网织细胞计

摘要：细胞凋亡与坏死是两种完全不同的细胞凋亡形式，根据死亡细胞在形态学、生物化学和分子生物学上的差别，可以将二者区别开来。细胞凋亡的检测方法有很多，下面介绍几种常用的测定方法。一、细胞凋亡的形态学检测根据凋亡细胞固有的形态特征，人们已经设计了许多不同的细胞凋亡形态学检测方法。1. 光学显微镜和倒置显微镜(1) 未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。(2) 染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。2. 荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。常用的DNA特异性染料有：HO 33342 (Hoechst 33342)，HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI。三种染料与 DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用时用PBS稀释成终浓度为2~5mg/ml。DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用终浓度一般为0.5 ~1mg/ml。结果评判：细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状(rippled)或呈折缝样(creased)，部分染色质出现浓缩状态;Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化;Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体(图1）。 http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2013/08/A1376376278_small.jpg3 透射电子显微镜观察结果评判：凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations）的空泡结构(图2)；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。 http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2013/08/A1376376295_small.jpg二、磷脂酰丝氨酸外翻分析(Annexin V法)磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine, PS)正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中(图3)。Annexin-V是一种分子量为35~36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素(FITC、PE)或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2013/08/A1376376296_small.jpg方法1. 悬浮细胞的染色：将正常培养和诱导凋亡的悬浮细胞(0.5~1×106)用PBS洗2次，加入100 ul Binding Buffer和FITC标记的Annexin-V(20ug/ml)10 ul，室温避光30 min，再加入PI(50 ug/ml)5 ul，避光反应5 min后，加入400 ul Binding Buffer，立即用FACScan进行流式细胞术定量检测(一般不超过1 h)， 同时以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作为阴性对照。2. 贴壁培养的细胞染色：先用0.25%的胰酶消化，洗涤、染色和分析同悬浮细胞。3. 爬片细胞染色：同上，最后用荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜进行观察。结果 http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2013/08/A1376376298_small.jpg http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2013/08/A1376376300_small.jpg

http://gene.bjmu.edu.cn/news/ap1.gif 　　细胞凋亡与坏死是两种完全不同的细胞凋亡形式，根据死亡细胞在形态学、生物化学和分子生物学上的差别，可以将二者区别开来。细胞凋亡的检测方法有很多，下面介绍几种常用的测定方法。 一、细胞凋亡的形态学检测 　　根据凋亡细胞固有的形态特征，人们已经设计了许多不同的细胞凋亡形态学检测方法。 　　1 光学显微镜和倒置显微镜 　　（1） 未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。 贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。 　　（2） 染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割 成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。 　　2 荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜 　　一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。 　　常用的DNA特异性染料有：HO 33342 (Hoechst 33342)，HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI。三种染料与　DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。 　　Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用时用PBS稀释成终浓度为2~5mg/ml。 　　DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用终浓度一般为0.5 ~1mg/ml。　　结果评判：细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样（creased），部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体(图1)。 　　3 透射电子显微镜观察 　　结果评判：凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations）的空泡结构(图2)；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。

一、实验目的1、掌屋凋亡细胞的形态特征 　　2、学会用荧光探针对细胞进行双标记来检测正常活细胞、凋亡细胞和坏死细胞的方法二、实验原理 细胞死亡根据其性质、起源及生物学意义区分为凋亡和坏死两种不同类型。凋亡普遍存在于生命界，在生物个体和生存中起着非常重要的作用。它是细胞在一定生理条件下一系列顺序发生事件的组合，是细胞遵循一定规律自己结束生命的自主控制过程。细胞凋亡具有可鉴别的形态学和生物化学特征。在形态上可见凋亡细胞与周围细胞脱离接触，细胞变园，细胞膜向内皱缩、胞浆浓缩、内质网扩张、细胞核固缩破裂呈团块状或新月状分布、内质网和细胞膜进一步融合将细胞分成多个完整包裹的凋亡小体，凋亡小体最后被吞噬细胞吞噬消化。在凋亡过程中细胞内容物并不释放到细胞外，不会影响其它细胞，因而不引起炎症反应。在生物化学上，多数细胞凋亡的过程中，内源性核酸内切酶活化，活性增加。核DNA随机地在核小体的连接部位被酶切断，降解为180-200bp或它的整倍数的各种片断。如果对核DNA进行琼脂糖电泳，可显示以180-200bp为基数的DNA ladder（梯状带纹）的特征。相比之下，坏死是细胞处于剧烈损伤条件下发生的细胞死亡。细胞在坏死早期即丧失质膜完整性，各种细胞器膨胀，进而质膜崩解释放出其中的内容物，引起炎症反应，坏死过程中细胞核DNA虽也降解，但由于存在各种长度不等的DNA片断，不能形成梯状带纹，而呈弥散状。一些温和的损伤刺激及一些抗肿瘤药物可诱导细胞凋亡，通常这些因素在诱导凋亡的同时，也可产生细胞坏死，这取决于损伤的剧烈程度和细胞本身对刺激的敏感程度。三尖杉酯碱（HT）是我国自行研制的一种对急性粒细胞白血病，急性单核白血病等有良好疗效的抗肿瘤药物。研究表明HT在0.02~5μg/ml范围内作用2小时，即可诱导HL-60细胞凋亡，并表现出典型的凋亡特征。本实验用1μg/ml HT在体外诱导培养的HL-60细胞发生凋亡，同时也有少数细胞发生坏死。用Hoechst33342和碘化丙啶（propidium iodide，PI）对细胞进行双重染色，可以区别凋亡、坏死及正常细胞。细胞膜是一选择性的生物膜，一般的生物染料如PI等不能穿过质膜。当细胞坏死时，质膜不完整，PI就进入细胞内部，它可嵌入到DNA或RNA中，使坏死细胞着色，凋亡细胞和活细胞不着色。而一些活细胞染料由于为亲脂性物质，可跨膜进入活细胞，因而可进行活细胞染色。Hoechst33342是一种活性荧光染料且毒性较弱，它是双苯并咪唑的一种衍生物。与DNA特异结合（主要结合于A-T）碱基区），显示凋亡细胞和活细胞。凡是看到有凋亡小体的细胞都是凋亡细胞。三、实验用品1、试剂：三尖杉酯碱（HT），300μg/ml，100mmol/L Tris-HCl（pH7.5），5mol/L EDTA缓冲液、碱性裂解液：0.2mol/L NaOH, 1%SDS、醋酸钠：3mol/L KAc（pH4.8）；异丙醇；70%乙醇；溴酚蓝，蔗糖指示剂。TBE电泳缓冲液，1%琼脂糖，溴乙锭。PI母液：500μg/ml；Ho33342母液：2mmol/L。 　　2、仪器设备：荧光显微镜，电泳仪，电泳槽，微量加样器（1ml，100μl）0.5、1.5ml离心管，载玻片，盖玻片。四、实验材料人早幼粒白血病HL-60细胞，用含10%小牛血清的RPMI1640培养基在37℃，5%CO2条件下培养。五、方法步骤 1、三尖杉酯碱诱发HL-60细胞凋亡 　　（1）实验前约24小时，接种两瓶HL-60细胞，标记①、②，每瓶含约6ml培养液，置37℃，5%CO2培养箱培养。 　　（2）实验前约2.5小时，当细胞密度达到70%，①号瓶加入三尖杉酯碱200μl，使终浓度为1μg/ml，②号瓶中加入同等量PBS（pH7.4）作对照。共同放入培养箱中继续培养2.5小时。2、Ho33342和PI双重染色鉴别三种细胞 　　（1）染色：将瓶中的细胞摇匀取200μl于1.5ml的离心管中，加入Ho33342母液2μl，PI 20μl，染色15分钟。 　　（2）滴片：取一载玻片用双面胶围成一小室，从离心管中各取以上染色后的细胞悬液10μl，加入小室内盖上盖玻片，荧光镜下用紫外激发光，高倍镜下观察，区别三种细胞，并注意三者比例。六、注意事项1、诱导培养HL-60细胞时间要准确；　　2、荧光显微镜下观察细胞时，由于荧光易碎灭，观察时要尽量快。

西达本胺通过信号通路调节促进癌细胞凋亡在我国，西达本胺已获批作为PTCL临床用药。西达本胺属于苯酰胺类化合物，是我国自主研发的首个亚型选择性口服HDACI，国家食品药品监督管理局已批准其用于临床试验，其选择性抑制I类HDAC1、2、3亚型和II类HDAC10亚型，可抑制肿瘤细胞增殖、促进凋亡，阻滞周期、引发DNA损伤，还可以增强抗肿瘤免疫反应。与其他抗肿瘤药物相比，西达本胺疗效好、选择性高、不良反应少。西达本胺可激活死亡受体途径和线粒体凋亡途径诱导细胞凋亡，其中最为主要的是线粒体凋亡途径，该途径受Bcl-2家族介导的细胞色素C释放通路调控。抗凋亡蛋白Bcl-2表达受到抑制，促凋亡蛋白Bax表达上调，使线粒体膜电位降低，细胞色素C释放到细胞质中，Caspase途径被激活，细胞发生凋亡。例如：西达本胺增强B淋巴瘤细胞组蛋白H3、H4 乙酰化水平，使线粒体膜电位降低随后激活Caspase 3，促进细胞凋亡；在肾癌中，它可以下调Bcl-2表达，上调Bax表达，随着药物浓度增加引起786-O 细胞凋亡。西达本胺可以调控ROS水平。HDACI可以上调ROS水平，导致DNA双链损伤。研究证明，西达本胺作用于白血病细胞后，诱导细胞内ROS产生，细胞凋亡增加[17]。此外，在胰腺癌细胞系中，西达本胺明显增强细胞内ROS的产生，上调γH2AX（DNA双链断裂的标志物）表达水平，诱发细胞DNA损伤。西达本胺通过调控细胞周期蛋白（Cyclin）、细胞周期蛋白依赖性激酶（Cyclin-dependent kinases，CDKs）以及细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂（Cyclin-dependent kinases inhibition，CDKI）的表达阻滞细胞周期。例如，西达本胺使MM细胞系P21、P27的表达量增高，CDK4、CDK6、Cyclin D2表达量下降，阻滞MM细胞系于G1期[19]。在NK/T细胞淋巴瘤中，西达本胺上调P21表达，下调Cyclin E表达，诱导细胞发生G0/G1期阻滞，从而抑制细胞的增殖。

摘要激光扫描共聚焦显微镜作为80年代发展起来的一种高精度分子细胞生物学分析仪器，具有组织细胞断层扫描、活细胞动态荧光监测、三维图像重建、共聚焦图像定量分析等先进功能，在近年的细胞凋亡这一研究热点中得到了大量创造性的应用。本文拟就对激光扫描共聚焦显微镜在凋亡的形态学、分子水平变化及重要生理过程三方面研究中的应用及其成果做一综述。细胞凋亡(apoptosis)是不同于细胞坏死的一种细胞主动死亡方式，并由特定的基因控制。凋亡细胞在形态上出现变圆皱缩、染色质浓缩边集、核碎裂、凋亡小体形成等变化，并最终由非炎症过程清除。由于细胞凋亡独特地影响着机体的细胞发育和代谢，在监测和清除肿瘤细胞与突变细胞等方面也可能发挥重要的作用，近年来受到了细胞生物学、分子生物学、免疫学等多学科的广泛关注。激光扫描共聚焦显微镜(laser scaing confocal microscopy, LSCM)是80年代发展起来的一种高精度分子细胞生物学分析仪器，辅以各类免疫荧光探针或荧光染料与被测物质特异性结合，不仅可观察固定的细胞组织切片，还可对活细胞的结构、分子和离子进行实时动态地观察和检测。在细胞凋亡的研究中，激光扫描共聚焦显微镜已被广泛地应用于形态学、分子水平监测及重要生理改变等各方面，其中不乏新颖之处，并获得了大量成果，以下将就此做一简单的介绍。激光扫描共聚焦显微镜与凋亡的形态学激光扫描共聚焦显微镜用点光源扫描标本的光学横断面，以代替普通光学显微镜所使用的场光源，并用探测针孔滤去离焦光线，所以消除了来自焦平面以外的衍射或散射光的干扰，可实现高清晰、高分辨率的组织细胞断层扫描。并且由于激光扫描共聚焦显微镜采用数字化成像，因而辅以一定的软件就能对图像进行定量分析及三维重建等操作。过去对细胞凋亡的形态学研究方法局限于活性细胞和组织切片染色、荧光镜观察，或者石蜡切片原位末端标记法。由于普通光镜的分辨率和清晰度有限，而电镜又显然不适合对凋亡这一复杂动态过程的监测，激光扫描共聚焦显微镜的应用使人们对细胞凋亡的形态学观察分析提高到了一个前所未有的新水平。细胞核核膜的破坏对于染色质聚集并形成凋亡小体起重要作用。lamin是构成核片层的蛋白质，位于核膜的内表面，由caase-6介导的lamin裂解可影响核膜的完整性。在McCall等的研究中，对果蝇卵子发生晚期的细胞凋亡现象进行了动态观察。以单抗mAb101标记其哺育细胞核内膜的laminDm0（哺乳类laminB的同源体），用激光扫描共聚焦显微镜加以观察。正常哺育细胞到11期时，染色的lamin呈弥散的雾状分布并围绕核周，而dcp-1GLC哺育细胞即使到了较晚的14期时，仍然显示界线明确的染色。可见dcp-1突变体在核lamin蛋白的酶切或解聚方面存在缺陷。细胞器Li 等在对C(6)-酰基鞘氨醇诱导胞内囊泡产生的研究中，在不产生中毒效应的情况下，加入10microM C(6)-酰基鞘氨醇以诱导鼠纤维母细胞(3T3-L1和3T3-F442A)凋亡。观察到囊泡的形成与C(6)-酰基鞘氨醇的诱导呈时间依从和剂量依从关系。大量小泡在其加入后8小时内出现，并且随时间而增大；大泡最终分布在核周，而小泡分布在细胞边缘。用抗-溶酶体膜蛋白抗体和共聚焦免疫荧光显微分析，证明增大的囊泡为晚期内吞体/溶酶体。另外，胞内的细胞器都有其适用的荧光探针，如高尔基复合体常用的探针有Dceramide、BODIPY ceramide等，内质网常用的有Dil、DiOC6等，经标记均可进行精细的观察。当然，激光扫描共聚焦显微镜在形态学中的优势更在于其对图像的三维重建功能，从而揭示过去只能在平面上显现的凋亡细胞在三维空间中的结构；而对细胞凋亡的动态过程，它可以用三维加时间的四维方式进行观察，来获取最逼真的形态学资料。凋亡过程中一些特征性的三维形态变化正期待着进一步具体的工作去发现。激光扫描共聚焦显微镜对凋亡细胞的分子水平监测随着分子生物学突飞猛进的发展，关于细胞凋亡分子机制的研究已有了很大的突破。细胞凋亡的信号传递途径及其调控涉及到大量的酶级联反应、生物大分子的空间转移等。而激光扫描共聚焦显微镜以其定性、定量、定时的优点，结合众多荧光探针的应用，成为了研究细胞凋亡分子水平变化的有力手段。DNA大分子DNA断裂以及染色质的异常凝聚，是细胞凋亡的关键，同时也是细胞核在细胞凋亡中具有标志性的变化。Columbara等报道将激光扫描共聚焦显微镜与原位TdT和Poll免疫荧光技术相结合，进而确定双链和单链DNA的断裂点。而在对细胞凋亡和细胞坏死区别的研究中，Kreel等在培养的K562细胞中加入放线菌素D以诱导凋亡，并对细胞的DNA片段进行了3’-末端标记。经激光扫描共聚焦显微镜观察发现K562细胞凋亡早期有大量DNA片段出现，且DNA片段弥散分布于除核仁外的细胞核区。伴随着凋亡的进展，细胞核内出现大量高标记密度的圆形小体。而采用NaN3或快速冻融法使细胞坏死，经激光扫描共聚焦显微镜观察证实，在坏死开始阶段并无DNA片段的出现，至少在坏死发生24小时后才有DNA片段产生。Caase家族Caases是一组高度保守的半胱氨酸蛋白酶，目前发现有11个成员。多数细胞凋亡是以Caase家族蛋白的激活并作用于其关键底物而实现的，而caases激活的关键又在于该家族蛋白间的级联反应，因此caases被认为是细胞凋亡的中心环节和执行者，成为研究的热点。Mandal等用激光扫描共聚焦显微镜对细胞凋亡中激活的caase-3的重分布进行了研究。用丁酸处理细胞后，观察到DNA-PKcs的裂解与caase-3的激活成正相关，而Bcl-2的过度表达则可抑制上述两个过程。同时还证明（1）激活后的caase-3重分布到核区，（2）裂解局部的DNA-PKcs和PARP（polyADP-ribosepolymerase，聚腺苷二磷酸核糖多聚酶），（3）裂解产物又被释放到核外的细胞液。caase-3的抑制物四肽DEVD-CHO又可抑制上述的三个连续的步骤。该研究提示：激活的caase-3在核内的重分布构成了丁酸所诱导的细胞凋亡中的一个重要凋亡信号。另外，在用激光扫描共聚焦显微镜对Q79诱导大鼠神经元凋亡的研究中，Sanchez等发现了Q79对caase-8的聚集和激活，而对caase-8的抑制则阻止了被诱导的细胞凋亡；加以Westernblot分析，还建立了caase-8的激活和某些神经退行性疾病（如舞蹈病）的联系。Grazyme丝氨酸蛋白酶grazyme为另一种重要的凋亡信号分子，对某些caase家族蛋白也有激活作用。Trapani等就证明了杀伤淋巴细胞利用穿孔素和grazymeB的协同作用来诱导靶细胞的凋亡，在其研究中通过激光扫描共聚焦显微镜观察到（1）50%细胞的胞核内快速聚集了以FITC荧光标记的grazymeB（最长7分钟，t1/2为2分钟），然后发生凋亡；（2）其它的细胞只有细胞液内有FITC-grazyme B的摄取，避免了凋亡。此间至少在13分钟后才有DNA碎片的出现，说明核内的grazyme B聚集出现在凋亡的执行阶段之前。并且通过对核内液的处理（加入70KDa FITC-dextran），间接观察到grazyme B的转移并非是因为核膜受caases的作用而破损，而是由于穿孔素的协同。其它以上的介绍显示，激光扫描共聚焦显微镜在检测活细胞酶活性动态变化方面有着突出的优势。实际上，对于细胞凋亡的分子机制这样一个极其复杂的课题，激光扫描共聚焦显微镜的应用远不只限于上述的几种离子和大分子，而是渗透到了大量的分枝课题中去。如在对重要的凋亡负调控蛋白Bcl-2的研究中，Beham等利用基因毒性损害（genotoxic damage）诱导细胞凋亡，并以Bcl-2蛋白抑制其凋亡过程。用激光扫描共聚焦显微镜和Immunoblotting观察显示，Bcl-2的作用在于阻止了诱导产生的p53蛋白向核内的转运。而Ohsawa等对独立于caase家族的另一种重要蛋白酶—组织蛋白酶进行了研究，用血清剥夺法诱导PC12细胞凋亡，并用激光扫描共聚焦显微镜监测了其精细超微结构改变过程和细胞内组织蛋白酶B和D的免疫活度的对比变化。又如，在人胰岛淀粉样多肽（hIA）的研究中，Hiddinga等用表达hIA的质粒转染COS-1细胞诱导凋亡，辅以免疫组化染色，用激光扫描共聚焦显微镜证明了hIA在细胞的内质网和高尔基复合体内呈簇状沉积，并与细胞

