托蛋白定仪

为什么要用冻干的方法制备稳定的蛋白药物产品？在蛋白药物治疗的早期研发中，有必要设计一种在运输和长期储存期间稳定的配方。显然，水溶剂的液体产品对于生产来说是很容易且经济的，对于终端使用者也是十分方便的。水溶剂的液体产品存在的问题1. 大多数的蛋白以液体状态存在时，易于化学（脱酰胺或氧化）和/或物理降解（聚合，沉淀） 2. 如果严格控制水溶剂蛋白的储存条件，并且对配方进行合理设计，可以减缓其降解，但是在实际的运输过程中，精确控制储存条件通常是行不通的，蛋白会因受到多种应力的作用而变性，包括摇动，高低温，冷冻等 3. 尽管会设计配方和运输条件尽可能规避这些应力导致的损害，但是仍然不能足够阻止在长期储存过程中造成的损害。例如，在某些情况下，尽量减少化学降解的条件会导致物理损伤，反之亦然，那么就无法找到提供必要的长期稳定性的折衷条件。解决方案：冻干配方设计合理的冻干配方，理论上可以解决以上存在的所有这些问题。在干燥的样品中，降解反应可以得到充分的抑制或减缓，蛋白产品在室温状态可以仍然维持其稳定性，保存期可达到数月或数年的时间。而且，在运输过程中，短期的温控偏离，冻干的蛋白样品通常也不会受到损害。即使在两种或多种降解途径需要不同条件才能实现最大热力学稳定性的情况下，干燥产品中反应速率的降低也可以实现长期的稳定性。因此，一般来说，当配方前研究表明在液体配方中不能获得足够的蛋白稳定性时，冷冻干燥提供了颇有吸引力的替代方案。冻干蛋白配方可能遇到的问题然而，相对水针剂产品，只需要简单灌装即可来说，冻干过程较为复杂，且耗时、成本高，再有，一个十分关心的问题，如果配方中没有合适的稳定赋形剂，大多数蛋白制剂在冻干的过程中至少部分会因冻结应力和脱水应力而变性，结果通常是不可逆的聚合，通常是在冻结之后立即聚合或在储存过程中，小部分蛋白分子发生聚合。因为大多数的蛋白药物是非肠道给药，即使只有百分之几的蛋白聚合也是不可以接受的。因此，只是简单的设计一个配方，允许蛋白能承受冻干过程中的应力，但是无法确保冻干后的样品能有长期的稳定性。一个较差的冻干配方，蛋白很容易发生反应，须要求在零度以下储存，这样的配方应当认为是不成功的。本文将提供一些实践的指导，用于配方的设计，可以在冻结和干燥过程中保护蛋白，并且在室温条件下长期储存和运输过程中具有很好的稳定性。再有，会简要地讨论，配方设计须考虑到工艺条件的物理限制，已获得最终低水分含量的良好蛋糕。我们将不讨论冻干工艺的设计和优化，也不会偏离关于赋形剂选择的实用建议，以解决关于这些化合物稳定蛋白质的机制的争论。有丰富经验的药物科学家可能跟这篇文章的内容也没有很大的关系，但是可以将蛋白药物产品推向市场，然而，我们的目标主要是针对对于稳定的冻干蛋白配方设计还不太了解以及具有很大挑战的那些研发人员提供一个很好的开始。 配方设计的主要制约因素有哪些？当合理设计冻干配方时，需要考虑的因素很多，从整体来看，工作会比较复杂，但如果能很好的理解决定最终成功的主要限制因素，那么就会容易很多。01蛋白的稳定性首先记住蛋白产品选择冻干方法的主要原因是其不稳定性，整个配方中最敏感的成分也是蛋白质，那么在配方设计中首要关心的是赋形剂的选择，能够提供蛋白好的稳定性。02最终药物配置在配方研发开始之前，须确定好最终药物的配置，需要考虑的问题包括给药途径（常为非肠道给药），共同给药的其他物质，产品体积，蛋白浓度，冻干盛装容器（西林瓶、预充针或其它）等，如果最终药物需要多次使用，在配方中需要加入防腐剂，这个可能会降低蛋白的稳定性。03配方张力在选择赋形剂时，可能会考虑设计等张溶液，甘露醇和甘氨酸通常是良好的张力调节剂，这些赋形剂经常优于NaCl,因为NaCl具有较低的共晶融化温度和玻璃态转变温度，使得冻干更难进行。另外，如果样品中含有相对低的蛋白量，经常会加入填充剂，避免在冻干的过程中蛋白损失，甘露醇和甘氨酸同时也可以充当这个角色，因为他们会最大程度的结晶并且形成机械强度较高的蛋糕结构。然而，须意识到单独使用晶体类的赋形剂通常不能够在冻干过程和储存期间给蛋白提供足够的稳定性。04产品的蛋糕结构最终冻干的样品须具有优雅的外观结构，较强的机械强度并且没有出现任何塌陷和/或共晶融化，水分残留要相对较低（1g水/100g 干物质），如果产品发生塌陷，不仅外观不能接受，而且会导致样品最终的水分含量较高，复水时间延长。05产品玻璃化转变温度为了确保干燥后蛋白具有长期稳定性，非晶态成分（包含蛋白）的玻璃转化温度要高于计划的储存温度。水是无定形相的增塑剂，需要保持较低的水分含量确保样品的Tg 要高于运输和储存的最高温度。06产品塌陷温度一般来说，达到最终的目标，在整个冻干过程中，需要维持产品温度在其玻璃转化温度以下。在干燥过程中，当冰晶升华时，对于非晶态样品，产品温度须维持在其塌陷温度以下，塌陷温度通常与热致相变温度（也就是最大冻结浓缩无定形相的玻璃态转变温度Tg’）一致，同时，也有必要维持产品温度在任何晶体成分的共晶融化温度以下。在实际中，这些温度可以通过差示扫描量热仪DSC或冻干显微镜来测定。在配方开发中有必要测定产品的塌陷温度。 冻干显微镜Lyostat5及搭配使用的DSC模块为什么要测定塌陷温度？在低于产品的塌陷温度下干燥是需要付出代价的，产品的温度越低，干燥的速度越慢，干燥的成本就越高。通常，在-40℃以下干燥是不实际的，同时样品能降低到的温度还受一些物理条件的限制，比如冻干机的性能以及产品的配方。在配方开发过程中，药物研发人员应该与工艺工程师（设计冻干工艺人员）紧密配合，并且清楚了解放大化生产型冻干机与实验室研发冻干机的区别是非常重要的，通常情况下，生产型冻干机和实验室冻干机在工艺参数控制方面会有所不同，一部分原因是生产型冻干机较大，在冻干过程中每瓶样品的产品温度差异较大。因此，如果对冻干过程熟悉的研发人员可以提供有用的信息帮助配方科学家做出正确的判断，避免由于误判导致将较好的配方排除在外。对于塌陷温度较低的产品，也有一些方法，如可以通过控制过程参数来实现短时快速干燥。配方设计需平衡蛋白稳定性和塌陷温度很明显，配方设计的一个目标是保证蛋白稳定性的前提下提供较高的塌陷温度，产品的塌陷温度主要取决于配方的组成，如果蛋白的含量超过所有溶质的20%，会对Tg’有较大的的影响。尽管单纯的蛋白溶液通常用DSC很难测出Tg’，根据实验得出，增加蛋白含量，对于大多数的配方来说，均可以提高Tg’。通过外推法得到纯的蛋白溶液的Tg’，大约为-10℃，远远高于大多数的单一赋形剂的Tg’(如蔗糖的Tg’为-32℃)，因此，从工艺过程的经济角度考虑，更期望配方中较高的蛋白质和稳定剂比例，然而，蛋白的稳定性通常随着稳定剂与蛋白含量比例的增加而提高，因此须在高的塌陷温度和较好的稳定性方面做出平衡。并且，如下文讨论的内容，随着蛋白浓度的增加，蛋白质在预冻过程中抵抗冻结应力损伤的能力就会得到改善，那么在高蛋白浓度和高稳定剂和蛋白重量比的情况下，稳定性是最好的，这样，就会导致整个配方较高的固形物浓度，给工艺带来困难，总浓度超过10%的配方将比较难冻干。如何改变Tg'？在升华之前对配方进行一些处理可以改变Tg’，如经常使用的退火处理，在退火处理过程中，会从无定形相中移走一小部分成分，如使用甘氨酸作为晶体的填充剂，取决于预冻的方法，可能一部分的甘氨酸分子会保留在样品的无定形相中，甘氨酸具有相对较低的Tg’(-42℃)，因此让甘氨酸尽可能的结晶是非常重要的，这样可以提高样品中无定形相的Tg’，加快干燥，节省成本。对于赋形剂结晶，设计理想完善的方案，可以用DSC模仿冻结和退火工艺的条件来进行，这个方法可以参考Carpenter 和 Chang的文章内容。 在哪些步骤蛋白需要维持稳定性？实际上，从灌装到最终干燥的产品复水，每一步均会对蛋白造成损伤，并且要求配方的成分能够抑制蛋白的降解。在快速处理步骤（如灌装，预冻，干燥和复水等）中，主要的问题通常是物理损害，如低聚物的形成和/或蛋白沉淀；通常，蛋白从液体到固体的转变，相对与减缓化学变化，更多的会减缓蛋白的物理变化的速率，因此，储存过程中的化学降解经常是更严重的稳定性问题。在储存期间或复水时，蛋白也会发生聚合。在预冻和干燥过程中，受到冻结和干燥应力的作用，蛋白的结构很容易遭到破坏，如果在这些过程中，能够抑制蛋白去折叠（变性），那么降解过程就会达到最小化，因此，配方设计主要的关注点就是在这些过程中能够保护蛋白，在干燥后的样品中具有较高的Tg及较低的含水量，能阻止样品内部发生化学反应，更好的保持蛋白的天然性能。01在预冻过程中的蛋白的稳定性特定的蛋白是否易受冷冻破坏的影响取决于许多因素，除了在配方中包含适当的稳定剂外。一般来说，会考虑三个很重要的参数：蛋白浓度，缓冲液的种类以及预冻方法。蛋白浓度增加蛋白质的浓度能够提高蛋白对冻结变性的抵抗力，可以通过简单地测定冻融后蛋白聚合的百分比，该百分比与蛋白质浓度呈反比。通常，如果预冻过程中去折叠的蛋白分子部分与浓度无关，那么预计增加蛋白浓度会增加蛋白聚合。然而，现在人们认为，增加蛋白质浓度会直接减少冷冻诱导的蛋白质去折叠。据推测，冻结阶段的损伤包括蛋白在冰水界面的变性，假设只有有限数量的蛋白分子在这个界面变性，增加蛋白的初始浓度会导致较低比例的变性蛋白。处于实际的目的，将蛋白浓度作为一个重要的考虑因素，在配方开发过程中尽可能保持较高的浓度，就显得特别简单了。缓冲液种类缓冲液的选择也是非常关键，主要引起问题的是磷酸钠和磷酸钾，在预冻和退火过程中，二者的pH值会有明显的变化。对于磷酸钠，其二元碱形式的容易结晶，导致在冷冻样品中，剩余的无定形相中的pH会降到4或更低。对于磷酸钾，其二氢盐结晶后，pH会变到接近9. pH改变的风险以及对蛋白的损害可以通过提高最初的冷却速度，限制退火步骤的时间，降低缓冲液的浓度等来控制，所有这些措施可以降低盐类结晶的机会。快速冷冻，不进行退火也限制了蛋白质在暴露在冷冻状态下的时间。尽管其他的赋形剂能够辅助抑制pH的改变，较好的方法是避免使用磷酸钠和磷酸钾。在预冻阶段pH有较小变化的缓冲液包括柠檬酸盐，组氨酸，Tris溶液等。预冻方法排除由于pH变化造成的问题，在实验中发现，预冻过程中，蛋白质受破坏的程度跟冷却的速率有关系，较快的冷却速度形成的冰晶体较小，冰的比表面积越大，受破坏的程度越大，这个推测是由于蛋白在冰水界面变性导致。冷却的速度通常受冻干机设备本身性能的限制，然而，一些对冷冻敏感的蛋白，即使慢速冷却也会导致其变性。02、在干燥和储存过程中蛋白的稳定性尽管整个蛋白分子在预冻过程中保持了其原有的结构，然而，在后续的脱水干燥过程中如果不加入合适的稳定剂也会面临变性的风险。简单的说，当去除蛋白分子的水合外层时，蛋白质天然的结构便遭到破坏。对多个蛋白的红外光谱研究表明：无合适的稳定剂存在时，在干燥的蛋白样品中，其结构将会遭到去折叠。如果样品迅速复水，损伤的程度（如，聚合百分比）与干燥蛋白质的红外光谱的非天然表现直接相关。因此，降低复水后结构的破坏需要减小预冻和主干燥过程中蛋白结构的去折叠。而且，即使样品立即复水后100%的天然蛋白分子被恢复，干燥的固体中也会有相当一部分去折叠的分子。在复水过程中分子内的再折叠可以主导分子间的相互作用，从而导致聚集，在复水后表现为100%的天然分子。适当的赋形剂可以阻止或至少减轻蛋白结构的去折叠，配方是否成功可以通过红外光谱检查干燥后蛋白的二级结构来立即判断，更重要的是，发表的一些研究显示，干燥样品的长期稳定性取决于干燥过程中天然蛋白的保留量，如果干燥后的蛋白样品存在结构上的去折叠，即使样品在低于其Tg温度以下储存，蛋白也会很快被破坏，因此，红外光谱法可作为蛋白配方的另外一种工具，研发人员可以在冻干后对样品进行检测，确定其结构是否遭到破坏。欢迎先关注我们，下一期内容将继续为大家带来“实用建议：如何合理设计稳定的冻干蛋白配方（二）”，详细分享：蛋白样品冻干的首选赋形剂有哪些、基于成功蛋白冻干配方会导致最终失败的一些细节问题等。莱奥德创冻干技术分享关注“莱奥德创冻干工场“，立即获取冻干线上技术分享内容。基于对于冻干研发的一些考量，莱奥德创创建了金字塔冻干技术分享平台：包含了从冻干理论基础，到配方和工艺开发，再到放大及生产，以及进阶的设备管理和线上线下专题内容分享。内容结合了来自Biopharma的冻干理论指导体系、来自于莱奥德创产品经理及应用工程师的实践经验总结及国内外专家的专题内容。获取方式Step 1：关注公众号 扫码关注莱奥德创公众号Step 2：点击菜单栏“冻干讲堂” Step 3：点击你感兴趣的内容Banner Step 4：开始学习 更多关于冻干技术分享平台的介绍请点击下方阅读：● 冻干免费技术内容获取-莱奥德创金字塔冻干技术分享平台► 点击阅读如果您对上述设备或冻干服务感兴趣，欢迎随时联系德祥科技/莱奥德创，可拨打热线400-006-9696或点击下方链接咨询。译自：《Rational Design of Stable Lyophilized Protein Formulations:Some Practical Advice》 John F.Carpenter,Michael J.Pikal,Byeong S.Chang,Theodore W.RandolpH pHarmaceutical Research, Vol.14,No.8,1997* 如有理解错误之处，还请参考原文关于莱奥德创冻干工场上海莱奥德创生物科技有限公司专注于提供前沿的冻干设备应用和制剂开发相关服务，依托于合作伙伴加拿大ATS集团SP品牌和英国Biopharma Group等的紧密合作，致力于促进中国生物医药技术创新升级，助力中国大健康行业的持续发展。莱奥德创在上海及广州设有实验室，拥有专业的技术团队及国内外专家支持体系。莱奥德创面向生物制药、食品科学等各个领域行业客户，提供冻干研发、放大、委托生产及培训等服务。前期研发● 产品配方特征研究:共晶点温度(Te)、塌陷温度(Tc)、玻璃态转化温度(Tg'、Tg)测定等；● 实验室工艺开发：冻干工艺开发:冻干制剂配方开发，工艺确定，申报材料撰写；● 冻干工艺优化：利用中试冻干机上PAT工具优化及缩短工艺；● 冻干产品质量指标测试：水分含量，冻干饼韧度分析；● 咨询服务：如产品外观问题、产品质量问题、其他troubleshooting等；工艺放大/技术转移● 冻干工艺转移/放大: 远程技术指导+现场服务；● 小批量冻干生产(NON-GMP)，临床一期生产（GMP）；其他业务● 企业小团队线上线下培训服务：冻干原理，工艺开发，设备使用维护等；● 冻干设备租赁服务。400-006-9696www.lyoinnovation.com莱奥德创冻干工场中国(上海)自由贸易试验区富特南路215号自贸壹号生命科技产业园4号楼1单元1层1002室德祥科技德祥科技有限公司成立于1992年，总部位于中国香港特别行政区，分别在越南、广州、上海、北京设立分公司。主要服务于大中华区和亚太地区——在亚太地区有27个办事处和销售网点，5个维修中心和2个样机实验室。30多年来，德祥一直深耕于科学仪器行业，主营产品有实验室分析仪器、工业检测仪器及过程控制设备，致力于为新老客户提供更完善的解决方案。公司业务包含仪器代理，维修售后，实验室咨询与规划，CRO冻干工艺开发服务以及自主产品研发、生产、销售、售后。与高校、科研院所、政府机构、检验机构及知名企业保持密切合作，服务客户覆盖制药、医疗、商业实验室、工业、环保、石化、食品饮料和电子等各个行业及领域。2009至2021年间，德祥先后荣获了“最具影响力经销商”、“年度最佳代理商“、”年度最高销售奖“等殊荣。我们始终秉承诚信经营的理念，致力于成为优秀的科学仪器供应商，为此我们从未停止前进的脚步。我们始终相信，每一天都在使这个世界变得更美好！

