溶壁酶

维权声明：本文为gl19860312原创作品，本作者与仪器信息网是该作品合法使用者，该作品暂不对外授权转载。其他任何网站、组织、单位或个人等将该作品在本站以外的任何媒体任何形式出现均属侵权违法行为，我们将追究法律责任。 本实验室主要工作就是:微生物发酵与代谢调控 、蛋白的分离纯化 、生物材料的研发与生产（ 化妆品 、面膜、人工血管 、人工骨................)http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2010/12/201012061858_264950_2019107_3.jpg啤酒酵母细胞自溶技术破壁研究摘要：研究了PH、温度、食盐浓度三个因素对啤酒酵母细胞破壁的影响，确定出最佳的自溶法破壁条件 。进而为分离啤酒废酵母中的有效活性成分奠定了基础。关键词：啤酒酵母；破壁；自溶The Research of Autolysis on the Beer Yeast Cells wallAbstract：This paper researched the condition of autolysis on the waste yeast cells wall with three factors (pH 、Temperature 、Salt density) and determined the best condition based on autolysis. And build basis for separating the activity forms from beer waste yeasts.Key words: The beer yeast; Breaking Cells wall; Autolysis引言啤酒酵母（S.csrsviside）属于真菌门酵母属，多数为单细胞微生物，细胞呈圆形或卵圆形，革兰氏染色呈阳性G+。啤酒酵母细胞是由细胞壁、细胞膜、液泡、颗粒和线粒体等部分组成，细胞年幼的时候细胞壁很薄，所以不明显；细胞年老时，细胞壁较厚。啤酒酵母细胞内不但含有丰富的蛋白质、维生素、葡聚糖及甘露聚糖等营养及保健成分，可作为食用单细胞蛋白，此外还含有辅酶I、细胞色素,卵磷脂、RNA,，这些物质或其降解产物及衍生物如氨基酸制剂和核苷酸及核酸制剂等在生物化学、医药及保健食品中最有重要的作用。由于啤酒废酵母价格便宜，因此可利用啤酒废酵母来提取、制备这些物质。啤酒废酵母(waste brewer's yeast)是啤酒生产的副产物，是指啤酒酿造后沉降的酵母泥，主要是由大量的弱细胞和死细胞组成。在啤酒生产过程中，每生产 100吨啤酒大约有1-1.5吨废酵母 (以干重计)产生。传统的处理方法，是弃置不用或作为饲料处理，直接排放到河流湖泊中，将造成环境污染，同时也是对财富的浪费；因其具有坚韧的细胞壁和特有的酵母臭，适口性差，不易消化和吸收，故烘干作为饲料用的经济效益不高。充分利用啤酒废酵母可以有效地减轻污染，实现资源的二次转化，也可产生巨大的经济效益，如开发酵母抽提物。 为了增加酵母抽提物产量国内外同行做出不同努力，开展了有些研究。目前关于啤酒酵母破壁的研究很多，大体可归纳为：化学破壁(酸解、碱解)、物理破壁(液体剪 切、固体剪切等)、生物破壁(酶解、自溶)。其中，化学破壁不仅会造成一些营养成分的破坏，而且为有效成分的提取增加困难；物理破壁虽然方法简单、成本低，能完好保存营养成分，但其破壁效果较差；生物破壁中的酶解法会增加提取成本，故均不能大规模广泛的应用。而采用自溶法进行细胞破壁是一种简便易行的操作过程，通过确定啤酒酵母细胞最适合的自溶条件，可以建立一套利用酵母细胞生产酵母抽提物的工艺和方法，旨在为啤酒酵母的综合利用寻求一种新的方法，为工业化生产提供理论基础和实践指导。1．4实验方法 工艺流程 啤酒废酵母（保藏）—— 活化、两次斜面培养—— 接种、平板划线——摇瓶培养——取对数期的酵母细胞——做稀释梯度——做影响因素（温度、食盐浓度、pH并固定时间60分钟）的实验-——做正交试验——镜检（血球计数法）——计算啤酒酵母细胞的破碎率——得到自溶的最佳工艺参数1．5啤酒废酵母自溶条件的确定酵母自溶的实质是酵母细胞内的蛋白质在自身蛋白酶的作用下，降解为游离的氨基酸，那么，一切影响酶促反应的因素均影响酵母细胞的自溶，如自溶温度、食盐浓度、pH值、自溶时间等。自溶法是以存在酶活性的新鲜活酵母为原料，利用酵母细胞本身的酶系，在一定条件下，将酵母体内的糖类物质、蛋白质和核酸分解为还原糖、氨基酸、肤类、核昔酸等小分子物质并从酵母细胞内抽提出来的一种方法。利用自溶法生产的酵母抽提物，蛋白质分解率高，游离氨基酸含量高，风味好，成本较低，但呈味核昔酸含量低.目前，欧美及我国所生产的酵母抽提物绝大部分都是采用这种方法。[font=仿宋_GB2

[align=center][font='宋体'][size=29px]溶菌酶[/size][/font][/align][size=24px]赵浩博[/size][size=12px]溶菌酶又称细胞壁质酶或[/size][size=12px] N- 乙酰胞壁质聚糖水解酶。1922 年英国细菌学家 A. Fleming 发现人的唾液、 眼泪中存[/size][size=12px]在有溶解细菌细胞壁的酶，[/size][size=12px] 因其具有溶菌作用， 故命名为溶[/size][size=12px]菌酶。[/size][size=12px] 此后在人和动物的多种组织、 分泌液， 及某些植物、[/size][size=12px]微生物中也发现了溶菌酶的存在。[/size][size=12px] 随着研究的不断深入， 发[/size][size=12px]现不仅有溶解细菌细胞壁的溶菌酶，[/size][size=12px] 还有作用于真菌细胞壁[/size][size=12px]的种类，[/size][size=12px] 同时对其作用机制也有了更进一步的了解。 