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概念:细胞克隆形成率即细胞接种存活率,表示接种细胞后贴壁的细胞成活并形成克隆的数量。贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆,而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。基本步骤:1、取对数生长期的各组细胞,分别用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞,并把细胞悬浮在10%胎牛血清的DMEM培养液中备用。2、将细胞悬液作梯度倍数稀释,每组细胞分别以每皿50、100、200个细胞的梯度密度分别接种含10mL 37℃预温培养液的皿中,并轻轻转动,使细胞分散均匀。置37℃ 5% CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养2~3周。3、经常观察,当培养皿中出现肉眼可见的克隆时,终止培养。弃去上清液,用PBS小心浸洗2次。加4%多聚甲醛固定细胞5mL固定15分钟。然后去固定液,加适量GIMSA应用染色液染10~30分钟,然后用流水缓慢洗去染色液,空气干燥。4、将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片,用肉眼直接计数克隆,或在显微镜(低倍镜)计数大于10个细胞的克隆数。最后计算克隆形成率。克隆形成率 =(克隆数/接种细胞数)×100%平板克隆形成试验方法简单,适用于贴壁生长的细胞。适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好,不能有细胞团,接种密度不能过大。
[size=18px]流式细胞术[/size][size=18px]及平板克隆[/size][size=16px]([/size][size=16px]1[/size][size=16px])铺板[/size][size=16px] [/size][size=16px]取[/size][size=16px]对数生长期[/size][size=16px] H446[/size][size=16px]、[/size][size=16px]H[/size][size=16px]69[/size][size=16px]、[/size][size=16px]H[/size][size=16px]526[/size][size=16px]、[/size][size=16px]D[/size][size=16px]MS114[/size][size=16px]细胞,[/size][size=16px]计数,分别接种等量细胞至[/size][size=16px]6[/size][size=16px]孔板,[/size][size=16px]“[/size][size=16px]十字形[/size][size=16px]”[/size][size=16px]晃动,使细胞分布均匀,[/size][size=16px]继续[/size][size=16px]培养。[/size][size=16px] [/size][size=16px]([/size][size=16px]2[/size][size=16px])药物处理[/size][size=16px] [/size][size=16px]待细胞融合率约[/size][size=16px]80%[/size][size=16px],[/size][size=16px]加入[/size][size=16px]不同浓度([/size][size=16px]0[/size][size=16px]、[/size][size=16px]IC20[/size][size=16px]、[/size][size=16px]IC50[/size][size=16px])[/size][size=16px]西达本胺处理[/size][size=16px]4[/size][size=16px]8[/size][size=16px] [/size][size=16px]h[/size][size=16px]。每组均设置[/size][size=16px]D[/size][size=16px]MSO[/size][size=16px]对照组。继续培养[/size][size=16px]4[/size][size=16px]8[/size][size=16px] [/size][size=16px]h[/size][size=16px]后采用[/size][size=16px]Annexin V-FITC /PI[/size][size=16px]双染法对细胞进行染色。[/size][size=16px]([/size][size=16px]3[/size][size=16px])准备:[/size][size=16px]冰[/size][size=16px]PBS[/size][size=16px]、流式细胞术专用试管、凋亡试剂盒([/size][size=16px]10[/size][font='arial'][size=16px]×[/size][/font][size=16px] [/size][size=16px]Annexin V[/size][size=16px]结合缓冲液用[/size][size=16px]DD[/size][size=16px]水稀释[/size][size=16px]1[/size][font='arial'][size=16px]×[/size][/font][size=16px])[/size][size=16px]([/size][size=16px]4[/size][size=16px])对照组的设置:阴性对照([/size][size=16px]未染色细胞[/size][size=16px])、[/size][size=16px]FITC Annexin V[/size][size=16px]([/size][size=16px]无[/size][size=16px]PI[/size][size=16px])单[/size][size=16px]染细胞[/size][size=16px]、[/size][size=16px]PI[/size][size=16px]单[/size][size=16px]染[/size][size=16px]([/size][size=16px]不含[/size][size=16px]FITC Annexin V[/size][size=16px])细胞。[/size][size=16px]([/size][size=16px]5[/size][size=16px])染色:[/size][size=16px]a[/size][size=16px].[/size][size=16px]将细胞[/size][size=16px]用冷[/size][size=16px]PBS[/size][size=16px]洗涤[/size][size=16px]3[/size][size=16px]次,然后[/size][size=16px]重悬细胞[/size][size=16px]在[/size][size=16px]密[/size][size=16px]度为[/size][size=16px]1.5[/size][font='arial'][size=16px]×[/size][/font][size=16px]10[/size][font='times new roman'][size=16px]6[/size][/font][size=16px]/[/size][size=16px]mL[/size][size=16px]的[/size][size=16px]1[/size][font='arial'][size=16px]×[/size][/font][size=16px]结合缓冲液中。[/size][size=16px]b[/size][size=16px].[/size][size=16px]将[/size][size=16px]100[/size][size=16px] [/size][size=16px]μ[/size][size=16px]L[/size][size=16px]的溶液[/size][size=16px](1×10[/size][font='times new roman'][size=16px]5[/size][/font][size=16px]个细胞[/size][size=16px])[/size][size=16px]转移到[/size][size=16px]5[/size][size=16px] mL[/size][size=16px]培养管中。[/size][size=16px]c[/size][size=16px].[/size][size=16px]加入[/size][size=16px]1[/size][size=16px] [/size][size=16px]μ[/size][size=16px]L [/size][size=16px]FITC Annexin V[/size][size=16px]和[/size][size=16px]1[/size][size=16px] [/size][size=16px]μ[/size][size=16px]L[/size][size=16px] PI[/size][size=16px]。[/size][size=16px]d[/size][size=16px].[/size][size=16px]轻轻[/size][size=16px]拍打[/size][size=16px]细胞,[/size][size=16px]避光、室温[/size][size=16px] [/size][size=16px](25°C)[/size][size=16px] [/size][size=16px]孵育[/size][size=16px]15[/size][size=16px] min[/size][size=16px]。[/size][size=16px]e[/size][size=16px].[/size][size=16px]向每管中加入[/size][size=16px]400[/size][size=16px] [/size][size=16px]μ[/size][size=16px]L[/size][size=16px]的[/size][size=16px]1[/size][font='arial'][size=16px]×[/size][/font][size=16px] [/size][size=16px]Annexin V[/size][size=16px]。[/size][size=16px]1[/size][size=16px] h[/size][size=16px]内进行流式细胞仪分析。[/size][size=18px]克隆形成实验[/size][size=16px]H446[/size][size=16px]、[/size][size=16px]DMS114[/size][size=16px]采用平板克隆实验,[/size][size=16px]H69[/size][size=16px]、[/size][size=16px]H526[/size][size=16px]采用软琼脂克隆实验。[/size][size=16px]用公式[/size][size=16px]克隆形成率[/size][size=16px]=[/size][size=16px]克隆形成数[/size][size=16px]/[/size][size=16px]接种细胞数[/size][font='arial'][size=16px]×[/size][/font][size=16px]100[/size][size=16px]%[/size][size=16px]计算克隆形成率。