平衡的小单元。层析的基本概念1. 固定相： 固定相是层析的一个基质。它可以是固体物质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂等），也可以是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液），这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附，溶解，交换等作用。它对层析的效果起着关键的作用。 2. 流动相： 在层析过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体或超临界体等，都称为流动相。柱层析中一般称为洗脱剂，薄层层析时称为展层剂。它也是层析分离中的重要影响因素之一。3. 分配系数及迁移率（或比移值）： 分配系数是指在一定的条件下，某种组分在固定相和流动相中含量（浓度）的比值，常用K来表示。分配系数是层析中分离纯化物质的主要依据。 K=Cs/Cm 其中Cs: 固定相中的浓度，Cm: 流动相中的浓度。 迁移率（或比移值）是指：在一定条件下，在相同的时间内某一组分在固定相移动的距离与流动相本身移动的距离之比值。常用Rf来表示。（Rf大于或等于1）可以看出：K增加，Rf减少；反之，会减少，Rf增加。 实验中我们还常用相对迁移率的概念。相对迁移率是指：在一定条件下，在相同时间内，某一组分在固定相中移动的距离与某一标准物质在固定相中移动的距离之比值。它可以小于等于1，也可以大于1。用Rx来表示。不同物质的分配系数或迁移率是不同的。分配系数或迁移率的差异程度是决定几种物质采用层析方法能否分离的先决条件。很显然，差异越大，分离效果越理想。 分配系数主要与下列因素有关：①被分离物质本身的性质；②固定相和流动相的性质；③层析柱的温度。对于温度的影响有下列关系式： lnK = －(DG0/RT) 式中： K为分配系数（或平衡常数） DG0为标准自由能变化 R为气体常数 T为绝对温度 这是层析分离的热力学基础。一般情况下，层析时组分的DG0为负值，则温度与分配系数成反比关系。通常温度上升20°C, K值下降一半，它将导致组分移动速率增加。这也是为什么在层析时最好采用恒温柱的原因。有时对于K值相近的不同物质，可通过改变温度的方法，增大K值之间的差异，达到分离的目的。 4. 分辨率（或分离度） 分辨率一般定义为：相邻两个峰的分开程度。用Rs来表示。图3－2 是计算分辨率的示意图。 分辨率： 由上式可见，Rs值越大，两种组分分离的越好。当Rs = 1时，两组分具有教好的分离，互相沾染约2%，即每种组分的纯度约为98%。当Rs=1.5时，两组分基本完全分开，每种组分的纯度可达到99.8%。如果两种组分的浓度相差较大时，尤其要求较高的分辨率。 为了提高分辨率Rs 的值，可采用以下方法： ⑴ 使理论塔板数N增大，则Rs上升。 ① 增加柱长，N可增大，可提高分离度，但它造成分离的时间加长，洗脱液体积增大，并使洗脱峰加宽，因此不是一种特别好的办法。 ② 减小理论塔板的高度。如减小固定相颗粒的尺寸，并加大流动相的压力。高效液相色谱(HPLC)就是这一理论的实际应用。一般液相层析的固定相颗粒为100mm；而HPLC柱子的固定相颗粒为10mm以下，且压力可达150kg/cm。它使Rs大大提高，也使分离的效率大大提高了。 ③ 采用适当的流速，也可使理论塔板的高度降低，增大理论塔板数。太高或太低的流速都是不可取的。对于一个层析柱，它有一个最佳的流速。特别是对于[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]气相色谱[/url]，流速影响相当大。 ⑵ 改变容量因子D（固定相与流动相中溶质量的分布比）。一般是加大D，但D的数值通常不超过10，再大对提高Rs不明显，反而使洗脱的时间延长，谱带加宽。一般D限制在1 ￡ D ￡ 10，最佳范围在1.5-5之间。