利用光谱流式技术,基于TRBC1评估T αβ大颗粒淋巴细胞白血病的T细胞克隆性
研究背景T-LGLL是一种罕见的慢性淋巴细胞增生性疾病(Chronic Lymphoproliferative Disorder, CLPD),其特征是血液或组织中的成熟细胞毒性T细胞,如大颗粒T淋巴细胞(T- Large Granular Lymphocytes, T-LGL)的克隆性增生。由于缺乏特异性基因标志物,其表现(绝对计数变化、形态、免疫表型特征等)又常常与反应性扩增相似,因此,在T-大颗粒淋巴细胞白血病(T-Large Granular Lymphocytic Leukemia, T-LGLL)的诊断检测中,证明扩增的 T-LGL 的克隆性仍然是一个挑战,特别是在没有淋巴细胞增多(lymphocytosis)的情况下。利用流式细胞术(Flow cytometry, FCM)分析T细胞受体β链恒定区1(Constant region 1 of T-cell receptor β chain, TRBC1)的表达(后续用TRBC1-FCM表示),已被证明是评估Tαβ细胞克隆性的一种有效、简单、快速和特异的方法。然而,由于更为成熟的Tαβ细胞相较于总Tαβ细胞,往往显示出更为宽泛的TRBC1+/TRBC1 -比值,TRBC1-FCM方法对于诊断T-LGLL 克隆性的实用价值,还有待进一步证实。研究目的研究者希望通过直接比较正常 Tαβ-LGL 与T-LGLL中 TRBC1+ 和 TRBC1-Tαβ 细胞的相对分布和绝对计数,验证TRBC1-FCM方法在诊断T-LGLL中特异性T细胞克隆的实用性。研究方法研究纳入了54例样本(EDTA抗凝的全血),样本分别来自17例正常对照(HD),8例反应性 Tαβ 淋巴细胞增多症,5例HDc(有T-LGL克隆的HD),及24例Tαβ-LGLL 患者(18 名 TαβCD8-LGLL、5 名 TαβCD4-LGLL和 1 名 Tαβ 双阴性 LGLL)。利用Cytek® Aurora全光谱流式细胞仪,研究者设计了两组免疫分型方案(Panel I 和Panel II)对样本进行检测分析,整个过程严格遵循EuroFlow SOP进行。Panel I ,主要为TRBC1+细胞成熟标记(如CD27, CD28, CD45RA and CD62L等) Panel II,包括12个骨架抗体(TRBC1、成熟标记、LGL常见异常表型标记),4个主要系别标记(CD3, CD4, CD8 和 TCRγδ),TCRVβ和CD45。两组光谱流式免疫分型方案详细信息如下图1:图1-基于光谱流式的免疫分型方案结论利用Panel I,研究者比较了含有多克隆(n = 25)和单克隆(n = 29) LGL的血液中TRBC1+和TRBC1−的Tαβ-LGL的分布和绝对计数。总体而言,多克隆性TRBC1+或TRBC1− 的Tαβ-LGL细胞数量(百分比)在0.36 ~ 571细胞/μL之间(3.2 ~ 91% TRBC1+细胞),而单克隆性LGL的细胞数量(百分比)在51 ~ 11,678细胞/μL之间(96% TRBC1+细胞)。因此可以认为,通过总Tαβ细胞群体中TRBC1表达谱鉴定的病理性T-LGL的绝对计数不能作为检测Tαβ克隆性的通用(单一)标准,特别是在没有淋巴细胞增多和/或血液中携带相对较少(图2-TRBC1+和TRBC1−细胞的绝对计数和相对分布(多克隆vs.单克隆)接下来,研究者将TRBC1-FCM方案结合TCRVβ库和异常表型检测(Panel II),以进一步验证 TRBC1-FCM 方法在临床环境中对 T-LGLL 中 T 细胞克隆性进行高灵敏度评估的实用性,并提高其检测(小)LGL 克隆的特异性。一共有12个例的样本被纳入此步研究(6 个 HD、2 个 TαβCD8-HDc 和 4 个 TαβCD8-LGLL)。结果发现,T-LGLL 和 HDc 例中克隆性 TRBC1+ 或 TRBC1-的 Tαβ 和 TαβCD8 细胞的绝对计数(32-5,515 个细胞/μL) ,显著高于来自正常/反应性例的多克隆 TRBC1+ 和 TRBC1- 的总 Tαβ(0-25 个细胞/μL)和 TαβCD8(0-21 个细胞/μL)细胞(图 3A&C)。但对TRBC1+ 细胞百分比的分析却并未观察到显著差异。提示,基于表达单个 TCRVβ 家族的细胞中 TRBC1 的表达模式识别 Tαβ-LGL 的克隆性,应该基于(表达单个TCRVβ 家族的克隆性 TRBC1+ 或 TRBC1- Tαβ 和 TαβCD8 细胞)绝对细胞计数和/或异常表型表达的综合评估。关于Cytek