本篇继上一篇“实用建议：“如何合理设计稳定的冻干蛋白配方（一）”继续为大家分享蛋白样品冻干的理想赋形剂有哪些、基于成功蛋白冻干配方会导致Final失败的一些细节问题等。 》》》对于蛋白样品，理想的赋形剂有哪些？从冻干对蛋白的所有危险以及我们需要在各个环节考虑的所有因素来看，快速开发一个稳定的蛋白配方看起来似乎是不可能的。幸运的是，如果我们能够采用合理的方法对配方进行很好的设计，大多数的配方问题是可以得到快速解决。这里，我们主要是对初始配方成分的选择提供基础。在一些情况下，初始的配方很有可能就是走向市场的Final产品。给定的组分，进行不同微小的修改，已经被成功地用于蛋白药物。需要强调的是对于冻干配方，在能够提供良好稳定性和结构的情况下，成分越简单越好。所加入的赋形剂都须要有数据证明对配方起有益的作用。01给定蛋白质维持稳定性的具体条件对于一些通用型的稳定剂，可以有效地保护绝大多数的蛋白质，在选择这些稳定剂之前，我们有必要通过优化影响蛋白物理和化学稳定性的具体因素来选择合适的稳定剂。影响蛋白物理和化学稳定性的具体因素：1. 避免极端的pH值可以显著降低蛋白脱氨基的几率。而且，通过优化溶液的pH值，可以显著提高蛋白在冻干过程中抵抗去折叠的能力。2. 还应该研究其他能提高蛋白质稳定性的特异性配体（通过增加去折叠的自由能）。肝素和其他聚阴离子对生长因子的稳定性影响就是一个很好的例子。3. 其它需要考虑的重要因素是离子强度对蛋白的去折叠和聚合的影响。须意识到，在预冻过程中，由于冰的形成将溶液浓缩，离子强度可增加50倍。因此负责原料药纯化和做药物配方前研究的人员已经对这些问题有了深刻的认识，配方科学家应该在着手设计冻干配方之前与他们进行沟通。即使在针对蛋白质稳定性优化的特定的溶液条件下，但是如果样品需要幸免于冻干的损害并长期保存，有必要加入一些其它的保护剂。首先，我们考虑一些已经用在冻干蛋白配方中的成分，但它们不能提供蛋白的稳定性，而且可能会促进蛋白在储存期间的破坏。我们将提供一个简单、有效的思路，并且讨论选择这些成分的原理。02不能提供蛋白稳定性的赋形剂部分多聚物作为赋形剂的优缺点在冻干工艺的快速开发过程中，为了获得一个强壮的蛋糕结构，一些多聚物，如葡聚糖，羟乙基淀粉，因具有较高的塌陷温度，导致Final产品的Tg也会比较高，常常是受欢迎的赋形剂。不好的是，这些多聚物在冻干过程中不能抑制蛋白结构的去折叠，因此在后续的储存中不能提供稳定性。无法抑制冻干诱导变性的原因大概是聚合物过大而无法与蛋白质氢键合，无法代替脱水过程中损失的水，或者是因为聚合物与蛋白质形成了分离的无定形相。尽管当这些多聚物单独使用时不是一种很好的稳定剂，但是经证实，如果其结合双糖稳定剂可以具有较好好的作用。冻干过程中的有效稳定剂对大量的化合物进行测定，显示在冻干过程在较有效的稳定剂是双糖，但是避免使用还原性糖。还原性糖在冻干过程中可以有效抑制蛋白结构的去折叠，但是在干燥样品的储存过程中，可以通过美拉德反应（糖的羰基和蛋白质上的游离氨基）降解蛋白，结果形成含有降解蛋白的棕色糖浆，而不是含活性蛋白的白色蛋糕状结构。通常，我们减缓这个过程的方法是将样品储存在零度以下，这就失去了产品冻干的意义，这些还原性的糖包括：葡萄糖，乳糖，麦芽糖，麦芽糊精等。在早期的研究中，晶体类的填充剂如甘露醇，甘氨酸在冻干过程中不能提供蛋白很好的稳定性，但是，一些配方使用了这两种物质的混合物，并且成功地推向了市场。在这些案例中，甘露醇和甘氨酸适当的比例可以导致一大部分的化合物保持无定形状态。这部分无定形状态的化合物足以抑制冻干过程中蛋白的去折叠并且提供长期储存的稳定性。但是建议谨慎选择这种方法，因为达到合适的工艺条件再加上合适的赋形剂比例，既耗时又很难办到的。03赋形剂的合理选择如何合理的选择赋形剂？案例分享举个具体的案例说明，假设：1. 蛋白药物的浓度定在2mg/ml；2. 主要的降解途径是冻干后或复水后蛋白的聚合以及储存期间蛋白的脱氨基；3. 优化具体的条件（如用柠檬酸盐缓冲液控制pH为6）只能将冻干和复水后聚合程度降到10%，尽管样品在低于Tg温度的20℃下进行储存脱氨基速度仍然不能接受。加入晶体类的膨胀剂，如甘露醇，保持样品强壮的结构及良好的外观。在这种情况下，主要缺少的成分是非还原性双糖，其在干燥样品中会与蛋白形成无定形的结构，作为主要的稳定剂，主要选择蔗糖或海藻糖。它们在预冻阶段能够很有效地保护蛋白并且能够很好的抑制复水过程中蛋白结构的去折叠。预冻阶段的保护取决于初始糖的总浓度，有时，超过5%（w/t）的浓度可以尽可能大程度地保持蛋白的稳定性。相反，在干燥阶段，蛋白的保护取决于Final糖和蛋白的质量比。一般来说，糖和蛋白的重量比至少为1:1时，可以提供较好的稳定性，当达到5:1时，可以达到很佳的稳定性。保持蛋白的浓度不变，选取一定范围的糖浓度进行筛选和检测，通过干燥样品中天然结构保留率以及复水后蛋白聚合降低的程度来确定最合适的浓度。一般来说，合适的糖浓度，可以在冻干过程中提供蛋白很好的稳定性，并且如果Final样品的Tg高于储存温度，在后期的储存期间也可以提供蛋白较好的稳定性。例如，假定最高的储存温度为30℃，那么Final产品的Tg ＞50℃应该是稳定的，但前提是Final样品的含水量需要达到允许的水平，因为水分的存在会降低样品的Tg。可以使用DSC检测每种样品的Tg值。蔗糖/海藻糖如何选择？蔗糖和海藻糖，作为两种常用的稳定剂，均有其优势和劣势，可根据不同的情况进行选择：● 在任何水分含量的样品中，海藻糖均会有较高的Tg，因此较为容易冻干。另外Tg ＞50℃的条件可以允许样品有较高的残留水分。然而，技术工程师应该能够针对这两种双糖设计经济有效的工艺。如果样品中蛋白浓度较高，可以提高Tg，这样就会弱化海藻糖的作用；● 与蔗糖相比，海藻糖更能抵抗酸解，双糖水解后会产生还原性的单糖，这是需要避免的。通常情况下，如果pH不是很低，如pH4左右或更低，这个应该不是很大的问题；● 蔗糖在冻干过程中抑制蛋白去折叠方面看似比海藻糖更有优势，当蛋白在预冻阶段非常不稳定（需要较高的糖浓度）和/或蛋白浓度较高时，这种优势更明显。海藻糖的相对不稳定性是由于在预冻和干燥过程中其更易于与蛋白之间产生相分离。对于给定的配方，这是否会有问题不能被预测，因此，每种制剂配方都需要检查其保护蛋白的能力。表面活性剂的作用在这里，我们案例中的配方可能就比较完整了，就像许多蛋白质的情况一样。然而，我们假设，即使蔗糖完全抑制可检测的蛋白质去折叠，正如用红外光谱对干燥固体的结构分析所评估那样，在复水后，仍然有1%的聚合蛋白。因为在原始的样品中是没有任何聚合的，假设在冻干过程中，一小部分蛋白发生了去折叠，在复水后，部分这些分子又重新折叠，但是部分聚合在一起。这个实际上看起来是个很普遍的问题，就像在冻干之前一些处理造成的聚合。幸运的是，通过在配方中加入一些非离子型表面活性剂，如聚山梨醇酯（吐温）通常可以抑制蛋白的聚合。要求的浓度通常比较低（＜0.5% w/v），通过将表面活性剂滴定到包含所有其它组分的冻干制剂中，可以识别出理想浓度。应避免加入过量，因为表面活性剂在室温下是液体的状态，如果浓度较高，会降低配方的玻璃态转变温度。然而，通常在优化蛋白质稳定性所需的非常低的浓度下，不会有问题。表面活性剂看作是画龙点睛，通常在冻干产品配方中加入表面活性剂是有利的，可以抑制处理过程中界面引起的去折叠和聚集（如起泡夹带或瓶-液界面引起的）。最重要的是表面活性剂在冻干/复水过程中抑制聚合的能力，目前还不太清楚表面活性剂的保护在哪一步起作用的。有资料证明，表面活性剂在冻融及复水过程中可减少蛋白聚合并且在预冻阶段有助于抑制蛋白的去折叠，对干燥固体中聚集物特定红外波段的检查表明，表面活性剂可以抑制冻干过程中产生的聚集。在复水过程中，曲折叠分子的聚合能通过表面活性剂得到抑制，猜测是通过分子之间的相互作用和/或作为一种润湿剂，加速冻干产品的溶解。如果显示表面活性剂在复水过程中是有益的，则可以通过在稀释剂中加入表面活性剂来达到这种效果。 》》》还有哪些意想不到的危险可能会导致失败？尽管根据上述给出的建议，对于给定蛋白，我们可以设计出成功的配方，但是，还有其他一些问题可能会导致Final失败，特别是在长期储存期间。● 赋形剂中经常会有一些污染物，这些会导致蛋白快速的化学降解，糖类和甘露醇中会含有过渡金属元素，表面活性剂可能被过氧化物污染，所有的这些可以促进蛋白的氧化；● 在储存过程中，水分从胶塞转移到产品，引起水分参与的降解，直接损坏蛋白，并且降低蛋白的Tg,加速蛋白的降解，特别是当储存温度高于Tg 时；● 即使在高温（如40℃）下的储存稳定性研究中，一切都表现出理想的状态，但有一个常见的，但很少报道的事件可能是灾难性的，这个问题可以用下面的故事来说明。产品在实验室中在40℃下储存可以保持几个月的稳定性，在冬季，产品在运输过程中也保持良好的稳定性，没有来自消费者的问题报告，然而，有时在夏季，运输后，在室温下储存仅2周后发现产品过度降解，用差示扫描量热仪DSC对一开始的干燥粉末进行了检查，给出了合理的解释，结果发现，制剂中的甘露醇没有全部结晶，而是形成了Tg约为45℃的亚稳玻璃态，当在夏季运输过程中，超过了这个温度时，甘露醇变发生结晶，最先与甘露醇结合的水被转移到了剩余的无定形相中，蛋白相的水含量增加，降低了它的玻璃化转变温度，因此，加速了蛋白质的降解。这个问题可以使用DSC设计合理的退火方案使甘露醇再预冻阶段全部结晶来避免，另外也可以通过调整甘露醇的浓度，降低残留水分含量，使甘露醇即使在45℃的条件下也不会结晶。 》》》对于给定的蛋白药物，这些信息足够吗？对于大多数的蛋白，上面给出的建议一般会设计出成功的配方，但是，每种蛋白都有其独特的物理化学特性和稳定性要求。因此，针对每种不同的蛋白，配方也需要自定义设计。结合蛋白本身的特性知识以及选择合理的赋形剂可以快速设计出稳定的冻干蛋白配方。最后，在快速冻干工艺中保持干物质的物理性质和在干燥后获得天然的蛋白质之间需要折衷，研究表明：当蔗糖结合葡聚糖一起使用时，由于蔗糖的作用，蛋白质的天然结构可以保留在干燥的固体中；葡聚糖的存在提高了制剂的Tg，并提供了一种无定形的填充剂，快速干燥的同时保留了所需的蛋糕性质；其他的一些聚合物有可能提供与葡聚糖相同的优势，如羟乙基淀粉也具有较高的Tg，通常比葡聚糖更容易接受用于肠胃外给药。期望可以合理地利用这些多聚物作为Tg的调节剂，使得制剂更稳定，更容易快速冻干。莱奥德创冻干技术分享关注“莱奥德创冻干工场“，立即获取冻干线上技术分享内容。基于对于冻干研发的一些考量，莱奥德创创建了金字塔冻干技术分享平台：包含了从冻干理论基础，到配方和工艺开发，再到放大及生产，以及进阶的设备管理和线上线下专题内容分享。内容结合了来自Biopharma的冻干理论指导体系、来自于莱奥德创产品经理及应用工程师的实践经验总结及国内外专家的专题内容。获取方式Step 1：关注公众号 扫码关注莱奥德创公众号Step 2：点击菜单栏“冻干讲堂” Step 3：点击你感兴趣的内容Banner Step 4：开始学习 如果您对上述设备或冻干服务感兴趣，欢迎随时联系德祥科技/莱奥德创，可拨打热线400-006-9696或点击下方链接咨询。译自：《Rational Design of Stable Lyophilized Protein Formulations:Some Practical Advice》 John F.Carpenter,Michael J.Pikal,Byeong S.Chang,Theodore W.RandolpH pHarmaceutical Research, Vol.14,No.8,1997* 如有理解错误之处，还请参考原文关于莱奥德创冻干工场上海莱奥德创生物科技有限公司专注于提供前沿的冻干设备应用和制剂开发相关服务，依托于合作伙伴加拿大ATS集团SP品牌和英国Biopharma Group等的紧密合作，致力于促进中国生物医药技术创新升级，助力中国大健康行业的持续发展。莱奥德创在上海及广州设有实验室，拥有专业的技术团队及国内外专家支持体系。莱奥德创面向生物制药、食品科学等各个领域行业客户，提供冻干研发、放大、委托生产及培训等服务。前期研发● 产品配方特征研究:共晶点温度(Te)、塌陷温度(Tc)、玻璃态转化温度(Tg'、Tg)测定等；● 实验室工艺开发：冻干工艺开发:冻干制剂配方开发，工艺确定，申报材料撰写；● 冻干工艺优化：利用中试冻干机上PAT工具优化及缩短工艺；● 冻干产品质量指标测试：水分含量，冻干饼韧度分析；● 咨询服务：如产品外观问题、产品质量问题、其他troubleshooting等；工艺放大/技术转移● 冻干工艺转移/放大: 远程技术指导+现场服务；● 小批量冻干生产(NON-GMP)，临床一期生产（GMP）；其他业务● 企业小团队线上线下培训服务：冻干原理，工艺开发，设备使用维护等；● 冻干设备租赁服务。400-006-9696www.lyoinnovation.com莱奥德创冻干工场中国(上海)自由贸易试验区富特南路215号自贸壹号生命科技产业园4号楼1单元1层1002室德祥科技德祥科技有限公司成立于1992年，总部位于中国香港特别行政区，分别在越南、广州、上海、北京设立分公司。主要服务于大中华区和亚太地区——在亚太地区有27个办事处和销售网点，5个维修中心和2个样机实验室。30多年来，德祥一直深耕于科学仪器行业，主营产品有实验室分析仪器、工业检测仪器及过程控制设备，致力于为新老客户提供更完善的解决方案。公司业务包含仪器代理，维修售后，实验室咨询与规划，CRO冻干工艺开发服务以及自主产品研发、生产、销售、售后。与高校、科研院所、政府机构、检验机构及知名企业保持密切合作，服务客户覆盖制药、医疗、商业实验室、工业、环保、石化、食品饮料和电子等各个行业及领域。德祥始终秉承诚信经营的理念，致力于成为优秀的科学仪器供应商，为此我们从未停止前进的脚步。我们始终相信，每一天都在使这个世界变得更美好！

项目编号：JSHC-2022121190C2项目名称：东南大学医学与生命科学平台蛋白纯化仪采购预算金额：96.0000000 万元（人民币）采购需求：东南大学医学与生命科学平台采购蛋白纯化仪一套，主要功能要求如下：可以进行生物大分子的范例纯化，已知和未知蛋白质的纯化，蛋白质的结构动力学药物作用靶点研究，药物蛋白的分离，蛋白质工程药物的合成，蛋白质的定性，基因表达产物的分离。主要技术要求如下：蛋白纯化系统主机部分系统泵：精确的全自动微量柱塞泵，双泵四泵头，每个泵头都有独立除气阀。流速：0.001-25ml/min；装柱可以双泵模式运行，达到0.1–50ml/min。压力范围：0–20 MPa (200bar，2900 psi)；梯度流速范围：0.5-25ml/min。具备恒压调速功能，自动根据压力调节流速输出，使压力保持稳定。项目编号：JSHC-2022121193C7项目名称：东南大学医学与生命科学平台蛋白质稳定分析仪采购预算金额：43.0000000 万元（人民币）采购需求：东南大学医学与生命科学平台采购蛋白质稳定分析仪一套，主要技术要求如下：（1）适用范围：可分析任意类型的蛋白样品：病毒颗粒、膜蛋白、标签蛋白、酶、抗体、激酶、多聚复合物等。（2）样品数量：≥6 个（3）测量时间：≤3 分钟（4）样品消耗量：≤10 µL合同履行期限：详见采购文件本项目( 不接受 )联合体投标。

球菌的细胞壁，与IgG的Fc片段具有非常强的特异性，分子量约为42×103，如图所示。一般在蛋白 A亲和层析中，配基在中性pH条件下结合抗体，在酸性pH条件下与蛋白解离。‍蛋白A与抗体IgG的Fc片段结合模式基于蛋白 A 亲和层析的抗体捕获工艺较为稳定，但也存在一些不足，主要包括：（1）介质成本高。（2）配基易脱落。（3）洗脱条件苛刻。（4）Protein A介质的再生比较困难。针对以上问题，部分商业化蛋白A亲和层析介质中使用的基本为改造的蛋白A配基，改善了天然蛋白A的缺点，提高了耐碱能力和洗脱 pH。月旭科技推出的耐碱抗体亲和介质-耐碱Protein A Solid/耐碱Protein A 4FF， 由大肠杆菌表达，经层析纯化获得，纯化过程不适用抗体柱亲和层析，避免了产品中掺入无关IgG的可能，改配基pH耐受0.5M NaOH和0.5M HCl处理，不降解，抗体结合能力不变。该介质适合从大批培养液捕获单克隆抗体或Fc融合蛋白，也适合与从腹水或者血浆中捕获多克隆抗体。技术参数‍应用实例订货信息

鼎昊源全自动转印仪Blotstainer在蛋白免疫印迹上的应用 由于蛋白免疫印迹的步骤操作较为繁琐，要求精度较高，实验中一步出现操作失误就会导致整个实验的白白浪费。并且一抗二抗试剂也比较宝贵，所以采用仪器操作可以降低实验的风险，保证实验的顺利进行。 鼎昊源推出的全自动转印仪就是替代人工操作的好选择，它配有自动移液系统，温控系统和孵育摇床。自动移液系统包括10个管路，相互独立，避免交叉感染。温控系统范围在4℃到80℃之间，满足蛋白免疫印迹，核酸分子杂交实验的孵育温度。整套系统根据客户自定义的操作程序自动完成。为了方便客户使用，全自动转印仪出厂预设了免疫印迹，核酸杂交，原位杂交和免疫组化的自动程序。 内置标准蛋白免疫印迹程序如下： Step Task Time Action Buffer Memo Execute x times 1 Set temp Off Temperature to RT 2 Incubate 00:05 Wash PBST Wash membrane X2 3 Set temp ON, 10℃ Temperature 10℃ 4 Incubate 01:00 Blocking Block solution Blocking 5 Incubate 02:00 AB-step Primary antibody Primary antibody 6 Incubate 00:05 Wash PBST Wash membrane X4 7 Incubate 00:30 Sec. antibody Second antibody Second antibody 8 Set temp Off Temperature to RT 9 Wash 00:05 PBST wash PBST PBST wash X10 10 Ready to stain in dark room 设置温度到室温 用0.01M PBS洗膜，5min × 2次。 设置温度到10℃ 4、加入包被液，平稳摇动，1hr。 5、加入一抗（按合适稀释比例用0.01M PBS稀释，液体必须覆盖膜的全部），2hr。 6、弃一抗，用0.01M PBS分别洗膜，5min× 4次。 7、加入二抗（辣根过氧化物酶偶联）（按合适稀释比例用0.01M PBS稀释），0.5hr。 8、设置温度到室温 9、弃二抗，用0.01M PBS洗膜，5min× 10次。 10、加入显色液，避光显色至出现条带时放入双蒸水中终止反应。 全自动转印仪在上述程序中可以实现在蛋白免疫印迹孵育过程中的温控，更加保证一抗二抗的活性，这是一般手工操作所达不到的。 整套程序5个小时内自动完成，不需要人工换液和取出薄膜。当然上述程序可以按照用户实际需要来调整全自动转印仪的程序。 关键词：蛋白免疫印迹，全自动转印仪

21世纪，全球各个国家都处在一个经济、信息、科技多方面高速发展的时期。经济的发展提高了绝大多数人们的生活水平，信息科技的大爆炸拓展了人们的视野和见识，科技的进步为人类的持续发展和安全提供源动力。然而，事物通常都具有两面性，给我们带来便捷和效益的同时，也将衍生诸多问题。食品安全问题愈发严峻，便是当今经济、信息、科技发展的副产物。食品企业追求经济利益最大化时，往往利用一些不法的伪科学手段来降低企业生产成本，损害人们的身心健康安全。层出不穷的食品安全事件，尤其在乳制品行业年年都接连不断地爆发，如同挥之不去的梦魇，在这个信息大爆炸的时代，迅速传播，不断地刺痛着人们越来越越敏感脆弱的神经。 日前，香港商业调查机构CER公司公布报告称，某洋品牌配方奶粉远未达到国际标准甚至是中国所能接受的最低标准，被指最差洋奶粉。质量最差门主要是该品牌1段婴幼儿配方奶粉，乳清蛋白和酪蛋白比例不合格。说明称，乳清蛋白中含有高浓度、比例恰当的必需氨基酸，还含有为新生儿必需的半胱氨酸。乳清蛋白还含有包括免疫球蛋白和双歧因子等免疫因子。对于宝宝而言，乳清蛋白是一种优质蛋白，因为它容易被消化，蛋白质的生物利用度高，从而有效减轻肾脏负担。酪蛋白中含有丰富的必需氨基酸，还含有婴儿特别需求的蛋氨酸、苯丙氨酸及酪氨酸。酪蛋白中结合了重要的矿物元素，如钙、磷、铁、锌等。但是，酪蛋白是一种大型、坚硬、致密、极困难消化分解的凝乳。过量的酪蛋白会产生较高的肾溶质负荷，给宝宝肾脏带来较重的负担，对宝宝是不安全的。 乳清蛋白和酪蛋白各有好处，但合适的比例还是应该以母乳作为黄金标准。母乳中乳清蛋白和酪蛋白的比例为60 : 40(而普通牛奶中乳清蛋白和酪蛋白的比例为18 : 82)。而此次被检测出的该品牌奶粉，乳清蛋白和酪蛋白的比列为41 : 59。国际食品法典委员会（CAC）在&ldquo 婴儿配方食品及特殊医学用途婴儿配方食品&rdquo 标准中，没有对产品中乳清蛋白的比例提出要求，而推荐以必需和半必需氨基酸的含量是否接近母乳作为婴儿配方食品中蛋白质质量的判定依据。其他国家和地区（包括美国、欧盟和澳大利亚、新西兰等）均未规定乳清蛋白在蛋白质中所占比例。我国国家标准GB10765－2010《婴儿配方食品》中，要求&ldquo 乳基婴儿配方食品中乳清蛋白含量应&ge 60%&rdquo ，即以乳或乳蛋白制品为主要原料的婴儿配方食品中，乳清蛋白所占总蛋白质的比例应大于等于60%。该要求主要是参考了母乳中乳清蛋白和酪蛋白的比例，沿用了我国GB10766－1997《婴儿配方乳粉ⅡⅢ》中关于乳清蛋白比例的相关规定。 各种品牌的婴儿奶粉都在宣称"接近母乳"，其中乳清蛋白和酪蛋白的比例是一个重要的指标，因为它能提供最接近母乳的氨基酸组合，更好地满足宝宝的成长需要。实际上，牛奶中酪蛋白含量的测定对于乳制品和奶酪制品生产商也都具有重大的经济意义。厂商通过测定酪蛋白含量，可以精确预测利用牛奶生产奶酪的产量。目前，市场上已经有一种快速测定乳清蛋白和酪蛋白比例的方法，是由美国CEM公司提出，在一些实验室应用推广。原理上是利用快速真蛋白测定仪，测得总蛋白含量后，沉淀及过滤酪蛋白，再测量乳清蛋白含量，能够快速精确得出酪蛋白含量，从而确定乳清蛋白和酪蛋白比例。整个过程仅需约15分钟,精确度和重复性相比其它凯氏定氮法和凝胶色谱法等更高，且没有污染性、腐蚀性试剂。这种高效而环保的方法值得推广，使用。 美国 CEM SPRINT 真蛋白质测试仪 更多详情，请联系培安公司： 电话：北京：010-65528800 上海：021-51086600 成都：028-85127107 广州：020-89609288 Email: sales@pynnco.com 网站：www.pynnco.com

植物蛋白结构与功能调控创新团队发表的最新研究进展回顾了植物蛋白乳化剂具有乳化性能的原理、影响因素，分析了蛋白质乳化性现有的表征及修饰方法，总结并展望了植物蛋白乳化剂在食品工业中的应用，以及其存在的主要差距与未来的发展方向，为植物蛋白乳化剂未来研究与应用提供了参考价值。乳化性是植物蛋白最重要的性质之一，因蛋白具有两亲性，可稳定油-水界面，形成乳状液，且因其具有健康、环境友好等优势，已被广泛应用于改善食品乳化性，其稳定的乳液也被应用于封装生物活性物质等方面，由此衍生出了众多新的乳化性表征与改善方法。该文章回顾了植物蛋白乳化剂具有乳化性能的机理，从天然因素、环境和加工因素等方面分析讨论了影响植物蛋白乳化性的原因。植物蛋白乳化性可通过LB膜、三相接触角、石英晶体微天平等方式进行表征；由于大多数植物蛋白的水溶性差、复杂性和环境敏感性导致其乳化性能有限，为了改善植物蛋白的乳化，通常使用物理、化学以及酶法对蛋白质进行修饰；植物蛋白由于具有与小分子乳化剂相似的乳化特性，可用于肉制品、沙拉酱、蛋黄酱、冰淇淋等食品的加工中，且植物蛋白稳定的乳液亦可用于负载风味物质、生物活性物质等。该文还提出，未来植物蛋白乳化特性的研究应探索新兴蛋白来源以及蛋白、多糖和其他功能化合物之间的相互作用机制，研发植物蛋白修饰的高新技术与最佳工艺条件，以提高植物蛋白的乳化能力，拓展其应用空间。此外，还应提高植物蛋白在食品中的利用率，并确保其适口性和可接受性。该研究成果在线发表在食品领域国际顶级期刊Food Hydrocolloids（JCR一区，IF:10.7）上。植物蛋白结构与功能调控创新团队2022级硕士研究生张鑫煜与王强研究员为论文共同第一作者，石爱民研究员为通讯作者。该综述得到了中国农业科学院青年创新专项（Y2022QC11），农业科技创新项目（CAAS-ASTIP-2022-IFST）的资助。原文链接：https://doi.org/10.1016/j.foodhyd.2023.109008植物蛋白乳化性的影响因素、表征方法、改性方法及应用示意图

一次肿瘤细胞的意外死亡，让一种明星分子浮出水面。日前，在科技成果评价机构组织的鉴定会上，一种独特的免疫蛋白分子引起了评审专家的兴趣。“肿瘤细胞死亡时的照片上，周边有起泡的现象非常有意思。”国家重点研发计划首席科学家、南京大学李朝军教授表示，这个情况和细胞焦亡挺像，值得更进一步的研究和应用。“这种分子是在七鳃鳗的免疫系统中找到的，它能够识别出人体肿瘤细胞，并从外面打孔，让肿瘤细胞死亡。”研发团队带头人、辽宁师范大学原副校长李庆伟教授介绍，目前正利用这种明星分子推动癌症早筛工作。本想向肿瘤细胞学习，却把它杀死了七鳃鳗在地球上已经生活了5.5亿年，被戏称为“僵尸鱼”，介于无脊椎动物和脊椎动物之间。“我们想把七鳃鳗细胞和肿瘤细胞放在一起培养，借助肿瘤细胞增殖因子，帮助七鳃鳗细胞繁衍。”李庆伟回忆，没想到的是，肿瘤细胞都死亡了。换了不同的肿瘤细胞结果仍一样。研究团队感觉七鳃鳗细胞一定分泌了一种独特的物质，对肿瘤细胞是致命的。为了找到这种物质，团队大量收集细胞培养上清，通过蛋白质组学技术最终锁定了LIP蛋白。围绕这一蛋白的系统研究在后来的十几年中逐渐推展开——破解蛋白结构、解码对应DNA序列、分析蛋白结构中的不同功能… … 谜题一一解锁，但人们最关心的是：古蛋白究竟是怎么杀死肿瘤细胞的？古老蛋白“一招夺命”肿瘤细胞光学显微镜下，一场杀戮由近及远次第展开。“我们给LIP‘镀上’荧光，标记了荧光基团的蛋白分子进入肿瘤细胞培养液，能从显微镜下看到荧光迅速聚集到了肿瘤表面，肿瘤细胞膜随后破裂。”辽宁师范大学生命科学学院教授逄越展示的照片复盘了整个过程：肿瘤细胞表面出现了大的孔洞，肿瘤细胞里的内容物全部外泄，一招夺命。更有趣的结果发生在研究团队“打扫战场”时。他们把肿瘤细胞表面的古蛋白做了收集检测发现，杀伐时蛋白不单兵作战，而是“组团”的聚合体。“我们提出了识别、定位、聚集、杀伤的机制。”逄越说，研究表明聚合体越多杀伤作用越大。整个机制的解析花了团队5年时间，终于弄清楚，蛋白上“凝集素”的结构域负责“指认”，“气单胞菌溶素”结构域能深深地插入肿瘤细胞膜搞破坏。明星分子“小试牛刀”机制清晰，研究走到了应用阶段。团队决定先让明星分子小试牛刀，在检测领域做验证。健康中国行动要求强化癌症早筛。膀胱癌检测一直痛苦得让患者望而却步，不愿早筛，实现“滴尿”筛查将让癌症发现大大提前。“我们将明星分子做成了检测试纸。尿液中脱落的膀胱表皮细胞如果有肿瘤的迹象，马上会被预警。”辽宁师范大学生命科学学院副教授韩英伦告诉科技日报记者，团队先从学校职工体检的尿检入手建立了指示分子含量的对照表，然后与大连市的几家医院合作进行临床研究，肿瘤患者的值会高过正常值2—3倍。相关研究数据显示，利用LIP特异性识别肿瘤细胞技术，尿液检测膀胱癌的LIP免疫荧光试纸灵敏性达到85%，特异性可达92%，简单、快速、微量、无创。“国际上这类检测试剂不多，美国FDA目前有三款试剂盒上市。”评审专家、大连医科大学附属第二医院院长刘志宇教授表示，作为我国自主研发的检测产品，尤其是从靶点开始的源头创新，目前的研究进展令人震撼。评审专家一致认为，该项目具有完全自主知识产权，达到国际领先水平。据介绍，相关研究多年来得到科技部国家重点基础研究发展计划、国家自然科学基金、辽宁省高等学校重大科技平台等项目支持。

