突破光学透射深度瓶颈，NIR-II小动物活体成像装机量攀升——恒光智影CTO艾中凯博士
小动物活体成像技术是指应用影像学方法，对活体状态下的生物过程进行组织、细胞和分子水平的定性和定量研究的技术。广泛应用于生物医学、药物筛选等领域。为帮助广大用户及时了解小动物活体成像前沿技术、产品与整体解决方案，仪器信息网特别策划“小动物活体成像技术”主题征稿活动。本期，特别邀请到恒光智影联合创始人兼CTO艾中凯博士围绕小动物活体成像技术发展与应用展开阐述，着重就恒光智影聚焦的近红外二区（NIR-II）成像技术的优势及未来发展进行分享。 本期嘉宾：艾中凯博士，上海恒光智影医疗科技有限公司CTO/联合创始人2008年-2014年，博士毕业于新加坡国立大学电气与计算器工程系。 2015年 至2019年就职于美国普林斯顿仪器公司 (Princeton Instruments)，担任应用科学家职位，负责探索弱光信号探测技术在前沿科学中的结合，深度参与许多前沿的科技项目，在弱光成像技术上有多年持续的积累。2020年至今，作为恒光智影联合创始人之一，参与公司技术专利8项，推出了新一代平台型近红外二区活体成像系统，具有丰富的产学研结合经验。 01 从动物模型到小动物活体成像技术人类疾病动物模型是现代生物医学研究中重要的实验方法与手段，是对医学研究和药物研发的有力支撑，有助于更方便、更有效地认识人类疾病的发生、发展规律以及研究防治措施。与此同时，由于大鼠、天竺鼠、小鼠等小动物作为动物模型具备诸多优势，在生命科学、医学研究及药物研究开发等多个领域的应用日益增多。众所周知，影像技术在基于动物模型的研究过程中发挥着至关重要的作用。近些年随着科学仪器设备技术的创新与突破，面对层出不穷、日新月异及个性化的科研需求，市场涌现出各种小动物成像的专业设备，为科学研究提供了强有力的工具。 02 市场规模破百亿，小动物活体成像五大主流技术路线据调研机构对小动物成像（活体内）行业市场数据的统计显示，2022年全球小动物成像（活体内）市场容量为115.86亿元（人民币）。预计全球小动物成像（活体内）市场规模在预测期将以9.94%的CAGR增长并预估在2028年达203.38亿元。动物活体成像技术是指应用影像学方法，对活体状态下的生物过程进行组织、细胞和分子水平的定性和定量研究的技术。动物活体成像技术目前主要分为光学成像 (optical imaging)、核素成像（PET/SPECT）、核磁共振成像（magnetic resonance imaging ，MRI）、计算机断层摄影（computed tomography，CT）成像和超声（ultrasound）成像五大类。根据数据类型，又可以分为绝对定量数据和相对定量数据两种。在样本中位置而改变，这类技术提供的为绝对定量信息，如CT、MRI和PET提供的为绝对定量信息；图像数据信号为样本位置依赖性的，如可见光成像中的生物发光、荧光、多光子显微镜技术属于相对定量范畴，但可以通过严格设计实验来定量。光学成像和核素成像特别适合研究分子、代谢和生理学事件，称为功能成像；超声成像和CT则适合于解剖学成像，称为结构成像，MRI则介于两者之间。 分子成像技术使活体动物体内成像成为可能美国哈佛大学Weisslede于1999年提出分子影像学（molecular imaging）的概念——应用影像学方法，对活体状态下的生物过程进行细胞和分子水平的定性和定量研究。此前传统成像技术大多依赖于肉眼可见的身体、生理和代谢过程在疾病状态下的变化，而不是了解疾病的特异性分子事件，而分子成像则是利用特异性分子探针追踪靶目标并成像。这种从非特异性成像到特异性成像的变化，为疾病生物学、疾病早期检测、定性、评估和治疗带来了重大的影响。分子成像技术使活体动物体内成像成为可能，它的出现，归功于分子生物学和细胞生物学的发展、转基因动物模型的使用、新的成像药物的运用、高特异性的探针、小动物成像设备的发展等诸多因素。活体动物体内光学成像主要采用生物发光与荧光两种技术。生物发光是用荧光素酶基因标记细胞或DNA，而荧光技术则采用荧光报告基团（GFP、RFP, Cy5及Cy7等）进行标记。该技术最初是由美国斯坦福大学的科学家采用了世界上最优秀的高性能CCD研发与生产制造商最新研发的背部薄化、背照射冷CCD，配合密闭性非常好的暗箱，使得直接监控活体生物体内的细胞活动和基因行为成为现实。