近几[/size][size=12px]年，[/size][size=12px] 人们根据溶菌酶的溶菌特性， 将其应用于医疗、 食品、[/size][size=12px]畜牧及生物工程中。[/size][size=12px]溶菌酶来源不同，其分子大小不一样，其氨基酸排列顺序也有所不同，如：[/size][size=12px] T4 噬菌体溶菌酶由 164 个[/size][size=12px]氨基酸组成，分子量为[/size][size=12px] 19 ku；鸡蛋溶菌酶只有 129 个[/size][size=12px]氨基酸，其分子量约为[/size][size=12px] 14.3 ku；人溶菌酶由 130 个氨[/size][size=12px]基酸残基组成，分子量为[/size][size=12px] 14.6 ku；植物中分离出的溶[/size][size=12px]菌酶，其分子量较大，约为[/size][size=12px] 24 ku~29 ku。各种溶菌酶[/size][size=12px]的等电点在[/size][size=12px] 10.7~11.5 之间，化学性质十分稳定， pH 在1.2~11.3 范围内剧烈变化时，其结构几乎不变，活性不[/size][size=12px]受影响，此外，溶菌酶对热也极为稳定，在[/size][size=12px] pH3.0 条件[/size][size=12px]下，沸水浴中加热[/size][size=12px] 60 min 其活力仍保持 90 %以上。[/size][size=12px]目前鸡蛋清溶菌酶是研究最清楚的一种溶菌酶并已投入商业化生产。它是由[/size][size=12px] 18 种 129 个氨基酸残基[/size][size=12px]构成的单一肽链，有[/size][size=12px] 4 个 S-S 键的氨基酸 Cys，等电点[/size][size=12px]约为[/size][size=12px] 11.1，最适溶菌温度为 45 ℃~50 ℃， pH 为 6.0~7.0。在酸性环境中，溶菌酶对热的稳定性很强， pH4~7[/size][size=12px]范围内，[/size][size=12px] 100 ℃处理 1 min 仍有近 100 的活力， 210 ℃加[/size][size=12px]热[/size][size=12px] 1.5 h 仍具有活性；在中性水溶液中，溶菌酶可维持[/size][size=12px]数天而不失去活性；在碱性条件下，其稳定性较差[/size][size=12px]。[/size][font='宋体'][size=14px]1. [/size][/font][font='宋体'][size=12px]溶菌酶的理化性质[/size][/font][size=12px]溶菌酶纯品呈白色、微黄或黄色的结晶体或无定形粉末，无异味，微甜，易溶于水，不溶于丙酮、乙醚。溶菌酶遇碱易被破坏，但在酸性环境下，溶菌酶对热的稳定性很强，在[/size][size=12px]pH值为4-7时，100℃处理1min，仍能较好地保持活力:pH值为3时，能耐100℃加热处理45min。 [/size][size=12px]溶菌酶化学性质非常稳定，当[/size][size=12px]pH值在一定范围内剧烈变化时，其结构几乎不变。溶菌酶不可逆变性的临界点是77℃，随溶剂的变化，不可逆变性临界点也发生变化，当溶菌酶所处溶液pH值小于1时，不可逆变性临界点降低到43℃。[/size][size=12px]溶菌酶最适[/size][size=12px]pH为5.3~6.4，可用于低酸性食品防腐；溶菌酶作为防腐剂安全性高，可被冷冻或干燥处理，且活力稳定。 [/size][size=12px]溶菌酶对几种变性剂的敏感程度为[/size][size=12px]:二恶烷二甲基乙酰胺二甲基甲酰胺丙酮，并且随溶剂用量的增加而直线下降。[/size][font='宋体'][size=14px]2. [/size][/font][font='宋体'][size=12px]溶菌酶的制备[/size][/font][size=12px]目前溶菌酶可以以鸡蛋清和蛋壳膜为材料提取制得，常用的方法有亲和层析法、离子交换树脂法、直接结晶法和聚丙烯酸沉淀法等。[/size][size=12px]亲和层析法是利用蛋白质和酶的生物学特异性，即蛋白质或酶与其配体之间所具有的专一性亲和力而设计的色谱技术。酶一底物复合物形成之后，在一定的条件下分离复合物便得到纯净的酶。常常使用的吸附剂为几丁质及其衍生物，如：几丁质粉、羧甲基几丁质、几丁质包埋纤维素、脱氨几丁质粉、[/size][size=12px]N-酰化壳聚糖、脱氨再生几丁质凝胶。[/size][size=12px]离子交换法是利用离子交换剂与溶液中的离子之间所生的交换反应来进行分离的，分离的效果较好，广泛用于微量组分的富集。一般流程为：鲜蛋一预处理一搅拌吸附一上柱洗脱一等电点沉淀一透析一喷雾干燥一成品。[/size][size=12px]溶菌酶在等电点以下较广泛的[/size][size=12px]pH值范围内，分子带正电荷，可吸附于弱酸性阳离子交换树脂上，洗脱后盐析，可得溶菌酶沉淀，再进行精制可得成品。蛋清吸附724树脂，洗涤缓冲液洗脱，硫酸铵溶液盐析透析，用NaOH去碱性蛋白，冻干溶菌酶，冻干粉沉淀干燥得到溶菌酶。在5—10℃下，将新鲜蛋清540kg加入到已处理好的80kg 724树脂中，搅拌吸附6h，在0—5℃静置过夜。倾出上层蛋清，树脂离心甩干，用蒸馏水反复洗去黏附的卵蛋白，然后将树脂装入柱内，用0.15mol/L、pH=6.5磷酸缓冲溶液约150L洗涤树脂，再用约600L的10%硫酸铵溶液洗脱，收集洗脱液。洗脱液中加硫酸铵，使最终含硫酸铵量为40%，有白色沉淀生成，冷处放置过夜。虹吸上层清液，沉淀吸滤抽干，再用1倍蒸馏水溶解沉淀呈稀糊状，然后装入透析袋，在约5℃的条件下，对蒸馏水透析24h左右，中间换水2—3次。