第一届Cell Death and Disease研讨会暨第四届中英"细胞死亡、干细胞与癌症"国际研讨会将于2013年5月8日-9日在上海召开。　　本次会议主题为：细胞死亡、干细胞与免疫，将邀请海内外相关领域卓有建树的科学家，采用大会报告及专题讨论的形式，结合国际上癌症生物学研究领域的前沿发展趋势，从细胞死亡、干细胞和免疫学等领域的研究，及其与癌症的关系等方面进行深入探讨。此次会议旨在加强领域前沿科学家之间、科学家与青年研究人员及国际权威科学期刊与我国科研人员的互动与交流，并提高我国癌症与干细胞生物学等领域的研究水平。希望可以通过互通有无，共同提高，尽快攻克癌症难题。

[b][size=15px][color=#595959]红三叶草[/color][/size][/b][size=15px][color=#595959](Trifolim pratense L.)是一种传统中药，具有调节更年期症状、心脏问题、炎症性疾病、牛皮癣和认知缺陷的作用。在以往的报道中，对红三叶草的研究主要集中在临床实践方面。红三叶草的药理作用尚未完全阐明。[/color][/size] [font=&][size=16px][color=#232323][/color][/size][/font][size=15px][color=#595959]为了确定调节[b]铁下垂[/b]的分子，检测了[b]红三叶草(Trifolium pratense L.)提取物(RCE)[/b]是否影响化学处理或[b]胱氨酸/谷氨酸反转运蛋白(xCT)[/b]缺乏引起的铁下[/color][/size][font=&][size=16px][color=#232323]垂。 [/color][/size][/font] [size=15px][color=#595959][/color][/size][size=15px][color=#595959][font=&][/font][/color][/size][b][size=15px][color=#595959]小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)[/color][/size][/b][size=15px][color=#595959]通过erastin/Ras-选择性致死3(RSL3)处理或xCT缺失诱导铁下垂细胞模型。用Calcein-AM和BODIPY-C荧光染料分别测定细胞内[b]铁和脂质过氧化水平[/b]。蛋白和mRNA分别用Western blot和real-time聚合酶链反应定量。对xCT MEFs进行RNA测序分析。 [/color][/size] [size=15px][color=#595959]RCE对erastin/RSL3处理和xCT缺失所致的铁下垂均有显著抑制作用。RCE的抗铁衰作用与细胞铁衰模型中细胞铁积累和脂质过氧化等铁衰表型变化相关。[/color][/size] [size=15px][color=#595959]重要的是，RCE影响铁代谢相关蛋白的水平，包括铁调节蛋白1、转运蛋白1 (FPN1)、二价金属转运蛋白1和转铁蛋白受体。通过RCE对xCT MEFs进行RNA测序分析，发现细胞防御基因表达上调，细胞死亡相关基因表达下调。[/color][/size] [size=15px][color=#595959][/color][/size][color=#3573b9]结论[/color][b][size=15px][color=#595959][/color][/size][/b][font=mp-quote, -apple-system-font, BlinkMacSystemFont, &][size=15px][color=#595959][/color][/size][/font] [b][size=15px][color=#595959][/color][/size][size=15px][color=#595959][/color][/size][size=15px][color=#595959][/color][/size][size=15px][color=#595959][/color][/size][size=15px][color=#595959][/color][/size][size=15px][color=#595959][/color][/size][/b][font=&][size=16px][color=#232323][/color][/size][/font][b][size=15px][color=#595959][/color][/size][size=15px][color=#595959][/color][/size][size=15px][color=#595959][/color][/size][size=15px][color=#595959][/color][/size][size=15px][color=#595959][/color][/size][size=15px][color=#595959][/color][/size][size=15px][color=#595959][/color][/size][/b][font=&][size=16px][color=#232323][/color][/size][/font][size=15px][color=#595959]RCE可通过[b]调节细胞铁稳态[/b]，有效抑制由erastin/RSL3处理和xCT缺乏引起的铁下垂。这是首次报道RCE在与铁中毒细胞死亡相关的疾病中具有治疗潜力，特别是由细胞铁代谢失调引起的铁中毒。[/color][/size]

[size=3][font=宋体]基本原理[/font][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=宋体]细胞凋亡早期改变发生在细胞膜表面，目前早期识别仍有困难。这些细胞膜表面的改变之一是磷脂酰丝氨酸（[/font][font=Times New Roman]PS[/font][font=宋体]）从细胞膜内转移到细胞膜外，使[/font][font=Times New Roman]PS[/font][font=宋体]暴露在细胞膜外表面。[/font][font=Times New Roman]PS[/font][font=宋体]是一种带负电荷的磷脂，正常主要存在于细胞膜的内面，在细胞发生凋亡时细胞膜上的这种磷脂分布的不对称性被破坏而使[/font][font=Times New Roman]PS[/font][font=宋体]暴露在细胞膜外。[/font][font=Times New Roman]Annexin V[/font][font=宋体]是一种[/font][font=Times New Roman]Ca+[/font][font=宋体]依赖的磷脂结合蛋白，最初发现是一种具有很强的抗凝血特性的血管蛋白，[/font][font=Times New Roman]Annexin V[/font][font=宋体]具有易于结合到磷脂类如[/font][font=Times New Roman]PS[/font][font=宋体]的特性。对[/font][font=Times New Roman]PS[/font][font=宋体]有高度的亲和性。因此，该蛋白可充当一敏感的探针检测暴露在细胞膜表面的[/font][font=Times New Roman]PS[/font][font=宋体]。[/font][font=Times New Roman]PS[/font][font=宋体]转移到细胞膜外不是凋亡所独特的，也可发生在细胞坏死中。两种细胞死亡方式间的差别是在凋亡的初始阶段细胞膜是完好的，而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就破坏了。因此，可以建立一种用[/font][font=Times New Roman]Annexin V[/font][font=宋体]结合在细胞膜表面作为凋亡的指示并结合一种染料排除试验以检测细胞膜的完整性的检测方法。[/font][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=宋体]试剂与仪器[/font][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=Times New Roman] [/font][font=宋体]孵育缓冲液：[/font][font=Times New Roman]10mmol/L HEPES/NaOH[/font][font=宋体]，[/font][font=Times New Roman]PH 7.4[/font][font=宋体]，[/font][font=Times New Roman]140mmol/L NaCl[/font][font=宋体]，[/font][font=Times New Roman]5mmol/L CaCl2 [/font][/size][size=3][font=Times New Roman] [/font][font=宋体]标记液：将[/font][font=Times New Roman]FITC- Annexin V[/font][font=宋体]（宝灵曼公司产品）和[/font][font=Times New Roman]PI[/font][font=宋体]加入到孵育缓冲液中，终浓度均为[/font][font=Times New Roman]1ug/ml [/font][/size][size=3][font=Times New Roman] [/font][font=宋体]流式细胞仪[/font][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=宋体]实验步骤[/font][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=Times New Roman]1. [/font][font=宋体]细胞收集：悬浮细胞直接收集到[/font][font=Times New Roman]10ml[/font][font=宋体]的离心管中，每样本细胞数为（[/font][font=Times New Roman]1~5[/font][font=宋体]）×[/font][font=Times New Roman]106[/font][font=宋体]，[/font][font=Times New Roman]/mL[/font][font=宋体]　[/font][font=Times New Roman]500~1000r/min[/font][font=宋体]离心[/font][font=Times New Roman]5min[/font][font=宋体]，弃去培养液。[/font][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=Times New Roman]2. [/font][font=宋体]用孵育缓冲液洗涤[/font][font=Times New Roman]1[/font][font=宋体]次，[/font][font=Times New Roman]500~1000r/min[/font][font=宋体]离心[/font][font=Times New Roman]5min[/font][font=宋体]。[/font][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=Times New Roman]3. [/font][font=宋体]用[/font][font=Times New Roman]100ul[/font][font=宋体]的标记溶液重悬细胞，室温下避光孵育[/font][font=Times New Roman]10~15min[/font][font=宋体]。[/font][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=Times New Roman]4. 500~1000r/min[/font][font=宋体]离心[/font][font=Times New Roman]5min[/font][font=宋体]沉淀细胞孵育缓冲液洗[/font][font=Times New Roman]1[/font][font=宋体]次。[/font][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=Times New Roman]5. [/font][font=宋体]加入荧光（[/font][font=Times New Roman]SA-FLOUS[/font][font=宋体]）溶液[/font][font=Times New Roman]4[/font][font=宋体]℃下孵育[/font][font=Times New Roman]20min[/font][font=宋体]，避光并不时振动。[/font][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=Times New Roman]6. [/font][font=宋体]流式细胞仪分析：流式细胞仪激发光波长用[/font][font=Times New Roman]488nm[/font][font=宋体]，用一波长为[/font][font=Times New Roman]515nm[/font][font=宋体]的通带滤器检测[/font][font=Times New Roman]FITC[/font][font=宋体]荧光，另一波长大于[/font][font=Times New Roman]560nm[/font][font=宋体]的滤器检测[/font][font=Times New Roman]PI[/font][font=宋体]。[/font][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=Times New Roman]7. [/font][font=宋体]结果判断：凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料如[/font][font=Times New Roman]PI[/font][font=宋体]有抗染性，坏死细胞则不能。细胞膜有损伤的细胞的[/font][font=Times New Roman]DNA[/font][font=宋体]可被[/font][font=Times New Roman]PI[/font][font=宋体]着染产生红色荧光，而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。因此，在细胞凋亡的早期[/font][font=Times New Roman]PI[/font][font=宋体]不会着染而没有红色荧光信号。正常活细胞与此相似。在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为（[/font][font=Times New Roman]FITC-/PI-[/font][font=宋体]）；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为（[/font][font=Times New Roman]FITC+/PI+[/font][font=宋体]）；而右下象限为凋亡细胞，显现（[/font][font=Times New Roman]FITC+/PI-[/font][font=宋体]）。[/font][/size]

[size=3][font=宋体]基本原理[/font][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=宋体]细胞凋亡早期改变发生在细胞膜表面，目前早期识别仍有困难。这些细胞膜表面的改变之一是磷脂酰丝氨酸（[/font][font=Times New Roman]PS[/font][font=宋体]）从细胞膜内转移到细胞膜外，使[/font][font=Times New Roman]PS[/font][font=宋体]暴露在细胞膜外表面。[/font][font=Times New Roman]PS[/font][font=宋体]是一种带负电荷的磷脂，正常主要存在于细胞膜的内面，在细胞发生凋亡时细胞膜上的这种磷脂分布的不对称性被破坏而使[/font][font=Times New Roman]PS[/font][font=宋体]暴露在细胞膜外。[/font][font=Times New Roman]Annexin V[/font][font=宋体]是一种[/font][font=Times New Roman]Ca+[/font][font=宋体]依赖的磷脂结合蛋白，最初发现是一种具有很强的抗凝血特性的血管蛋白，[/font][font=Times New Roman]Annexin V[/font][font=宋体]具有易于结合到磷脂类如[/font][font=Times New Roman]PS[/font][font=宋体]的特性。对[/font][font=Times New Roman]PS[/font][font=宋体]有高度的亲和性。因此，该蛋白可充当一敏感的探针检测暴露在细胞膜表面的[/font][font=Times New Roman]PS[/font][font=宋体]。[/font][font=Times New Roman]PS[/font][font=宋体]转移到细胞膜外不是凋亡所独特的，也可发生在细胞坏死中。两种细胞死亡方式间的差别是在凋亡的初始阶段细胞膜是完好的，而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就破坏了。因此，可以建立一种用[/font][font=Times New Roman]Annexin V[/font][font=宋体]结合在细胞膜表面作为凋亡的指示并结合一种染料排除试验以检测细胞膜的完整性的检测方法。[/font][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=宋体]试剂与仪器[/font][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=Times New Roman] [/font][font=宋体]孵育缓冲液：[/font][font=Times New Roman]10mmol/L HEPES/NaOH[/font][font=宋体]，[/font][font=Times New Roman]PH 7.4[/font][font=宋体]，[/font][font=Times New Roman]140mmol/L NaCl[/font][font=宋体]，[/font][font=Times New Roman]5mmol/L CaCl2 [/font][/size][size=3][font=Times New Roman] [/font][font=宋体]标记液：将[/font][font=Times New Roman]FITC- Annexin V[/font][font=宋体]（宝灵曼公司产品）和[/font][font=Times New Roman]PI[/font][font=宋体]加入到孵育缓冲液中，终浓度均为[/font][font=Times New Roman]1ug/ml [/font][/size][size=3][font=Times New Roman] [/font][font=宋体]流式细胞仪[/font][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=宋体]实验步骤[/font][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=Times New Roman]1. [/font][font=宋体]细胞收集：悬浮细胞直接收集到[/font][font=Times New Roman]10ml[/font][font=宋体]的离心管中，每样本细胞数为（[/font][font=Times New Roman]1~5[/font][font=宋体]）×[/font][font=Times New Roman]106[/font][font=宋体]，[/font][font=Times New Roman]/mL[/font][font=宋体]　[/font][font=Times New Roman]500~1000r/min[/font][font=宋体]离心[/font][font=Times New Roman]5min[/font][font=宋体]，弃去培养液。[/font][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=Times New Roman]2. [/font][font=宋体]用孵育缓冲液洗涤[/font][font=Times New Roman]1[/font][font=宋体]次，[/font][font=Times New Roman]500~1000r/min[/font][font=宋体]离心[/font][font=Times New Roman]5min[/font][font=宋体]。[/font][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=Times New Roman]3. [/font][font=宋体]用[/font][font=Times New Roman]100ul[/font][font=宋体]的标记溶液重悬细胞，室温下避光孵育[/font][font=Times New Roman]10~15min[/font][font=宋体]。[/font][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=Times New Roman]4. 500~1000r/min[/font][font=宋体]离心[/font][font=Times New Roman]5min[/font][font=宋体]沉淀细胞孵育缓冲液洗[/font][font=Times New Roman]1[/font][font=宋体]次。[/font][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=Times New Roman]5. [/font][font=宋体]加入荧光（[/font][font=Times New Roman]SA-FLOUS[/font][font=宋体]）溶液[/font][font=Times New Roman]4[/font][font=宋体]℃下孵育[/font][font=Times New Roman]20min[/font][font=宋体]，避光并不时振动。[/font][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=Times New Roman]6. [/font][font=宋体]流式细胞仪分析：流式细胞仪激发光波长用[/font][font=Times New Roman]488nm[/font][font=宋体]，用一波长为[/font][font=Times New Roman]515nm[/font][font=宋体]的通带滤器检测[/font][font=Times New Roman]FITC[/font][font=宋体]荧光，另一波长大于[/font][font=Times New Roman]560nm[/font][font=宋体]的滤器检测[/font][font=Times New Roman]PI[/font][font=宋体]。[/font][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=Times New Roman]7. [/font][font=宋体]结果判断：凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料如[/font][font=Times New Roman]PI[/font][font=宋体]有抗染性，坏死细胞则不能。细胞膜有损伤的细胞的[/font][font=Times New Roman]DNA[/font][font=宋体]可被[/font][font=Times New Roman]PI[/font][font=宋体]着染产生红色荧光，而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。因此，在细胞凋亡的早期[/font][font=Times New Roman]PI[/font][font=宋体]不会着染而没有红色荧光信号。正常活细胞与此相似。在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为（[/font][font=Times New Roman]FITC-/PI-[/font][font=宋体]）；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为（[/font][font=Times New Roman]FITC+/PI+[/font][font=宋体]）；而右下象限为凋亡细胞，显现（[/font][font=Times New Roman]FITC+/PI-[/font][font=宋体]）。[/font][/size]

