神经酸

今日，曼哈格和博莱克联合研发生产的蛋白质氨基酸/神经递质/儿茶酚胺检测试剂盒（液相色谱-串联质谱法）隆重推出。本次推出的3套kit是建立在高效液相色谱质谱平台上，可针对实验动物和人体血样、尿样中的20种蛋白质氨基酸、12种神经递质和6种儿茶酚胺进行精准定量检测。检测试剂盒检测指标▣ 20种蛋白质氨基酸Asparagine天冬酰胺proline脯氨酸Histidine组氨酸Tyrosine酪氨酸Serine丝氨酸Methionine甲硫氨酸Glycine甘氨酸Lysine赖氨酸Glutamine谷氨酰胺Valine缬氨酸Arginine精氨酸Isoleucine异亮氨酸Aspartic acid天冬氨酸Leucine亮氨酸Glutamic acid谷氨酸Phenylalanine苯丙氨酸Threonine苏氨酸Tryptophan色氨酸Alanine丙氨酸Cysteine半胱氨酸▣ 12种神经递质Norepinephrine去甲肾上腺素γ-Aminobutyricacid4-氨基丁酸Metanephrine甲氧基肾上腺素Octopamine章鱼胺Epinephrine肾上腺素Tyramine酪胺Dopamine多巴胺Agmatine胍丁胺Serotonin5-羟色胺Methoxytyramine甲氧酩胺Tryptamine色胺Histamine组胺▣ 6种儿茶酚胺Normetanephrine甲氧基去甲肾上腺素Epinephrine肾上腺素Norepinephrine去甲肾上腺素Dopamine多巴胺Metanephrine甲氧基肾上腺素Methoxytyramine甲氧酪胺产品优势

中国医学科学院北京协和医学院药物研究所贺玖明研究员团队以封底文章在《药学学报》英文刊（APSB）2022年第8期（IF：14.903）发表了题为“A temporo-spatial pharmacometabolomics method to characterize pharmacokinetics and pharmacodynamics in the brain microregions by using ambient mass spectrometry imaging”的研究论文，建立了一种时空分辨的代谢组学方法（基于AFADESI-MSI的时空药物代谢组学），可全景式描绘脑中药物代谢和效应的时空特征，为中枢神经系统作用新药研发提供了一种有力的可视化工具和新的视角。　　封底图 | 表征鼠脑中中枢神经药物的微区域药代动力学和药效学的时空代谢组学方法策略和工作流程　　研究背景　　中枢神经系统（CNS）具有复杂而脆弱的结构，在大脑的许多微区域之间具有高度的互连性和相互作用。大脑是人体复杂的器官，可以细分为许多微区域。脑中多种内源性功能代谢物在不同的微区分布不均匀。脑微区的代谢酶、受体、配体、蛋白和血流的功能差异也会导致药物的空间分布和疗效差异。大脑是中枢神经系统疾病的靶点，大多数中枢神经系统药品只有在进入大脑后才会发挥作用。因此了解药物及相关内源代谢物在大脑中的原位分布的信息对于评估药物疗效、毒理学和药代动力学具有重要意义。　　目前研究大脑的常用功能性脑成像技术（包括组织化学标记、免疫荧光、MRI、PET、全身放射自显影等），仅提供脑组织结构的图像，不能在分子水平上进行分析，可监测的物质种类也有限。另一方面，脑内药物分析通常使用的基于组织匀浆或微透析采样的高效液相色谱-质谱（HPLC-MS）技术获得的结果仅能反映采样微区的平均代谢水平，而缺乏分子在整个大脑中的空间分布的信息。质谱成像技术（MSI）不需要复杂的预处理和特殊的化学标记，具有高通量、高灵敏度和高分辨率的特点，可检测已知或未知小分子代谢物的定性、定量和空间分布信息。　　本研究使用AFADESI-MSI空间代谢组学研究表征了临床中枢神经系统药物奥氮平（OLZ）和大鼠脑内内源性代谢物，并进行了给药期间的时空变化以及脑微区药物动力学和药效学研究，成功地展示了OLZ及其作用相关代谢物的时空特征，并为中枢神经系统药物作用的分子机制提供了新的见解。　　研究思路　　研究方法　　1. 实验分组/研究材料：饲养一周的雄性 Sprague-Dawley 大鼠　　（1） 实验组：4组（3只/组），口服OLZ溶液（50mg/mL）后 20 分钟、50 分钟、3 小时和 12 小时用高浓度乙醚。　　（2） 对照组：1组，3只/组　　2.技术路线　　2.1. 鼠脑的微区划分：15个微区，包括尾状壳核（CP）、大脑皮质（CTX）、海马（HP）、下丘脑（HY）、丘脑（TH）、小脑皮质（CBC）、小脑髓质(CM)、髓质 (MD)、脑桥 (PN)、大脑导水管 (CA)、中脑 (MB)、穹窿 (FN)、梨状皮质 (PC)、嗅球 (OB) 和胼胝体 (CC)。　　2.2 质谱成像：AFADESI-MSI分析（全扫描及MS2扫描）　　2.3代谢物定性：人类代谢组数据库 (www.hmdb.ca)、Metlin、MassBank和LIPID MAPS　　研究结果　　1.通过AFADESI-MSI绘制大鼠大脑中的内源性代谢物和药物图谱　　无论是正离子模式还是负离子模式，使用AFADESI-MSI空间代谢组学均可从治疗组和对照组脑组织切片中获得内源性代谢物信息。在100-500 Da的低质量范围内，可以检测到氨基酸、核苷、核苷酸、有机酸、脂肪酸等极性小分子代谢物和γ-氨基丁酸 (GABA)、肌酸、肉碱、乙酰肉碱和磷脂酰胆碱等神经递质类代谢物；在500-1000 Da的高质量范围内，可以检测到一些脂质，包括鞘磷脂（SM）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰胆碱（PC）、溶血磷脂酰胆碱（LysoPC）和磷脂酰肌醇 (PI) 等。原型药物 OLZ 及其代谢物 2-羟甲基 OLZ 在正离子模式下被检测，结果如图1C1和D1所示。这些结果表明，非靶向质谱成像的方法可以在一次实验中同时绘制外源性药物和内源性代谢物的图谱，并可以获得它们的空间分布特征和微区域丰度变化。　　图1 | 使用 AFADESI-MSI 从脑组织切片获得的外源性药物和内源性代谢物的质谱成像结果　　2.鼠脑中奥氮平（OLZ）及其代谢物的时空变化　　OLZ是一种用治疗精神分裂症的药物，大脑是其主要靶器官。本实验为探究给药时间药物在大脑各功能微区的分布情况，分别在给药后20 min、50 min、3 h和12 h收集治疗组和对照组大鼠脑组织进行MSI分析。OLZ 及其代谢物 2-羟甲基 OLZ 的在鼠脑分布结果如图2A所示。　　这些结果表明，OLZ 可以很容易地穿透脑血屏障，主要分散在脑室和脑实质组织中，但并不是均匀分布在大脑的所有微区域中。给药后20分钟发现OLZ主要分布在大脑皮质中。50分钟后，OLZ的水平显著增加。随着时间的推移，大脑中的药物信号迅速下降到成像检测限以下。同时作者发现，2-羟甲基OLZ主要分布在穹窿中，其在各个微区的分布格局与OLZ不同。　　这些结果表明，OLZ药物的吸收、分布和代谢的速率在大脑的不同微区不同，表明微区对药代动力学有影响。它还证明了所提出的基于AFADESI-MSI 的时空药物代谢组学方法能够同时说明药物及其代谢物在大脑复杂微区域中的水平和空间分布的变化。　　图2 | 脑微区OLZ和其代谢产物2-羟甲基OLZ的时空变化　　3.OLZ 对神经递质类代谢物的的微区调控　　OLZ药物治疗精神分裂的作用机制是阻断多巴胺 D2 受体或血清素 2A 受体调节神经递质类代谢物（NTs）。然而OLZ的微区效应和分子作用机制仍不清楚。因此作者分析了与OLZ生理活动密切相关的NTs的时空变化，包括GABA、Glu、谷氨酰胺 (Gln) 和腺苷。NTs的AUC变化率如图3B1-B7所示。　　GABA（γ-氨基丁酸）是中枢神经中的一种神经递质，可抑制神经中枢。空间代谢组检测结果显示GABA（m/z 104.0706）主要分布在下丘脑中，药物干预后下丘脑的 GABA 受到轻微调节。但同时在梨状皮质和嗅球中观察到药物干预后GABA显著上调。Glu 是中枢神经中的一种主要神经递质，对神经细胞具有兴奋作用。在药物干预后，Glu及其代谢物Gln的时空动态模式在脑部微区中呈现出相对一致的变化趋势。腺苷广泛分布在中枢神经系统中，是大脑中的一种兴奋性和抑制性神经递质，并在脑中不均匀分布。并且在给药3小时后海马和下丘脑中的高水平腺苷显著增加，表明当药物积累时腺苷的上调会更加明显。组胺、乙酰胆碱（Ach）、牛磺酸等神经递质类物质都有各自特征的微区分布，以及在给药后具有上调的趋势。　　上述神经递质类物质的靶向成像分析结果表明，该方法可以检测到与中枢神经药物作用机制相关的大量原型药物及其代谢物和内源性代谢物的空间分布和变化。这对于阐明中枢神经系统药物的作用机制和了解精神分裂症及相关疾病具有重要意义。　　　图3 | 药物对脑内NTs分布和AUC变化率的影响　　4. OLZ 药物干预的微区代谢调控　　组织和器官的内源性代谢变化可以反映药物刺激的效果。为探索药物干预后的微区代谢效应，通过药物代谢组学测试研究了内源性代谢物的分子谱及其动态变化的分布信息。分别在OLZ和生理盐水给药后 50分钟采集每组治疗和对照大鼠的三个脑组织样本进行微区域分析。　　OPLS-DA结果表明，基于正离子模式和负离子模式下脑微区的定量分析，对照组和治疗组分别明显分开。总共筛选和鉴定了 90 种差异内源性代谢物，作为药物作用相关效应物,它们在大脑微区域中发挥了巨大作用。其中81种被MS2鉴定，9 种被同位素模式鉴定。差异代谢物包含了很多种类型的代谢物，包括氨基酸、脂肪酸、甘油磷脂、有机酸、多胺和酰基肉碱。　　经过分析确定了治疗组和对照组之间显著差异的七种代谢途径，包括丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢、牛磺酸和亚牛磺酸代谢、淀粉和蔗糖代谢、甘油磷脂代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、精氨酸生物合成、嘌呤代谢和柠檬酸循环（TCA循环）。下面对影响较大的丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和甘油磷脂代谢的异常代谢途径进行重点分析。　　图4 | 对照组和治疗组中鉴定的差异代谢物的层次聚类分析 (HCA)　　4.1 丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢紊乱　　异常的Glu-Gln循环在精神分裂症的病理生理过程中起重要作用。丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢途径代谢物在老鼠脑的时空分布如图5所示。柠檬酸在大脑大部分微区分布均匀；与对照组相比，表达显著提高，结果提示药物干预加速了TCA循环的代谢，为机体提供了更多能量。Glu也均匀分布在各个微区，药物干预后呈下调趋势。它的代谢物Gln 和 GABA，主要在下丘脑和的多个微区中上调。　　根据通路分析和代谢谷氨酸脱羧酶（GAD）酶反应，推测OLZ直接激活GAD促进GABA合成。GABA可增加糖酵解中己糖激酶的活性，从而加速葡萄糖的代谢。空间分布结果表明葡萄糖分布在大脑的所有微区，但给药后主要分布在梨状皮质和嗅球中，给药后20分钟血糖水平显著升高。　　图5 | 丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢途径代谢物的时空分布　　4.2.甘油磷脂代谢途径的紊乱　　甘油磷脂有助于控制肝脏脂质代谢，促进记忆力，增强免疫力，延缓衰老。甘油磷脂代谢途径代谢物的时空分布如图6。这项研究的结果表明，在给药后，大多数脂质在大多数微区域中显示出上调。OLZ在临床应用中具有代谢副作用，如体重增加、血脂异常、高甘油三酯血症和胰岛素抵抗。实验结果证明，脂质代谢的上调可能导致OLZ治疗期间的副作用。　　图6 | 甘油磷脂代谢途径代谢物的时空分布　　相关讨论　　作者开发的时空药物代谢组学方法，使用质谱成像技术MSI来表征大脑中枢神经药物的药代动力学和药效学。结果表明，该方法可有效识别与药物作用相关的内源性分子效应物。评估OLZ药物对脑组织的微区域效应，并证明其穿过血脑屏障后的微区域药代动力学和药效学方面的有效性。该方法清楚地展示了原型药物及其代谢物 2-羟甲基OLZ在大鼠大脑不同微区的药代动力学。也在脑部微区现一些神经递质类物质和其它小分子极性代谢物，并显示出与药物干预相关的多种代谢途径。发现天冬氨酸、谷氨酸和甘油磷脂代谢途径的调节可能与 OLZ 临床使用观察到的治疗和不良反应有关，为了解其作用的分子机制提供了关键信息。　　小鹿　　与基于LC-MS的常规药物代谢组学分析手段相比，基于AFADESI-MSI的时空药物代谢组学技术具有同时检测内源性和外源性物质的静态水平变化，并提供大脑不同微区的动态时间依赖性趋势和空间分布信息的优势，能够非常准确地呈现原位和微区域分子变化规律。在此基础上将药代动力学和药效学与代谢途径相关联，有利于获得关键信息，从而更深入地了解药物作用的分子机制。基于AFADESI-MSI 的时空药物代谢组学技术不仅是阐述中枢神经系统药物的原位药代动力学和药效学全面有效的工具，也可为脑组织内源性代谢物的变化以及其它动物组织的原位代谢研究提供重要信息。　　该研究工作，药物所2017级硕士研究生刘丹为作者，贺玖明研究员为独立通讯作者。工作得到国家自然科学基金和医科院创新工程项目的资金资助。

自愈导电水凝胶的开发对于电活性神经组织工程至关重要。典型的导电材料如聚吡咯（PPy）通常用于制造人工神经导管。此外，组织工程领域已经朝着透明质酸（HA）水凝胶等产品的使用方向发展。尽管HA修饰的PPy薄膜可用于各种生物应用，但细胞-基质相互作用机制仍然知之甚少。此外，还没有关于HA修饰的PPy注射自愈水凝胶用于周围神经修复的报道。　　近日，南通大学科研团队用HA、胱胺（Cys）和吡咯-1-丙酸（Py-COOH）构建了一种具有可注射性、生物可降解性、生物相容性和神经再生能力的自修复导电水凝胶（HASPy）。该水凝胶直接靶向白细胞介素17受体A，主要通过激活白细胞介素17信号通路来促进与雪旺细胞髓鞘形成相关的基因和蛋白质的表达。科研人员将水凝胶直接注射到大鼠坐骨神经挤压损伤部位，以研究其体内神经再生的能力，并发现其可促进功能恢复和髓鞘再生。这项研究可能有助于理解细胞-基质相互作用的机制，并为HASPy水凝胶作为神经再生先进支架的潜在用途提供新的见解。该研究论文发表在《先进科学》（Advanced Science）上。