离心去除沉淀，沉淀再用少量水洗一次，洗液与离心液合并。再往透析清液中慢慢加入1mol/L氢氧化钠溶液，同时不断搅拌，使pH值上升到8.0—9.0，如有白色沉淀，即离心除去。然后用3mol/L盐酸调pH=5.0，冷冻干燥，即得白色片状溶菌酶。也可将离心液用3mol/L盐酸调pH=3.5，在搅拌下缓慢加入5%的固体氯化钠，在约5℃的温度下静置48h，离心，沉淀用0℃丙酮洗涤，干燥，即得溶菌酶。[/size][size=12px]在蛋清中加入一定量的碘化物或碳酸盐等盐类，并调[/size][size=12px]pH值至9.5—10.0，溶菌酶会以结晶形式慢慢析出，而大多数蛋白质仍然在溶液。在超滤浓缩脱盐后，为获得较纯产品，采用结晶纯化酶液经超滤处理后，用NaOH调整pH 9.5，离心去除。上清液在缓缓搅拌下，加NaCl至5%，静置一周，得粗结晶。结晶溶于pH 4.6醋酸水中，分去不溶物后，进行重结晶，结晶的最终得率为60%左右。即每公斤蛋清中可得重结晶品近1.3 g，活力测定为8000U/mg。 [/size][size=12px]聚丙烯酸沉淀法为将提取过滤后含酶洗脱液，首先经过吸附步骤，即将过滤后的澄清溶液用[/size][size=12px]20%的NaOH溶液调pH至6.0，在调pH值的过程中不停的搅拌。有少量的乳白色沉淀析出，然后加入15%聚丙烯酸，立即有白色沉淀析出，加至pH值为3.0为止，静置17个小时进行静析，得到粘附于底部的乳白色胶状物。第二步解离，将前步得到的溶菌酶聚丙烯酸凝聚物。加入少量蒸馏水并用0.5 mol/L的碳酸钠，将其溶解，转移后，将pH值调到9.5。加入5%CaCl2溶液将溶菌酶聚丙烯酸解离，至无沉淀析出，然后过滤，得到澄清溶液。第三步盐[/size][size=12px]析，将所得澄清溶液加入[/size][size=12px]5%的NaCI溶液搅拌均匀。放入冰箱调温度为0℃。待有晶体析出后，用无水乙醇洗涤数次，置恒温培养箱中40℃条件下干燥称重。[/size][font='宋体'][size=14px]3. [/size][/font][font='宋体'][size=12px]溶菌酶的应用[/size][/font][font='宋体'][size=12px]本文主要从溶菌酶在食品添加剂中的应用展开进行论述。[/size][/font][size=12px]3[/size][size=12px].1 用于水产、肉类的防腐[/size][size=12px]将溶菌酶应用于水产品、肉类的保鲜防腐，目前已做了大量的研究。如早在[/size][size=12px] 2001 年前陈舜胜等就研[/size][size=12px]究了溶菌酶复合保鲜剂在冷藏（[/size][size=12px]5 ℃）与冰藏（0 ℃~1 ℃）[/size][size=12px]条件下对虾、带鱼段、扇贝柱和柔鱼的保鲜效果，结果表明，使用溶菌酶（[/size][size=12px]0.05 %）复合保鲜液浸泡后冷藏或[/size][size=12px]用溶菌酶（[/size][size=12px]0.05 %~0.08 %）复合保鲜液制备保鲜冰冰[/size][size=12px]藏，与常规保鲜方法相比，可将上述水产品的保鲜期延长约一倍的时间。[/size][size=12px]2012 年张观科又报道：采用溶[/size][size=12px]菌酶、[/size][size=12px]Nisin、甘氨酸、VC、山梨酸钾、NaCl 等不同的配比[/size][size=12px]的复合生物保鲜剂在不同温度对牡蛎进行保鲜贮藏研究。结果表明，采用[/size][size=12px] Nisin 和溶菌酶配合的生物保鲜[/size][size=12px]剂的保鲜效果最佳（在[/size][size=12px]-3 ℃微冻条件下，保藏 30 天后[/size][size=12px]感官性状仍然良好）[/size][size=12px] 。而钱曦利用海藻糖、蜂胶、茶多[/size][size=12px]酚、魔芋葡甘露聚糖、[/size][size=12px]Nisin、溶菌酶、壳聚糖和姜汁 8种[/size][size=12px]天然保鲜剂对鹿肉保鲜进行研究，结果表明：单独使用时，溶菌酶对鹿肉样品就有较明显的抑菌作用（最佳抑菌浓度为[/size][size=12px] 0.5 %）；而采用复合天然保鲜剂（茶多[/size][size=12px]酚、溶菌酶、海藻糖、[/size][size=12px]Nisin 复合）效果更好，可以有效的[/size][size=12px]提高鹿肉的货架期至[/size][size=12px] 36 d。从以上研究结果来看，溶菌[/size][size=12px]酶尤其是它在与其他保鲜剂按一定比例复合使用时，对水产及肉类能起到较好的防腐保鲜效果。[/size][size=12px]3[/size][size=12px].2 在低度酒类、饮料中的应用[/size][size=12px]日本已成功的使用鸡蛋清溶菌酶代替水杨酸作防腐剂用于清酒的防腐[/size][size=12px]。在国内，倪瑛和钟立人研[/size][size=12px]究了溶菌酶在葡萄酒生产中的应用。因为在葡萄酒生产中乳酸菌会将苹果酸转变为乳酸，但如果在酒精发[/size][size=12px]酵的前期就完成了这种反应，会对葡萄酒的感官产生不良影响，而控制乳酸菌生长的传统方法是使用[/size][size=12px] SO2，[/size][size=12px]但[/size][size=12px] SO2 的使用不仅对人体产生毒性，同样影响葡萄酒[/size][size=12px]的品质。