我们可以通过改变柱温（一般降低温度），改变流动相的性质及组成（如改变pH值，离子强度，盐浓度，有机溶剂比例等），或改变固定相体积与流动相体积之比（如用细颗粒固定相，填充的紧密与均匀些），提高D值，使分离度增大。 ⑶ 增大a（分离因子，也称选择性因子，是两组分容量因子D之比），使Rs变大。实际上，使 a 增大，就是使两种组分的分配系数差值增大。同样，我们可以通过改变固定相的性质、组成，改变流动相的性质、组成，或者改变层析的温度，使 a 发生改变。应当指出的是，温度对分辨率的影响，是对分离因子与理论塔板高度的综合效应。因为温度升高，理论塔板高度有时会降低，有时会升高，这要根据实际情况去选择。通常，a 的变化对Rs影响最明显。 总之，影响分离度或者说分离效率的因素是多方面的。我们应当根据实际情况综合考虑，特别是对于生物大分子，我们还必须考虑它的稳定性，活性等问题。如pH值、温度等都会产生较大的影响，这是生化分离绝不能忽视的。否则，我们将不能得到预期的效果。5. 正相色谱与反相色谱 正相色谱是指固定相的极性高于流动相的极性，因此，在这种层析过程中非极性分子或极性小的分子比极性大的分子移动的速度快，先从柱中流出来。 反相色谱是指固定相的极性低于流动相的极性，在这种层析过程中，极性大的分子比极性小的分子移动的速度快而先从柱中流出。 一般来说，分离纯化极性大的分子（带电离子等）采用正相色谱（或正相柱），而分离纯化极性小的有机分子（有机酸、醇、酚等）多采用反相色谱（或反相柱）。

[size=24px][color=#ff0000]各种分子筛，质量参差不齐[/color][/size]分子筛是常用的吸附剂。在气体分析领域，分子筛填充柱至今还有着不可替代的用途。然而，目前市面上能买到的分子筛色谱柱和分子筛吸附剂质量参差不齐，分离性能差别较大。进口品牌，比如美国OV、美国色谱科、日本信和等产品性能很好，但价格较高。国产品牌也很多，但大部分性能不太理想，主要表现在：（1）柱效不高；（2）峰型不对称、拖尾；（3）吸附能力略差，保留较弱。以最常用的5A分子筛为例，从以下几张色谱图的对比中可见一二。[img=,690,907]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2022/09/202209091609550129_1190_2204387_3.jpg!w690x907.jpg[/img][img=,690,907]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2022/09/202209091615313126_8276_2204387_3.jpg!w690x907.jpg[/img][img=,690,1076]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2022/09/202209091609550275_3931_2204387_3.jpg!w690x1076.jpg[/img]以上三个都是标称的5A分子筛。第一张图为美国OV产5A分子筛，柱效可达800~900塔板/米，峰型尖锐，对称性也较好。第二张图为早期上海试剂厂精选的国内质量最好的5A分子筛固定相，峰型对称性较好，但是柱效不高，不到400塔板/米。第三张图为目前市面上买到的常见5A分子筛吸附剂，虽然也声称是色谱专用，但是效果较差，柱效和峰型均不太好。.[size=24px][color=#ff0000]影响分子筛色谱性能的原因有哪些？[/color][/size]这一问题要详解较为复杂，因为到目前为止关于分子筛的吸附机理仍然没有定论，但是以下两点还是比较清楚的：（1）孔结构影响传质阻力，从而影响柱效。目标物要能够扩散进入吸附剂内部，需要靠孔道提供路径。大而浅的孔好比宽阔的高速公路，小而深的孔犹如曲折的乡间小路，二者的传质效率差异明显。传质阻力大则导致柱效低。（2）组成影响吸附能力。分子筛具有以硅铝复合氧化物形成的层状结构，而金属离子穿插在层间，对孔径和孔内的电荷分布产生影响，从而影响对不同物质的吸附能力。