[/size][size=16px]([/size][size=16px]1[/size][size=16px])铺板[/size][size=16px] [/size][size=16px]取[/size][size=16px]对数生长期[/size][size=16px] 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roman'][size=16px]静置培养[/size][/font][font='times new roman'][size=16px] [/size][/font][font='times new roman'][size=16px]2[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]-[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]3[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]周(终止培养时间以不于[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]2[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]周而且克隆之间不发生融合为标准)。[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]c[/size][/font][font='times new roman'][size=16px].[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]出现肉眼可见的克隆时,终止培养。弃去[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]旧培养基[/size][/font][font='times new roman'][size=16px],[/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#4472c4] [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px]用[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]PBS [/size][/font][font='times new roman'][size=16px]清[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]洗[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]2[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]次[/size][/font][font='times new roman'][size=16px],[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]4%[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]多聚甲醛[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]固定液[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]固定[/size][/font][font='times new roman'][size=16px] 20[/size][/font][font='times new roman'][size=16px] min[/size][/font][font='times new roman'][size=16px],随后[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]去除固定液,加适量结晶紫染色[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]30[/size][/font][font='times new roman'][size=16px] min[/size][/font][font='times new roman'][size=16px],用[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]蒸馏水[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]洗去[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]结晶紫[/size][/font][font='times new roman'][size=16px],[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]晾干,用扫描仪扫描成图片。[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]d[/size][/font][font='times new roman'][size=16px].[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]在低倍镜[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]下[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]计数大于[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]50[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]个细胞的克隆数。[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]e.[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]计算克隆形成率。[/size][/font][size=16px]([/size][size=16px]4[/size][size=16px])[/size][size=16px]软琼脂[/size][size=16px]克隆形成实验[/size][font='times new roman'][size=16px]适用于悬浮生长的细胞以及繁殖较快的贴壁细胞。[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]a[/size][/font][font='times new roman'][size=16px].[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]配胶液:[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]用蒸馏水[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]和琼脂糖粉配制浓度为[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]0.6%[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]和[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]0.3%[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]的[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]琼脂糖液,高压灭菌[/size][/font][font='times new roman'][size=16px],[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]置于[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]42[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]℃[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]水浴锅中,目的是为了使其保持融化状态。[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]b[/size][/font][font='times new roman'][size=16px].[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]配制含[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]20%[/size][/font][font='times new roman'][size=16px] [/size][/font][font='times new roman'][size=16px]FBS[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]、[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]2[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]×[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]双抗的[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]2[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]×[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]1640[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]培养基,用[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]0.22[/size][/font][font='times new roman'][size=16px] [/size][/font][font='times new roman'][size=16px]m[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]的滤器过滤除菌。[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]c[/size][/font][font='times new roman'][size=16px].