因此，倪瑛等尝试将溶菌酶替代或补充[/size][size=12px] SO2 调[/size][size=12px]控乳酸菌的生长，结果显示，在葡萄原汁中加入[/size][size=12px] 0.1 %~0.15 %的溶菌酶，乳酸菌生长被抑制；在白葡萄酒中溶[/size][size=12px]菌酶剂量加至[/size][size=12px] 0.5 %时，可完全抑制苹果酸向乳酸的转[/size][size=12px]变。此外，将溶菌酶用于饮料防腐也有报道，如常凯等将溶菌酶（[/size][size=12px]0.05 %） 、甘氨酸和 NaCl 进行复配用于生[/size][size=12px]产脱脂山核桃乳，其抑菌效果较显著，降低了山核桃乳的杀菌强度，延长了产品货架期。从以上结果看，在葡萄酒的生产中溶菌酶可作为[/size][size=12px]SO2 天然的、安全的替代或补充品来抑制乳酸菌的生[/size][size=12px]长，在其他低度果酒中也可做类似的尝试；同样将溶菌酶用饮料的防腐也有较显著的效果。[/size][size=12px]3[/size][size=12px].3 在乳制品中的应用[/size][size=12px]由于溶菌酶对肠道中腐败性微生物有特殊的杀灭作用，同时可直接或间接地促进肠道中双歧杆菌的增殖[/size][size=12px]。因此，有大量有关溶菌酶应用于婴幼儿奶粉的[/size][size=12px]专题论述[/size][size=12px] 冯棋琴，等：溶菌酶在食品工业中的研究进展[/size][size=12px]35研究报道，如刘浩强等研究了鸡蛋溶菌酶对婴幼儿[/size][size=12px]配方奶粉的抑菌效果，结果表明，婴幼儿配方奶粉在喷雾干燥后添加[/size][size=12px] 10 mg/100 mL~50 mg/100 mL 的鸡蛋[/size][size=12px]溶菌酶效果最好。张明江[/size][size=12px]等关于婴幼儿配方奶粉中[/size][size=12px]溶菌酶的添加工艺的研究也得出了相似的结论，既奶粉喷雾干燥后添加[/size][size=12px] 500 mg/L 的溶菌酶抑菌效果最好。[/size][size=12px]3[/size][size=12px].4 在水果保鲜上的应用[/size][size=12px]水果经过溶菌酶处理，其表面的细菌被有效的抑制或杀灭，从而延长水果的保鲜期。胡晓亮等[/size][size=12px]采用溶[/size][size=12px]菌酶与溶菌酶复合保鲜剂对马陆葡萄进行涂膜保鲜，结果表明：溶菌酶单独使用有一定的保鲜效果，但将溶菌酶（[/size][size=12px]0.1 %）和海藻酸钠（1 %）复合使用对抑制马陆[/size][size=12px]葡萄的感官品质下降效果更为显著，在（[/size][size=12px]4±1） ℃条件下[/size][size=12px]贮藏[/size][size=12px] 25 d 后，仍保持果实的硬度和组织形态，质量损[/size][size=12px]失率仅为[/size][size=12px] 9.34 %。[/size][size=12px]溶菌酶本身作为一种天然蛋白质，能在胃肠内作为营养物质被消化和吸收，对机体无毒性，也不会在体内残留，安全性很高，加之有效的防腐特性，溶菌酶已受到了食品行业的青睐。但目前实际应用的且已商品化的是鸡蛋清溶菌酶，它的抗菌谱较窄，只对[/size][size=12px] G+细菌起作用，底物特异性[/size][size=12px]强，且投入[/size][size=12px]/效率低，这限制了它们的广泛使用。为了扩[/size][size=12px]大溶菌酶使用领域及防腐效果，可以将鸡蛋清溶菌酶与其他天然保鲜剂（如海藻糖、茶多酚、[/size][size=12px]Nisin、溶菌酶、[/size][size=12px]壳聚糖等）配合使用。[/size][size=12px]此外，随着科学技术的发展，人们还可以采用一些高科技手段（如采用微生物发酵法生产溶菌酶，采用酶修饰法合成溶菌酶复合物如溶菌酶[/size][size=12px]-环糊精、溶菌酶-半乳甘露聚糖等）生产并改良溶[/size][size=12px]菌酶。经过改良的溶菌酶不仅抗菌活性稳定，而且具有良好的乳化性能。当这些杀菌谱广、成本低、安全性高溶菌酶复合剂以及人工合成溶菌酶商品化时，溶菌酶的使用范围定会越来越广，将会在各行业发挥不可估量的作用。[/size][font='宋体'][size=14px]4. [/size][/font][font='宋体'][size=12px]溶菌酶的限量，检测与标准[/size][/font][size=12px]溶菌酶可水解细菌的细胞壁[/size][size=12px], 造成藤黄微球菌的溶解而引起溶液吸光度值的降低。[/size][size=12px]一个溶菌酶活力单位定义为[/size][size=12px]25 ℃ ,pH 6.2 条件下, 使用藤黄微球菌悬浊液在450 nm 处每分钟引[/size][size=12px]起吸光度变化为[/size][size=12px]0.001 所需溶菌酶的量。[/size][size=12px]试剂和材料[/size][size=12px]藤黄微球菌:ATCC4698 或 CICC10680。[/size][size=12px]0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液:pH 6.2。