角度激光光散射凝胶色谱系统

[list][*][b]凝胶初辟本相对，打破传统需散射[/b][/list]终于写到了光散射部分，辉博士还是很兴奋的，毕竟搞了这些年色谱和光散射，很多陈谷子烂芝麻的往事和经验。静态光散射原理的发展快有一个世纪了吧，这项技术和GPC开始联用可以追溯到上个世纪八十年代，那是很多种新技术百花齐放、争相斗艳的年代。当然百花齐放不意味着每一朵花都能盛开到最后。国外很多公司设计出基于静态光散射和色谱连用技术的设备，有基于多角度外推的技术MALS（multi angle light scattering），也有基于小角度直接检测的技术LALS (low angle light scattering)。后来，呵呵，后来故事太多了，有些公司被收购，有些公司消失了，还有一些公司成长成为业内的翘楚！博士对于开发这些技术的先驱们一直充满了崇敬之情，因为如果不是当年他们面对困难所付出的勇气和努力，对了还有智慧（智慧最重要，呵呵），就没有今天我们坐在这里侃侃而谈。前面谈到单RI检测器通过校正只能得到相对分子量信息，对于想要了解高分子真实性能的科研工作者，这是远远不够的。在线光静态散射技术，不需要通过标准样品进行色谱柱校正，可以直接检测绝对分子量的结果，而高分子的绝对分子量直接决定了高分子的物理性能。在这一部分，我们聊聊在线光散射技术的原理和其功能。在线静态光散射检测器通常和RI检测器在GPC中连用，某些行业中，如蛋白质检测，光散射则和紫外检测器连用也经常用到。[b]静态光散射原理[/b][img=,578,325]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/09/201909060943550725_4845_3200617_3.png!w578x325.jpg[/img]当一束光撞击到大分子或者颗粒的时候，一部分光会被吸收，并被重新向各个方向发射出去。当一个光子撞击到大分子的时候，光子的部分能量会引发大分子内部的偶极震荡。这部分能量随后以光的形式，向各个方向被重新发射出去。我们每天都可以见到这种现象，例如白云，日落，或者灰尘经过一束阳光或者投影。光散射方面的定律可以帮助我们测量很多和大分子相关的物理量。瑞利理论描述了散射光强度与大分子的尺寸和分子量的关系，定义了发生散射的大分子和颗粒对散射光的强度的影响[img=,230,74]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/09/201909060944369098_7516_3200617_3.png!w230x74.jpg[/img]其中C为样品的浓度，θ为测量的角度（散射角），Rθ 为θ角方向的瑞利散射比（散射光与入射光的强度比），Mw 为重均分子量，A2 为第二维里系数，K和Pθ的定义式为[img=,191,65]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/09/201909060945059868_192_3200617_3.png!w191x65.jpg[/img]其中λ0 为真空中激光的波长，NA 为阿伏加德罗常数，n0 为溶剂的折光指数，dn/dc为样品在溶剂中的折光指数随浓度增量[img=,253,54]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/09/201909060945425178_8444_3200617_3.png!w253x54.jpg[/img]其中Rg 为大分子的旋转均方半径。瑞利散射方程阐述了一定的角度下散射光强度与几个因素有关，其中包扩分子量和分子尺寸，请注意是两个未知数哦。同时也可以发现，较大的分子量和分子尺寸会产生更强的散射光。散射光强的增加与分子量的增加成线性关系，但是不与分子尺寸成线性关系。[b]散射光的角度依赖性[/b]当分子具有较大的尺寸的时候，散射光的强度会随着散射角度的不同发生变化，这就是角度依赖性。瑞利散射方程中，P[sub]θ[/sub]是高分子的形状因子，是未知项，不同的光散射技术对它的处理也不相同。我们再次看看P[sub]θ[/sub]的定义：[img=,253,54]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/09/201909060946211678_3558_3200617_3.png!w253x54.jpg[/img]其中n[sub]0[/sub]为溶剂的示差折光指数，R[sub]g[/sub]为大分子的旋转均方半径，λ[sub]0[/sub]为激光在真空中的波长，θ为散射角。从定义式中可知，1/P[sub]θ[/sub]受很多参数的影响，既包扩样品也包括实验条件，如溶剂的示差折光指数（n[sub]0[/sub]），激光在真空中的波长（λ[sub]0[/sub]）散射角（θ）和大分子的旋转均方半径（Rg）。这意味着对于大分子，散射光的强度与测试角度相关，这就是角度依赖性。产生角度依赖性的原因，是当分子的尺寸增加后，散射光的光子彼此之间会发生干涉等相互作用，如下图[img=,690,234]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/09/201909060947188008_3081_3200617_3.png!w690x234.jpg[/img][list][*]各向同性的散射体的尺寸相对于激光的波长来说较小，各向散射光均匀分布。各向异性散射体的尺寸相对于入射激光的波长明显较大，各个方向的散射光强度不等。[*]当大分子的尺寸相对于激光的波长来说较小的时候，如上，散射的形式表现为单点散射，这时各个方向的散射光的强度相同，这样的大分子被称为各向同性散射体。[/list]当大分子的尺寸相对于激光的波长来说明显变大的时候，分子的尺寸和结构开始变得重要。来自激光的光子会在大分子中的不同部位发生散射。这种情况与大分子的Rg有关。这些发生散射的光子彼此之间相互作用，导致测量的光强受观测位置影响。这样的大分子被称为各向异性散射体。在各向异性散射中，所有的相互作用都是造成衰减的，因此散射光的强度相比于各向同性的散射是降低的。如果我们用这个散射强度去计算分子量，我们就会得到偏低的结果。那么怎么办呢？瑞利散射方程告诉我们如果可以在0度角测量散射光强度，那么sin[sup]2[/sup](θ/2)就等于0，1/Ｐ[sub]θ[/sub]的值就是1。不过由于0度存在强度很高的入射激光，所以我们很难分辨出单独的0度角高分子散射光的强度。由于不能够直接在0度角测量，我们需要一种替代的手段。于是就出现了市场上的两种技术，即多角光散射MALS和小角光散射LALS。万变不离其宗，他们的目的都是为了检测0度角附近的散射光强，从而得到准确的大分子的分子量的信息，只不过，MALS利用的是外推的方式，LALS直接在0度角附近检测而免除了外推的过程。