在绿色生物制造和合成生物学等研究领域中，高质量的蛋白分离和纯化是研究目的蛋白结构和功能的重要步骤。传统的分离纯化方法通量低、耗时长、均一性差，全自动高通量蛋白纯化系统在生命科学研究和生物制药领域已开始广泛运用，从样本前处理工序，到不同类型的蛋白纯化流程，可实现多管线自动化平行实验，具有稳定的工艺流程，可极大提高实验效率，节约时间和人力成本；同时还可以进行数据交互，实现样本溯源和实验数据管理。今天小贝给大家整理了几种常见好用的蛋白纯化方案助力您的科学研究。磁珠捕获特异性标签蛋白，因其纯化步骤精简成熟被广泛应用，图1是磁珠纯化流程示意图。小贝为您量身定制蛋白纯化全流程自动化方案：使用Biomek i系列液体工作站，整合核酸/蛋白提取仪，实现高效高通量自动化蛋白纯化，极大节省实验时间和科研精力。图1 磁珠纯化流程图2 Biomek i系列液体处理工作站展示图Biomek i系列液体工作站配置96通道和灵活8通道加样器，适配各种商品化试剂盒和用户自配试剂，轻松实现试剂分装和高通量样本纯化。同时工作站支持多设备整合，可进行后期无限升级，添加离心机、酶标仪等设备助力全流程自动化实验。图3 磁珠纯化方法截图及纯化结果高通量磁珠法蛋白纯化模块可以通过结合核酸/蛋白提取仪实现极简快速蛋白纯化，也可以通过自动化液体工作站结合磁力架完成。使用该功能时仅需要通过软件的简易命令行即可完成，如图3所示，工作站机械抓手会根据纯化流程将Binding Buffer、Beads、Washing Buffer等试剂自动搬运到指定位置，使用磁套进行磁珠转运，单次可以完成96个样本纯化，浓度稳定在0.5-0.8mg/ml，96孔板纯化时间约60min，节省枪头成本，省时省力。图4 亲和层析柱蛋白纯化法实验流程RoboColumn是一种小型色谱柱，用于抗体、蛋白质、多肽等的全自动平行色谱分离，其纯化流程如图4所示。高通量的RoboColumn ALP 与Biomek i系列液体工作站相结合，配置Span8固定针，可实现多通道自动化的平行层析实验流程，显著缩短工艺开发时间；同时还可以进行数据追踪，实现样本溯源，减少重复工作。图5 RoboColumn ALP模块结构及Span8固定针示意图W1：废液槽；B1：收集板载架；C1：柱载架Biomek液体工作站可以实现台面整合RoboColumn ALP模块，通过软件流程式编辑方法，控制ALP板位自动位移，实现液体收集，轻松完成蛋白纯化，图6展示了软件控制ALP板位收集液体的方法以及RoboColumn纯化结果，实验中1.56mg蛋白上样，经0.1M Gly-HCl(pH2.7)洗脱回收得到蛋白含量1.31mg，纯化得率达到84%，8通道操作时间约为80min。图6 调用RoboColumn方法界面及纯化结果展示图7 PhyTip法自动化纯化关键流程PhyTip为枪头式分散固相亲和色谱柱，采用枪头式装置，纯化树脂被填充于枪头尖端，由自动化液体处理工作站加载PhyTip，可以实现单通道到96通道灵活样品数纯化，其纯化流程如图7所示，可对微克级到毫克级的蛋白进行纯化。图8 PhyTip实物图、PhyTip纯化方法及结果展示图Biomek液体工作站与枪头式纯化色谱柱相结合，利用工作站加载PhyTip让纯化流程变得如移液流程一样简单！如图8所示，加样器加载PhyTip，分别在平衡液、蛋白样品、洗杂液和洗脱液中混匀即可完成高通量蛋白纯化，单次可处理96个样品，收集10mL菌液使用PhyTip(40uL填料)，纯化后经BCA蛋白定量测定蛋白含量稳定在400ug左右，优于手工对照实验340ug的结果，96孔板操作时间约为90min。小 结

p 　　摘 要：随着抗体药物上游大规模高效培养技术的飞速发展，抗体蛋白的表达浓度有了大幅度的提高，这给下游纯化工艺带来了巨大的压力。为了突破下游技术瓶颈，整个世界生物制药产业都加大了对下游技术的革新力度，近年来也取得了丰硕的成果。本文就抗体药物的纯化策略、最新技术进展以及技术应用等方面做一个调研，以期能对本部门的相关研究工作有所助益。 /p p 　　关键词：抗体 下游工艺 纯化 技术进展 /p p 　　自1997年来，全球抗体药物市场经历了一个快速发展的阶段，总销售额从1997年的3.1亿美元增长到2008年的400亿美元，复合增长率高达55%，而且增长势头还在持续 [1]。国际上通常把年销售额超过10 亿美元的品牌药称为“重磅炸弹”药物，很大一部分抗体药物都已迈入“重磅炸弹”行列。在2008年全球15大药品中，抗体药物占据了1/3，且排名仍在上升，这意味着几乎每种单抗药物的成功开发都代表着巨大的市场前景[2]。受益于此，全球主要的生物制药公司都获利颇丰，可见抗体药物具有巨大的经济价值和社会价值。 /p p 　　抗体药物生产技术门槛高，需要掌握抗体筛选、抗体重组、高表达细胞株构建和大规模悬浮培养等核心技术，其下游关键技术是长期以来的薄弱之处。哺乳动物细胞表达系统具有活性高、稳定性好等优点，已成为抗体等生物制品最重要的系统之一，为抗体药物的产业化提供可能。目前，国际上该项技术发展较快，已趋成熟，以默克公司为代表的流加培养生产规模达10000L以上，以贝尔公司为代表的灌流培养生产规模达200L以上，蛋白表达浓度为1-10g/L。我国在该技术领域起步较晚，基础较差，但近年来经过努力，已经实现了该项技术的突破，流加培养规模达500L以上，灌流培养规模达100L以上，蛋白表达浓度为0.2-2g/L[2]。 /p p 　　随着动物细胞表达抗体产品大规模高效培养技术的快速发展，下游纯化工艺越来越成为抗体药物生产中主要的技术瓶颈[3]。因此，如何提高下游工艺的生产效率就成为了抗体药物研发必须解决的问题。本文就国际上高表达抗体蛋白下游工艺的研究进展做一个调研，使本人及同事们能了解国际上的研究成果和发展趋势，以期能对本部门的相关研究工作有所助益。 /p p 　　1. 抗体药物纯化策略 /p p 　　每个单抗的等电点、电荷密度、疏水性、糖基化程度等生化性质各不相同。选择单抗的纯化方法，既要了解它们的共性，又要了解它们的个性，从而制定相应的纯化策略(表1)。 /p p 　　1.1 抗体药物下游工艺一般策略 /p p 　　CHO和NSO等哺乳动物细胞表达系统主要用来生产治疗性单抗，临床剂量大(数十至几百毫克/dose)，批产量达公斤级，纯度要求极高。层析技术是抗体分离纯化的核心技术，一般采用经典的三步纯化策略：粗纯-中间纯化-精细纯化。粗纯的主要目的是捕获、浓缩和稳定样品，约80%的下游工艺用Protein A亲和层析进行快速捕获，一步即可达到95%以上的纯度。治疗用抗体一般使用动物细胞大规模高密度无血清悬浮培养进行生产，不仅对终产品的单体含量有严格的规定，还必须去除各种潜在的杂质以满足药品安全的要求，因此在粗纯之后还需要进行中间纯化和精细纯化，去除宿主细胞蛋白(HCP)、宿主DNA、抗体聚集体和变体等，常用的层析技术有离子交换、凝胶过滤、疏水层析等[4]。 /p p 　　2003 年初，中国SFDA下属的中国药品与生物制品检定所(NICPBP)公布了《人用单克隆抗体质量控制技术指导原则》[5]。生产者除须保证最终抗体产品纯度，还需要验证所用的纯化方法能有效对潜在的污染物，如HCP、免疫球蛋白、宿主DNA、用于生产腹水抗体的刺激物、内毒素、培养液成分、层析凝胶析出成分(脱落的Protein A配基)进行去除 并能有效的去除/灭活病毒。也就是说，在设计下游工艺时，需多角度综合考虑抗体本身的性质、抗体的来源、发酵培养技术、发酵液蛋白浓度、宿主杂质、抗体批间的差异、潜在污染及病毒灭活等问题。此外，治疗用抗体在生产和纯化过程中还会由于糖基化程度不同、蛋白酶作用、以及脱氨基和脱酰胺等反应而产生带电性质不同的多种抗体变体 另外，抗体氧化、聚集和片段化也是常见的降解途径[4]。针对这些变体，一方面，在表达和纯化过程中选择参数(如pH、盐浓度等)时要充分考虑到目标抗体的稳定性 另一方面，应控制细胞培养的条件(DO、渗透压等)，同时加快下游分离纯化的速度，最大程度上避免抗体在纯化过程中产生变体，从而保证终产品的均一性和高的比活，也有利于控制终产品的内毒素水平。 /p p style=" text-align: center " span style=" font-size: 14px " 　　表1 单抗特性及纯化策略 /span /p p style=" text-align: center " img title=" 11111.png" style=" float: none " src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201808/insimg/e2693d21-e711-4b42-bb9c-53b5b7848f82.jpg" / /p p style=" text-align: center " img title=" 2222.png" style=" float: none " src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201808/insimg/5035b8d3-81f1-4e6b-96d7-3e12b347a344.jpg" / /p p 　　1.2 新型的两步层析技术与纯化工艺整合 /p p 　　近年来，GE Healthcare公司开发出了新型的亲和捕获介质Mabselect SuRe和混合作用模式的强阴离子交换介质Capto adhere(这两种介质的主要特点将在下文详细介绍)。凭借着MabSelect SuRe的卓越性能以及Capto adhere的复合多除杂功能，使得抗体纯化工艺由经典的三步层析转变为两步层析得以实现。这种新型的两步层析技术的工艺流程是：在细胞培养表达以后，采用0.2-0.45μm的中空纤维膜技术进行澄清，然后用MabSelect SuRe捕获，酸性条件洗脱后直接pH 4.0 病毒灭活，澄清过滤后穿透方式上Capto adhere，这一步离子交换之前或之后会有一步20nm纳滤去病毒，最后50K膜超滤浓缩和洗滤进行缓冲液置换。整个工艺如图1,这一工艺平台已经尝试过多个不同的抗体并取得成功(表2),同时很多实验表明这一工艺平台适合多数抗体的生产。有些抗体如果通过优化结果不甚满意, 通过增加一步Capto Q也基本上可以达到要求或是采用Capto S-Capto Q(这两种介质的主要特点将在下文详细介绍)的工艺步骤[4]。 /p p style=" text-align: center " 　 img width=" 450" height=" 374" title=" 1.jpg" style=" width: 435px height: 258px " src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201808/insimg/401b7d6a-ad5b-4c9a-9eee-2376ebef51fa.jpg" / /p p style=" text-align: center " 　 span style=" font-size: 14px " 图1　抗体生产两步层析法主导的抗体纯化最新工艺[6] /span /p p 　　Mabselect SuRe可以达到99%以上的抗体纯度，亲和洗脱峰使用Capto adhere的流穿模式进行精纯：使抗体分子流穿而聚合体、HCP、脱落的Protein A配基等杂质结合在柱上加以去除。这样仅用两步层析就可以得到符合药用级质量要求的高纯度抗体产品，大大缩短了工艺时间，提高了生产效率，同时增加了收率，降低了生产成本。 /p p style=" text-align: center " img width=" 599" height=" 164" title=" 2.jpg" style=" width: 580px height: 159px " src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201808/insimg/ce7191a4-3940-4315-8122-856bbbadbc24.jpg" / /p p style=" text-align: center " 　　 span style=" font-size: 14px " 表2 两步法用于多种抗体的纯化结果(括号内数值为纯化前)[4] /span /p p 　　2. 抗体药物下游技术最新研究进展 /p p 　　2.1 样品澄清 /p p 　　2.1.1 中空纤维膜过滤技术 /p p 　　中空纤维膜是近年来发展起来的新型切向流膜分离技术,与盒式膜包相比,中空纤维膜可以直接处理高固含量和高黏度的粗料液,具有容尘量高、速度快、剪切力小、成本低等优点。目前,中空纤维微滤膜已经广泛用于生物制药的各个领域[7]。 /p p 　　对于动物细胞培养液,可以将高密度的培养液直接用中空纤维微滤膜(0.22或0.45μm)进行澄清,而无需事先经过离心和预过滤,步骤少,速度快,收率高,成本低。和离心机比较,具有极高的澄清度,因此中空纤维澄清后的细胞培养液可直接Protein A亲和层析进行纯化。 /p p 　　中空纤维膜澄清细胞培养液的优势有：(1)步骤少,速度快,收率更高(通过有效的洗滤可使样品收率稳定而且高于离心机)，同时最大程度上避免抗体降解而影响产品均一性。(2)成本低：不仅省去了连续流高速离心机昂贵的前期投资和运转的日常维护成本，还节省了离心后死端过滤的成本。中空纤维膜物理化学性质稳定，可以通过清洗而反复使用，成本低廉。(3)有利于内毒素控制：中空纤维膜稳定的化学性质可以耐受1M NaOH 40-50℃和氧化剂NaClO的清洗，从而有效去除内毒素 封闭的系统，也更有利于生产过程中内毒素的控制。此外，大部分中空纤维滤柱还可以进行高压灭菌。(4)低剪切力：中空纤维采用低剪切力的开放式流道，不仅可以处理含有高固含量的料液，还避免了蛋白质活性分子在高剪切力下的聚集变性，有利于抗体的稳定。(5)工艺耐用性强：相比死端过滤，中空纤维澄清具有很好的操作灵活性和耐用性，可以通过调整操作参数(流速、TMP)处理不同性质的细胞培养液。(6)易于线性放大：通过维持切向流速、TMP 等参数恒定，方便地进行线性放大，生产规模的处理量可达几千升料液，目前国内销售最大的中空纤维膜过滤系统已达400m2且生产稳定[8]。 /p p 　　2.1.2 深层过滤介质 /p p 　　深层过滤采用两种机制去除颗粒。首先是拦截，颗粒由于自身的物理尺寸在过滤器内被截留。它们可能被困在过滤器表面，因此根本没有进入基质，或在通过深层过滤基质的曲径时被俘获(筛选)。颗粒拦截伴随过滤器压差增高，因为它的基质被不断累积的颗粒堵塞。第二种机制是吸附，比过滤器拦截精度更小的颗粒能够从流体中被吸附去除。这种机制是通过深层过滤基质上的净电荷实现的[26]。 /p p 　　目前应用比较广泛的双层膜深层过滤介质有Millipore公司的Millistak+HC、Sartorius公司的Sartobran-P、Pall公司的Supradisc HP等。Millistak+HC深层过滤介质由纤维素和无机助滤剂(聚丙稀粘合的硅藻土)组成，包裹在聚丙烯外壳内 它由两层全厚度深层滤板(上游一层粗过滤和下游一层精细过滤)组成，附带一层RW01纤维素膜终过滤。Sartobran-P深层过滤介质由醋酸纤维素滤膜、聚丙烯外壳和支撑层组成，加强型的滤膜有良好的机械强度，有利于在反复的过滤和灭菌过程中保持完好无损 采用了折叠膜，在体积小巧的同时还保证了超大的过滤面积。Supradisc HP深层过滤介质由纤维素、硅藻土、带正电荷树脂和聚丙烯组成 也由两层全厚度深层滤板(上游一层粗过滤和下游一层精细过滤)组成。 /p p 　　2.2最新抗体捕获技术 /p p 　　2.2.1 MabSelect介质 /p p 　　MabSelect是第一个使用高流速琼脂糖凝胶作为骨架的新型Protein A层析介质，专为大规模抗体纯化而设计，适合快速高效的进行抗体生产和放大，已经成为单抗纯化和放大的标准介质。 /p p 　　MabSelect的特点有：(1)更高的流速和动态载量：Protein A经基因工程改造，C端含一个半胱氨酸，形成一个定向的硫酯键，同时增加了对IgG的有效结合。Protein A和凝胶偶联时采用了全新的单点偶联工艺，降低了空间位阻，因此可以在使用更高流速的条件下增加动态载量：在线形流速为500cm/hr和柱床高度为20cm(停留时间2.4min)的条件下，每毫升MabSelect的动态载量可以达到& gt 30mg IgG。(2)更低的非特异性吸附，抗体纯度更高：Mabselect介质高度亲水性的琼脂糖骨架最大程度上降低了非特异性吸附，使得洗脱峰中杂蛋白和DNA更少，有利于后期抗体的精细纯化。著名的抗体生产商IDEC公司以及R.Hahn的研究显示，Mabselect对CHO细胞HCP的吸附比其它Protein A介质低7倍[9-10]。R.L.Fahrner等的研究显示，Mabselect所得抗体的DNA残留量比其它Protein A介质低30%[11]。(3)更低的Protein A脱落：MabSelect由于通过新型环氧共价交联技术，Protein A的脱落比其它同类介质低，这不仅有利于抗体纯化，还延长了介质的使用寿命，降低了生产成本。(4)更易于工艺的线性放大：通过实验室条件的优化，MabSelect 可以在保持线性流速和上样比例等参数不变的条件下，通过增加柱直径进行线性放大。(5)MabSelect 易于清洗与除菌，寿命更长、更经济：在长期连续的生产中，有效的在位清洗(CIP)有助于延长介质使用寿命，但一般的Protein A介质往往不能耐受NaOH，只能使用高浓度的尿素或盐酸胍进行清洗，效果远不如NaOH且成本非常高。而MabSelect的CIP和除菌程序简单，用很常规、经济的试剂如50mM NaOH+1M NaCl或50mM NaOH+0.5M Na2SO4就可以有效去除沉淀和变性物质 用非离子去污剂或酒精可以去除通过疏水作用结合的物质 用0.1M醋酸和20%酒精可以在位灭菌(SIP)。经测试，Mabselect配合CIP(50mMNaOH+1M NaCl)纯化三百次后，抗体产品纯度与收率不变[12]。 /p p 　　2.2.2 MabSelect Xtra介质 /p p 　　Mabselect Xtra介质是在Mabselect介质的基础上优化而来，是目前市场上所有的商品化Protein A介质中载量最高的亲和层析介质之一。它除了具有MabSelect介质的全部特点外，还具有载量最高和非特异性吸附更低的特点。 /p p 　　Mabselect Xtra介质使用孔径更大的多孔高流速琼脂糖作为骨架，同时减小介质粒径。这样不仅增加了比表面积和配基密度，还降低了传质阻力，从而有效的增加了动态载量。其动态载量超过41mg/ml，在工艺生产过程中可以有效减少层析柱的体积，从而降低生产成本。R.Hahn的研究显示，Mabselect Xtra对CHO细胞HCP的吸附比其它Protein A介质更是低了近10倍[13]。 /p p 　　2.2.3 MabSelect SuRe介质 /p p 　　MabSelect SuRe介质也是在Mabselect介质的基础上优化而来，是目前市场上唯一耐强碱的Protein A亲和层析介质，寿命最长，稳定性最好[10]。它除了具有MabSelect介质的全部特点外，还具有以下特点：(1)可以耐受0.1-0.5M NaOH：MabSelectSuRe具有不同于其它Protein A介质的同型四聚体配基-SuRe配基，即使在强碱条件下也不易变性或脱落，可以用高达0.5M NaOH进行CIP和SIP，能有效去除沉淀和变性物质，大大降低了抗体产品被内毒素污染和批间交叉污染的风险，有利于延长介质使用寿命，同时还大大降低了CIP和SIP的成本。(2)更温和的洗脱，避免抗体聚集，提高收率：同型四聚体配基避免了不同配基与抗体Fc段亲和性的差异，也消除了某些域对Fab段的亲和作用，使得洗脱条件更加均一而温和。Mabselect SuRe介质可以用更高的pH进行洗脱，有效避免了抗体在低pH下的聚集，产品纯度和均一性更高，浊度也更低[14]。(3)不同抗体洗脱所需pH差异小：由于消除了对抗体Fab段的亲和作用，使得同一种属亚型的不同抗体分子洗脱所需的条件更接近，有利于平台技术的建立，进一步降低了不同的抗体分离纯化工艺的研发成本。(4)SuRe 配基稳定性更好：SuRe配基对碱和蛋白酶更稳定，纯化过程中脱落更少(& lt 10ppm)，有利于后期脱落配基的进一步去除。 /p p 　　2.2.4 ProSep-vA Ultra介质 /p p 　　ProSep-vA Ultra介质是将自然界非动物性来源的Protein A交联于700Å 的多孔性玻璃珠骨架上，是刚性和不可压缩的介质。ProSep-vA Ultra介质具有如下特点：低反压性 不收缩、不溶胀 高动态载量 极低的Protein A脱落 高重复使用性，标准化的清洗和除菌操作[27]。 /p p 　　2.2.5 ProSep Ultra Plus介质 /p p 　　ProSep Ultra Plus介质是在ProSep-vA Ultra介质基础上优化而来，也是目前市场上所有的商品化Protein A介质中载量最高的亲和层析介质之一。它除了具有ProSep-vA Ultra介质的全部特点外，还具有载量最高、纯化效率更高、工艺更易于放大、成本更低等特点[28]。 /p p 　　2.2.6 MEP Hypercel介质 /p p 　　MEP Hypercel复合作用模式介质是一种灵活的层析介质设计，也称之为疏水电荷诱导层析(HCIC)，用于捕获和纯化从实验室到生产规模的抗体和各种重组蛋白。MEP Hypercel介质由一个独特的连接4-巯基乙基吡啶(4-MEP)的刚性纤维素骨架组成。纤维素骨架赋予高孔隙率、化学稳定性和低非特异性吸附。平均直径80-100μm，在低反压下有优良的流速特性。MEP Hypercel介质在大规模使用时具有显著优势，基于它的配基结构，可选择性地捕获免疫球蛋白。组合其它传统的方法如离子交换、疏水作用，甚至用在Protein A之后从不同的料液中直接捕获或中度纯化抗体，以增强对宿主DNA、HCP和聚合体的清除。MEP Hypercel介质有助于建立一个简化的工艺流程，节省操作步骤(例如洗滤、超滤等) 预计有更长的使用寿命，因为它可以耐受苛刻的CIP方法(0.5-1M NaOH，30-60分钟接触时间)，而所有因素都有利于降低成本[29]。 /p p 　　2.3最新精细纯化技术 /p p 　　2.3.1 CaptoFamily系列介质 /p p 　　新型的Capto S，Q系列介质是以高流速琼脂糖为骨架，同时交联了非常“柔软”的葡聚糖链，这样不仅增加了比表面积，同时降低了传质阻力和空间位阻，使得介质在高流速下的动态载量大大增加，有利于提高生产效率，降低成本。 /p p 　　Capto S，Q系列介质可以装填在直径60cm的工业层析柱中使用高达500cm/h 的流速进行纯化(柱高30cm)。这样不仅有利于工艺放大后大规模层析柱的填装，还大大提高了生产效率，每步层析更短的操作时间也有效避免了抗体分子在分离纯化过程中产生各种变体和聚合体，使得收率更好，终产品的活性更高、性质更均一。 /p p 　　2.3.2 Captoadhere介质 /p p 　　为了进一步减少抗体分离纯化步骤，提高特定杂质的去除效率，以满足日益增长的治疗用抗体的生产需要，2007 年初，GE Healthcare公司推出了新型复合作用模式的强阴离子交换介质：Capto adhere介质。Capto adher介质专为治疗用抗体的分离纯化而设计，其配基综合了阴离子交换、氢键和疏水等多种复杂的作用方式，因此对于抗体的聚合体具有非常独特而高效的去除能力。此外，通过有效的实验设计(DoE)，流穿模式的Capto adher介质还可以同时有效去除脱落的Protein A配基、HCP、宿主DNA、内毒素和潜在的病毒，并使得结合MabSelect SuRe的抗体两步层析纯化工艺成为现实(表3)。Capto adhere还具有很强的病毒去除能力，如MVM病毒的去除能力可达5.9个Log。目前，新型的两步法抗体层析纯化工艺已经被国内外诸多知名药企广泛用于多种抗体的分离纯化，各项指标均符合治疗用抗体的要求。Capto adher层析还可以和阴离子交换(Capto Q)和疏水层析等结合使用，以达到更高的质量要求[15]。 /p p style=" text-align: center " 　　 img title=" 3.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201808/insimg/4aa1c980-c9be-44e9-82b5-899ba9f7eec9.jpg" / /p p style=" text-align: center " span style=" font-size: 14px " 表3 两步层析纯化工艺对污染物的去除效果[15] /span /p p 　　2.3.3膜层析技术 /p p 　　PALL Life Science公司自10余年前颠覆性地开发出独一无二的层析产品-Mustang膜层析系列产品后，经过不断地技术改造，于近年推出全新Mustang Q XT家族，扩展了膜层析工艺放大产品线。膜层析技术，相对于传统的柱层析，无需层析填料和层析柱等复杂构件，直接通过膜式过滤器，经过简单的过滤环节即可达到纯化目的。Mustang Q以16层超级打褶的聚醚砜过滤膜作为基架，上面偶联了季胺基等功能基团，可以使生物分子流经的时候与功能位点迅速结合，具有高流速和高动态载量等优点。 /p p 　　Sartorius Stedim公司也开发出了一整套膜层析技术，包括Sartobind S,Q,C和D离子交换、Sartobind IDA(亚氨基二乙酸)金属螯合、Sartobind醛、Sartobind环氧基和Sartobind Protein A(重组)等膜层析系列产品。Sartobind在很多蛋白和病毒纯化应用中可以取代传统耗时、繁琐的层析步骤。膜吸附器的快速纯化特点使蛋白分离可以在高流速下获得高收率，较传统柱层析流速最高能提高100倍，达到20-40 CV/min。传统颗粒胶95%以上的结合位点集中在颗粒胶内部。Sartobind膜层析的结合位点是均一地交联到交叉偶联的增强纤维素骨架内0.5-1μm厚的薄层上。大孔结构和快速吸附结合特性使膜吸附器可以忽略扩散时间因素。同时多微孔膜结构不存在传统颗粒胶的孔内扩散问题。在对流情况下，流动相的分子运动只由泵压力决定。因此，膜吸附器具有操作周期极短、流速和处理能力极高的特点[30]。 /p p 　　与离子交换柱层析相比，离子交换膜层析技术已经被证明利用高动态结合能力吸附大量的生物分子，如病毒、HCP和宿主DNA。最近，阴离子交换膜层析技术已经被作为柱层析技术的替代技术用于Protein A亲和捕获后的mAb中微量污染物的去除[16]。 /p p 　　2.4终产品的浓缩洗滤 /p p 　　多维纯化得到的洗脱峰可以用Kvick Lab/Process盒式膜包进行快速浓缩和缓冲液置换。Kvick盒式膜包的优点有：(1)无热原：很多时候，仅用0.5M NaOH 清洗难以彻底去除膜表面的热原。Kvick盒式膜包化学性质非常稳定，可以使用1M NaOH在40-50℃下进行彻底的SIP/CIP，避免最终超滤浓缩时引入热原而影响产品质量。(2)孔径均一、速度快：Kvick盒式膜包孔径更均一，甚至可以使用50-100K的膜包进行抗体浓缩而不漏过，速度更快，大大节省了操作时间。(3)易于线性放大：通过保持流速、TMP等参数恒定，可以直接线性放大到生产规模。 /p p 　　Amicon Ultra系列超滤离心管可以用来进行抗体的快速浓缩、脱盐及缓冲液置换。它具有如下特点：(1)效率高：一步法离心达到25到80倍浓缩。(2)节省时间：垂直结构的膜，避免堵膜，减少浓差极化，可以用超快离心速度极短时间完成 最少10分钟即可完成浓缩、脱盐或缓冲液置换。(3)收率高：独特的反转离心设计，有利于取得最大回收率且避免了人为移液误差 低吸附滤膜和聚丙烯内壳，使回收率高达90%以上。(4)不漏液、无损失：100%完整性测试确保不漏液 独特的死体积设计避免过度离心至干，没有样品损失。(5)广泛的化学相容性：与广泛的溶剂兼容，适用于pH1-pH9，热封膜杜绝了粘合剂和下游溶出物污染。 /p p 　　Vivaspin系列超滤离心管同样是进行蛋白质快速浓缩和缓冲液置换的常用产品。获得专利的垂直膜配合狭长的流道设计，有效地避免滤膜堵塞，提高浓缩速度 同时在浓缩管底部设计有死端结构，确保即使离心时间过长也不会发生样品被甩干的现象。Vivaspin可灵活选用三种不同材质的超滤膜：聚醚砜、三醋酸纤维和Hydrosart。它的另一个特点是有两种回收浓缩液的方法，既可以直接用移液器从浓缩管底部吸取，也可以将浓缩液反转离心到回收管内，加盖密封保存，这两种方法都保证了高回收率。Vivaspin经过一次离心，最高可以将蛋白溶液浓缩300倍。 /p p 　　2.5终产品的除菌除病毒过滤 /p p 　　浓缩后的样品，最终经过0.22μm无菌滤器进行除菌过滤。ULTA Pure SG，HC除菌滤器具有过滤速度快、化学稳定性好、载量高和溶出物少等优点，细菌挑战实验表明其除菌能力大于7log。除菌过滤过程的优化主要从三个方面入手：操作过程中过膜压力的控制、过膜流速以及单位膜载量控制，这三个参数优化以后，可以在同种类型、材质的NFF膜上进行线性放大，否则很容易影响收率。 /p p 　　Durapore除菌级亲水性滤膜由亲水性PVDF材料制造，具有可靠的除菌保证以及低蛋白吸附量、低析出、无纤维脱落、广泛的化学兼容性等优点，是常用的除菌滤膜。Durapore 0.22μm亲水性滤膜用于液体除菌或去除微粒，0.1μm亲水性滤膜用于液体中去除微粒、微生物和支原体。装有Durapore亲水性滤膜的滤器有Millipak、Opticap XL、Opticap XLT、筒式滤器和Optiscale等。Millipak滤器独特的堆叠盘状设计使残留量最小并且无颗粒脱落，因此适合于高附加值产品的终端过滤和灌装。Millipak和Opticap XL滤器都有O型圈垫片和软管倒钩连接的上游排气阀和排空阀设计，使操作简单易控。Opticap XL和XLT滤器的结构设计，特别耐高温、高压条件，在除菌过程中提供更高的稳定性和可靠性，同时更易清洗。Optiscale一次性滤器专为小规模工艺筛选和工艺放大所设计，是工艺评估的理想工具。 /p p 　　目前被广泛应用的生物制品病毒去除的方法是纳米膜过滤。纳米膜过滤有如下优点：(1)针对性强，实用性广：纳米膜过滤只与病毒和目的蛋白的大小有关，无论病毒是否有脂包膜外壳、是否耐热，纳米膜过滤都能将之去除。(2)毒性小，下游污染少：能有效去除杀灭病毒后可能留下的如抗原和核酸蛋白混合物等病毒标志物，有效降低下游污染，是纳米膜的另一特点。大多数病毒灭活处理都使用有毒或致突变的理化试剂，从而必须在使用后从蛋白质溶液中清除，而纳米膜过滤不存在毒性问题，只是在验证中要考虑到滤器浸出物的风险。(3)蛋白活性高，回收率高：纳米膜过滤是在正常条件下的pH、渗透压和温度下进行的温和的生产步骤，其蛋白回收率和活性都很高，通常在90%—95%。基于体外分析、实验研究和临床经验，纳米膜过滤试验都没有显示出蛋白质改变或是新抗原的产生。纳米膜过滤不改变制品特性，这一特点促进了监管机构认可和产品的注册。 /p p 　　日本Asahi Kasei公司于1989年推出了第一款专门为清除生物制药产品中病毒颗粒而设计的过滤器Planova，由亲水铜铵再生纤维素制成的中空纤维微孔膜，装入聚碳酸酯壳体中。Millipore公司的Viresolve NFP膜是一种复合PVDF膜，过滤盒被设计来从高纯蛋白溶液中移除小型病毒，如B19，蛋白质溶液中，B19的去除量通常& gt 4 log。PALL Life Science公司的Ultipor VF DV50和DV20膜式过滤器可以从生物流体中去除显著数量级的病毒，同时目标蛋白可以很好地通过。滤芯由三层独特的亲水、低蛋白吸附的PVDF滤膜经新月型打褶方式构成，过滤面积大，具有可靠、安全和高流量等特点。Sartorius Stedim生产的Virosart CPV为聚醚砜过滤器，能去除& gt 4 log的PPV和& gt 6 log的逆转录病毒。 /p p 　　2.5扩张柱床吸附层析技术 /p p 　　扩张柱床吸附层析技术(EBA)是上世纪九十年代初期进入下游生产，整合了发酵和下游纯化的技术。新一代STREAMLINE Direct扩张柱床设备及介质是EBA技术中最成熟的产品。通过条件优化，STREAMLINE能直接从浑浊的发酵液中捕获目标生物分子，细胞碎片及不吸附的杂质穿过扩张床内悬浮的介质被冲洗掉，将以往澄清、浓缩、捕获等步骤整合为一步，达到粗纯化的效果(图2)[17]。 /p p 　　STREAMLINE的操作过程如下[17-18]：(1)起始：将STREAMLINE介质倒入扩张柱中。(2)平衡：从下向上流的缓冲液，将STREAMLINE柱内的吸附介质悬浮起来，形成稳定的、充分平衡好的扩张床。(3)上样：发酵液带菌体从柱底进入，目标生物产品吸附在STREAMLINE介质上 不吸附的宿主杂质及菌体碎片随液流从柱顶排出。(4)淋洗/穿透：进一步用缓冲液将不吸附的杂质洗掉。(5)洗脱：洗脱液洗脱目标生物产品。(6)CIP/再生：用1M NaOH+1M NaCl进行CIP。整个操作过程如图3所示。 /p p style=" text-align: center " img title=" 4.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201808/insimg/07a79270-4b7d-4fe5-bc9a-125837562297.jpg" / /p p style=" text-align: center " 　 span style=" font-size: 14px " 　图2　传统纯化工艺与STREAMLINE [17] /span /p p style=" text-align: center " img title=" 5.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201808/insimg/333de887-f92b-405d-9094-9ec89635f74d.jpg" / /p p style=" text-align: center " span style=" font-size: 14px " 　　图3 STREAMLINE的基本工作原理和操作过程[18] /span /p p style=" text-align: center " 　 span style=" font-size: 14px " 　(箭头示液体过柱时的流向) /span /p p 　　STREAMLINE介质是一系列包裹着石英芯，以琼脂糖为骨架的介质。特殊设计的STREAMLINE扩张柱床可以产生稳定的向上拔的扩张液流，每一颗不同比重的STREAMLINE介质，悬浮在自身重力和扩张升力平衡的位置原地扰动。STREAMLINE 技术是稳态扩张，样品流均匀分布整个床体，目标产物吸附均匀，穿透小，回收率高，类似于固定床吸附性层析[19]。 /p p 　　3. 抗体最新下游技术应用实例 /p p 　　Lonza Biologics公司是全球最大的抗体合同生产商之一，为了开发一个稳定的20000L的抗体生产工艺，其纯化开发部门对多个不同的抗体亲和层析凝胶进行了有效的比较，他们发现Mabselect SuRe的动态载量高、使用寿命最长、Protein A脱落最低，实验数据明确支持放大到1.4m直径的柱子用于20000L培养规模的经济生产[4]。 /p p 　　德国的Roche公司一种用于肿瘤治疗的单抗已进入临床Ⅲ期。他们将目前几种Protein A介质进行充分的比较之后，选择了高载量、更易于装柱和寿命更长的Mabselect。目的抗体是通过无血清培养的转染的杂交B淋巴细胞表达的IgG1。将过滤后的无细胞上清上样到Mabselect填充的FineLINE柱，直径300cm，柱高20cm，上样的浓度是30mg/ml。洗脱后，洗脱液立即用磷酸钾中和pH值到6.8-7.0，再用凝胶过滤检测，结果表明比活超过90%，纯度在95%以上[20]。 /p p 　　Cytheris公司是法国一家生物制药公司，目前正在研制一种用CHO细胞表达的免疫调节剂(临床Ⅱ期)。原先的工艺采用传统层析法，但不能稳定去除病毒。改进后，在工艺的第一步使用Mustang Q对污染物进行捕获，取得了25%去除率的良好结果 同时对MVM、MLV和Re03三种病毒也达到超过4个Log的滴度降效果，而整个工艺对病毒的去除效率普遍提高了7-11个Log。说明Mustang Q的使用对下游层析起到了很好的保护作用。 /p p 　　在第五届生物制药工艺优化大会上，Crucell公司介绍了他们对腺病毒(AAV)纯化工艺的摸索。与传统的层析填料相比，Mustang Q膜层析的开放孔道的设计使对病毒的动态载量大大提高30倍左右，回收率在80%以上。用40L的膜层析柱相当于1000L的传统层析柱的效果，节省了验证工作，提高了工艺经济性，十分有利于放大生产。 /p p 　　德国的Boehringer Mannheim公司生物制药部，用STREAMLINE技术代替传统工艺生产400L CHO细胞培养的Fc融合蛋白，结果样品回收率提高14%，缓冲液减少25%，时间缩短47%[17]。 /p p 　　世界最大的制药公司-GlaxoSmithKline公司，使用特别设计的BioProcess全自动层析系统和STREAMLINE扩张柱生产药用脂蛋白疫苗，比原工艺产品体积缩小2倍，纯化系数1.5，内毒素减少100倍[17]。 /p p 　　日本YOSHITOMI公司正在使用多套STREAMLINE 1000系统生产人重组白蛋白，与原生产工艺产品纯度相同，产率提高30%，时间减少一半，年产量为12.5吨[17]。 /p p 　　AVECIA公司重新设计临床Ⅲ期药品生产工艺，选用STREAMLINE技术及SOURCE新型凝胶，生产效率提高12倍，回收率提高1倍[17]。 /p p 　　2001年，ILEX制药公司的CAMPATH获得FDA批准。该单克隆抗体使用Sartobind Q离子交换层析模块以流穿的方式进行精制，这是膜吸附器首次被批准应用于治疗性蛋白的生产，证明了膜层析技术通过了证实和测试[30]。 /p p 　　4. 展望 /p p 　　随着抗体产品上游大规模高效培养技术的进一步发展,实验室规模哺乳动物细胞表达水平可以达到25g/L，如果这一水平能够有效放大到生产,将对下游生产纯化带来更大的压力。所以下游纯化工艺的技术发展也是势在必行。 /p p 　　以下一些发展方向可能成为下游工艺未来发展的重要关注点：(1)刚性更好、载量更高、耐碱性更好的完全亲水琼脂糖凝胶的开发[4]。(2)优化操作次序，降低缓冲液消耗的更大规模生产线的应用[21]。(3)通过单抗的氨基酸序列预测下游工艺关键参数：亲和层析洗脱pH条件、离子交换层析洗脱pH和盐浓度条件、病毒灭活pH等[22]。(4)下游工艺的成本消耗占全部成本的50-80%，亲和捕获是下游工艺的最关键步骤，通过改进亲和配体，提高捕获能力，节省成本[23]。(5)新型层析系统全程实时控制纯化过程，在线检测HCP、宿主DNA、Protein A等的含量[24]。(6)由于在去除杂质方面的优势，膜层析将会得到飞速的发展，未来工艺甚至可能完全基于膜层析而不是柱层析[25]。 /p p 　　参考文献 /p p 　　[1] 刘亚明,薛章.生物制药：迎接抗体药物的黄金时代.医药细分子行业研究报告,2009. /p p 　　[2] 陈志南.基于抗体药物的我国生物制药产业化发展前景.2008中国药学会学术年会暨第八届中国药师周论文集,2008. /p p 　　[3]Gail Dutton.Trends in Monoclonal AntibodyProduction.Feature Articles,2010, 30(4). /p p 　　[4]孙文改,苗景赟.抗体生产纯化技术.中国生物工程杂志,2008,28(10):141-152. /p p 　　[5]《人用单克隆抗体质量控制技术指导原则》.NICPBP(中国药品与生物制品检定所),2003. /p p 　　[6]Capto adhere：用于生产单抗的两步纯化操作.GE Healthcare公司技术资料. /p p 　　[7]中空纤维滤柱分离纯化应用集锦.GE Healthcare公司技术资料. /p p 　　[8]中空纤维膜过滤技术在单抗生产中的应用.GE Healthcare公司技术资料. /p p 　　[9]Amersham Biosciences.Downstream Gab’02 Abstracts,Extended Reports from the 2nd International Symposium on DownstreamProcessing of Genetically Engineered 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PALL LifeScience公司技术资料. /p p 　　[17]整合发酵和下游纯化的新技术：扩张柱床吸附技术.GE Healthcare公司技术资料. /p p 　　[18]余晓玲,米力，姚西英，陈志南.扩张柱床吸附层析与固定柱床层析纯化单克隆抗体的比较.中国生物工程杂志,2003,23(1):61-64. /p p 　　[19]High-throughput monoclonal antibody purification.GE Healthcare公司技术资料. /p p 　　[20]抗体纯化手册.GE Healthcare公司技术资料. /p p 　　[21]Purification Strategies to Process 5 g/L Titers ofMonoclonal Antibodies. BioPharm International技术资料. /p p 　　[22] T.Ishihara,T.Kadoya.Accelerated purification process development ofmonoclonal antibodies for shortening time to clinic:Designand case study of chromatography processes.J Chromatogr A,2007，1176(1-2)：149-156. /p p 　　[23] A.Cecilia,A.Roque,et al.Antibodies and Genetically Engineered RelatedMolecules:Production and Purification.BiotechnolProg,2004，20：639-654. /p p 　　[24] S.Flatman,I.Alam,et al.Process analytics for purification of monoclonal antibodies.JChromatogr B,2007，848：79-87. /p p 　　[25]ProcessChromatography:Five Decades of Innovation.BioPharmInternational技术资料. /p p 　　[26]双层滤板膜堆在单抗工艺上的大规模澄清过滤应用评估.BioProcessInternational技术资料. /p p 　　[27]Affinity Chromatography Media.Millipore公司技术资料. /p p 　　[28]ProSep Ultra Plus ChromatographyMedia.Millipore公司技术资料. /p p 　　[29]MEP Hypercel混合模式层析填料. PALL LifeScience公司技术资料. /p p 　　[30]Sartobind膜层析技术高效的蛋白纯化工具. SartoriusStedim公司技术资料. /p p /p