[b]芍药苷靶向GSDMD抑制细胞焦亡缓解胆汁淤积[/b] [font=宋体][size=15px][color=black]胆汁淤积（CT）是由胆汁产生、分泌或排泄受损引起的疾病，可进展为严重并发症，包括肝硬化、肝衰竭和可能危及生命的疾病。在CT期间小鼠肝组织的焦亡加剧，靶向焦亡可能在减轻CT方面具有治疗潜力。[/color][/size][/font] [font=宋体][size=15px][color=black]芍药苷（PF）是一种源自芍药属的生物活性天然化合物，在各种肝脏疾病中显示出显著的保肝作用。作者之前的研究表明，PF不仅对对乙酰氨基酚诱导的肝损伤具有治疗益处，还可以调节胆汁酸代谢。已有研究表明PF不仅促进胆汁酸分泌，还增强了胆汁酸的运输和代谢。然而PF是否通过靶向特定的NLRP3/GSDMD信号通路发挥其保肝和利胆作用，以及治疗靶点尚不清楚。[/color][/size][/font] [font=宋体][size=15px][color=black]2024年9月3日，成都中医药大学药学院马骁团队在Phytomedicine[i][/i]上发表了题为“Paeoniflorin inhibited GSDMD to alleviate ANIT-induced cholestasis via pyroptosis signaling pathway”的文章，发现PF给药可减轻 ANIT 诱导的肝脏病理，增强肝功能标志物，并提高细胞活力，GSDMD被确定为PF的直接靶标。机制上，PF靶向GSDMD通过NLRP3依赖性焦亡途径和随后的炎症介质释放，减轻胆汁淤积。[/color][/size][/font] [size=15px][b][font=宋体][color=#0070c0]1[/color][/font][font=宋体][color=#0070c0]、PF改善ANIT诱导的CT模型肝损伤[/color][/font][font=宋体][color=#0070c0][/color][/font][/b][/size] 作者首先构建了ANIT（Alpha-naphthylisothiocyanate）诱导的胆汁淤积大鼠模型，发现PF显著降低ANIT诱导的ALT、AST水平的升高，减轻肝损伤，降低BA, [color=var(--weui-LINK)]TBIL[i][/i][/color]和DBIL水平，降低ALP和γ-GT水平，表明PF可有效减轻ct诱导的肝损伤。此外，PF治疗组炎症细胞浸润程度及胆管增生程度明显减少，且PF显著提高ANIT处理的[color=var(--weui-LINK)]HepG2细胞[i][/i][/color]的活力（图1）。 [align=center] [/align][align=center] [/align] [size=15px][b][font=宋体][color=#0070c0]2[/color][/font][font=宋体][color=#0070c0]、PF通过NLRP3途径改善ANIT诱导的焦亡[/color][/font][font=宋体][color=#0070c0][/color][/font][/b][/size] [font=宋体][size=15px][color=black]先前的研究已经证实，芍药可以通过NF-κB/NLRP3信号通路缓解ANIT诱导的CT。PF作为芍药的主要活性成分，在缓解CT方面显示出显著的治疗潜力。作者推测PF可能通过nlrp3介导细胞焦亡来降低ANIT诱导的CT。通过网络药理学显示高评分值的靶标中包括NLRP3，且处于核心地位。此外，关键靶点的GO和KEGG通路进行富集分析均提示PF通过调节nlrp3依赖性焦亡来改善CT（图2）。[/color][/size][/font] [align=center] [/align][align=center] [/align][size=15px][b][font=宋体][color=#0070c0]3[/color][/font][font=宋体][color=#0070c0]、PF介导NLRP3/GSDMD通路改善ANIT诱导的焦亡[/color][/font][font=宋体][color=#0070c0][/color][/font][/b][/size] [font=宋体][size=15px][color=black]上述研究表明PF可能通过NLRP3依赖经典焦亡途径缓解ANIT诱导的CT。作者进一步通过电镜对焦亡进行研究，发现PF处理组线粒体肿胀明显减少，且PF治疗减少模型组出现的细胞肿胀，膜上有明显的孔并伴有许多水泡状突起。WB表明实验模型组NLRP3、GSDMD-N、ASC、Caspase 1 P20蛋白表达明显上调，而PF显著逆转上述情况（图3）。[/color][/size][/font] [align=center] [/align][align=center][font=宋体][size=15px][color=black][/color][/size][/font][/align][align=center] [/align] [size=15px][b][font=宋体][color=#0070c0]4[/color][/font][font=宋体][color=#0070c0]、PF通过靶向GSDMD改善ANIT诱导的焦亡[/color][/font][/b][/size] [font=宋体][size=15px][color=black]作者接着研究PF抑制ANIT诱导细胞焦亡的分子机制，通过蛋白芯片来筛选PF的直接作用靶标。结果表明，PF与GSDMD具有较高的亲和力，提示PF可能通过直接结合GSDMD抑制焦亡。进一步作者通过分子对接、CETSA、SPR等实验验证了PF与GSDMD之间的结合，这些结果共同表明PF直接与GSDMD蛋白结合（图4）。[/color][/size][/font] [align=center] [/align][align=center][font=宋体][size=15px][color=black][/color][/size][/font][/align][align=center] [/align] [size=15px][b][font=宋体][color=#0070c0]5[/color][/font][font=宋体][color=#0070c0]、PF通过GSDMD抑制炎症因子的释放[/color][/font][font=宋体][color=#0070c0][/color][/font][/b][/size] [font=宋体][size=15px][color=black]在焦亡信号通路中，细胞通常积累大量的pro-il -1β和pro-IL-18。caspase-1的激活是将这些促炎因子切割成活性形式所必需的。Caspase-1也裂解GSDMD，导致膜孔的形成，GSDMD的激活和随后的毛孔形成促进了裂解的活性炎症因子的快速释放引起局部或全身炎症反应。作者发现模型组炎症因子的表达明显升高，然而，体内和体外实验均表明高剂量PF组IL-1β、IL-18、IL-1β和IL-18的表达显著下调。LDH水平升高是焦亡的常见指标，作者发现模型组大鼠血清和肝组织中LDH释放量明显增加，PF治疗显著逆转了这些效应。这些结果表明，PF可能通过靶向GSDMD来减轻ANIT诱导的焦亡，从而抑制下游炎症因子的释放（图5）。[/color][/size][/font] [align=center] [/align][align=center][font=宋体][size=15px][color=black][/color][/size][/font][/align][align=center] [/align] [size=15px][b][font=宋体][color=#0070c0]总结[/color][/font][font=宋体][color=#0070c0][/color][/font][/b][/size] [font=宋体][size=15px][color=black]研究发现 PF 给药可减轻ANIT诱导的肝脏病理，增强肝功能标志物，并提高细胞活力。网络药理学和焦亡抑制剂研究表明，PF可能通过NLRP3依赖性焦亡途径减轻CT。Western blot、IF 和IHC 分析进一步支持了这一假设，这表明PF有可能抑制CT中NLRP3依赖性焦亡。通过蛋白芯片筛选将GSDMD确定为靶点。通过MD、 MDS[i][/i]、CETSA和SPR技术验证PF与 GSDMD 的结合亲和力。此外，ELISA和IHC证实了GSDMD对下游炎症通路的调节影响。总之，PF在ANIT诱导的CT中表现出保肝作用，主要是通过靶向GSDMD，从而抑制ANIT诱导的细胞焦亡和随后的炎症介质释放。[/color][/size][/font] [align=center][img=,690,430]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2024/09/202409101152102873_6541_6561489_3.png!w690x430.jpg[/img][img=,690,683]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2024/09/202409101152107014_173_6561489_3.png!w690x683.jpg[/img][img=,690,843]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2024/09/202409101152103146_2762_6561489_3.png!w690x843.jpg[/img][img=,690,453]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2024/09/202409101152108627_6893_6561489_3.png!w690x453.jpg[/img][img=,690,460]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2024/09/202409101152108231_8089_6561489_3.png!w690x460.jpg[/img][img=,690,726]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2024/09/202409101152104087_8784_6561489_3.png!w690x726.jpg[/img] [/align][align=center][font=宋体][size=15px][color=black][/color][/size][/font][/align][align=center] [/align] [font=宋体][size=15px] [/size][/font]

流式细胞仪是对细胞进行自动分析和分选的装置。它可以快速测量、存贮、显示悬浮在液体中的分散细胞的一系列重要的生物物理、生物化学方面的特征参量，并可以根据预选的参量范围把指定的细胞亚群从中分选出来。多数流式细胞计是一种零分辨率的仪器，它只能测量一个细胞的诸如总核酸量，总蛋白量等指标，而不能鉴别和测出某一特定部位的核酸或蛋白的多少。也就是说，它的细节 分辨率为零。

新型细胞培养系统研制成功作者：张笑 来源：科学网美国威斯康辛大学麦迪逊分校的科学家们近日开发出一套新细胞培养系统，有望为细胞治疗提供更加一致和安全的细胞培养物。11月14日的《自然—方法学》刊登了这一成果。领导这项研究的Laura Kiessling教授表示这套系统并不昂贵，可承担多能细胞培养中的大量预估工作。这项技术“很简单”，“任何人都能使用”。目前，大部分人类胚胎干细胞的培养都是作为实验室研究用途的，而通常所采用的培养方法又容易造成各种污染。这套新系统采用一种化学合成制得的可与干细胞相结合的蛋白片段底物，并通过与特定培养基结合，可将细胞培养固定在未分化阶段达三个月或者更长时间。据报告显示，该系统亦可用于诱导多功能干细胞培养。“科学家现在普遍采用的培养系统都有着非特定的缺点，并且缺乏一致性，以致出现质量差异”， 领导这项研究的Laura Kiessling教授解释，“我们研发的这套系统特定性很好，而且并不贵”。（科学网 张笑/编译）相关仪器及方法：新型细胞培养系统 IX81显微镜 7500 Fast实时PCR系统 发光光度计

[size=14px] [/size] [size=14px]含笑内酯（Micheliolide，MCL）是小白菊内酯衍生物，具有抗氧化和抗炎作用，在肿瘤和炎症疾病中发挥多种功能。先前的文献还表明MCL可作为NF-κB的特异性抑制剂，抑制炎症因子的表达。此外，还有研究发现MCL通过调节NF-κB通路来防止阿霉素诱导的心脏毒性。然而，MCL对动脉粥样硬化（AS）进展和巨噬细胞铁死亡的影响仍不清楚。[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]2023年12月7日，哈尔滨医科大学第二附属医院贾海波团队在Redox Biol（IF=11.4）发表题为“MCL attenuates atherosclerosis by suppressing macrophage ferroptosis via targeting KEAP1/NRF2 interaction”的研究文章，发现MCL对AS具有保护作用。机制上，MCL 通过与 NRF2 竞争结合KEAP1的Arg483位点来促进KEAP1/NRF2解离，激活NRF2通路增加 GPX4和xCT来抑制巨噬细胞铁死亡和线粒体功能，减少炎症反应并改善了氧化应激，从而减缓AS的进展。[/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px]Highlights[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]1）MCL减弱AS的发展，减少了炎症反应并改善了氧化应激；[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]2）MCL抑制巨噬细胞铁死亡和线粒体功能，从而减缓AS的进展；[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]3）MCL通过激活NRF2通路增加GPX4和xCT来抑制铁死亡；[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]4）MCL通过与NRF2竞争结合KEAP1的Arg483位点来促进KEAP1/NRF2解离。[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]研究结果[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]1、MCL给药减缓ApoE ?/?小鼠的AS进展[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]作者首先研究了MCL是否对AS有保护作用，ApoE?/?小鼠被喂养补充有MCL的西式饮食16周，发现MCL不仅减轻AS的发展，而且还改善了ApoE?/?小鼠脂质水平和炎症反应[/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px]2、MCL 抑制巨噬细胞铁死亡并改善动脉粥样硬化斑块中的氧化应激[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]鉴于巨噬细胞铁死亡在AS发展中的重要作用，作者推测MCL是否可能通过抑制巨噬细胞铁死亡来改善AS，通过检测GPX4和xCT mRNA和蛋白水平，检测血清铁含量、MDA和4-HNE水平，结果均表明MCL可能通过抑制巨噬细胞铁死亡来延缓AS的发展[/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px]3、MCL体外抑制巨噬细胞铁死亡及改善ox-LDL诱导的氧化应激[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]已有研究报道ox-LDL可引起巨噬细胞铁死亡，作者发现MCL可增加ox-LDL处理的巨噬细胞的细胞活力并降低上清液中的LDH水平，且MCL预处理可显著防止巨噬细胞线粒体的超微结构变化，改善巨噬细胞中的脂质ROS水平，逆转巨噬细胞中降低的GPX4和xCT水平。此外，MCL降低ox-LDL处理的巨噬细胞中的MDA水平，升高SOD活性和GSH水平，降低ox-LDL 诱导的巨噬细胞中铁离子浓度的升高[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]此外，作者还检测了线粒体功能，发现MCL显著改善ox-LDL引起的膜电位损失，改善线粒体功能。与仅用ox-LDL处理的细胞相比，用MCL孵育的ox-LDL处理的细胞的基础、最大和ATP偶联的线粒体耗氧率显著增加。这些数据表明MCL显著抑制巨噬细胞铁死亡，改善线粒体功能[/size] [size=14px] [/size][size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px]4、MCL增强ox-LDL培养的巨噬细胞中NRF2核转位[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]先前研究报道NRF2调节GPX4和xCT的转录，作者推测MCL是否可能激活NRF2通路从而增加巨噬细胞中的GPX4和xCT表达。结果发现MCL降低了细胞质裂解物中NRF2蛋白的表达，但显著增加细胞核裂解物中NRF2蛋白水平。此外，ChIP-q[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]实验发现MCL处理后NRF2对GPX4和xCT启动子序列的富集显著增加，这些数据表明MCL增强了NRF2核转位并增加了GPX4和xCT转录[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]5、MCL通过激活NRF2通路抑制巨噬细胞铁死亡减轻AS[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]为进一步证实MCL通过激活NRF2通路抑制巨噬细胞铁死亡，作者采用NRF2特异性抑制剂M385预处理巨噬细胞，发现MCL治疗后升高的GPX4和xCT蛋白表达被ML385显著消除，且ML385抑制NRF2可消除MCL对脂质ROS和线粒体损伤的保护作用，此外，ML385可消除MCL诱导的GSH水平和SOD活性。用Si-NRF2降低巨噬细胞中NRF2水平，结果与ML385一致。这些数据表明MCL通过激活NRF2通路抑制巨噬细胞铁死亡[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]此外，为了证明MCL通过激活体内NRF2通路保护AS ，作者通过尾静脉给ApoE ?/?小鼠注射了AAV-sh-NRF2和AAV-sh-NC，同样发现MCL通过激活NRF2通路来保护动脉粥样硬化并改善炎症反应[/size] [size=14px]6、MCL抑制NFR2与KEAP1结合促进NRF2核转位[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]NRF2活性主要受其与KEAP1相互作用的调节。在生理条件下，KEAP1可以与NRF2相互作用形成复合物，抑制NRF2的核易位，进而导致其通过泛素化降解。作者发现ox-LDL促进NRF2和KEAP1复合物的形成，而MCL抑制了这种作用。作者接着通过分子对接来预测MCL是否可以直接与KEAP1结合，发现MCL分别与KEAP1的Gly364、Asn414、Arg483 和Ala556结合。进一步免疫沉淀和免疫荧光实验表明KEAP1-R483S突变体消除了MCL促进NRF2核转位的作用，表明MCL通过竞争性结合KEAP1的Arg483位点促进 KEAP1/NRF2 解离和NRF2核转位（图8）。[/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px]7、MCL通过竞争性结合KEAP1的Arg483位点抑制巨噬细胞铁死亡并改善线粒体功能[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]作者进一步研究了MCL是否抑制KEAP1-R483S突变巨噬细胞中的铁死亡，发现在KEAP1-R483S突变的巨噬细胞中，MCL不能改善ox-LDL诱导的细胞活力下降和LDH水平升高。此外，MCL对降低 KEAP1-R483S 突变巨噬细胞中总ROS和线粒体ROS的作用也消失，在巨噬细胞中转染 KEAP1-R483S减弱MCL对GPX4和xCT上调的影响。此外，MCL降低KEAP1-WT巨噬细胞中的铁含量和脂质ROS水平，但这种作用在KEAP1-R483S突变巨噬细胞中被消除，在 KEAP1-R483S 突变的巨噬细胞中，MCL对线粒体损伤的保护作用被抑制（图9）。[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]此外，MCL不能改善ox-LDL 诱导的KEAP1-R483S突变巨噬细胞中细胞膜电位的丧失。KEAP1-R483S质粒转染减轻了MCL对线粒体功能的保护作用，氧消耗分析也显示MCL不能增加被KEAP1-R483S质粒感染的巨噬细胞的OCR。这些结果表明MCL通过竞争性地与KEAP1的Arg483位点结合来抑制ox-LDL诱导的巨噬细胞铁死亡（图10）。[/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px]8、携带 AAV-KEAP1-R483S 的ApoE ?/?小鼠中MCL的 AS保护作用减弱[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]为了进一步证实MCL通过竞争性结合KEAP1的Arg483对AS的保护作用，将含有 KEAP1-WT和KEAP1-R483S的AAV通过尾静脉注射到8周龄ApoE ?/?小鼠体内，发现在 KEAP1-R483S突变小鼠中，MCL的抗炎作用、改善脂质沉积作用、提升GPX4，xCT和NRF2表达的作用均受到抑制。这些结果表明MCL通过竞争性结合KEAP1的Arg483位点来抑制巨噬细胞铁死亡和AS进展[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]总结[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]研究首次报道了MCL对AS的保护作用，阐明了MCL抑制AS的具体机制。MCL通过改善氧化应激抑制巨噬细胞铁死亡来抑制动脉粥样硬化，机制上通过竞争性结合KEAP1的Arg483位点促进NRF2活化，研究结果为MCL在AS治疗中的机制提供了新的见解，并提供了一种通过与NRF2竞争性结合KEAP1的Arg483位点来抑制巨噬细胞铁死亡，从而限制斑块进展的治疗方法。[/size]

科技日报 2013年10月19日 星期六 科技日报讯 如果你问一个生物学家，某个细胞下一步会做什么？他可能先要问你该细胞的电压、氧化性、pH值、渗透性、葡萄糖浓度等等，然后才可能据此预测它是正要发起一个动作电位，还是要进入有丝分裂，抑或正在走向凋亡。但如果你能轻松地得到亚细胞范围的温度曲线图，比如每个线粒体、中心粒甚至内质网区的温度，就像母亲给孩子量体温那么容易，情况又会完全不一样。 据物理学家组织网10月16日报道，日本京都大学科学家最近将绿色荧光蛋白和沙门氏菌体内感受热量的一种蛋白融合在一起，制造出一种能检测细胞内部不同细胞器温度波动的基因编码“温度计”，并将细胞器温度变化与细胞内部功能联系在一起，有助于人们进一步理解细胞行为。相关论文发表在最近的《自然·方法学》杂志上。 制做这种新型“温度计”的关键，是一种已知的名为TlpA的蛋白，这种蛋白由沙门氏菌制造，其正常作用是作为一种自动调节抑制器，感知温度以控制转录，能在37℃左右进行迅速可逆的结构转录。研究人员把绿色荧光蛋白（GFP）的荧光片段与TlpA融合，使GFP的荧光光谱随温度变化，最后再把融合蛋白加入到能瞄准线粒体、内质网或细胞质膜蛋白的序列中。 这种以蛋白质为基础的新型热传感器还能通过基因编码，直接瞄准不同的细胞器，比如线粒体，同时测量膜蛋白和产生的能量，并在温度变化与细胞器的内部功能之间建立联系。在本实验中，研究人员能探测到褐脂肪线粒体的生热作用，并把温度与线粒体膜蛋白、三磷酸腺苷（ATP）生产联系在一起。 利用这种序列，他们能同时绘制出“感温”GFP随线粒体膜蛋白电压指示器JC-1的染色图。他们发现，在温度高的地方，电压也相应较高。他们还用另一种基因编码传感器（ATeam26）结合荧光共振成像（FRET）检测ATP，再次证实了这种相关性。ATP主要是在氧化磷酸化过程中由一种电化学泵产生的，反映了线粒体的质子变化曲线，与JC-1所指示的类似。 研究人员指出，这一技术充分发挥作用的最佳地方是脑细胞。它能更好地处理温度变化，不仅在轴突的内外，而且能在神经胶质细胞内部。胶质细胞包裹着髓磷脂，所以携带了脉冲能量的很大一部分，有助于人们更好地理解神经信号的传输。但这还有争议，脉冲神经元热动力学主要还是由实验驱动，而并非不太精确的外在温度传感器。（常丽君）