总结：[list][*]Rg小于12nm（~入射激光波长1/40）的分子，散射光表现为各向同性，几乎不表现出角度依赖性，那么这时候任何角度检测的结果都是正确的，不需要多角MALS也不需要小角LALS，实际上一个单90度角得到的结果是非常好的[*]Rg大于12nm（~入射激光波长1/40）的分子，散射光表现出各向异性，散射光的强度与散射角有关，需要0度角的散射光强来准确计算分子量，此时需要多角MALS或者小角LALS技术[/list][b] 旋转均方半径Rg的计算[/b][img=,690,357]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/09/201909060948475418_2265_3200617_3.png!w690x357.jpg[/img][align=center][b]Guinier图表示KC/R[sub]θ[/sub]对应sin[sup]2[/sup]（θ/2）的函数关系。其截距为1/Mw，起始部分的斜率与Rg有关[/b][/align][b] [/b][list][*]Rg可以从角度依赖性曲线（Guinier 图）中起始部分的斜率中计算[*]必须要足够显著的角度依赖性来计算曲线的斜率[/list]曲线起始部分的斜率可以表示为[img=,139,51]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/09/201909060949118845_5780_3200617_3.png!w139x51.jpg[/img]Rg可以从这个公式中得到，然而，对于较小的大分子，曲线的斜率可能非常小，甚至淹没在噪音当中。只有当大分子的尺寸相对入射光波长非常显著的时候，曲线的斜率才会被精确的计算，从而获得可信的Rg。入射波长为633nm激光可以计算的Rg的下限约为12nm左右。但是，绝对的下限可能高于或低于12nm，这与样品，溶剂和测试条件都有关系。很多MALS仪器制造商提出的Rg下限为10nm（甚至更低），这通常是对于标准样品或者具有较高dn/dc或者浓度的样品的理想情况。实际使用的过程中，很多样品无法达到这样的下限。另外极端条件如样品的dn/dc很低或者不在理想条件下，其Rg的下限都会远高于12nm的理论值。[b] GPC/SEC与静态光散射连用[/b][img=,690,60]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/09/201909060949352365_2620_3200617_3.png!w690x60.jpg[/img]GPC/SEC可以使我们轻松的将光散射数据和浓度检测器提供的数据联系起来进行计算。最常用的浓度检测器是示差折光检测器RI或者紫外检测器UV。现在常用的静态光散射仪器有2种，分别RALS与LALS联用，和多角光散射MALS。[b] 光散射检测器1 - RALS/LALS直角和小角联用光散射检测器[/b]RALS与LALS具有一定的互补性的。RALS灵敏度高，适合测量散射光各向同性的样品，LALS适用于测量散射光各向异性的样品，可以提供非常准确的结果。如下图，RALS/LALS联用检测器将两种检测器整合在一个流通池当中。在Zimm图上，RALS主要测试分子尺寸小于临界半径12nm的各向同性散射体，LALS则精确测试分子尺寸大于临界半径12nm的各向异性散射体。软件会自动根据检测器的信号在RALS与LALS之间进行切换。对于各向异性散射体，两个检测器计算的分子量的比值可以用于估计Ｐθ，这样再对分子结构进行假设（无规线团或刚性球），就可以估计分子的Rg了。[img=,687,252]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/09/201909060950302655_7653_3200617_3.png!w687x252.jpg[/img][b]左图，RALS/LALS联用检测器结构与流通池流路。激光从流通池末端进入，检测器布置在90度和小角度方向。右图，使用RALS/LALS联用时，对应的Zimm图为两个点，其中RALS为各向同性散射体提供高灵敏度的检测，LALS为各向异性散射体提供高精确度的检测[/b]RALS/LALS联用的特点：[list][*]对于分子体积不大的大分子，RALS可以提供最高的灵敏度[*]对于分子体积较大的大分子，LALS可以提供最好的准确性[*]可以比较两个角度的散射光强度[*]对两个角度的数据进行分析，可以计算Zimm曲线的斜率，进而计算Rg，当然这个Rg的准确程度比MALS得到的Rg要差一些，毕竟只有两个点的外推[*]RALS/LALS联用检测器具有很小的流通池，这其实是相对MALS检测池的优势之一，毕竟检测池小了，扩散效应会降低很多[b][/b][/list][b]光散射检测器2 - 多角光散射MALS[/b]如名称所示，MALS检测器在多个角度检测散射光的强度，如下图。将这些角度的数据点添加在Zimm图中，通过最合理的拟合曲线外推至0度角，就可以计算分子量。曲线起始部分的斜率可以精确的计算分子尺寸Rg。[img=,686,252]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/09/201909060951288805_6810_3200617_3.png!w686x252.jpg[/img][align=left][b]左图：MALS检测器结构与流通池流路。激光从流通池末端进入，检测器布置在多个角度方向上 。右图：使用MALS时，可以得到一条完整的拟合曲线 ，这条曲线外推至0度可以计算大分子的分子量，曲线起始部分的斜率可以计算Rg[/b][/align][b] 多角光散射的外推模型小分子[/b] 小分子线团、蛋白质、单克隆抗体等样品为均匀散射，不需要外推。[b] 大分子[/b] 外推模型包括： [list][*]Zimm外推，Kc/R[sub]θ[/sub]对于 sin[sup]2[/sup](θ/2)外推拟合，适用于适用于适中分子大小 Rg ~ 20-50 nm的分子线团 [*]Deby外推，R[sub]θ[/sub]/Kc 对于 sin[sup]2[/sup](θ/2)外推拟合，在一个比较宽的Rg范围内使用，是一种广谱的拟合模型，其适合范围比Zimm模型更加宽泛 [*]Berry外推，（Kc/R[sub]θ[/sub]）[sup]0.5[/sup]对于 sin[sup]2[/sup](θ/2)外推拟合，适用于比较大的分子 Rg 50 nm[/list][img=,634,189]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/09/201909060951554498_5952_3200617_3.png!w634x189.jpg[/img][b]左图：为小分子量聚合物的Zimm曲线，散射光为均匀散射，没有角度依赖性右图：为高分子量聚合物的Zimm曲线，散射光为非均匀散射，具有角度依赖性，需要外推得到0度角的散射光[/b] 其中在拟合过程中，用户可以适当删除一些与拟合曲线偏差较大的光散射数据点，以及使用1-5阶指数拟合方式（线形好尽可能用低阶指数），以达到更好的拟合效果。