荧光显微成像技术对人们理解神经科学起了非常关键的作用。而最近一些年出现的各种超分辨显微成像技术和专门的荧光探针能够以超过以往普通光学显微镜的分辨率直接观察神经元亚细胞结构和蛋白质排列。并以直观可视方式揭示了神经细胞骨架组成、分布、运动和膜蛋白信号传导、突触下结构和功能，以及神经元−胶质细胞相互作用。同时超高分辨显微成像技术（Super Resolution,SR,下文中出现SR均指超高分辨率显微成像技术）对于许多自身免疫和神经退行性疾病模型中的分子靶点研究也提供了全新的强大工具。今年春，Werner等科学家在美国化学学会会刊（ACS)上最新发表了一篇综述，比较详实系统介绍了超高分辨率显微技术在神经科学上的最新应用进展。我们在此文基础上进行了编译整理。因文章较长，我们将分三期陆续介绍。本期介绍第一部分。1. 背景介绍成像技术是推动生命科学几乎所有学科基础研究的核心平台。在神经科学领域，近几十年来，共聚焦显微镜技术已成为分析神经组织的标准荧光成像技术。激光扫描共聚焦显微镜对固定的神经元样本进行观察，在扫描水平上提供了三维和多色图像并使单个细胞达到树突结构的分辨率。作为补充，电子显微镜（EM）用于获取神经元和亚区室超微结构的信息，并用于大脑的连通性分析。EM非常适合于神经元突触和囊泡、细胞器和膜构象的结构分析。然而，由于靶向特异性标记方法的局限性，基于EM的复杂样品中蛋白质和特定电子密度特征的识别受到限制。为了进一步理解神经元功能，包括双光子显微镜在内的几种活体视频显微镜应用的发展使神经元细胞培养的活细胞成像、器官型切片培养和动物模型的活体成像成为可能。同时，新的荧光染料、功能探针和荧光蛋白以及光遗传学方法和光驱动（如笼状化合物）不仅可以表征神经元，还可以操纵神经元及其从单分子水平到整个神经系统的相互作用。然而，荧光显微图像中可见细节的水平，即图像分辨率，仍然受到衍射极限的限制。一个多世纪以来，由λ/2NA定义的阿贝衍射极限（λ为波长，NA为显微镜物镜的数值孔径）决定了光学显微镜的分辨率极限，限制了两个位置小于200纳米的细节分辨。在过去的二十年中，超分辨显微镜（SRM）已经发展成为一种非常有效的亚细胞水平荧光成像和分辨细胞器结构的研究手段。SRM现在可以提供远低于常规光学显微镜衍射极限的空间分辨率，从而能够深入了解神经元细胞和组织中蛋白质的空间结构和相互作用。本文综述了超分辨显微镜和荧光标记方法及其在神经科学中的成功应用。我们将首先详细介绍各种SRM方法的基本原理、新的功能型荧光探针和标记技术。接着，我们将回顾SRM如何有助于我们理解神经元亚细胞结构和功能以及神经元−胶质细胞相互作用。此外，我们将概述超分辨率成像方法如何帮助研究自身免疫和神经退行性疾病的病理生理学。最后，我们将介绍这些新的成像方法是如何应用于神经精神疾病相关的人类样本的分析。由于该领域持续快速发展，我们最多只能代表一份中期报告。进一步的创新和新的显微镜方法的发展将使人们对神经系统功能有更详细的了解。 2. 神经科学中的超分辨率成像方法2.1. 光学衍射极限及其对神经科学的影响人类大脑包含超过800亿个神经元，每个神经元由数千个突触连接。因此，它构成了复杂神经元网络。这些网络的主要组成部分，例如突触神经末梢，显示的空间维度接近于光学衍射极限分辨率∼200 nm。释放递质的突触活性区（突触前细胞基质的特化区）的直径通常约为300±150 nm。突触小泡作为递质运输和释放的关键元件，其尺寸平均小10倍，直径为40−50nm。这些递质被释放到宽度为20-50nm的突触间隙中−再结合突触后受体。由于衍射极限的尺寸限制，胞吐机制和跨突触信号在传统的光学显微镜下基本上是无法观测到的，因此需要用提高10倍分辨率的方法进一步研究。（图1）。图1. 兴奋性突触结构组成。左图为兴奋性突触的油画示意图，右图为左图的灰度图像，其中浅紫色圆圈为衍射极限光斑；玫红色圆圈为兴奋性突触囊泡，约40-50nm；绿色为突触后膜AMPA受体，尺寸小于10nm；黄色部分为突触间隙，约20-30nm。 此外，大量参与突触信号传导的不同的分子，位于极小的突触内，造成很高的分子分布密度，这对微观研究具有挑战性。例如，对于较小的突触，兴奋性突触可以包含数百个小泡，对于大型苔藓纤维束突触，可以包含数千个小泡，每个小泡包含多达1万到10万个递质分子。在这些囊泡中，约有10±5个与释放部位对接，释放的递质平均与0−20 个NMDA受体和0−200个AMPA受体结合，而这些突触后受体又被320±130个突触后PSD-95密度蛋白分子环绕。由于加速电子的波长要短得多，因此EM是唯一能够解析突触纳米级结构的方法。然而，虽然传统的EM产生的电子密度图像具有极好的超微结构分辨率，但需要进行固定和靶向特异性标记的制样方法在很大程度上限制了蛋白质识别和神经元追踪。荧光显微镜可以很容易地对蛋白质进行选择性标记，但是受制于可见光的衍射（400−700 nm）使生成的图像无法实现对纳米结构的分析。 2.2.绕开光学衍射极限的光学显微镜方法 20世纪后期，人们开发了新的策略，通过利用物理或化学手段来区分不同荧光团的发射或减少同一时间荧光分子的数量，以尽量绕过衍射极限。减少荧光团的点扩散函数（PSF）的重叠可以通过生成光图案在集合级别以确定性方式进行，或者通过减少同一时间荧光团的数量在单分子水平上以随机方式进行。在下文中，我们将从确定性集合方法开始介绍，该方法将激光扫描共聚焦显微镜（CLSM）的有效空间分辨率推到理论极限。2.2.1. 确定性集合超高分辨率成像方法（Deterministic Ensemble SR-Imaging Methods） CLSM用针孔探测器阵列替换单点探测器，空间分辨率可以提高√2倍。CLSM测量每个扫描位置探测器每个点的荧光信号。在应用适当的算法后，生成分辨率提升的图像。这些所谓的像素重分配方法包括图像扫描显微镜（ISM）、重扫描共聚焦（RSC）、光学光子重分配（OPRA）、AiryScan和即时结构照明显微镜（iSIM）。对于信号检测，使用了诸如CCD相机、光电倍增管阵列、单光子雪崩二极管阵列和六角光纤束等探测器阵列。结构照明显微镜（SIM）在光路中插入光栅，产生与样品干涉的相干光束，生成横向和轴向方向不同的新照明图案。然后可以使用傅里叶变换提取这种新照明图案的信息，从而在所有三维空间中实现空间频率分解和分辨率倍增。SIM对样品制备的要求最低，并且可使用所有常规荧光探针，这些探针具有最低的光稳定性，并且可以很容易地扩展到多色成像。然而，当记录三维或长时间成像时，强烈建议使用光稳定性更高的荧光团。此外，SIM使用更低的激发强度，因此是活细胞SR实验的理想选择。为了获得更高的分辨率，引入了通过图案化饱和或荧光激发或图案化耗损光开关染料的非线性SIM（NL-SIM）。然而对染料开关特性的苛刻要求限制了NL-SIM在常规生命科学实验中的适用性。非线性SIM单位时间内还需要采集更多的图像，因此实际上仅限于2D成像。另一方面，掠入射（GI）-SIM显示了高达每秒266帧的快速超分辨率成像以及100nm分辨率，揭示前所未有的细胞器动力学细节。结构照明的局限性在于其对波长的普遍依赖性、与其他SR成像技术相比的低分辨率以及对系统稳定校准的需要。最后，后处理需要进行先验质量检查以避免伪影,例如由于高背景信号或不充分标记产生的低对比度图像导致的人工蜂窝图案。通过受激发射耗损(STED)显微镜进行超分辨率成像是一种实现更高空间分辨率的成像方法。这里，高斯分布的激发激光束被中空的甜甜圈样的耗损激光束覆盖，使扫描点外围的荧光团返回基态，这导致纳米级焦点区的直径与耗损光束的强度成反比，耗损光束的强度直接转换为STED显微镜的分辨能力：上图公式中λ为波长，n为折射率，α为物镜的收集角，ISTED为STED光束的照射强度，IS为饱和强度。因此，可以通过改变损耗激光强度来调整分辨率，可定制设计分辨率达30−80nm 的显微镜。STED显微成像可通过连续或脉冲激光激发、门控检测。带有脉冲激光的STED显微镜会降低激发能量，从而减少实时成像中的光毒性效应。STED显微镜中的时间门控检测可以去除荧光团光子到达时间前的空间信息，并且可以在较低的平均功率下工作。商品化STED能提供用户友好的高分辨率成像，无需进一步的数据后处理。活体成像，例如活体树突棘动态成像已经很成熟，但快速动态成像仅限于小帧尺寸，因为它仍然是点扫描方法，高激光强度可能会导致光损伤。STED通过应用自适应照明方式Dymin和rescue技术，可以明显减少光损伤。在Dymin STED中，在共聚焦模式下扫描时确定最低可能的STED光束强度。根据样品的标记密度，这将使STED光束强度降低20到100倍。Rescue STED同样通过减少STED激光开放的区域，从而比普通STED减少光漂白接近8倍。STED的另一个限制是对荧光团光稳定性的依赖，因为在高激光强度下会发生明显的光漂白。这影响了动力学的研究和三维图像的获取。值得注意的是，最近通过使用荧光团标记的寡核苷酸（瞬时结合到连接靶蛋白结合探针的互补寡核苷酸）或非结合荧光团来进行细胞STED成像，从而绕过了STED光漂白问题。这两种方法中，基于DNA互补标记的STED成像和超分辨率阴影成像SUSHI分别通过荧光团标记的寡核苷酸和高浓度的非结合和自由扩散的荧光团不断交换来防止光漂白。SUSHI的方法已经成功地用于活体脑片中细胞外间隙和神经肽的结构解析及其动力学的STED成像。如果使用具有毫秒或更长寿命的两种稳定状态的可逆切换荧光团来代替标准荧光团，则STED强度可以显著降低。可逆饱和切换光学线性荧光转换方法（RESOLFT）已通过可逆可切换荧光蛋白（reFPs）实现，并成功应用于活体海马脑片树突棘的超分辨率成像。2.2.2. 随机单分子SR成像方法（Stochastic Single-Molecule SR-Imaging Methods）上述的确定性方法是通过改变激发模式或相位掩膜来暂时控制荧光发射达到超分辨成像，而基于单分子的定位SR显微镜则是随机地在时间上分离单个荧光团的发射。单分子定位显微镜（SMLM）基于单个荧光团的随机激活，使用配备高灵敏相机（EMCCD或sCMOS）的宽场荧光显微镜进行单分子检测，以及精确的位置测定。通过将理想PSF与实际测量的光子分布拟合来进行分子定位。只要信号来自单个发射区，且单个发射区之间的距离大于显微镜能分辨的最小距离，则通过收集更多光子和最小化噪声，定位的标准误差可以任意小。激活和定位过程重复多次，所有定位最终用于重建超分辨率图像。为了确保在成像的任何时候，只有稀疏的小荧光团以其活性荧光形式存在（开启状态），使用了光开关、光转换、光激活或自发闪烁的荧光团。由于定位精度和最终图像分辨率取决于每次检测到的光子数量，通常采用明亮且稳定的荧光团与1 kW/cm2的辐照强度相结合的方式。根据所使用的荧光团不同，SMLM可达到10−50 nm横向分辨率。光激活荧光蛋白（FPs），自2006年以来已用于光激活定位显微镜（PALM），例如在405 nm的激光照射下可从关闭状态不可逆地转换为打开状态的PA-GFP和PA-mCherry 以及可通过适当波长的激光照射从一种波长状态不可逆地转移到另一种波长状态的光转换FPs，例如MEO。此外，还成功地应用了诸如Dronpa之类的光开关FPs，其在不同激发波长的激光照射下可在非荧光和荧光状态之间可逆地切换。对于活细胞应用，使用荧光蛋白的PALM是首选方法。因为在理想情况下，每个感兴趣的蛋白质都可以用荧光蛋白进行计量标记。然而，荧光蛋白比有机染料表现出更低的光稳定性和光子计数，从而降低了定位精度，并且通常需要更长的采集时间。此外，对于PALM成像而言，融合蛋白通常会过度表达，这可能会导致不真实图像，而用转基因变体替代显示野生型表达和功能的自身蛋白仍然具有挑战性。对于细胞内源性蛋白质的标记，通常使用有机染料的免疫标记。SMLM适用的有机染料必须是光开关、光激活或自发闪烁的，以实现单个染料发射的时间分离，但化学计量标记要困难得多。有机染料通常表现出较高的光子计数和光稳定性，从而使定位精度达到5−10nm。花菁染料Cy5和Alexa Fluor 647可以在荧光开启状态（其典型寿命为10 ms）和非荧光关闭状态（寿命为几秒，利用光开关缓冲液，缓冲液包括PBS，10−100mM硫醇，如ß-巯基乙缅（MEA），酶促氧清除剂，可以有/没有激活染料）之间可逆切换，为随机光学重建显微镜（STORM）和直接型STORM（dSTORM）的发展铺平了道路。近年来，应用于（d）STORM的染料已大大扩展，除了菁染料外，还包括罗丹明和恶嗪染料。有趣的是，最近的研究表明，即使是多个标记的抗体在光开关缓冲液中也呈现出类似于单发射的表现，因此适用于dSTORM实验。光活化染料的作用与光活化荧光蛋白相似。也就是说，它们在被光照射或自发激活之前处于非荧光状态。罗丹明衍生物PA-JF549和PA-JF646以及桥环菁染料Cy5B是已成功用于SMLM的光活化染料。此外，在没有光开关缓冲液的水溶液中，硅罗丹明HMSiR等自发闪烁染料也能应用于SMLM。最近，通过图案化照明方式实现更高的定位精度，单个荧光发射区的定位得到了改进。定位精度取决于信号的大小和强度，可以通过测量的PSF标准偏差的平方除以收集的光子数来估计。然而，包括拟合性能、标记密度、标记误差和显微镜漂移在内的其它参数决定了高定位精度是否可以转化为低于10 nm的空间分辨率。此外，到目前为止，因为SMLM方法成像需要昂贵的仪器和成像者具备广泛的专业知识，这在一定程度上阻碍了其广泛应用。2.2.3. SMLM-点累计纳米成像技术（PAINT，Point Accumulation for Imaging Nanoscale Topography）第一代SMLM技术依赖于荧光团的光开关和光激活，其分辨率需要有效地利用荧光团发出的光子数，而PAINT(point accumulation for imaging nanoscale topography)方法使用活的，与目标区域结构短瞬结合的染料。在成像过程中，被漂白的荧光团可以被成像介质中充足的新鲜荧光团不断置换替补。由于游离染料在采集单个图像帧期间在多个像素上快速扩散，因此它们仅显示为模糊背景且不能准确定位，而结合染料显示为PSF且能准确定位。因此PAINT的第一种方法是将荧光染料（如尼罗红）与细胞膜进行非特异性结合，然后进行光漂白和新的结合。此外，基于蛋白质片段的探针被用于单分子定位标记。在最近的一个研究中，将这种方法与传统的基于phalloidin的肌动蛋白标记方法进行了比较。通过引入通用PAINT（uPAINT）使Ni-Tris-NTA与转基因蛋白质上表达的His-Tags更特异结合，并可用于突触间隙成像。uPAINT也可以应用于其它标记方法，如免疫标记（内源性蛋白抗体、纳米抗体如绿色荧光蛋白）或受体配体结合。为了提高PAINT的适用性和特异性，引入DNA-PAINT方法。它使用长度小于10个核苷酸的短的可控的寡核苷酸链（成像链）瞬时标记其靶结合互补寡核苷酸链（对接链）。成像链与对接链的瞬时结合产生明显的闪烁。因此，荧光团开-关状态之间的切换与其光物理性质不直接关联。DNA-PAINT首先在DNA折纸（DNA-origami）上得到验证。DNA折纸是一种自组装的DNA结构（具有已知的大小），通过侧链和荧光团进行结合，并通过宽场显微镜观察。总的来说，DNA-PAINT是一种易于实现的SR成像标记方法，无需特定光物理特性的荧光团。因为探针可以在一轮结合后，从成像介质中置换补充荧光团，从而避免了光漂白。DNA-PAINT的缺点是图像获取时间长，这是由成像链与对接链的结合和解离速率决定的，以及荧光成像链的纳摩尔浓度引起的背景信号。尽管通过使用优化的DNA序列和缓冲条件，以及使用串联的周期性DNA结构域或通过短肽的卷曲螺旋相互作用（称为“Peptide-PAINT”），可以加快采集速度，但还是要利用全内反射荧光（TIRF）（仅限于对靠近盖玻片结构进行成像的特点），才能更好地减少成像链的背景信号。另一方面，基于DNA的探针提供了序列成像复用的明显优势，如Exchange PAINT中所述，已成功用于小鼠视网膜切片中多个结构的成像（图2）。Exchange PAINT的概念也被推广到dSTORM、STED、SIM和更传统的衍射限制的宽场和共聚焦荧光显微镜。最近，通过一种称为PRISM(probe-based imaging for sequential multiplexing)的基于DNA-PAINT的成像方法，实现了高达10个神经元蛋白质的分辨率约为20nm的多通道成像。该方法使用了低亲和力成像探针，该探针与突触、肌动蛋白和微管一抗上的对接链结合。图2 原代神经元中多个神经元靶点的多标Exchange-PAINT成像。（A）DNA-PAINT顺序成像的四种突触蛋白的超分辨图像：圆圈表示漂移校正的基准点；（B）为（A）中不带*的感兴趣区域的高放大倍率图和超分辨图像。（C）为（A）中带*的感兴趣区域的超分辨结果及单通道图像。2.2.4. 定量SMLM如果每个目标分子都可以单独标记和定位的话，与所有其他超分辨率成像技术相比，SMLM还可以提供有关分子分布和分子绝对数的单分子信息。然而，内源性蛋白质的定量免疫标记仍然是一个挑战，并且多标记抗体的不同定位数目也会使数据解释复杂化。另一方面，达到内源性表达水平比较困难，另外FPs蛋白成熟缓慢也同样会令定量化困难。然而，可以通过设计专门的对照实验估计拷贝数，并提取出有关生物目标结构分子的真实信息。借助合适的算法，SMLM可以提供有关拷贝数、聚类、共定位和复杂化学计量的数据，用于定量模型的生成和模拟。此外，还可以通过将突触结构信息与其功能关联来实现量化，例如膜片钳神经元的生物细胞素标记。例如，通过对链霉亲和素标记后膜片钳神经元进行STORM成像，结合CB1受体的免疫标记，然后在GABA能的海马轴突终端内定量，研究了内源性大麻素信号。本研究发现，与树突投射型中间神经元相比，胞周投射型中间神经元具有更高的CB1受体密度和更复杂的活动区。通过免疫标记和dSTORM研究了黑腹果蝇神经肌肉连接处内源性Bruchpilot（Brp）分子的数量。利用抗体滴定实验，确定了野生型神经肌肉连接处活性区细胞基质中Brp蛋白的数量为137个，其中四分之三以约15个七聚体簇状排列结合从相同组织样本记录的电生理数据，研究Brp如何组织控制活动区功能。利用DNA纳米结构作为校准，每个活性区Brp蛋白的数量估计通过定量DNA-PAINT（qPAINT）实验证实。此外，定量dSTORM实验表明，每个活性区Brp蛋白的数量和分布受突触标记蛋白-1的影响，这说明突触活性区递质释放的复杂性。在最近的一项研究中，使用Alexa Fluor 532和Alexa Fluor 647免疫标记的双色dSTORM已用于小鼠小脑平行纤维活性区中代谢型谷氨酸受体4（mGluR4）的定量研究（图3）。该研究还使用抗体滴定实验估计每个活性区平均包含约35个mGluR4分子，并排列在小纳米结构中。此外，mGluR4通常在munc-18-1和CaV2.1通道附近被发现，这支持了mGluR4与这些蛋白质相互作用以调节突触传递的观点。图3小鼠脑片中代谢型mGluR4受体定位定量双色dSTORM。上图：mGluR4和Bassoon免疫染色的小脑冠状切片的dSTORM图像，作为活性区参考。与宽场显微镜结果的比较。（A）DBSCAN聚类算法定义了近距离的En face活性区表面积（灰色）和mGluR4信号（品红）。（B）活性区大小的频率分布直方图（C）mGluR4信号到突触和突触外区域的映射。（D）通过Ripley H函数分析评估Bassoon和mGluR4的聚集分布。与随机分布的分子（蓝色、灰色）进行比较。虚线表示Ripley分析的最大值。这些研究显示了定量SMLM在神经科学研究中的潜力。可以预见，定量SMLM的进一步发展将为突触前和突触后蛋白质的功能关系，及其组织和结构的研究提供更有价值的信息。2.2.5. 组织三维（3D）SMLM虽然SMLM方法实现了仅几纳米的非常高的水平定位精度，但它需要特殊的方法来打破图像平面上方和下方PSF的对称性，来实现高轴向定位精度。实现高轴向定位精度的两种方法是PSF重塑和多焦面检测，通常用于在3D中精确定位荧光团。在SMLM中最常用的方法是通过在成像路径中插入单个柱面透镜从而不对称地扭曲PSF，利用光学像散原理来实现三维定位。基于像散方法的3D dSTORM技术还可以与光谱拆分相结合，对COS-7细胞中的网格蛋白表面小窝成像。像散引起的畸变程度由荧光团的轴向位置决定，因此可用于轴向位置计算。例如，3D散光SMLM已用于确定抑制性突触后密度区gephyrin蛋白和受体复合物的分布和拷贝数，或突触前活动区和突触后密度区各种成分的空间关系。采用双物镜像散成像方案，通过3D SMLM研究组织中肌动蛋白、血影蛋白和其他相关蛋白的结构，发现这些蛋白在轴突中形成190nm的周期性环状结构。替代方法包括使用相位掩模、变形镜实现双螺旋、四足或鞍点PSF重塑，和双焦面成像方法实现更大的轴向范围，并已成功应用于不同的应用中。为了在2D和3D中定位单个荧光发射区，已经开发了不同的算法和软件工具。在最近的一次综述中，列出了不同3D SMLM方法获得的水平和轴向分辨率，以供比较高30倍。此外，使用NHS染料对所有蛋白进行标记，然后进行迭代ExM，可以对高蛋白密度的结构或细胞器（如线粒体），实现与EM相比具有更高对比度的超微结构细节。为了在分子尺度上进行成像，ExM与SMLM方法（如dSTORM）相结合是一个理想的选择。然而在含有硫醇和盐的传统光转换缓冲液中，会发生荷电氢凝胶收缩。可通过使用低离子强度缓冲液或加入中性溶液使凝胶稳定以避免收缩。另一种策略是使用自发闪烁的荧光团（如HMSiR）在水中进行SMLM。通过Ex-dSTORM实现分子分辨率的关键是膨胀后标记，这增加了表位可及性，从而提高了标记效率并减少了标记错误。Ex-dSTORM超分辨成像已成功应用于原代细胞和神经元中微管和中心粒结构的解析。