[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]铺下层胶:[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]将[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]0.6%[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]的琼脂糖胶[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]液[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]与[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]2[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]×[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]1640[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]培养基[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]等体积[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]混合,[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]以[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]每孔[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]1.5[/size][/font][font='times new roman'][size=16px] mL[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]加[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]至[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]6[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]孔板中,室温[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]等其[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]凝固。[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]d.[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]细胞计数:将细胞用[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]PBS[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]洗一遍,离心,加入新的培养基混匀稀释,[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]计数。[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]H[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]69[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]以[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]8[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]×[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]1[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]0[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]3[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]/[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]孔铺入[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]6[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]孔板,[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]H[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]526[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]以[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]5[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]×[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]1[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]0[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]3[/size][/font][font='times new 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[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]μ[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]L[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]细胞悬液[/size][/font][font='times new roman'][size=16px],[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]混匀后,每孔加入[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]1.5[/size][/font][font='times new roman'][size=16px] mL[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]混合液[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]。[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]f.[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]放入[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]37℃[/size][/font][font='times new roman'][size=16px],[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]5%CO[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]2[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]培养箱培养,约[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]2[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]-3[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]周后[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]终止培养[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]。[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]g.[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]计数比较对照组与实验组的细胞数量,计算克隆形成率。[/size][/font]
一、实验目的了解稀释平板计数的原理,掌握涂抹平板培养法和混合平板培养法,认识细菌、放线菌、霉菌的菌落特征。二、实验原理 稀释平板计数是根据微生物在固体培养基上所形成的单个菌落,即是由一个单细胞繁殖而成这一培养特征设计的计数方法,即一个菌落代表一个单细胞。计数时,首先将待测样品制成均匀的系列稀释液,尽量使样品中的微生物细胞分散开,使成单个细胞存在(否则一个菌落就不只是代表一个细胞),再取一定稀释度、一定量的稀释液接种到平板中,使其均匀分布于平板中的培养基内。经培养后,由单个细胞生长繁殖形成菌落,统计菌落数目,即可计算出样品中的含菌数。此法所计算的菌数是培养基上长出来的菌落数,故又称活菌计数。一般用于某些成品检定(如杀虫菌剂等)、生物制品检验、土壤含菌量测定及食品、水源的污染程度的检验。三、实验器材 1.活材料:苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)菌剂。2.培养基:牛肉膏蛋白胨琼脂培养基(附录三、1)3.器材:90ml无菌水、9ml无菌水、无菌平皿、lml无菌吸管、天平、称样瓶、记号笔、玻璃刮铲等。四、实验方法 1.样品稀释液的制备 准确称取待测样品l0g,放入装有90ml无菌水并放有小玻璃珠的250ml三角瓶中,用手或置摇床上振荡20 min,使微生物细胞分散,静置20-30s,即成10-1稀释液;再用1ml无菌吸管,吸取10-1稀释液lml,移入装有9ml无菌水的试管中,吹吸3次,让菌液混合均匀,即成10-2稀释液;再换一支无菌吸管吸取10-2稀释液1 ml,移入装有9ml无菌水的试管中,也吹吸三次,即成l0-3稀释液;以此类推,连续稀释,制成10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9等一系列稀释菌液(图22-1)。图22-1 平板计数法中样品的稀释和稀释液的取样培养用稀释平板计数时,待测菌稀释度的选择应根据样品确定。样品中所含待测菌的数量多时,稀释度应高,反之则低。通常测定细菌菌剂含菌数时,采用10-7、10-8、10-9稀释度,测定土壤细菌数量时,采用10-4、10-5、10-6稀释度,测定放线菌数量时,采用l0-3、10-4、10-5稀释度,测定真菌数量时,采用10-2、10-3、10-4稀释度。2.平板接种培养 平板接种培养有混合平板培养法和涂抹平板培养法两种方法。 (1)混合平板培养法 将无菌平板编上10-7、10-8、10-9[fo