细胞自噬是机体一种重要的防御和保护机制。但是这种自噬“信号”如何传递给细胞从而使其“执行”自噬过程，则一直是科学界的难题。近期，我校生命科学学院林圣彩教授课题组成功找到高等动物细胞在生长因子缺失条件下，启动自噬的部分“密码”，从而在细胞自噬机制研究方面取得重大突破。　　4月27日，最新一期的美国《科学》杂志以研究文章的形式刊发了这项研究成果，并配发专门评述。这也是近三年来，我校生命科学学院第二篇发表在这一世界顶级学术刊物上的论文。2009年6月，该院韩家淮教授的一篇有关细胞选择死亡方式机制的研究文章曾“登上”该杂志。　　所谓自噬，是指细胞消化自身蛋白质或细胞内的结构（细胞器）的一种自食现象。通过这种现象，细胞可以降解、消除和消化受损、变性、衰老和失去功能的细胞器和变性蛋白质等生物大分子，为细胞的生存和修复提供必须的能量。　　科学家们认为，自噬与细胞凋亡、细胞衰老一样，是一种十分重要的生物学现象。有关实验表明，包括肥胖症、糖尿病、神经退行性疾病、免疫失调及癌症在内的人类许多重大疾病的发生都与该过程的异常有关。为此，自噬也是当前生命科学中最热门的研究领域之一。　　据林圣彩介绍，对自噬进行分子机制的研究始于上世纪90年代的以单细胞生物酿酒酵母为模型的研究，目前，一系列构成单细胞生物自噬核心机器的基因已被发现并命名。　　然而，对自噬在多细胞生物特别是哺乳动物中的调控机制的研究，科学界至今仍在不断探索中。摆在科学家面前的一个根源性的问题是：在多细胞生物中，诱导自噬的各种信号是如何被传递到细胞内自噬“核心机器”从而启动自噬过程的？　　研究表明，与单细胞生物不同，在多细胞生物内，外界营养元素要依赖于生长因子的调控才能被转运到细胞内。一旦细胞外的生长因子匮乏，细胞便能启动自噬以维持能量平衡。那么，生长因子缺失这一信号又是如何“传达”的呢？　　这也成为长期致力于细胞信号转导研究的林圣彩教授课题组近年来的研究目标之一。经过多年研究，课题组终于成功“**”这一自噬启动“密码”——即通过一种名为GSK3的激酶活性增高后磷酸化并随之激活乙酰转移酶TIP60，进而导致自噬核心机器中的蛋白激酶ULK1的乙酰化水平增强而启动细胞自噬。简言之，这一发现揭示了多细胞生物在生长因子缺失条件下的细胞自噬过程的新的介导分子及其通路。　　林圣彩认为，弄清楚了细胞内到底有哪些蛋白分子“参与”了自噬和它们如何串联在一起，将有益于科学界从“源头”上认识相关疾病，并为这些疾病的诊断和治疗提供新的靶点。

[em03] [em03] [em04] [em04] [img]http://www.instrument.com.cn/bbs/images/affix.gif[/img][url=http://www.instrument.com.cn/bbs/download.asp?ID=52163]流式细胞仪检测凋亡２[/url]把一　二放在一个文件夹下然后打开就行！！！

肝癌是全球第3大癌症死亡原因，其中肝细胞癌约占所有肝癌类型的80%[1]。据世界卫生组织统计，每年因肝细胞癌死亡的人数高达83万例，且其发病率和死亡率仍呈现上升趋势，严重损害人类生命健康[2]。在慢性肝病的基础上，基因突变、表观遗传变化、信号通路失调和血管生成异常等分子机制相互作用，共同推动慢性肝病向肝细胞癌过程的发展[3]。目前肝细胞癌治疗的一线药物主要是索拉菲尼、仑伐替尼等靶向药及阿替利珠单抗、贝伐珠单抗等免疫治疗药物[4]。然而，靶向药及免疫治疗药的耐药性和不良反应导致肝细胞癌的5年生存率仍然不高。因此，亟需寻找安全性高、不良反应少的治疗药物，为肝细胞癌患者提供更有效、安全的治疗选择。 近年来，随着对肝细胞癌研究的不断深入，自噬在肝细胞癌中的作用逐渐被关注。在肝细胞癌的发展过程中，自噬一方面通过维持细胞内稳态来抑制肿瘤起始，另一方面通过影响信号通路的效应因子来抑制早期肝细胞癌的进程[5]。自噬受到多种机制的严格调控和影响，涉及自噬的几条重要信号通路有Wnt/β-catenin、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）、p53通路等[6]，这些通路在肝细胞癌中异常激活，参与肝癌细胞的增殖、凋亡和自噬等生物学行为。研究表明，mTOR通路在自噬调控机制中发挥至关重要的作用[7]，mTOR是自噬的负性调控因子，可以与UNC-51样激酶1（Unc-51 like autophagy activating kinase 1，ULK1）的丝氨酸结合抑制自噬的启动过程，也可以通过磷酸化使自噬调节复合物失活影响自噬小体的发生，磷酸化自噬相关蛋白14（autophagy-related protein 14，Atg14）、自噬和Beclin-1调节器1（activating molecule in beclin-1 regulated autophagy protein 1，AMBRA1）和核受体结合因子2（nuclear receptor binding factor 2，NRBF2）直接调节自噬的成核步骤[8]。因此，针对自噬及其机制开展治疗可能是肝细胞癌的有效对抗策略。 地榆为蔷薇科植物地榆Sanguisorba officinalis L.的干燥根，具有凉血止血、解毒敛疮的功效。地榆皂苷II是从地榆中提取的一种三萜皂苷类化合物，现代药理学研究发现，地榆皂苷II不仅具有抗炎、抗氧化、免疫调节的药理作用，同时具有广泛的抗肿瘤活性[9-11]，能通过多种途径抑制多种癌症的发生和发展，其机制可能与阻滞细胞周期、促进细胞凋亡和细胞自噬有关[12-15]。课题组前期研究发现，地榆皂苷II能够抑制小鼠肝细胞癌的发展[15]。然而，地榆皂苷II是否能通过影响Akt/mTOR通路诱导凋亡和自噬抑制肝细胞癌尚不明确。本研究中选择人肝癌HepG2细胞和小鼠肝癌Hepa1-6细胞作为研究对象，探究地榆皂苷II对肝癌细胞增殖、自噬和凋亡的影响，探讨地榆皂苷II在抗肝细胞癌方面的潜在作用机制，为将来用于临床治疗提供数据支持。 1 材料 1.1 细胞 HepG2细胞购自中国科学院上海细胞生物学研究所，Hepa1-6细胞购自上海富衡生物科技有限公司。 1.2 药品与试剂 地榆皂苷II（批号MUST-11051204，质量分数≥98%）购自上海源叶生物科技有限公司；PVDF膜（批号IPVH00010）购自美国Sigma公司；青霉素-链霉素（批号S11JV）购自上海源培生物科技股份有限公司；DMEM培养基（批号C11995500BT）、胎牛血清（批号A3160801）购自美国Gibco公司；PBS（批号WHB823K091）购自武汉普诺赛生命科技有限公司；0.25%胰酶消化液（批号C0203）、RIPA组织/细胞裂解液（批号P0013C）、蛋白酶抑制剂混合物（批号P1050-1）、磷酸酶抑制剂混合物（批号P1050-2）、EdU-555细胞增殖检测试剂盒（批号C0075S）购自上海碧云天生物技术有限公司；CCK-8试剂盒（批号A311-02）、BCA蛋白浓度测定试剂盒（批号E112-01）、高敏型ECL化学发光检测试剂盒（批号E412-01）、相对分子质量为1.8×105的蛋白marker（批号MP-102AA）购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；一抗稀释液（批号G2025）、二抗稀释液（批号G2009）、高相对分子质量marker（批号26625）购自武汉赛维尔生物科技有限公司；7.5% PAGE凝胶快速制备试剂盒（批号PG111）、10% PAGE凝胶快速制备试剂盒（批号PG112）、12.5% PAGE凝胶快速制备试剂盒（批号PG113）购自上海雅酶生物医药科技有限公司；β-actin、Beclin1抗体（批号分别为20536-1-AP、11306-1-AP）购自美国Proteintech公司；B淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、p62抗体（批号分别为ab196495、ab56416）购自英国Abcam公司；Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cystein-asparate protease-3，Caspase-3）、Caspase-8、cleaved Caspase-3、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR抗体（批号分别为5023T、9662S、4790T、9664T、4685S、4060T、2972S、5536T）购自美国CST公司；甲醇（批号10014118）购自国药集团化学试剂有限公司；山羊抗兔二抗（批号RS0002）购自美国ImmunoWay公司；Annexin V-FITC染色液（批号E-CK-A211）购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司。 1.3 仪器 AL104型电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多有限公司）；HH-S型恒温水浴锅（北京市永光明医疗仪器厂）；CKX53型倒置生物显微镜、IX73倒置荧光显微镜（日本Olympus公司）；3111型CO2培养箱、Multiskan Go-1510型全波长酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）；Centrifuge 5424R型微量离心机（德国Eppendorf公司）；SDS PAGE凝胶电泳及转膜电泳仪（美国Bio-Rad公司）；BETS-M5型转移微型翘板摇床（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；XH-C型涡旋混合器（金坛市医疗仪器厂）；MINI-4K型微型离心机（杭州米欧仪器有限公司）；5200型全自动化学发光图像分析系统（上海天能科技有限公司）；CytoFLEX流式细胞仪（美国贝克曼库尔特有限公司）；ThermoCell恒温金属浴（杭州博日科技股份有限公司）。 2 方法 2.1 CCK-8实验 将HepG2和Hepa1-6细胞分别以1×105个/mL接种于96孔板中，贴壁生长24 h，设置对照组、不同剂量地榆皂苷II组，对照组仅加入培养基，其余各组分别加入5、10、15、20、30、40、60、80、100 μmol/L相应药物，继续培养24 h，用CCK-8试剂盒测定各组吸光度（A）值，计算细胞存活率。 细胞存活率＝(A实验－A空白)/(A对照－A空白) 2.2 EdU实验 将HepG2和Hepa1-6细胞分别以1×105个/mL接种于96孔板中，贴壁生长24 h，设置对照组和地榆皂苷II（10、20、40 μmol/L）组，给药组给予相应药物，对照组仅加入培养基，继续培养24 h。将EdU稀释到2×EdU工作液（20 μmol/L），预热后等体积加入96孔板中，孵育细胞2 h后去除培养液，加入100 μL固定液（4%多聚甲醛），孵育10 min后去除固定液，用100 μL洗涤液洗涤细胞3次后每孔加入100 μL通透液（含0.3% Triton X-100的PBS），室温孵育15 min。去除通透液，每孔用1 mL洗涤液洗涤细胞2次，每次5 min。参考说明书配制Click反应液。每孔加入50 μL Click反应液，轻轻摇晃培养板后室温避光孵育30 min。洗涤液洗涤3次，吸除洗涤液后，每孔加Hoechst 33342溶液100 μL，室温避光孵育10 min。用洗涤液洗涤3次，每次3～5 min，随后进行荧光检测。 2.3 细胞凋亡检测 将HepG2和Hepa1-6细胞分别以1×105个/mL接种于6孔板中，贴壁生长24 h，设置对照组和地榆皂苷II（10、20、40 μmol/L）组，给药组给予相应药物，对照组仅加入培养基，继续培养24 h。用胰酶消化细胞，300×g离心5 min，弃上清，收集细胞，PBS洗涤，轻轻重悬细胞，300×g离心5 min，弃上清。用PBS洗涤细胞，离心后弃上清，加入Annexin V Binding Buffer重悬细胞。细胞悬液中加入Annexin V-FITC Reagent和5 μL的碘化丙啶（PI），轻柔涡旋混匀后，室温避光孵育15～20 min，立即上机检测。 2.4 Western blotting检测相关蛋白表达 将HepG2和Hepa1-6细胞分别以1×105个/mL接种于6孔板中，贴壁生长24 h，设置对照组和地榆皂苷II（10、20、40 μmol/L）组，给药组给予相应药物，对照组仅加入培养基，继续培养24 h。加入RIPA中强度缓冲液裂解后收集细胞，使用BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度。蛋白样品经凝胶电泳，转至PVDF膜，加入5%脱脂奶粉，封闭1.5 h，加入一抗，4 ℃孵育过夜；洗膜3次后加入二抗，4 ℃孵育1.5 h；最后使用ECL化学发光检测试剂盒，用化学发光图像分析系统显影。 2.5 统计学分析 采用GraphPad Prism 9统计软件对实验数据进统计学分析，计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA）。 3 结果 3.1 地榆皂苷II对HepG2和Hepa1-6肝癌细胞增殖的影响 如图1所示，与对照组比较，随着地榆皂苷II浓度的升高，HepG2和Hepa1-6肝癌细胞的存活率明显降低，且呈剂量相关性。经GraphPad Prism 9软件分析，地榆皂苷II对HepG2、Hepa1-6细胞的IC50值分别为26.94、26.18 μmol/L，因此以10、20、40 μmol/L作为后续地榆皂苷II的给药剂量。 图片 3.2 地榆皂苷II对HepG2和Hepa1-6肝癌细胞增殖的影响 EdU-555阳性表示细胞正处于增殖状态，Hoechst33342阳性指示细胞为活细胞，EdU-555/Hoechst33342表示细胞的增殖率。如图2所示，与对照组比较，地榆皂苷II给药后HepG2和Hepa1-6细胞的EdU-555/Hoechst33342值明显降低（P＜0.05、0.001），表明地榆皂苷II能够抑制肝癌细胞的增殖。 图片 3.3 地榆皂苷II对HepG2和Hepa1-6肝癌细胞凋亡的影响 如图3所示，与对照组比较，地榆皂苷II给药组HepG2和Hepa1-6细胞凋亡率显著升高（P＜0.01、0.001）。凋亡蛋白（包括调控凋亡的激活因子和执行凋亡的效应因子）参与细胞凋亡的过程。采用Western blotting检测地榆皂苷II对HepG2细胞和Hepa1-6细胞凋亡相关蛋白表达的影响，如图4所示，与对照组比较，地榆皂苷II给药组Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Bcl-2蛋白表达量显著降低（P＜0.05、0.01、0.001），cleaved Caspase-3、Bax蛋白表达量显著升高（P＜0.05、0.01）。以上结果说明地榆皂苷II促进HepG2和Hepa1-6细胞的凋亡。 图片 图片 3.4 地榆皂苷II对HepG2和Hepa1-6肝癌细胞自噬的影响 采用Western blotting检测细胞中代表自噬的核心蛋白LC3II、LC3Ⅰ、Beclin1、p62表达量，如图5所示，与对照组比较，地榆皂苷II给药组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ值明显升高（P＜0.05、0.01、0.001），Beclin1蛋白表达量上升（P＜0.05、0.01），p62蛋白表达量明显下降（P＜0.05、0.01），表明地榆皂苷II促进HepG2和Hepa1-6肝癌细胞的自噬。 图片 3.5 地榆皂苷II对HepG2和Hepa1-6细胞中Akt/mTOR信号通路蛋白表达的影响 采用Western blotting检测地榆皂苷II给药后Akt/mTOR信号通路蛋白表达量，如图6所示，与对照组比较，地榆皂苷II给药组p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR值明显下降（P＜0.05、0.01、0.001），表明地榆皂苷II能够抑制Akt/mTOR信号通路。 图片 4 讨论 肝细胞癌具有高发病率、高病死率的特点，虽然目前肝细胞癌研究备受关注，但其5年生存率仍为14.1%[16]。因此，迫切需要发现新的治疗策略和候选药物。近年来，地榆皂苷II在抗肿瘤方面的研究不断深入，研究发现地榆皂苷II抑制肿瘤与细胞自噬和凋亡存在紧密的关联，地榆皂苷II可通过诱导细胞凋亡来显著抑制乳腺癌MDA-MB-435细胞和胃癌BGC-823细胞的增殖[14-15]，诱导自噬显著抑制结直肠癌细胞增殖[17]。课题组既往研究证明，地榆皂苷II可在体内抑制肝细胞癌，其机制可能与抑制表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）信号通路有关[15]。然而，目前关于地榆皂苷II是否通过自噬和凋亡抑制肝细胞癌及其机制尚不明确。因此，本研究利用体外实验对地榆皂苷II刺激后肝癌细胞的增殖、自噬、凋亡及相关机制进行探究，结果表明，地榆皂苷II能抑制肝癌细胞的增殖，促进肝癌细胞的凋亡和自噬，其机制与抑制Akt/mTOR通路有关。 自噬又被称为II型程序性死亡，负责真核生物细胞质中细胞器、蛋白质和大分子的降解和回收。细胞中降解和回收的底物被吞噬后形成自噬体，自噬体与溶酶体结合形成自噬酶体最后降解。本研究检测了自噬中具有代表性的LC3、p62和Beclin1蛋白。Beclin1蛋白是一种自噬启动子，帮助自噬过程中囊泡的形成[18]，地榆皂苷II作用于肝癌细胞后，Beclin1蛋白表达量上升，促进自噬启动，囊泡形成增多，从而自噬水平升高。在自噬形成时，LC3I通过泛素激活酶E1和泛素结合酶E2与磷脂酰乙醇胺偶联，生成LC3II，LC3II存在于自噬体的表面，负责膜的融合和选择性降解过程[19]，p62在自噬体表面与LC3II相互作用后包裹进自噬体降解，与LC3II共同调节选择性降解过程[20]。地榆皂苷II给药后LC3II/LC3I值增高，p62蛋白表达量下降，促进自噬过程中自噬囊泡的融合和降解，进而促进自噬。Beclin1是自噬过程中的核心因子，已有研究证明Beclin1可以与抗凋亡因子Bcl-2相互作用，从而对凋亡过程产生影响[21]。细胞凋亡是一种生理性或病理性的程序性的死亡过程，近年来通过诱导促进癌细胞的凋亡来控制癌症一直是抗肿瘤的热点。Caspase级联反应是细胞凋亡过程的关键步骤，其启动受到抗凋亡因子和促凋亡因子Bcl-2和Bax的调节。在Caspase级联反应中，启动性Caspase包括Caspase-8、Caspase-9被激活后调控下游执行性Caspase如Caspase-3进而引起凋亡反应[22-24]。地榆皂苷II作用于肝癌细胞后，细胞中的Bcl-2蛋白表达量减少，Bax蛋白表达量增多，Bax蛋白在线粒体表面形成孔道，释放细胞色素C，引发Caspase级联反应，Caspase-8、Caspase-9激活进而诱导下游的Caspase-3活化为cleaved Caspase-3，切割下游多种底物，促进细胞凋亡典型形态变化。 Akt/mTOR信号通路在正常细胞生理过程中发挥关键作用，同时在多种癌症中，该通路的异常激活对自噬、细胞凋亡、化疗耐药性及转移过程产生重要影响[25]。诸多研究证据表明，Akt/mTOR途径是调控癌症细胞自噬反应的核心通路[26-28]。地榆皂苷II作用于肝癌细胞后，Akt和mTOR蛋白的磷酸化水平显著下降，Akt/mTOR信号通路被抑制，激活肝癌细胞凋亡和自噬，抑制肝癌细胞的增殖（图7，由Figdraw绘制）。 图片 上述体外研究结果初步解析了地榆皂苷II抑制肝细胞癌的机制，即地榆皂苷II通过抑制Akt/mTOR信号通路诱导肝癌细胞的凋亡和自噬，抑制肝癌细胞增殖，为地榆皂苷II在肝细胞癌治疗的药物研究开发中提供了药理学证据。