MALS特点：[list][*]由于可以获得多个角度的散射光强度，使用者可以通个比较相邻的角度的数据更好的确定结果的准确性[*]MALS可以测量各种大分子的分子量，因为计算过程已经将角度依赖性考虑在其中了[*]通过多个角度的数据，可以精确的计算Rg[*]根据Zimm曲线的形状，MALS可以洞察散射光的角度依赖性的情况[*]需要选择合适的模型，这点非常重要，毕竟Zimm，Debby，Berry的最适合的范围不同[*]如果某个角度的数据不合理或者噪音太高，计算过程中可以将其去掉，这样做不会对结果造成太大的影响[*]光学元件的设计导致散射池体积较大，这会造成比较大的扩散效应[/list]当使用MALS时候，最为关键的一点是能不能确定拟合曲线的类型，而精确的拟合曲线主要是由精确的低角度的数据的数量决定的。因此一台MALS应该配置尽可能多的低角度接收器，这有助于提高外推至0度角的准确性。总体上对于不同类型的MALS而言，角度越多，外推过程的准确性就越好。[b]趣谈1 光散射检测器角度越多分子量检测越准？[/b]这真的是一个需要很多前提条件的论断。首先，12nm以下的小分子散射是均匀的，任何一个信噪比良好的角度得到的散射光强计算分子量都可以得到准确的结果，不必需要0度角的信号意味着既不需要多角度MALS的外推也不必需小角度LALS的信号。这在众多通过90度角单角度检测蛋白（如人学白蛋白HA，单克隆抗体）的用户实际检测中得到了验证。不但单抗单体150KDa检测极为精确，而且其他的寡聚体峰，如二聚体300KDa，三聚体450KDa都没有任何问题。而在检测大分子的过程中，小角光散射LALS的准确度并不比多角差。实际上，因为不需要像MALS一样选择模型进行外推（外推过程中的选点，选模型，选择拟合阶次都是具有一定主观性的），在检测分子量的角度，小角度的准确性甚至更高。很多GPC的专业书籍都对此有所描述：[img=,690,338]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/09/201909060952216648_8096_3200617_3.png!w690x338.jpg[/img] 所以，我的观点是只有当您：1选择了多角光散射MALS作为检测器，2检测大分子的时候，角度越多分子量越准。毕竟角度越多越有利于外推的准确性。但是话说回来，如果您特别在意Rg的检测的话，那么多角度还有有其优势的。 [b]趣谈2光散射检测器不需要校正[/b] 很多厂商都是这么说的，但是，实际上完整的表述是，光散射检测器不需要做传统校正曲线！在不同的流动相下，其光散射检测器的光学常数不同，这个光学常数以及检测器之间的保留体积需要通过一个窄分布的标准样品校正出来，而一旦校正出来常数，做任何样品都是一样的。据博士所知，所有厂商都是如此！！！[align=left][b]趣谈3装了光散射检测器的GPC是不是所有样品都可以检测？[/b][/align]光散射检测器不是万能的，也有其限制。限制1. 分子量或者dn/dc极低的样品。这时候散射光强会很弱，有可能散射信号的信噪比很差，此时光散射结果会有较大偏差限制2. 多组分混合物，这里指的是不同化学结构单元的混合物，如聚苯乙烯PS和聚氯乙烯PVC的混合物。由于不同组分的dn/dc不同，而软件只能输入一个dn/dc值，所以检测出来的数据必定不那么“绝对”。一个例子就是沥青的分子量检测，其标准方法就是相对分子量，因为成分太复杂了，没法符合光散射的基本要求。限制3. 荧光样品。具有荧光发射的样品对于散射光信号是一种干扰，如木质素，通常会使得散射光增强，也就是分子量偏高。一个治标不治本的方法是在检测器前加入荧光滤光片，然而，先不谈荧光滤光片会降低检测器的灵敏度，其得到的散射光强也是有偏差的。解决之道是使用RI和粘度检测器连用，进行普适校正，这个后面我们到粘度检测器再慢慢聊。 [b]趣谈4光散射检测器好贵呀，我一定要检测绝对分子量吗？[/b]当然不是。每一种检测方式都有其存在的必然。如果您面对的工作是工厂中的QAQC，或者研发中的初步判断和比较，应该传统校正的相对分子量就够了。但是如果您面对的工作是高端的研发，以及需要分子量和其他物理化学性能相关联，那么绝对分子量无疑会更好。最近会写一个番外篇，也是一个预告：[b]为什么凝胶渗透色谱需要光散射技术[/b] 好了，先聊到这里，开学了，家长和孩子们的惊悚大片即将上映，祝大家心平气和！

[align=center][b]我与凝胶色谱的故事[/b][/align][align=right][/align][b]阴差阳错，走入色谱仪器[/b]2005年2月的一天，春节刚过。我便乘坐T290次火车只身前往首都北京------我谋生的第一份工作地。记得到达北京西站之后，当时还在读研的同学张*亮接待了我。在大运村的学生宿舍度过了一个不眠之夜，叙旧有之，最终的是走上工作的岗位的激动之情难以自控。迈入社会，以后的路怎么走？我是被学校的教导员推荐到北京这家公司的，公司虽然不是很大，是一家中外合资的高新科技企业做HPLC液相色谱仪……我所学的是教育专业，本来的志向是教书育人……懵懵懂懂的就走上了工作岗位。我的第一个手机，还是用我同学的学生证作为担保买了电卡，从此有了属于我的手机号码：15881963923。怎么进的公司，怎么做的自我介绍，怎么办的入职手续……这些我都忘记了。第二天我便在海淀区的某栋大厦上开始了第一份工作。鉴于工作需要，了解公司的工作流程，首先，在每个部门轮岗。期间，在市场部做过英文资料的翻译，在研发部，做原理的认识，学习；在生产部做仪器设备的组装调试。在忙碌了20多天之后，我拿到了人生的第一份工资：820块。[b]初识HPLC液相色谱，GPC凝胶色谱[/b]定岗之后，我成了一名所谓的工程师。其实主要的工作就是组装和测试色谱泵的工作。一开始很不适应，觉得大材小用了。我是抱着教书树人的抱负走出学校，结果却做了一个流水工人……思想波动很大。最后，我决定还是静下心来做事情。年轻人有理想是好的，但是重要的还是用热诚和冲劲去认识和了解你的职业和行业。慢慢地，我认识到什么是HPLC，高效液相的产生以及商业化其实也不过是短短五、六十年的光景，是很有发展前途的行业。[align=center][img=,690,522]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/08/201808270945430228_8391_1608025_3.png!w690x522.jpg[/img]心情图[/align][align=left]在两年时间里，了解熟悉了每个组成部分的原理，结构以及仪器的应用发展。