烏巴配基

&ldquo 第一个，科技成果不行，创新性、独创性、实用性、成熟度都不行，出发点是为了写论文，而不是为了走市场 第二个，过分考虑成果属于谁，就像鸭子还没弄到手，就考虑怎么烤着吃。&rdquo 　　中科院院士、青海大学校长王光谦委员，常会遇到来高校求项目却空手而归的企业。在遗憾的同时，他也坦陈：&ldquo 我们高校诞生了太多无用的成果。&rdquo 　　在研究了一个个成果转化的失败案例后，他得出结论，&ldquo 科技成果转化难，我认为这是一个伪命题!&rdquo 　　&ldquo 我们现在对科技成果的认定就是错误的。什么叫科技成果?就是除了面向未来的基础研究成果，就是市场决定的应用性成果。这种成果，市场觉得你有用，那才叫科技成果 为了评职称、写论文，那就不是，它对市场没用。&rdquo 在王光谦眼中，真正的科研成果应该是能够转化的，也就是符合市场需求的创新成果。 　　实践中，他发现这样的成果太少了，&ldquo 我看，只有百分之几的量，个位数。&rdquo 　　&ldquo 科技成果转化不是简单地买卖，企业期望成果像洗衣粉配方一样，他一手交钱，我一手交配方就是了。但大部分成果不那么简单，双方应面向市场培育一个新的想法，在实验中慢慢放大，最后才有实用的产品。&rdquo 　　在&ldquo 伪命题&rdquo 之外，王光谦还有个&ldquo 真困惑&rdquo 。他谈到了美国科技成果转化的例子。&ldquo 一般专利收益2/3分配给发明人，超过30万美元的按1/3比例归发明人所有。&rdquo 这是美国夏威夷大学关于《知识产权的管理条例》的规定，它代表了部分国外科研机构对成果转化的态度&mdash &mdash 给予发明人丰厚的物质报酬，激发科研人员积极性。 　　在他看来，国外重视成果转化，有一套成熟的利益分配机制，&ldquo 我们的成果转化过分强调成果为单位所有，科技人员不能拿去赚钱 其实，单位占有还是个人占有并不重要，重要的是转出去，然后获利。说清楚这个钱怎么赚，而不是大家扯皮。课题组内部的扯皮分配不均，单位分配不均，这样的话就不好转化了。&rdquo

研究背景各种类型的涂层，包括粘合剂和油墨，在包装优化过程中起着关键的作用。对于所有形式的涂层来说，了解并匹配基材的表面特性和涂层的特性是至关重要的，即润湿性、液滴铺展、染料吸收、短期/长期的粘附力及印刷质量等。对于表面特性和涂层在涂料树脂领域的新发展，BASF要求ORONTEC的自动化和数字化专家在Ludwigshafen总部建立了数字化材料分析实验室，这是世界上最现代化的涂料实验室之一。在此项Lab 4.0综合项目中普遍地采用了KRÜ SS的MSA进行接触角测量。案例介绍ORONTEC的模块化表面扫描设备根据涂料行业的规范和标准整合了不同的测量设备。当个别要求超出这个范围时，就像巴斯夫的情况一样，于是ORONTEC与客户一起开发了自动化的概念。在BASF SE，ORONTEC首次根据要求将接触角的测量整合到表面扫描系统中。该系统可测量的参数包括：色值、光泽、雾度、DOI、干膜厚度，以及基于接触角的润湿性。接触角这个测量变量与涂层表面的防水、防污和防腐蚀性能息息相关，对最终产品的使用寿命和可持续性起着重要的参考作用。KRÜ SS便携式表面分析仪 - MSA用于接触角测量，已经在BASF SE的传统实验室中被广泛使用。除了出色的便携性和可靠的自动化分析外，极快的测量和结果输出也是这台仪器最终脱颖而出的重要原因。整合的过程极为简单，ORONTEC将ADVANCE软件通过接口（API）整合到复杂的自动化和数据处理程序中。对于KRÜ SS来说，这并不是第一次将其测量设备整合到自动化系统中--而这种通过水接触角和二碘甲烷测接触角，以确定表面自由能（SFE）的方式，还提供了极性和非极性物质的表面润湿性概况。用户相信只有通过 "一键式 "测量SFE表面自由能的方法，才能实现这套测量程序的数字化的整合。涂料行业有一种乐观的精神--对于ORONTEC来说，通过数字化实现发展、协同、整合的时代才刚刚开始。在BASF SE实施的项目充分地展示了通过自动化和智能化的系统，涂料的研发可以变得如此高效。一键式表面自由能测量仪 - MSA