p 　　随着抗体药物上游大规模高效培养技术的飞速发展，抗体蛋白的表达浓度有了大幅度的提高，这给下游纯化工艺带来了巨大的压力。为了突破下游技术瓶颈，整个世界生物制药产业都加大了对下游技术的革新力度，近年来也取得了丰硕的成果。本文就抗体药物的纯化策略、最新技术进展以及技术应用等方面做一个调研，以期能对本部门的相关研究工作有所助益。 br/ /p p 　　自1997年来，全球抗体药物市场经历了一个快速发展的阶段，总销售额从1997年的3.1亿美元增长到2008年的400亿美元，复合增长率高达55%，而且增长势头还在持续 [1]。国际上通常把年销售额超过10 亿美元的品牌药称为“重磅炸弹”药物，很大一部分抗体药物都已迈入“重磅炸弹”行列。在2008年全球15大药品中，抗体药物占据了1/3，且排名仍在上升，这意味着几乎每种单抗药物的成功开发都代表着巨大的市场前景[2]。受益于此，全球主要的生物制药公司都获利颇丰，可见抗体药物具有巨大的经济价值和社会价值。 br/ /p p 　　抗体药物生产技术门槛高，需要掌握抗体筛选、抗体重组、高表达细胞株构建和大规模悬浮培养等核心技术，其下游关键技术是长期以来的薄弱之处。哺乳动物细胞表达系统具有活性高、稳定性好等优点，已成为抗体等生物制品最重要的系统之一，为抗体药物的产业化提供可能。目前，国际上该项技术发展较快，已趋成熟，以默克公司为代表的流加培养生产规模达10000L以上，以贝尔公司为代表的灌流培养生产规模达200L以上，蛋白表达浓度为1-10g/L。我国在该技术领域起步较晚，基础较差，但近年来经过努力，已经实现了该项技术的突破，流加培养规模达500L以上，灌流培养规模达100L以上，蛋白表达浓度为0.2-2g/L[2]。 /p p 　　随着动物细胞表达抗体产品大规模高效培养技术的快速发展，下游纯化工艺越来越成为抗体药物生产中主要的技术瓶颈[3]。因此，如何提高下游工艺的生产效率就成为了抗体药物研发必须解决的问题。本文就国际上高表达抗体蛋白下游工艺的研究进展做一个调研，使本人及同事们能了解国际上的研究成果和发展趋势，以期能对本部门的相关研究工作有所助益。 /p p 　　1. 抗体药物纯化策略 /p p 　　每个单抗的等电点、电荷密度、疏水性、糖基化程度等生化性质各不相同。选择单抗的纯化方法，既要了解它们的共性，又要了解它们的个性，从而制定相应的纯化策略(表1)。 /p p 　　1.1 抗体药物下游工艺一般策略 /p p 　　CHO和NSO等哺乳动物细胞表达系统主要用来生产治疗性单抗，临床剂量大(数十至几百毫克/dose)，批产量达公斤级，纯度要求极高。层析技术是抗体分离纯化的核心技术，一般采用经典的三步纯化策略：粗纯-中间纯化-精细纯化。粗纯的主要目的是捕获、浓缩和稳定样品，约80%的下游工艺用Protein A亲和层析进行快速捕获，一步即可达到95%以上的纯度。治疗用抗体一般使用动物细胞大规模高密度无血清悬浮培养进行生产，不仅对终产品的单体含量有严格的规定，还必须去除各种潜在的杂质以满足药品安全的要求，因此在粗纯之后还需要进行中间纯化和精细纯化，去除宿主细胞蛋白(HCP)、宿主DNA、抗体聚集体和变体等，常用的层析技术有离子交换、凝胶过滤、疏水层析等[4]。 /p p 　　2003 年初，中国SFDA下属的中国药品与生物制品检定所(NICPBP)公布了《人用单克隆抗体质量控制技术指导原则》[5]。生产者除须保证最终抗体产品纯度，还需要验证所用的纯化方法能有效对潜在的污染物，如HCP、免疫球蛋白、宿主DNA、用于生产腹水抗体的刺激物、内毒素、培养液成分、层析凝胶析出成分(脱落的Protein A配基)进行去除 并能有效的去除/灭活病毒。也就是说，在设计下游工艺时，需多角度综合考虑抗体本身的性质、抗体的来源、发酵培养技术、发酵液蛋白浓度、宿主杂质、抗体批间的差异、潜在污染及病毒灭活等问题。此外，治疗用抗体在生产和纯化过程中还会由于糖基化程度不同、蛋白酶作用、以及脱氨基和脱酰胺等反应而产生带电性质不同的多种抗体变体 另外，抗体氧化、聚集和片段化也是常见的降解途径[4]。针对这些变体，一方面，在表达和纯化过程中选择参数(如pH、盐浓度等)时要充分考虑到目标抗体的稳定性 另一方面，应控制细胞培养的条件(DO、渗透压等)，同时加快下游分离纯化的速度，最大程度上避免抗体在纯化过程中产生变体，从而保证终产品的均一性和高的比活，也有利于控制终产品的内毒素水平。 /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201810/uepic/1eb75a7d-0f0f-4f60-8224-a3984ccff0e3.jpg" title=" 表1.png" alt=" 表1.png" / /p p style=" text-align: center " img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201810/uepic/f8ff0f67-6f0b-4295-ab81-05543e5efbd8.jpg" title=" 表2.png" alt=" 表2.png" / br/ strong 表1 单抗特性及纯化策略 /strong /p p 　　1.2 新型的两步层析技术与纯化工艺整合 /p p 　　近年来，GE Healthcare公司开发出了新型的亲和捕获介质Mabselect SuRe和混合作用模式的强阴离子交换介质Capto adhere(这两种介质的主要特点将在下文详细介绍)。凭借着MabSelect SuRe的卓越性能以及Capto adhere的复合多除杂功能，使得抗体纯化工艺由经典的三步层析转变为两步层析得以实现。这种新型的两步层析技术的工艺流程是：在细胞培养表达以后，采用0.2-0.45μm的中空纤维膜技术进行澄清，然后用MabSelect SuRe捕获，酸性条件洗脱后直接pH 4.0病毒灭活，澄清过滤后穿透方式上Capto adhere，这一步离子交换之前或之后会有一步20nm纳滤去病毒，最后50K膜超滤浓缩和洗滤进行缓冲液置换。整个工艺如图1,这一工艺平台已经尝试过多个不同的抗体并取得成功(表2),同时很多实验表明这一工艺平台适合多数抗体的生产。有些抗体如果通过优化结果不甚满意, 通过增加一步Capto Q也基本上可以达到要求或是采用Capto S-Capto Q(这两种介质的主要特点将在下文详细介绍)的工艺步骤[4]。 /p p style=" text-align: center " 　　 img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201810/uepic/a804fe1c-9660-4ab2-8cc4-177870630ce5.jpg" title=" 图1.png" alt=" 图1.png" style=" text-align: center " / /p p style=" text-align: center " strong 图1　抗体生产两步层析法主导的抗体纯化最新工艺[6] /strong /p p 　　Mabselect SuRe可以达到99%以上的抗体纯度，亲和洗脱峰使用Capto adhere的流穿模式进行精纯：使抗体分子流穿而聚合体、HCP、脱落的Protein A配基等杂质结合在柱上加以去除。这样仅用两步层析就可以得到符合药用级质量要求的高纯度抗体产品，大大缩短了工艺时间，提高了生产效率，同时增加了收率，降低了生产成本。 /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201810/uepic/3ef7b3a2-9f79-4e74-8a71-6a6cbcbea5ec.jpg" title=" 图2.png" alt=" 图2.png" / /p p style=" text-align: center " strong 表2 两步法用于多种抗体的纯化结果(括号内数值为纯化前)[4] /strong /p p 　　2. 抗体药物下游技术最新研究进展 /p p 　　2.1 样品澄清 /p p 　　2.1.1 中空纤维膜过滤技术 /p p 　　中空纤维膜是近年来发展起来的新型切向流膜分离技术,与盒式膜包相比,中空纤维膜可以直接处理高固含量和高黏度的粗料液,具有容尘量高、速度快、剪切力小、成本低等优点。目前,中空纤维微滤膜已经广泛用于生物制药的各个领域[7]。 /p p 　　对于动物细胞培养液,可以将高密度的培养液直接用中空纤维微滤膜(0.22或0.45μm)进行澄清,而无需事先经过离心和预过滤,步骤少,速度快,收率高,成本低。和离心机比较,具有极高的澄清度,因此中空纤维澄清后的细胞培养液可直接Protein A亲和层析进行纯化。 /p p 　　中空纤维膜澄清细胞培养液的优势有：(1)步骤少,速度快,收率更高(通过有效的洗滤可使样品收率稳定而且高于离心机)，同时最大程度上避免抗体降解而影响产品均一性。(2)成本低：不仅省去了连续流高速离心机昂贵的前期投资和运转的日常维护成本，还节省了离心后死端过滤的成本。中空纤维膜物理化学性质稳定，可以通过清洗而反复使用，成本低廉。(3)有利于内毒素控制：中空纤维膜稳定的化学性质可以耐受1M NaOH 40-50℃和氧化剂NaClO的清洗，从而有效去除内毒素 封闭的系统，也更有利于生产过程中内毒素的控制。此外，大部分中空纤维滤柱还可以进行高压灭菌。(4)低剪切力：中空纤维采用低剪切力的开放式流道，不仅可以处理含有高固含量的料液，还避免了蛋白质活性分子在高剪切力下的聚集变性，有利于抗体的稳定。(5)工艺耐用性强：相比死端过滤，中空纤维澄清具有很好的操作灵活性和耐用性，可以通过调整操作参数(流速、TMP)处理不同性质的细胞培养液。(6)易于线性放大：通过维持切向流速、TMP 等参数恒定，方便地进行线性放大，生产规模的处理量可达几千升料液，目前国内销售最大的中空纤维膜过滤系统已达400m2且生产稳定[8]。 /p p 　　2.1.2 深层过滤介质 /p p 　　深层过滤采用两种机制去除颗粒。首先是拦截，颗粒由于自身的物理尺寸在过滤器内被截留。它们可能被困在过滤器表面，因此根本没有进入基质，或在通过深层过滤基质的曲径时被俘获(筛选)。颗粒拦截伴随过滤器压差增高，因为它的基质被不断累积的颗粒堵塞。第二种机制是吸附，比过滤器拦截精度更小的颗粒能够从流体中被吸附去除。这种机制是通过深层过滤基质上的净电荷实现的[26]。 /p p 　　目前应用比较广泛的双层膜深层过滤介质有Millipore公司的Millistak+HC、Sartorius公司的Sartobran-P、Pall公司的Supradisc HP等。Millistak+HC深层过滤介质由纤维素和无机助滤剂(聚丙稀粘合的硅藻土)组成，包裹在聚丙烯外壳内 它由两层全厚度深层滤板(上游一层粗过滤和下游一层精细过滤)组成，附带一层RW01纤维素膜终过滤。Sartobran-P深层过滤介质由醋酸纤维素滤膜、聚丙烯外壳和支撑层组成，加强型的滤膜有良好的机械强度，有利于在反复的过滤和灭菌过程中保持完好无损 采用了折叠膜，在体积小巧的同时还保证了超大的过滤面积。Supradisc HP深层过滤介质由纤维素、硅藻土、带正电荷树脂和聚丙烯组成 也由两层全厚度深层滤板(上游一层粗过滤和下游一层精细过滤)组成。 /p p 　　2.2最新抗体捕获技术 /p p 　　2.2.1 MabSelect介质 /p p 　　MabSelect是第一个使用高流速琼脂糖凝胶作为骨架的新型Protein A层析介质，专为大规模抗体纯化而设计，适合快速高效的进行抗体生产和放大，已经成为单抗纯化和放大的标准介质。 /p p 　　MabSelect的特点有：(1)更高的流速和动态载量：Protein A经基因工程改造，C端含一个半胱氨酸，形成一个定向的硫酯键，同时增加了对IgG的有效结合。Protein A和凝胶偶联时采用了全新的单点偶联工艺，降低了空间位阻，因此可以在使用更高流速的条件下增加动态载量：在线形流速为500cm/hr和柱床高度为20cm(停留时间2.4min)的条件下，每毫升MabSelect的动态载量可以达到& gt 30mg IgG。(2)更低的非特异性吸附，抗体纯度更高：Mabselect介质高度亲水性的琼脂糖骨架最大程度上降低了非特异性吸附，使得洗脱峰中杂蛋白和DNA更少，有利于后期抗体的精细纯化。著名的抗体生产商IDEC公司以及R.Hahn的研究显示，Mabselect对CHO细胞HCP的吸附比其它Protein A介质低7倍[9-10]。R.L.Fahrner等的研究显示，Mabselect所得抗体的DNA残留量比其它Protein A介质低30%[11]。(3)更低的Protein A脱落：MabSelect由于通过新型环氧共价交联技术，Protein A的脱落比其它同类介质低，这不仅有利于抗体纯化，还延长了介质的使用寿命，降低了生产成本。(4)更易于工艺的线性放大：通过实验室条件的优化，MabSelect 可以在保持线性流速和上样比例等参数不变的条件下，通过增加柱直径进行线性放大。(5)MabSelect 易于清洗与除菌，寿命更长、更经济：在长期连续的生产中，有效的在位清洗(CIP)有助于延长介质使用寿命，但一般的Protein A介质往往不能耐受NaOH，只能使用高浓度的尿素或盐酸胍进行清洗，效果远不如NaOH且成本非常高。而MabSelect的CIP和除菌程序简单，用很常规、经济的试剂如50mM NaOH+1M NaCl或50mM NaOH+0.5M Na2SO4就可以有效去除沉淀和变性物质 用非离子去污剂或酒精可以去除通过疏水作用结合的物质 用0.1M醋酸和20%酒精可以在位灭菌(SIP)。经测试，Mabselect配合CIP(50mMNaOH+1M NaCl)纯化三百次后，抗体产品纯度与收率不变[12]。 /p p 　　2.2.2 MabSelect Xtra介质 /p p 　　Mabselect Xtra介质是在Mabselect介质的基础上优化而来，是目前市场上所有的商品化Protein A介质中载量最高的亲和层析介质之一。它除了具有MabSelect介质的全部特点外，还具有载量最高和非特异性吸附更低的特点。 /p p 　　Mabselect Xtra介质使用孔径更大的多孔高流速琼脂糖作为骨架，同时减小介质粒径。这样不仅增加了比表面积和配基密度，还降低了传质阻力，从而有效的增加了动态载量。其动态载量超过41mg/ml，在工艺生产过程中可以有效减少层析柱的体积，从而降低生产成本。R.Hahn的研究显示，Mabselect Xtra对CHO细胞HCP的吸附比其它Protein A介质更是低了近10倍[13]。 /p p 　　2.2.3 MabSelect SuRe介质 /p p 　　MabSelect SuRe介质也是在Mabselect介质的基础上优化而来，是目前市场上唯一耐强碱的Protein A亲和层析介质，寿命最长，稳定性最好[10]。它除了具有MabSelect介质的全部特点外，还具有以下特点：(1)可以耐受0.1-0.5M NaOH：MabSelectSuRe具有不同于其它Protein A介质的同型四聚体配基-SuRe配基，即使在强碱条件下也不易变性或脱落，可以用高达0.5M NaOH进行CIP和SIP，能有效去除沉淀和变性物质，大大降低了抗体产品被内毒素污染和批间交叉污染的风险，有利于延长介质使用寿命，同时还大大降低了CIP和SIP的成本。(2)更温和的洗脱，避免抗体聚集，提高收率：同型四聚体配基避免了不同配基与抗体Fc段亲和性的差异，也消除了某些域对Fab段的亲和作用，使得洗脱条件更加均一而温和。Mabselect SuRe介质可以用更高的pH进行洗脱，有效避免了抗体在低pH下的聚集，产品纯度和均一性更高，浊度也更低[14]。(3)不同抗体洗脱所需pH差异小：由于消除了对抗体Fab段的亲和作用，使得同一种属亚型的不同抗体分子洗脱所需的条件更接近，有利于平台技术的建立，进一步降低了不同的抗体分离纯化工艺的研发成本。(4)SuRe 配基稳定性更好：SuRe配基对碱和蛋白酶更稳定，纯化过程中脱落更少(& lt 10ppm)，有利于后期脱落配基的进一步去除。 /p p 　　2.2.4 ProSep-vA Ultra介质 /p p 　　ProSep-vA Ultra介质是将自然界非动物性来源的Protein A交联于700Å 的多孔性玻璃珠骨架上，是刚性和不可压缩的介质。ProSep-vA Ultra介质具有如下特点：低反压性 不收缩、不溶胀 高动态载量 极低的Protein A脱落 高重复使用性，标准化的清洗和除菌操作[27]。 /p p 　　2.2.5 ProSep Ultra Plus介质 /p p 　　ProSep Ultra Plus介质是在ProSep-vA Ultra介质基础上优化而来，也是目前市场上所有的商品化Protein A介质中载量最高的亲和层析介质之一。它除了具有ProSep-vA Ultra介质的全部特点外，还具有载量最高、纯化效率更高、工艺更易于放大、成本更低等特点[28]。 /p p 　　2.2.6 MEP Hypercel介质 /p p 　　MEP Hypercel复合作用模式介质是一种灵活的层析介质设计，也称之为疏水电荷诱导层析(HCIC)，用于捕获和纯化从实验室到生产规模的抗体和各种重组蛋白。MEP Hypercel介质由一个独特的连接4-巯基乙基吡啶(4-MEP)的刚性纤维素骨架组成。纤维素骨架赋予高孔隙率、化学稳定性和低非特异性吸附。平均直径80-100μm，在低反压下有优良的流速特性。MEP Hypercel介质在大规模使用时具有显著优势，基于它的配基结构，可选择性地捕获免疫球蛋白。组合其它传统的方法如离子交换、疏水作用，甚至用在Protein A之后从不同的料液中直接捕获或中度纯化抗体，以增强对宿主DNA、HCP和聚合体的清除。MEP Hypercel介质有助于建立一个简化的工艺流程，节省操作步骤(例如洗滤、超滤等) 预计有更长的使用寿命，因为它可以耐受苛刻的CIP方法(0.5-1M NaOH，30-60分钟接触时间)，而所有因素都有利于降低成本[29]。 /p p 　　2.3最新精细纯化技术 /p p 　　2.3.1 CaptoFamily系列介质 /p p 　　新型的Capto S，Q系列介质是以高流速琼脂糖为骨架，同时交联了非常“柔软”的葡聚糖链，这样不仅增加了比表面积，同时降低了传质阻力和空间位阻，使得介质在高流速下的动态载量大大增加，有利于提高生产效率，降低成本。 /p p 　　Capto S，Q系列介质可以装填在直径60cm的工业层析柱中使用高达500cm/h 的流速进行纯化(柱高30cm)。这样不仅有利于工艺放大后大规模层析柱的填装，还大大提高了生产效率，每步层析更短的操作时间也有效避免了抗体分子在分离纯化过程中产生各种变体和聚合体，使得收率更好，终产品的活性更高、性质更均一。 /p p 　　2.3.2 Captoadhere介质 /p p 　　为了进一步减少抗体分离纯化步骤，提高特定杂质的去除效率，以满足日益增长的治疗用抗体的生产需要，2007 年初，GE Healthcare公司推出了新型复合作用模式的强阴离子交换介质：Capto adhere介质。Capto adher介质专为治疗用抗体的分离纯化而设计，其配基综合了阴离子交换、氢键和疏水等多种复杂的作用方式，因此对于抗体的聚合体具有非常独特而高效的去除能力。此外，通过有效的实验设计(DoE)，流穿模式的Capto adher介质还可以同时有效去除脱落的Protein A配基、HCP、宿主DNA、内毒素和潜在的病毒，并使得结合MabSelect SuRe的抗体两步层析纯化工艺成为现实(表3)。Capto adhere还具有很强的病毒去除能力，如MVM病毒的去除能力可达5.9个Log。目前，新型的两步法抗体层析纯化工艺已经被国内外诸多知名药企广泛用于多种抗体的分离纯化，各项指标均符合治疗用抗体的要求。Capto adher层析还可以和阴离子交换(Capto Q)和疏水层析等结合使用，以达到更高的质量要求[15]。 /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201810/uepic/282961ea-e704-47d1-aabd-f044e108f59c.jpg" title=" 图3.png" alt=" 图3.png" / /p p style=" text-align: center " strong 表3 两步层析纯化工艺对污染物的去除效果[15] /strong /p p 　　2.3.3膜层析技术 /p p 　　PALL Life Science公司自10余年前颠覆性地开发出独一无二的层析产品-Mustang膜层析系列产品后，经过不断地技术改造，于近年推出全新Mustang Q XT家族，扩展了膜层析工艺放大产品线。膜层析技术，相对于传统的柱层析，无需层析填料和层析柱等复杂构件，直接通过膜式过滤器，经过简单的过滤环节即可达到纯化目的。Mustang Q以16层超级打褶的聚醚砜过滤膜作为基架，上面偶联了季胺基等功能基团，可以使生物分子流经的时候与功能位点迅速结合，具有高流速和高动态载量等优点。 /p p 　　Sartorius Stedim公司也开发出了一整套膜层析技术，包括Sartobind S,Q,C和D离子交换、Sartobind IDA(亚氨基二乙酸)金属螯合、Sartobind醛、Sartobind环氧基和Sartobind Protein A(重组)等膜层析系列产品。Sartobind在很多蛋白和病毒纯化应用中可以取代传统耗时、繁琐的层析步骤。膜吸附器的快速纯化特点使蛋白分离可以在高流速下获得高收率，较传统柱层析流速最高能提高100倍，达到20-40 CV/min。传统颗粒胶95%以上的结合位点集中在颗粒胶内部。Sartobind膜层析的结合位点是均一地交联到交叉偶联的增强纤维素骨架内0.5-1μm厚的薄层上。大孔结构和快速吸附结合特性使膜吸附器可以忽略扩散时间因素。同时多微孔膜结构不存在传统颗粒胶的孔内扩散问题。在对流情况下，流动相的分子运动只由泵压力决定。因此，膜吸附器具有操作周期极短、流速和处理能力极高的特点[30]。 /p p 　　与离子交换柱层析相比，离子交换膜层析技术已经被证明利用高动态结合能力吸附大量的生物分子，如病毒、HCP和宿主DNA。最近，阴离子交换膜层析技术已经被作为柱层析技术的替代技术用于Protein A亲和捕获后的mAb中微量污染物的去除[16]。 /p p 　　2.4终产品的浓缩洗滤 /p p 　　多维纯化得到的洗脱峰可以用Kvick Lab/Process盒式膜包进行快速浓缩和缓冲液置换。Kvick盒式膜包的优点有：(1)无热原：很多时候，仅用0.5M NaOH 清洗难以彻底去除膜表面的热原。Kvick盒式膜包化学性质非常稳定，可以使用1M NaOH在40-50℃下进行彻底的SIP/CIP，避免最终超滤浓缩时引入热原而影响产品质量。(2)孔径均一、速度快：Kvick盒式膜包孔径更均一，甚至可以使用50-100K的膜包进行抗体浓缩而不漏过，速度更快，大大节省了操作时间。(3)易于线性放大：通过保持流速、TMP等参数恒定，可以直接线性放大到生产规模。 /p p 　　Amicon Ultra系列超滤离心管可以用来进行抗体的快速浓缩、脱盐及缓冲液置换。它具有如下特点：(1)效率高：一步法离心达到25到80倍浓缩。(2)节省时间：垂直结构的膜，避免堵膜，减少浓差极化，可以用超快离心速度极短时间完成 最少10分钟即可完成浓缩、脱盐或缓冲液置换。(3)收率高：独特的反转离心设计，有利于取得最大回收率且避免了人为移液误差 低吸附滤膜和聚丙烯内壳，使回收率高达90%以上。(4)不漏液、无损失：100%完整性测试确保不漏液 独特的死体积设计避免过度离心至干，没有样品损失。(5)广泛的化学相容性：与广泛的溶剂兼容，适用于pH1-pH9，热封膜杜绝了粘合剂和下游溶出物污染。 /p p 　　Vivaspin系列超滤离心管同样是进行蛋白质快速浓缩和缓冲液置换的常用产品。获得专利的垂直膜配合狭长的流道设计，有效地避免滤膜堵塞，提高浓缩速度 同时在浓缩管底部设计有死端结构，确保即使离心时间过长也不会发生样品被甩干的现象。Vivaspin可灵活选用三种不同材质的超滤膜：聚醚砜、三醋酸纤维和Hydrosart。它的另一个特点是有两种回收浓缩液的方法，既可以直接用移液器从浓缩管底部吸取，也可以将浓缩液反转离心到回收管内，加盖密封保存，这两种方法都保证了高回收率。Vivaspin经过一次离心，最高可以将蛋白溶液浓缩300倍。 /p p 　　2.5终产品的除菌除病毒过滤 /p p 　　浓缩后的样品，最终经过0.22μm无菌滤器进行除菌过滤。ULTA Pure SG，HC除菌滤器具有过滤速度快、化学稳定性好、载量高和溶出物少等优点，细菌挑战实验表明其除菌能力大于7log。除菌过滤过程的优化主要从三个方面入手：操作过程中过膜压力的控制、过膜流速以及单位膜载量控制，这三个参数优化以后，可以在同种类型、材质的NFF膜上进行线性放大，否则很容易影响收率。 /p p 　　Durapore除菌级亲水性滤膜由亲水性PVDF材料制造，具有可靠的除菌保证以及低蛋白吸附量、低析出、无纤维脱落、广泛的化学兼容性等优点，是常用的除菌滤膜。Durapore 0.22μm亲水性滤膜用于液体除菌或去除微粒，0.1μm亲水性滤膜用于液体中去除微粒、微生物和支原体。装有Durapore亲水性滤膜的滤器有Millipak、Opticap XL、Opticap XLT、筒式滤器和Optiscale等。Millipak滤器独特的堆叠盘状设计使残留量最小并且无颗粒脱落，因此适合于高附加值产品的终端过滤和灌装。Millipak和Opticap XL滤器都有O型圈垫片和软管倒钩连接的上游排气阀和排空阀设计，使操作简单易控。Opticap XL和XLT滤器的结构设计，特别耐高温、高压条件，在除菌过程中提供更高的稳定性和可靠性，同时更易清洗。Optiscale一次性滤器专为小规模工艺筛选和工艺放大所设计，是工艺评估的理想工具。 /p p 　　目前被广泛应用的生物制品病毒去除的方法是纳米膜过滤。纳米膜过滤有如下优点：(1)针对性强，实用性广：纳米膜过滤只与病毒和目的蛋白的大小有关，无论病毒是否有脂包膜外壳、是否耐热，纳米膜过滤都能将之去除。(2)毒性小，下游污染少：能有效去除杀灭病毒后可能留下的如抗原和核酸蛋白混合物等病毒标志物，有效降低下游污染，是纳米膜的另一特点。大多数病毒灭活处理都使用有毒或致突变的理化试剂，从而必须在使用后从蛋白质溶液中清除，而纳米膜过滤不存在毒性问题，只是在验证中要考虑到滤器浸出物的风险。(3)蛋白活性高，回收率高：纳米膜过滤是在正常条件下的pH、渗透压和温度下进行的温和的生产步骤，其蛋白回收率和活性都很高，通常在90%—95%。基于体外分析、实验研究和临床经验，纳米膜过滤试验都没有显示出蛋白质改变或是新抗原的产生。纳米膜过滤不改变制品特性，这一特点促进了监管机构认可和产品的注册。 /p p 　　日本Asahi Kasei公司于1989年推出了第一款专门为清除生物制药产品中病毒颗粒而设计的过滤器Planova，由亲水铜铵再生纤维素制成的中空纤维微孔膜，装入聚碳酸酯壳体中。Millipore公司的Viresolve NFP膜是一种复合PVDF膜，过滤盒被设计来从高纯蛋白溶液中移除小型病毒，如B19，蛋白质溶液中，B19的去除量通常& gt 4 log。PALL Life Science公司的Ultipor VF DV50和DV20膜式过滤器可以从生物流体中去除显著数量级的病毒，同时目标蛋白可以很好地通过。滤芯由三层独特的亲水、低蛋白吸附的PVDF滤膜经新月型打褶方式构成，过滤面积大，具有可靠、安全和高流量等特点。Sartorius Stedim生产的Virosart CPV为聚醚砜过滤器，能去除& gt 4 log的PPV和& gt 6 log的逆转录病毒。 /p p 　　2.5扩张柱床吸附层析技术 /p p 　　扩张柱床吸附层析技术(EBA)是上世纪九十年代初期进入下游生产，整合了发酵和下游纯化的技术。新一代STREAMLINE Direct扩张柱床设备及介质是EBA技术中最成熟的产品。通过条件优化，STREAMLINE能直接从浑浊的发酵液中捕获目标生物分子，细胞碎片及不吸附的杂质穿过扩张床内悬浮的介质被冲洗掉，将以往澄清、浓缩、捕获等步骤整合为一步，达到粗纯化的效果(图2)[17]。 /p p 　　STREAMLINE的操作过程如下[17-18]：(1)起始：将STREAMLINE介质倒入扩张柱中。(2)平衡：从下向上流的缓冲液，将STREAMLINE柱内的吸附介质悬浮起来，形成稳定的、充分平衡好的扩张床。(3)上样：发酵液带菌体从柱底进入，目标生物产品吸附在STREAMLINE介质上 不吸附的宿主杂质及菌体碎片随液流从柱顶排出。(4)淋洗/穿透：进一步用缓冲液将不吸附的杂质洗掉。(5)洗脱：洗脱液洗脱目标生物产品。(6)CIP/再生：用1M NaOH+1M NaCl进行CIP。整个操作过程如图3所示。 /p p 　　 /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201810/uepic/dba748ae-d64e-479c-8fb1-ea738ef437da.jpg" title=" 图4.jpg" alt=" 图4.jpg" / /p p style=" text-align: center " strong 图2　传统纯化工艺与STREAMLINE [17] /strong /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201810/uepic/0f71d1a8-a218-43f5-8c1f-917bd4f432a5.jpg" title=" 图5.png" alt=" 图5.png" / /p p style=" text-align: center " strong 图3 STREAMLINE的基本工作原理和操作过程[18](箭头示液体过柱时的流向) /strong /p p 　　STREAMLINE介质是一系列包裹着石英芯，以琼脂糖为骨架的介质。特殊设计的STREAMLINE扩张柱床可以产生稳定的向上拔的扩张液流，每一颗不同比重的STREAMLINE介质，悬浮在自身重力和扩张升力平衡的位置原地扰动。STREAMLINE技术是稳态扩张，样品流均匀分布整个床体，目标产物吸附均匀，穿透小，回收率高，类似于固定床吸附性层析[19]。 /p p 　　3. 抗体最新下游技术应用实例 /p p 　　Lonza Biologics公司是全球最大的抗体合同生产商之一，为了开发一个稳定的20000L的抗体生产工艺，其纯化开发部门对多个不同的抗体亲和层析凝胶进行了有效的比较，他们发现Mabselect SuRe的动态载量高、使用寿命最长、Protein A脱落最低，实验数据明确支持放大到1.4m直径的柱子用于20000L培养规模的经济生产[4]。 /p p 　　德国的Roche公司一种用于肿瘤治疗的单抗已进入临床Ⅲ期。他们将目前几种Protein A介质进行充分的比较之后，选择了高载量、更易于装柱和寿命更长的Mabselect。目的抗体是通过无血清培养的转染的杂交B淋巴细胞表达的IgG1。将过滤后的无细胞上清上样到Mabselect填充的FineLINE柱，直径300cm，柱高20cm，上样的浓度是30mg/ml。洗脱后，洗脱液立即用磷酸钾中和pH值到6.8-7.0，再用凝胶过滤检测，结果表明比活超过90%，纯度在95%以上[20]。 /p p 　　Cytheris公司是法国一家生物制药公司，目前正在研制一种用CHO细胞表达的免疫调节剂(临床Ⅱ期)。原先的工艺采用传统层析法，但不能稳定去除病毒。改进后，在工艺的第一步使用Mustang Q对污染物进行捕获，取得了25%去除率的良好结果 同时对MVM、MLV和Re03三种病毒也达到超过4个Log的滴度降效果，而整个工艺对病毒的去除效率普遍提高了7-11个Log。说明Mustang Q的使用对下游层析起到了很好的保护作用。 /p p 　　在第五届生物制药工艺优化大会上，Crucell公司介绍了他们对腺病毒(AAV)纯化工艺的摸索。与传统的层析填料相比，Mustang Q膜层析的开放孔道的设计使对病毒的动态载量大大提高30倍左右，回收率在80%以上。用40L的膜层析柱相当于1000L的传统层析柱的效果，节省了验证工作，提高了工艺经济性，十分有利于放大生产。 /p p 　　德国的Boehringer Mannheim公司生物制药部，用STREAMLINE技术代替传统工艺生产400L CHO细胞培养的Fc融合蛋白，结果样品回收率提高14%，缓冲液减少25%，时间缩短47%[17]。 /p p 　　世界最大的制药公司-GlaxoSmithKline公司，使用特别设计的BioProcess全自动层析系统和STREAMLINE扩张柱生产药用脂蛋白疫苗，比原工艺产品体积缩小2倍，纯化系数1.5，内毒素减少100倍[17]。 /p p 　　日本YOSHITOMI公司正在使用多套STREAMLINE 1000系统生产人重组白蛋白，与原生产工艺产品纯度相同，产率提高30%，时间减少一半，年产量为12.5吨[17]。 /p p 　　AVECIA公司重新设计临床Ⅲ期药品生产工艺，选用STREAMLINE技术及SOURCE新型凝胶，生产效率提高12倍，回收率提高1倍[17]。 /p p 　　2001年，ILEX制药公司的CAMPATH获得FDA批准。该单克隆抗体使用Sartobind Q离子交换层析模块以流穿的方式进行精制，这是膜吸附器首次被批准应用于治疗性蛋白的生产，证明了膜层析技术通过了证实和测试[30]。 /p p 　　4. 展望 /p p 　　随着抗体产品上游大规模高效培养技术的进一步发展,实验室规模哺乳动物细胞表达水平可以达到25g/L，如果这一水平能够有效放大到生产,将对下游生产纯化带来更大的压力。所以下游纯化工艺的技术发展也是势在必行。 /p p 　　以下一些发展方向可能成为下游工艺未来发展的重要关注点：(1)刚性更好、载量更高、耐碱性更好的完全亲水琼脂糖凝胶的开发[4]。(2)优化操作次序，降低缓冲液消耗的更大规模生产线的应用[21]。(3)通过单抗的氨基酸序列预测下游工艺关键参数：亲和层析洗脱pH条件、离子交换层析洗脱pH和盐浓度条件、病毒灭活pH等[22]。(4)下游工艺的成本消耗占全部成本的50-80%，亲和捕获是下游工艺的最关键步骤，通过改进亲和配体，提高捕获能力，节省成本[23]。(5)新型层析系统全程实时控制纯化过程，在线检测HCP、宿主DNA、Protein A等的含量[24]。(6)由于在去除杂质方面的优势，膜层析将会得到飞速的发展，未来工艺甚至可能完全基于膜层析而不是柱层析[25]。 /p p 　　参考文献 /p p 　　[1] 刘亚明,薛章.生物制药：迎接抗体药物的黄金时代.医药细分子行业研究报告,2009. /p p 　　[2] 陈志南.基于抗体药物的我国生物制药产业化发展前景.2008中国药学会学术年会暨第八届中国药师周论文集,2008. /p p 　　[3]Gail Dutton.Trends in Monoclonal AntibodyProduction.Feature Articles,2010, 30(4). /p p 　　[4]孙文改,苗景赟.抗体生产纯化技术.中国生物工程杂志,2008,28(10):141-152. /p p 　　[5]《人用单克隆抗体质量控制技术指导原则》.NICPBP(中国药品与生物制品检定所),2003. /p p 　　[6]Capto adhere：用于生产单抗的两步纯化操作.GE Healthcare公司技术资料. /p p 　　[7]中空纤维滤柱分离纯化应用集锦.GE Healthcare公司技术资料. /p p 　　[8]中空纤维膜过滤技术在单抗生产中的应用.GE Healthcare公司技术资料. /p p 　　[9]Amersham Biosciences.Downstream Gab’02 Abstracts,Extended Reports from the 2nd International Symposium on DownstreamProcessing of Genetically Engineered 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蛋白质是复杂的含氮有机化合物,分子量很大,大部分高达数万至数百万,分子的长链从数纳米至100nm,它们由20种氨基酸通过酰胺键以一定的方式结合,并具有一定的空间结构,所含的主要化学元素为C、H、O、N,在某些蛋白质中还含有P、Cu、Fe、I等元素,但氮的相对丰度基本稳定,是区别于其它有机化合物的主要标志。不同蛋白质的氨基酸构成比例及方式不同,所以各种蛋白质其含氮量也不同。一般蛋白质含氮量平均为16%,即1份氮素相当于6.25份蛋白质,此即蛋白质系数。 意大利VELP凯氏定氮仪在环保节能方面具有性能， 的蒸汽发生器和钛冷凝器，蒸馏滴定同步进行，分析速度快，冷却水用量仅0.5升/分钟，降低能耗从而节约了成本。因此该仪器被广泛应用于各类蛋白质检测的实验研究。 测定脱脂奶粉中蛋白质的含量，对掌握其营养价值和品质的变化，保障人体健康，合理配料，为乳制品深加工提供数据十分重要，此外，蛋白质分解产物对乳制品的色、香、味都有一定作用，所以测定具有深远意义。