逐渐从生产线走向了客户现场，在第一现场往往会遇到意想不到的问题，需要随机应变。[b]蜜蜂八种黄酮检测试验[/b]2007年左右在蜂蜜出口中，加入了八种黄酮含量的测试。当时，日本的标准是全球最高的。中国企业都需要购买进口设备，来满足分析的需求。由于市场的需求，我们开始接触到这个行业。在新郑附近的产蜂蜜基地，我们和当地农户。开始摸索试验。由于实验室条件很差，时间和紧张。我和另外一名同事披着大裳，在严寒的冬天坚持做了4天3夜的试验。终于在凌晨5点左右做出了重复结果。我们小心的呵护着柱温箱，生怕温度变化影响洗脱梯度，我们试过很多种色谱柱，寻找了最佳分离效果；我们不停的变换着流动相比例来寻求最佳效果；我们不辞辛苦去北京林业研究所追寻实验条件。但是，一个行业标准需要付出很大努力……最终，试验结果终于出来了。满心欢喜！就像在学校实验室做出重大发现一样的高兴。虽然，我没有真正意义上的试验导师。但是，最终的结果并不好。由于种种原因，用户最终还是选择了某日本品牌，匹配当时的行业标准HB。[/align][align=center][img=,690,250]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/08/201808271109336762_3661_1608025_3.jpg!w690x250.jpg[/img] 北京林业研究所 八种黄铜之4，图片来自网络[b]分析与制备中的GPC/SEC凝胶色谱[/b]公司的一楼试验车间，同事们在紧张的等待试验结果。这是某天然提纯项目在我们新的DAC设备上的最后测试。结果试验成功了。大家欢欣鼓舞，公司在天然多糖和蛋白提纯设备上迈出了一大步，订单纷纷踏来。对于，我们来说，加班也不可避免。其中，我比较感兴趣的是在每一步除试，放大，中试，再放大，分离制备产品，收集前后，都要测试纯度。这就要用到凝胶色谱。这也是我第一次接触到这个名词。从HPLC到PHPLC再到GPC，这是一个顺其自然的过程。我们现有的设备也很简单。自己搭了一台泵，一个手动7725i进样阀，一个简陋的柱温箱，一个多糖分离的色谱柱，和一个简单的折光分光检测器。软件是在某软件的基础上改进的。有了这些，简简单单的组成了一套设备。我们在这台设备上经历了很多，有成功也有失败……[/align][align=center][img=,449,605]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/08/201808271056049009_2558_1608025_3.jpg!w449x605.jpg[/img][/align][align=left][b]驰骋在凝胶色谱路上[/b]1，分离净化凝胶色谱随着时间的推移，我从最传统的GPC色谱接触，只能做简单的相对分子量QC开始。慢慢地读了一些关于色谱以及凝胶色谱的一些书籍。这些特别感谢化学工业出版社出版的一系列色谱技术丛书，一共13本。我能接触到的只有4-5本。不过就是这些让我学到了很多。在08年有一次机会。我专门开始做GPC维修工作。对凝胶色谱有了进一步认识和提高。我主要负责两种设备GPC设备。一种是分离净化，应用于样品的前处理。样品前处理是一件非常重要，同时也非常复杂繁琐的一件事情。处理不好往往对后续试验造成影响，要么对分析仪器造成影响，要么对试验结果产生影响。甚至产生假的数据，假阳性或者假阴性。GPC尤其对痕量微量检测有很大帮助，在农残方面比较有名的秦皇岛商检单位就用到了这一分离净化技术。做维修应用等技术工作往往都是枯燥的无味的，来不得半点虚假。如果做不到位，仪器不会工作，数据不会撒谎。这些要求我一定要细心和谨慎判断问题以及解决问题。GPC分离净化往往涉及到回收率问题。而回收率又和分离色谱柱，进样系统，回收系统有很大关系。记得有一个用户，因为氮气量不足导致了回收浓缩设备问题，也破费了一些周折，才得以解决：原因是连接氮气的管路和氮气调节阀之间微漏造成了浓缩体积增大，回收时间增加温度过高而影响了回收率。在08-09年的三聚氰胺测试中，分离GPC扮演了非常重要的角色。面粉中的13种添加物之一测试 馏分收集及浓缩装置2，分析测试凝胶色谱另一种就是我们更加熟悉的GPC/SEC体积排阻色谱。它是化学物理材料合成以及天然高分子生物分子结构研究的利器。目前商品化的主要有三种类型。第一种是我前面提到的传统校正分子量，结构简单。但是越来越有数据不足，信息少的缺点；第二种是带有在线黏度检测器的凝胶色谱，具有较好的分析机构构型的功能；第三种就是在前面两种检测器基础上添加了光散射检测器。在原理上解决了分子量准确性的问题，而且操作越来越方便。光散射的加入，使色谱有了飞跃发展。光散射的种类也非常多。有信噪比准确性能高的小角度光散射，也有应用于药物研究的多角度光散射。得到的有用信息更多更详实……[/align][align=left][img=,690,245]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/08/201808271108346983_8221_1608025_3.jpg!w690x245.jpg[/img]市场上的GPC/SEC产品，图片来源于网络多检测器联用越来越多的被应用到实验室中，对于我来说需要了解的东西也很多。目前，正在做的是HPLC/GPC/SEC与DLS联用的试验连接。[b]努力前行，做一名合格的小学生[/b]我与凝胶色谱相识相处也有十几年的光景。这些年来，我越来越发现自己的只是储备不够，需要加强学习。在色谱行业从业者中，我不过是一名小学生，是GPC/SEC激励着我，给我学习的动力，敢于学习新知识畅游于书的海洋；给我游历祖国的机会，每次出差在完成工作之余，我都在感慨中华地大物博；给我结实新朋友的契机，工作上遇到的每一位都是我的老师……是它陪伴我，虽然仪器不会说话，它却默默地陪我度过了最美的青春十年。[/align][align=center][img=,690,401]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/08/201808271110435272_9524_1608025_3.jpg!w690x401.jpg[/img][/align][align=center]祖国大好河山[/align]说到色谱感谢崔*臣，沈*刚两位老师把我领进门，说道凝胶色谱感谢王*、顾*粮两位前辈的指导，说道光散射感谢*辉博士的指导学习……还有我最好的行业伙伴们庞*辉，忘不了学习英语时的青涩，忘不了关于结构讨论的激烈，忘不了试验成功的喜悦……最后感谢仪器信息网有这么一次活动，可以让我静下心来，回顾过去的自己。我只不过是最普通的”三无人员”的一个，努力做一名合格的小学生，道阻且长，不畏风雨；道阻且跻，一往直前；道阻且右，淡然处之……

