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蛋白质结构定量分析具体步骤?谢谢
蛋白质为复杂的含氮有机化合物,是各种氨基酸以肽键连接而成,各类食品的蛋白质含量很不均匀,蛋白质含量是评价食物营养价值的重要指标之一。在食品中蛋白质含量测定方法中最常用最基本的方法是凯氏定氮法,在GB/T5009.5-2003中也将其定为法定检测方法,凯氏定氮法有常量凯氏氮法和微量凯氏定氮法。采用经典的凯氏定氮法比较费时费力,采用模块式消化、全自动凯氏定氮仪测定食品中的蛋白质,该方法比经典法快速,且数据准确可靠。1 材料与方法1.1 仪器与试剂1.1.1主要仪器:KjeltecTM2300型全自动凯氏定氮仪,DS-20消化炉及排废装置(均为瑞典FOSSTECATOR公司生产),样品磨,电子天平(准确至0.0001克)。1.1.2主要试剂:浓硫酸;硫酸钾;硫酸铜;盐酸标准溶液0.1027mol/L;氢氧化钠溶液400g/L;1%溴甲酚绿和0.7%甲基红混合指示剂;1%硼酸吸收溶液;硫酸铵;蔗糖。所用试剂均为优质品。1.2 测定方法称取适量样品放入消化管中,加入0.2g硫酸铜,6g硫酸钾及约12mL浓硫酸慢慢摇动将样品浸湿。把消化管放入已预热至42℃的加热模块中,将抽气泵打开到最大。5min后,关小抽气泵至酸雾刚好充满排废罩,在试管中形成冷凝环。约60min样品消化至透明蓝绿色液体,取出冷却至室温。将消化管放入2300型自动凯氏定氮仪,关上安全门,待仪器自动蒸馏、滴定、计算并打印结果。2 结果与讨论2.1 精密度取3种蛋白质含量不同的样品,每种样品平行测定6次,从测定结果可见,该仪器的精密度良好(见表1)。表1 仪器精密度测定样品名称 蛋 白 质 含 量(g/100g) 平均值(g/100g) 相对标准差(RSD%)纯牛奶 3.18 3.17 3.20 3.19 3.18 3.18 3.18 0.34大豆 31.25 31.46 31.38 31.53 31.62 31.39 31.44 0.41螺旋藻粉 67.54 67.78 67.58 67.64 67.69 67.82 67.68 0.16
[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/yp][color=#3333ff]ICP-MS[/color][/url]技术是80年代发展起来的新的分析测试技术。它以将ICP的高温(8000K)电离特性与四极杆质谱计的灵敏快速扫描的优点相结合而形成一种新型的最强有力的元素分析、同位素分析和形态分析技术。该技术提供了极低的检出限、极宽的动态线性范围、谱线简单、干扰少、分析精密度高、分析速度快以及可提供同位素信息等分析特性。目前,在[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/yp][color=#3333ff]电感耦合等离子体质谱[/color][/url]技术上面的突破性技术已经越来越少,但在[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/yp][color=#3333ff]ICPMS[/color][/url]应用方面却在不断的扩大,比如应用[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/yp][color=#3333ff]ICP-MS[/color][/url]对蛋白质进行定量分析。一般来说蛋白质的定量分析主要借助于生物质谱,但是随着生命科学的迅猛发展,[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/yp][color=#3333ff]ICP-MS[/color][/url]凭借其诸多优点也开始进入并活跃在蛋白质分析领域。本文就带你走进[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/yp][color=#3333ff]ICP-MS[/color][/url]的应用前沿,领略下基于[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/yp][color=#3333ff]ICP-MS[/color][/url]蛋白质定量分析的几种相关技术。基于[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/yp][color=#3333ff]ICP-MS[/color][/url] 的蛋白质定量分析方法主要有以下几种,如下图所示,本文将一一叙述。[color=teal][/color][img=,538,358]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/04/201804041432166086_2066_1615758_3.png!w538x358.jpg[/img]一、基于金属元素的蛋白质[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/yp][color=#3333ff]ICP-MS[/color][/url]定量技术[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/yp][color=#3333ff]ICP-MS[/color][/url]对蛋白的定量主要是通过测定金属元素的含量,再根据每种蛋白质所含金属的计量比,计算出蛋白质的绝对量。有文献利用65Cu作为稀释剂,采用[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/yp][color=#3333ff]ICP-MS[/color][/url]同位素稀释法法对含铜的蛋白进行绝对定量。[img=,578,314]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/04/201804041433401796_21_1615758_3.png!w578x314.jpg[/img]二、基于硒元素的[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/yp][color=#3333ff]ICP-MS[/color][/url]蛋白质定量技术硒在体内主要通过硒蛋白发挥作用,人体血液中96%~98%的硒是和蛋白质结合的,一般以硒代半胱氨酸(Sec)、硒代甲硫氨酸的形式结合在蛋白质中。