舒立克隆

单克隆抗体 (mAb) 型药物代表了发展迅速的一类生物药物，对这类药物需要进行深入表征，以便获得临床试验和后续上市的批准。鉴于单克隆抗体具有分子量大及存在翻译后修饰（糖基化）的特征，精确质量数测定是单克隆抗体分析表征中最具挑战性的步骤。这些特性也使得修饰位置的测定更加复杂。?为了应对抗体质量数测定相关的挑战，人们使用了大量补充方法。可以用 PNGase F 处理抗体去除 N-糖链，后用 IdeS 等蛋白酶酶解获得抗体片段，也可还原单克隆抗体，以生成轻链和重链，随后进行质量数测定。这些技术可以各种组合加以应用。样品前处理可能费时费力，而且重现性不佳。本应用简报展示了如何使用 Agilent AssayMAP Bravo 的自动化功能简化这些方法，减少引入人为误差的可能性，提高重现性，并实现更长的无人值守时间。

单克隆抗体 (mAb) 型药物代表了发展迅速的一类生物药物，对这类药物需要进行深入表征，以便获得临床试验和后续上市的批准。鉴于单克隆抗体具有分子量大及存在翻译后修饰（糖基化）的特征，精确质量数测定是单克隆抗体分析表征中最具挑战性的步骤。这些特性也使得修饰位置的测定更加复杂。为了应对抗体质量数测定相关的挑战，人们使用了大量补充方法。可以用 PNGase F 处理抗体去除 N-糖链，后用 IdeS 等蛋白酶酶解获得抗体片段，也可还原单克隆抗体，以生成轻链和重链，随后进行质量数测定。这些技术可以各种组合加以应用。样品前处理可能费时费力，而且重现性不佳。本应用简报展示了如何使用 Agilent AssayMAP Bravo 的自动化功能简化这些方法，减少引入人为误差的可能性，提高重现性，并实现更长的无人值守时间。

Felix移液工作站在单克隆杂交瘤筛选中以“整板移液”优势提高了的孔间的一致性，以“12板位”优势保证了整板移液的高通量；以“体积小”的优势，能放进生物安全柜，降低了细胞培养过程中污染的可能性。

在分子克隆过程中，筛选含有插入基因片段的重组质粒转化子是一项必不可少的工作。一种称为“蓝白斑筛选”的颜色报告基因可以根据克隆颜色快速区分出重组和非重组的克隆。尽管蓝白筛选提供了一个直观的辨别重组克隆的方法，但是，在克隆挑取过程中，过多的人工操作过程存在主观、速度慢、易出错等问题。Molecular Devices QPix400系列微生物克隆筛选系统提供了一个自动化的解决方案，尤其针对蓝白克隆筛选，通过白光成像提供了准确高效的克隆转化检测方法。这个解决方案整合了QPix Software2.0蓝白筛选模块、QPix颜色滤片以及可调平板适配器。本文重点描述了使用QPix420系统进行颜色克隆筛选实验的结果，通过DNA测序进一步验证了挑取克隆的准确性。优势?通过白光高效监控转化效率?准确区分白色、蓝色或浅蓝色等颜色?智能化软件选择模块，可以自动或自定义筛选

迄今为止，经临床批准的大多数单克隆抗体类生物治疗药物，主要是IgG1形式，其次是IgG2和IgG4形式。糖基化是导致单克隆抗体翻译后修饰异质性的主要原因，会影响药物的治疗作用机制（MOA）。同时，糖基化也是影响药物溶解度、动力学、稳定性和疗效的关键因素之一。因此，监测聚糖的关键质量属性（CQA）在药物开发阶段显得至关重要。IgG与其细胞Fc受体（FcR）的结合亲和力取决于其IgG亚类和Fc区的糖基化修饰。并且，N-聚糖的结构也与抗体ADCC活性密切相关，因此需要对单克隆抗体制剂及其生物类似药进行糖基化修饰的监测。东曹生命科学（Tosoh Bioscience）开发出了一种基于Fcγ IIIa的亲和色谱法来评价单克隆抗体糖型差异的全新方法。在文章中，首先简要概述了Fc受体的功能。然后，阐述了基于FcR的亲和色谱的原理、新型FcR色谱柱根据抗体N-聚糖分离多种单克隆抗体具有高选择性。最后，我们举例介绍了FcR色谱柱在细胞株筛选、糖工程监测、工艺开发和生产过程监控中的应用。