生物启发脉冲神经网络架构有望通过模拟人脑的高算力、高并行度、低功耗等特性，解决冯诺依曼架构存储墙和能效瓶颈等问题。然而，面向构建脉冲神经网络的神经形态硬件的研究尚处于探索阶段，基于传统CMOS的神经形态芯片通常需要数十个晶体管和若干电容；基于新型存储器等新原理神经元器件亦需集成额外电容或复位操作电路，且耐久性受限，难以满足高频神经元器件的信息整合处理需求。自旋电子器件具有高能效、高耐久性及更丰富的物理特性，成为神经形态硬件开发最具潜质的载体之一。 　　近日，中国科学院微电子研究所微电子器件与集成技术重点实验室刘明院士团队基于合成反铁磁异质结构，通过界面工程有效调控磁畴壁动力学特性，在无需电容和复位电路的情况下实现了具有积累-泄露-放电-自复位特性的神经元器件及阵列。该团队提出并验证了体系焦耳热依赖的Ruderman-Kittel-Kasuya-Yosida交换作用和内建磁场相互竞争驱动磁畴壁往复运动物理机制，有望实现高放电率(17 MHz)、低能耗(486 fJ/spike)神经元集成器件。该工作结合负微分电阻器件特性构建了“winner-takes-all”的神经元电路模块，提升了脉冲神经网络性能的同时可大幅降低网络功耗。该研究基于所开发的器件磁畴壁动力学物理模型模拟神经元行为特性，进一步构建了两层脉冲神经网络(兴奋性神经元+抑制性神经元layer)。这一体系架构对Modified National Institute of Standards and Technology(MNIST)手写数字集的基准识别率达到88.5%，为神经形态计算领域提供了硬件开发的新思路。 　　相关研究成果以Spintronic leaky-integrate-fire spiking neurons with self-reset and winner-takes-all for neuromorphic computing为题，在线发表在《自然-通讯》(Nature Communications)上，并被选为“编辑亮点推荐工作”。研究工作得到国家重点研发计划、国家自然科学基金、中科院战略性先导科技专项等的支持。　a、b：自旋电子神经元器件磁光显微镜磁-电输运测试与磁光克尔数据图像；c、神经元器件磁滞回线；d、磁光克尔与霍尔电压信号LIFT特性。

p style=" text-indent: 2em text-align: justify " 近日，Neurocrine Biosciences和Voyager Therapeutics公司联合宣布达成战略合作，共同开发和推广Voyager公司的基因疗法项目，其中包括治疗帕金森病（Parkinson’s disease, PD）的主打在研疗法VY-AADC和治疗弗里德赖希共济失调（Friedreich’s ataxia）的VY-FXN01。这一合作将Neurocrine在神经科学和药物研发及推广方面的专长，与Voyager公司的创新基因疗法项目相结合，开发靶向严重神经疾病的新疗法。 /p p style=" text-indent: 2em text-align: justify " Voyager公司是一家专注于开发基因疗法的生物医药公司。该公司致力于选择和优化腺相关病毒（AAV）载体，为治疗不同疾病的基因疗法找到最匹配的递送工具。该公司的研发管线中拥有多款基因疗法。其中，治疗PD的VY-AADC是一款通过AAV2载体表达芳香族L-氨基酸脱羧酶（AADC）基因的基因疗法。AADC是将左旋多巴转化为多巴胺的重要代谢酶。在PD患者中，左旋多巴疗法逐渐失效的原因之一可能是患者的AADC水平下降。VY-AADC通过恢复AADC水平，可能提高左旋多巴的治疗效果。目前这一疗法已经开始关键性２期临床试验。 /p p style=" text-indent: 2em text-align: justify " 根据合作协议，Neurocrine将支付Voyager公司1.65亿美元的预付款，并且资助VY-AADC的2-3期临床开发和VY-FAX01的1期临床开发。在VY-AADC获得2期临床试验和VY-FAX01获得1期临床试验结果时，Voyager公司可以选择与Neurocrine共同研发这两款疗法，或者给予Neurocrine全权开发这些产品的权利。除此以外，Neurocrine公司有权选择Voyager公司另外两款基因疗法项目进行研发。根据所有产品的研发，监管和推广里程碑，Voyager公司可能获得高达17亿美元的后续付款。 /p p style=" text-indent: 2em text-align: justify " “我们非常高兴能够与Voyager公司合作，共同开发治疗严重神经疾病，改善患者生活的疗法，”Neurocrine公司首席执行官Kevin Gorman博士说：“这一合作让我们能够利用Voyager公司在聚焦中枢神经系统的基因疗法方面的专长，开发出治疗PD和弗里德赖希共济失调的潜在疗法。这些领域仍然有很大未竟医疗需求。” /p p style=" text-indent: 2em text-align: justify " “Neurocine公司是一个理想的合作伙伴，它在开发和推广神经疾病疗法方面经验丰富，”Voyager公司的总裁兼首席执行官Andre Turenne先生说：“这一合作将帮助我们成为行业领先，完全整合的基因疗法公司。我们很高兴与Neurocrine优秀和敬业的团队合作，推动这些研究项目的进展。” /p

● 快讯近日，同济大学医学院附属上海市第十人民医院神经内科赵延欣教授及刘学源教授课题组在细胞外囊泡与神经退行性疾病关系研究领域取得了新的进展。该项研究从小细胞外囊泡的角度为阿尔兹海默症中发生的兴奋抑制失衡提供了新见解。相关研究成果已发表在国际知名期刊《Journal of Nanobiotechnology》（IF:10.435，JCR 2区）。图1｜国际知名期刊《Journal of Nanobiotechnology》（IF:10.435，JCR2区）细胞外囊泡 (EV) 是由细胞释放到细胞外环境中的小囊泡。EVs 由脂质双层膜组成，该膜包裹着小的无细胞器的细胞质。根据它们的大小，通常分为三种类型，小EVs (sEVs) (50-150 nm)、大EVs (100-1000 nm) 和凋亡小体 ( 5 μm)。其中，sEVs 通常可通过血脑屏障 (BBB)，成为中枢神经系统 (CNS) 细胞之间通讯的关键介质，有证据表明，sEV 中的微小RNA (miRNA)参与到众多细胞和生物过程，例如神经元细胞的生长和凋亡。目前，E/I（兴奋/抑制）失衡假设被概念化为谷氨酸能和氨基丁酸（GABA）能突触输入之间的不平衡。E/I 失衡被认为是神经退行性疾病脑功能障碍的基础，包括阿尔茨海默病 (AD)、帕金森病 (PD)、精神分裂症和其他神经疾病。谷氨酸兴奋性毒性和 GABA 能神经元功能障碍似乎是 AD 中发生的神经元细胞死亡的关键原因。但是关于 E/I 失衡对AD的影响，其中的机制仍不明确。为了对该机制进行进一步阐释，赵延欣教授及刘学源教授团队在本研究中用谷氨酸/GABA/PBS 处理原代培养的神经元，并分离出 sEV。然后，将不同来源的 sEV 添加到用 Aβ（β淀粉样蛋白）处理的神经元或注射到 AD 模型小鼠中。此后对经 Aβ 治疗的小鼠和神经元进行了评估。经GABA 处理的神经元释放的 sEVs 减轻了 Aβ 诱导的损伤，而谷氨酸处理的神经元释放的 sEVs 加重了 Aβ 的毒性。此外，本研究通过 miRNA 测序比较了从谷氨酸/GABA/PBS 处理的神经元中分离的 sEV 的 miRNA 组成。该研究进一步表明，sEV 中 miR-132 的变化加速了表征病理的生化改变。图2｜实验方案示意图分离原代神经元后，用谷氨酸/GABA/PBS 处理原代培养的神经元，并分离出 sEV。将不同来源的 sEV 添加到用 Aβ 处理的神经元或注射到 AD 模型小鼠中，并对小鼠进行MWM测试。文章中，在评估在小鼠体内系统传递的 sEVs 的分布的实验中，使用了博鹭腾AniView100多模式动物活体成像系统拍摄。该实验中使用近红外染料DiR进行标记，同时进行了阴性对照实验（仅注射 DiR，不注射 sEV）。通过 APP/PS1 小鼠的尾静脉注射 DiR 标记的 sEV，使用Aniview100活体成像系统在注射后 24 小时拍摄小鼠的图像并评估分布情况。在带有 DiR 标记的 sEV 的小鼠的大脑和重要器官中均检测到荧光。随后，处死小鼠，取出器官并成像，目的为识别荧光信号来源的器官并使信号干扰最小化。此外，为了排除游离染料干扰实验结果的可能，在收集器官前用不含 sEV 的游离 DiR处理小鼠。实验结果显示，脑、心、肝、肺、脾、肠、肾均呈不同程度荧光。图3｜sEV的体内外分布情况在注射 DiR 标记的 sEV 后 24 小时，使用活体成像系统对A - C活小鼠进行成像。a)、小鼠背面成像b)、小鼠腹侧成像c)、收集指定器官后使用活体成像系统成像本研究中证明了 sEV 的功能可以受神经递质平衡状态的调节，并对神经元中的 Aβ 毒性有不同的影响。并且该研究从 sEV 的角度为 AD 中发生的 E/I 失衡提供了新见解，并表明通过GABA 能系统对 sEV 进行生物学改造可能是预防或减轻 AD 发病机制的治疗途径。论文链接：https://doi.org/10.1186/s12951-021-01070-5

本文由中国药科大学药物代谢与药代动力学重点实验室天然药物国家重点实验室所作，发表于DRUG METABOLISM AND DISPOSITION （2018）46:53–65。 胃肠道和中枢神经系统之间的双向沟通途径，称为“肠-脑轴”，其与脑损伤的治疗越来越相关。尽管血浆和大脑暴露浓度水平极低，三七总皂苷提取物(PNE)仍是预防和治疗心脑血管缺血性疾病的常用药物。迄今为止，PNE神经保护作用的潜在机制在很大程度上仍然未知。本文通过研究PNE对胃肠微生物群落和γ-氨基丁酸(GABA)受体的调节，系统地探明了PNE的神经保护作用。 结果表明，PNE预处理对大鼠局灶性脑缺血/再灌注(I/R)损伤有显著的神经保护作用，但对无菌大鼠的保护作用减弱。PNE预处理可显著防止I/R手术引起的长双歧杆菌(Bifidobacterium longum, B.L.)下调，B.L.定植也可发挥神经保护作用。更重要的是，PNE和B.L.均可上调I/R大鼠海马GABA受体的表达，同时给予GABA-B受体拮抗剂可显著减弱PNE和B.L.的神经保护作用。上述研究表明，PNE的神经保护作用可能主要归因于其对肠道菌群的调节，口服PNE也可通过上调GABA-B受体用于I/R损伤的治疗。使用仪器：岛津LCMS-8050 图1 正常、I/R模型和I/R + PNE大鼠(n = 6/组)的TTC染色脑冠状切片(A)、梗死体积(B)和神经功能缺损评分(C)。PGF、PGF + I/R模型和PGF + I/R + PNE大鼠(n = 6/组)的TTC染色脑冠状切片(D)、梗死体积(E)和神经功能缺损评分(F)。大鼠海马中IL-1b水平(*P，0.05，**P，0.01 vs对照组，#P，0.05 vs I/R组，# P，0.01 vs I/R组) (G)，大鼠海马中IL-6水平(**P，0.01 vs对照组，#P，0.05 vs PGF+I/R组，# P，0.01 vs I/R组) (H)和大鼠海马中BDNF水平(*P，0.05 vs对照组，# P，0.05 vs I/R组) (I) (n = 6/组) 图2 B.L.的神经保护作用(n = 6/组)。(A) TTC染色的脑冠状切片、(B)梗死体积、(C) 神经功能缺损评分、(D) IL-1b、(E) IL-6、 (F) TNF-a、 (G) BDNF (*P，与对照组比较0.05，# P，与I/R组比较0.05) 图3 Western blotting检测PNE和B.L对GABA-B受体(R1、R2)表达的影响(n = 6/组)。(A) GABA-B R1、GABA-B R2、GAPDH对应的蛋白带 (B) GABA-B R1蛋白表达的灰度分析 (C) GABA-B R2蛋白表达的灰度分析。(*P, 0.05 vs对照组，#P, 0.05 vs I/R组，##P, 0.01 vs I/R组) 图4 GABA-B受体拮抗剂对PNE疗效的影响(n = 6/组)。(A) TTC染色的大脑冠状面、(B)大鼠大脑梗死体积、(C)大鼠神经功能缺损评分、(D) IL-1b水平、(E) IL-6水平、(F) TNF-α水平(* P, 0.05) 因此，本研究结果表明，I/R手术改变了肠道菌群，下调了B.L的数量，B.L水平的下降导致GABA受体表达的下调。PNE预处理后可在一定程度上预防肠道菌群I/R相关的变化，显著提高B.L的相对丰度。B.L水平的升高可上调大鼠海马GABA-A和GABA-B受体的表达，而GABA-B受体的上调在缺血性脑损伤中起保护作用。据我们所知，这是首篇阐明PNE涉及肠道微生物群的大脑保护作用的报告。值得注意的是，B.L在PNE通过上调GABA-B受体治疗脑I/R中起着关键作用。 文献题目《Low Cerebral Exposure Cannot Hinder the Neuroprotective Effects of Panax Notoginsenosides》 使用仪器岛津LCMS-8050 作者Haofeng Li, Jingcheng Xiao, Xinuo Li, Huimin Chen, Dian Kang, Yuhao Shao, Boyu Shen,Zhangpei Zhu, Xiaoxi Yin, Lin Xie, Guangji Wang, and Yan Liang Key Laboratory of Drug Metabolism and Pharmacokinetics, tate Key Laboratory of Natural Medicines, China Pharmaceutical University, Nanjing, China

p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 神经递质，大脑中在突触传递中担当“信使”的特定化学物质，称作神经递质，简称递质。图1、图2为其示意图。随着神经生物学的发展，陆续在神经系统中发现了大量神经活性物质。在中枢神经系统（CNS）中，突触传递最重要的方式是神经化学传递。神经递质由突触前膜释放后立即与相应的突触后膜受体结合，产生突触去极化电位或超极化电位，导致突触后神经兴奋性升高或降低。神经递质组成复杂，包括多种生化物质。 /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201905/uepic/fbdc9fad-1519-44e3-a655-6b3885113b87.jpg" title=" 图片 1.png" alt=" 图片 1.png" / /p p style=" text-align: center text-indent: 2em " 图1 神经递质示意图 /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201905/uepic/0c74c60c-889b-43a7-9e53-78cd8567cd74.jpg" title=" 图片 2.png" alt=" 图片 2.png" / /p p style=" text-align: center text-indent: 2em " 图2 大脑中的“神经递质”， span style=" text-align: justify text-indent: 2em " 黑质就被称为“神经递质” /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 要对神经递质进行分析，必须首先从活脑中提取神经递质，然后用HPLC-MS / MS进行分析，这实在有点匪夷所思，令人难以置信。然而，加拿大滑铁卢大学雅努什· 波利西恩（Janusz Pawliszyn）领导的团队成功了。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 从活脑中提取神经递质，本质上是侵入性的。但是，他们通过利用固相微萃取（SPME）技术，已设法使其成为非侵入性的。他们的方法是将涂有某种形式的吸收性SPME材料的细不锈钢丝插入活体的大脑中。由于钢丝较细，对大脑造成的干扰较小，雅努什的团队使用150μm粗的不锈钢丝。他们首先用酸蚀刻了不锈钢丝的下端部分，直到它只有100μm粗。然后，他们将SPME涂在蚀刻部分，将其直径又增加至150μm。最后，又在涂层部分再添加了50μm厚的覆盖层。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 该团队在特制的神经递质混合物（包括去甲肾上腺素，乙酰胆碱和5-羟色胺）上测试了各种不同的市售聚合物SPME材料，但没有一种被证明是理想的。问题在于性能最好的SPME材料是以相对较大的颗粒形式出现的，尺寸可达60μm，需要将其研磨成细粉末涂在钢丝上。但这种研磨导致材料失去了一些官能团，使其在吸收神经递质方面的效率降低。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 所以波利西恩和他的团队选择使用来自沃特世的一种名为HLB（亲水 - 亲脂平衡）的SPME材料，这种材料在吸收神经递质方面不如其他一些材料有效，但其颗粒直径却只有5μm，可直接应用于钢丝。然后，他们在颗粒表面添加了强阳离子交换（SCX）基团，提高了材料对神经递质的有效性。在吸收神经递质混合物方面时，HLB-SCX材料被证明优于任何其他测试的SPME材料。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " SPME材料确定后，他们用提取的脑组织和琼脂凝胶的混合物制成了人造大脑材料，以方便研究。在人造大脑材料中，加入了另一种神经递质混合物。他们发现，将HLB-SCX涂层的钢丝插入人造大脑，20min后，足以使HLB-SCX材料吸收令人满意的神经递质。将HLB-SCX涂层的钢丝取出，浸泡在水、乙腈和甲醇的混合物中，释放神经递质，然后以高效液相色谱 - 串联质谱（HPLC-MS / MS）仪进行分析。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 实验表明HLB-SCX材料可以从脑材料中提取几种加标的神经递质，包括去甲肾上腺素、乙酰胆碱和5-羟色胺，用于通过HPLC-MS / MS在低于生理水平进行鉴定。然而，其他神经递质，包括牛磺酸，谷氨酸和γ-氨基丁酸，只能在高于正常生理水平的浓度下检测到。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 最后，他们在活恒河猴猕猴的大脑上测试了他们的SPME方法。这包括在三个不同的场合同时将HLB-SCX涂层的钢丝插入猴脑的三个不同区域。当科学家用HPLC-MS / MS分析提取的物质时，能够检测到多种不同的神经递质，包括多巴胺、谷氨酸和色氨酸。他们用人工脑材料进行测试，甚至能够检测到牛磺酸，这是用生理检测方法检测不到的。他们还测量了大脑不同区域的不同浓度的神经递质，其中，在某区域发现的神经递质，在其它区域可能根本没有发现，即使在同一区域内，场合不同其神经递质也不同。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 在此成功之后，波利西恩及其团队正在计划使用他们的SPME方法对活恒河猴猕猴大脑中神经递质的分布进行详细研究。他们还在考虑进一步提高方法提取效率的方法，以便它可以解释可能存在的所有神经递质。 /p p style=" text-align: right text-indent: 2em " （编译：符斌 北京中实国金国际实验室能力验证研究中心研究员） /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 根据Brain extraction: A novel method for extracting neurotransmitters from live brains编写 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " Published: Apr 15, 2019 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " span style=" text-indent: 2em " Author: Jon Evans /span /p p style=" text-indent: 2em " SeparationsNOW.com& nbsp & nbsp sample Preparation Newsletter /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " br/ /p p br/ /p