同位素稀释质谱[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/yp][color=#3333ff]ICP-MS[/color][/url] 定量法利用标记77Se 的硒代甲硫氨酸作为稀释剂,通过测定硒代甲硫氨酸77Se 和80Se 的丰度比从而进行定量。[img=,664,306]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/04/201804041446313436_7795_1615758_3.png!w664x306.jpg[/img]三、基于硫元素的[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/yp][color=#3333ff]ICP-MS[/color][/url]蛋白质定量技术在[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/yp][color=#3333ff]ICP-MS[/color][/url] 可以测量的所有元素中,硫是最适合作为蛋白质定量分析的内标元素.这是由于S 是蛋白质中一种常见的元素,S 原子多以共价键稳定地存在于蛋白质分子中.蛋白质有两种氨基酸,即蛋氨酸和半胱氨酸含有硫元素。如果某种蛋白质已经由生物质谱鉴定,或者这种蛋白质分子的氨基酸序列和其中含有的S 原子数已知,那么就可以通过[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/yp][color=#3333ff]ICP-MS[/color][/url] 直接测定半胱氨酸或甲硫氨酸中硫的含量实现蛋白质的绝对定量。[img=,664,269]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/04/201804041449050956_1648_1615758_3.png!w664x269.jpg[/img]四、基于磷元素[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/yp][color=#3333ff]ICP-MS[/color][/url] 测定的蛋白质定量技术磷是生物体中最重要的元素之一。磷酸化过程是调节蛋白质活性的重要过程,揭示蛋白质磷酸化修饰发生规律是理解生物体复杂多样的生物进程的一个重要前提。磷酸化蛋白在样本中含量低且动态范围广、蛋白质磷酸化水平不均一、磷酸化修饰类型多,这些特点决定了对磷酸化蛋白的研究具有挑战性。蛋白质分子中磷的测定可以对蛋白质的磷酸化状态提供重要信息。[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/yp][color=#3333ff]ICP-MS[/color][/url] 对元素的测定与分析物的结构无关,只与分析物中元素的含量有关,因此[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/yp][color=#3333ff]ICP-MS[/color][/url] 不仅能够鉴定蛋白质中磷的存在,而且可准确测定蛋白质的磷酸化程度。[img=,563,296]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/04/201804041449182306_4389_1615758_3.png!w563x296.jpg[/img]五、基于元素标记的[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/yp][color=#3333ff]ICP-MS[/color][/url]蛋白质定量技术稀土金属元素的化学物理性质非常相近,在液相上能共金属元素的化学物理性质非常相近,在液相上能共洗脱。与硫、磷等元素相比,稀土金属元素在[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/yp][color=#3333ff]ICP-MS[/color][/url] 中质谱响应更强,受到的同量异位素干扰较少,更容易检测。因此,利用[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/yp][color=#3333ff]ICP-MS[/color][/url] 检测蛋白质标记的稀土金属从而进行蛋白质定量的方法具有很大的应用前景。将标记元素引入蛋白质的方法主要有两种:通过共价键直接将杂原子与特定氨基酸结合;通过配位化合物引入金属元素。标记时既可以标记蛋白质或肽的主链(N或C端) ,也可以标记其中的氨基酸(Cys、Met、Lys 等)。主要有碘、汞、稀土等。[img=,639,345]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/04/201804041451025126_6783_1615758_3.png!w639x345.jpg[/img][img=,615,352]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/04/201804041451027144_9325_1615758_3.png!w615x352.jpg[/img][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/yp][color=#3333ff]ICP-MS[/color][/url] 作为元素的分析手段, 需要ESI-MS、MALDI-TOF 等生物质谱提供蛋白质结构信息,将元素定量分析的无机质谱和蛋白质结构分析的生物质谱有机地结合。基于分离技术的发展和其他质谱技术的辅助,蛋白质的[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/yp][color=#3333ff]ICP-MS[/color][/url] 定量技术在生物样本的蛋白质定量和蛋白质组学研究中会具有潜在广泛的应用价值。