[/size][size=12px]称取[/size][size=12px]11.70 g 磷酸二氢钠(NaH[/size][font='宋体'][size=12px]2[/size][/font][size=12px]PO[/size][font='宋体'][size=12px]4[/size][/font][size=12px] 2H[/size][font='宋体'][size=12px]2[/size][/font][size=12px]O) 、7.86 g 磷酸氢二钠(Na[/size][font='宋体'][size=12px]2[/size][/font][size=12px]HPO[/size][font='宋体'][size=12px]4[/size][/font][size=12px]12H[/size][font='宋体'][size=12px]2[/size][/font][size=12px]O) 及0.372 g[/size][size=12px]乙二[/size][size=12px]胺四乙酸二钠 (EDTA-[/size][font='宋体'][size=12px]2[/size][/font][size=12px]Na)于无菌水中并稀释定容至1000mL。调整缓溶液pH至6.2±0.1。[/size][size=12px]注[/size][size=12px]: 用小份缓冲溶液检查pH, 以避免缓冲溶液被污染。如果需要, 通过加入更多的磷酸二氢钠溶液或磷酸氢二钠[/size][size=12px]溶液调整[/size][size=12px]pH。[/size][size=12px]溶菌酶标准品: 蛋清溶菌酶。[/size][size=12px]底物溶液: 用磷酸盐缓冲液制备50 mL 藤黄微球菌悬浊液。 使用前, 底物于37 ℃ 培养30 min。[/size][size=12px]该底物溶液室温下可稳定[/size][size=12px]2 h。 以磷酸盐缓冲液调分光光度计零点, 然后测定底物溶液的吸光度,450 nm 下读数应为0.70±0.1。[/size][size=12px]仪器和设备[/size][size=12px]分光光度计: 精度±0.001。pH 计。[/size][size=12px]注[/size][size=12px]: 所用的器皿应保持无菌, 保证工作环境的清洁。[/size][size=12px]分析步骤[/size][size=12px]试样溶液的制备[/size][size=12px]准确称取[/size][size=12px]100 mg±0.1 mg 试样, 置于50 mL 容量瓶中, 用约25 mL 磷酸盐缓冲液搅拌溶解并稀释[/size][size=12px]定容[/size][size=12px], 充分混匀。 再转移3 mL 上述试样制备溶液至100 mL 容量瓶中, 用磷酸盐缓冲液搅拌溶解并稀[/size][size=12px]释定容。[/size][size=12px]标准溶液的制备[/size][size=12px]精确称取[/size][size=12px]50 mg 蛋清溶菌酶标准品于50 mL 容量瓶中, 用约25 mL 磷酸盐缓冲液搅拌溶解并稀释[/size][size=12px]定容[/size][size=12px], 充分混匀(如果需要, 冷冻该溶液以备后续测定)。转移3 mL 上述标准制备溶液至100 mL容量[/size][size=12px]瓶中[/size][size=12px], 用磷酸盐缓冲液搅拌溶解并稀释定容。测定[/size][size=12px]取[/size][size=12px]3 份标准溶液和3 份试样溶液进行测定。[/size][size=12px]25 ℃ 室温下, 将1 cm 比色皿放入分光光度计, 用磷酸盐缓冲液调整吸光度零点。 吸2.9 mL 底物[/size][size=12px]溶液于比色皿[/size][size=12px], 最初450 nm 处吸光度应为0.70±0.10,3 min 之内初始吸光度值变化应小于或等于0.003 时, 方可开始测定。 吸取0.1 mL 标准溶液加入底物溶液, 充分混合。 记录3 min 吸光度值的变[/size][size=12px]化[/size][size=12px], 每15s 记录一次吸光度值。 每分钟吸光度值变化应在0.03~0.08, 若不在要求范围需调整试样溶液[/size][size=12px]的浓度。[/size][size=12px] 重复操作测定试样溶液。[/size][size=12px]反应[/size][size=12px]1 min 后稳定, 计算时忽略最初1 min 的读数。[/size][size=12px]结果计算[/size][size=12px]酶活力[/size][size=12px] X , 按式计算:[/size][align=center][size=12px]X =(A[/size][font='宋体'][size=12px]1[/size][/font][size=12px] -A[/size][font='宋体'][size=12px]2[/size][/font][size=12px])[/size][size=12px]/([/size][size=12px]2 × m ×0.001[/size][size=12px])[/size][/align][size=12px]式中[/size][size=12px]:[/size][size=12px]A1 ———[/size][size=12px]试样在[/size][size=12px]450 nm [/size][size=12px]处反应[/size][size=12px]1 min [/size][size=12px]时的吸光度[/size][size=12px] [/size][size=12px]A2 ———[/size][size=12px]试样在[/size][size=12px]450 nm [/size][size=12px]处反应[/size][size=12px]3 min [/size][size=12px]时的吸光度[/size][size=12px] [/size][size=12px]m ———用于分析的试样制备溶液中的溶菌酶质量, 单位为毫克(mg) [/size][size=12px]2 ———获得1 min 和3 min 吸光度读数所用的时间, 单位为分钟(min) [/size][size=12px]0.001———由单位溶菌酶每分钟引起的吸光度降低的值。