因此Ca-A分子筛、Na-A分子筛、K-A分子筛等不同型号，吸附能力差异明显。.[size=24px][color=#ff0000]离子交换，一个简单却容易忽视的步骤[/color][/size]在分子筛的生产过程中，对于常见的A型分子筛，都是先生产Na-A型分子筛，也就是4A分子筛，然后通过离子交换将钠离子转化为钙离子或者钾离子，于是就得到了5A分子筛或者3A分子筛。离子交换反应很简单，将4A分子筛与盐溶液混合浸泡即可，制备5A分子筛的离子交换反应如下：[img=,690,27]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2022/09/202209091652554928_2381_2204387_3.png!w690x27.jpg[/img]但是，离子交换是平衡反应，实际上并不完全按上述反应式定量反应。生产中如果不进行严格的控制，所得产物不能保证全部都是5A分子筛，而可能是5A分子筛与4A分子筛的混合物，或者是介于5A与4A之间的分子筛，这就会使得产品的分离性能受到严重的影响。而目前大部分厂家采用的生产工艺都是简单的等摩尔交换法，就是用理论计算量的钙离子溶液与4A分子筛混合加热，一次性进行交换。按这种生产工艺，交换不完全的问题在所难免，性能必然大打折扣。如果能使用过量的钙溶液或者多交换几次，保证交换完全，必然能使性能提高。.[size=24px][color=#ff0000]多加一步处理，性能显著提升[/color][/size]为了验证上述推断，我以国内某知名试剂公司的5A分子筛为原料，将其用氯化钙溶液离子交换处理2次，具体操作为：10g分子筛试样加1mol/L氯化钙溶液20mL，搅匀后加盖，在90度烘箱中放置8小时，然后水洗。重复处理一次。最后120度干燥3小时、250度3小时，按常规方法装柱，280度通氮气老化。结果对比如下：[img=,690,575]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2022/09/202209091719326639_1078_2204387_3.png!w690x575.jpg[/img][img=,690,1076]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2022/09/202209091728475320_289_2204387_3.jpg!w690x1076.jpg[/img]上图对比可以明显看出，原商品分子筛柱效很低，峰很宽，而且保留能力较弱。而经过钙溶液交换后，保留能力显著增强，峰型也更加尖锐，柱效达到约600塔板/米，接近进口分子筛的柱效水平。由此可见，原商品5A分子筛在生产过程中肯定存在钙离子交换不完全的问题，实际上含有较多分离效果不佳的4A分子筛或者中间产物。而经过进一步的钙离子交换处理，使得转化完全了，性能也就显著提升。.[size=24px][color=#ff0000]细节决定成败，分析仪器需要精益求精，不能凑合[/color][/size]上述示例看起来非常简单，却对产品质量有着显著的影响，这里面的原理也并不复杂，略微懂得化学知识就能够想到。但是国内的相关生产厂家却几乎没有重视这一问题的。我买过多个不同厂家的色谱级5A分子筛，包括阿拉丁、麦克林等知名试剂厂商，交换反应不完全的问题均不同程度的存在。而进一步处理保证交换完全后，性能都有不同程度的提升。这证明该问题具有普遍性。这一现象反映出目前国内生产厂家缺乏精益求精的精神，做产品不把质量控制放在第一位，而是一味地追求降低成本，凑合能用就行。而这一思想正是严重制约国产分析仪器发展的毒瘤。分析化学是关于定量的科学，准与不准只在点滴之间，差一点就是不合格，绝不能凑合。国产仪器只有能接受这一观念，才有可能真正的发展壮大，否则就永远是劣质低价的代名词。