荧光显微成像技术对人们理解神经科学起了非常关键的作用。而最近一些年出现的各种超分辨显微成像技术和专门的荧光探针能够以超过以往普通光学显微镜的分辨率直接观察神经元亚细胞结构和蛋白质排列。并以直观可视方式揭示了神经细胞骨架组成、分布、运动和膜蛋白信号传导、突触下结构和功能，以及神经元−胶质细胞相互作用。同时超高分辨显微成像技术（Super Resolution,SR,下文中出现SR均指超高分辨率显微成像技术）对于许多自身免疫和神经退行性疾病模型中的分子靶点研究也提供了全新的强大工具。今年春，Werner等科学家在美国化学学会会刊（ACS)上最新发表了一篇综述，比较详实系统介绍了超高分辨率显微技术在神经科学上的最新应用进展。我们在此文基础上进行了编译整理。因文章较长，我们将分三期陆续介绍。本期接着上期的第一部分超高分辨率显微技术在神经科学中的应用（一） ，为第二部分内容。4.荧光标记与样品制备4.1. 荧光标记神经元和脑片的超分辨率成像是用适当的荧光团标记感兴趣的生物分子，理想情况下是以定量和化学计量的方式。虽然SIM和其他超分辨方法的成像质量取决于信号背景（S/B）比，但SIM对荧光团没有特殊要求。另一方面，STED显微镜可达到的分辨率在很大程度上取决于所用荧光团的光稳定性。RESOLFT显微镜使用可逆光开关FPs，具有两个稳定状态，因此可以使用较低的激光照射强度。所有SMLM方法的定位精度取决于每个事件检测到的光子数。dSTORM需要光开关有机荧光团，包括菁、罗丹明和恶嗪染；而PALM则需要使用光开关、光转换和光激活FPs。与此相反，DNA-PAINT理论上适用于所有荧光团，因为开/关速率由对接链和成像链序列和缓冲条件决定，而其中 Cy3B和ATTO 643效果最好。、为了获得一张好的超分辨率图像，除了成像方法以外，样品制备也非常关键。使用荧光探针进行高效和特异的标记，并且使标记误差（荧光团和目标之间的距离）达到最小。为了通过荧光成像进行结构解析，标记密度（即荧光探针之间的距离）必须显著高于所需的分辨率。另一方面，特别是对于接近几乎分子分辨率的超分辨率成像方法，标记误差必须尽可能小，以达到高精度成像。对于活细胞标记而言，在合适的表达载体中融合感兴趣的蛋白质的基因编码FPs无疑成为首选。然而，FPs的亮度较低，与有机染料相比，其图像分辨率较低。理想的标记方法是使用荧光染料标记基因编码的蛋白质、肽标签或单一氨基酸。在模式生物如果蝇或秀丽隐杆线虫的应用得益于基因编码工具，通过转座子、操纵二分体Gal4/UAS表达系统或Crispr/Cas9方法引入或去除突触蛋白和荧光蛋白。由于瞬时转染的细胞表现出不同的蛋白质表达水平，蛋白质的分布和功能不一定反映野生型的情况。图5 通过单体链霉亲和素结合AP标记的突触蛋白成像结果显示Nlg1和LRRTM2的差异分布（dSTORM成像）。上排：Homer 1c GFP作为突触后室的参考。第二排：Nlg1和LRRTM2（dSTORM成像）。左下：频率分布直方图，用于显示相对于Homer 1位置中心的信号分散情况。右下：列出比较两种蛋白质的突触结构域数量的直方图。然而，通过构建优化表达，稳定表达的细胞或CRISPR基因敲入等方法可以产生从内源性到强过表达的蛋白质表达水平。根据不同的转染策略，可以采用不同的方法转染神经元。传统的磷酸钙共沉淀法和脂质体法在大多数实验室都可实施，但这两种技术的转染效率很低。而病毒转染的效率比较高，允许注射到大脑区域，但需要实验者具备病毒生产方面的专业知识，并需要考虑生物安全问题。此外，还必须考虑病毒类型、插入片段大小、毒性和差异表达等因素。要达到高转染效率，可以使用高压脉冲将核酸直接输送到细胞核，进行核转染。然而其缺点是，当这种方法应用于小鼠原代神经元时，会导致细胞存活率较低，并且实验设备昂贵，还需要根据神经元密度和物种对脉冲参数进行多次测试。另外，也可以使用细胞附着式高电阻管，在完整神经元网络（如器官型切片）中进行单细胞电穿孔。利用这种方式，结合CRISPR基因敲入获得了接近内源性的蛋白质表达水平。基于CRISPR基因敲入，在神经元发育的不同时间点通过脂质感染、核感染或病毒转染在神经元中实现。如前所述，FPs光稳定性和荧光光子输出较低，这降低了图像质量。另外，连接大小为2−5nm的FP后,蛋白质功能可能会受到影响。因此,首先必须清楚感兴趣的蛋白质在野生型的功能表现。而有机染料比FPs小得多，有更高的光子产率和光稳定性，但需要与其它能与感兴趣分子结合的分子进行连接耦合。对于固定细胞，使用一抗和二抗进行免疫染色仍然是标记内源性蛋白质的首选方法。缺点是由两个大小17.5 nm左右的IG抗体间接免疫标记有可能导致标记误差。使用直接法免疫荧光或Fab片段可以减少标记误差。另外针对GFP或转基因短肽标签的更小（1.5×2.5 nm）的骆驼“纳米抗体”已应用于dSTORM成像。此外，耦合了链霉亲和素的荧光染料可用于神经元和器官型组织中靶蛋白的特异性标记。使用这种标记方法，研究了神经氨酸酶-1ß、神经肽原-1和富含亮氨酸的重复跨膜蛋白2的动力学和纳米级结构，并揭示了跨突触粘附结构的形成（图5）。另外可以使用生物正交肽或自标记蛋白质标签，例如FlAsH tags, SNAP-tags, and Halo-tags。这些标签蛋白与目标蛋白共表达，并以共价和特异性结合其各自的荧光标记试剂或配体。对于肌动蛋白和微管的标记，可以使用小肽药物，如双环七肽-鬼笔环肽和紫杉烷类药物，如紫杉醇。膜和细胞器的标记可以通过荧光脂质和细胞器的追踪试剂来实现。此外，小肽或配体可以直接用荧光团标记，并特异性结合生物分子，例如，显示抑制性突触后位点的超结合肽。要达到最小的标记误差，可以通过单个非天然氨基酸的特定位点标记实现。通过基因编码导入设计的非天然氨基酸，并用四嗪染料进行生物正交点击化学标记。显然，神经元和组织切片必须根据要成像的结构进行透膜和固定。与所使用的标记方法无关，特别注意所用的试剂必须能保留自然细胞环境中生物分子的超微结构。通过化学试剂固定交联蛋白质，可能会影响结合亲和力，也可能削弱分子间的相互作用。在大多数情况下，多聚甲醛（PFA）和戊二醛已成功用于神经科学的超分辨率成像。此外，还引入了乙二醛等新型固定剂。膜分子应始终使用4%的PFA和0.2%戊二醛固定，以尽量减少残余流动性并避免伪影，例如抗体结合诱导的簇形成。4.2. 神经元的多色遗传标记荧光蛋白彻底改变了神经元的活细胞成像方式，因为荧光蛋白可以与感兴趣的蛋白质融合，并且在假定不影响野生型功能的前提下，用于双色和三色成像。神经系统具有非常高密度的轴突和树突相互作用结构，需要使用更多不同颜色的标记来区分不同的神经元连接。2007年，随着一种名为Brainbow的转基因方案的开发，这一问题得到了解决，该策略能够对神经元进行多色标记。结合单细胞分辨率成像技术，Brainbow技术可以用来创建大脑图谱，详细描述神经元如何形成回路，其连接体以及它们投射到何处。Brainbow利用了三原色，即可见光谱的所有颜色都可以由三种原色的不同混合物生成，即红色、绿色、蓝色（RGB）或转化为荧光蛋白，例如RFP、YFP和CFP。为了实现这一想法，应用了Cre/lox重组系统，该系统可以通过DNA切除、反转或染色体重组启动基因表达，使三个荧光蛋白基因中的一个在转基因中随机表达。转基因盒的多个拷贝的引入导致三个不同拷贝数的基因在每个细胞中组合表达，从而产生几十种颜色，使相邻神经元分化并观察其相互作用。Brainbow技术非常适合绘制不同神经元类型之间的连接模式，追踪轴突，并识别大脑中远距离的神经元连接。此外，已经证明Brainbow表达可以成功地用于研究周围神经损伤后的轴突再生，并检测大脑发育过程中的重要阶段。为了进一步改进Brainbow在包括突触蛋白在内的大脑和连接图谱中的应用，SRM的应用是显而易见的。最近通过结合Brainbow、顺序免疫染色和ExM同时研究同一脑切片上的形态、分子标记和连接，成功地证明了这一点（图6）。将这项技术应用到全脑研究一直是一个挑战，直到最近才成功应用。图6 结合Brainbow和ExM的多轮免疫染色和ExM(miriEx)成像。(A) 实验方案：在Parvalbumin cre/+ 小鼠的脑切片中，Parvalbumin蛋白阳性中间神经元通过Brainbow进行观察，并在下一轮应用4倍ExM成像。使用EYFP信号对Homer1和Gephyrin进行免疫染色来观察突触。(B) Brainbow 信号的免疫染色。(C) 分别通过突触后标记homer1和Gephyrin的免疫染色来区分抑制性和兴奋性突触。插图(D)−(F)和(G)−(I) 显示图像的更多细节图。(J)和(K)神经元的形态重建(使用ImageJ软件插件nTracer)，包括其各自传入的特征。虚线框表示(B)和(C)中所示的区域。重建的神经元按顺序编号。标尺(膨胀前的)：10μm(B/C)、2.5μm(I)、20μm(J/K)。4.3. 神经科学中的光电联合显微镜电子显微镜(EM)和电子断层扫描具有光学显微镜无法达到的空间分辨率，可以获得细胞和细胞器的超微结构信息。然而，EM和电子断层扫描不能标记特定的分子，因此难以识别未知的细胞结构或具有相似形态特征的结构。用胶体金标记结合抗体可以实现蛋白质的纳米级定位，但抗原的标记效率低下，这意味着胶体金颗粒的数量仅占抗原总数量的1%到20%。而另一方面，荧光显微镜虽然分辨率较低，但可以进行大视场成像和对活细胞中蛋白质进行定位。对固定样本细胞中的各种分子进行高效和特异的分子标记后，结合超分辨率荧光显微镜方法，达到的空间分辨率可以远低于衍射极限。因此，光电联合显微镜（CLEM）作为一种通用的方法，在电子显微镜提供的细胞超微结构背景下，通过超分辨率成像来可视化蛋白质的定位和相互作用。然而，将超分辨率成像与EM结合起来更为困难，因为乍一看，这主要是由于两种方法的样品制备流程不同且不兼容。例如，EM中保存超微结构所需的固定和染色会引入很强的自发荧光。而且荧光蛋白还会在固定和聚合物包埋所需的脱水和氧化条件下淬灭。此外，这两幅图像必须在纳米精度下精确叠加，首先需要使用在荧光成像和EM中都表现出极好的对比度的固定对准标记物，如裸金微球。 另外，样品脱水引起的结构变形会严重破坏两幅图像的正确叠加。所以必须在超微结构和荧光保存之间找到折衷方案。例如，已经证明，对于某些周期性分子结构，如核孔复合体，无需使用对准标记，dSTORM和EM扫描图像可以以20 nm的精度叠加。光电联合显微镜的流程是先对轴突和树突进行荧光实时成像后，再使用透射电镜观察。例如，表达GFP的脑组织在荧光成像后进行化学固定，再使用电子密度标记进行免疫标记，例如EM金。或者采用更成熟的方法，如过氧化物酶或胶体金标记。最后，可以通过光转化在荧光团处局部生成二氨基联苯胺（DAB）聚合物。为了克服标记问题并确保超微结构的保存，已经开发了用于EM (NATIVE)的纳米体辅助组织免疫染色。NATIVE能够高效标记蛋白质，无需苛刻的渗透步骤、特殊树脂、锇替代物或透明化试剂。随着方法的改进和技术的发展，光电联合显微镜已被证明是研究不同种类突触和定位突触蛋白的理想选择。5.超分辨显微镜观察神经元隔室/突触以及神经元−胶质细胞相互作用下面我们将展示通过超高技术获得的有关细胞骨架组成和动力学、突触前室和突触后室对神经传递准确性至关重要的分子组装，以及形成神经元功能的星形细胞结构的调节和构建的最新数据。5.1. 细胞骨架神经元的极化性质以及树突和轴突的长度都需要结构和功能性支架来支持它们的稳定性、适应可塑性和物质运输，这些特性对神经元的存活和信号传递是必不可少的。因此，神经细胞骨架的结构在过去几十年中引起了神经科学家的注意，并在其它文献中进行了详细的回顾。20世纪70年代的电镜研究表明，神经细胞骨架由三种主要类型的神经纤维组成：大小约为20−30 nm的微管，直径为10 nm的神经纤维和5−10 nm大小的肌动蛋白丝。微管是由异二聚体在GTP依赖性组装过程中结合α和β微管蛋白单体组装而成的圆柱体，称为原丝，再由13个这样的原丝形成一个微管单元。轴突的微管成束状组织，并根据其相对于神经元胞体的位置显示不同的方向。它们的极化通过快速增长的正端和缓慢增长的负端体现。STED显微镜揭示了快速生长极依赖钙锚定在肌动蛋白皮质上。使用dSTORM对发育中的神经元进行活细胞成像证明了神经元极性和轴突具有方向一致的、平行的由TRIM46驱动的微管束，而树突微管的特征是混合极性。用Motor-PAINT方法进行纳米跟踪发现稳定和乙酰化的微管显示负端向外的方向，而动态和酪氨酸酶化的微管则显示相反的方向（图7）。例如轴突起始节中微管密集地聚集在束簇中，由于密集的重叠定位，使用SMLM方法具有挑战性。这个问题可以通过两种实验方法来解决：第一，设计更小的标记探针，如微管蛋白纳米抗体，这不需对神经元微管更详细的观察。第二，一种降低群聚密度的超分辨率方法，如ExM，可用于胞体和树突中微管亚群的可视化。神经纤维是在轴突中形成的广泛平行网络的异质聚合物，它为轴突提供稳定性并调节轴突直径和传导速度，其组成包括低、中、高分子量神经纤维、中间蛋白和外周蛋白的三联体。它们的自组装首先形成平行的异二聚体，然后半交错地结合成反平行的四聚体。最后，八个四聚体横向聚集成单位长度的神经纤维，进一步拉长并径向压缩至最终的神经纤维外观。用电镜观察到在神经纤维之间的交界面，形成3−5 nm大小的交叉桥，但对其功能及其与神经纤维的分子相互作用仍不清楚。在这里，ExM与SMLM的结合或DNA-PAINT的应用可能有助于研究密集神经纤维中的这种相互作用。神经纤维动力学已经通过光转换和光活化SRM实验进行了研究，显示了端到端蛋白合成中的退火和切断过程。肌动蛋白最初被认为与一组更集中的短肌动蛋白丝结合在一起，在轴浆中形成斑点状的膜下层。在原代神经元和脑切片中使用phalloidin Alexa Fluor 647进行STORM成像，揭示了轴突肌动蛋白的新的组成原理。这些实验揭示了轴突中存在圆周式肌动蛋白环，每190 nm固定重复间隔绕一圈，并进一步表征了轴突中具有类似尺寸的ßII血影蛋白和钠通道的周期性条带，而树突状腔室内显示出更细长的肌动蛋白组织。此外，通过STORM成像发现，并通过STED显微镜的研究得到证实，这种肌动蛋白组织模式的普遍性也存在于树突中。进一步的报告发现，尽管树突中也存在基于肌动蛋白血影蛋白的周期性膜骨架，树突中这种结构的形成倾向和发育速度低于轴突。此外，本文还显示了肌动蛋白和血影蛋白在胞体和部分树突中的二维多边形晶格结构，类似于红细胞中的膜骨架结构。此外，使用SiR-actin，可通过STED显微镜在活的原代神经元中观察到这种周期性结构。最后，最近的CLEM方法结合铂金复原电镜（PREM）和STORM研究了无顶轴突中的肌动蛋白组织，并提供了轴突编织状肌动蛋白结构与周期性肌动蛋白超微结构相关的证据（图8）。图8。原代神经元无顶轴突（unroofed axons）的CLEM成像（结合铂复型电子显微镜和STORM的光电联合成像）。用铂复型电镜（PREM）（灰色）显示的轴突辫状条带（箭头）被叠加到大鼠原代神经元的超分辨肌动蛋白环（伪彩）上，比例尺=2, 1, 0.2μm（从左到右）。中间：轴突辫状条带间距测量后显示出与周期肌动蛋白间距相似的尺寸。右图：在铂复型电镜（PREM）中记录的神经纤维厚度，未分裂（交织在一起）和分裂（分裂开）的轴突肌动蛋白辫状条带为蓝色，树突中的单个肌动蛋白神经纤维为紫色，微管为灰色参考。采用平均值和标准误显示数据。Copyright 2019 Springer Nature.ßII 血影蛋白基因敲除导致周期性肌动蛋白环结构破坏，同时细胞器的双向轴突运输受损。SMLM结果显示，与轴突相比，轴突起始节中的分子组织其特征是轴突起始节（AIS）蛋白ankyrin-G和ßIV-血影蛋白，这种基于肌动蛋白-血影蛋白的细胞骨架与远端轴突相似。此外，在AIS中存在ßIV-血影蛋白和Ankyrin G，而在远端轴突中存在ßi--血影蛋白和Ankyrin B。SMLM显示与肌动蛋白环相连的纵向头对头ßIV血影蛋白和Ankyrin的二价取向有助于建立紧凑的AIS超微结构，该超微结构甚至对针对肌动蛋白和微管的药物治疗具有抵抗力。进一步显示Ankyrin-G会聚集到亚结构域，增强神经元活性，而成为精神疾病的主要风险基因。随后的SMLM研究还阐明了αII血影蛋白与ßIV血影蛋白共同在AIS提供强健的周期性细胞骨架组织以及防止AIS装配不完全和神经变性的重要性。一份相关报告显示，αII 血影蛋白丰度随有髓鞘轴突直径的增加而增加，表明大直径轴突更容易发生神经退行性病变。在免疫标记II血影蛋白后，将其连接到一种可膨胀的聚合物，并在水中膨胀后，通过ExM研究ßII spectrin沿轴突的周期性模式。这一新方法证实了如前所述的细胞骨架内部的组织原理。不幸的是，在ExM过程中，phalloidin探针在膨胀过程中被冲掉。有两种策略解决这一问题：一方面，携带甲基丙烯酸基团的phalloidin三功能抗体被设计用于与凝胶的有效标记；另一方面，最近的一份报告使用荧光团结合抗体，类似于常规免疫染色，将荧光团靶向phalloidin探针与凝胶连接。在中枢神经系统的几种神经细胞类型和动物物种中，肌动蛋白和附属蛋白的强大超微结构组织也得到了证实。外周神经系统（PNS）中，STED显微镜也显示在梳理的神经纤维样本上有重复的细胞骨架成分。最后，SMLM揭示了肌动蛋白-血影蛋白骨架的一个重要生物学功能：它可以作为一个信号平台，通过组织跨膜信号蛋白，包括G蛋白偶联受体（GPCR）、细胞粘附分子（CAM）和受体酪氨酸激酶（RTK），在神经元中进行信号转导从而实现GPCR-和CAM介导的RTK信号。5.2. 突触前室为了确保有效的神经化学传递，突触前膨大参与突触囊泡循环、神经递质填充以及与突触前膜在活性区（特殊蛋白质密集分布的纳米隔室）的融合，以最终释放神经递质。在这里，我们关注SRM如何扩展我们对突触前功能的理解。早期只能使用EM对化学固定神经元里的小直径突触小泡进行研究，但随着SRM的出现，应用快速STED显微镜，通过免疫标记位于突触前室突触小泡上的钙传感器突触标记蛋白1（SYT1）来观察突触小泡的活动。STED显微镜进一步显示，突触小泡融合后Syt1分子似乎驻留在突触膜上，也支持胞吐后突触小泡蛋白的清除过程。此外，在突触小泡融合过程中，当暴露于细胞外空间时，靶向Synaptobevin 2 pHluorin的荧光团结合纳米体后，亚衍射追踪显示了突触小泡的异质性迁移。一种类似的方法使用vGlut1 pHluorin在原代神经元中的表达来观察单个神经元突触小泡，定位精度为27 nm，并揭示了突触小泡的多个不同释放位点。作为一项方法学的进步，为了对主动循环的小泡成像，设计了一种名为mCLING的亲脂膜探针，该探针可对突触膜进行染色，通过内吞作用和固定，可以进行免疫标记，且和SRM相结合。突触小泡的胞吐过程需要一组属于突触前细胞基质的突触前蛋白质的高度可靠的相互作用，使突触小泡接近和暂时驻留在所谓活动区的膜上，并最终释放突触小泡。黑腹果蝇易于遗传，有助于精确定位果蝇幼虫神经肌肉接头（NMJ）活动区的第一个重要蛋白质。Bruchpilot（Brp）是一种必不可少的活性区成分，是一种大的、卷曲的螺旋蛋白，对于钙通道聚集和突触囊泡定位到突触释放位点至关重要。除了通过Brp研究钙通道聚集外，STED显微镜还证明了该蛋白细长的组织结构，并揭示了与Brp相互作用的蛋白（如syd-1α、liprin和rim结合蛋白（RBP））的定位。定量dSTORM方法研究了果蝇活动区Brp丝的数量，并显示了Brp的结构组织与其功能之间的强相关性。接下来的研究通过dSTORM评估Syt1敲除后的活动区（CAZ）电生理学和细胞基质参数。这项研究表明，在果蝇NMJs 1b型突触膨胀中，Syt1基因的敲除导致更高的Brp计数和簇内Brp图谱的改变。在哺乳动物突触中，突触前支架蛋白bassoon 和 piccolo参与突触囊泡释放的调节。据报道，bassoon蛋白通过与RBP的相互作用来控制CaV2.1型钙通道的定位。此外bassoon蛋白能加速囊泡释放，因为其丢失导致小脑苔藓纤维到颗粒细胞突触中的突触囊泡数量显著减少和突触抑制。STED显微镜显示bassoon 和 piccolo蛋白是一个夹心三明治结构，两侧为piccolo蛋白，bassoon蛋白居中。STORM成像通过距离测量显示bassoon蛋白相对于突触前和突触后室中其他相关突触蛋白质的方向。囊泡胞吐过程由一组可溶性ethylmaleimide敏感因子附着受体（SNARE）蛋白质进一步协调。位于突触膜上的囊泡SNAREs (v-SNAREs) 蛋白和 t-SNARES蛋白的复杂形成导致突触囊泡成功融合。在质膜上的突触体相关蛋白25（SNAP-25）和突触融合蛋白聚集首先通过STED显微镜进行研究。这项研究表明，大约75个突触融合蛋白分子被堆积成50- 60 nm大小的纳米团簇。在之后的研究中，SMLM以更高的精度对SNAP-25和突触融合蛋白的分布进行成像。在这里，描述了Syntaxin簇内的分子密度梯度。dSTORM成像显示，未聚集的分子紧密地定位于聚集区域。最近的一项研究显示了一种以syntaxin或SNAP-25为靶点的像。研究表明，集中在突触前部位的60%的通道是可变的。此外，通过应用BAPTA钙缓冲降低了钙通道的扩散。结果表明，突触小泡和钙通道之间的纳米域偶联保证了神经传递的精确度，并可根据需要通过突触前钙通道的扩散进行精细调节。 在融合和递质释放后，内吞机制诱导循环产生新的囊泡，从而重建可释放的囊泡池并为持续的神经传递提供基础。囊泡循环的主要机制由网格蛋白介导的内吞作用组成。使用光遗传学和”闪光冷冻”电镜的研究也报道了比超快的内吞快200倍的过程。如双色iso-STED显微镜所示，通过摄取针对囊泡内膜结合位点的Syt 1抗体，将内吞位点定位到活性区外周。此外，在神经内分泌细胞中，STED显微镜也揭示了囊泡只能部分与突触前膜融合释放递质，形成一个“Ω”形状的结构，而没有完全融入膜中，因此有利于“接触后即脱离”（kiss and run）的模式。与网格蛋白介导的内吞作用相比，它会产生更快囊泡再循环率的递质释放模型。依赖于活性的大量内吞作用进一步增加了可能涉及的机制的复杂性，有人提出，根据突触类型和活动，多种内吞模式可能并行运作。本文由超高显微技术应用工程师郭连峰、黄梓彤编译