[/size][size=12px]试验结果以平行测定结果的算术平均值为准。[/size][size=12px] 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差[/size][size=12px]值不大于算术平均值的[/size][size=12px]10%。[/size][size=12px]最终对于溶菌酶的检测要求罗列如下：[/size][img]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2021/08/202108081546089787_7027_1608728_3.png[/img][align=center][img]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2021/08/202108081546090379_7253_1608728_3.png[/img][/align][align=center][img]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2021/08/202108081546091326_4621_1608728_3.png[/img][/align][size=12px]注：本标准适用于以鸡蛋清为原料[/size][size=12px], 经提取、精制等工艺制得的食品添加剂溶菌酶。[/size][size=12px]溶菌酶作为一种天然球状蛋白质，[/size][size=12px] 能促进营养物质被人[/size][size=12px]体消化吸收，[/size][size=12px] 对人体无毒性， 也不会在体内残留， 是一种安[/size][size=12px]全性很高的食品保鲜剂、[/size][size=12px] 营养保健品和药品。 由于每一类型[/size][size=12px]的溶菌酶都有其最适的作用条件，[/size][size=12px] 而且底物特异性强， 因[/size][size=12px]此，[/size][size=12px] 在应用溶菌酶时， 必需注意以下几个事项： ①充分掌握[/size][size=12px]溶菌酶的酶学特性，[/size][size=12px] 掌握食品中的营养成分、 pH 值、 食盐[/size][size=12px]浓度等影响溶菌酶效果的因素以及造成某种食品腐败的主要微生物群体，[/size][size=12px] 采用适当的添加量和添加方法才能收到应有的[/size][size=12px]防腐效果。[/size][size=12px] ②为了有效的发挥溶菌酶作用效力， 可以考虑与[/size][size=12px]其它物质配伍使用。[/size][size=12px] 如将溶菌酶与甘氨酸混合使用， 其防腐[/size][size=12px]效果则远远高于单独使用溶菌酶。[/size][size=12px] 因为甘氨酸含量达到一定[/size][size=12px]程度时，[/size][size=12px] 能抑制微生物细胞壁的合成， 这种作用对革兰氏阳[/size][size=12px]性菌和阴性菌均有效，[/size][size=12px] 从而增了溶菌酶效力的发挥。 也可[/size][size=12px]以考虑与植酸、[/size][size=12px] 聚合磷酸盐等配伍使用， 以增强溶菌酶革兰[/size][size=12px]氏阴性细菌的抑菌作用。[/size][size=12px] 不管与哪种物质配伍使用， 使用之[/size][size=12px]前都要进行小试。[/size][size=12px]参考文献：[/size][font='宋体'][size=14px][1] [/size][/font][font='宋体'][size=12px]GB 1886.257-2016,食品安全国家标准 食品添加剂 溶菌酶[s].[/s][/size][/font][font='宋体'][size=14px][2] [/size][/font][font='宋体'][size=12px]范林林[/size][/font][font='宋体'][size=12px], 林楠, 冯叙桥,等. 溶菌酶及其在食品工业中的应用[J]. 食品与发酵工业, 2015, 41(003):248-253.[/size][/font][font='宋体'][size=14px][3] [/size][/font][font='宋体'][size=12px]冯棋琴[/size][/font][font='宋体'][size=12px], 周立梅, 高文功,等. 溶菌酶在食品工业中的研究进展[J]. 食品研究与开发, 2015, 000(005):134-136[/size][/font][font='宋体'][size=14px][4] [/size][/font][font='宋体'][size=12px]张新宝[/size][/font][font='宋体'][size=12px], 陈红兵. 溶菌酶的性质及其在食品防腐中的应用[J]. 江西食品工业, 2008(4):42-45[/size][/font]