以离子交换剂（如聚苯乙烯基质离子交换树脂）作固定相，基于流动相中溶质（样品）离子和固定相表面离子交换基团之间的离子交换作用而达到溶质保留和分离的离子色谱法。分离机理除电场相互作用（离子交换）外，还常常包括非离子性吸附等次要保留作用。其固定相主要是聚苯乙烯和多孔硅胶作基质的离子交换剂。离子交换色谱法最适合无机离子的分离，是无机阴离子的最理想的分析方法。

[font=宋体][font=宋体]亲和层析是应用生物高分子与配基可逆结合的原理，将配基通过共价键牢固结合于载体上而制得的层析系统。这种可逆结合的作用主要是靠生物高分子对它的配基的空间结构的识别。常用的生物亲和关系有酶[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]底物、底物类似物、抑制剂、激活剂、辅因子，抗体[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]抗原，激素[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]受体蛋白、载体蛋白，外源凝集素[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]多糖、糖蛋白、细胞表面受体，核酸[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]互补核苷酸序列、组蛋白、核酸结合蛋白等，具有高效、简单、快速的优点，是当前最为理想的分离纯化蛋白的方法。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]亲和层析纯化步骤：[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1[/font][font=宋体]、捕获阶段[/font][/font][font=宋体]在样品捕获阶段，通过将速度和容量进行优化组合，使样品中的目标产物被有效的分离、浓缩和稳定化处理。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]捕获阶段一般选择亲和层析，离子交换层析或者疏水层析，通过吸附作用使样品和杂质实现分离。如果样品带有标签，第一步可以选择标签蛋白亲和层析；如果样品不带有标签，可以考虑使用离子交换[/font][font=Calibri]/[/font][font=宋体]疏水层析。由于捕获阶段一般样品量较大，杂质较多，所以捕获阶段分辨率不是特别主要考虑的因素，可以主要考虑增加上样量和速度。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]、中度纯化阶段[/font][/font][font=宋体]在中度纯化阶段，应将注意力集中于将目标样品和大多数大体积的杂质分开。在中度纯化阶段，速度不是最重要的因素，因为经过捕获阶段样品体积会缩减。中度纯化阶段一般建议使用离子交换层析或者疏水层析进一步提高样品的纯度。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]3[/font][font=宋体]、精细纯化阶段[/font][/font][font=宋体]在精细纯化阶段，关注的重点就是如何达到高分辨率，从而完成最终的纯化。在此前的步骤中已经去除了大部分的污染物和杂质。如果需要达到较高的分辨率，可能会在此步骤造成一些回收率的损失。精细纯化阶段一般建议使用高分辨率的分子筛或者高分辨率的离子交换层析柱。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]亲和层析纯化优缺点：[/b][/font][font=宋体][font=Calibri]1. [/font][font=宋体]亲和层析法是分离蛋白质的一种极为有效的方法，它经常只需经过一步处理即可使某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出来，而且纯度很高。