上海，中国——贝克曼库尔特商贸(中国)有限公司——作为一家成立百年的专门从事诊断和生命科学相关产品生产和服务的技术型公司，在流式细胞产品有着完备的流程和系统，除了有流式细胞仪的生产工厂之外，还在在全球有3家配套流式试剂生产工厂：美国迈阿密、法国马赛、印度班加罗尔，为全球临床和科研用户提供高质量的流式试剂来满足当今流式细胞实验室的需求。试剂类型除了有传统的液体试剂也有最新型的干粉试剂。适应不同实验室、不同环境对于检测试剂的要求。ClearLab LS(淋巴瘤筛选方案) P/N B74074试剂用于各种血液淋巴样细胞异常样本的筛选研究。该试剂可以帮助鉴别诊断血液淋巴恶性肿瘤。该检测主要针对T，B及NK淋系细胞进行定性，其结果可以与其他实验结果进行综合解读。*一管即用型淋巴瘤筛选方案*采用贝克曼库尔特独家干粉专利技术，常温存储*预混10色共计12个抗体*用于Navios等3L10C高端流式*简化样本制备流程*可检测外周血，骨髓及淋巴结样本，适用于EDTA，肝素及ACD等多种抗凝样本*25人份包装更适合临床研究*CE注册*WHO 2008修订分类指导方案该方案的克隆及染料搭配基于能更契合临床研究的需要，鉴别样本中所有主要淋巴瘤型别，以及在正常和肿瘤阶段中主要造血细胞系别。ClearLab Compensation Kit 多色补偿试剂盒 P/N B74074 提供即用型干粉十色补偿管，可用外周血或补偿微球进行多色的流式补偿条件设置。*每盒5套*CE注册DURACLONE IF T细胞活化检测方案如今单细胞水平的细胞因子检测可以通过更为简单、灵敏的实验流程实现。即用型干粉试剂DuraClone§ IF T活化方案消除了由于抗体移液带来的误差，并采用简单快速的PerFix-nc通透方案，为您的细胞功能分析提供一套标准化工作流程！ 细胞免疫功能测定的往往操作方法繁琐，重复性差。DuraClone IF T活化试剂无需重复的抗体移液和避免不同抗体间效期问题，并且在紫光、蓝光和红光三个激光都提供了开放的检测的通道，为检测方案增添灵活性。红激光开放通道选取串色程度最低的灵敏度最高的APC染料，确保了在该检测通道的优先用于检测弱表达标记。DuraClone RE管贝克曼库尔特联合该领域的权威专家，对血液疾病（比如B淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤）临床研究中用于稀有细胞流式检测的灵敏抗体进行优化，推出了现在的DuraClone RE§管。该方案一共包含三个独立panel，可以对B细胞发育分化的不同阶段中含量极少的异常细胞进行检测，B80393针对成熟B淋巴异常细胞，含有ROR-1抗体，被认为是区分慢淋和正常B细胞以及套白MCL的一个全新标志物。B80394针对浆细胞中异常细胞。C00163针对未成熟B细胞中的异常细胞。三个方案均留有开放通道允许外加抗体或染料如核染色SYTO41，满足研究灵活便利的需要。DuraClone RE CLB管826,000个CD45+细胞数据分析示例。异常B细胞群以红点表示（568个，0.069% CD45+），正常B细胞群以蓝点表示（16,003个）。Kaluza§雷达图通过ROR-1、CD5、CD43、CD81、CD79b和CD20的多元视角确定了布尔设门策略。数据由Navios流式细胞仪分析全血样品获得。DuraClone RE PC管2,660,000个CD45+细胞数据分析示例。异常浆细胞群以红点表示（52个，0.003% CD45+），正常浆细胞群以绿点表示（30个）。Kaluza§雷达图通过全部8个参数CD45、CD38、CD138、CD19、CD56、CD200、CD81和CD27的多元视角确定了布尔设门策略。数据由Navios流式细胞仪分析全血样品获得。DuraClone RE ALB管1,228,000个CD45+细胞数据分析示例。异常浆细胞群以红点表示（132个，0.011% CD45+），正常B细胞群以绿点表示（39，898个）。结合采用CD58、CD34、CD10、CD38、CD20分析异常细胞。数据由Navios流式细胞仪分析全血样品获得。*以上产品仅用于科研，不用于临床诊断。