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如果我们不幸罹患上了癌症，除了积极治疗之外，医生更多地是建议我们要清淡饮食，忌大油大肉，做到均衡营养，从生活习惯上延缓癌症的转移或者复发。这一观点的流行也得益于大家知道癌症是由多因素导致的，不仅包括基因突变还包括环境，甚至是不良的生活习惯。科学研究也支持这一观点，比如高脂饮食（详见BioArt报道：Cell Stem Cell | 高脂饮食促进肿瘤发生的新机制——抑制肠道干细胞MHCII表达）、肥胖（详见BioArt报道：Cell Meta | 肥胖驱动乳腺癌发生发展的机制）等就是癌症的高危因素。这之中，脂肪酸与其转运蛋白CD36就与癌症的发生、发展和药物抵抗有关（详见BioArt报道：Nature | 低糖饮食不仅降糖还抑癌，关键取决于脂代谢）。那么在我们的日常膳食中，哪种脂肪酸与癌症发展有关以及其机制是什么呢？2021年11月10日，西班牙巴塞罗那科学技术研究院的Salvador Aznar Benitah、Gloria Pascual和美国西北大学Ali Shilatifard合作在Nature上发表了文章Dietary palmitic acid promotes a prometastatic memory via Schwann cells，揭示了棕榈酸而不是油酸或者亚油酸可以促进小鼠口腔癌和黑色素瘤的转移。研究人员选择了食用油中常见的棕榈酸（palmitic acid，PA，棕榈油中主要的饱和脂肪酸）、油酸（OA，oleic acid）和亚油酸（LA，linoleic acid）作为研究对象，并利用这三种脂肪酸处理人口腔鳞状细胞癌细胞（OSCC）4天（棕榈酸300uM，在人血液生理浓度内；油酸和亚油酸均为50uM，避免脂毒性），之后再将处理的细胞异种移植到到小鼠身上，发现这三种脂肪酸均不能影响肿瘤的形成，但是只有棕榈酸却能够显著促进肿瘤的转移和转移灶的大小，并且能够诱导脂肪酸转运蛋白CD36的表达。棕榈酸的这种促转移能力是否是因为持续刺激而产生的呢？研究人员就先用不同的脂肪酸刺激口腔癌细胞4天，之后撤除脂肪酸14天，再将其移植到小鼠中，发现经过棕榈酸处理的癌细胞仍然表现出强大的促转移能力，油酸和亚油酸甚至有降低，另外棕榈酸在50uM时也表现出促转移能力。这一结果说明了棕榈酸甚至可以让癌细胞产生“转移记忆”。那么，日常使用棕榈油的效果如何呢？研究人员将OSCC移植到小鼠上，然后分别喂棕榈油、橄榄油和标准饮食10天，之后全部换成标准饮食养至死亡，杀死小鼠后将癌细胞纯化（CD36bright）进行二次移植并进行标准饮食，结果显示只有进棕榈油喂食的小鼠其癌细胞仍然具有强大的转移能力，不仅口腔癌细胞如此，黑色素瘤细胞亦是如此。如果敲除CD36或者中和CD36则会抑制肿瘤转移。细胞记忆与表观遗传有很大的关系。那么棕榈酸导致的肿瘤转移记忆是否也跟表观遗传有关系呢？研究人员在体外使用棕榈酸或油酸处理口腔癌细胞4天，之后撤除棕榈酸培养14天，进行ChIP-Seq（包括H3K4me3、H3K4me1、H3K27ac、H3K27me3、H3K9me3）。尽管H3K4me1, H3K27me3和H3K27ac的分布在棕榈酸处理4天后存在改变，但大部分在棕榈酸撤除14天后消退，只有H3K4me3形成了稳定的改变。GO分析显示这些H3K4me3改变的基因与神经发生和神经重塑有关，不仅如此，研究人员使用6-羟基多巴胺可以有效抑制癌细胞的转移。启动子转录因子结合实验揭示EGR2结合区域富集明显，敲除EGR2可以改变H3K4me3分布并能抑制癌细胞在体“转移记忆”。H3K4me3与甲基转移酶MLL/COMPASS家族有关，包括MLL1, MLL2, Set1A和Set1B。接下来便是确定癌细胞这一“转移记忆”具体和哪种甲基转移酶有关。在敲除Set1B后，棕榈酸导致的癌细胞“转移记忆”被抑制。前面讲到棕榈酸引起肿瘤细胞表观遗传改变的基因富集在与神经有关的基因上，那么这一“神经特征”是否会影响到肿瘤基质尤其是其中的神经相关细胞呢？研究人员对基质细胞进行了bulk RNA-seq，发现差异基因富集在与细胞外基质组织、神经生成、神经分布、胶质生成等相关的基因上，节点通路相互作用预测分析揭示与神经映射和施旺细胞（Schwann cell）发育相关的通路有关。于是，研究人员就进行了单细胞转录组分析，发现与肿瘤相关的施旺细胞和淋巴管内皮祖细胞改变最为明显。空间转录组分析也揭示施旺细胞在喂食棕榈油的小鼠癌症灶中浸润明显，使用胆碱酯酶ABC消化施旺细胞特异性的细胞外基质成分则能阻止棕榈酸的促转移能力。总之，该研究不仅揭示棕榈油中的棕榈酸可以促进小鼠口腔癌和黑色素瘤细胞的转移，通过表观遗传导致这些癌细胞形成“转移记忆”，也提示了长期食用棕榈油或是癌症转移的高危因素。原文链接：https://doi.org/10.1038/s41586-021-04075-0

胃肠道（gastrointestinal, GI）所有器官均由胚胎发育过程中源自三原胚层的细胞组装而成，且是正确执行胃肠道复杂功能所必需的。比如说，胃以化学和机械方式分解食物的关键功能取决于内胚层形成的上皮细胞之间复杂的相互作用以产生胃酸和蛋白酶，中胚层发育而来的平滑肌控制缩放，而外胚层而来的肠道神经负责协调前两个过程。近端胃肠道的先天性和获得性疾病包括食管闭锁、胃轻瘫和胃食管反流病，这些疾病可能由上皮、肠道神经系统（enteric nervous system, ENS）或平滑肌发育不当引起。尽管动物模型对于研究胃食管的发育和疾病非常重要，但不同物种在该器官中存在巨大的结构和功能差异，例如啮齿动物就具有人类不存在的前胃，Hedgehog信号在鸡和小鼠胚胎中胃肠平滑肌的发育中也具有不同作用【1】。因此，创建一种可在体外操作的遗传易处理且复杂的人类GI 组织模型可以加速改善胃食管功能药物的开发和研究。然而，当前的胃和食管类器官模型的局限性在于它们仅包含上皮组织【2, 3】，因此，迫切需要在体外整合来自其他两个胚层的祖细胞从而增加食管类器官的复杂性。2021年12月1日，来自美国辛辛那提儿童医院医学中心的James M. Wells团队在Cell Stem Cell杂志上发表了一篇题为 Functional human gastrointestinal organoids can be engineered from three primary germ layers derived separately from pluripotent stem cells 的文章，该团队开发了由源自人类多能干细胞的三原胚层的细胞组装而成的包含功能性肠道神经元、平滑肌层和分化腺体的人胃类器官，利用该系统证明人类肠神经嵴细胞（enteric neural crest cells, ENCCs）对胃上皮和间充质发育的关键作用，并为其他复杂类器官的开发提供了一个强大的范例。胃肠道发育的第一个，也是最关键的步骤之一是将上皮细胞和间充质组装成原始肠道管。尽管多能干细胞衍生的人胃类器官具有完整的上皮细胞类型，但它们本质上并没有形成强大的间充质【2, 3】。为此，作者根据最近建立的一种方法，直接将人多能干细胞分化为胃间充质细胞的来源，即内脏间充质细胞（splanchnic mesenchyme, SM）【4】，并尝试将间充质纳入胃类器官发育，通过标记物鉴定确认具有间充质包裹上皮的胃窦类器官（hAGOs）生成（图1）。紧接着，作者将有无间充质的hAGOs移植到小鼠体内培养，结果显示约60%没有添加间充质的hAGOs 没能继续生长，即使存活下来也仅有简单的未完全分化的结构，相反，那些具有间充质的hAGOs具有100%的存活率，说明间充质的的掺入能促进hAGOs在体内的生长。图1. 由人多能干细胞衍生hAGO+SM类器官方法示意图需要注意的是，尽管SM能促进hAGOs的生长，但上皮并未发育成类似于人胃的腺体结构。为了解决这个问题，作者基于先前的研究从人多能干细胞中获取ENCCs，将其与hAGOs+SM在体外重组后再次移植到小鼠体内，并惊喜地发现hAGO+SM+ENCCs移植物具有嵌入肠道神经元网络的平滑肌层，且其组织方式类似于人38周的胎儿胃，并包含胃窦细胞类型，比如粘液细胞、表达生长素释放肽、组胺和胃泌素的内分泌细胞等。采用类似的方法，作者还生成了胃底类器官（hFGOs），hAGOs和hFGOs在移植后仍能保持它们的区域特性，通常将人类胃底与胃窦区分开来的细胞类型比例也同样能将hAGOs与hFGOs区分开。从组织结构上来看hAGOs和hFGOs类似于人胃，那么功能上呢？胃对食物的机械分解和十二指肠的排入涉及ENS对平滑肌的收缩控制。作者将从hAGOs分离的组织置于器官水浴系统检测其收缩性，来判断是否存在功能性神经肌肉单位。可以观察到源自hAGO+SM+ENCC的组织存在高度规则的自发收缩振荡，而hAGO+SM的收缩活动则是不规则的。此外，将分离的组织暴露于电场刺激（EFS），仅导致hAGO+SM+ENCC收缩活动增加，表明ENS对平滑肌的调节，如果添加神经毒素TTX阻断ENS功能，也消除了平滑肌的收缩活动。在构建类器官的过程中，作者还发现ENCCs能引起上皮周围的间充质细胞增加2-4倍，且与胃间充质细胞基因BARX1、NKX3-2等的表达水平增加相关，说明肠道神经元在促进对于生成胃特异性间充质细胞。此外，作者将hAGO+ENCC移植到小鼠体内，研究在没有间充质的条件下ENCCs如何影响上皮发育。作者发现，在21个移植物中有5个存在明显的腺上皮形态发生，而19个没有ENCCs的hAGO均未有上皮形态发生，这一发现说明如果没有足够的间充质参与，单独添加ENCCs不会导致正常胃的发育，但也会促进hAGO的存活和部分移植物中腺上皮的发育。然而，这些腺上皮并不表达关键的胃或肠特异性上皮标志物，而与十二指肠近端黏膜下层，靠近幽门连接处的Brunner腺体相似，说明ENCCs需要强大的间充质细胞群来促进胃腺形态发生，即间充质和ENCCs的信号协同作用对于维持胃特征而言十分重要。除了胃窦和胃底类器官，作者还利用上述方法设计了食管类器官，说明通过组合三个胚层祖细胞来设计不同胃肠道器官的可行性，同时也强调了上皮、间充质和ENCCs细胞间通讯对于胚胎器官的正确组装和功能的重要性，为重建先天性GI疾病和上消化道急性损伤模型提供了研究材料。原文链接：https://doi.org/10.1016/j.stem.2021.10.010