介绍过传统校正对于相对分子量的检测方法，以及光散射技术对于绝对分子量的检测原理，下面我们通过检测概念、标准样品影响、保留时间影响、对于分布检测的准确性、测试质量判断、对于团聚物的检测以及检测效率几个方面来了解一下GPC技术需要和光散射技术联合使用。[b]检测概念[/b][img=,690,331]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/09/201909091020170531_1340_3200617_3.jpg!w690x331.jpg[/img][b]光散射法和传统法色谱信号区别[/b]通过RI和光散射检测器连用，凝胶渗透色谱GPC/SEC在一个测试过程中同时收集RI和光散射信号，得到绝对分子量Mw、Mn、Mz，分子量分布，均方旋转半径和第二维利系数。而通过传统校正在一个测试过程中收集RI信号，得到相对分子量Mw、Mn、Mz，分子量分布。相对分子量的检测的准确性依赖于很多条件，但最关键的一点是溶解在溶剂中的高分子线团的流体力学体积，因为流体力学体积的大小和分布决定了样品的流出时间也就决定了所得到的相对分子量的数值和重复性。[img=,519,654]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/09/201909091021073771_7920_3200617_3.jpg!w519x654.jpg[/img][b]光散射信号和RI信号对于聚苯乙烯及其溴化聚苯乙烯的响应[/b]上面的一个例子中，通过两种不同的检测方法检测了两个样品。一个是聚苯乙烯，另外一个是溴化聚苯乙烯。溴元素是质量很大但是体积很小的元素，溴化的聚苯乙烯和没有溴化的聚苯乙烯相比分子量有明显的升高，但是分子体积基本不变。通过测试我们发现，传统校正下，对于聚苯乙烯和溴化聚苯乙烯的RI信号几乎没有区别，因此传统校正得到的结论是相对分子量没有改变，而通过光散射检测器我们可以看到，溴化之后的散射光强明显加强，说明分子量增大。光散射得到的绝对分子量告诉我们，溴化后的聚苯乙烯分子量是62万，而没有溴化的聚苯乙烯的分子量是25万！ 我们再来看一个蛋白质测试的例子。蛋白质样品本身是多肽的四级堆积结构，分子密度较高，而不同聚集态的蛋白团聚物之间的分子密度差别很大，这就导致了相对分子量和其真实分子量之间差别很大。[img=,589,229]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/09/201909091022290190_9869_3200617_3.png!w589x229.jpg[/img]这个例子中我们首先使用一系列蛋白进行了传统校正曲线的绘制，如上图[img=,690,157]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/09/201909091022557007_3603_3200617_3.png!w690x157.jpg[/img][align=left]利用传统校正曲线检测BSA牛血清白蛋白样品（单体分子量66.4KDa），如上图我们可以看到，其二聚体和三聚体Mw分别得到202KDa和345 Da，这些寡聚体的分子量与其真实值有着明显的偏差。[/align][img=,525,418]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/09/201909091024147031_8985_3200617_3.png!w525x418.jpg[/img][b][/b]而通过光散射检测器得到的结果单体66 K Da，二聚体133 K Da，三聚体201 K Da，这与其真实值具有高度的一致性！[b]标准样品影响[img=,650,616]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/09/201909091027005812_621_3200617_3.jpg!w650x616.jpg[/img][/b]LS = K[sub]LS[/sub]• (dn/dc)^2• M• CRI = K[sub]RI[/sub]• （dn/dc）• C通过光散射检测器检测绝对分子量只需要仪器常数K[sub]LS[/sub]和K[sub]RI[/sub]，而仪器常数只取决于流动相的种类、检测温度，不取决于任何标准样品以及标准样品的种类。而对于传统校正而言，其计算结果严重依赖于标准样品的种类和来源！相对分子量的计算取决于校正曲线，所有影响校正曲线的因素将对于计算结果造成影响，而标准样品是影响校正曲线的重要因素之一。使用不同高分子标准样品由于分子密度的差异，得到不同的标准曲线。即使使用同一种标准样品，相同供应商的不同批次，校正曲线也会有所差异，导致分子量结果不同[b]保留时间影响[/b][img=,690,264]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/09/201909091027389110_208_3200617_3.jpg!w690x264.jpg[/img][b][/b][align=center][b]保留时间对于光散射检测和传统检测的意义[/b][/align]通过光散射检测器检测绝对分子量不依赖于样品信号保留时间！分子量结果和重复性只与RI和光散射信号强度相关，与保留时间无关，因而可以得到极高的准确性和重复性。传统校正严重依赖于样品信号保留时间！由于色谱柱老化，色谱泵不稳定，测试温度波动造成的样品RI信号保留时间的改变会造成分子量结果的明显差异。[b]对分子量分布的检测准确性[/b][img=,690,313]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/09/201909091029080971_12_3200617_3.jpg!w690x313.jpg[/img]高分子分布信息的准确性取决于分子量检测的准确性。对于窄分布样品如蛋白质，光散射得到的绝对分子量能够正确地表征样品的分布信息。而传统校正由于其分子量是通过校正曲线得到，其分子量在不同的流出时间在校正曲线上有所差别，所以得到的分子量分布与样品的真实结果会有明显偏大。这将影响到检测者得到正确的结论。[img=,690,492]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/09/201909091029568798_241_3200617_3.jpg!w690x492.jpg[/img][b] 典型的蛋白质色谱流出曲线判断测试质量[/b][img=,690,233]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/09/201909091031060697_8566_3200617_3.jpg!w690x233.jpg[/img][align=center][b]绝对分子量分布和相对分子量分布对于信号质量的判断[/b][/align] 通过光散射和RI检测器的结合使用，还可以有效判断GPC的测试质量。