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免疫球蛋白（Immunoglobulin，Ig）具有抗体活性，是脊椎动物在对抗原刺激的免疫应答中，由淋巴细胞产生的，能与相应的抗原发生特异性结合的或化学结构与抗体相似的一类球蛋白。它普遍存在于哺乳动物的血液、组织液、淋巴液和体外分泌液中，是主要的液体免疫物质。1890年，德国学者Behring和日本学者北里首次发现免疫球蛋白。随后人们用电泳技术证明了血液中抗体的活性存在于γ区、β2区、β区和α区。为了避免名称上的混乱，1964年WHO命名委员会统一将抗体和一些化学结构、抗原性与其有关的蛋白统称为免疫球蛋白。免疫球蛋白广泛应用于开发新型功能性食品添加剂，仔畜饲料以及生物新药和医药生化诊断、检测试剂等，已经成为研究和商业等部门重要的物质。所以免疫球蛋白的纯化也备受关注。由于免疫球蛋白对金属螯合色谱的亲和力最da，因此可采用增加上样量使其突破饱和点再用强洗脱液洗下吸附的免疫球蛋白。据报道，此法得到的免疫球蛋白的纯度可达95%，活力几乎没有损失。金属螯合色谱是一种利用金属离子与蛋白质中的某些氨基酸，如组氨酸等特有的亲和力进行分离纯化的新型色谱分离技术，它具有条件温和，分离的蛋白质活性回收率较高。同时操作较为简单，具有较高的处理能力，使用寿命也较长，适宜于生物活性蛋白的分离纯化。月旭推出的Chelating Tanrose 6FF金属螯合亲和介质，由亚氨基二乙酸（IDA）偶联到琼脂糖而成，相当于未螯合Ni离子的Ni Tanrose 6FF(IDA)。Chelating Tanrose 6FF介质的配基可提供3个配位位点同金属离子螯合，同时提供三个离子键结合部位高亲和的纯化目的蛋白，亲和力要强。可广泛应用于分离提纯蛋白质和多肽。其原理是利用蛋白质的组氨酸、半胱氨酸和色氨酸的侧链与多种过渡金属离子如Cu2+，Zn2+，Co2+，Fe3+的相互作用，从而达到分离纯化的目的。