唾液酸具有促进新生儿大脑发育的功能，中国科学家刚刚研发了一项新的测定婴儿配方乳粉中唾液酸的量的方法。 　　N-乙酰神经氨酸(N-acetylneuraminic acid，Neu5Ac)是大多数哺乳动物组织中最重要的唾液酸。它与婴儿记忆力和智力的发育非常相关。Neu5Ac在肝脏中合成，而新生儿肝脏合成唾液酸速度较慢。因此，一些婴幼儿乳粉厂家在乳粉中添加Neu5Ac以达到唾液酸自然水平。 　　最近，《国际乳品技术期刊》(International Journal of Dairy Technology)发表了中国科学家研发的有关测定婴儿配方乳粉中Neu5Ac含量的新方法。此方法是超高效色谱与质谱的结合技术，有助于婴儿配方乳粉中唾液酸的质量控制。 　　婴儿配方乳粉样品中的Neu5Ac以游离态和结合态两种形式存在。在前处理过程中，通过糖类和蛋白质的水解作用可以得到结合态的唾液酸。得到的两种形式的Neu5Ac需要通过固相萃取柱的净化和色谱柱的分离后，最终采用质谱检测。 　　该方法测定范围涵盖了一般乳基婴儿配方食品中唾液酸的浓度范围。前处理过程需要一个多小时的时间，但是检测过程仅需5分钟左右。&ldquo 该方法不仅适用于乳品工业，也可满足实验室内产品评估控制。&rdquo 研究小组公开表示。 编译：郭浩楠

存算一体及人工智能神经网络芯片采用非冯诺依曼架构体系，可大降低数据的访问延迟和传输能耗，提升计算速度。SOT-MRAM以其高速、高耐久度等优点，在此类应用中将发挥巨大的优势。当前，存算一体和人工智能神经网络芯片领域亟需一种全线性的多态存储器件（图1b），以便为人工智能神经网络的神经元、突触、存内计算等提供硬件支撑。但现有的SOT多态磁性存储器件及其他类型的存储器件大都是非全线性的（图1a），其输入-输出曲线的部分区域为线性，其他部分为非线性区，要使器件工作在线性区需要额外的时间、能耗和电路开销，阻碍了其在高速、低功耗和高集成密度的存算一体及人工智能神经网络芯片方面的应用[1]。图1、（a）目前的多态存储器件，（b）理想的全线性存储器件，（c）目前电流磁化翻转曲线，（d）通过调节DMI和交换耦合实现的线性磁化翻转曲线。 今年5月，微电子所杨美音副研究员和博士研究生李彦如为共同作者，微电子所先导中心罗军研究员和半导体所王开友研究员为通讯作者，在Physical Review Applied期刊上发表了题为“All-linear multistate magnetic switching induced by electrical current”的学术论文[2]，该团队合作研制出全线性的电流诱导多态自旋轨道矩（SOT）磁性存储器件，并实现了低能耗、可编辑的突触功能，对基于SOT-MRAM的低功耗存算一体逻辑和神经形态计算提供了一种新方法。图2、（a）离子注入引起的全线性磁化翻转，（b）局域离子注入注入实现的可编译的突触功能。 为了获得全线性的多态磁性存储器件，该团队在理论上模拟调节磁性材料中的“DMI效应”和“交换耦合效应”的比例，发现可将非全线性的磁化翻转曲线调控成全线性的磁化翻转曲线（图1c，d）。该理论预测的结果获得了实验验证。该团队在本次工作创新的采用离子注入工艺，成功调节了普通磁性材料中“DMI效应”和“交换耦合效应”的比例，实现了SOT磁性存储器件的全线性磁化翻转（图2a）。同时，通过局域的离子注入，实现了无外场的线性多态存储和突触功能。该突触可在同一超低电流脉冲下实现兴奋和抑制功能，并具备可编译特性。图3 面内场Hx下垂直磁场脉冲作用的磁畴壁运动速度。样品(a) S1, (b) S2, 和 (c) S3. 插图分别是面内场Hx（负、零和正）下的磁畴壁运动的轨迹。(d) 测量的A和D值。本项工作中样品的磁动力学过程观测，磁畴壁运动速度和DMI作用测量的工作由北京航空航天大学张学莹老师组合作提供（如图3），此系列测量表征工作利用了北航-致真团队自主研制的多功能高分辨率磁光克尔显微成像系统，该系统除了能够获得高分辨率的动态磁畴观测外，在磁性薄膜材料和自旋电子器件动力学分析领域也有着突出的优势，它自带了磁场探针台，能够让用户利用软件定义电、磁等多种想要的波形，在进行电输运测量的同时，观察器件磁畴的变化，一键触发后，在样品上同步施加垂直/面内磁场、电流脉冲、微波信号，并同步采集克尔图像信息，能够直观、高效、无损地测量多种参数，包括饱和磁化强度、各向异性强度、海森堡交换作用强度和DMI强度等，是传统的磁光克尔显微镜所不具备的。 图4 多功能高分辨率磁光克尔显微成像系统 产品基本参数：☛ 向和纵向克尔成像分辨率可达300 nm；☛ 配置二维磁场探针台，面内磁场高达1 T，垂直磁场高达0.3 T（配置磁场增强模块后可达1.5 T）；☛ 快速磁场选件磁场反应速度可达1 μs；☛ 可根据需要选配直流/ 高频探针座及探针；☛ 可选配二次谐波、铁磁共振等输运测试；☛ 配置智能控制和图像处理系统，可同时施加面内磁场、垂直磁场和电学信号同步观测磁畴翻转；☛ 4K~800K，80K~500K 变温选件可选。 参考信息：[1] http://www.ime.ac.cn/zhxx/zhxw/202105/t20210521_6036245.html[2] M Yang et al., PHYSICAL REVIEW APPLIED 15, 054013 (2021)

中枢神经系统的自身免疫性疾病，如多发性硬化、视神经脊髓炎谱系障碍，以慢性、进行性神经炎症、脱髓鞘和神经变性为特征。这些疾病在发病率和临床特征上都表现出强烈的女性倾向，其患者多为中青年女性。随着疾病的进展逐渐失去自主活动能力。已有的治疗药物多为对症治疗，选择品种有限且价格昂贵，无法得到根治，给家庭和社会带来巨大的负担。因此，迫切需要开发能够有效延缓这类疾病进展的药物，而目前对这类疾病认识有待更新，拓展研究思路是建立新的治疗方法的重要基础。　　2023年11月21日，中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心(神经科学研究所)、神经科学国家重点实验室周嘉伟研究组、中国科学院分子细胞科学卓越创新中心宋昕阳研究组、中国科学院上海有机化学研究所生物与化学交叉研究中心朱正江研究组与上海交通大学医学院附属瑞金医院神经内科陈晟团队合作在Immunity上发表了文章Intestinal epithelial dopamine receptor signaling drives sex-specific disease exacerbation in a mouse model of multiple sclerosis(肠道上皮细胞多巴胺受体信号驱动雌性多发性硬化小鼠疾病进展)，利用基因修饰小鼠和药理学实验方法以及多组学联合分析，他们发现，肠道上皮细胞多巴胺D2受体(IEC DRD2)过度激活可以选择性地在雌性小鼠中改变肠道菌群的组成及其代谢物水平，从而促进多发性硬化的发病。此研究聚焦中枢神经系统自身免疫性疾病研究前沿，独辟蹊径，通过跨系统研究，揭示了肠道远程调控中枢神经系统自身免疫性疾病易感性的新机制，为建立具有性别选择性的中枢神经系统自身免疫性疾病干预手段开辟了一条新途径。　　　　已知，肠道微生物群失调促进多发性硬化的发展。在多发性硬化动物模型中，肠道微生物群在疾病的起始阶段、效应阶段和调节阶段以及个体对药物治疗的反应中都起着关键作用。然而，由于个体之间，肠道微生物群组成的差异很大，迄今，国内外医学界未能建立起具有广泛代表性的“核心微生物群表型”。肠道上皮细胞为胃肠道构筑了一条防线，不仅可以隔绝肠腔及其内容物，还可以整合肠腔内的多种菌群信号，以维持胃肠道正常生理功能。据报道，有多种与多发性硬化相关的肠道细菌可以产生多巴胺受体激动剂，因此，作者设想，肠道上皮细胞多巴胺受体介导了菌群和宿主相互联系，并且这种联系在多发性硬化发病过程中发挥重要作用。　　为对上述设想予以验证，作者分别构建了在肠道上皮细胞分别特异性敲除多巴胺D2、D3、D4受体的小鼠，同时根据文献提供的肠道细菌产生大量的多巴胺受体激动剂苯乙胺这一线索，利用实验性自身免疫性脑脊髓炎作为多发性硬化动物模型，观察在上述基因缺失的情况下，小鼠行为学、病理学的变化，并作多组学分析，之后，使用小胶质细胞系和野生型小鼠对所发现的差异代谢物进行筛选，寻找和鉴定可以减轻动物模型发病严重程度的代谢物。同时收集多发性硬化患者和健康对照的粪便样品用于靶向代谢物检测，验证苯乙胺含量与多发性硬化发病之间的相关性及性别差异。　　首先，通过代谢组学检测，作者发现，多发性硬化患者粪便中苯乙胺含量显著高于健康对照，且存在性别差异。通过条件性基因敲除等实验方法，观察到只有肠道上皮细胞多巴胺受体D2，而不是D3和D4基因缺失，可显著缓解多发性硬化小鼠模型发病的严重程度。通过与野生型对照组转录组的对比，发现DRD2敲除的多发性硬化小鼠模型中，肠道溶菌酶等抗菌肽表达量显著减少 同时通过16s rRNA测序，发现在造模前和发病高峰期肠道菌群组成出现显著差异 通过同笼饲养和抗生素处理，发现DRD2在多发性硬化小鼠模型的作用是肠道菌群依赖的 通过非靶向代谢学检测和代谢精准分析术 MetDNA，鉴定了47种只在雌性小鼠脊髓中存在差异的代谢物。之后，利用小胶质细胞细胞系BV2细胞和野生型小鼠对这些差异代谢物进行筛选，确定了N-乙酰赖氨酸可以在整体动物和体外培养细胞水平显著抑制炎症反应，从而缓解自身免疫性脑脊髓炎的发病。　　为了进一步探究N-乙酰赖氨酸抑制炎症的分子机制，利用磁珠分选、流式细胞分选等方法，将脊髓中的小胶质细胞分离并进行转录组测序及单细胞测序。发现N-乙酰赖氨酸显著降低了多发性硬化相关小胶质细胞的比例，提高了增殖性小胶质细胞和稳态小胶质细胞的比例。表明N-乙酰赖氨酸有利于恢复多发性硬化小鼠模型失衡的中枢神经系统免疫稳态。　　传统观点认为，性激素等在中枢神经系统自身免疫性疾病发病过程中发挥重要作用。本研究显示，肠道的苯乙胺-多巴胺D2受体-溶菌酶信号轴是决定雌性动物或中青年女性群体对多发性硬化发病易感性的重要因素，这是对传统观点的新的延伸和拓展。作者还揭示了肠道—微生物群——脑的相互作用是如何调控中枢神经系统免疫稳态，这一调控方式突出了宿主肠道细胞本身对肠道菌群的核心作用，为发展基于肠道上皮细胞活动调控的脑疾病干预方法提供了新的分子和细胞基础。N-乙酰赖氨酸的抑炎作用的发现为研发适用于女性多发性硬化患者的神经炎症治疗方法提供了新的机会。　　该项工作由彭海蓉博士、邱佳倩、周勤明博士和博士研究生张彧锴在周嘉伟研究员、宋昕阳研究员、朱正江研究员和陈晟教授的指导下完成，课题组的其他成员积极参与，并得到了中国科学院上海营养与健康研究所肖意传、邱菊研究员的大力协助，因此，是众多课题组通力合作的结果。　　在雌性小鼠中，粪便中较高的苯乙胺浓度会引起肠道上皮细胞中的DRD2过度激活，促进溶菌酶和防御素表达量增加。这些过量的抗菌肽，对细菌的杀伤力增强，因此，乳酸杆菌等对溶菌酶敏感的菌种在雌性小鼠体内减少。而乳酸杆菌产生的N-乙酰赖氨酸对小胶质细胞介导的炎症具有很强的抑制作用，是缓解中枢神经系统自身免疫性疾病，如多发性硬化的物质基础之一。　　原文链接：https://doi.org/10.1016/j.immuni.2023.10.016

前言骆清铭院士和龚辉教授带领MOST团队发明的显微光学切片断层成像系列技术（MOST/fMOST）作为介观尺度最精准的三维完整器官成像技术，已在神经机制、脑疾病、心脑血管疾病以及药理毒理等科学前沿领域研究中发挥重要作用，并带动了相关标记技术和大数据处理和解析技术的发展。 文章题目：Single-neuron projectomes of mouse paraventricular hypothalamic nucleus oxytocin neurons reveal mutually exclusive projection patterns发表时间：2024年1月29日发表期刊： Neuron研究团队：北京大学生命科学学院黎胡明珠、华中科技大学苏州脑空间信息研究院江涛是论文的共同第一作者；北京大学于翔教授、华中科技大学李安安教授、西湖实验室边文杰研究员为论文的共同通讯作者 催产素是九个氨基酸组成的环状神经肽，由大脑中的神经细胞合成、分泌。其最早被报道的作用是促进分娩和泌乳，主要由垂体分泌至外周循环的催产素完成。进一步研究发现催产素还参与维持机体代谢平衡和内稳态，并调控社交行为、学习与记忆、奖赏等复杂行为。关于催产素的研究已经持续百年，但其多样功能的结构基础仍不清楚。一个关键问题是，催产素神经元如何将催产素分泌至各个脑区及外周组织，从而实现特定功能的调控。前人研究表明大脑中产生催产素的神经元主要分布在14个脑区中，其中下丘脑室旁核（paraventricular hypothalamic nucleus, PVH）拥有数量最多且投射最为复杂的催产素神经元。因此，对于室旁核催产素神经元投射的形态解析对理解其功能多样性至关重要。室旁核包含两类传统方法定义的催产素神经元类群：大细胞催产素神经元被认为拥有复杂的轴突结构并参与中枢和外周的调控，小细胞催产素神经元主要参与中枢自主神经调控（图1）。然而群体示踪的方法无法精细区分两类神经元的投射图谱，也无法揭示每一类群中是否存在进一步的功能与形态异质性。系统性重构单神经元形态为解答这一问题提供了可能。 2024年1月29日北京大学于翔团队与合作者在 Neuron 期刊发表了题为“Single-neuron projectomes of mouse paraventricular hypothalamic nucleus oxytocin neurons reveal mutually exclusive projection patterns”的研究论文，在单细胞水平揭示了下丘脑室旁核催产素神经元的完整形态。中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心与上海科技大学联合培养，目前就职于北京大学生科院的黎胡明珠博士为第一作者。 图1：（左）根据传统分类与群体示踪的大细胞催产素神经元（magnocellular）与小细胞催产素神经元（parvocellular）分类。（右）基于系统性重构单神经元形态提出的室旁核催产素神经元C1与C2分类 该研究首先构建了病毒载体rAAV-EF1α-DIO-YPet-p2A-mGFP，在Oxytocin-ires-Cre小鼠中实现了室旁核催产素神经元的稀疏高亮标记。通过荧光显微光学切片断层成像（fluorescence micro-optical sectioning tomography, fMOST）对稀疏标记样本进行全脑成像，用Fast Neurite Tracer进行形态追踪，重构了264个室旁核催产素神经元的完整三维形态，从而绘制了亚微米分辨率下的单神经元全脑投射图谱。进一步通过层级聚类和投射靶点相关性分析，揭示室旁核催产素神经元包含两类投射模式互斥的类群。其中，C1类包括177个神经元，轴突较短且终止于正中隆起（连接下丘脑与垂体的脑区），仅有少量分支分布于下丘脑区域，且对其他脑区几乎没有投射（图2，红色）；C2类包括87个神经元，其轴突广泛投射至除正中隆起之外的两百余个脑区，涵盖新皮质、嗅区、海马结构、皮质板下层、纹状体、苍白球、丘脑、下丘脑、中脑、脑干、脑桥、延髓、小脑和纤维束（图2，绿色）。每一类群又可进一步分为投射模式不同的三个亚类。此外，还发现室旁核催产素神经元，特别是C2类神经元的树突形态复杂并可延伸至室旁核以外，而C1类神经元的树突则较简单且分布在胞体附近，两类神经元胞体位置有一定偏好，并具有独特的转录特征与分子标志。 图2：小鼠下丘脑室旁核催产素神经元根据单神经元投射图谱可分为C1类（红色）和C2类（绿色）。 C1类和C2类神经元及其亚类在投射模式上的高度异质性，表明各亚类神经元可能分别执行了催产素的不同生理功能：（1）正中隆起—垂体后叶是催产素向外周分泌的重要途径，因此C1类神经元应主要负责通过神经内分泌调控外周生理活动，同时其在下丘脑的投射分支可能参与中枢自主神经调控；（2）C2类1亚型（C2-1）神经元投射至脑干多个区域，可能参与自主神经调控、介导躯体感觉以及伤痛感觉的调控；（3）C2-2 和 C2-3亚型神经元拥有复杂且精细轴突分支，全脑广泛投射，除了涵盖C2-1亚型神经元的功能之外，很可能介导社会识别、亲社会行为、学习与记忆、奖赏行为及厌恶行为等高级脑功能；（4）脑室周围存在C2类神经元轴突分布，提示其分泌的催产素可能是脑脊液中催产素的重要来源之一；（5）对催产素神经元树突的重构发现其分支延伸至室旁核周围核团中，可能具有整合信号输入及通过催产素的树突释放调控周围脑区的作用（图3）。 图3：(A, B) 室旁核催产素神经元各亚类的单神经元投射图谱。(C) C1类与C2类神经元具有截然不同的投射模式。(D) C2类神经元轴突投射至脑室附近区域。 综上，该研究对室旁核催产素神经元进行全方位的、单细胞精度的胞体、树突和轴突形态学分析，为进一步理解催产素神经元调控复杂生理功能提供了详实的结构基础。两类神经元分子标记物的鉴定，为后续特异性的分子、环路操作和功能探索奠定了基础。该项工作从单细胞水平，更新了人们长久以来对于室旁核催产素神经元形态结构的认知，并将为后续研究提供重要的参考。 该研究工作是多团队联合攻关的成果。中科院脑科学与智能技术卓越创新中心和上海科技大学博士毕业生，现北京大学生命科学学院研究助理黎胡明珠是该论文的第一作者。华中科技大学苏州脑空间信息研究院江涛是论文的共同第一作者。北京大学于翔教授、华中科技大学李安安教授、西湖实验室边文杰研究员为论文的共同通讯作者。华中科技大学骆清铭、龚辉与李安安团队，中科院遗传与发育研究所吴青峰课题组，中科院脑科学与智能技术卓越创新中心严军与许晓鸿课题组及全脑介观神经联接图谱平台中心对该研究做出了重要贡献。 原文链接：https://www.cell.com/neuron/fulltext/S0896-6273(23)01010-3