不需显微操作体细胞核移植的利益和前景远大。当前的成果包括降低装备费用，简化预备工作及实验技术要求低。任何做过胚胎方面试验和口吸管方面工作的人都能很快掌握。尽管用卵母细胞试验的直接工作没有显著减少，但降低了这些工作的技术难度。此外，与早期的技术相比，预备工作如制作工具可以省略。然而，应该注意到产生三倍体需要较多的卵母细胞。无透明带的胚胎可能有利于嵌合体的制作，克隆方法的简化也将有利于核移植的自动化。在卵母细胞成熟期间，用于建立该方法的供体细胞是贴壁的原代培养的颗粒细胞，这些细胞并不是都很适合做供体。随着方法的进一步改进，可能能用不同器官组织的传代细胞和血清饥饿培养的细胞。

本文使用岛津GCMS-QP2020 NX气质联用仪结合负化学离子源（NCI），建立了环境水中得克隆类物质残留量的检测方法。样品经溶剂提取、复合硅胶柱净化、溶液浓缩后上机测试。实验结果表明：在0.5~50 ng/mL浓度范围内，得克隆组分线性良好，线性相关系数均在0.9997以上，仪器检出限在0.10~0.17 ng/mL之间。取浓度为1.0 ng/mL标准溶液，连续进样6次，得克隆化合物峰面积相对标准偏差小于8%，重复性良好。在空白地表水样品中进行50 ng/L和100 ng/L两个不同浓度加标实验，回收率在87.5%-109%之间。该方法灵敏度高，适用于地表水、地下水、工业废水和生活污水中得克隆含量的测定。

本文使用岛津GCMS-TQ8050 NX三重四极杆气质联用仪结合BEIS离子源，建立了环境水中得克隆类物质残留量的检测方法。样品经溶剂提取、复合硅胶柱净化、溶液浓缩后上机测试。实验结果表明：在0.2~50 ng/mL浓度范围内，得克隆组分线性良好，线性相关系数均在0.9996以上，仪器检出限在0.044~0.096 ng/mL之间。取浓度为0.2 ng/mL标准溶液，连续进样7次，得克隆化合物峰面积相对标准偏差小于7%。在空白地表水样品中进行1 ng/L浓度加标实验，平均回收率在86-118%之间。该方法灵敏度高，重复性良好，适用于地表水、地下水、工业废水和生活污水中得克隆含量的测定。

药用多肽和蛋白质是一类快速膨胀的治疗药物，常用于治疗各种疾病，如癌症、代谢与自身免疫类疾病、HIV等。生物药如单克隆抗体源于生物体，通常价格高昂。由于很多生物制剂依照专利生产，市场为节约成本的生物医药做好准备，但是所有的蛋白质包括单克隆抗体具有决定其功能的复杂结构，结构差异改变其生物活性，进而导致药物安全和效力发生变化。