科学家借此可以观测活体动物体内肿瘤的生长及转移、感染性疾病发展过程、特定基因的表达等生物学过程。所以说该技术是伴随着背部薄化、背照射冷CCD的产生而产生，并随着该CCD技术的发展而发展。由于具有更高量子效率CCD的问世，使活体动物体内光学成像技术具有越来越高的灵敏度，对肿瘤微小转移灶的检测灵敏度极高。在该技术诞生后的10几年间，科学家借此取得了大量的科学成果，发表了几千篇文献资料，大部分都是应用以背部薄化、背照射冷CCD为核心部件的成像系统而得出的。活体动物光学成像技术的应用史，从设备技术层面，也是生物学家应用背部薄化、背照射冷CCD进行生物微弱发光检测的应用史。该技术之所以促进活体动物光学成像技术的发展，主要是由于超低温的CCD芯片，CCD镜头温度越低，噪音越小，信噪比越好，灵敏度越高因此对物微弱发光具有极高的灵敏度，使近年来产生了大量的高水平的应用活体成像技术进行肿瘤学、基因治疗、流行病学等研究的文献，极大的促进了生物医学在分子成像方面的发展。 03 突破透射深度瓶颈的近红外二区（NIR-II）成像技术 荧光成像技术，对比X-ray CT、PET-CT、MRI、超声等技术，在多个方面具有优势并拥有广阔的应用前景，但透射深度是光学活体成像最关键的瓶颈所在。小动物活体成像技术路线特点分析红外光线应用于活体层面，科学家们常用拓展到 760~900 nm 的近红外一区（NIR-I）窗口进行成像。然而，在该窗口内，在生物组织中传播的光子仍然受到较强的散射作用，这严重限制了组织荧光成像的成像深度和图像分辨率。2003年， 哈佛医学院 Frangioni教授及麻省理工学院 Bawendi 教授等预测了大于 1000 nm 光学窗口的大深度成像潜力。2009年，斯坦福大学戴宏杰教授团队利用单壁碳纳米管实现了首例大于1000 nm的近红外活体荧光成像。不久后，1000~1700 nm 作为第二个近红外成像窗口（近红外二区 NIR-II，又称短波红外波段SWIR）被大家熟知。NIR-II比NIR-I拥有更低的水吸收，不易受组织自发荧光或者实验室光照环境影响，更低光散射等特性，使得NIR-II比NIR-I拥有更佳的组织穿透性，从而获得高清晰度的活体成像数据。近6年，人们发现NIR-II和NIR-I成像更重要的是检测器上的差别。传统NIR－I成像使用的是Si检测器，NIR-II成像使用的是InGaAs检测器。其检测灵敏度如下图所示：传统Si检测器的响应范围在400nm到1000nm之间，InGaAs检测器的响应范围在1000nm到1700nm之间。于此同时NIR-I，NIR-II荧光成像波长的差别带来的荧光成像透射深度及分辨率的差别极为明显，如下图所示：NIR-II染料CH1055-PEG 在1200～1700nm对小鼠脑部血管成像的效果远远好于临床应用的NIR-I染料ICG（750～900nm）。脑部主要血管（~4mm深度）在NIR-II荧光成像中清晰可见，但在NIR-I成像中难以分辨清楚。如下图对比所示，在类似的曝光时间下，3mm深度NIR-II的空间分辨率可达0.04mm，而且产生极少量的自荧光现象。 NIR-II染料与三维光学断层成像技术相得益彰光学分子影像具有高度灵敏、实时直观、成像快速、操作简便、成本低、无放射性危害且可同时观测多分子事件等优点。 尽管光学分子影像学技术已被广泛应用于药物开发、肿瘤早期诊断及复发监测、辅助治疗、预后判断等生物医学领域，但是它也有一些不足，如但荧光分子不稳定性导致其存在重现性差、光在体内散射致使探测深度较浅等问题。此外，由于空间分辨率相对较差并缺乏深度信息,常规平面光学成像不能用于定位组织深处的光学探针,因此难以通过其获得特定分子或目标在组织内的空间分布信息。近年来,多功能光学分子探针和各种三维光学断层成像技术,包括光学相干断层成像(Optical Coherence Tomography,OCT)、荧光分子断层成像(Fluorescent Molecular Tomography, FMT)、生物自发光断层成像(Bioluminescence Tomography, BLT)、切伦科夫荧光断层成像(Cerenkov Luminescence Tomography, CLT)等新技术的发展,提高了光学成像的灵敏性和特异性,探测深度、范围和空间分辨率,使光学分子影像技术在生物医学的基础和应用研究中展现出良好的前景。