[img]http://www.instrument.com.cn/bbs/images/affix.gif[/img][url=http://www.instrument.com.cn/bbs/download.asp?ID=52162]流式细胞仪检测凋亡[/url][em03] [em03] [em04] [em04]

乳腺癌是世界范围内女性最常见的致死性恶性肿瘤，据统计，2020年女性乳腺癌已超越肺癌成为全球癌症发病率最高的癌种[1-2]。其中三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）是雌激素受体（estrogen receptor，ER）、孕激素受体（progesterone receptor，PR）和人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2，HER-2）均呈阴性表达的乳腺癌亚型，占所有乳腺癌的15%～20%[3]，具有侵袭力强、转移率高、术后复发率高、预后差的特点[4]。由于TNBC内分泌治疗的不确定性及靶向治疗的不应答性，导致临床上的治疗效果不理想[5-6]。因此，寻找有效抑制TNBC增殖转移的药物、降低患者的病死率一直是乳腺癌基础研究的一个重要方向[7-8]。 石蒜碱是石蒜Lycoris radiata (L'Hér.) Herb.、文殊兰Crinum asiaticum L. var. sinicum (Roxb. et Herb.) Baker、朱顶红Hippeastrum rutilum (Ker.-Gawl.) Herb.等石蒜属植物鳞茎中含量较高的异喹啉类生物碱，具有抗肿瘤、抗病毒、抗菌、抗炎镇痛、保肝等药理活性[9-10]，近年来石蒜碱的抗肿瘤作用受到众多研究者的关注。有文献报道石蒜碱对人乳腺癌MCF-7细胞[11]、人宫颈癌Hela细胞[12-13]、人肝癌HepG-2细胞[13-16]、人胃癌SGC-7901细胞[17]、人结肠腺癌LoVo细胞[18-19]具有显著的抑制作用，但对其作用机制的研究仍然处于初始阶段。本研究以人乳腺癌MDA-MB-231细胞为研究对象，主要通过体外实验从细胞水平和分子水平探讨石蒜碱对MDA-MB-231细胞的体外抑制活性及其通过线粒体氧化损伤诱导肿瘤细胞自噬及凋亡的机制，为今后石蒜碱抗肿瘤新药的深入研发和临床实践提供理论基础和实验参考。 1 材料 1.1 细胞株 MDA-MB-231细胞由国家教育部抗肿瘤天然药物工程技术研究中心提供。 1.2 药品与试剂 石蒜碱（批号34296，质量分数98%）购自阿拉丁试剂有限公司；胎牛血清（批号0201021）购自浙江杭天生物科技公司；RPMI 1640细胞培养基（批号AD123707271）购自美国HyClone公司；二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO，批号20200901）购自天津中和盛泰化工有限公司；Hoechst 33258染液（批号C1011）、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（批号P0015）、吉姆萨染液（批号C0131）、CCK-8试剂盒（批号C0043）、活性氧（reactive oxygen species，ROS）检测试剂盒（批号S0033S）、PMSF（批号ST505）、HRP标记的山羊抗大鼠IgG二抗（批号A0192）、Western blotting及IP细胞裂解液（批号072318180723）、30% Acr-Bis（批号093018181017）购自碧云天生物技术研究所；碘化丙啶（propidium iodide，PI）染液（批号R20285）、Rhodamine 123（批号R8004）购自美国Sigma公司；台盼蓝（批号72-52-1）购自美国默克公司；Reagent A染液（批号5000113）购自北京诺博莱德科技有限公司；聚山梨酯20（批号20190207）购自美国Biotopped公司；Tris（批号181127）购自美国Amresco公司；兔抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cystein-asparate protease-3，Caspase-3）抗体（批号WL02512）、兔抗B淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）抗体（批号WL01506）、兔抗Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）抗体（批号WL02385）、兔抗细胞色素C（cytochrome-C，Cyt-C）抗体（批号WL04963）、兔抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体（批号WL01114）购自沈阳万类生物科技有限公司；兔抗线粒体内膜转位酶（translocase of inner membrane，TIM）抗体（批号PSI-RF16109）、兔抗线粒体外膜转位酶（translocase of outer membrane，TOM）抗体（批号PSI57577）、兔抗E3泛素连接酶（E3 ubiquitin protein ligase，PARKIN）抗体（批号PSI50248）、兔抗PTEN诱导的激酶1（PTEN induced putative kinase 1，PINK1）抗体（批号PSI7859）、兔抗微管相关蛋白轻链3（microtubule-associated protein light chain 3，LC3-B）抗体（批号BS79705）、兔抗p62抗体（批号p196-269）购自艾美捷科技有限公司。 1.3 仪器 ECO-170P-230型细胞培养箱、Model 680型酶标仪（美国NBS公司）；Adventurer型万分之一电子天平（美国OHAUS公司）；EPICS-XL型流式细胞仪、AllegraTM 64R型低温高速离心机（美国Beckman-Coulter公司）；CKX-41-32型倒置显微镜（日本Olympus公司）；荧光显微镜、TCS-SP2激光共聚焦扫描显微镜（德国Leica公司）；680型全自动酶标仪（美国Bio-Rad公司）；P型微量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff]移液器[/color][/url]（芬兰百得公司）；标准型PB-10 pH计（德国Sartorius公司）；GIS-2019型Tannon凝胶成像系统（天能科技有限公司）；DYY-7C型电泳仪、M344039型垂直电泳转印槽（北京六一仪器厂）。 2 方法 2.1 细胞培养 MDA-MB-231细胞复苏后接种于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，置于5% CO2、37 ℃恒温培养箱中培养，待细胞长势良好时进行传代，取对数生长期的细胞进行实验。 2.2 CCK-8法检测细胞增殖活性 MDA-MB-231细胞以2×103个/孔接种于96孔板中，细胞培养24 h后，给药组每孔加入不同浓度（2、4、8、16、32 μmol/L）的石蒜碱100 μL，对照组加入100 μL细胞培养基，每组均设置6个平行孔，处理48 h后，每孔加入10 μL CCK-8试剂，继续培养4 h。采用酶标仪检测490 nm处的吸光度（A）值，计算各组细胞的增殖抑制率与石蒜碱对MDA-MB-231细胞的半数抑制浓度（half inhibitory concentration，IC50）。 2.3 倒置显微镜、荧光显微镜、激光共聚焦扫描显微镜观察细胞形态变化 MDA-MB-231细胞以3×103个/孔分别接种于2块6孔板中，细胞培养24 h后，根据石蒜碱对MDA-MB-231细胞的IC50设定3个给药剂量，分别以3、6、12 μmol/L的给药浓度每孔加入石蒜碱1 mL，对照组加入1 mL细胞培养基，继续处理48 h。取1块板用倒置显微镜观察并拍照后，每孔加入1 mL多聚甲醛固定1 h，冲洗后加入200 μL Hoechst 33258染液，37 ℃孵育30 min后，用荧光显微镜观察并拍照；取另1块板收集各组细胞，用预冷的PBS重悬细胞并弃去上清液，加入Annexin V-FITC于37 ℃避光孵育15 min，冲洗后加入PI染液于4 ℃避光孵育15 min后，用激光共聚焦扫描显微镜观察并拍照。 2.4 集落实验检测细胞克隆能力 MDA-MB-231细胞以1×103个/孔接种于6孔板中，细胞培养24 h后，按“2.3”项下方法对细胞进行分组和给药，连续培养7 d后弃去培养基。PBS洗涤后用甲醇固定10 min，冲洗后加入吉姆萨染液染色后，用倒置显微镜观察细胞集落形成率并拍照。 2.5 划痕实验检测细胞迁移能力 MDA-MB-231细胞以1×105个/孔接种于6孔板中，细胞培养24 h，细胞融合至70%～80%后，用200 μL[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff]移液器[/color][/url]倚靠直尺，枪头垂直于每孔底部竖直划痕。PBS冲洗后，按“2.3”项下方法对细胞进行分组和给药，培养48 h后，用倒置显微镜观察细胞的迁移情况并拍照记录，比较各组间的划痕宽度，使用Image J软件测量并计算划痕愈合率。 2.6 流式细胞仪检测细胞凋亡率 按“2.3”项下方法对细胞进行分组和给药，培养48 h后，收集各组细胞，加入70%冷乙醇2 mL于4 ℃固定24 h后离心。弃去上清液，PBS冲洗后，加入800 μL PI染液，4 ℃避光孵育30 min，经尼龙网滤过后，采用流式细胞仪进行检测，激发波长为488 nm。 2.7 流式细胞仪检测ROS水平 按“2.3”项下方法对细胞进行分组和给药，培养48 h，收集各组细胞，PBS洗涤后加入5 μmol/L DCFH-DA染液0.2 mL，37 ℃避光孵育20 min，经尼龙网滤过后，采用流式细胞仪进行检测。 2.8 流式细胞仪检测线粒体膜电位 按“2.3”项下方法对细胞进行分组和给药，培养48 h后，收集各组细胞，PBS洗涤后，避光加入Rhodamine 123染料，避光孵育30 min后离心弃去上清液，用PBS洗涤并混匀细胞，经尼龙网滤过后，采用流式细胞仪进行检测。 2.9 激光共聚焦扫描显微镜检测线粒体膜通透性转换孔（mitochondrial permeability transition pore，MPTP）活性 按“2.3”项下方法对细胞进行分组和给药，培养48 h后，收集各组细胞，加入37 ℃预热的Reagent A染液500 μL，离心后弃去上清液。37 ℃避光加入染色工作液，混匀后孵育20 min，离心去除上清液，将细胞吹打混匀后，经尼龙网滤过，采用激光扫描共聚焦显微镜检测并进行拍照。 2.10 Western blotting检测线粒体自噬相关蛋白TIM、TOM、PARKIN、PINK1、LC3-B、p62和凋亡相关蛋白Caspase-3、Bax、Bcl-2、Cyt-C表达 按“2.3”项下方法对细胞进行分组和给药，培养48 h后，收集各组细胞，加入含PMSF的细胞裂解液，冰上裂解30 min后将细胞加入EP管中，离心15 min。取上清液，煮沸使蛋白变性，采用BCA试剂盒定量蛋白浓度。采用SDS-PAGE凝胶电泳，转至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭2 h后，加入一抗，4 ℃孵育过夜。TBST洗膜后加入二抗，37 ℃孵化2 h，洗膜后加入化学发光试剂，采用凝胶成像系统拍照并进行分析。 2.11 统计学分析 用SPSS 21.0软件进行统计分析，数据以表示，多样本均数比较采用One-way ANOVA分析，通过Graphpad Prism 8软件绘图。 3 结果 3.1 石蒜碱对MDA-MB-231细胞增殖的影响 如图1所示，石蒜碱对MDA-MB-231细胞具有显著的增殖抑制作用（P＜0.01），且呈浓度相关性。石蒜碱对MDA-MB-231细胞的IC50为6.21 μmol/L，并参考IC50值设定后续石蒜碱给药浓度分别为3、6、12 μmol/L。 3.2 石蒜碱对MDA-MB-231细胞形态的影响 采用倒置显微镜、荧光显微镜、激光共聚焦显微镜观察石蒜碱对MDA-MB-231细胞形态的影响，如图2所示，与对照组比较，石蒜碱给药后，随着给药浓度增加，细胞生长逐渐变稀疏，细胞膜破裂现象更加明显，细胞间轮廓更加模糊，细胞核固缩形成凋亡小体，发出较强荧光。 3.3石蒜碱对MDA-MB-231细胞克隆、迁移的影响 集落实验结果表明，石蒜碱可以抑制MDA-MB-231细胞的克隆能力（图3-A），且随着浓度的增加细胞集落数量逐渐减少，且呈浓度相关性。划痕实验结果显示，石蒜碱可以显著抑制MDA-MB-231细胞的迁移能力（P＜0.01，图3-B、C），呈剂量相关性。 3.4 石蒜碱对MDA-MB-231细胞凋亡率、ROS水平的影响 如图4-A、B所示，经流式细胞仪PI单染法检测出现明显的凋亡峰，表明DNA的合成受到抑制，且随着给药浓度增加，凋亡峰越明显，凋亡率也呈上升趋势，与对照组比较有显著性差异（P＜0.01），且呈浓度相关性。如图4-C、D所示，随着给药浓度增加，细胞内ROS水平逐渐升高，具有显著性差异（P＜0.01），且呈浓度相关性。 3.5 石蒜碱对MDA-MB-231细胞线粒体膜电位和MPTP的影响 如图5-A、B所示，经流式细胞仪检测，随着石蒜碱给药浓度增加，细胞内线粒体膜阳性表达率逐渐降低，具有显著性差异（P＜0.01），且呈浓度相关性。如图5-C、D所示，应用激光扫描共聚焦显微镜结合AM染色技术对不同浓度的石蒜碱作用48 h后的MDA-MB-23细胞进行检测，激光扫描共聚焦显微镜扫描得到的荧光象素强度反映出细胞膜通透性的改变，随着给药浓度增加，细胞内线粒体膜通透性逐渐升高，具有显著性差异（P＜0.01），且呈浓度相关性。 3.6 石蒜碱对MDA-MB-231线粒体自噬和凋亡相关蛋白表达的影响 应用凝胶成像系统分析MDA-MB-231细胞中线粒体自噬和凋亡相关蛋白表达的情况。如图6所示，随着石蒜碱浓度增加，细胞自噬相关蛋白TIM、TOM和p62蛋白表达量逐渐降低，PARKIN、PINK1和LC3-B蛋白表达量逐渐升高，均具有显著性差异（P＜0.01）。如图7所示，随着石蒜碱浓度增加，细胞凋亡相关蛋白Bcl-2蛋白表达量逐渐降低，Bax、Caspase-3和Cyt-C蛋白表达量逐渐升高，均具有显著性差异（P＜0.01）。 4 讨论 乳腺癌已成为全球最常见的恶性肿瘤，与乳腺癌的其他分子亚型相比，TNBC最具侵袭性和高度异质性[20-22]，使其在临床上难以得到有效治疗。因此如何有效抑制TNBC侵袭、增殖和转移是目前亟待解决的问题。近年来，有研究表明中药在抗肿瘤方面具有显著的优势[23-25]。石蒜碱是异喹啉类生物碱，广泛分布于石蒜属植物鳞茎中，具有较强的抗肿瘤活性[26-27]。基于石蒜碱的抗肿瘤作用，结合课题组前期研究中TNBC细胞活性筛选，发现石蒜碱对MDA-MB-231细胞较为敏感，故选择MDA-MB-231细胞作为研究对象，本研究结果发现石蒜碱对MDA-MB-231细胞的增殖和迁移具有显著抑制作用，且呈浓度相关性。 ROS水平升高和线粒体功能障碍是诱导肿瘤细胞自噬和凋亡的重要途径[28]。研究发现，过量ROS的产生会诱发肿瘤细胞的损伤、自噬及凋亡并降低细胞的多药耐药性[29]。此外，肿瘤细胞对外源性ROS比正常细胞更敏感且ROS具有一定的细胞毒性。因此，促进ROS水平升高的药物可表现出一定的抗癌活性。有研究表明，线粒体功能障碍与多种恶性肿瘤的发生及ROS的过量产生密切相关[30]。本研究通过激光共聚焦显微镜和流式细胞仪检测结果表明，石蒜碱可以显著提高MDA-MB-231细胞凋亡率和ROS水平，并使线粒体膜电位下降，MPTP开放。这表明石蒜碱诱导细胞自噬和凋亡作用可能与线粒体的氧化损伤有关。 TOM及TIM是线粒体膜蛋白，当线粒体自噬增强时，其细胞内表达水平下降。研究表明线粒体损伤会使线粒体膜电位降低，导致PINK1在线粒体外膜上表达，从而使PINK1-PARKIN依赖性线粒体自噬反应被激活[31]。LC3-B是自噬体形成的特异性标志物，其含量与自噬泡数量成正比，因此被广泛用于监测细胞自噬。p62作为自噬降解的产物，自噬增强，p62水平会下降。p62还可与自噬体膜上的LC3-B蛋白及泛素化的蛋白形成复合物，在自噬溶酶体内完成降解[32]。ROS的过度累积，会触发MPTP开放，导致线粒体膜电位下降，引起Cyt-C从线粒体释放并进入细胞质中，进而激发Caspase的级联反应并启动细胞线粒体凋亡[33]。Bcl-2为抗凋亡蛋白，Bax为促凋亡蛋白，当接收到凋亡刺激信号后可转位至线粒体膜上，Bcl-2和Bax可形成二聚体或多聚体，从而增加细胞线粒体膜的通透性，进一步激活Caspase级联反应，Caspase-3可通过抑制凋亡抑制物，从而破坏细胞结构使蛋白丧失功能[34]。本研究通过Western blotting检测自噬相关蛋白和凋亡相关蛋白的表达，结果显示石蒜碱能够上调PARKIN、PINK1、LC3-B、Caspase-3、Bax和Cyt-C蛋白表达，下调TIM、TOM、p62和Bcl-2蛋白表达，表明石蒜碱可通过线粒体的氧化损伤介导MDA-MB-231细胞的自噬及凋亡。 综上，石蒜碱对MDA-MB-231细胞具有生长抑制作用，并可通过调控线粒体氧化损伤介导MDA-MB-231细胞的自噬及凋亡。本研究为石蒜碱抗肿瘤新药的深入研发和临床实践提供理论基础。