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]2. [/font][font=宋体]是最有效的生物活性物质纯化方法，它对生物分子选择性的吸附和分离，可以取得很高的纯化倍数。此外蛋白在纯化过程中得到浓缩，结合到亲和配基后，性质更加 稳定，其结果提高了活性回收率。此外它可以减少纯化步骤，缩短纯化时间，对不稳定蛋白的纯化十分有利。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]3. [/font][font=宋体]除特异性的吸附外，仍然会因分子的错误认别和分子间非选择性的作用力而吸附一些杂蛋白质，另洗脱过程中的配体不可避免的脱落进入分离体系。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]4. [/font][font=宋体]载体较昂贵，机械强度低，配基制备困难，有的配基本身要经过分离纯化，配基与载体耦联条件激烈等。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]更多详情可以参看义翘神州[url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-by-ac][b]亲和层析纯化蛋白[/b][/url]：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-by-ac[/font][/font]

早在20世纪初，俄国著名植物化学家次维特提出色谱概念以后，直到1975年，美国Dow化学公司的H。Small等人才首先提出了离子交换分离、抑制电导检测分析思维，即提出了离子色谱这一概念。色谱技术经历了半个多世纪的发展，才发展到离子色谱的阶段。这一概念的提出，便立即被商品化、产业化。由Dow公司组建的Dionex公司最早生产离子色谱并申请了专利。我国也从20世纪80年代才开始引进离子色谱仪器。　　离子色谱按照分离原理分类，可以分3种不同类型，分别是离子交换色谱、离子对色谱和离子排斥色谱。。　　其中离子色谱分离，主要是应用离子交换的原理，采用低交换容量的离子交换树脂来分离离子，它在离子色谱中应用最广泛，其主要填料类型为有机离子交换树脂。　　离子对色谱的固定相为疏水型的中性填料，用于种植牙阴离子分离的对离子是烷基胺类，如氢氧化四丁基铵、氢氧化十六烷基三甲烷等。用于阳离子分离的对离子是烷基磺酸类，如己烷磺酸钠、庚烷磺酸钠等。　　离子排斥色谱，主要根据Donnon膜排斥效应：电离组分受排斥不被保存，而弱酸则有一定保存的原理制成。离子排斥色谱主要用于分离有机酸以及无机含氧酸根，如硼酸根、碳酸根和硫酸根、有机酸等。目前，离子色谱的应用有：无机阴离子的检测；无机阳离子的检测和有机阴离子和阳离子分析，主要包括生物胺，有机酸和糖类分析。　　具体在实验中，用户应该结合实际选择合适的分离方式，例如上海牙防所水合能高和疏水性弱的离子，如Cl-或K，最好用HPIC分离。水合能低和疏水性强的离子，如高氯酸(ClO4-)或四丁基铵，最好用亲水性强的离子交换分离柱或MPIC分离。有一定疏水性也有明显水合能的pKa值在1与7之间的离子，如乙酸盐或丙酸盐，最好用HPICE分离。有些离子，既可用阴离子交换分离，也可用阳离子交换分离，如氨基酸，生物碱和过渡金属等。　　随着不断的实验与改进，离子色谱也在不断发展，无论是在检测方法，还是色谱柱方面，相信离子色谱在今后的应用会越来越广泛。