小编在此前文章中为小伙伴们带来了德国DosaTec DosaPrepX8全自动溶媒配制仪后，有不少伙伴来电咨询溶媒配制的法规要求到底有哪些，本文中小编整理了相关要求，以飨读者。各类法规对溶媒（溶出介质）的要求如下，且听小编慢慢道来。[b]USP[/b]药典各论中规定了药品需要采用的溶媒介质，如果采用的是缓冲液，则需要调整溶媒的pH在规定值的±0.05范围内。溶媒中溶解的气体如果使实验结果产生偏差，则需要在实验前进行脱气。脱气的方法可以是：在不断搅拌的状态下加热介质，到大约41℃，立即通过0.45μm或更小孔径的滤膜过滤，在真空状态下继续搅拌约5min。其它经过验证的脱气方法也可以被采用。[align=center][img=,600,284]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/09/201909101044411772_4638_932_3.jpg!w690x327.jpg[/img][/align][align=center][color=#333333]早期根据USP要求设计的脱气装置[/color][/align][b]USP 溶出方法的开发与验证[/b]在选择溶媒介质时，需要考虑缓冲液、pH值和表面活性剂对药物溶解度和稳定性的影响，当然剂型的主要参数，如硬度、脆度、增溶剂等助剂的加入也会影响药物溶出的释放机理（速释、缓释和控释）和崩解速率。建立溶出方法时，需要符合漏槽条件，即溶媒体积需要至少为药物饱和溶液体积的三倍，达到这个漏槽条件后，溶出结果才能反映为剂型的真正溶出特性。采用水和有机相的混合溶媒是不被提倡的，但如果经过适当的评估，这种类型的溶媒也可以被接受。溶媒的脱气是非常重要的，气泡存在于药剂表面或溶出篮表面，会使药物溶出受阻，导致检测结果偏差。气泡也会附着在转轴、桨和溶出杯内壁，存在于药剂表面的气泡会增加药剂浮力，增加溶出速率，同时减小了药剂与溶媒的接触面，而降低了溶出速率。[align=center][img=,600,795]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/09/201909101044460307_1108_932_3.png!w448x594.jpg[/img][/align][color=#333333][/color][align=center]篮法溶出实验中，未脱气的溶媒可能产生气泡聚集（A和B）[/align]含表面活性剂的溶媒，通常无需脱气处理，因为脱气反而会产生很多气泡。对于胶囊或者凝胶涂覆的药品，在溶出实验中可以增加酶类物质。[b]溶出机械验证与性能确认工具包USP Toolkit 2.0[/b]溶媒加热的时间需要尽量缩短，需要达到USP要求的脱气要求，真空度建议达到100mbar以下。溶媒体积需要控制在±1%允许范围内，体积需要在室温下测得，更精确的测量方法是采用重量法测量溶媒体积。溶出实验中，溶媒温度需要控制在±0.5℃范围内，每个溶出杯内的溶媒温度都要单独测量。[b]《口服固体制剂溶出度试验技术指导原则》对溶出介质的规定[/b]如有可能，溶出度试验应尽可能在生理条件下进行，这样可以参比制剂体内行为解释相关的溶出度。溶出介质的体积一般为500，900和1000mL，最好为漏槽条件，但不强制要求。应采用pH为1.2~6.8的水性介质，一般不超过pH8.0。某些制剂和组分对溶出介质中溶解的空气敏感，因此需要脱气。[align=center][img=,300,260]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/09/201909101044490080_5202_932_3.jpg!w272x236.jpg[/img] [img=,300,261]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/09/201909101044519813_2858_932_3.jpg!w271x236.jpg[/img][/align][color=#333333][/color][color=#333333][/color]下面我们梳理一下法规要求和Dosatec DosaPrepX8的符合性： [table=535][tr][td=1,1,249]法规具体要求项[/td][td=1,1,165]DosaPrepX8性能[/td][td=1,1,121]符合性[/td][/tr][tr][td=1,1,249]溶媒体积控制在±1%[/td][td=1,1,165]1%[/td][td=1,1,121]✔ [/td][/tr][tr][td=1,1,249]更精确的体积测量方法是重量法[/td][td=1,1,165]重量法[/td][td=1,1,121]✔ [/td][/tr][tr][td=1,1,249]溶出介质的体积为500，900和1000mL[/td][td=1,1,165]150~8000mL可选[/td][td=1,1,121]✔ [/td][/tr][tr][td=1,1,249]真空度建议达到100mbar[/td][td=1,1,165]一般＜100mbar[/td][td=1,1,121]✔ [/td][/tr][tr][td=1,1,249]pH为1.2~6.8的水性介质[/td][td=1,1,165]完全符合[/td][td=1,1,121]✔ [/td][/tr][tr][td=1,1,249]pH要求值的±0.05内[/td][td=1,1,165]完全符合[/td][td=1,1,121]✔ [/td][/tr][tr][td=1,1,249]溶媒加热的时间需要尽量缩短[/td][td=1,1,165]整个配制过程仅15min，包含混合、加热和脱气。[/td][td=1,1,121]✔ [/td][/tr][/table]

作者：孙蕊;刘世超; (河南省洛阳市中心医院药剂科;河南省洛阳市妇女儿童医疗保健中心药剂科;)摘要：目的:建立高效液相法测定奥美拉唑镁肠溶片含量的方法。方法:采用Diamonsil-C18(4.6 mm×150 mm,5μm)色谱柱;流动相:甲醇-水-磷酸-三乙胺(65∶35∶0.12∶0.3);检测波长:302 nm;流速:1.0 ml/min。结果:奥美拉唑镁在13.3182～31.0758μg范围内与峰面积呈良好的线性关系(r=0.999 0),平均回收率为101.14%,RSD=1.64%。结论:本法简便、准确、重现性好,可用于奥美拉唑镁肠溶片的质量控制。谱图：http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2012/08/201208201413_384697_1606903_3.jpg