【背景】CIK是“Cytokine-Induced Killer Cells”的缩写，中文全称为“细胞因子诱导的杀伤细胞”。 CIK是单个核细胞在CD3单抗和多种细胞因子(包括IFN-g, IL-2等)的作用下培养获得的一群以CD3+CD56+细胞为主要效应细胞的异质细胞群， 其既具有T淋巴细胞强大的抗肿瘤活性，又具有NK细胞(自然杀伤细胞)的非MHC(主要组织相容性抗原)限制性肿瘤杀伤能力。CIK细胞具有杀瘤活性高、杀瘤谱广，对正常组织毒性低，体外可高度扩增等特点，是目前临床上广泛使用的过继性免疫治疗细胞。【培养原理】CIK培养用细胞因子和抗体：nCD3激发型单抗：T细胞活化的第一信号来自于T细胞表面的受体，即T细胞抗原受体(T cell antigen receptor, TCR)与APC提呈的抗原的特异性结合，也就是T细胞对抗原的特异性识别。TCR是由2条不同肽链构成的异二聚体，在T细胞表面，其与CD3分子通过非共价键结合，形成TCR/CD3复合体。TCR识别特异性抗原后会引起CD3和T细胞表面的辅助受体CD4或CD8分子的胞浆尾部聚集，进而激活与胞浆尾部相连的酪氨酸激酶(Lck, Fyn和ZAP-70等)，促使CD3分子胞浆区的免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif, ITAM)中的酪氨酸(Y)磷酸化。磷酸化的酪氨酸(pY)进一步磷酸化下游含酪氨酸的蛋白，从而引起激酶活化的级联反应(磷脂酰肌醇途径或MAP激酶途径等)，最终通过激活转录因子，使其进入细胞核内，结合于调控T细胞增殖和活化的靶基因(如IL-2和IFN-g等)，引起基因的表达和转录，T细胞因而由静止状态转为增殖和活化状态。由上可见，CD3分子在T细胞活化信号的转导中起着极其关键的作用。CD3激发型单抗与T细胞表面CD3分子特异性结合后，可引起CD3分子胞浆区ITAM基序中酪氨酸的磷酸化，进而导致T细胞增殖和活化的下游信号的激活，从而使T细胞增殖和活化。也就是说，CD3激发型单抗能够模拟抗原与TCR/CD3复合物的识别和激活过程，从而引起T细胞的增殖与活化，因此是CIK细胞培养中不可或缺的刺激因素。此外，CD3激发型单抗在选用时一定要注意克隆号。研究表明，仅克隆号为OKT-3的CD3激发型单抗可以刺激所有人的T细胞的增殖，而其它克隆号的CD3激发型单抗仅能刺激一部分人的T细胞。因此，在进行CIK培养时，最好选用OKT-3克隆，以保证每个患者的T细胞均能被激活。nIL-2 (白细胞介素-2)IL-2最初发现时被称为T细胞生长因子(T cell growth factor, TCGF)，是引起T细胞增殖最重要的细胞因子。IL-2既是自分泌细胞因子，也是旁分泌细胞因子，其通过与T细胞表面的IL-2受体(IL-2R)的特异性结合而促使T细胞活化，并进入细胞分裂状态。此外，IL-2还可刺激NK细胞的生长并增强其杀伤能力。因此CIK细胞培养中须添加IL-2，以促进T细胞的增殖与活化。nIFN-g (干扰素-g)IFN-g 具有上调外周血淋巴细胞表面IL-2R表达的作用，因此会增强T细胞对IL-2促增殖反应的敏感度和强度。在诱导CIK细胞形成的过程中加入IFN- g ，可降低IL-2的用量。研究发现，IFN-g加入的顺序与CIK的细胞毒活性密切相关。先加入IFN- g，培养24后再加入IL-2，可明显提高CIK的细胞毒活性。nIL-1a(白细胞介素-1a)IL-1a也可以介导外周血淋巴细胞表面上调表达IL-2R。当IL-1a与IFN-g和激发型CD3单抗合用时，可以明显提高CIK 的细胞毒作用。【细胞制备】1．外周血单个核细胞的采集1.1用血细胞分离机采集患者自身的外周血单个核细胞50-100mL；1.2淋巴细胞分离液密度梯度离心法进一步纯化单个核细胞(PBMC)；1.3无血清培养液洗涤2次，获得纯度在90%以上的PBMC。2．CIK细胞的培养及鉴定2.1将PBMC按1-2 x 106/ml的浓度悬浮于无血清培养液中，加入1,000 U/ml 的重组人IFN-g，37oC，5%CO2培养箱中培养；2.224h 后加入50ng/ml 的CD3 单克隆抗体和300 U/ml 的重组人IL-2，刺激CIK 细胞的生长和增殖；注：此时也可同时加入100 U/ml的重组人IL-1a。2.3每3天半量换液或扩瓶一次，并补加重组人IL-2 300 U/ml；2.4在培养的第14d，收获CIK细胞。2.5CIK细胞质控：2.9.1台盼蓝染色检测：活细胞应在80%以上；2.9.2流式细胞仪检测细胞表面CD3、CD8、CD56等分子的表达：CD3+CD56+细胞的比例应在20%以上。2.9.3细胞杀伤实验：以CIK细胞为效应细胞，以肿瘤细胞(可为原代肿瘤细胞或肿瘤细胞株)为靶细胞，将效应细胞与靶细胞按10 : 1(数目比) 的比例加入96 孔U 型板中，每孔含靶细胞1 x 104个，终体积为200 ml，设3个复孔。培养4h，然后取培养上清，用乳酸脱氢酶(LDH) 试剂盒检测效应细胞对靶细胞的杀伤率。2.9.4收获细胞前，取少量培养物进行细菌、真菌培养，并检测支原体、衣原体，及内毒素(标准：病原学检测阴性，内毒素5 Eu)。【步骤简图】http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2013/04/B1366873006_small.jpg 【推荐试剂】http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2013/04/B1366873008_small.jpg 注：Animal Free意为无动物成分。无动物成分的重组细胞因子在生产过程中不会有任何动物源性物质，尤其是牛蛋白的混入，使得最终获得的重组人蛋白中不含任何动物成分。这样可避免动物病原体(如疯牛病，克雅氏病等)的污染及外源蛋白引起的机体异种排斥和过敏反应，因此细胞治疗的体外细胞培养过程中最好使用无动物成分的重组细胞因子。【其它相关试剂】 http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2013/04/B1366873009_small.jpg【参考文献】 Li R, Wang C, et al. Autologous cytokine-induced killer cell immunotherapy in lung cancer: a phase II clinical study. Cancer Immunol Immunother. 2012; 61:2125-2133

[font=宋体][font=宋体]在生物学和医学研究中，细胞增殖是一个关键过程，对于理解生命活动的基本规律以及疾病的发病机理具有重要意义。随着科技的发展，流式细胞仪作为一种高效、灵敏的分析工具，广泛应用于细胞增殖的检测。流式细胞仪通过快速分析单个细胞，可以对细胞周期、细胞增殖活性、细胞凋亡等多个方面进行研究。本文将探讨流式细胞仪在检测细胞增殖方面的主要方法，包括但不限于溴脱氧尿苷（[/font][font=Calibri]BrdU[/font][font=宋体]）掺入法、细胞周期蛋白检测法以及细胞大小分析法等，以期为读者提供全面的技术应用概览。流式细胞仪检测细胞增殖方法：[/font][/font][b][font=宋体][font=Calibri]1[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]3H[/font][font=宋体]（氚离子）掺入法[/font][/font][/b][font=宋体][font=宋体]原理：是在细胞[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]合成时，用[/font][font=Calibri]3H[/font][font=宋体]脱氧胸腺嘧啶核苷代替普通的脱氧胸腺嘧啶核苷掺入新合成的[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]中，增殖的细胞因为掺入[/font][font=Calibri]3H[/font][font=宋体]而具有放射性，通过定量检测样品细胞的放射性大小而反映细胞的增值活性[/font][/font][font=宋体][font=宋体]缺点：[/font][font=Calibri]1[/font][font=宋体]）使用的是具有放射性的同位素，操作较为复杂，同时需要采取放射性保护措施 [/font][font=Calibri]2[/font][font=宋体]）低比例高活跃增殖和高比例低活跃增殖可能得到的是相同的结果，用此方法无法进行鉴别 [/font][font=Calibri]3[/font][font=宋体]）此方法无法进一步得到具有活性的增值细胞用于下一步的研究 [/font][font=Calibri]4[/font][font=宋体]） 此方法时间较短，无法检测加入前细胞的增殖情况，而且检测到放射性只能说明细胞[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]合成，而不能提供合成[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]的细胞是否进入增殖阶段的信息[/font][/font][b][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]、相对计数法[/font][/font][/b][font=宋体]原理：将对照组和各实验组控制在相同条件下直接计数然后比较计数结果得到增殖结论[/font][font=宋体]注意点：[/font][font=宋体][font=宋体]对照组与实验组每种细胞所加浓度必须相同，每组至少设置[/font][font=Calibri]3[/font][font=宋体]个复孔，这样每个孔可以得到[/font][font=Calibri]1[/font][font=宋体]个细胞数，将[/font][font=Calibri]3[/font][font=宋体]个复孔取平均值后就是这个组的结果。如果同时需要得到每孔目标细胞增殖后的绝对参数，在每孔细胞中加入[/font][font=Calibri]1*105PE[/font][font=宋体]标记的人工微球作为内参[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]收集各组的细胞于[/font][font=Calibri]EP[/font][font=宋体]管中，注意必须尽量将各组的所有细胞都收集起来。标记需要计数细胞的标志表型的荧光素偶联抗体，[/font][font=Calibri]4[/font][font=宋体]℃静置[/font][font=Calibri]30min[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]PBS[/font][font=宋体]洗涤一次，洗去游离的抗体[/font][/font][b][font=宋体][font=Calibri]3[/font][font=宋体]、示踪染料标记法[/font][/font][/b][font=宋体][font=宋体]示踪染料与细胞结合的方式：[/font][font=Calibri]1[/font][font=宋体]）能够与细胞内的蛋白质上的氨基发生非特异性的共价结合 [/font][font=Calibri]2[/font][font=宋体]）能够非特异性地嵌入细胞膜的脂质双分子层中与细胞发生非共价性结合[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]原理：示踪染料的荧光信号都很强，当细胞分裂时，母细胞内的染料会被平均分配到子细胞中，细胞荧光信号会被减弱一半，所以通过检测减弱的、发射示踪染料荧光信号的细胞比例就可以判断细胞增殖的强弱。当荧光强度减弱到标记时的[/font][font=Calibri]1/2[/font][font=宋体]以及以下的细胞都是增殖后的细胞，这些细胞所占比例越高则代表细胞增殖越活跃[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]标记方法：[/font][font=宋体][font=宋体]①纯化增殖反应的目标细胞，将细胞的浓度调整为[/font][font=Calibri]1*106/ml[/font][font=宋体]，加入[/font][font=Calibri]CFSE[/font][font=宋体]，其标记浓度为[/font][font=Calibri]5[/font][font=宋体]微摩尔[/font][font=Calibri]/[/font][font=宋体]升。置于[/font][font=Calibri]37[/font][font=宋体]℃水浴中标记[/font][font=Calibri]15min[/font][font=宋体]，在标记过程中每隔一段时间混匀细胞一次[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]②加入预冷、含有血清的培养基终止标记，在[/font][font=Calibri]4[/font][font=宋体]℃冰箱中静置[/font][font=Calibri]5min[/font][font=宋体]，离心沉淀[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]③用培养基再洗涤一次，尽量洗净未结合的游离的[/font][font=Calibri]CFSE[/font][font=宋体]，然后将目标细胞静置在增殖体系中[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=Calibri]4[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]BrdU[/font][font=宋体]和[/font][font=Calibri]EdU[/font][font=宋体]掺入法[/font][/font][/b][font=宋体][font=Calibri]BrdU[/font][font=宋体]：[/font][font=Calibri]5-[/font][font=宋体]溴脱氧尿嘧啶核苷是胸腺嘧啶核苷的类似物，其特点是胸腺嘧啶环上[/font][font=Calibri]5[/font][font=宋体]位[/font][font=Calibri]C[/font][font=宋体]连接的甲基被溴取代，在细胞增殖[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]合成时可以与内源性的胸腺嘧啶核苷竞争掺入到新合成的[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]中，而[/font][font=Calibri]BrdU[/font][font=宋体]抗体可以特异性的识别[/font][font=Calibri]BrdU[/font][font=宋体]，不与胸腺嘧啶核苷结合，所以可以用于检测细胞增殖[/font][/font][font=宋体][font=宋体]适用范围：适用于体内检测目标细胞的增殖，一般将[/font][font=Calibri]BrdU[/font][font=宋体]掺入小鼠的应用水中或经腹腔注射，经过一段时间后，取出目标细胞制成单细胞悬液然后用多聚甲醛固定细胞，后用打孔剂皂苷在细胞膜上打孔，最后标记荧光素偶联抗[/font][font=Calibri]BrdU[/font][font=宋体]抗体，目标细胞的[/font][font=Calibri]BrdU[/font][font=宋体]阳性细胞就是增殖的细胞，阳性比例越高，增殖越活跃。[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=Calibri]5[/font][font=宋体]、其他方法[/font][/font][/b][font=宋体][font=宋体]细胞周期法检测细胞增殖：流式细胞术能够检测细胞内[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]的含量，所以可以检测细胞周期。处于[/font][font=Calibri]S[/font][font=宋体]期的细胞，[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]的量处于二倍体和四倍体之间[/font][font=Calibri] [/font][font=宋体]处于[/font][font=Calibri]G2/M[/font][font=宋体]期时，[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]量为四倍体。处于[/font][font=Calibri]S[/font][font=宋体]期和[/font][font=Calibri]G2/M[/font][font=宋体]期的细胞比例越高说明细胞增殖越活跃[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]PCNA[/font][font=宋体]检测细胞增殖：[/font][font=Calibri]PCNA[/font][font=宋体]（增殖细胞核抗原），在细胞核合成且只存在于细胞核内，是[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]聚合酶的辅助蛋白，所以与细胞[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]的合成关系密切，是反映细胞增殖状态的良好指标[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]Ki-67[/font][font=宋体]检测细胞增殖：是一种与细胞增殖特异相关的核抗原[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]CD71[/font][font=宋体]检测细胞增殖：是转铁蛋白受体，表达于细胞的表面，该受体广泛表达于各种恶性肿瘤细胞表面，正常细胞表达较少，与肿瘤细胞的增殖密切相关[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州提供[url=https://cn.sinobiological.com/services/flow-cytometry-service][b]流式细胞检测技术服务[/b][/url]，更多关于流式细胞仪检测细胞增殖详情欢迎咨询，详情可以关注：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/flow-cytometry-service[/font][/font][b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州：蛋白与抗体的专业引领者，欢迎通过百度搜索[/font][font=宋体]“义翘神州”与我们取得联系。[/font][/font][/b]