在GPC检测过程中如果在错误的制备条件下检测样品，（意味着流动相、色谱柱种类错误），都可能造成高分子样品在色谱柱上的吸附。而高分子在色谱柱上的吸附将会造成GPC在分离过程中高分子材料不按照从大到小的顺序流出，这将导致错误的分子量和分子量分布结果。通过光散射检测器和RI检测结合，可以得知样品在色谱柱上有无吸附，判断依据如下：[list=disc][/list]1.绝对分子量是否随着保留时间增加2. 光散射检测器是否有脱尾，且其回归基线时间是否晚于RI回归基线时间[list=disc][/list]如果同时出现以上两种情况，则说明样品在色谱柱上有吸附，需要重新设定检测条件。传统校正的相对分子量由校正曲线得到，永远随保留时间下降，检测者无法得到样品检测条件是否正确的任何信息！[img=,690,322]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/09/201909091032150236_186_3200617_3.jpg!w690x322.jpg[/img][b]光散射检测器对于多糖分子的检测。左图测试条件下有吸附，分子量分布具有翘尾，右图条件下没有吸附[/b]上图显示了光散射检测器对于一个纤维素样品测试质量的判断。左图中纤维素样品的光散射信号具有拖尾，同时分子量随流出时间具有向上翘的现象，意味着样品在色谱柱中具有吸附，右图是在正确的色谱条件下检测，分子量随流出时间单相下降。[b]探测大颗粒或者聚集物[/b][img=,690,278]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/09/201909091033213723_7156_3200617_3.jpg!w690x278.jpg[/img][align=center][b]光散射信号对于少量团聚物的存在非常敏感，而RI或者UV检测器完全检测不到[/b][/align][color=#072e67] 光散射检测器信号正比于分子量的平方，因而对于大分子物质及其敏感，即使是微量存在的大颗粒或者团聚物，也可以得到较强信号。这对于生物领域尤其是蛋白质的研究工作者具有非常重要的意义。而RI检测器只对应于样品的浓度，对于微量存在的团聚物无法检测。[/color][img=,690,324]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/09/201909091033593471_645_3200617_3.jpg!w690x324.jpg[/img][b]光散射检测器可以检测到BSA团聚物存在，而RI和UV检测器没有信号检测效率[/b] 通过光散射检测器检测绝对分子量只需要得到仪器常数，无需色谱柱校准。在不更换溶剂的条件下，通常不需要测试标准样品。更换溶剂时需要得到新的仪器常数。而对于传统校正而言，需要经常检测标准样品已确定色谱柱、色谱泵、工作曲线是否正常。而每次标准曲线的测定则需要使用7-13个标准样品，极大地增加了使用者测定样品所需时间。最后我们通过一个表格归纳不同测试模式的特点[img=,690,583]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/09/201909091034241821_627_3200617_3.png!w690x583.jpg[/img]总结：在这个番外片中，我们聊到了GPC的两种检测方法的区别，以及在GPC中引入静态光散射检测器的意义。正如前几个帖子中所述，没有一种方法是万能的，所有样品都可以检测，光散射也是如此。但是光散射检测器为测试者带来了更多、更准确的信息，为GPC的检测质量提供了良好的依据好了，先聊到这里，祝大家中秋快乐，团圆安康！

[font='Times New Roman']2010[/font][font=宋体]年[/font][font='Times New Roman']4[/font][font=宋体]月[/font][font='Times New Roman']7[/font][font=宋体]日[/font][font=宋体]，马尔文仪器公司在北京德宝饭店举办了“多检测器凝胶色谱[/font][font='Times New Roman']GPC/SEC[/font][font=宋体]在生物和高分子领域应用研讨会”。给大家发些现场的图片。[img]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2010/04/201004081148_210534_1906379_3.jpg[/img][/font][color=black][font=宋体] 会议现场[/font][/color][color=black][font=Arial][img]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2010/04/201004081148_210535_1906379_3.jpg[/img][/font][/color][color=black][font=宋体] 秦和义总经理致开幕词[/font][/color][color=black][font=Arial][img]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2010/04/201004081154_210537_1906379_3.jpg[/img][font='Times New Roman'] Ali Soleymannezhad[/font][font=宋体]先生介绍多检测器凝胶色谱[/font][font='Times New Roman']GPC/SEC[/font][font=宋体]技术原理及最新进展[img]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2010/04/201004081156_210540_1906379_3.jpg[/img][/font][/font][/color][font=宋体] 嘉宾们与宁辉博士现场交流[/font][size=2][color=#000000][color=#000000][b]凝胶渗透色谱简介：[/b]凝胶渗透色谱[GPC（Gel Permeation Chromatography）][也称作体积排斥色谱(Size Exclusion Chromatography)]是三十年前才发展起来的一种新型液相色谱，是色谱中较新的分离技术之一。[/color][font=宋体]利用多孔性物质按分子体积大小进行分离。凝胶渗透色谱在工业、农业、医药、卫生、国防、宇航以及日常生活的各个领域得到了广泛的应用。