实验方法原理TA克隆 系统由Invitrogen公司（San Diego，CA）发展而来的商业性试剂盒，它用于PCR 产物的克隆 和测序。其原理是利用Taq酶能够在PCR 产物的3' 末端加上一个非模板依赖的A，而T载体是一种带有3' T突出端的载体，在连接酶作用下，可以快速地、一步到位地把PCR 产物直接插入到质粒载体的多克隆 位点（MCS）中。 外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能，而且T4噬菌体DNA连接酶还有一种大肠杆菌DNA连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。但这种连接的效率比粘性末端的连接率低，一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。 T4噬菌体DNA 连接酶催化DNA 连接反应分为3 步：首先，T4 DNA 连接酶与辅因子ATP形成酶-ATP复合物；然后，酶-ATP复合物再结合到具有5' 磷酸基和3' 羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化；最hou产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。连接反应通常将两个不同大小的片断相连。因为DNA片断有两个端点，所以切割时出现两种可能，一种是单酶切，另一种是双酶切，这两种酶切方法在基因工程操作中都经常用到。对于单酶切来说，载体与供体的末端都相同，连接可以在任何末端之间进行，这样就导致了大量的自连接产物。为了减少自环的高本底，可对载体进行5' 除磷酸处理，原理是连接酶只能连接DNA片断的3' OH末端与5' 端，所以除磷后载体不会自环。一旦有外源片断插入时，由外源片断提供5' 端就能与载体进行连接。通过这种方法可大大减少由载体的自环造成的高本底。对于双酶切来说，无论载体与供体同一片段上都有不同的末端，这样就避免了载体与供体的自环，能使有效连接产物大大增加。双酶切的另一个特点是能将供体分子定向连接到载体上。 连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性。但是在这个温度下粘末端的氢键结合是不稳定的。因此采取折中的温度，即12-16℃，连接12-16h（过夜），这样既可最da限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。Taq DNA酶扩增的PCR产物，其DNA双链前后末端都有一个游离的A碱基，可以与pGEM-T Easy Vector 末端游离的T碱基互补形成环状重组T质粒。

有限稀释是一个普遍接受的建立单克隆性的方法，它基于统计概率因此只有很少一部分（ 10-30% ）的微孔能被接种单个细胞。流式细胞分选是另一种传统的克隆方法，它可以高效地接种单个细胞至微孔内，但是液体剪切力会对被分选细胞的活率造成不可忽视的影响1-2 。此外，仪器维护和培训产生的高昂成本对一些资源有限的用户造成障碍。因此，急需高性价比的细胞株开发流程和高效的克隆方法。CloneSelect™ Single-Cell Printer™ f.sight™ （ f.sight ）被开发用于满足这些需求， 它可以柔和地接种单个细胞至微孔，同时记录整个细胞接种过程，提供单克隆性的图像证据以及优异的接种后细胞生长用于细胞株开发。

在生物制药行业，单克隆抗体生产的下游加工过程通常包括三步色谱纯化：捕获、中间纯化和精制纯化。蛋白质A 柱常在捕获步骤中使用，它能带来高通量（即分析能力和分析速度），同时在浓缩目标分子和免疫球蛋白方面同样发挥了重要的作用。在投入高成本进行制备以及使用大量蛋白质A 柱之前；若想要对细胞培养上清液的单克隆抗体滴度和产量进行监测，就需要通过小型（分析型）的处理工序来确定单克隆抗体的滴度，以便确定单克隆抗体产品的最佳采集时间。在本应用简报中，采用预填充的Agilent Bio-Monolith 蛋白质A 色谱柱进行了快速捕获细胞上清液中的单克隆抗体滴度的研究。

了解勃林格殷格翰如何为其单克隆抗体寻找最佳缓冲条件

从老鼠腹水中纯化而来的单克隆抗体往往含有一些异构体。即使在SDS-PAGE 电泳分析中只显从老鼠腹水中纯化而来的单克隆抗体往往含有一些异构体。即使在SDS-PAGE 电泳分析中只显示一条带，但当使用等电聚焦电泳时却可以观察到多条带的存在。TSKgel CM-STAT是一款适合于分析抗体异构体的高分辨率、非多孔、弱阳离子交换色谱柱。在本数据中介绍了使用TSKgel CM-STAT 色谱柱进行鼠腹水由来的单克隆抗体异构体分析的应用。同时，我们将通过TSKgel CM-STAT色谱柱分离获得的不同组分进一步使用等电聚焦电泳进行了鉴定。结果表明，TSKgel CM-STAT色谱柱确实适合于异构体的分析，并且可以适用于毫克级别的微量、高分离度的样品制备。