确认化学武器袭击很复杂自2011年叙利亚内战爆发以来，叙利亚使用化学武器一直是一个主要问题。2013年，有关于叙利亚古塔地区使用沙林毒气的广泛报道，随后得到了联合国的证实。很难证明化学武器的使用，因为必须首先从怀疑发生袭击的地方收集样本。这些样本可能来自空气、土壤或水中，甚至来自受害者的尸体，但在战区很难获得。样品可以使用离子迁移率光谱法等技术进行现场分析，也可以在实验室进行分析，通常使用GC-MS或LC-MS。国防大学（捷克共和国）核、生物和化学防御研究所的Tomas Rozsypal观察到，橡胶手套往往是化学袭击医疗响应人员佩戴的唯一一种个人防护装备，通常在现场处理。这种手套对化学制剂没有太大的保护作用，但它们可能是使用化学武器的证据来源。因此，Rozsyal开发了一种检测一次性橡胶手套上G型神经毒剂的GC-FID方法，可供军事法医团队在移动和传统实验室使用，并调查了攻击后能检测到神经毒剂的时间。安全第一本研究采用气相色谱-火焰离子化检测器对一次性丁腈、乳胶和乙烯基手套上的代表性神经毒剂沙林、梭曼和环沙林进行了检测。在使用这些危险的神经毒剂时，必须严格遵守安全规程，包括使用合适的通风柜、穿戴合适的个人防护装备、严格的去污程序和适当的废物处理。Rozsypal试验使用军事实验室常见的六种溶剂（己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、乙腈和甲醇）从手套中提取掺入的神经毒剂，并比较了握手10分钟、涡旋0.5～5分钟和超声5或10分钟，最终选择涡旋1分钟。比较色谱背景，用己烷或乙腈提取得到最干净的痕量，几乎没有干扰峰。离心后，使用Thermo Trace 1310和TG-5MS柱（30 米 × 0.32 毫米 × 0.50 μm，也来自Thermo）和氦气（1.5 mL min-1）作为载气。在80°C下开始运行2分钟，在20°C min-1下升至130°C，然后在5°C min-2下升至150°C，最后在20°C.min-1下降至280°C，并保持2分钟。使用1µL的注射体积，注射口设置为250°C。FID检测器设置为280°，使用氮气（30 mL min-1）作为补充气体，空气和氢气分别设置为350 mL min-1和40 mL min-1。对手套上神经毒剂的稳定性进行了评估，以了解攻击后手套可以作为证据使用多长时间。寿命受到分析物的挥发性和与手套材料的结合的影响，乳胶手套的寿命最短。当然，这可能因不同制造商或材料的手套而异。从化学攻击现场收集样本既困难又危险，因此对类似于现场使用的样本处理程序进行了评估，对结果没有太大影响。使用开发的方法，可以在一次性橡胶手套上检测到化学武器的痕迹，这表明如果在化学武器袭击现场发现的手套在袭击后不久被收集起来，就可以作为证据。分析人员应注意，一些溶剂会破坏橡胶手套样品，因此在选择提取溶剂时需要小心。相关链接Rozsypal T. Contaminated disposable rubber gloves as evidence samples after a chemical attack with nerve agents. Drug Test Anal. 2023. https://doi.org/10.1002/dta.3468De Vooght-Johnson R. Detecting biomarkers of chemical weapons in hair with μLC-MS/MS. Wiley Analytical Science. 8 March 2023 (https://analyticalscience.wiley.com/do/10.1002/was.0090284 accessed 31 March 2023).UN investigation of chemical weapons use in Ghouta, Wikipedia (https://en.wikipedia.org/wiki/UN investigation of chemical weapons use in Ghouta accessed 31 March 2023).作者简介•Ryan De Vooght JohnsonRyan是一名自由科学作家和编辑。在获得仪器和分析方法硕士学位后，他在制药行业担任过各种分析开发职务，之后担任编辑职务。作为委托编辑，他创办了两本与分析化学和药物相关的期刊，《生物分析》和《治疗药物》，并管理了许多其他期刊。他现在是一名自由科学作家和编辑，以便有更多的时间与家人、自行车和分配物在一起。来源：GC-FID can detect chemical weapons on disposable rubber gloves——Sensitive, rapid detection of G-type nerve agentsSeparationGCDetectors，2023/3/30供稿：符 斌，北京中实国金国际实验室能力验证研究有限公司

卫生部近日表示，正在协调有关部门研究撤销过氧化苯甲酰作为面粉处理剂及其相关配套措施，引发社会广泛关注。然而面粉增白剂只是公众对于食品添加剂安全问题担忧的冰山一角———食品添加剂滥用、超标，食物中使用非法添加物，有关食品安全的消息再次牵动着消费者的神经。 　　“我国在食品添加剂问题上，存在盲目的拿来主义思想，缺乏自主客观的判断。”食品安全专家李里特教授说，“我们通常都是照搬外国的标准，不管人家是否一直允许用、允许用多少，我们就直接拿来，自己没有判断和评价。” 　　“反式脂肪酸在我国的大量使用，也是非常盲目的。”李里特介绍说，反式脂肪酸即氢化油，是一种代替猪油的混合油，用于西式面包的加工。当时，这项发明被视为一种进步。后来科学家研究发现反式脂肪酸对人体危害比它带来的好处要大，所以西方马上就禁止了，很多生产厂家便把这些产品移到中国。“反式脂肪酸的危害在学者当中已经形成共识，经营企业的人也知道，”李里特建议，媒体应该加大对反式脂肪酸危害的宣传力度，呼吁有关部门制定法律法规禁止反式脂肪酸的使用。

用于肠道内环境研究，基于“LCMS-9030”超高效液相色谱质谱联用仪，检测10分钟内完成 日前，日本岛津制作所启动了DL-氨基酸※1委托分析服务—“DL-氨基酸筛查”。该服务的基础是大阪大学研究生院工学研究科福崎研究室开发的DL-氨基酸快速分析法。测定仪器使用岛津制作所首款超高效液相色谱四极杆-飞行时间质谱联用仪“LCMS-9030”，通过提高处理能力，实现了低价格。测定作业由岛津集团负责委托分析的岛津TECHNO-RESEARCH实施。去年12月，协同乳业与岛津制作所、大阪大学、大阪大学?岛津分析创新联合研究讲座等机构在英国科学期刊《Scientific reports》上报告了由肠道菌群产生的12种游离型D-氨基酸※2。首次确认到其中的9种以游离态存在于肠腔内。岛津将根据这一成果，向食品制造商和研究机构提供“DL-氨基酸筛查”服务。由于传统的DL-氨基酸分析法需要衍生化，用于筛查的话，存在“测定时间长”、“价格高”等课题。基于“LCMS-9030”的委托分析服务“DL-氨基酸筛查”，可以1小时6个检体的高处理能力同时分析DL-氨基酸的40种成分。D-氨基酸是来源于肠道菌群的生理活性物质※3，备受期待。岛津制作所将通过本委托分析服务，为“尚有很多未弄清部分的D-氨基酸机能研究”及“更具附加值的机能性食品开发”做贡献。※1氨基酸是一种分子内含氨基和羧基两种官能团的化合物。除甘氨酸外，其他的氨基酸存在像左右手一样方向相反但结构相同的基团，分别称为“L型”和“D型”。以前，认为生物体内只有L型氨基酸，但近年来，存在极微量的D型，作用于生物体肾脏和神经系统、老化现象等的可能性越来越明显。※2 Free D-amino acids produced by commensal bacteria in the colonic lumen Scientific Reports 8, Article number: 17915 (2018)※3 维生素和矿物质、核酸、酶等调节身体功能的各种物质。

2022年6月20日，清华大学时松海课题组在 Nature Neuroscience 期刊在线发表了题为：Metabolic lactate production coordinates vasculature development and progenitor behavior in the developing mouse neocortex（乳酸代谢调控小鼠大脑新皮层血管生长和神经前体细胞行为）的研究论文。该研究揭示了大脑新皮层发育过程中的早期增殖型放射状胶质前体细胞（Radial glia progenitor，RGP）具有更强的糖酵解代谢能力并大量合成和分泌乳酸，进而调节血管生长及其自身增殖分裂特性。大脑新皮层是神经系统的最高级中枢，理解大脑新皮层的发育组装及工作机制是脑科学乃至整个自然科学的终极目标之一。研究大脑新皮层的发育及其调控机制有助于更好地理解其细胞组成和结构特性，进而推动生理功能和运行工作机制的认知，同时对相关疾病的诊断治疗有着至关重要的意义。大脑新皮层是进化的末期产物，其发育是一个高度复杂且受到多种因素的共同调节的生物学过程，这也为系统性研究其内在机制带来了诸多挑战。为此该研究从细胞最为基本特征—细胞代谢的角度出发，揭示了细胞代谢方式及相关产物在调控大脑新皮层发育过程中的关键作用和机制，为更好的理解大脑皮层发育机制提供了重要的理论补充。放射状胶质前体细胞（RGP）是大脑发育最为关键的一种神经前体细胞，其分裂产生大脑皮层几乎所有的神经元和胶质细胞。在小鼠发育早期（E10.5-E11.5），大脑新皮层中几乎没有血管生长，此时 RGP 以对称分裂进行增殖。伴随着血管的生长，RGP 也随之改变其分裂方式，以不对称分裂进行神经细胞产生。基于单细胞代谢状态分析，该研究首先发现大脑新皮层发育过程中，随着 RGP 谱系发生过程的进行，RGP 及其子代细胞具有不同的代谢状态，并呈现出不同的代谢特征。在此基础上，结合基因表达分析、细胞代谢类型分析以及碳代谢流分析多方面研究，进一步发现进行对称分裂的增殖型 RGP 具有更强的糖酵解代谢能力，并大量合成和分泌乳酸，而进行不对称分裂的分化型 RGP 具有更强的氧化磷酸化代谢能力，并积累高浓度的乙酰辅酶A。图1: 单细胞代谢状态分析揭示神经细胞代谢特征为深入探讨细胞代谢方式与大脑新皮层发育的相互关系，研究团队考察了具有强糖酵解代谢能力的增殖型 RGP 对早期大脑新皮层发育的影响，发现当抑制增殖型 RGP 的乳酸合成或分泌，导致大脑新皮层中乳酸浓度降低，血管生长出现缺陷。进一步分析发现，乳酸可以通过调节趋化因子配体 CXCL1 的表达来调节血管内皮细胞的迁移和增殖。此外，研究团队发现抑制增殖型 RGP 的乳酸合成代谢会系统性改变其基因表达谱并重塑细胞代谢方式，导致 RGP 过早分化。为探讨这一内在机制，研究者发现与分化型 RGP 相比，增殖型 RGP 呈现出更长的线粒体形态，抑制或阻断乳酸合成或分泌都会导致线粒体长度大幅度缩短，进而导致 RGP 分化。该结果表明增殖型 RGP 通过加强乳酸合成来影响线粒体形态，进而保持其对称分裂增殖特性。图2: 乳酸合成代谢调控早期大脑新皮层发育清华大学生命科学学院时松海教授为本文通讯作者，清华大学生命科学学院2017级博士董晓翔为本文第一作者。清华大学生命科学学院张强强博士和马健博士、清华大学生命科学学院博士研究生于翔宇和王玎，以及美国达特茅斯学院本科生马嘉明为本文共同作者。该研究得到了清华大学实验动物中心和生物医学测试中心的大力协助和支持。该研究获得了国家自然科学基金委创新群体基金、国家科技部脑科学与类脑研究基金、北京市教育委员会卓越青年科学家计划、北京市科技委员会科技计划、北京生物结构前沿研究中心、生命科学联合中心和北京脑科学与类脑研究中心的资助。

氨基酸分析在欧美临床应用非常普遍，越来越多的学者认识到氨基酸的定量分析与临床的多种疾病如遗传性代谢缺陷病、恶性肿瘤、急慢性肝病、肾病以及中枢神经系统疾病的诊断、治疗以及疗效观察有着密不可分的关系，同时氨基酸水平的监测还可为术后或衰竭病人的支持治疗和烧伤病人的康复提供依据。 近年来，氨基酸分析技术有了很大的改进，一次可测血浆，脑脊液，尿液中的氨基酸含量种类高达40种，并且具有极高的重复性。Biochrom 专用氨基酸分析系统在欧美主要医院安装超过200台，主要用户如英国的 Guy’s hospital, London 和美国的 Philadelphia Children hospital 等。 通用电气中国医疗集团将邀请 Biochrom Hoefer 公司技术专家 Anthony Le 讲述有关氨基酸分析在欧美的临床应用。 会议详情请点击：http://www.instrument.com.cn/show/news/003209.shtml

黄金抗腐蚀性强，极为稳定，是首饰业、电子业、现代通讯、航天航空业等部门的重要材料，因为稀有而逐渐成为了珍稀品，甚至成为了一个国家的财富象征。“点石成金”的神奇药水丁基黄原酸盐“点石成金”的故事众所周知，仙道点铁石而成黄金，化腐朽为神奇。跟传说的手指一点而成金不同的是，21世纪的今天，“点石成金”靠神奇药水---丁基黄原酸盐。丁基黄原酸盐为黄色粉末固状，俗称“丁基黄药”，是一种重要的金属硫化矿捕集药剂，被广泛应用于各种重金属硫化矿（如PbS、ZnS、CuS等）和部分贵金属硫化矿（如Au2S3、Ag2S等）的浮选捕收。Tips：浮选捕收剂的目的是通过在被浮矿物表面选择性吸附形成疏水层，从而使疏水性矿粒附着气泡上浮至泡沫产品中，成为精矿，实现了真正的“千淘万漉不辛苦，吹尽狂沙始到金”。浮选捕收剂的结构示意图浮选捕收剂与矿物作用的原理图“危害健康”的有毒药水丁基黄原酸盐丁基黄原酸盐也是会对身体造成伤害的有毒药水，金矿在提炼过程会产生大量的毒副产品，如部分丁基黄原酸盐随废水排入地表水，污染饮用水源和土壤。此外，金矿提炼过程中还伴随着如铅、汞、镉等重金属污染，严重者会导致该地三十年内寸草不生！Tips：丁基黄原酸盐对人体和畜禽的危害主要表现在伤及神经系统和肝脏器官，对造血系统也有不良影响。谱育科技全新工业污染物监测方案根据《水质 丁基黄原酸的测定 吹扫捕集/气相色谱-质谱法》（HJ 896-2017）中的描述：水样中需加入硫代硫酸钠、氢氧化钠、氟苯及磷酸对丁基黄原酸进行衍生（衍生方程式如下），通过测定二硫化碳，间接测定水中丁基黄原酸的浓度。C4H9OCSSK(Na) + HCl→CS2↑+ C4H9OH + K(Na)Cl谱育科技EXPEC 2100 水中挥发性有机物在线监测系统可以实现对丁基黄原酸的在线监测。吹扫捕集-气相色谱-质谱法测定水中的丁基黄原酸我国在《集中式生活饮用水地表水源地特定项目标准限值》（GB 3838-2002）中对生活饮用水中丁基黄原酸的含量进行了严格限定。谱育科技可为您提供吹扫捕集-气相色谱-质谱法 对水中的丁基黄原酸进行分析，该方法具有灵敏度高、重复性好、无人化操作等优点。方案特点★ 丁基黄原酸在0.2-4μg/L线性相关系数R2＞0.999，连续6针进样的重复性RSD为8.24%；★ 丁基黄原酸的检出限为0.03μg/L，达到实验室检测水平；★ EXPEC 2100产品提供高精度压力控制，保证卓越的保留时间稳定性和峰面积稳定性；★ 搭配EXPEC 2100可实现无人化操作，可以实现对水中挥发性有机物的在线监测。EXPEC 2100水中挥发性有机物在线监测系统可实现对丁基黄原酸的全自动在线监测，助力实现“既要金山银山，也要绿水青山”这一美好愿望。