层析技术的应用与发展，对于植物各类化学成分的分离鉴定工作起到重大的推动作用。如中药丹参的化学成分在30年代仅从中分离到3种脂溶性色素，分别称为丹参酮Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。但以后进一步的研究，发现除丹参酮Ⅰ为纯品外，Ⅱ、Ⅲ、均为混合结晶。此后通过各种层析方法，迄今已发现15种单体（其中有4种为我国首次发现）。目前新的层析技术不断发展，随着层析理论和电子学、光学、计算机等技术的应用，层析技术已日趋完善。　　一．层析法的基本原理：层析过程是基于样品组分在互不相溶的两“相”溶剂之间的分配系数之差（分配层析），组分对吸附剂吸附能力不同（吸附层析），和寓子交换，分子的大小（排阻层析）而分离。通常又将一般的以流动相为气体的称为气相层析，流动相为液体的称为液相层析。　　一、 吸附层析法（AdsorptionChromatography）　　（一）吸附剂、溶剂与被分离物性质的关系：液一固吸附层析是运用较多的一种方法，特别适用于很多中等分子量的样品（分子量小于1，000的低挥发性样品）的分离，尤其是脂溶性成分一一般不适用于高分子量样品如蛋白质、多糖或离子型亲水住化合物等的分离。吸附层析的分离效果，决定于吸附剂、溶剂和被分离化合物的性质这三个因素。　　1． 吸附剂：常用的吸附剂有硅胶、氧化铝、活性炭、硅酸镁、聚酰胺、硅藻土等。　　（1） 硅胶：层析用硅胶为一多孔性物质，分子中具有硅氧烷的交链结构，同时在颗　　粒表面又有很多硅醇基。硅胶吸附作用的强弱与硅醇基的含量多少有关。硅醇基能够通过氢键的形成而吸附水分，因此硅胶的吸附力随吸着的水分增加而降低。若吸水量超过17％，吸附力极弱不能用作为吸附剂，但可作为分配层析中的支持剂。对硅胶的活化，当硅胶加热至100～110℃时，硅胶表面因氢键所吸附的水分即能被除去。当温度升高至500℃时，硅胶表面的硅醇基也能脱水缩台转变为硅氧烷键，从而丧失了因氢键吸附水分的活往，就不再有吸附剂的性质，虽用水处理亦不能恢复其吸附活性。所以硅胶的活化不宜在较高温度进行（一般在170cC以上即有少量结合水失去）。　　硅胶是一种酸性吸附剂，适用于中性或酸性成分的层析。同时硅胶又是一种弱酸性阳离子交换剂，其表面上的硅醇基能释放弱酸性的氢离子，当遇到较强的碱注化台物，则可因离子交换反应而吸附碱性化合物。　　（2）氧化铝：氧化铝可能带有碱性（因其中可混有碳酸钠等成分），对于分离一些碱性中草药成分，如生物碱类的分离颇为理想。但是碱性氧化铝不宜用于醛、酮、醋、内酯等类型的化合物分离。因为有时碱性氧化铝可与上述成分发生次级反应，如异构化、氧化、消除反应等。除去氧化铝中绚碱性杂质可用水洗至中性，称为中性氧化铝。中性氧化铝仍属于碱性吸附剂的范畴，本适用于酸性成分的分离。用稀硝酸或稀盐酸处理氧化铝，不仅可中和氧化铝中含有的碱性杂质，并可使氧化铝颗粒表面带有NO3一或CI一的阴离子，从而具有离于交换剂的性质，适合于酸性成分的层析，这种氧化铝称为酸性氧化铝。供层析用的氧化铝，用于拄层析的，其粒度要求在100～160目之间。粒度大子100目，分离效果差：小于160目，溶浓流速大慢，易使谱带扩散。样品与氧化铝的用量比，一般在1：20～50之间层析柱的内径与柱长比例在1：10-20之向。　　在用溶剂冲洗柱时，流速不宜过快，洗脱液的流速一般以每半～1小时内流出液体的毫升数与所用吸附剂的重量（克）相等为合适。　　（3）活性炭：是使用较多的一种非极性吸附剂。一般需要先用稀盐酸洗涤，其次用乙醇洗，再以水洗净，于80℃干燥后即可供层析用。层析用的活性炭，最好选用颗粒活注炭，若为活性炭细粉，则需加入适量硅藻土作为助滤剂一并装柱，以免流速太慢。活性炭主要且于分离水溶性成分，如氨基酸、糖类及某些甙。活性炭的有为吸附作用，在水溶液中最强，在有机溶剂中则较低弱。故水的洗脱能力最弱，而有机溶剂则较强。例如以醇-水进行洗脱时，则随乙醇浓度的递增而洗脱力增加。活性炭对芳香族化合物的吸附力大于脂肪族化合物，对大分子化合物的吸附力大于小分子化合物。利用这些吸附性的差别，可将水溶性芳香族物质与脂肪族物质分开，单糖与多糖分开，氨基酸与多肽分开。　　2．溶剂：层析过程中溶剂的选择，对组分分离关系极大。在柱层析时所用的溶剂（单一剂或混合溶剂）习惯上称洗脱剂，用于薄层或纸层析时常称展开剂。洗脱剂的选择，须根据被分离物质与所选用的吸附剂性质这两者结合起来加以考虑在用极性吸附剂进行层析时，当被分离物质为弱极性物质，一般选用弱极性溶剂为洗脱剂；被分离物质为强极性成分，则须选用极性溶剂为洗脱剂。