● 全流程应用与整合解决方案● 背景介绍和应用实例集锦● iPSC基因重编程应用解决方案● 细胞克隆筛选应用解决方案● 化繁为简，合而不同

轻柔分选：鞘液压力2psi，提高分选细胞活性灵活分选：可根据荧光信号筛选，也可以不染色直接铺板无菌分选：一次性芯片，保证样本之间完全隔离；仪器体积小巧，可置于超净台中高效分选：96孔板分选不到1min，384孔板4min以内，单克隆率超过95%轻松分选：仪器操作简单，无需专人操作维护

单克隆抗体是一类重要的治疗药物，拥有治疗多种疾病的巨大潜力。由于其结构具有高度复杂性和聚糖异质性，因此必须对其关键质量属性进行表征和严格控制，才能保证药物的质量和功效。与Fc区Asn-297糖基化位点相连的mAb聚糖会影响生物活性，如抗体依赖性细胞毒性（ADCC）和稳定性。TSKgel FcR-IIIA系列色谱柱根据单?克隆抗体对Fcγ RIIIA配体的亲和力，将其分为3个组分：低亲和力、中亲和力和高亲和力。这主要取决于mAb的糖型及其ADCC活性。为了定量和阐明基于FcRIIIA亲和力分离的不同组分糖型聚糖谱，需要首先对馏分中的抗体聚糖进行释放并标记，再使用HILIC-MS 的分析。TSKgel FcR-IIIA-5PW是一种半制备型亲和色谱柱，其固定相是将重组Fcγ RIIIA 配基，键合到10 μ m粒径的多孔聚甲基丙烯酸酯聚合物基质上，上样量最高可达5 mg mAb。它与分析柱 (TSKgel FcRIIIA-NPR) 不同，分析柱采用的是无孔填料基质，上样量通常 ≤ 50μ g mAb。因此，使用半制备型TSKgel FcR-IIIA-5PW色谱柱，单次可收集更多的样品，对这一工作流程大有裨益。该半制备型色谱柱的附加效用是可以通过收集足量的样品，通过酶促聚糖释放和HILIC-MS方法对mAb糖型进行深度分析。

细胞株开发对于生物药物 ( 如单克隆抗体 )的生产至关重要。为了建立细胞株，单个细胞被接种至孔板，随后增殖形成克隆，评估其表达水平后进一步放大。将单个细胞接种至多孔板的仪器有流式细胞仪和单细胞分离设备。而更传统的获得单细胞孔的方法是有限稀释。在这个方法中，梯度稀释产生单个细胞的孔，并伴随着一定概率的空孔和多细胞孔。

当前，单克隆抗体和重组蛋白等蛋白质类生物药物广泛应用于治疗各种严重威胁人类生命的疾病，包括癌症和自身免疫性疾病。蛋白质治疗远远比小分子药物的治疗复杂，因此，阐明这种复杂性成为一个分析难题。本文使用配备 DAD 检测器的 Agilent 1290 Infinity 二维液相色谱解决方案，论证了采用全二维液相色谱 (LCxLC) 分析单克隆抗体胰蛋白酶酶解物的应用潜力。

单克隆抗体的优点是：理化性状高度均一、生物活性单一、与抗原结合的特异性强、便于人为处理和质量控制，并且来源容易。这些优点使其广泛应用于抗肿瘤等领域，缺点就是生成的抗体只针对1种抗原决定簇，比较单一。