[align=center][color=#666666]　[/color][/align][color=#666666]在回流操作或浓缩溶液时，经常会有结晶析出在液面上方的烧瓶内壁上，且附着牢固，不仅不能继续参加反应，有时还会因热稳定性差而逐渐分解变色。[/color][color=#666666]遇此情况，可轻轻振摇烧瓶，以内部溶液浸润结晶，使其溶解。[/color][color=#666666]如果装置活动受限，不能振摇烧瓶时，可用冷的湿布敷在烧瓶上部，使溶剂冷凝沿器壁流下时，溶解析出的结晶。[/color]

今天收到客户一个实验，检测奥美拉唑镁肠溶片，溶出度实验，样品中有一个杂质未分开，希望安排售前实验，进行色谱柱的筛选。以辛烷基硅烷键和硅胶为填充剂，流动相是0.01M磷酸氢二钠（磷酸调pH=7.6）-乙腈=75:25，波长302nm，要求奥美拉唑峰与杂质I分离度大于2.0.下面是客户做的结果，实验室色谱柱筛选工作正在进行中……http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2016/03/201603071349_586166_1987954_3.png

[b]问题：[b][b][b][/b][/b]艾司奥美拉唑镁肠溶片的检测，流动相是？[/b]答案：流动相： A：水-磷酸盐缓冲溶液-乙腈（80:10:10） B：乙腈-磷酸盐缓冲溶液-水（80:1:19）=======================================================================【活动内容】1、每个工作日上午10：00左右发布一个关于应用数据库的应用问答题，版友根据题目给出自己理解的答案。2、每个工作日下午15：10公布参考答案。【活动奖励】幸运奖：抽奖软件，当天随机抽取3个或5个回答正确的版友ID号（最后一个ID号，截止至下午15：00），每人奖励[color=#ff0000]2钻石币[/color]（抽奖人数≤10，抽取3个版友；抽奖人数＞10，抽取5个版友）；中奖名单：lijing320323(注册ID：lijing320323）999youran（注册ID：999youran）dahua1981（注册ID：dahua1981）PAEs（注册ID：v2911392）吕梁山（注册ID：shih20j07）[img=,690,388]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/09/201809041504163298_6848_1610895_3.png!w690x388.jpg[/img][img=,690,388]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/09/201809041504189792_3148_1610895_3.png!w690x388.jpg[/img]积分奖励：所有回答正确的版友奖励[color=#ff0000]10个积分[/color]（幸运奖获得者除外）。【注意事项】同样的答案，每人只能发一次[/b][align=left][color=#ff0000][b]PS：该贴浏览权限为“回贴仅作者和自己可见”，回复的版友仅能看到版主的题目及自己的回答内容，无法看到其他版友的回复内容。[/b][/color][/align][align=left][color=#ff0000][b] 下午3点之后解除，即可看到正确答案、获奖情况及所有版友的回复内容。[/b][/color][/align][align=center]=======================================================================[/align]方法：HPLC基质：药品应用编号：103783化合物：艾司奥美拉唑色谱柱：[url=http://www.dikma.com.cn/product/details-855.html]Platisil ODS 5μm 250 x 4.6mm[/url]样品前处理：有关物质供试品：精密称取20mg样品置于100mL容量瓶中，加10mL甲醇，振摇，加20mL磷酸盐缓冲溶液（每1000mL水中加入磷酸钠0.0137mol和磷酸氢二钠0.0551mol），超声使其溶解，用水稀释到100mL，混匀，过滤，取续滤液。色谱条件：色谱柱： Platisil ODS 250*4.6 mm，5 μm(Cat#：99503)流动相： A：水-磷酸盐缓冲溶液-乙腈（80:10:10） B：乙腈-磷酸盐缓冲溶液-水（80:1:19）磷酸盐缓冲溶液：1000mL水+磷酸二氢钠0.0052mol+磷酸氢二钠0.0315mol流速： 1.0 mL/min柱温： 30 ℃检测器： 302nm进样量： 20uL文章出处：天津应用实验室关键字：艾司奥美拉唑镁肠溶片、Platisil ODS、99503、HPLC摘要：Platisil ODS检测艾司奥美拉唑镁肠溶片。图谱：[img]http://www.dikma.com.cn/u/image/2017/01/05/1483598227111770.jpg[/img][img]http://www.dikma.com.cn/u/image/2017/01/05/1483598227527569.jpg[/img][img]http://www.dikma.com.cn/u/image/2017/01/05/1483598227109068.jpg[/img]