[b][b][font=&][size=18px]会议咨询：[font=inherit]顾成刚13621995193（微信同号）[/font][/size][/font][/b][font=&][size=18px][color=#404040]2022深圳细胞产业大会[/color][/size][size=18px][color=#404040]第九届（深圳）细胞与肿瘤精准医疗高峰论坛[/color][/size][size=18px][color=#404040]2022年8月深圳 11月 武汉[/color][/size][/font][font=&][size=18px]深圳会议时间：2022年8月21-22日[size=16px][/size][/size][/font][font=&][size=18px][size=16px]深圳会议地点：深圳湾万丽酒店（深圳市南山区科技南路18号）[/size][/size][/font][font=&][size=18px][size=16px][/size][/size][size=18px][color=#404040][/color][/size][size=18px][color=#404040]同期举办：[/color][/size][size=18px][color=#404040]细胞与基因治疗前沿技术应用峰会 外泌体技术转化与疾病研讨会[/color][/size][size=18px][color=#404040]单细胞多组学研究与临床应用峰会 3D细胞培养与类器官临床应用峰会[/color][/size][/font][color=#404040]细胞外囊泡前沿与转化峰会[/color][color=#404040][img]https://img-user-qn.hudongba.com/upload/_oss/userarticleimg/202207/28/31658988346866_article3_1579.png?image/auto-orient,1/quality,q_80[/img][/color][color=#404040]招展联系人：顾先生13621995193（微信Wechat）[/color][size=14px][color=#404040]大会概况：[/color][color=#404040]2022细胞产业大会 2022第九届（深圳）细胞与肿瘤精准医疗高峰论坛将于8月在深圳举办，本次峰会紧密围绕政策规范、监管、工艺与产业化进展、细胞与基因治疗、外泌体临床研究与疾病治疗、外泌体临床检验与肿瘤免疫治疗、细胞外囊泡领域的机制研究、体外诊断及疾病治疗、单细胞多组学、单细胞测序、3D细胞培养与类器官、溶瘤病毒药物的开发与产业转化、干细胞临床前研究与临床应用转化、干细胞存储与治疗、肿瘤免疫治疗、通用型CAR-T细胞治疗、基因治疗及溶瘤病毒、实体瘤治疗及药物开发、临床研究与治疗进展等话题，特邀来自国家药品审评监管机构、科研院所、医疗机构、创新药企、生物治疗、生物技术和服务企业、产业链上下游企业、产业园区、投资机构、行业协会等多位权威专家与产业先锋进行分享交流及产品展示。组委会竭诚搭建优质对话合作平台，诚邀您八月深圳相聚，共襄盛会！[/color][color=#404040]近年来，现代生命科学与生物技术取得了一系列重要进展和重大突破，尤其是以干细胞、免疫细胞为核心的细胞治疗技术更是迅猛发展，在多种难治性疾病的临床研究上获得了许多成绩，在未来展现出了巨大的应用前景细胞治疗受到前所未有的重视，国家和地方层面也密集出台相关政策，支持干细胞、免疫细胞研究的发展。[/color][color=#404040]2009年单细胞测序技术强势问世，发展至今，单细胞测序技术已经在肿瘤、临床诊断、免疫学、微生物学、神经科学等领域占有重要的应用地位，是目前研究和应用的点。研究范围也不再只是基因组、转录组学，而扩展到了表观基因组、空间转录组学、代谢组、免疫组、蛋白组谱系。这些“多组学”技术允许研究人员更仔细地观察细胞之间的异质性，更清楚地识别特定细胞及其功能。[/color][color=#404040]细胞与基因治疗改变了人类治疗遗传疾病和疑难杂症的方式，并正在撬动整个制药生态圈。在各种适应症需求的推动下，细胞与基因治疗快速发展，多种细胞免疫疗法、干细胞疗法、基于腺相关病毒及慢病毒载体的基因疗法相继问世，为复发难治性肿瘤及严重的基因遗传缺陷类疾病提供了重要的治疗选择。随着CAR-T免疫细胞疗法在国际以及国内获批上市，细胞和基因疗法进入了全新的赛道，整个行业进入了技术突破和产业化的快速演进。[/color][color=#404040]2022细胞产业大会 2022第九届（深圳）细胞与肿瘤精准医疗高峰论坛将于8月在深圳举办，本次峰会紧密围绕政策规范、监管、工艺与产业化进展、干细胞临床前研究与临床应用转化、干细胞存储与治疗、肿瘤免疫治疗、细胞与基因治疗、通用型CAR-T细胞治疗、单细胞多组学、单细胞测序、细胞外囊泡分离及检测、3D细胞培养与类器官、基因治疗及溶瘤病毒、实体瘤治疗及药物开发、临床研究与治疗进展等话题，特邀来自国家药品审评监管机构、科研院所、医疗机构、创新药企、生物治疗、生物技术和服务企业、产业链上下游企业、产业园区、投资机构、行业协会等多位权威专家与产业先锋进行分享交流及产品展示。组委会竭诚搭建优质对话合作平台，诚邀您八月深圳相聚，共襄盛会！[/color][color=#404040]专题会议[/color][color=#404040]1、干细胞临床研究与转化应用峰会[/color][color=#404040]干细胞临床前研究与转化应用[/color][color=#404040]干细胞临床前研究与临床应用转化[/color][color=#404040]干细胞治疗技术与临床研究[/color][color=#404040]干细胞与免疫细胞临床研究的制剂质量评价[/color][color=#404040]干细胞治疗质量控制管理的现状与未来[/color][color=#404040]干细胞与类器官研究[/color][color=#404040]干细胞外泌体的应用[/color][color=#404040]干细胞与再生医学[/color][color=#404040]间充质干细胞外囊泡治疗难治性疾病[/color][color=#404040]新型干细胞治疗新冠肺炎[/color][color=#404040]2、肿瘤免疫治疗产业转化领袖峰会[/color][color=#404040]细胞免疫治疗研发突破与商业化进程[/color][color=#404040]通用型CAR-T细胞免疫治疗[/color][color=#404040]细胞免疫治疗质量控制&产业化[/color][color=#404040]细胞治疗药物研发与商业化生产[/color][color=#404040]细胞治疗产品开发与工艺优化[/color][color=#404040]TIL细胞在实体瘤治疗中的技术挑战与发展趋势[/color][color=#404040]iPSC来源的CAR先天性免疫细胞及其在肿瘤免疫细胞治疗中的应用[/color][color=#404040]细胞外囊泡的多组学研究[/color][color=#404040]细胞外囊泡RNA组分解析及其应用[/color][color=#404040]外泌体技术的开发与临床转化[/color][color=#404040]3、单细胞多组学研究与临床应用峰会[/color][color=#404040]单细胞多组学研究与临床应用[/color][color=#404040]单细胞转录组技术致力于大脑发育及神经干细胞调控的研究[/color][color=#404040]单细胞多组学科学创新前沿及最新技术[/color][color=#404040]单细胞空间组学的开发与应用进展[/color][color=#404040]单细胞技术助力精准医学研究[/color][color=#404040]单细胞组学研究技术在肿瘤免疫与个性化治疗中的应用[/color][color=#404040]单细胞技术在肿瘤微环境及肿瘤细胞异质性探究中的应用[/color][color=#404040]单细胞测序结合多组学技术的应用[/color][color=#404040]4、细胞与基因治疗前沿技术应用峰会[/color][color=#404040]细胞及基因治疗的临床研究与产业转化[/color][color=#404040]细胞与基因治疗的国内外最新研究进展[/color][color=#404040]细胞与基因治疗CDMO[/color][color=#404040]基因治疗及溶瘤病毒产品的开发[/color][color=#404040]AAV基因治疗药物大规模生产工艺研究及成本控制[/color][color=#404040]基因治疗GMP病毒载体规模化生产[/color][color=#404040]基因工程化外泌体用于肿瘤靶向治疗的研究[/color][color=#404040]溶瘤病毒及RNA疗法[/color][color=#404040]5、3D细胞培养与类器官临床应用峰会[/color][color=#404040]3D细胞培养与类器官前沿进展[/color][color=#404040]3D类器官培养技术发展及其应用[/color][color=#404040]类器官基础研究与技术开发[/color][color=#404040]类器官临床医学研究与应用[/color][color=#404040]类器官药物筛选与生物制造[/color][color=#404040]类器官技术的科研应用和临床转化[/color][color=#404040]类器官在肿瘤精准医学研究中的应用[/color][color=#404040]类器官在伴随诊断和新药研发中的应用和进展[/color][color=#404040]微流控器官芯片在精准医疗及药物研发中的应用[/color][color=#404040]* 最终议程以现场为准，发言企业可自行命题[/color][color=#404040]更多嘉宾邀约中，欢迎各单位推荐自荐！[/color][color=#404040]* 最终以现场为准[/color][color=#404040]谁将参与[/color][color=#404040]全国各大医院的院长、医院管理者、肿瘤内科、肿瘤外科、生物治疗科、血液科、病理科、辅助生殖科、检验科等各科室主任医师、副主任医师、主治医生及从相关领域研究的专家、科研人员、医药企业等；[/color][color=#404040]科研院所、生物医药企业、技术服务代理商及投资机构、临床医生等；[/color][color=#404040]知名高校的教授、研究员、副研究员及生命科学专业、药学专业、医学专业、免疫学专业等；[/color][color=#404040]细胞及肿瘤抗体免疫治疗上游供应商、诊断试剂及设备服务商、技术与设备仪器提供商、IT大数据解决方案提供商等；[/color][color=#404040]基因治疗、基因编辑、基因测序、基因检测公司、生物技术公司研发人员等技术人员、研发总监等；[/color][color=#404040]精准医疗方面的机构、企业、细胞存储与治疗上、中、下游产业链的企业以及CRO、CMO等；[/color][color=#404040]CEO及药厂研发负责人：抗体免疫治疗药物研发、免疫细胞治疗及制品开发、溶瘤病毒、治疗性疫苗、小分子免疫治疗药物、细胞治疗与再生医学领域的专家、临床研究人员、从业医师、研究生以及细胞治疗与再生医学领域的医疗用品科研人员与厂商等；[/color][color=#404040]政府机构与代表、产业园区、招商局、投资孵化机构、咨询与培训机构、银行、律师、知识产权、证券公司等。[/color][/size][size=14px][color=#404040][img=2021.9嘉宾集竖版.jpg,1047,1177]https://img-user-qn.hudongba.com/upload/_oss/uePasteUpload/202206/2315/1655968748942_2757.jpg?image/auto-orient,1/quality,q_80[/img][/color][/size][size=14px][color=#404040]2021细胞产业大会 2021第六届（上海）细胞与肿瘤精准医疗高峰论坛伴随着为期两天的会议和三天的展览于4月25日在上海展览中心（上海市静安区延安中路1000号）落下帷幕！本次大会集聚60+行业大咖到场分享精彩演讲，现场参观参会人数高达1800多人，共有100多家优质展商和60多家行业媒体列席，呈现出一场学术与产业紧密交融的盛宴。细胞产业大会成熟的“会议+展览”的模式得到了参会嘉宾、参展企业及参会代表的一致好评！[/color][/size][size=14px][color=#404040][img=2021.4嘉宾集竖版.jpg,1047,1266]https://img-user-qn.hudongba.com/upload/_oss/uePasteUpload/202206/2315/1655968747557_2756.jpg?image/auto-orient,1/quality,q_80[/img][/color][/size][size=14px][color=#404040]2021细胞产业大会 2021第七届（深圳）细胞与肿瘤精准医疗高峰论坛/2021基因与精准诊疗（深圳）高峰论坛/2021肿瘤精准诊疗（深圳）论坛伴随着为期两天的会议和展览于10月27日在深圳会展中心落下帷幕！疫情特殊时期，本次大会采用了“线上（约12万人观看）+线下（600多人参加）”相结合的方式同步进行的，专家们以专业的视角分享行业动态，以战略的眼光探讨产业发展，共商细胞治疗、基因治疗及肿瘤精准诊疗的未来发展之路！[/color][color=#404040]活动预告[/color][color=#404040]2022细胞产业大会[/color][color=#404040]2022第九届（深圳）细胞与肿瘤精准医疗高峰论坛[/color][color=#404040]时间：2022年8月[/color][color=#404040]地点：深圳[/color][color=#404040]2022细胞产业大会[/color][color=#404040]2022第十届（武汉）细胞与肿瘤精准医疗高峰论坛[/color][color=#404040]时间：2022年11月[/color][color=#404040]地点：武汉[/color][color=#404040]展位及论坛赞助[/color][color=#404040]赞助商及演讲收费标准：[/color][color=#404040]套餐一：2个开放式展位+40分钟演讲+大会电子版会刊封三+资料入袋 RMB 100,000[/color][color=#404040]套餐二：1个开放式展位+30分钟演讲+大会电子版会刊彩页1P RMB 50,000[/color][color=#404040]套餐三：1个开放式展位+20分钟演讲+大会电子版会刊彩页1P RMB 40,000[/color][color=#404040]套餐四：20分钟演讲 RMB 20,000[/color][color=#404040]套餐六：1个开放式展位 RMB 22,800[/color][color=#404040]套餐七：光地展位每平方米 RMB 2,000[/color][color=#404040]听众参会代表收费标准：[/color][color=#404040]2022年8月1日前注册RMB 1,000/人，8月1日后注册RMB 1,200/人（深圳） [/color][color=#404040]2022年11月1日前注册RMB 1,000/人；11月1日后注册RMB 1,200/人（武汉） [/color][color=#404040]团体注册：3人以上可享受9折优惠（深圳、武汉两地均享此政策）[/color][color=#404040]费用包含：会议资料、大会入场资格、授权老师的PPT、午餐、茶歇等。[/color][color=#404040]上海顺展展览服务有限公司[/color][color=#404040]联系人：顾先生13621995193（微信Wechat）[/color][color=#404040]邮箱：[/color][/size][size=14px][color=#404040][email]2498299886@qq.com[/email][/color][/size][size=14px][color=#404040]地址：上海市松江区沪松公路1221号星晨大厦801室[/color][/size][size=14px][color=#404040][img]https://img-user-qn.hudongba.com/upload/_oss/userarticleimg/202207/28/11658988287538_article1_1574.png?image/auto-orient,1/quality,q_80[/img][/color][/size][/b][font=仿宋][/font]

原标题 “纳米生物间谍”技术能进入活细胞取样 可用于深入揭示线粒体基因组变异的重要性 科技日报讯 据物理学家组织网近日报道，美国加利福尼亚大学圣克鲁兹分校（UCSC）研究人员开发出一种机器人式的“纳米生物间谍”系统，能从单个活细胞内提取出微量样本，进行RNA或DNA测序，而不会杀死细胞。研究人员表示，这种单细胞“纳米生物间谍”技术是一种了解活细胞内部动态过程的有力工具。相关论文发表在最近出版的美国化学协会《纳米》杂志上。 “我们能从活细胞中拿走一个‘生物间谍’，再把它送回该细胞，在几天内这样重复多次而不会杀死细胞。如果用其他技术，你不得不牺牲这个细胞才能分析它。”该生物传感与生物电技术小组负责人、UCSC巴斯金工程学院生物分子工程教授内德·波曼德说。 “纳米生物间谍”平台是研究小组用纳米吸液管开发的最新设备。纳米吸液管是一种小玻璃管，取液端越来越细，至尖端直径仅50到100纳米。波曼德说：“我能在实验室造出纳米吸液管，这不需要昂贵的纳米制造设备。但要进入一个细胞，问题是即使在高倍显微镜下，你也看不见吸液管尖端，不知道它偏离了细胞有多远。” 实验室博士后研究员亚当·赛格尔解决了这一问题。他基于在一台改造过的扫描离子电导显微镜（SICM），开发出一种反馈控制系统。该系统能利用通过纳米吸液管尖端的离子流作为反馈信号，在尖端接近细胞表面时探测其中的液滴。在尖端进入细胞之前，一种自动控制系统能定位它在细胞上面的位置，然后尖端很快插入穿透细胞膜，通过操控电压有控制地提取一小点细胞内物质。由于吸液管尖端极精细，对细胞造成的损害极微小。 研究小组用这种系统从活细胞中提取的微量细胞物质，估计只有50毫微微升（千万亿分之一升），约一个人体细胞百分之一的量。他们从单个人体癌细胞中提取物质并进行RNA测序，还从人类成纤维细胞中提取了线粒体并对其进行了DNA测序。“人们已经知道，线粒体和多种神经退化疾病有关。该技术可用于深入揭示线粒体基因组变异的重要性。”波曼德说。 该技术应用前景广阔。波曼德希望能与其他研究人员合作，探索其更多用途。“对于癌症生物学家、干细胞生物学家等想要了解细胞内部情况的科学家来说，这是一种多功能的平台。”（常丽君）来源：中国科技网-科技日报 2014年01月20日

[b][size=15px][color=#595959]多囊卵巢综合征(PCOS)[/color][/size][/b][size=15px][color=#595959]患者和动物模型表现出闭锁卵泡增加、[b]颗粒细胞(GCs)[/b]紊乱、细胞层变薄和黄体数量减少。一些研究表明，卵泡发育不良与GCs存在相关性。GCs为正常卵泡发育提供必要的激素和营养支持。目前关于PCOS和卵泡发育的大量实验研究都是为了了解GCs的功能。[/color][/size] [b][size=15px][color=#595959]滋肾清热利湿化瘀方(ZQLHR)[/color][/size][/b][size=15px][color=#595959]由知母、山萸肉、丹参、桃仁、薏苡仁、白芥子、黄柏、玄参、甘草组成，是在中医理论和临床实践的基础上创制的中药方剂，主要用于PCOS。前期研究发现，ZQLHR能有效提高PCOS患者自主排卵率及有排卵月经的发生率，并能改善痤疮及降低血清睾酮水平。然而，ZQLHR治疗PCOS的潜在机制尚未清楚阐明。[/color][/size] [size=15px][color=#595959]验证ZQLHR是否通过Krüppel样因子4[b](KLF4)[/b]-CCATT增强子结合蛋白β [b](C/EBPβ)[/b]通路调控GCs[b]增殖和凋亡[/b]，为ZQLHR促进卵泡发育和治疗PCOS患者的作用提供体外分子机制支持。 [/color][/size] [size=15px][color=#595959]在前期实验的基础上，首先用不同浓度的ZQLHR处理KGN细胞(一种类固醇性人颗粒样[b]肿瘤细胞[/b]系)48 h，观察各组细胞的凋亡情况。其次，采用实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url](q-[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url])和Western blot检测ZQLHR给药后KGN细胞中KLF4和C/EBPβ mRNA和蛋白的表达水平。第三，利用siRNA敲除KLF4和C/EBPβ后，检测KGN细胞中KLF4和C/EBPβ的关系。[/color][/size] [size=15px][color=#595959]进一步通过细胞计数试剂盒-8、集落形成实验和流式细胞术验证ZQLHR是否通过[b]KLF4-C/EBPβ通路[/b]促进KGN细胞增殖和凋亡。最后，采用q-[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]和Western blot检测ZQLHR是否通过KLF4-C/EBPβ通路介导b细胞[b]淋巴瘤[/b]-2 (Bcl-2)、Bcl-2相关X (BAX)、增殖细胞核抗原(PCNA)和裂解caspase-3等增殖和凋亡相关因子影响KGN细胞的增殖和凋亡。[/color][/size] [b][size=15px][color=#595959][/color][/size][size=15px][color=#595959][/color][/size][size=15px][color=#595959][/color][/size][size=15px][color=#595959][/color][/size][size=15px][color=#595959][/color][/size][size=15px][color=#595959][/color][/size][/b][font=&][size=16px][color=#232323][/color][/size][/font][b][size=15px][color=#595959][/color][/size][size=15px][color=#595959][/color][/size][size=15px][color=#595959][/color][/size][size=15px][color=#595959][/color][/size][size=15px][color=#595959][/color][/size][size=15px][color=#595959][/color][/size][size=15px][color=#595959][/color][/size][/b][font=&][size=16px][color=#232323][/color][/size][/font][size=15px][color=#595959][font=&][/font][font=&][/font][/color][/size][b][size=15px][color=#595959][/color][/size][size=15px][color=#595959][/color][/size][size=15px][color=#595959][/color][/size][/b][font=&][size=16px][color=#232323][/color][/size][/font][b][size=15px][color=#595959][/color][/size][size=15px][color=#595959][/color][/size][size=15px][color=#595959][/color][/size][/b][size=15px][color=#595959][font=&][/font][/color][/size][size=15px][color=#595959]体积0.2%的ZQLHR对KGN细胞的凋亡率最低。ZQLHR处理后，KGN细胞中KLF4和C/EBPβ的表达水平升高。此外，ZQLHR通过KLF4-C/EBPβ通路调节增殖和凋亡相关因子，促进KGN细胞增殖和抑制凋亡。此外，[b]证实了KLF4和C/EBPβ在KGN细胞中相互调节[/b]。这些结果表明，[b]ZQLHR可增强GCs的增殖并抑制其凋亡，这可能是治疗PCOS患者的一种治疗机制[/b]。[/color][/size][size=15px][color=#595959][font=&][/font][/color][/size][size=15px][color=#595959][/color][/size][size=15px][color=#595959][/color][/size][size=15px][color=#595959][/color][/size][font=&][size=16px][color=#232323][/color][/size][/font][size=15px][color=#595959][/color][/size][size=15px][color=#595959][/color][/size]