一、蛋白样品制备　　之前和大家介绍过细胞和组织蛋白质的提取，当我们做WB的时候，需要对提取好的蛋白样品进行处理：在蛋白样品中加入SDS loading buffer 6X（蛋白上样缓冲液）稀释至1X（如蛋白样品有120ul，则加入SDS loading buffer 6X 600ul），混匀，75-95度加热10-15分钟，使蛋白变性以充分暴露抗原位点。在加热结束后，进行离心，使蛋白样品适当降温，防止PAGE胶被融化。　　PS：要测量的蛋白如果是磷酸化形式，一般加热到75度，一般情况可95度加热。市面上买到的SDS loading buffer 有2X的也有5X的，最后稀释至1X即可。　　那么为什么我们加入SDS loading buffer呢？主要就是用它的不同成分在电泳中起了关键的作用。　　SDS loading buffer 的主要成分及作用：A：0.1%溴酚蓝，作为指示剂，方便观察电泳进行的程度；B：10%甘油，密度大，增加样本的重量，可携带样本沉到底部；C：2%SDS，是一种阴离子表面活性剂，能打断蛋白质的氢键和疏水键，按一定比例和蛋白质分子结合成为复合物，是蛋白质带满负电荷，从而是蛋白带电荷一致，减少电荷对电泳结果的影响；D：巯基乙醇还原剂，使蛋白质的二硫键断开，使得蛋白保持线性结构。　　二、蛋白上样　　1. 将之前配好的胶固定在电泳装置上，加入1X电泳液　　2. 拔出梳子，应该两侧同时用力，缓慢拔出，注意在拔除梳子时防止气泡进入梳孔使其变形，若上样孔有变形，可用适当粗细的针头拨正。　　3.加入蛋白样品，一般10孔的梳孔，每孔可以加入20ul -40ul蛋白样品，15孔的梳孔，每孔可以加入10ul -30ul蛋白样品，是用微量注射器加样，平时我们也可以用普通的移液枪加样，尽量让枪头深入梳孔底物，防止蛋白样品飘出，一般在目的蛋白两侧加入等量的marker，如果两侧有空的梳孔，应该加入1X的loading buffer，起“压边”作用，可以使蛋白样品在一条水平线上往下跑。　　4.电泳：接上电极，正负极不要弄反，红色对红色，黑色对黑色，初始电压设为90V，当样品跑至分离胶时将电压调至120V，一般在溴酚蓝跑出胶时停止电泳，也可根据目的蛋白的分子量来选择跑的时间，如分子量较大，可以延长电泳时间，使得分子量大的marker跑的分散开，容易判断分子量。　　三、注意事项　　1.蛋白样品上样量最好相等，不要过多。　　2.不要过多重复使用电泳Buffer　　3.最佳分辨区在分离胶的2/3　　4.电泳后测定的分子量有10%的误差，不可完全信任。有些蛋白质由亚基（如血红蛋白）或两条以上的肽链（α-胰凝乳蛋白酶）组成的，它们在巯基乙醇和SDS的作用下解离成亚基或多条单肽链，SDS-PAGE电泳法测定的只是它们的亚基或是单条肽链的相对分子量，有的蛋白质（如电荷异常或结构异常的蛋白质，带有较大辅基的蛋白质）不能采用该发测相对分子量。　　5.如果电泳中出现拖尾，染色带的背景不清晰等现象，可能是SDS不纯引起。

共同战疫 2020年 免疫球蛋白含量快速测定安东帕Abbemat系列全自动折光仪 随着新型冠状病毒感染的肺炎确诊越来越多，医疗物资需求也越来越大，其中，静注人免疫球蛋白是目前防控新冠状病毒感染肺炎的重要药品之一。人免疫球蛋白人免疫球蛋白是取健康献血员的新鲜血浆或保存期不超过2年的冰冻血浆，每批最少应由1000名以上健康献血员的血浆混合。用低温乙醇蛋白分离法分段沉淀提取免疫球蛋白组分，经超滤或冷冻干燥脱醇、浓缩和灭活病毒处理等工序制得，其免疫球蛋白纯度应不低于90%。然后配制成蛋白浓度为10%的溶液，加适量稳定剂，除菌滤过，无菌灌装制成。人免疫球蛋白作为重要的医疗用品，选择合适的含量检测方法具有重大意义。目前，中国药典明确规定人血浆中蛋白可采用折射仪法进行测定。折光率作为物质浓度和纯度的表征，可用于物质含量的测定。将折光仪用于免疫球蛋白含量的测定，不但操作简单，其快速、准确的优势，可帮助制药企业节约大量时间成本，这在需要大量生产与检测免疫球蛋白的特殊时期，尤为关键！

金属蛋白酶（MP）是一个在其活性中心具有金属离子的大型蛋白酶家族。根据结构域的不同，金属蛋白酶可分为多种亚型，主要包括基质金属蛋白酶（MMPs）、解整合素金属蛋白酶（ADAMs）以及具有血栓反应蛋白基序的ADAMs（ADAMTS）。它们具有蛋白质水解、细胞粘附和细胞外基质重塑等多种功能。相关会议推荐点击可免费报名金属蛋白酶在多种类型的癌症中表达，并通过调节信号转导和肿瘤微环境参与涉及肿瘤发生、发展、侵袭和转移的许多病理过程。因此，更好地了解MP在癌症免疫调节中的表达模式和功能将有助于开发更有效的癌症诊断和免疫治疗方法。MP的结构和表达基质金属蛋白酶（MMP）在脊椎动物中，MMP家族由28个成员组成，至少23个在人体组织中表达，其中14个在脉管系统中表达。基质金属蛋白酶通常根据其底物和其结构域的组织结构分为胶原酶（MMP1、MMP8、MMP13）、明胶酶（MMP2、MMP9）、溶血素（MMP3、MMP10、MMP11）、基质溶素（MMP7、MMP26）、膜型MMPs（MT MMPs）或其他MMPs。MMP家族有一个共同的核心结构。典型的MMPs由大约80个氨基酸的前肽、170个氨基酸的金属蛋白酶催化结构域、可变长度的连接肽或铰链区和约200个氨基酸的血红素蛋白结构域组成。不同类型的MMP具有不同于典型MMP的特定结构特征。例如，MT MMPs缺乏前结构域，而MMP7、MMP26和MMP23缺乏Hpx结构域和连接肽。此外，MMP2和MMP9包含纤连蛋白的三个重复。MMPs中的这些不同结构域、模块和基序参与与其他分子的相互作用，从而影响或决定MMP活性、底物特异性、细胞和组织定位。MMPs已在多种人类癌症中检测到，MMPs的高表达通常与大多数癌症的生存率降低有关，包括结直肠癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌和胃癌。其中MMP2和MMP9，能够降解基底膜中的IV型胶原，是研究最广泛的金属蛋白酶，与各种癌症患者的疾病进展和生存率降低相关。解整合素金属蛋白酶（ADAM）ADAMs是锚定在细胞表面膜上的I型跨膜蛋白，迄今已发现30多种。与MMPs类似，ADAMs包括前结构域和锌结合金属蛋白酶结构域。ADAM还包括一个在细胞表面蛋白中独特的去整合素结构域。ADAM的金属蛋白酶结构域高度保守，大多数ADAM都有一个富含半胱氨酸的结构域和跨膜区域相邻的EGF样结构域，然后是一个长度和序列在不同ADAM家族成员之间变化很大的胞内区。由于这些结构域的存在，ADAM可以结合底物并影响细胞粘附和迁移的变化，以及细胞表面分子的蛋白水解释放。它们的主要底物是完整的跨膜蛋白，如生长因子、粘附分子和细胞因子的前体形式。癌细胞通常表达高水平的ADAM，ADAM17是所有ADAM蛋白中研究最广泛的。一项评估ADAM17作为卵巢癌潜在血液生物标志物的研究表明，与对照组相比，培养的卵巢癌细胞系的培养基上清液以及卵巢癌患者的血清和腹水中的ADAM17水平明显更高。具有血栓反应蛋白基序的ADAM（ADAMTS）ADAM不同，ADAMTS是一种分泌型金属蛋白酶，其特征在于辅助结构域包含血栓反应蛋白1型重复序列（TSR）和间隔区，并且缺少跨膜区、胞内域和（EGF）样结构域，人ADAMTS家族包括19种蛋白。ADAMTS蛋白酶参与前胶原和von Willebrand因子的成熟，以及与形态发生、血管生成和癌症相关的ECM蛋白水解。研究表明，不同的ADAMTS具有不同的生物学功能，并且个体ADAMTS可以在不同的癌症中或根据临床环境发挥不同的作用。与MMPs和ADAMs相比，ADAMTS在TME中的参与研究较少，因此迫切需要系统地研究其在癌症中的功能。涉及癌细胞免疫相关MP的信号通路信号转导途径由多个分子组成，它们相互识别和相互作用，并传递信号以调节许多重要的生物学过程，如肿瘤细胞增殖、转移和免疫调节。三种信号通路尤其与免疫调节中的MP密切相关。肿瘤坏死因子信号肿瘤坏死因子-α（TNF-α）是一种重要的促炎细胞因子，参与免疫系统的维持和稳态，以及炎症和宿主防御。可溶性TNF-α通过蛋白水解酶ADAM17，也称为TNF-a转换酶（TACE），从跨膜TNF-α（tmTNF-α）裂解，该酶可通过激活TNF-α来协调免疫和炎症反应。鉴于ADAM17对TNF信号通路的受体和配体的作用，ADAM17被认为以多种方式影响TNF-α信号传导。例如，可溶性TNF-α产生的减少将导致tmTNF-α的积累，其将与TNFR2结合并导致不同的生物学结果。转化生长因子–β转化生长因子-β（TGF-β）作为肿瘤行为的关键调节因子，在肿瘤侵袭和转移、免疫调节和治疗抵抗中发挥重要作用。TGF-β也是TME免疫抑制的核心，根据具体情况对免疫系统具有多效性功能。MMP9和MMP2是已知的两种金属蛋白酶，可切割未激活的TGF-β前体并产生不同的TGF-β蛋白水解切割产物，从而导致TGF-β活化。此外，与CD44结合的MMP9降解纤连蛋白导致活性TGF-β的释放。癌细胞中MMP9的水平不仅可能影响TGF-β的蛋白水解，还可能影响TGFβ和TGF信号通路下游物质的表达。对乳腺癌中MMP9与TGF信号通路之间关系的研究表明，乳腺癌细胞中MMP9的过表达不仅显著上调了SMAD2、SMAD3和SMAD4的表达，还增强了SMAD2的磷酸化。Notch信号通路Notch信号涉及肿瘤生物学的多个方面，其在免疫应答的发展和调节中的作用比较复杂，包括塑造免疫系统和TME的组成部分，例如抗原呈递细胞、T细胞亚群和癌细胞之间的复杂串扰。特别是，Notch在不同免疫细胞的发育和维持中发挥着关键作用。配体与Notch受体结合后，下游信号由包括ADAM家族成员在内的一些蛋白酶介导。首先，受体/配体相互作用暴露了蛋白水解切割位点S2，其被ADAM金属蛋白酶切割。γ-分泌酶介导的S3处的后续裂解发生在跨膜区，导致Notch胞内结构域（NICD）的释放，该结构域转移到细胞核中，并将MAML与RBPJ结合，触发靶基因如Myc、P21和HES1的转录。已知ADAM10和ADAM17参与裂解S2，而ADAM17导致配体非依赖性Notch激活，ADAM10导致配体依赖性激活。MP对肿瘤微环境的调节TME是指肿瘤细胞周围的微环境，包括血管、免疫细胞、成纤维细胞、骨髓源性抑制细胞、各种信号分子和ECM。TME在调节癌症的免疫反应中起着关键作用。MP对ECM的影响ECM是TME基质的非细胞成分，ECM的重塑在癌症的发展和体内稳态以及免疫细胞募集和组织转移中起着重要作用。癌症进展过程中ECM的广泛重塑导致其密度和组成发生变化，具体而言，蛋白酶诱导的ECM成分的分解对于肿瘤细胞跨越组织屏障至关重要。MMPs和ADAMs是参与ECM降解的主要酶，参与ECM降解的MMPs可大致分为膜锚定MMPs和可溶性MMPs。ECM降解主要通过MT1 MMP激活的可溶性MMP（如MMP2、MMP9和MMP13）实现。ECM有三个主要成分：纤维、蛋白聚糖和多糖。MMPs通过与这些基质结合以促进各种ECM蛋白的周转，在组织重塑中发挥重要作用。MMPs降解ECM的具体机制尚不清楚，需要进一步研究。MP与免疫细胞之间的关系MP在促进免疫细胞活性和调节免疫细胞迁移方面发挥重要作用。MP和免疫细胞之间的关系如下图所示。ADAM10和ADAM17在静止的CD4+Th细胞表面表达，对调节CD4+Th的发育和功能很重要。ADAM10/17在T细胞共刺激受体以及共抑制受体的脱落中发挥关键作用。例如，CD154（CD40L）是一种II型膜共刺激受体，在T细胞和APC之间的相互作用后，CD154表达在几个小时内迅速上调，随后在ADAM10和ADAM17裂解后从T细胞表面释放。此外，ADAM10和ADAM17还作用于共刺激受体CD137，以及抑制性受体LAG-3、TIM-3，sLAG-3和sTIM-3的可溶性形式都是在ADAM10和ADAM17蛋白水解裂解后形成的。B细胞是体液免疫的关键细胞成分，位于脾脏中边缘区B细胞（MZB）表达高水平的CD80/86共刺激分子，导致T细胞活化。Notch2信号传导是MZB细胞发育所必需的，在MZB的发育过程中，Notch2异二聚体与基质细胞和APC上的DLL1等配体结合，这启动了一种未知的金属蛋白酶水解受体，导致Notch胞内结构域的释放，该结构域转移到细胞核并触发下游靶基因的表达。这种未知的金属蛋白酶可能是ADAM10。NK细胞表达IgG Fc受体FcγRIII（CD16），CD16分子可被ADAM17从活化的NK细胞表面裂解，ADAM17的抑制会削弱CD16和CD62L的胞外脱落，从而显著增加细胞内TNF-α和IFN-γ的水平。此外，MMPs和ADAMS可以从肿瘤细胞表面切割活化受体NKG2D的配体。这些裂解蛋白的可溶性形式与NKG2D结合，并诱导该受体的内吞和降解，导致肿瘤逃避监控。总的来说，ADAM17裂解的多种底物与NK细胞的不同作用有关。肿瘤相关巨噬细胞（TAM）有助于癌症的发生和恶性进展，高水平的TAM与预后不良和总体生存率降低有关。在多种癌症中，发现TAM通过分泌MMPs促进肿瘤血管生成和侵袭，并调节免疫反应。MMP的调节与TAM分泌的趋化因子密切相关。与MPs相关的免疫调节细胞因子多种来源于肿瘤细胞的细胞因子，包括TGF-β、EGF、HGF和TNF-α，介导许多MP的表达。其中最重要的是MMP9，其在血清和与肿瘤相关的组织中升高，并参与ECM的降解，以促进癌症中免疫细胞的迁移。此外，这些细胞因子必须被MP切割以参与肿瘤免疫过程。例如，被ADAM17切割的TmTNF-α产生活性sTNF-α。IL-12在T细胞发育和扩增中也起着关键作用，未激活的IL-12前体需要在被MMP14切割之后在TME中转变为活性状态。金属蛋白酶和血管生成迄今为止，已经报道了几种类型的肿瘤血管生成，包括萌芽血管生成和血管生成拟态（VM）。萌芽血管生成是通过血管基底膜中各种水解酶（如MP和组织纤溶酶）的上调实现的，这导致基底膜和ECM的降解和重塑。例如，在胰腺神经内分泌肿瘤中，MMP9分泌增加会从基质中释放出隔离的VEGF，从而将血管静止转变为活跃的血管生成。在肺癌细胞中，MMP2活性的抑制减少了其与整合素AVB3的相互作用，并抑制了下游PI3K/AKT信号介导的VEGF的表达，导致血管生成减少。VM是侵袭性肿瘤形成新血管的新模型，为肿瘤生长提供血液供应。研究表明，实体瘤的初始缺氧环境与VM密不可分，缺氧与MMPs的表达和活性密切相关。低氧诱导因子-1α（HIF-1α）已被证明直接调节MMP14、MMP9和MMP2的表达。靶向MP的免疫治疗鉴于MP在癌症免疫调节中的作用，人们开始探索靶向MP的免疫治疗，临床试验中出现了多种广谱MP抑制剂。然而，由于药物的非特异性靶向和MP在免疫调节中的复杂作用，MP抑制剂迄今未能改善癌症患者的生存和预后。最近，有报道称MP抑制剂可用于联合治疗，以提高免疫治疗的疗效。SB-3CT作为一种MMP2/9抑制剂，被认为可以提高抗PD-1和抗CTLA-4治疗黑色素瘤和肺癌小鼠模型的疗效。SB-3CT治疗不仅通过减少多种致癌途径导致PD-L1表达减少，而且与抗PD-1治疗相结合，显著改善了免疫细胞浸润和T细胞的细胞毒性。此外，SB-3CT与抗CTLA-4的组合增强了PD-L1表达的下调，并增加了肿瘤中活化的肿瘤浸润CD8+T细胞的丰度。Andecaliximab（GS-5745）是一种选择性抑制MMP9的单克隆抗体，GS-5745通过与MMP9前体结合并阻止MMP9活化来抑制MMP9，而与活性MMP9的结合则抑制其活性。Fab 3369作用于MMP14，阻断细胞表面表达的内源性MMP14，并抑制三阴性乳腺癌（TNBC）中ECM的降解。此外，有多种抗体可有效抑制ADAM17，包括A12、A9和MED13622。还有一些小分子抑制剂在临床开发中，在临床试验中显示出积极的效果。小结MP在TME中的免疫调节中发挥重要作用，包括ECM重塑、信号通路转导、细胞因子脱落和释放以及促进血管生成。与MP相关的新兴技术和药物在癌症诊断和治疗中得到了越来越多的探索。因此，更好地了解MP在癌症免疫调节中的表达模式和功能将有助于开发更有效的癌症诊断和免疫治疗方法。基于MP的探索和新技术具有巨大潜力，它们可能会为未来的癌症诊断和治疗提供有效的策略。参考文献：1.Immunomodulatory role of metalloproteases in cancers: Current progress and future trends. Front Immunol.2022 13: 1064033.