就荧光分子断层成像（FMT）而言，能够提供目标物在生物体内的分布信息,克服平面荧光成像的局限性,在肿瘤检测、基因表达、蛋白质分子检测、揭示机体功能变化等方面有着很大的应用潜力【1】。荧光分子断层成像以荧光探针标记的分子或细胞为成像源,在外部光源的激发下产生荧光,通过测量组织边界处的荧光光强,结合光子在组织中传播的模型,来重建出组织内部的荧光光学特性的分布图像以及组织光学参数。由于NIR-I染料的兴起，NIR-I荧光分子断层扫描（NIR-I FMT）已被充分开发用于临床前诊断和小动物实验，然而NIR-I FMT要达到令人满意的效果仍然是一个具有挑战性的问题），因为NIR-I光在生物组织中的强烈散射，NIR-I FMT仍然呈现严重的缺陷和问题。NIR-II比NIR-I减少了组织散射效应和更长波长产生的最小自发荧光，因此NIR-II荧光成像具有更深的组织穿透深度（厘米级）和更高的空间分辨率。NIR-II FMT预计可以进一步提高重建精度和空间重叠。另一方面，有效且临床可用染料的缺乏也在技术发展初期限制了NIR-II成像的临床应用。但是最近的研究报道吲哚菁绿（ICG）在NIR-II窗口中发出尾部荧光，适用于NIR-II FMI。这些进展促进了NIR-II成像的发展，为NIR-II FMT创造了有利的条件【2】。 聚焦NIR-II成像，恒光智影突破多项技术攻关上海恒光智影医疗科技有限公司成立于2019年，由海外留学归国团队创办，公司的研发团队核心成员来自斯坦福大学、新加坡国立大学、中国科学院大学、武汉大学、哈尔滨工业大学、中国科学技术大学、浙江大学等国内外知名高校，60%以上具有博士学位，技术研发专注于近红外二区（900-1700nm）及全光谱（400-1700nm）小动物活体成像系统，并整合CT、X-ray、光谱、超声、光声成像技术，可为肿瘤药理、神经药理、心血管药理、大分子药代动力学等一系列学科的科研人员提供清晰的成像效果，为用户提供前沿的生物医药与科学仪器服务。2022年被评为“国家高新技术企业”，上海市“科技创新行动计划”科学仪器领域立项单位。自公司成立以来，恒光智影坚持以产品研发和技术创新为核心驱动力，突破了多项技术攻关，完成新产品研发和交付：• 2020上半年疫情期间，团队克服种种困难，没有间断产品研发，于2020年7月1日，恒光智影自主开发的近红外二区小动物活体成像系统MARS正式面市；• 2020年12月，在南方科技大学完成MARS的首台装机。MARS面市后，凭借出色的产品性能与售后服务，得到了用户和市场的广泛认可。自2021年起，在近红外二区小动物活体成像系统领域的市场占有率遥遥领先；• 2021年7月，恒光智影推出近红外二区高光谱小动物活体成像系统；• 2021年8月，MARS推出自主研发的多波长融合激光光源；• 2022年1月，恒光智影推出全球首款近红外二区小动物体视活体成像系统并实现首台装机交付；• 2022年11月，推出并实现首台全光谱小动物活体成像系统装机；• 2022年11月，推出全球首台近红外二区+CT小动物活体成像系统并实现首台订单；• 2023年6月，推出X射线辐照近红外二区小动物活体成像系统并实现首台装机；• 2023年9月，推出全球首台近红外二区双光子共聚焦成像系统并完成首台装机； 跨尺度全光谱小动物活体成像凸显核心竞争力恒光智影聚焦在近红外二区成像技术，提出跨尺度活体成像概念，其产品组合已覆盖宏观成像、体视成像、共聚焦显微成像、X射线和PET-CT模块、荧光寿命模块、荧光光谱、拉曼光谱等模块，并且整合可见光至近红外一区系统，推出全光谱小动物活体成像设备，全方位满足生物医学、临床前和临床应用科研工作对活体成像的需求。——产品优势/核心竞争力——1、高灵敏度宏观光学系统（MARS），实现高清晰度活体动物成像：1)深制冷InGaAs相机，提供了高灵敏，低噪声，高速读出的优异性能；2)自主开发高光通量宏观镜头，光折损小，对低亮度探针成像适应性更强；3)丰富且灵活可变的荧光通道，轻松滤除干扰信号，获取目标荧光信号。2.可快速切换至体视光路（Pathfinder），1-7X连续变倍观察，实现30mm-2mm小鼠宏观整体到局部介观超宽范围FOV的成像：3.