如果对某一极性物质用吸附性较弱的吸附剂（如以硅藻土或滑石粉代替硅胶），则洗脱剂的极性亦须相应降低。　　在柱层操作时，被分离样品在加样时可采用于法，亦可选一适宜的溶剂将样品溶解后加入。溶解样品的溶剂应选择极性较小的，以便被分离的成分可以被吸附。然后渐增大溶剂的极性。这种极性的增大是一个十分缓慢的过程，称为“梯度洗脱”，使吸附在层析柱上的各个成分逐个被洗脱。如果极性增大过诀（梯度太大），就不能获得满意的分离。溶剂的洗脱能力，有时可以用溶剂的介电常数（ε）来表示。介电常数高，洗脱能力就大。以上的洗脱顺序仅适用于极性吸附剂，如硅胶、氧化铝。对非极性吸附剂，如活性炭，则正好与上述顺序相反，在水或亲水住溶剂中所形成的吸附作用，较在脂溶性溶剂中为强。　　3．被分离物质的性质：被分离的物质与吸附剂，洗脱剂共同构成吸附层析中的三个要素，彼此紧密相连。在指定的吸附剂与洗脱剂的条件下，各个成分的分离情况，直接与被分离物质的结构与性质有关。对极性吸附剂而言，成分的极性大，吸附住强。　　当然，中草药成分的整体分子观是重要的，例如极性基团的数目愈多，被吸附的住能就会更大些，在同系物中碳原子数目少些，被吸附也会强些。总之，只要两个成分在结构上存在差别，就有可能分离，关键在于条件的选择。要根据被分离物质的性质，吸附剂的吸附强度，与溶剂的性质这三者的相互关系来考虑。首先要考虑被分离物质的极性。如被分离物质极性很小为不含氧的萜烯，或虽含氧但非极性基团，则需选用吸附性较强的吸附剂，并用弱极性溶剂如石油醚或苯进行洗脱。但多数中药成分的极性较大，则需要选择吸附性能较弱的吸附剂（一般Ⅲ～Ⅳ级）。采用的洗脱剂极性应由小到大按某一梯度递增，或可应用薄层层析以判断被分离物在某种溶剂系统中的分离情况。此外，能否获得满意的分离，还与选择的溶剂梯度有很大关系。现以实例说明吸附层析中吸附剂、洗脱剂与样品极性之间的关系。如有多组分的混合物，象植物油脂系由烷烃、烯烃、舀醇酯类、甘油三酸醋和脂肪酸等组份。当以硅胶为吸附剂时，使油脂被吸附后选用一系列混合溶剂进行洗脱，油脂中各单一成分即可按其极性大小的不同依次被洗脱。　　又如对于C-27甾体皂甙元类成分，能因其分字中羟基数目的多少而获得分离：将混合皂甙元溶于含有5％氯仿的苯中，加于氧化铝的吸附柱上，采用以下的溶剂进行梯度洗脱。如改用吸附性较弱的硅酸镁以替代氧化铝，由于硅酸镁的吸附性较弱，洗脱剂的极牲需相应降低，亦即采用苯或含5％氯仿的苯，即可将一元羟基皂甙元从吸附剂上洗脱下来。这一例子说明，同样的中草药成分在不同的吸附剂中层析时，需用不同的溶剂才能达到相同的分离效果，从而说明吸附剂、溶剂和欲分离成分三者的相互关系。

Sepax Proteomix系列离子交换色谱柱的填料是以刚性、球形、高度交联的聚苯乙烯-二乙烯基苯（PS/DVB）树脂颗粒为基质、树脂表面涂覆一层纳米厚度的中性的亲水性聚合物薄膜、在亲水性薄层的表面通过共价化学键合致密且均匀的离子交换功能基团而成。亲水性的薄层完全覆盖疏水的树脂表面，可以消除与生物分子之间的非特异性结合作用，从而达到高效分离。 Sepax Proteomix系列离子交换色谱柱可以耐受高温（80℃）与高压（4,000psi），其pH适用范围为2-12，适用于分离蛋白质、低聚核苷酸和多肽类生物样品。流动相的选择范围广，可以是水，也可以是乙腈、甲醇等有机溶剂，还可以是缓冲盐溶液，如磷酸盐、tris、醋酸盐等。[img]http://www.instrument.com.cn/bbs/images/affix.gif[/img][url=http://www.instrument.com.cn/bbs/download.asp?ID=19461]赛分离子交换色谱柱在生物样品分离的应用[/url]

[color=#444444]第一次做离子交换，不太懂，填料真空脱气1个多小时效果也很不好，所以一着急就用了超声脱气2min，会不会破坏填料啊？有没有办法挽救呢？填料时借别人的，好贵的。还有我的样品是黑色的，做完后色素有残留，怎么去除？谢谢[/color]