聚焦蛋白质互作研究进展与实验方法研究蛋白-蛋白相互作用是理解生命活动的基础。蛋白质—蛋白质互作网络是生物信息调控的主要实现方式，是决定细胞命运的关键因素。检测蛋白质间相互作用的实验方法有哪些？这些检测方法各有什么优缺点?总结如下。1. 生化方法●共纯化、共沉淀，在不同基质上进行色谱层析(需要补充)●蛋白质亲和色谱 基本原理是将一种蛋白质固定于某种基质上(如Sepharose)，当细胞抽提液经过改基质时，可与改固定蛋白相互作用的配体蛋白被吸附，而没有吸附的非目标蛋白则随洗脱液流出。被吸附的蛋白可以通过改变洗脱液或者洗脱条件而回收下来。GST pull down技术：为了更有效的利用蛋白质亲和色谱，可以将待纯话的蛋白以融合蛋白的形式表达，即将”诱饵“蛋白与一种易于纯化的配体蛋白融合。例如与GST融合的蛋白再经过GSH的色谱柱时，就可以通过GST和GSH的相互作用而被吸附。当载有细胞抽提物经过柱时，就可以得到能够与“诱饵”蛋白相互作用的目标蛋白了。Epitope-tag技术：表位附加标记技术 就是将附加的抗原 融合到目的蛋白以检测目的蛋白的表达，同时还可以通过亲和层析法来纯化目的蛋白。 缺点：表位附加标记可能会使融合蛋白不稳定，改变或使融合蛋白功能丧失。以上两种方法都要共同的缺点：假阳性。实验所检测到的相互作用可能时由蛋白质所带电荷引起的，并不是生理性的相互作用 蛋白的相互作用可能并不是直接的，可是由第三者作为中介的 有时会检测到两种在细胞中不可能相遇却有极强亲和力的蛋白。因此实验结果还应经其他方法验证。●免疫 共沉淀 免疫共沉淀是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。改法的优点是蛋白处于天然状态，蛋白的相互作用可以在天然状态下进行，可以避免认为影响 可以分离得到天然状态下相互作用的蛋白复合体。 缺点：免疫共沉淀同样不能保证沉淀的蛋白复合物时候为直接相互作用的两种蛋白。另外灵敏度不如亲和色谱高。●Far-Western 又叫做亲和印记。将PAGE胶上分离好的凡百样品转移到硝酸纤维膜上，然后检测哪种蛋白能与标记了同位素的诱饵蛋白发生作用，最后显影。 缺点是转膜前需要将蛋白复性。2. 等离子表面共振技术(Surface plasmon resonance)该技术是将诱饵蛋白结合于葡聚糖表面，葡聚糖层固定于几十纳米厚的技术膜表面。当有蛋白质混合物经过时，如果有蛋白质同“诱饵”蛋白发生相互作用，那么两者的结合将使金属膜表面的折射绿上升，从而导致共振角度的改变。而共振角度的改变与该处的蛋白质浓度成线性关系，由此可以检测蛋白质之间的相互作用。该技术不需要标记物和染料，安全灵敏快速，还可定量分析。缺点：需要专门的等离子表面共振检测仪器。3. 遗传学方法使某处发生缺损，检测对其他地方的影响。●基因外抑制子。基因外抑制子是通过一个基因的突变 来弥补原有基因的突变。比如相互作用的蛋白A和B，如果A发生了突变使两者不再相互作用，此时B如果再发生弥补性突变就可以使两者的相互作用恢复，那么B就是A的基因外抑制子。 缺点：需要知道基因，要有表型，筛选抑制子比较费时。●合成致死筛选 指两个基因同时发生突变会产生致死效应，而当每个基因单独发生突变时则无致死效应。用于分析两个具有相同重要蛋白之间的相互作用。4. 双杂交技术原理基于真核细胞转录因子的结构特殊性，这些转录因子通常需要两个或以上相互独立的结构域组成。分别使结合域和激活域同诱饵蛋白和猎物蛋白形成融合蛋白，在真核细胞中表达，如果两种蛋白可以发生相互作用，则可使结合域和激活域在空间上充分接近，从而激活报告基因。 缺点：自身有转录功能的蛋白会造成假阳性。融合蛋白会影响蛋白的真实结构和功能。不利于核外蛋白研究，会导致假隐性。5. 荧光共振能量转移技术指两个荧光法色基团在足够近(100埃)时，它们之间可发生能量转移的现象。荧光共振能量转移技术可以研究分子内部对某些刺激发生的构象变化，也能研究分子间的相互作用。它可以在活体中检测，非常灵敏，分辩率高，能够检测大分子的构象变化，能够定性定量的检测相互作用的强度。 缺点 此项技术要求发色基团的距离小于100埃。另外设备昂贵，还需要融合GFP给蛋白标记。此外还有交联技术(cross-linKing)，蛋白质探针技术，噬菌体展示技术(Phage display)以及生物信息学的方法来检测蛋白质之间相互作用。

在世界经济论坛发布的《2023年十大新兴技术报告》中，空间组学被评选为未来最有潜力对世界产生积极影响的十大新兴技术之一。这标志着空间组学不仅在科研领域取得了显著成果，更有望为医学、农业等多个领域带来革命性的突破。在这一技术浪潮中，景杰生物以其卓越的科研实力和前瞻性的战略布局，成为空间蛋白质组学领域的佼佼者。自2021年6月首次推出空间蛋白质组以来，景杰生物不断对技术与体系进行全面优化，一次次刷新着空间蛋白质组学的研究边界。如今，景杰生物再次重磅推出“全息空间蛋白质组学”，为空间蛋白质组学研究提供了更为强大的工具。全息空间蛋白质组学依托于景杰生物创新的10X Proteomics平台，该技术能够支持组织微环境的全覆盖高深度蛋白质组空间检测。在实验中，景杰生物研发团队选择了癌症石蜡样本，运用全流程的先进仪器设施，如徕卡冷冻切片机、数字玻片扫描系统和蔡司激光捕获显微切割仪，进行一站式操作。经过烤片、脱蜡、复水、HE染色等一系列步骤后，成像技术精准定位目标区域，并进行无间隔地切割取样。酶解后使用Orbitrap Astral / timsTOF 最新款高性能质谱平台进行蛋白质组学检测，从而得到与组织微环境图像匹配的全覆盖空间蛋白质组学数据。通过对目标区域进行全覆盖检测，得到了带有空间位置信息的100份蛋白质组学数据，每份数据对应精细组织，无间隔地构成了“全息”的空间蛋白质组学数据集。这些数据集共检测到5500多个蛋白，平均每个样本可检测到4100多个蛋白，是目前最大最全面的全息空间蛋白质组学数据集之一。对于全息空间蛋白质组学得到的庞大数据集而言，如何有效地利用生信分析手段进行挖掘和展示是大家的重要关注点。为此，景杰生物生信和人工智能团队借鉴空间转录组的分析经验，针对全息空间蛋白质组学开发了一系列工具，帮助我们“看得见、挖得深、画得漂亮、画得清晰”。通过以上数据分析方案，可实现与空间转录组学类似的：全息空间样本点无监督聚类分析、类间差异分析/差异蛋白功能注释、单个差异蛋白空间可视化、基于清晰的组织病理特征注释和指定病理分组差异分析、基于反卷积等算法注释细胞类型得分/比例等等个性化分析。相信这样一套分析的组合拳，一方面可以将蛋白信息清晰还原到组织空间微环境中，另一方面也可以与临床病理信息精准结合，定会成为空间蛋白质组学研究的标杆，加速精准医学和基础研究。随着本次全息空间蛋白质组学发布，景杰生物已搭建成全球首个结合空间蛋白质组学、空间磷酸化修饰组学以及全息空间蛋白质组学的一站式空间组学平台。包含了既可以满足个性化选取不规则点位进行蛋白质组精准检测的空间蛋白质组学，又可以进行个性化选取不规则形状点位进行磷酸化修饰精准检测的空间磷酸化修饰组学，本次又实现对组织微环境进行高分辨率全覆盖式蛋白质组精准检测的全息空间蛋白质组学，满足蛋白质组研究的多项需求，为空间蛋白质组学研究提供更多选择。展望未来，全息空间蛋白质组学将在癌症研究、神经科学、免疫学等多个领域发挥重要作用。而景杰生物作为空间蛋白质组学的先驱和引领者，将不遗余力全面推进空间蛋白质组学的技术进步，为前沿研究保驾护航！

近日，中国科学院深圳先进技术研究院合成生物学研究所马英新课题组在国际学术期刊 Sensors and Actuators B: Chemical 上发表了题为：Construction of ratiometric Si-Mn:ZnSe nanoparticles for the immunoassay of SARS-CoV-2 spike protein 的研究论文。 该研究开发了一种比率型荧光探针（Si-Mn:ZnSe NPs），通过结合酶联免疫反应（ELISA）模型，建立了一种新冠病毒（SARS-CoV-2）刺突蛋白（S蛋白）的免疫荧光检测方法。 以SARS-CoV-2假病毒和VSV-G假病毒作为实际样本考察该方法的传感性能，结果显示该方法对SARS-CoV-2假病毒响应特异性良好，具有与商品化试剂盒相当的检测灵敏度，为诊断SARS-CoV-2感染提供了一种可靠的潜在思路。 S蛋白是新冠病毒侵染过程中的关键成分，具有识别目标细胞和促进膜融合的作用。因此，快速检测S蛋白对新冠疫情的防控至关重要。 目前，新冠感染早期诊断的主流方法有三种，包括分子检测（检测病毒RNA）、抗体检测（检测IgG和IgM抗体）和抗原检测（检测病毒蛋白）。相比其他两种方法，抗原检测特异性好且反应时间短，在大批量SARS-CoV-2阳性筛查中，已得到广泛应用。当下市场上的抗原自测试剂盒多数依托胶体金免疫测流层析技术，灵敏度低限制了其应用场景。 量子点（QDs）具有吸收光谱宽、斯托克斯位移大、荧光强度高和生物毒性低的优势，是一类理想的荧光探针，在生化分析领域得到广泛应用。据研究，荧光法的灵敏度是比色法的10~100倍，荧光免疫分析有望提升病毒抗原检测的灵敏度。本研究构建的比率荧光法采用Si-Mn:ZnSe NPs双发射探针，相当于在检测系统中添加了一项内标校准，解决了单发射探针强度受环境变化、探针浓度变化和仪器波动的影响较大的局限性，具有灵敏度高、稳定性好的优点。图2：（A）Si-Mn:ZnSe NPs探针构建；（B）比率荧光ELISA法检测SARS-CoV-2 S蛋白原理。通过形成固定化CAT的免疫复合物，可将检测S蛋白含量转化为检测体系内H2O2含量。 根据上述原理图，该团队通过Si dots和Mn:ZnSe QDs的自组装作用制备了Si-Mn:ZnSe NPs探针。首先考察了Si-Mn:ZnSe NPs的荧光强度对H2O2浓度的响应。随着H2O2浓度从0μmol/L增加到50μmol/L, Si-Mn:ZnSe NPs在610nm处的荧光被明显猝灭，而440nm处的荧光没有明显变化。这证明通过比率荧光的方法检测体系中的H2O2浓度是可行的（图3）。过氧化氢酶（CAT）可以催化H2O2分解，因此，CAT介导的ELISA可以用于S蛋白的免疫分析。图3：Si-Mn:ZnSe NPs对H2O2响应的荧光光谱 在最优反应条件下，S蛋白浓度与Si-Mn:ZnSe NPs的荧光强度比呈线性关系。如图4A和4B所示，随着S蛋白浓度从0.05ng/mL增加到300ng/mL, Si-Mn:ZnSe NPs在610nm处的荧光发射强度逐渐增强。如图4C所示，lg（S）与荧光信号比（F610/F440）在0.05~10ng/mL范围内呈良好线性关系（y = 0.2318x + 0.3378, R2 = 0.9904）。图4D显示，S蛋白浓度与荧光信号比（F610/F440）在5~50ng/mL范围内呈良好线性关系（y = 0.0116x + 0.4479, R2 = 0.9987）。本方法对S蛋白检出限为0.032ng/mL。图4：不同浓度SARS-CoV-2 S蛋白存在下Si-Mn:ZnSe NPs的荧光光谱（A）与信号比（B）；SARS-CoV-2 S蛋白浓度与荧光信号比的线性拟合（C-D） 前期工作中，该团队将SARS-CoV-2 S蛋白整合到HIV假病毒合成系统中，构建SARS-CoV-2 S蛋白假病毒（ACS Appl. Mater. Interfaces, 2021, 13, 21, 24477-24486.）。 本研究以上述SARS-CoV-2 S蛋白假病毒作为实际样本模型考察了本方法的准确性与重现性，并与商品化试剂盒检测结果进行对比（图5）。结果显示，所建比率荧光ELISA法测定的S蛋白浓度与商品化试剂盒相似，表明该方法具有较高准确性。构建VSV-G假病毒作为阴性对照，采用比率荧光ELISA法检测SARS-CoV-2假病毒和VSV-G假病毒中的S蛋白，结果如图6所示，10组SARS-CoV-2假病毒均有检出，而10组VSV-G假病毒均无检出，表明该方法对SARS-CoV-2 S蛋白检测具有较高的特异性。图5：商品化试剂盒和本方法测定SARS-CoV-2假病毒S蛋白的结果。n.s.表示不显著，*表示p＜0.05。图6：比率荧光ELISA法检测SARS-CoV-2假病毒和VSV-G假病毒S蛋白的结果 本研究以水热法制备了Si dots，水浴法制备了Mn:ZnSe QDs，通过二者静电相互作用自组装合成具有良好pH稳定性和光稳定性的Si-Mn:ZnSe NPs。H2O2可以特异性猝灭探针位于610nm处的荧光而对440 nm处的荧光无影响。在ELISA体系中，通过固定化CAT免疫复合物巧妙地将检测S蛋白浓度转化为检测体系内H2O2浓度。结果显示，在0.05~10ng/mL和5~50ng/mL浓度范围内，S蛋白浓度与荧光信号比（F610/F440）呈良好线性关系，检出限为0.032ng/mL。构建SARS-CoV-2假病毒作为实际样本模型，所构建方法的检测结果与商品化试剂盒相当。综上，所构建的比率荧光ELISA方法对SARS-CoV-2 S蛋白具有较高准确性和特异性，可作为一种新型诊断方法协助病毒感染筛查。

背景介绍2022年8月1日，由国家药品监督管理局发布YY/T 1805.3-2022《组织工程医疗器械产品 胶原蛋白 第3部分：基于特征多肽测定的胶原蛋白含量检测 液相色谱-质谱法》医疗器械行业标准正式实施。该标准适用于组织提取纯化的胶原蛋白及其胶原类产品中不同类型胶原蛋白特征多肽含量的测定，并规定了液相色谱-质谱法测定不同类型胶原蛋白特征多肽含量的方法。该标准由全国外科植入物和矫形器械标准化技术委员会组织工程医疗器械产品分技术委员会（SAC/TC110/SC3）归口，岛津中国创新中心使用LCMS-8050参与了新标准的研制和验证工作，助您一起轻松应对新标准的应用。胶原蛋白检测新标准来袭，您准备好了么？标准解读胶原蛋白具有良好的生物降解性、生物相容性和弱抗原性，成为应用最为广泛的生物材料之一。胶原蛋白产品属于大分子，可用液相色谱法、MALDI质谱法，凝胶电泳法对其整体性能进行表征。但不同动物来源及不同类型的胶原蛋白的结构、分子量、等电点等理化性质较为相似，上述传统方法对胶原内部精细结构的变化识别能力有限，无法实现胶原类别的精准鉴别。本标准基于液相色谱质谱特征多肽法可实现不同动物来源不同类型的胶原蛋白的定性和定量检测，为胶原蛋白产品的定性及纯度判别提供了依据。胶原蛋白是大分子纤维状蛋白，具有三螺旋结构，本标准采用热变性处理使其三螺旋结构解旋并溶解，胰蛋白酶酶解后对不同类型胶原的特征肽进行检测。为了减少质谱分析时基质的干扰并提高方法的准确性，本标准采用内标法进行定量。本标准的颁布对不同类型胶原产品进行精准鉴别、规范动物源胶原的监管、提高胶原产品的理化表征能力和生物安全性等方面具有深远的意义。图1.《组织工程医疗器械产品 胶原蛋白第3部分：基于特征多肽测定的胶原蛋白含量检测 液相色谱-质谱法》医药行业标准发布稿特征多肽法的原理：筛选已知序列目标蛋白中特有且稳定存在的肽段，利用液质联用技术检测该肽段含量从而推算目标蛋白的含量。该方法通常使用胰蛋白酶特异性地酶解精氨酸和赖氨酸的C末端，生成具有碱性氨基酸末端的多肽，因此具有较强的方法专属性和检测灵敏度。目前特征多肽法已成功应用于胶类中药的真伪鉴别，食品中过敏原的检测以及乳品中A2 β-酪蛋白的含量测定等工作中。岛津解决方案岛津三重四极杆液相色谱质谱联用仪LCMS-8050采用全新设计的加热ESI源和新型碰撞池UFsweeperⅢ，大幅提高了灵敏度。在确保数据准确度和精度的同时，LCMS-8050可实现555 ch/sec的高速MRM采集和5 msec的正负极性切换。即便对于未完全分离的色谱峰，LCMS-8050也可实现定量离子、参比离子和内标离子充分的采集。Skyline软件是由西雅图华盛顿大学的MacCoss团队开发的一款蛋白质靶向分析的专业软件，实现了从蛋白质到多肽再到MRM离子对检测列表的转化。其独特的保留时间预测功能以及碰撞能量预测功能使得多肽分析方法的开发变得更加便捷。岛津LabSolutions工作站与Skyline软件无缝衔接，是靶向蛋白质定量方法开发的得力工具。分析仪器表1. 猪I型胶原蛋白特征多肽MRM检测参数*定量离子对猪I型胶原蛋白特征多肽对照品的典型色谱图见图2，二级质谱图见图3。图2. 猪I型胶原蛋白特征多肽对照品典型色谱图图3. 猪I型胶原蛋白特征多肽对照品典型二级质谱图结 论胶原基生物材料中胶原蛋白的含量检测是胶原蛋白制品品质评价，工艺稳定性评价的重要要素。猪I型胶原海绵是一种重要的医用胶原制品，其主要成分猪I型胶原蛋白分子量逾40万，液质联用仪无法直接检测。本方法采用碳酸氢铵水溶液稀释并使用胰蛋白酶酶解。通过检测猪I型胶原特征肽的含量，折算出胶原海绵中猪I型胶原蛋白的含量。本法具有前处理操作简便，方法特异性好，精密度高等优点，方法稳定可靠，可在胶原医疗器械产品检测领域推广。-参考文献 -《YYT 1805.3-2022 组织工程医疗器械产品胶原蛋白第3部分：基于特征多肽测定的胶原蛋白含量检测——液相色谱-质谱法》

使用沃特世公司SYNAPT High Definition质谱系统， 利兹大学就所获得的结果发表文章 沃特世（Waters® ）公司(股票代码NYSE: WAT) 2007年12月3日宣布利兹大学爱斯布理Astbury结构分子生物学中心使用最近购买的沃特世公司SYNAPT High Definition MS™ (HDMS) 质谱系统，在Journal of the American Society of Mass Spectrometry (JASMS) 美国质谱协会杂志上发表了蛋白研究的成果。 Ashcroft实验室正在使用SYNAPT® HDMS质谱系统研究生物分子功能。在2007年12月刊的一篇文章中，利兹的研究人员描述了对几种蛋白，如细胞色素C和贝塔-2-微球蛋白，的成功分离和分析，Ashcroft希望该成就可以通向对某些生物过程的完全了解，如淀粉纤维形成，细菌纤毛集结以及病毒衣壳的装配，这些过程都与衰老症有关。 蛋白质被人体小心地折叠，经三维长链分子装配而成。当正确地被折叠时，蛋白调节正常身体功能。当某些蛋白被折叠成特殊形状而变成错误折叠时，引起一系列反应，可导致自身聚集和淀粉纤维形成，因此一些高发疾病可能发生，包括老年痴呆症，疯牛病和帕金森氏综合症。在利兹大学，Alison Ashcroft艾利森艾斯克劳福特博士和她的同事Sheena Radford诗娜拉德福德教授就是研究这样一种蛋白，贝塔-2-微球蛋白，试图探索它是如何形成纤维，在透析病人的关节聚集，并与透析相关的淀粉样变性病有关。对这些过程在分子水平的完全了解将有助于治疗方法的设计。 新型质谱为生物学研究带来新领域 作为工具，常规质谱是区分不同质量蛋白质的优秀方法。然而，一个特定蛋白的不同构象或不同的折叠形式具有同一质量数，使用常规的方法是无法区分开来的。这就是沃特世公司SYNAPT HDMS质谱系统和镶嵌其中的离子淌度技术帮助利兹大学的方式。 “一个蛋白可以折叠成紧密的三维结构，或者在某些条件下，蛋白可以打开成伸展的结构。即使这些三维结构拥有相同的质量和质荷比(m/z)，SYNAPT HDMS的离子淌度功能可以分离这些蛋白，并告诉您多少蛋白在折叠的形式而多少在非折叠的形式。而且，由于两种蛋白构象的横截面积不同，因为能够基于形状分离，SYNAPT HDMS质谱系统使我们能够区分各种不同的蛋白形状。 ”结果确实令人惊奇。”Alison Ashcroft艾利森艾斯克劳福特博士说，她是生物分子质谱研究员，质谱室主任。 来自沃特世公司的SYNAPT 质谱系统为实验室带来研究聚集过程的新的洞察力。“它为我们的研究提供新一维的空间。我们现在可以对原始状态的蛋白质定量，也可对非折叠或部分折叠的蛋白进行定量。我们也可以监测某种特定的蛋白构象在聚集过程被消耗。这为生物分子在分子水平如何工作提供了重要的新层面。”艾斯克劳福特博士补充道。 沃特世公司于2006年6月在美国西雅图美国质谱年会上推出SYNAPT HDMS质谱系统。它是第一台商业化的，在质量之外，基于尺寸，形状和电荷数分析离子的质谱。 一个管理万亿字节科学数据的决策 在生物技术和生物科学院(BBSRC) 和维尔康姆信托的资助下，艾斯克劳福特实验室拥有五台不同形式的质谱仪器，而管理其产生的数据是一个巨大的挑战。为了更有效地管理数据文件，该实验室选择沃特世公司NuGenesis Scientific Data Management System (SDMS)科学数据管理系统。 “每天在DVD上备份数据已经不需要了。科学数据管理系统SDMS 每天一次从五台质谱仪上将数据自动备份，我们的研究生和博士后可以直接从他们办公室的计算机上看到数据。存档文件对我们很重要，因为政府资助部门要求我们自建成之日起存储五或十年的数据。研究生花四年的时间拿到博士学位，所以他们需要四年或更长时间查看数据，特别是如果在拿到博士学位后要写文章” 艾斯克劳福特博士评论道。 “非分析化学背景的人们认为一台质谱就是一个复杂的称重机器。通常他们没有意识到使用这台仪器可以看到蛋白功能和行为。但是当他们发现了之后，会感到无比惊奇。”艾斯克劳福特博士说。 艾斯克劳福特博士在美国质谱协会杂志的文章全文参考: Monitoring co-populated conformational states during protein folding events using ESI-IMS-MS, D. P. Smith, K. Giles, R. H. Bateman, S. E. Radford,A. E Ashcroft, J. Am. Soc. Mass Spectrom., 2007 Dec 18 (12): 2180 – 90, DOI:10.1016/j.jasms.2007.09.017 文章再版要求请寄至A. E. Ashcroft 博士, Astbury Centre for Structural Molecular Biology, Astbury Building, Faculty of Biological Sciences, University of Leeds, Leeds LS2 9JT UK，或发电子邮件email: a.e.ashcroft@leeds.ac.uk 关于利兹大学生物科学系，请浏览(http://www.fbs.leeds.ac.uk/) 利兹大学的生物科学系是英国最大的生命科学研究团体之一，拥有将近一百五十名学者和四百多名博士后和研究生。该系目前活跃的研究基金约六千万英镑，资助者包括慈善，研究院，欧盟和企业。该系拥有杰出的研究成果，在上一期政府研究评价检查(HEFCE)中，所有主要评估项目均获得第五级。 关于利兹大学爱斯布理Astbury中心， 请浏览(http://www.astbury.leeds.ac.uk/) 爱斯布理Astbury结构分子生物学中心是利兹大学一个跨学科研究中心。成立该中心的目的是在结构分子生物学的各个领域从事国际水平的研究课题。Astbury中心汇集了五十多位来自利兹大学各学科的学者，拥有共同的学术兴趣。该中心以 W.T.Astbury 的名字命名，他是生物物理学家，在利兹大学长期从事科学研究(1928-1961)，工作期间在该领域成立了多个基金会。 艾利森艾斯克劳福特博士，(http://www.astbury.leeds.ac.uk/facil/mass.htm) 是生物分子质谱研究员，利兹大学，生物科学系，爱斯布理Astbury结构分子生物学中心质谱室主任。她的研究着重于开发和使用质谱方法探索生物分子功能。 诗娜拉德福德教授，(http://bmbsgi10.leeds.ac.uk/)，是利兹大学，生物科学系，爱斯布理Astbury结构分子生物学中心结构分子生物学教授。她的研究着重于蛋白质折叠，非折叠和聚集机理。 生物技术和生物科学研究院(BBSRC) (www.bbsrc.ac.uk)是英国生命科学资助机构。 政府投资的生物技术和生物科学研究院BBSRC 每年在很大范围的研究领域投资三亿八千万英镑，为英国国民的生活质量做出突出贡献。 维尔康姆信托(www.wellcome.ac.uk)是英国最大的慈善机构。它资助英国国内和国际创新生物医学研究，每年投资额在五亿英镑左右。 (Waters, SYNAPT, High Definition MS, High Definition Mass Spectrometry, NuGenesis 和 HDMS 是沃特世公司商标。)