自动化激发时分复用系统(Multicolor)，可整合1- 6路激光，可实现单/多波长同时激发，匹配不同探针体系；4.暗室+旋转舱门结构设计，除了提供正常成像过程中所需要的暗室环境外，打开时可提供180°的开阔空间，供2-3名研究人员同时进行手术导航等操作；5.可扩展的多模态平台架构，可在MARS宏观系统上增配体视光路系统、荧光寿命系统、X-ray和CT断层扫描模块，实现多模态功能扩展，节省设备复购的成本，更适合科研应用；——应用领域——近红外二区荧光活体成像技术适用于多个生物医药科研的应用领域，包括：1.肿瘤成像/手术导航/靶向性/诊疗一体化/抗癌药研发等；2.血管成像/颅内血管造影/血栓研究/脑中风模型/血脑屏障BBB等；3.脏器系统/药剂崩解追踪/肠道菌群/肾代谢/外泌体追踪/骨结构成像等；4.药物药理研究、药效评价、分子药物药代动力学研究等；涉及颅内血管、肿瘤、骨关节、肝胆、肠道菌群，淋巴系统等多个器官和组织的活体成像，以及荧光探针的发射光谱、靶向性能、荧光寿命、生物毒性、发光强度等性能指标的研究和测试:自2020年上市以来，恒光智影MARS已在复旦大学、上海交通大学、中科院上海药物研究所、深圳先进技术研究院、西安交通大学、北京化工大学等40多家国内知名院校及医疗机构的相关课题组和重点实验室完成了系统安装和交付使用，已协助科研人员发文20余篇。 04 展望：NIR-II成像技术多领域应用潜力可观对于肿瘤学研究，NIR-II成像为活体内三维结构、血管分布、血流和肿瘤中动态免疫细胞浸润过程的成像提供了可能。通过结合多种内源性和外源性NIR-II探针，进一步发展多种光谱成像方法，将为全面分析肿瘤的发生、发展和转移提供一种独特的工具，从而为肿瘤的精确诊断和治疗提供理论依据。就临床应用而言，NIR-II成像最有希望的应用是图像引导的肿瘤手术；在未来，先进的NIR-II成像技术可能会大大提高肿瘤手术的精度和预后。此外，与FDA批准的基于ICG的NIR-I成像相比，NIR-II成像在组织穿透深度和时空分辨率方面具有优越的性能，因此在临床心血管疾病的精确诊断和治疗方面也具有巨大潜力。在再生医学领域，无创NIR-II成像也将在探索基本生物学问题方面发挥重要作用，如胚胎和器官的发育过程以及干细胞的谱系和命运。应用多光谱NIR-II成像技术可以提供丰富的成像通道，同时监测干细胞的易位、活力、旁分泌、分化和老化，从而全面了解干细胞再生的过程和潜在机制。 05 后记：习近平总书记曾说道：“我们比历史上任何时期都更需要建设世界科技强国”。建设世界科技强国，首先必须建设世界仪器强国。中国在近红外二区荧光成像方向上的科学技术水平引领世界，恒光智影正是怀揣着这样的科研理想，通过在近红外二区成像技术的不断研发创新，打造高端科研仪器，肩负起中国仪器之崛起，助力中国走向世界科技强国，实现中华民族伟大复兴的历史使命。参考文献：【1】“Application of Three-Dimensional Optical Tomography for in Vivo Bioimaging”，LI Zhuhenga,b, ZHANG Huab, LIU Dianjunb, WANG Zhenxinb，DOI: 1000-0518(2018)12-1411-09 【2】”NIR-II/NIR-I Fluorescence Molecular Tomography of Heterogeneous Mice Based on Gaussian Weighted Neighborhood Fused Lasso Method”, Meishan Cai, Zeyu Zhang, Xiaojing Shi, Zhenhua Hu,and Jie Tian , Fellow, IEEE, DOI: 10.1109/TMI.2020.2964853征稿提纲：https://www.instrument.com.cn/news/20230925/685455.shtml欢迎持续投稿！投稿文章后续将在【小动物活体成像技术专题】展示并在仪器信息网相关渠道推广。投稿邮箱：liuld@instrument.com.cn，关于征稿内容要求也可邮件咨询或电话联系刘编辑：13683372576（同微信）。
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