生物制药是生物技术产业中发展最为迅速的部分，以单克隆抗体药物为标志，目前全球已批准35个抗体药物上市，用于癌症、自身免疫、黄斑变性、血液病和感染治疗等。在生物制药的每个生产环节，产品的纯化和分析过程都至关重要。早期抗体的质量控制过程中，必须测定样品的效价、聚集体和电荷亚型。单克隆药物（MAb）产品中两个主要的杂质是电荷亚型单抗和单抗聚集体，这些副产物会产生与主产品不同的药效，有时会引起严重的副作用，如抗药性抗体的形成。蛋白聚体是在生产过程、纯化或者运输过程中产生（如温度，pH的影响）。本文讨论了采用一套HPLC系统（UltiMate3000钛系统）同时实现单克隆抗体的聚集体的分离和电荷亚型的分离。

本文向您介绍使用Skyline 软件和岛津LCMS-8050/8060 创建MRM方法，对生物样品中的单克隆抗体进行特异性检测的分析示例。岛津LCMS-8050/8060 和 Skyline 软件的组合使用，缩短定量分析方法的创建时间。

利用生物兼容高效液相色谱仪，选择合适的疏水作用色谱柱（HIC）分别对融合蛋白和单克隆抗体样品中结构异构体的杂质蛋白与主成分进行有效的分离。

98%。QPix400 系列的荧光成像模块可以显著减少下游的工作量，因为通过对荧光蛋白表达的定量，实现了有目的性筛选，确保只挑感兴趣的克隆。QPix 已成为市场上微生物克隆筛选系统的领导者，它可以提供多组荧光滤光片，兼容大多数的荧光克隆载体。基于荧光的重组克隆筛选方法使重组基因表达的筛选更加容易，提供了一个更加准确的筛选方法。

高分辨率的对完全原态下(fully native)的单克隆抗体的电荷变异体的分离，对 mAb 和 ADC (抗体药物结合物)的分析均能提供非常好的准确度和灵敏度

本文讨论了采用一套HPLC系统（UltiMate3000钛系统）同时实现单克隆抗体的聚集体的分离和电荷亚型的分离。

PepFinder软件对单克隆抗体进行常规肽图分析的各种应用。结果表明，使用PepFinder软件可以简便快捷的得到序列覆盖度分析的结果，并且可以对脱酰胺等生物医药质控中重要的翻译后修饰进行鉴定以及定量。PepFinder独具的单克隆抗体分子量计算功能及二级谱图智能预测功能大大减少了分析人员花费在数据处理上的时间；在PepFinder2.0版本中，新增的De Novo Sequencing功能和mgf格式文件、pinpoint txt文件输出功能帮助分析人员对数据进行不同平台上的深入挖掘。通过生成快速、全面的肽段表征及自动化的修饰位点总结报告， PepFinder 软件能够大幅减少生物产品详细表征所需的时间和精力。

建立了TSQ 9610三重四极杆气质联用仪测定土壤中得克隆两种异构体的方法。实验结果表明，得克隆两种异构体在0.1~200 ng/mL浓度范围内线性判定系数均在0.9999以上，在1 ng/mL与10 ng/mL标准品溶液连续进样8次情况下，峰面积RSD值均小于4.0%，方法检出限（MDL）低至0.026与0.025 ng/mL，加标浓度2 ng/mL与100 ng/mL的回收率在96~106%。

本文使用配备了BEIS离子源及长寿命灯丝的岛津GCMS-TQ8050 NX三重四极杆气质联用仪，建立了环境水中得克隆类物质残留量的检测方法。在0.2~50 ng/mL浓度范围内，得克隆组分线性良好，取浓度为0.2 ng/mL标准溶液，连续进样10次，仪器检出限在0.063~0.103 ng/mL之间。交替采集样品溶液和得克隆标准溶液，考察得克隆响应的长期稳定性，500针样品内标液峰面积比、离子比例变化在20%之内。该方法灵敏度高，稳定性好，适用于环境水中得克隆含量的长期测定。

运用RapiFluor-MS技术的沃特世UNIFI生物制药平台解决方案是采用成熟分析方法开展工业规模高通量应用的理想之选，这套解决方案能够满足实验室支持生物学家开展上游、下游加工或克隆筛选研究的各项需求。