专 业：神经与精神病学 会议类型：学术大会 会议日期： 2013-09-21 会议地点：奥地利--维也纳 主办单位：N/A 推荐等级： 会议费用： 元 会议介绍 首席医学会议频道（conference.shouxi.net）2012年10月22日报道，世界神经学联盟是一个由全球100多个国家和地区的神经专家组成的国际组织。世界神经学联盟是通过对整个神经系统疾病患者的治疗与预防以提高全球人类健康为宗旨的协会。预计本次会议将有5000多代表参加。 会议详情 　　I am honoured to invite you personally to the twenty-first World Congress of Neurology, which will take place in September 2013 in Vienna and which I am sure will leave a lasting impression on us all. 　　The congress theme is &ldquo Neurology in the age of globalization&rdquo . We will discuss the major breakthroughs and developments in the field of neurology &ndash from clinical practice to research and technology. In addition to a top-rate scientific program, there will be many opportunities for hands-on learning and networking as well as exciting social events. 　　As the chairman of the Austrian Society of Neurology, I am happy that the EFNS - The European Federation of Neurological Societies and the World Federation of Neurology (WFN) - are our partners in this important event. 　　I look forward to welcoming you to Vienna, a majestic capital, filled with beautiful architecture and cultural attractions. 　　The Austrian capital city can be considered an ideal location for an international medical congress of this dimension. Vienna is a city rich in culture and boasts an impressive history in the medical sciences with all the modern amenities. Vienna is located in the heart of Europe and is easy to reach by plane, train, car or boat. The city offers excellent conference infrastructure and the highly professional services required for the organization of the World Congress of Neurology. Vienna has successfully hosted large congresses in the past, with up to 30,000 delegates. 　　Vienna and its environments offer an exceptional range of accommodation &ndash from luxury 5 star to moderately priced and inexpensive hotels. Vienna has always been a magnet for the &ldquo new&rdquo EU countries and its long established traditional medical contacts extend beyond Europe into all parts of the world. Hence, the congress will be held in close collaboration with our neighboring countries. 　　The Austrian capital is famous for its hospitality and culture. We are confident that the social events and leisure activities will contribute to the success of the congress. 　　本次会议的目标是：为参会者提供一次高质量、原创科学研究及临床实践的平台 促进临床、实践、科学信息及想法交流的平台 为所有对神经科学感兴趣的医生学者提供一次学习的机会 为参会者提供与同行建立网络联系的机会 通过不断努力来扩大及加强世界神经学联盟的影响力 令参会者跟上最新工业设备研究与发展的节奏。 　　会议的题目有：癫痫/运动障碍 中风/感染 肌肉骨骼/肌肉 头痛/神经眼科。 　　论文提交的栏目有：痴呆 自主神经疾患 行为神经学 脑血管病(中风与神经超声) 儿科神经学/发育神经学 临床神经生理学 重症护理/急诊/外伤 癫痫 伦理学、疼痛学与姑息医学护理 普通神经学/神经系统病 头痛与疼痛 神经学历史 成像 感染 运动障碍 MS与相关疾病 肌肉病/神经肌肉接点 神经康复 神经肿瘤 神经眼科/视觉神经 神经流行病学/健康服务 神经基因学与基因治疗 神经代谢异常/神经毒性 神经学的教学与科研 神经免疫 失眠问题。

l-氨基酸是体内存在大量的蛋白质和营养成分，而 d-氨基酸含量极低，但它对于发酵食品成分分析、生理功能分析、颅神经系统分析和生物标志物检索等各个领域中起着至关重要的作用，甚至关乎人类的健康和美丽。氨基酸（除了甘氨酸）都有一个手性碳原子相邻的羧基（co2-）。氨基酸手性中心的立体异构会形成一对以彼此为镜像的立体异构。结构彼此十分相似，就好像的左手、右手。这些镜像被称为对映异构体。然而，d/l 两种氨基酸成分分析经常受到各种各样的肽或氨基化合物的背景干扰，分析难度很大。因此急需建立高度敏感和高度、高选择性的液质联用仪分析方法。在此方法包发售之前，研究者大多使用传统的 hplc 分析方法需要进行氨基酸的衍生化处理，分析时间长（通常分析时间超过 10 小时）。 本方法包优势是采用手性色谱柱实现在 10 分钟之内完成高灵敏度的氨基酸分析，同时lcms-8045/8050/8060 的高灵敏度分析能力可减少无氨基酸衍生化的实验流程。本方法包可用于发酵食品成分分析、d-氨基酸生化领域分析。本方法包需配合岛津 lcms-8045/8050/8060 三重四极液质联用仪使用。产品特点? 可实现批处理分析，10 分钟内单次分析 21 种 dl 氨基酸。分析过程无需衍生化，使用质联用仪和 crownpak cr-i 系列手性色谱柱高灵敏度的分析手性氨基酸成分。? 采用 crownpak cr-i（+）或（-）色谱柱可分离 d/l 型氨基酸。crownpak cr-i（+）色谱柱时 d 型氨基酸流出速度要高于 l 型氨基酸；crownpak cr-i（-）色谱柱的流出顺序与 crownpak cr-i（+）相反。谷氨酸和赖氨酸，苏氨酸，异亮氨酸和异体异亮氨酸有非常相似的理化性质。因此，几乎相同的 mrm 离子对使得在三重四极型质谱仪难以筛分共流出的氨基酸组分，需要通过 cr - i (+),和 cr - i (-) 两组数据结果进行综合的数据分析。

新型芯片复制神经肌肉接头有助于为神经肌病测试药物麻省理工学院（MIT）工程师们开发出一种复制神经肌肉接头（神经和肌肉之间至关重要的连接）的微流控设备（microfluidic device）。该设备约有25美分硬币大小，包含单个肌条和一小组运动神经元。研究人员能够在逼真（现实）的三维基质中影响和观察两者之间的相互作用。研究人员对该设备中的神经元进行基因改造，使其对光照做出反应。通过将光照之间投射到（这些）神经元上，他们能够精确刺激这些细胞，发送信号激发肌肉纤维。研究人员还测量了设备内肌肉在被激发后抽搐或收缩的力量。该研究结果2016年8月3日在线发表于《Science Advances》期刊，可能帮助科学家们理解并识别药物以治疗肌萎缩侧索硬化（ALS，即卢伽雷氏症）和其他神经肌肉相关疾病。“神经肌肉接头涉及许多失能性疾病，其中有些是残酷而致命的，还有很多尚未被发现”领导该研究的MIT机械工程系研究生Sebastien Uzel说，“我们希望能够在体外形成神经肌肉接头，从而帮助我们理解某些疾病活动”。Sebastien Uzel现在是哈佛大学Wyss研究所博士后。自1970年代以来，科学家们已经提出了大量方法在实验室中模拟神经肌肉接头。大部分这些实验涉及在培养皿或小玻璃基板上生长肌肉和神经细胞。但这样的环境与（动物）体内状态相去甚远，在动物体内，肌肉和神经细胞存活于复杂的三维环境中，并且通常距离较远。“想想长颈鹿”Uzel说，“脊髓神经元所发出的轴突需要跨越非常大的距离才能与腿部肌肉连接。”为了在体外重建更逼真的神经肌肉接头，Uzel和同事们构造了一种微流控设备，该设备具有两个重要特性：1. 三维环境；2. 隔离肌肉和神经的隔间，从而模拟两者在人体内的自然分离状态。研究人员将肌肉和神经元细胞悬浮于隔间中，然后充满凝胶以模拟三维环境。为了生长肌肉纤维，研究团队使用了获得自小鼠的肌肉前体细胞，随后将其分化成肌肉细胞。他们将细胞注入微流控隔间，细胞会在隔间内生长并融合形成单个肌条。同样的，他们从干细胞分化出运动神经元，然后将所获得的神经细胞聚合体放置在第二个隔间中。在分化两种细胞之前，研究人员使用光遗传学（optogenetics）技术对神经细胞进行了基因改造。该研究共同作者、MIT机械和生物工程Cecil and Ida Green特聘教授Roger Kamm说：光“能够让你精确控制你想要激活的细胞”。在这样的狭小空间里，电极无法实现这一点。最后，研究人员为该设备添加了另一个特性：力传感。为了测量肌肉收缩，他们在肌肉细胞隔间内构造了两个微小的弹性支柱，位于肌肉纤维周围并能够被生长的肌肉纤维所包裹。随着肌肉收缩，支柱会被挤压在一起，形成位移，研究人员能够测量这些位移并转换为机械力。在测试该设备的实验中，Uzel和同事们首次观察到神经元在三维区域内向肌肉纤维伸展轴突。在观察到轴突建立连接时，他们用微小的蓝光激射刺激神经元，并立即观察到肌肉收缩。“发射闪光，就能观察到抽搐”Kamm说道。根据这些实验，Kamm说，这种微流控设备可能作为神经肌病药物测试卓有成效的试验场，甚至可以根据个体患者进行定制。“你可能从ALS患者获得多能细胞，将它们分化成肌肉和神经细胞，并且为特定患者制造整个系统”Kamm说，“然后你能够根据需要多次复制，同时测试不同的药物或疗法的组合，查看哪种疗法能够最有效地改善神经和肌肉之间的连接。”另一方面，他说，该设备在“建模操作协议（modeling exercise protocols）”中可能是有用的。例如，通过以不同的频率刺激肌肉纤维，科学家们能够研究重复压力如何影响肌肉的性能。“现在，随着所有这些新型微流控方法的开发，你能够开始建立神经元和肌肉的更复杂的模型”Kamm说，“神经肌肉接头是另一个现在可以被纳入测试模式的单位”。

3月16日，厦门大学医学院神经科学研究所张杰教授、冷历歌副教授团队在PLOS Biology发表题为“Hypothalamic Menin regulates systemic aging and cognitive decline”的研究论文。该研究表明，下丘脑中一种叫Menin的蛋白质的下降可能是衰老的一个关键驱动因素，而通过食物简单地补充一种氨基酸就可能逆转衰老带来的一些生理变化。 Menin是一种重要的蛋白质，它由Men1基因编码，在人类体内广泛表达。Menin的功能十分复杂，已有的一些研究表明，Menin可以与DNA结合，并与许多转录因子相互作用，调节基因表达。此外，Menin还可以参与蛋白质泛素化、修饰、细胞周期等多种生物学过程。在肿瘤发生中，Menin被认为是一个关键的肿瘤抑制因子，可以调控多种肿瘤相关基因的表达。 下丘脑被认为是生理衰老的一个重要调节器，通过随着时间的推移增加神经炎症信号的过程来发挥作用，而炎症会促进大脑和外围的多种与年龄有关的过程。 在最新的这项研究中，张杰、冷历歌团队表明，Menin，是下丘脑神经炎症的一个关键抑制剂，这引发了他们对Menin在衰老中的作用的探究。 在下丘脑中，他们观察到Menin的水平随着年龄的增长而下降，星形胶质细胞或小胶质细胞则不会。为了探究Menin水平下降带来的后果，研究人员开发了可以阻断 Menin 活性的条件性基因敲除小鼠。结果发现，在年轻小鼠身上，Menin的减少导致下丘脑神经炎症增加、出现包括骨密度降低、皮肤厚度降低、认知下降等衰老相关表型，寿命一定程度缩短。 Menin减少带来的另一个变化是氨基酸D-丝氨酸的降低。D-丝氨酸是一种神经递质，对神经元突触可塑性和学习记忆等认知功能至关重要。D-丝氨酸广泛存在于大豆、鸡蛋、鱼和坚果等食物中。研究人员指出，Menin水平的降低调节了一种与D-丝氨酸合成相关酶的活性，因而影响了D-丝氨酸的水平。 Menin水平的降低推动了衰老进程 那么，阻止与年龄相关的Menin丢失，是否可以可以逆转生理衰老的症状呢？ 为此，研究人员将Men1基因植入老年（20个月大的）小鼠的下丘脑来进行验证。结果表明，30天后，小鼠的皮肤厚度和骨量有所改善，学习、认知和平衡能力也有所提升，这与海马体中D-丝氨酸的增加有关，海马体是非常重要的一个大脑中枢区域，参与学习和记忆等过程。 更为惊奇的是，通过三周的D-丝氨酸膳食补充，可以在认知方面获得类似的好处，但对于外周衰老的症状并无显著改善。 冷历歌在一份新闻稿中表示：“我们推测，下丘脑Menin表达的下降可能是衰老的一个驱动因素。Menin可能作为关键蛋白连接着衰老的遗传、炎症和代谢等因素。用D-丝氨酸治疗于认知衰退富有极大的前景。” 不过，研究人员还指出，关于Menin在衰老中的作用还有很多需要了解的地方，包括导致其下降的上游机制。需要进一步的研究来评估利用这个新发现的通路的潜力，以及减缓表型衰老的程度和持续的时间。还有待确定的是，补充D-丝氨酸是否会引起其他不可预料的变化。 文章链接：https://journals.plos.org/plosbiology/issue

p 　　近日，在北京举办的“国家神经系统疾病临床医学研究中心建设推进与战略研讨会”上，兰州大学第二医院神经内科成为全国首批29家“国家神经免疫与感染疾病研究分中心”之一，成为甘肃省唯一一家分中心单位。 /p p 　　兰大二院神经内科成为全国首批“国家神经免疫与感染疾病研究分中心”，标志着兰大二院神经免疫感染性疾病的诊治及科研与国内高水平和国际水平接轨。中心将致力于建设并完善我国神经免疫与感染疾病医疗与临床科研体系，在全国范围内整合神经免疫专科力量，通过高层次对话与合作搭建专家与政府、医院之间以及医患之间的沟通桥梁，为甘肃省神经内科事业的发展做出新的贡献。 /p

近日，中国科学技术大学化学与材料科学学院黄光明教授与生命科学学院熊伟教授开展紧密合作，基于自行开发的单细胞电生理与质谱联合检测平台，对小鼠大脑中单个神经元开展了多种化学成分的快速质谱检测，并且可以做到同步采集电生理信号，在单细胞层次上成功完成了对神经元功能、代谢物组成及其代谢通路的研究。相关研究成果以“Single-Neuron Identification Of Chemical Constituents,Physiological Changes, And Metabolism Using Mass Spectrometry”为题，于2月21日在线发表在国际权威综合学术期刊《美国科学院院报》(Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, PNAS)上。　　脑内神经细胞在细胞形态、突触连结、细胞结构、电生理以及生理功能上具有高度的多样性。不同种类的神经细胞中，其化学分子组成、含量、代谢也都有着很大的差别。因此，对脑内单个神经元的化学成分进行分析，具有重要的生物学价值。质谱分析因为具有高灵敏度、大的线性范围以及高通量分析化学分子的特点，逐渐被用于单细胞的细胞代谢分析。但目前的方法需要使用大量有机试剂对细胞进行处理，无法保持采样时细胞的活性 冗长的处理和分离过程也导致较慢的分析速度，无法短时间内完成大量单细胞分析，并缺乏来自同一细胞的电生理信号，最终导致单细胞代谢物的质谱分析无法大规模用于神经细胞的分析。近年来，中国科大黄光明教授实验室与熊伟教授实验室紧密合作，开发了能用于复杂样品的原位质谱分析方法，大大提高了分析速度，并于近期实现了针对细胞内蛋白质的直接分析(Angew. Chem. Int. Ed. 2011, 50:2503 Angew. Chem. Int. Ed. 2011, 50:9907 Anal. Chem. 2016,88:10860)，同时通过电生理膜片钳技术开展了对小鼠脑内单个神经元的功能鉴定与解析(Nat. Chem. Biol., 2011 J. Exp. Med., 2012 Nat. Neurosci., 2014)。这些研究为实现单个神经细胞的高通量质谱分析、代谢物鉴定和代谢通路研究提供了重要的工作基础。膜片钳与单细胞质谱分析联用技术分析单个神经细胞示意图　　该工作实现了单个神经元化学成分及代谢物的即时分析，该技术将目前神经细胞成分分析的研究推向了一个活细胞及单细胞水平，有望在单细胞层次上去研究神经生物学、代谢组学、毒理学等生命科学的重大问题，具有非常重要的应用前景。　　中国科大生命学院与化学院联合培养博士后朱洪影、生命学院博士研究生邹桂昌、王宁为该文章的共同第一作者，黄光明教授和熊伟教授为共同通讯作者。该研究工作得到了科技部、国家自然科学基金委、中科院先导专项以及国家青年千人计划等资助，以及中国科大国家同步辐射实验室光电离质谱线站的仪器与技术支持。

岛津公司即日起推出 LC/MS/MS DL-氨基酸分析方法包。 L-氨基酸是体内存在大量的蛋白质和营养成分，而 D-氨基酸含量极低，但它对于发酵食品成分分析、生理功能分析、颅神经系统分析和生物标志物检索等各个领域中起着至关重要的作用，甚至关乎人类的健康和美丽。氨基酸（除了甘氨酸）都有一个手性碳原子相邻的羧基（CO2-）。氨基酸手性中心的立体异构会形成一对以彼此为镜像的立体异构。结构彼此十分相似，就好像的左手、右手。这些镜像被称为对映异构体。然而，D/L 两种氨基酸成分分析经常受到各种各样的肽或氨基化合物的背景干扰，分析难度很大。因此急需建立高度敏感和高度、高选择性的液质联用仪分析方法。在此方法包发售之前，研究者大多使用传统的 HPLC 分析方法需要进行氨基酸的衍生化处理，分析时间长（通常分析时间超过 10 小时）。 本方法包优势是采用手性色谱柱实现在 10 分钟之内完成高灵敏度的氨基酸分析，同时LCMS-8045/8050/8060 的高灵敏度分析能力可减少无氨基酸衍生化的实验流程。本方法包可用于发酵食品成分分析、D-氨基酸生化领域分析。本方法包需配合岛津 LCMS-8045/8050/8060 三重四极液质联用仪使用。产品特点1.可实现批处理分析，10 分钟内单次分析 21 种 DL 氨基酸。分析过程无需衍生化，使用质联用仪和 CROWNPAK CR-I 系列手性色谱柱高灵敏度的分析手性氨基酸成分。2.采用 CROWNPAK CR-I（+）或（-）色谱柱可分离 D/L 型氨基酸。CROWNPAK CR-I（+）色谱柱时 D 型氨基酸流出速度要高于 L 型氨基酸；CROWNPAK CR-I（-）色谱柱的流出顺序与 CROWNPAK CR-I（+）相反。谷氨酸和赖氨酸，苏氨酸，异亮氨酸和异体异亮氨酸有非常相似的理化性质。因此，几乎相同的 MRM 离子对使得在三重四极型质谱仪难以筛分共流出的氨基酸组分，需要通过 CR - I (+),和 CR - I (-) 两组数据结果进行综合的数据分析。关于岛津 岛津企业管理（中国）有限公司是（株）岛津制作所于1999年100%出资，在中国设立的现地法人公司，在中国全境拥有13个分公司，事业规模不断扩大。其下设有北京、上海、广州、沈阳、成都分析中心，并拥有覆盖全国30个省的销售代理商网络以及60多个技术服务站，已构筑起为广大用户提供良好服务的完整体系。本公司以“为了人类和地球的健康”为经营理念，始终致力于为用户提供更加先进的产品和更加满意的服务，为中国社会的进步贡献力量。