特别是近年来，随着各种高分子材料的问世，人们对高分子科学的不断探索，高聚物的分子量及其分布的测定显得尤为重要，成为科研和生产中不可缺少的测试项目之一。例如：常见的聚苯乙烯塑料制品，其分子量为十几万，如果聚苯乙烯的分子量低至几千，就不能成型；相反，当分子量大到几百万，甚至几千万，它又难以加工，失去了实用意义。科研和生产上通过控制高聚物的分子量及其分布宽度指数D(D=Mw/Mn)、分子量微分分布曲线、分子量积分分布曲线来生产出性能最佳的高聚物产品。另外，除了快速测定分子量及其分布以外，凝胶渗透色谱还广泛用于研究高聚物的支化度，共聚物的组成分布及高聚物中微量添加剂的分析等方面。如果配以在线的绝对分子量检测器（如：LALLS、Multi-Angle LS、Dual-Angle LS等），凝胶渗透色谱可以测定高聚物的绝对分子量。来自马尔文下属公司Viscotek的专家最近完成了使用TDAmax凝胶渗透色谱/尺寸排除色谱（GPC/SEC）系统的一些研究，这些研究结果表明对基于多聚糖的复杂食品成分和添加剂的综合分析来说，TDAmax是一种能够提供丰富信息、且具有极高效率的分析解决方案。Viscotek TDAmax采用全面整合的三重检测器集成单元，包含创新的专利小角度光散射检测器（LALS）、专利四毛细管示差粘度计和折光率检测器，为GPC/SEC设立了新的标准。[/font][/color][/size]

辉博士辉博士参加工作后有缘接触了凝胶渗透色谱GPC/SEC这个技术，一干11年，从一个呱呱的色谱菜鸟到逐渐积累了很多经验。人生中很多第一次就交给了这个可爱又可恨的仪器。第一次做实验看到结果是惊叹的，哇塞，分子量还能测得这么准；第一次装机是兴奋的，哈哈，几十个部件连在一起工作了，关键是还出数了，标样一次通过；第一次色谱柱堵了是沮丧的，明明溶解的很好，可是咋就能堵柱子呢；第一次色谱怎么也泵不出溶剂是绝望的，好像哪里也没漏啊；第一次样品结果没有重复性…；第一次用混合溶剂得到客户的认可…；很多第一次……仪器和实验是枯燥的，但是好还辉博士周围有一群给力的兄弟，工作中总充满了乐趣；安装和培训是辛苦的，还好看到了客户笑容，值得；很多应用是绝望的，但是抱着一线希望去挑战绝望终于还是成就了一些成功的案例。最近辉博士终于有时间坐下来，喘口气，回想一下，和大家一起聊聊这门应用广泛技术，以及这些年自己累积的一点点见解。错别字会有的，博士语文水平一般，谬误之处可能会有，还请多多谅解，各位大咖不吝赐教。[b]第一聊：GPC/SEC之分离篇[/b][align=left]凝胶渗透色谱技术是一种按照分子大小进行分离和检测的技术，其实是一个还不小的技术范畴，从应用角度讲有纯化级色谱，还有分析级色谱，而这里我们只聊聊分析级设备。从温度控制角度，有常温GPC和高温GPC。从检测角度而言，主要有四种检测器应用于GPC的信号检测，分别是示差折光RI，紫外UV，光散射（静态光散射哦，不是蒸发光）还有在线粘度检测器。红外检测器是个特例，因为基本只应用于高温GPC，这里也就不多说了，感兴趣的朋友直接上Polychar的官网详细了解。[/align][align=left] GPC设备无论出自那个厂家，基本都分为两个部分，前面的分离模块和后面的检测模块。分离模块包含基本的色谱泵，进样器，脱气机，柱温箱，色谱柱，起到的作用就是把高分子按照其大小进行分离，分子体机大的先流出，而分子体积小的后流出。检测器模块检测对各个被分离的组分的物理性质做出响应，给出不同的分子信息，如分子量，分子量分布，分子大小，分子支化程度，分子链的刚性柔性，共聚物组成等等。[/align][align=left]先谈谈分离吧，对于GPC测试而言，前端分离是根本，好的分离效果可以（可能）带来好的检测效果，不好的分离效果一定会影响检测的准确性、重复性和客观性。[/align][align=left]GPC色谱的操作原理是利用分子的流体力学半径（Rh）或流体力学体积（Vh）进行分离，而非利用分子量的差异。分离过程在GPC色谱柱中进行，其柱填充物通常是多孔聚苯乙烯、丙烯酸酯微球、玻璃粉或硅胶等多孔物质。由于分子大小的差异，较大的分子扩散进入凝胶色谱填料中的微孔比较困难，能更快的从色谱柱中被洗脱。上图阐释了GPC分离的机理。当样品从色谱柱被洗脱后，它将被一个或多个检测器进行检测，其结果最终被电脑的数据处理系统进行分析。[/align][align=left]凝胶色谱的分离机理是一种基于分子大小的物理分离方式，应最大程度的避免样品分子和色谱柱填料之间的化学相互作用。[/align][img=,690,399]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/08/201908151724165824_3312_3200617_3.png!w690x399.jpg[/img][color=#072e67] [/color][b][/b][align=left][b]色谱柱[/b][/align][align=left]对于GPC而言选择适合的色谱柱对于检测非常重要，良好的分离效果是准确检测大分子分子量的基础。了解色谱柱说明书中的参数可以更好地挑选色谱柱以达到预想的分离性能。色谱柱主要参数包括填料颗粒粒径（Particle Size），理论塔板数（Theoretical Plate Number），分子量排阻上限（Exclusion Limit Mw），最大孔径（Max. Pore Size），色谱柱的溶剂兼容性。GPC色谱填料的大体范围在5um-20um之间，填料颗粒粒径越小，意味着在一根色谱柱中装填的色谱柱填料数量越多，达到更高的理论塔板数。分子量排阻上限通常专指应对于某一种标准样品，比如聚苯乙烯PS或者聚乙二醇PEO，只是给与使用者一个参考数值，而不是一个泛指的参数。色谱柱填料颗粒越小，意味着在转换不同极性溶剂过程中，色谱柱中填料的整体膨胀/收缩率越大，溶剂兼容性越差。[/align][align=left]从溶剂类型分，色谱柱主要包括有机相色谱柱，水相色谱柱和蛋白质色谱柱。从填料孔径分布分类可分为单孔径柱（Single Pore），混合柱（Mixed Bed）和线性混合柱（Linear Mixed Bed）。[/align][align=left]最常用的有机相色谱柱的常用填料基质是由聚苯乙烯和二乙烯基苯交联而成的多孔小球。普通水性色谱柱的常用填料由多孔丙烯酸酯组成，不但可以检测低电荷含量的水性样品，还可以耐受DMF溶剂。对于带电较多的聚电解质样品，对应可以选择阴离子型色谱柱以检测带负电基团较多的高分子，以及阳离子型色谱柱以检测带正电基团较多的高分子。蛋白柱的填料主要分为两种，即氧化硅和纤维素凝胶。氧化硅基质的填料的优点是硬度较高，分辨率较高，耐压性较好，可以使用较高流速使用。纤维素凝胶填料的优点是用途广泛，甚者可以同时分离蛋白和某些高分子的混合物，如PEG和蛋白，但是硬度较低，流出物较多，建议在低流速下使用。