2020年7月29日，四川大学生物治疗国家重点实验室作为第一作者单位和通讯作者单位，在Nature 在线发表题为“A vaccine targeting the RBD of the S protein of SARS-CoV-2 induces protective immunity”的研究论文，这也是Nature杂志发表的首篇新冠疫苗研究论文。研发团队的研究目标是开发出一款通过重组蛋白候选新冠疫苗。在该研究中通过非人灵长类等动物模型的实验表明，这款疫苗能诱发强烈的针对新冠病毒SARS-CoV-2所产生的保护性免疫应答以及产生能够病毒中和抗体。S蛋白是存在于冠状病毒的一类很大的突刺糖蛋白，本研究中，科学家们使用S蛋白的多个不同部分制作了多款候选疫苗，经过测试和比较，他们最终确认，相比S蛋白的细胞外结构域蛋白（ECD）、S1亚基和S2亚基，RBD作为免疫原有最大的病毒中和活性。研究小组最终使用了RBD中编号为319-545的一段氨基酸序列，通过重组蛋白的方式制备新冠疫苗的抗原。研究人员利用了昆虫细胞和杆状病毒表达系统，从细胞培养液中分离提纯了该蛋白，并利用上海勤翔Clinx ChemiScope化学发光成像系统进行了鉴定。（通过Superdex 200凝胶分离柱上重组RBD蛋白的代表性洗脱色谱图。 插图显示洗脱的RBD样品的SDS-PAGE和蛋白质印迹分析）（小鼠或兔子血清对SARS-CoV-2假病毒感染的中和作用） A图： 将含有SARS-CoV-2假病毒的上清液与来自小鼠的血清预热，将其血清稀释2倍。 在37°C下温育1小时后，将混合物添加到ACE2转染的293T（293T / ACE2）细胞中以检测病毒的感染性。通过荧光显微镜和流式细胞仪确定感染细胞中绿色荧光蛋白（GFP）表达的数量。 三组图片分别是Sera/ RBD组（首次疫苗接种后第14天，用RBD疫苗免疫的5只小鼠的血清）和Sera / PBS组（用PBS作为对照的小鼠的血清），未治疗（感染SARS-CoV-2伪病毒而没有血清）。 B图：在首次免疫后14天，使用与A相同的方法，从兔子的血清中和SARS-CoV-2假病毒的感染。（诱导抗SARS-COV-2中和抗体在转基因hACE2小鼠和野生型小鼠中的活性）与单独用PBS组处理相比，在存在氢氧化铝的情况下，每只小鼠在50μl中用10μg重组RBD蛋白接种免疫转基因hACE2小鼠和野生型小鼠。第二次接种为14天后，从小鼠收集血清。为了评估SARS-COV-2感染的中和作用，将Vero E6细胞（5×10 4）预加载至96孔板中并生长过夜。将100 TCID50（50％组织培养感染剂量）的SARS-CoV-2与等体积的稀释血清预孵育，然后添加到细胞中。在37°C下温育1小时后，将混合物添加到Vero E6细胞中。在显微镜下记录细胞病变效应（CPE），并计算导致完全抑制的血清稀释液的中和滴度。该研究发现由S-RBD结构域319-545氨基酸残基构成的重组疫苗，可在接受单剂接种7或14天之后的小鼠、兔和非人灵长类动物（猕猴）中诱导有效的功能抗体应答。免疫动物的血清在体外阻断了RBD结合域与细胞表面ACE2受体的结合，并中和了SARS-CoV-2假病毒和SARS-CoV-2活病毒的感染。重要的是该疫苗还为受SARS-CoV-2病毒感染的非人类灵长类动物提供了保护，在受到SARS-CoV-2病毒感染的病人体内检测到特异性结合RBD的抗体含量的升高。 几种免疫途径和CD4tT淋巴细胞参与了疫苗抗体反应的诱导。在接种了疫苗的小鼠和猴子没有观察到抗体依赖性肺炎增强或加速出现肺炎的不良反应，因此重组RBD蛋白疫苗是重要的新冠疫苗选择之一。 参考资料：[1] Jingyun Yang et al., (2020) A vaccine targeting the RBD of the S protein of SARS-CoV-2 induces protective immunity. Nature. 背景：新冠肺炎疫情全球蔓延，对人类健康和社会秩序带来巨大挑战。截至目前（8月4日），据约翰霍普金斯大学发布的实时统计数据，全球累计新冠肺炎确诊病例超过1800万例，死亡人数达69万。目前对于新型冠状病毒所致疾病没有特异治疗方法，迫切需要有效的预防这种病毒的疫苗，通过对人群预防接种获得对新冠病毒的免疫力。虽然目前尚未有新冠疫苗正式上市，但在全球抗疫的大背景下，各国都在努力让疫情能够尽快过去。据世界卫生组织7月20日更新的数据显示，目前全球至少有24种新冠病毒疫苗已进入临床研究阶段，另有142种候选疫苗处于临床前研究阶段，为对抗新冠肺炎所作出积极贡献。

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冷冻干燥蛋白酶是在生物制药、生物化学实验和分子生物学研究等领域中常见的操作，该过程能够保留蛋白酶的活性，延长其保存时间。以下是冷冻干燥蛋白酶的一般操作流程：1. 准备工作：选择蛋白酶： 根据实验需求选择合适的蛋白酶，确保其适用于冷冻干燥的过程。准备样品： 准备含有蛋白酶的溶液。注意溶液的浓度和成分，确保其适用于冷冻干燥处理。 2. 冷冻：样品冷冻： 将蛋白酶溶液以合适的体积倒入冷冻盘或其他冷冻容器中，然后放入冷冻设备冷阱室中，确保冷冻过程中样品均匀冷却。冷冻温度： 控制冷冻温度，通常是零下温度，使蛋白酶迅速冻结。 3. 冷冻干燥：转移： 将冷冻的样品迅速从冷阱室内转移到冷冻干燥机的干燥架上。真空抽气： 启动冷冻干燥机的真空泵，建立真空环境，抽除样品中的水分。升温阶段： 开始升温（提供样品中水分升华时所需的热量），使蛋白酶在真空条件下升华，从而去除水分。等温阶段： 在升温后的一定温度下保持稳定，确保样品中的水分充分升华。 4. 收集和存储：冷冻干燥结束： 当冷冻干燥结束后，停止真空，关闭冷冻干燥机。收集样品： 从冷冻干燥机中取出样品。注意避免受潮，尽快妥善保存。存储： 将冷冻干燥后的蛋白酶样品存储在防潮、密封的容器中，最好在-20°C以下的低温环境中保存，以确保长期稳定性。 注意事项：操作过程中要防止样品过度升温，以免影响蛋白酶的活性。确保冷冻干燥机和其他设备的清洁和维护，以保证实验的准确性和重复性。操作过程中要避免样品受到空气湿度的影响，尽量在湿度低的环境中进行。这个操作流程是一般性的指导，具体操作可能因使用的冷冻干燥机型号和蛋白酶种类而略有不同。在操作过程中，请参考设备和试剂的使用说明书，确保按照正确的步骤进行操作。

通过车间生产方式制造肉、蛋、奶，变革了食物蛋白制造模式，实现高质量供给，替代蛋白的兴起和发展大大缓解了传统蛋白生产方式存在的问题。在5月18日举办的首届全国微生物蛋白技术创新及产业发展大会上，中国工程院院士、江南大学教授陈坚认为，作为替代蛋白的一种，微生物蛋白有助于提升人类健康水平、改进地球生态质量。随着技术进步，替代蛋白产业发展的春天已经到来。　　食物蛋白是人类重要的营养物质，现有的蛋白供应主要依赖于种植业和养殖业。随着人口增长和经济发展，到2050年食品蛋白需求将增长30%至50%，传统食品蛋白供给在数量、质量和可持续方面正面临着严峻考验，如何提高蛋白生产和转化效率，构建可持续的高品质蛋白供给模式迫在眉睫。　　践行“大食物观”向微生物要蛋白　　替代蛋白包括动物细胞蛋白、植物蛋白、微生物蛋白、藻类蛋白和昆虫蛋白等多种类。陈坚介绍，微生物蛋白是利用可再生物质原料等为底物，通过在发酵罐中培养微生物的方式制造蛋白，与传统畜禽养殖生产方式相比，产生的温室气体更少，占用耕地面积更小，在资源消耗和环境影响等方面更加高效环保。　　微生物蛋白合成效率是传统养殖方式获取蛋白效率的上千倍。据介绍，以1000平方米面积为例，种植大豆每年可以生产1.1吨蛋白，满足40人的需求；而通过二氧化碳发酵微生物技术每年能够生产15吨蛋白，满足520人的需求，生产效率大幅提升。　　据波士顿咨询公司测算，到2035年，替代蛋白市场规模有望达到2900亿美元，微生物发酵蛋白市场份额将达到22%。　　陈坚表示，替代蛋白发展的战略意义远超单纯的食品创新。目前，我国蛋白供给还存在动物蛋白缺口较大、优质蛋白自给率不足等问题，需继续开发优质蛋白资源，提高食物蛋白自给率。　　随着人们生活质量的不断提升，消费者对优质蛋白、肉等食品的需求逐步增加，生产替代蛋白是解决肉类资源紧缺的有效途径之一。陈坚认为，发展微生物蛋白产业是落实“大食物观”碳减排和解决优质食品蛋白供给问题的重要途径，是新质生产力的典型代表。　　据介绍，针对当前食品加工粗放、营养缺乏人群针对性、膳食结构不合理等问题，微生物蛋白在营养、口感等方面具有一定优势。如酵母蛋白含有人体全部必需的氨基酸，属于全价蛋白，营养丰富，能够满足人体营养需求，没有豆腥味，而且无致敏成分，适用人群广泛。　　科技创新 构建多元化蛋白供给体系　　利用更少的资源产出更多的蛋白，微生物蛋白具有生产效率高且二氧化碳排放少的优势。陈坚介绍，目前，全球已有超过80家公司从事微生物菌体蛋白的生产。作为重要的替代蛋白，微生物蛋白的高效制造和规模化应用是构建多元化蛋白供给体系，实现可持续蛋白供给的重要途径。　　陈坚认为，微生物蛋白一方面可以作为主要蛋白生产原料，从成本、可持续、生产效率等方面解决肉、蛋、奶产业链中的关键蛋白供给难题；另一方面，还可以作为功能蛋白生产配料，作为细胞工厂通过精密发酵获取高附加值的蛋白，从而在口味、口感、营养等方面提升产品品质。　　作为食品领域的前沿技术，市场需求是推动替代蛋白发展的动力。据了解，当前“人造肉”在风味、口感、品质等方面仍与真实肉存在较大差异。植物肉缺乏真实肉中的纤维结构，肉质疏松是导致其口感和品质较差的主要原因。而微生物蛋白的发展为人造肉外观、风味、口感、品质等特性的提升提供了新方法。　　 例如，植物肉中存在醇、醛等挥发性物质，导致其具有一定的豆腥味。使用醇、醛脱氢酶将醇、醛等挥发性物质分解，可以显著提高植物肉的风味。一些特定的人群对植物蛋白肉过敏，筛选特异性的蛋白酶能够将植物肉中特定的过敏原降解，使其分解成为氨基酸和短肽，在去除过敏原的同时保留其营养成分。　　“目前，我们正在建立微生物蛋白菌种库，筛选出一批原料廉价、生长速度快、蛋白含量高的菌种，加快生产多种不同类型的蛋白，满足不同应用场景的需求。”陈坚建议，行业发展应该以满足居民多元化消费需求为导向，通过科技创新，优化蛋白品种和品质，满足人民日益增长的美好生活需要。

新品一：3D空间组，真正3D成像的原位空间组，告别2D时代！新品二：30个免疫蛋白检测panel--通过蛋白核酸偶联技术实现多个免疫蛋白的共检！新品三：FFPE样本的超高分辨率空间组学检测，让久远临床宝藏样本重见天日、回顾性队列分析如虎添翼！ 鲲羽生物立足基因原位测序（in situ sequencing）和原位杂交(in situ hybridization)技术的研发和应用。核心成员从事相关研究20年，拥有本细分领域国际一流的核心技术和知识产权。作为少数从事基因原位检测的研发型公司，鲲羽生物以解码生命空间奥秘、革新临床精准诊断为目标，结合基础科研和临床发展实际需要，重视研发不断拓新，在前期快速DNA FISH试剂盒/RNA FISH试剂盒/原位空间测序技术服务及自动化杂交、成像仪器的基础上，隆重推出新品三连发！20233D空间组重磅来袭2022年，空间组学技术被国际顶级学术期刊《Nature》评为年度七大颠覆性技术；2023年，世界经济论坛发布《2023年十大新兴技术报告》，空间组学与柔性电池、人工智能辅助医疗、可持续航空燃料等创新技术被评为最有潜力、对世界产生积极影响的十大技术。然而目前市场上的空间组学仅是基于一张切片来检测的2D空间组。鲲羽生物推出两种3D空间组：一种通过连续或半连续切片做2D检测后，将多张切片成像数据对准后实现厚组织的检测；第二种是对厚组织直接透明检测成像，在获取X轴和Y轴信息基础上，同步获得Z轴信息，实现真正三维空间组的检测！小脑三维空间图谱构筑斑马鱼端脑三维空间图谱构筑202330个免疫蛋白检测panel--蛋白基因偶联检测重磅来袭蛋白是生命活动功能的主要执行者，过去的研究通过绘制转录表达谱来推测单细胞中相关的蛋白丰度，但大量数据显示这两者的相关性较差。传统的免疫荧光检测通量受限于二抗属源或染料数目，然而仅凭少数蛋白难以对细胞身份及功能进行注释。目前大尺寸的研究单细胞及空间分辨率的蛋白图谱依旧具有挑战性。鲲羽生物历经多年专研打磨，突破分辨率、灵敏性、特异性、大视野等限制，推出单细胞分辨率高灵敏高保真大视野的寡核苷酸抗体多重免疫组合空间蛋白组学。其主要原理是将特定抗体和特定核酸序列进行偶联，将蛋白信息转化为核酸序列信息，通过检测抗体偶联上的核酸序列从而获得蛋白的原位表达图谱。目前已实现在一张切片上检测30个免疫蛋白和多个RNA分子的同时检测，深度解析免疫微环境，助力免疫方向的临床诊断和科学研究！2023FFPE样本的超高分辨率空间组学检测重磅来袭FFPE（formalin fixation and paraffin embedding）样本是指福尔马林固定后经石蜡包埋的组织样本。过去几十年中，按照此方法保存了大量的生物样本。FFPE样本承载着众多疾病信息，是当之无愧的病理“瑰宝”。但是FFPE样本取材不严格，存放时间长，存放条件不稳定等因素，增加了RNA检测的困难，大大制约了珍贵样本的信息挖掘。鲲羽生物自主研发的原位检测技术对存放一年以上的FFPE样本仍有极佳的检出效果。 目前鲲羽生物已助力客户在Cell、Nat Commun、Dev Cell、Nat Plants等知名学术期刊上发表文章。鲲羽生物目前已拥有多种DNA、RNA、蛋白原位检测产品以及高通量自动化FISH操作与成像平台、原位测序仪器等，拥有完全自主的基因原位检测相关技术核心知识产权多项，打破了国外在新一代单细胞组学技术的垄断，推动民族生物原始创新技术走向世界、服务全球。鲲羽已助力客户在 Cell、Nat Plants、Dev Cell、Nat Commun、SciAdv、Elife 等国际顶流期刊发表多篇文章。

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大家好，本周为大家分享一篇发表在Nat. Commun.上的文章：Structure and dynamics of endogenous cardiac troponin complex in human heart tissue captured by native nanoproteomics ，文章的通讯作者是威斯康星大学麦迪逊分校的葛瑛教授。　　蛋白质大多都是通过组装成蛋白复合物来执行特定的生物功能，因而表征内源性蛋白复合物的结构和动力学将有助于生命过程的理解。蛋白复合物在其组装、翻译后修饰(Post-translational modifications，PTMs)和非共价结合等方面是高度动态的，在native状态下通常以低丰度存在，这给研究其结构和动态性的传统结构生物学技术(如X-ray和NMR)带来了巨大的挑战。非变性Top-down质谱(nTDMS)结合了非变性质谱和Top-down蛋白组学的优势，目前已发展成蛋白复合物结构表征的有力工具，可以保留蛋白质亚基-配体间的非共价作用和PTMs等重要信息。然而，由于内源性蛋白复合物自身的低丰度特性，导致对其的分离纯化和检测非常困难，所以nTDMS目前仅限用于过表达的重组或高丰度蛋白质的表征。在本研究中，作者开发了一种非变性纳米蛋白质组学(Native nanoproteomics)技术平台，通过使用表面功能化的超顺磁性纳米颗粒(Nanoparticles，NPs)直接富集组织中的蛋白复合物，然后再利用高分辨质谱表征其结构和动态性。这里选用心肌肌钙蛋白(Cardiac troponin，cTn)异源三聚体复合物(~77 kDa)作为研究对象。cTn三聚体复合物是调节横纹肌肌动蛋白收缩的Ca2+离子调节蛋白，由TnC、cTnI和cTnT这3个亚基组成。其中，TnC是Ca2+结合亚基，cTnI是抑制肌动蛋白-肌球蛋白相互作用的亚基，而cTnT细丝锚定亚基。TnC与Ca2+的结合，以及cTnI 亚基的磷酸化，会共同引起细丝上的分子级联事件，诱导心肌收缩所必需的肌动蛋白-肌球蛋白交叉桥的形成。传统结构生物学技术不能有效捕获cTn复合物高度动态的构象变化，并且先前研究用的cTn复合物是由原核细胞表达的，缺乏PTMs的信息。因此，作者开发了native纳米蛋白组学的方法，以实现对人内源性cTn复合物结构和动力学的全面表征。作者首先使用肽功能化的超顺磁性氧化铁NPs富集了人心脏的内源性cTn复合物，同时优化了非变性蛋白提取缓冲液(高离子强度LiCl溶液，生理pH)。富集到的cTn复合物中的3种亚基的含量比例为1:1:1，真实反应了肌节cTn异源三聚体复合物的组成。作者也发现含有750 mM L-Arg，750 mM咪唑和50 mM L-Glu(pH 7.5)的溶液对蛋白复合物的洗脱效果最好，并且不会破坏亚基间的相互作用。该富集方法具有很好的重现性，proteoforms信息得到很好保留，且可以直接用于化学计量分析。总的实验流程如图1所示，洗脱后的cTn复合物经体积排阻色谱(Sze-exclusion chromatography，SEC)除盐和交换至醋酸铵溶液中，随后对cTn复合物进行多种nTDMS分析：1)在线SEC监测复合物 2)超高分辨傅里叶变换离子回旋共振质谱(FTICR-MS)表征复合物的化学计量比和proteoforms 3)捕获离子淌度质谱(TIMS-MS)解析调控复合物构象变化中的非共价作用的结构动态性。　　图1. 用于表征人心脏中内源性cTn复合物的native纳米蛋白组学平台。　　为了全面表征内源性cTn复合物，作者使用FTICR-MS进行proteoforms测序和复合物表征。图2展示了native状态下检测丰度最高的cTn复合物的电荷态(19+)，其中包含了4种独特的proteoforms，这些复合物主要带有单磷酸化的cTnT、单磷酸化和双磷酸化的cTnI，以及结合了3个Ca2+的TnC。这些结果表明人cTn复合物在肌节中以结构多样化的分子组成存在，具有高度异质的共价和非共价修饰，可产生一系列不同的完整复合物。　　图2. FTICR-MS分析展示的cTn复合物状态。红色方框中是最高丰度电荷态(19+)的放大谱图，理论同位素分布(红色圆圈)可以与谱图很好叠加，说明结果具有高质量精度(质量偏差在2 ppm 以内)。　　作者接着对cTn复合物进行complex-up分析，以研究复合物的化学计量比及其组成。图3a~3b分别显示的是完整cTn三聚体复合物，以及经CAD碎裂后的蛋白亚基谱图。但这里没有检测到cTnI单体，可能是因为cTnI和TnC在native状态下的亲和力很强，且cTnI单体带的电荷不多，导致其在高m/z区域出峰，所以不易被检测到.随后，作者又对解离出的亚基进行complex-down分析。图3c展示了检测到的cTnT的多种proteoforms：未磷酸化的 cTnT、单磷酸化的cTnT(p cTnT)和 C 端 Lys 截断的磷酸化cTnT(pcTnT [aa 1-286])，CAD碎裂谱图也发现cTnT的C端较N端更易暴露在外界溶剂中。图3e则是cTn(I-C)二聚体的谱图，共检测到6种具有不同数量Ca2+结合和磷酸化的proteoforms。二级谱图可将cTnI的两个磷酸化位点准确定位在Ser22和Ser23，同时发现cTnI序列两端都较内部区域更易暴露于溶剂中。但还无法通过nTDMS准确推断Ca2+结合和磷酸化是如何影响cTn复合物的稳定性。作者在此也没有优化FTICR-MS在非常高m/z范围的离子检测，所以也会遗漏带少量电荷的cTn复合物信息。　　图3.nTDMS表征人心脏来源的cTn复合物。(a~b)完整cTn复合物和经CAD碎裂后的亚基谱图 (c~d)cTnT单体及其代表性的CAD碎裂谱图 (e~f)cTn(I-C)二聚体及其代表性的CAD碎裂谱图。　　人TnC蛋白含有3个钙结合EF-hand基序(结构域 II~IV)。结构域 II与Ca2+结合的亲和力较低，是触发心肌收缩的调控域。结构域 III 和 IV则与Ca2+具有强的亲和力，在心肌舒张和收缩时均始终保持与Ca2+充分结合，但结构域 II只有在收缩时才被Ca2+占据。这里观察到了TnC分别与0、1、2和3个Ca2+结合的情况，通过CAD碎裂也进一步定位了TnC与Ca2+结合的具体氨基酸序列(图4)。研究发现结构域 II的骨架最容易发生碎裂，而结构域 III的骨架最难碎裂。目前结构域 II~IV的序列在UniprotKb中分别对应65DEDGSGTVDFDE76、105DKNADGYIDLDE116和141DKNNDGRIDY152。这里分别将与1、2和3个Ca2+结合的TnC隔离出来进行CAD碎裂(m/z分别为2312、2316和2321)，可以更准确地将结构域 III、II和IV的序列分别定位到113DLD115、141DKNND145和73DFDE76(图4c)，表明非变性纳米蛋白组学方法在定位非共价金属结合方面具有高分辨能力。　　图4.nTDMS定位 TnC与Ca2+结合的结构域。(a)FTICR-MS隔离与不同数量Ca2+结合的TnC单体 (b~c)与两个Ca2+结合的TnC的CAD碎裂谱图，蓝色、红色和黄色方框分别对应结构域 II 、III和IV。　　Ca2+与TnC的结合会对cTn复合物的功能和构象有着很大影响。cTn复合物的核心区维持着构象的稳定，但当Ca2+与TnC发生结合时，其柔性区会经历广泛的构象变化，复合物结构会从“closed”状态转变成“opened”状态，这会促进肌动蛋白和肌球蛋白间的相互作用，最终导致心肌收缩。然而，传统结构生物学技术很难捕获cTn复合物与Ca2+结合时的构象变化。因此，作者使用离子淌度质谱来分析cTn复合物的构象变化。TnC亚基和与Ca2+结合的cTn(I-C)二聚体的淌度分离谱图如图5所示。与0~3个Ca2+结合的TnC的碰撞截面(Collision Cross-Section，CCS)值分别为1853、1849、1829和1844 Å2(图5a~5b)，TnC构象比IMPACT预测的更为紧凑，但cTn(I-C)二聚体的CCS值与预测的非常接近(图5c~5d)。作者推测TnC与两个Ca2+结合会形成更致密的构象，是因为在静息舒张时Ca2+与结构域 III 和 IV充分结合。当第三个 Ca2+与结构域II结合时，TnC转变为“opened”构象，使其N端与cTnI的C端相结合，进而引发心肌收缩(图5e)。cTn(I-C)二聚体与Ca2+结合时的构象变化也是如此(图5f)。　　图5.TnC单体(a~b)和与Ca2+结合的cTn(I-C)二聚体(c~d)的离子淌度分离谱图 (e~f)TnC和cTn(I-C)二聚体与Ca2+结合时的构象变化。　　最后，作者通过添加EGTA来剥离cTn复合物中的Ca2+，以进一步研究Ca2+在维持复合物结构稳定性上的作用。图6b~6c是没有EGTA孵育时的cTn复合物的TIMS-MS谱图。cTn复合物的CCS值与理论预测值非常符合。随着EGTA孵育浓度的增加(25、50和100mM)，Ca2+逐渐被螯合，cTn复合物的结构也越来越舒展，体现在平均电荷态逐渐增加，以及逐渐在较低m/z范围内出峰，这表明cTn复合物构象的稳定性丢失与EGTA浓度的增加相关(图6d~6f)。虽然100mM EGTA孵育也不敢保证Ca2+的完全剥离，并且cTnI的存在又会增强TnC与Ca2+的结合，但TIMS-MS为我们研究cTn复合物与Ca2+结合时的构象变化提供了一种切实可行的分析手段。　　图6.cTn复合物与EGTA孵育时的构象变化。(a)cTn复合物的构象随EGTA孵育浓度的增加发生改变 (b~c)cTn复合物的TIMS-MS谱图 (d~f)cTn复合物与不同浓度EGTA(25、50和100mM)孵育的谱图和CCS分析。　　总的来说，本研究开发了一种可用于内源性蛋白复合物富集和结构表征的非变性纳米蛋白组学方法，以获取其组装、proteoforms异质性和动态非共价结合等方面的生物信息。本文采用的功能化NPs可被灵活设计成选择性结合特定的靶蛋白，在富集和洗脱过程中可以很好保持其近似生理条件下的存在状态。更为重要的是，功能化NPs与nTDMS的整合可以作为一种强有力的结构生物学工具，可以作为传统技术的补充，用于内源性蛋白复合物的表征。　　撰稿：陈昌明 编辑：李惠琳文章引用：Structure and dynamics of endogenous cardiac troponin complex in human heart tissue captured by native nanoproteomics　　参考文献　　Chapman EA,Roberts DS, Tiambeng TN, et al. Structure and dynamics of endogenous cardiac troponin complex in human heart tissue captured by native nanoproteomics. Nat Commun. 2023 14(1):8400. Published 2023 Dec 18. doi:10.1038/s41467-023-43321-z