[size=3][font=Times New Roman]1. [/font][font=宋体]附着细胞的凋亡研究：在悬液中的细胞比贴壁细胞更容易发生凋亡，建议在用胰蛋白酶处理前单独收集培养液中悬浮的细胞。[/font][/size][size=3][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=Times New Roman]2.[/font][font=宋体]固定剂的影响：在做[/font][font=Times New Roman]DNA[/font][font=宋体]断裂片段分析凋亡细胞时（如[/font][font=Times New Roman]APO-BRDU[/font][font=宋体]、[/font][font=Times New Roman]APO-DIRECT[/font][font=宋体]），要注意使用化学固定剂（如多聚甲醛）固定细胞，使[/font][font=Times New Roman]DNA[/font][font=宋体]交联。原因是：在洗细胞的步骤中，未固定的细胞可能会丢失小的[/font][font=Times New Roman]DNA[/font][font=宋体]片段，而使用化学试剂固定后的细胞，小[/font][font=Times New Roman]DNA[/font][font=宋体]片段就不会丢失。建议做[/font][font=Times New Roman]DNA[/font][font=宋体]断裂片段分析细胞系时，比较不同的固定剂和破膜剂的效果。[/font][/size][size=3][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=Times New Roman]3.[/font][font=宋体]为了减少细胞丢失，染色、分析时建议使用[/font][font=Times New Roman]12[/font][font=宋体]′[/font][font=Times New Roman]75mm[/font][font=宋体]聚苯乙烯管。其它类型的试管（如聚丙烯管），会使细胞在管壁堆积，造成细胞丢失，并影响染色效果。洗细胞后，建议轻轻药匀细胞沉淀，避免使用加液枪，以免由于塑料枪头的使用造成细胞损失。[/font][/size][size=3][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=Times New Roman]4.[/font][font=宋体]洗细胞时应注意应洗到管壁内侧细胞可能附着的位置，使细胞充分悬浮。这样可以避免在随后的染色步骤中，由于细胞贴壁或悬着不充分，造成细胞染色不均一。如果细胞染色不均，在荧光参数分析时，表现为双峰现象，即多出一群着色弱的细胞。[/font][/size][size=3][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=Times New Roman]5.[/font][font=宋体]做[/font][font=Times New Roman]APO-BRDU[/font][font=宋体]或[/font][font=Times New Roman]APO-DIRECT[/font][font=宋体]分析时，若发现染色荧光弱，可以适当延长[/font][font=Times New Roman]BrdU[/font][font=宋体]掺入反应的时间。一些细胞的反应时间可以到[/font][font=Times New Roman]37[/font][font=宋体]°[/font][font=Times New Roman]C 4[/font][font=宋体]小时。[/font][/size][size=3][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=Times New Roman]6.[/font][font=宋体]做[/font][font=Times New Roman]APO-BRDU[/font][font=宋体]或[/font][font=Times New Roman]APO-DIRECT[/font][font=宋体]分析时，可以结合[/font][font=Times New Roman]PI[/font][font=宋体]染色，研究凋亡与细胞[/font][font=Times New Roman]DNA[/font][font=宋体]周期的关系。[/font][/size]

肌肉能提供干细胞来促进肌肉的生长和受伤肌肉的再生，但肌肉干细胞必须驻留在特殊的部位才能有助肌肉的生长和修复。德尔柏林布吕克分子医学中心（MDC）发育生物学家Dominique Bröhl和Carmen Birchmeier教授已经阐明这些干细胞是如何定植于肌肉干细胞“巢穴”中的。肌肉干细胞也被称为卫星细胞，位于平滑肌细胞的质膜和周围基底层之间。可发育分化为成肌细胞，后者可互相融合成为多核的肌纤维，形成骨骼肌最基本的结构。http://www.bioon.com/biology/UploadFiles/201209/2012091813042153.jpg在本研究中，Bröhl博士和教授Birchmeier表明，小鼠的肌肉祖细胞缺乏Notch信号后，不能定植于干细胞“巢穴”。相反，肌肉祖细胞会定植于肌纤维之间的组织中。发育生物学家认为，这是肌肉弱化的原因。干细胞定植于错误的地方就不再像以前那样拥有多种生物学功能，难以有助于肌肉生长。此外，Notch信号通路在肌肉的发育过程中具有第二大功能。它可以通过抑制肌肉发育促进因子MyoD防止干细胞分化成肌肉细胞，从而确保肌肉中总会存在能保存有修复和再生功能的干细胞“巢穴”。这项工作对肌肉再生和肌肉无力的研究具有重大意义。这实验势必为肌肉严重损伤和肌肉萎缩的患者提供新的希望！多么希望此技术能在中国普及。

液氮槽vaporphase长期储存。-20℃不可超过1小时，以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。（2）程序降温：利用已设定程序的等速降温机以-1～-3℃/分钟之速度由室温降至（-80℃以下）-120℃，再放在液氮槽vaporphase长期储存。适用于悬浮型细胞与hybridoma之保存。3、步骤：（1）冷冻前24-48小时更换半量或全量培养基，使细胞处于指数生长期。（2）配制冷冻保存溶液(使用前配制)：另取一离心管，加入培养基、血清，逐滴加入二甲基亚砜（DMSO）至20%浓度，即制成双倍的冻存液，置于室温下待用。（3）离心收集培养之细胞，用加血清的培养基重悬起细胞，取少量细胞悬浮液(约0.1ml)计数细胞浓度及冻前存活率。（4）取与细胞悬液等量的冻存液，缓慢逐滴加入细胞悬液，并晃动试管，制成细胞冻存悬液（DMSO最后浓度为5～10％），使细胞浓度为1～5×106cells/ml，混合均匀，分装于已标示完全之冷冻保存管中，1～2ml/vial，并取少量细胞悬浮液作污染检测。严密封口后，注明细胞名称、代数、日期。然后进行冻存。4、注意事项：（1）欲冷冻保存之细胞应在生长良好(logphase)且存活率高之状态，约为80～90％致密度。冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质，例如hybridoma应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。（2）细胞在液氮中可长期冻存无限时间，而不会影响细胞活力；在-70度可保存数月。（3）注意冷冻保护剂之品质。DMSO应为试剂级等级，无菌且无色(以0.22micron　FGLP　Telflon过滤或是直接购买无菌产品，如Sigma D-2650)，以5～10ml小体积分装，4℃避光保存，勿作多次解冻。Glycerol亦应为试剂级等级，以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。本方法中先制备双倍冻存液，可避免DMSO直接加入时释放的热量对细胞的损伤。缓慢逐滴加入细胞悬液是使细胞逐步适应高渗，可降低细胞受损。DMSO可能引起部分白血病细胞株的分化，可换用10%甘油冻存。（4）冷冻保存之细胞浓度：①normal human fibroblast:1～3×106cells/ml②hybridoma:1～3×106cells/ml，细胞浓度不要太高，某些hybridoma会因冷冻浓度太高而在解冻24小时后死去。③adherent tumor lines:5～7×106，依细胞种类而异。Adenocarcinoma解冻后须较高之浓度，而HeLa只需1～3×106cells/ml④other suspensions:5～10×106cells/ml，human lymphocyte须至少5×106cells/ml。（5）冷冻保护剂浓度为5或10％DMSO，若是不确定细胞之冷冻条件，在做冷冻保存之同时，亦应作一个backup culture，以防止冷冻失败。（6）冻存可用10%～90%的血清，一般高浓度血清有助于维护细胞活力，此处介绍20%终浓度有利于细胞悬浮而少沉积（4度时），复苏存活率在80%～90%以上，对原代培养细胞，以90%血清冻存更为有效。二、冷冻细胞活化1、冷冻细胞之活化原则为快速解冻，以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害，导致细胞之死亡。2、细胞活化后，约需数日，或继代一至二代，其细胞生长或特性表现才会恢复正常(例如产生单株抗体或是其它蛋白质)。3、材料37℃恒温水槽、新鲜培养基、无菌吸管/离心管/培养瓶、液氮或干冰容器4、步骤：（1）操作人员应戴防护面罩及手套，防止冷冻管可能爆裂之伤害。（2）自液氮或干冰容器中取出冷冻管，检查盖子是否旋紧，由于热胀冷缩过程，此时盖子易松掉。（3）将新鲜培养基置于37℃水槽中回温，回温后喷以70%酒精并擦拭之，移入无菌操作台内。（4）取出冷冻管，立即放入37℃水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化，以70%酒精擦拭保存管外部，移入无菌操作台内。（5）取出解冻之细胞悬浮液，缓缓加入有培养基之培养容器内(稀释比例为1:10～1:15)，混合均匀，放入CO2培养箱培养。取0.1ml解冻细胞悬浮液作存活测试。（6）解冻后是否立即去除冷冻保护剂(例如DMSO或glycerol)，依细胞种类而异，一般而言，大都不需要立即去除冷冻保护剂。惟若要立即去除，则将解冻之细胞悬浮液加入含有5-10ml培养基之离心管内，离心1000rpm，5分钟，移去上清液，加入新鲜培养基，混合均匀，放入CO2培养箱培养。（7）若不需立即去除冷冻保存剂，则在解冻培养后隔日更换培养基。三、细胞计数与存活测试1、原理：（1）计算细胞数目可用血球计数盘或是Coultercounter粒子计数器自动计数。（2）血球计数盘一般有二个chambers，每个chamber中细刻9个1mm2大正方形，其中4个角落之正方形再细刻16个小格，深度均为0.1mm。当chamber上方盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为1mm2×0.1mm=1.0x10-4ml。使用时，计数每个大正方形内之细胞数目，乘以稀释倍数，再乘以104，即为每ml中之细胞数目。（3）存活测试之步骤为dyeexclusion，利用染料会渗入死细胞中而呈色，而活细胞因细胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色。一般使用蓝色之trypan blue染料，如果细胞不易吸收trypan blue，则用红色之Erythrosin bluish。计算细胞活率：活细胞数/（活细胞数+死细胞数）×100%。计数应在台盼兰染色后数分钟内完成，随时间延长，部分活细胞也开始摄取染料；因为台盼兰对蛋白质有很强的亲和力，用不含血清的稀释液，可以使染色计数更为准确。2、材料：0.4%w/v trypan blue(GibcoBRL15250-061)；Erythosin bluish stain；取0.1gram Erythrosin bluish(SigmaE-9259)及0.05gram preservative methyl paraben(SigmaH-3647)溶于100mlCa++/Mg++freesaline；血球计数盘及盖玻片(Hemocytometerandcoverslip)；计数器(counter)；低倍倒立显微镜；粒子计数器(Coultercounter,CoulterElectronics)。白细胞稀释液（4%乙酸溶液）。3、步骤：（1）取50μl细胞悬浮液与50μl trypan blue(orErythrosinbluish)等体积混合均匀于1.5ml小离心管中。（2）取少许混合液(约15μl)自血球计数盘chamber上方凹槽加入，盖上盖玻片，于100倍倒立显微镜下观察，活细胞不染色，死细胞则为蓝色(或红色-Erythrosin bluish)。（3）计数四个大方格之细胞总数，再除4，乘以稀释倍数(至少乘以2，因与trypanblue等体积混合)，最后乘以104，即为每ml中细胞悬浮液之细胞数。若细胞位于线上，只计上线与右线之细胞(或计下线与左线之细胞)。注：4大格细胞总数×稀释倍数×104/4=细胞数/ml；每一大格的体积=0.1cm×0.1cm×0.01cm=10-4ml计数板计数时，最适浓度为5～10×105细胞/ml，此范围外计数误差偏大。高浓度细胞悬液，可取出部分作稀释或连续稀释后计数。5、范例：T75 monolayer culture制成10ml细胞悬浮液，取0.1ml溶液与0.1ml trypan blue混合均匀于试管中，取少许混合液加入血球计数盘，计数四大方格内之细胞数目。活细胞数/方格：55，62，49，59；死细胞数/方格：5，3，4，6；细胞总数=243平均细胞数/方格=60.75；稀释倍数=2；细胞数/ml：60.75×104×2（稀释倍数）=1.22×106；细胞数/flask（10ml）：1.22×106×10ml=12.2×106存活率：225/243﹦92.6%

植物细胞原生质体制制备与融合2006-11-20 17:14植物细胞原生质体制制备与融合1、原生质体常现的杂交育种由于物种间难以逾越的天然屏障而举步维艰。科学家们受细胞全能性理论及组织培养成功的启示，逐渐将眼光转向细胞融合，试图用这种崭 图3-2新的手段冲破自然界的禁钢。１９３７年michel率先实施植物细胞融合的试验。如何去除坚韧的细胞'接成了牛物学工作者必须解决的首要难题。１９６Ｏ年该领域终于出现了重大突破。由英国诺丁汉大学Cocking教授领导的小组率先利用真菌纤维素酶，成功地制备出了大量具有高度活性可再生的番茄幼根细胞原生质体，开辟了原生质体融合研究的新阶段。植物细胞原生质体是指那些已去除全部细胞壁的细胞。2、原生质体制备（１）取材与除菌 为了让制得的原生质体一般都生活力较强，再生与分生比例较高。常用的外植体包括：种子根。子叶、下胚轴、胚细胞、花粉母细胞、悬浮培养细胞和嫩叶。对外植体的除菌要因材而异。悬浮培养细胞一般无需除菌。对较脏的外植体往往要先用肥皂水清洗再以清水洗２～３次，然后浸人 ７０％酒精消毒后，再放进 ３％次氯酸钠处理。最后用无菌水漂洗数次，并用无菌滤纸吸干。（２）酶解 现以叶片为例说明如何制备植物原生质体。①配制酶解反应液：反应液应是一种ＰＨ值在５·５～５·８的缓冲液，内合纤维素酶０．３%～３．０%以及渗透压稳定剂、细胞膜保护剂和表面活性剂等，②酶解：除菌后的叶片 撕去下表皮 切块放人反应液 不时轻摇 (条件25℃～30℃,2～4h)反应液转绿。反应液转绿是酶解成功的一项重要指标，说明已有不少原生质体游离在反应液中。经镜检确认后应及时终止反应，避免脆弱的原生质体受到更多的损害。（３） 分离 在反应液中除了大量的原生质体外，尚有一些残留的组织块和破碎的细胞。为了取得高纯度的原生质体就必需进行原生质体的分离。可选取２００～４００目的不锈钢网或尼龙布ｊ叭ｉ过滤除渣，也可采用低速离心法或比重漂浮法直接获取原生质体。（４） 洗涤刚分离得到的原生质体往往还含有酶及其他不利于原生质体培养。再生的试剂，应以新的渗透压稳定剂或原生质体培养液离心洗涤２～４次。 （5） 鉴定 只有经过鉴定确认已获得原生质体后才能进行下阶段的细胞融合工作。由于已去除全部或大部分细胞壁，此时植物细胞呈圆形。如果把它放人低渗溶液中，则很容易胀破。也。'厂月荧光增白剂染色后置紫外显微镜下观察，残留的细胞壁呈现明显荧光。通过以上观测，基本上可判别是否原生质体及其百分中 此外，尚可借助台盼蓝活细胞染色、胞质环流观察以及测定人、作用、呼吸作用等参数定量检测原生质体的活力。4、 原生质体的融合（1）化学法诱导融合 化学法诱导融合无需贵重仪器，试剂易于得到，因此一直是细胞融合的主要方法。尤其是聚乙二醇（ＰＥＧ）纳合成钙高ｐＨ诱导融合法已成为化学法诱导细胞融合的主流。以下简介此方法（在无菌条件下进行）：按比例混合双亲原生质体-----滴加 ＰＥＧ溶液，摇匀，静置----滴加高钙高ｐＨ值溶液，摇匀，静置-----滴加原生质体培养液洗涤数次-----离心获得原生质体细胞团一筛选、再生杂合细胞。（２）物理法诱导融合 １９７９年Ｓｅｎｄａ等发明了微电极法诱导细胞融合。１９８１年Ｚｉ。。ｍａｎｎ等提出了改进的平行电极法，现简介如下：将双亲本原生质体以适当的溶液悬浮混合后，插入微电极，接通一定的交变电场。原生质体极化后顺着电场排列成紧密接触的珍珠串状。此时瞬间施以适当强度的电脉冲，则使原生质体质膜被击穿而发生融合。电激融合不使用有毒害作用的试剂，作用条件比较温和，而且基本上是同步发生融合。只要条件摸索适当，亦可获得较高的融合率。上述操作实际上是供体与受体原生质体对等融合的方法。由于双方各具几万对基因，要筛选得到符合需要且能稳定传代的杂合细胞是相当困难的。最近，有人提出以Ｘ射线、伽玛射线。纺锤体毒素或染色体浓缩剂等对供体原生质体进行前处理。轻剂量处理可造成染色体不同程度的丢失、失活、断裂和损伤，融合后实现仅有少数染色体甚至是DNA片段的转移；致死量处理后合ｕ可能产生没再仅体万染色体ｗ划她旋余种。利用这种价值不对称融合方法，大大提高了融合体的生存率和可利用率。经过上述融合处理后再生的细胞株将可能出现以下几种类型．2） 亲本双方的细胞核和细胞质能融洽地合为一体，发育成为完全的杂合植株。这种例子不多。3） 融合细胞由一方细胞核与另一方细胞质构成，可能发育为核质异源的植株。亲缘关系越远的物种，某个亲本的染色体被丢失的现象就越严重。 4） 融合细胞由双方胞质及一方核或再附加少量他方染色体或ＤＮＡ片段构成。④原生质体融合后两个细胞核尚未融合时就过早地被新出现的细胞壁分开。以后它们各自分生长成嵌合植株。5、 杂合体的鉴别与筛选双亲本原生质体经融合处理后产生的杂合细胞，一般要经含有渗透压稳定剂的原生质体培养基培养（液体或固体），再生出细胞壁后转移到合适的培养基中。待长出愈伤组织后按常规方法诱导其长芽、生根、成苗。在此过程中可对是否杂合细胞或植株进行鉴别与筛选。 (1) 杂合细胞的显微镜鉴别 根据以下特征可以在显微镜下直接识别杂合细胞：若一方细胞大，另一方细胞小，则大。小细胞融合的就是杂合细胞；若～方细胞基本无色，另一方为绿色，则自绿色结合的细胞是杂合细胞；如果双方原生质体在特殊显微镜下或双方经不同染料着色后可见不同的特征，则可作为识别杂合的标志；发现ｈ述杂合细胞后可借助显微操作仪在显微镜下直接取出，移置再牛培养基培养。（2）以互补法筛选杂合细胞 显微鉴别法虽然比较可信，但实验者有时会受到仪器的限制，工作进度慢且未知其能否存活与个长 遗传互补法则可弥补以上不足。 遗传互补法的前提是获得各种遗传突变细胞株系。白化互补：不同基山叨的白化突变株出aBｘAh，可互补为绿色细胞株AaBb。生长互补：甲细胞株缺外源激素Ａ不能生长，乙细胞株需要提供外源激素Ｂ才能生长，则甲株与乙株融合，杂合细胞在不含激素Ａ、Ｂ的选择培养基上可能生长。抗性互补筛选：假如某个细胞株具某种抗性(抗青霉素)另一个细胞株具另一种抗性（如抗卡那霉素），则它们的杂合株将可在含上述两种抗生素的培养基上再生与分裂。这种筛选方式即所谓的抗性互补筛选。代谢互补筛选：根据碘代乙酚胺能抑制细胞代谢的特点，用它处理受体原生质体，只有融合后的供体细胞质才能使细胞活性得到恢复，等等。 （３）采用细胞与分子生物学的方法鉴别杂合体 经细胞融合后长出的愈伤组织或植株，可进行染色体核型分析、染色体显带分析、同功酶分析以及更为精细的核酸分子杂交、限制性内切酶片段长度多态性（ＲＦＬＰ，见８．２．２．２）和随机扩增多态性ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）分析，以确定其是否结合了双亲本的遗传素质。（４）根据融合处理后再生长出的植株的形态特征进行鉴别质。