[/align]一个负责任的色谱柱生产厂家出具的色谱柱说明书一定会包含大量的信息，如色谱填料材质，填料大小，理论塔板数，孔径，排阻上限等等，比如：[img=,690,491]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/08/201908151725176201_2855_3200617_3.png!w690x491.jpg[/img][align=left] 看参数其实是一件令人头痛的事情，对了，其实最有用的是说明书中的校正曲线：[/align][img=,690,377]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/08/201908151725588782_6652_3200617_3.png!w690x377.jpg[/img][align=left]色谱柱的最佳分离范围在其校正曲线斜率较小对应的分子量范围。因为斜率越小意味着分子同样的尺寸差下可以得到更好的分离，也就是更大的流出体机差值。[/align][b]流动相[/b][align=left]流动相的选择对于GPC检测非常重要。很多种类的高分子可以在不止一种溶剂中溶解，例如聚苯乙烯可以在THF、DMF、甲苯、三氯苯中溶解，聚甲基丙烯酸甲酯PMMA可以在DMF、氯仿、NMP等等溶剂中溶解。GPC检测的一个误区是，如果高分子可以在一个溶剂下溶解，就可以在这个溶剂的流动相检测。我们挑选溶剂时需要考虑以下几点：[/align][list][*][align=left]高分子在所选溶剂中是否和色谱柱有化学相互作用，即吸附效应。如果有化学相互作用，即高分子不再按照体积大小进行流出，则会造成检测结果误差。一个例子是很多种类的硅油和硅橡胶在THF中有较好的溶解性，但是在GPC测试过程中由于和色谱柱之间的化学相互作用，导致色谱峰脱尾，重复性不好，甚至色谱流出峰消失。大多数情况下，改用甲苯作为溶剂和流动相，问题得到解决。[/align][*][align=left]样品溶液的dn/dc。dn/dc即折光指数随浓度增量，是一种高分子溶解在某种溶剂中的固定光学参数，在RI检测器部分会详细介绍其概念。由于多个检测器的检出信号响应强度与dn/dc相关，如RI检测器信号正比于dn/dc，光散射检测器信号正比于(dn/dc)^2，所以选择一种dn/dc较高的溶剂有利于得到较高的检测器信号，进而得到更加可靠、具有重复性的检测结果。[/align][*][align=left]使高分子达到较高Mark-Houwink α值的溶剂。Mark-Houwink α值（可参看粘度检测器原理部分）反映高分子线团的溶解状态，α值越高，线团构象越趋向于展开，而展开的构象可以提高色谱的分离效率，即在同样的分子量差别下，构象越舒展，体积差别越大，大分子流出时间间隔越大。[/align][/list][align=left] [/align][align=left]看到这的朋友相信眼睛一定已经疲劳了，讲几个小故事吧。[/align][align=left] [/align][align=left]故事1. 博士的第一次装机[/align][align=left]那是2010年，秋高气爽的日子，首堵北京，某大学。博士和一位资深工程师一起出动，装机艰辛过程略去一万字，总之是装好了，THF相。用户的某一个样品正是硅氧烷，THF溶解良好，第一针出峰似乎正常，我们正在沾沾自喜中，然而第二针来了，第二针的结果和第一针不重复！抓狂！于是重新做标样，标样正常，再进样，还是不重复！好在用户其他样品都是正常的，最终接受了仪器。几年之后，一个机会终于了解到，有些硅氧烷在THF中是和柱子有化学相互作用的，说白了就是吸附了。好吧，人生还要继续……[/align][align=left] [/align][align=left]故事2. HA样品[/align][align=left]HA有好几个名字，透明质酸，玻尿酸等等，一般是以钠盐的形式作为产品。HA作为一种添加剂可以用于化妆品，药物，日化用品行业，可以增稠，保湿，增加铺展性。倒退20年，那可是相当的高大上。为啥，看看当年欧莱雅晚霜的广告就知道了，晚上抹一抹，皱纹去无踪。得益于国内产量的激增（一种细菌发酵提取工艺），最近几年HA逐渐平民化了，就连眼药水和洗发水里也是经常添加。[/align][align=left]废话说多了，话说当时博士和另一个博士兄弟拿到几个透明质酸样品，分子量挺高，100 -200万吧，串了两根水性混合柱，排阻上限（当然是对标准样品而言的）2000万！浓度配的相当低了，也就零点几mg/ml吧。出峰挺好的，可是一看PD值，分布只有1.05-1.1，分布窄的快赶上标样了。然并卵，这不科学！为啥？这是天然多糖呀！这是百万级的天然多糖呀！都知道不会是窄分布！折腾了大半天后，问题通过换上两根最大牌号的线型柱解决了，换上后测得分布1.6-1.9之间。结论是，虽然混合柱中存在一些大的孔径，分子量分离范围也比较宽，可以对于分子量高的样品进行一定分离，但是分离度不够。像HA这样刚性的分子，在溶液中舒展度比较大，也就造成了分子体机较大，混合柱还是会有极强的排阻效应，说白了就是大分子小分子一起出来了，造成分布较窄。而牌号较大的线性柱中有足够多的大孔径填料，问题得以解决。[/align] [align=left]用户趣问1. 我的样品GPC出峰为啥不是正态分布的呀[/align][align=left]其实，很多种类的高分子样品的出峰都不一定是正态分布，如聚丙烯，很多种嵌段共聚物，很多天然多糖。[/align][align=left] [/align]用户趣问2. 我的色谱柱堵了，能反冲吗[align=left]这个还真不好说。因为GPC色谱柱填料在装填的过程中是比较规则的排列，而色谱柱中其实是存在一些空间而不是100%装填满的，反冲会导致排列的改变。如果反冲后柱压降下来了，而走标样峰形正常，分布正常，那么恭喜您，这死马被医活了。不过死马大部分时候还是死马。[/align][align=left] [/align][align=left]用户趣问3. 一根柱子分离度不好，加了一根一样牌号的只好了一点点，这和想想中不一样啊[/align][align=left]同样牌号的柱子串联，理论塔板数会加倍，但分辨率是和理论塔板数开根号成正比的，也就是从 1变到1.414，可没增长两倍哦。有时候不同牌号的线型柱串联，也许会达到明显的分辨率提高。[/align][align=left] [/align][align=left]用户趣问4. 柱子说明书上说这柱子耐受很多中溶剂，那我到底能不能换啊[/align][align=left]话虽如此，最好还是溶剂专柱专用。不同的流动相极性不一样，每一次换溶剂填料不是收缩就是膨胀，您说老是收缩膨胀，这柱子能用多久啊[/align][align=left] [/align][align=left]好了，先聊这么多，祝大家工作愉快，身体健康！[/align]