仪器信息网讯 东京时间2022 年 8 月 29 日，Olympus Corporation（以下称“奥林巴斯”）和奥林巴斯的全资子公司 EVIDENT Co., Ltd.（以下称“Evident”）宣布，奥林巴斯 与 Bain Capital Private Equity, LP （以下称“贝恩资本”）关于Evident 的转让达成了最终协议。根据该协议，Evident 的所有股份将以 4276 亿日元（约合 31 亿美元、213亿元人民币）的价格、于 2023 年 1 月 4 日转让给贝恩资本，但需获得监管部门的批准和交割条件。出售该部门之际，奥林巴斯加快了对其业务组合的改革，以专注于医疗技术。这也将是这家日本公司迄今为止最大的一次撤资。作为将自己重塑为一家医疗技术公司的努力的一部分，奥林巴斯于 2021 年剥离了亏损的相机业务，同时于今年 4 月剥离了 Evident，并着眼于出售该子公司。转让背景奥林巴斯于2019年11月6日宣布了新的企业战略(以下称“企业战略”)，以实现作为全球医疗技术公司的增长。在这一公司战略下，我们努力加强我们的管理基础，积极将管理资源分配至医疗业务，重点是内镜解决方案业务和治疗解决方案业务，以实现奥林巴斯集团整体可持续增长。在这种情况下，奥林巴斯专注于提高整个集团的企业价值，通过让Evident接管的科学解决方案业务（这不同于医疗业务的业务特点），并建立适合每个业务特点的管理结构，并一直在研究所有的选择，包括转让Evident的股份。经过奥林巴斯的研究，得出的结论是，为了提高整个奥林巴斯集团的企业价值，实现科学解决方案业务的自我可持续和持续增长，基于企业战略将Evident的所有股份转让给贝恩资本是最好的选择。为实现作为全球医疗技术公司的可持续发展，奥林巴斯正努力通过将资源分配给医疗业务来加强其管理基础，重点是内窥镜解决方案和治疗解决方案业务。奥林巴斯的科学解决方案业务于2022年4月转移至Evident；该决定旨在通过建立与医疗和科学解决方案领域各业务特点相匹配的管理体系，加速增长、提高盈利能力并为提高奥林巴斯整体的企业价值做出贡献。奥林巴斯科学解决方案业务部 Evident 在生命科学和工业应用领域开展业务。这些领域的增长基础基于全球市场的品牌积淀和强劲需求。Evident用于生命科学的显微镜支持广泛的学术和临床研究领域、病理学诊断服务以及最近对药物发现和生育治疗不断增长的需求。Evident 的工业解决方案范围从用于不断扩大的半导体行业和电子元件市场的显微镜，到用于工业应用的工业视频内窥镜和纤维内窥镜、无损检测设备和 X 射线荧光分析仪，其广泛的应用包括汽车、航空、金属制造、发电、贵金属和其他一些制造和检验检测市场等领域。鉴于这种有利的市场环境，奥林巴斯认为将 Evident 的所有股份转让给贝恩资本将符合其最大利益，以使 Evident 能够根据市场需求以更加敏捷和灵活的决策发展其业务，进一步领先发展，并为客户开发更多创新的解决方案。“贝恩资本对 Evident 的商业价值和增长潜力有着深刻的理解。重要的是，他们高度赞赏 Evident 的企业文化，这是奥林巴斯通过全球合作和前沿技术的积极商业化满足各种客户需求的宝贵资产，”奥林巴斯公司总裁兼首席执行官 Yasuo Takeuchi 说，“他们能够为 Evident 提供最适合其业务特点的商业环境，从而可持续地最大化其企业价值。我相信贝恩资本是 Evident 的最佳合作伙伴。”Evident 总裁兼代表董事 Yoshitake Saito 评论了新公司的重点：“Evident 将继续在贝恩资本旗下，为其客户群提供广泛的全球创新产品和服务。基于我们长期的专业知识，我们将扩展我们的数字技术，包括基于云的解决方案，以增强客户体验并改善多个研究和检测领域的整体工作流程。凭借更大的管理自主权，我们将促进敏捷和开放的创新，这将加快产品开发速度，以解决客户的挑战。”关于Evident● 公司名称： Evident Corporation● 总部注册地：日本长野县上伊那郡龙野町● 总部办公室：日本东京都新宿● 社长兼代表董事：Yoshitake Saito● 业务描述：开发、制造、销售和提供解决方案产品包括生物显微镜、工业显微镜、工业用视频内窥镜和纤维内窥镜、无损检测设备、X -射线分析仪等● 主要股东和持股比例：奥林巴斯，100%● 资本金：240 亿日元（截至 2022 年 6 月 30 日）● 员工人数（全球）：约 4,000 人奥林巴斯将继续支持 Evident 的业务转让。展望未来，奥林巴斯将专注于医疗领域，不断努力使人们的生活更健康、更安全、更充实。显然，以科学精神为指导，以创新为核心，将继续提供和扩展其在生命科学和工业应用领域的服务和工作流程解决方案。附：奥林巴斯科学解决方案业务财务数据财年截止2022年3月31日营收119.05亿日元营业利润175.26亿日元转让股份数量、转让价格、转让前后持股比例在转让之前持股数量100股(持股比例:100.0%)转移股份数目100股售价4276.74亿日元转让后持有的股份数量的变化0股出售价格等于转让日的股权价值。 转让时间表董事会会议董事决议日期2022年8月29日协议完成日期2022年8月29日转移生效日期2023年1月4日（注）(注)本次转让受特定条件的约束，包括贝恩资本根据日本和其他相关司法管辖区的竞争法和相关法律法规获得相关部门的批准，转让日期可能会根据过程进行修改。

近日，世界卫生组织下属国际癌症研究机构（IARC）宣布了一则重磅消息，无糖饮食中常用的代糖——阿斯巴甜被正式列为2B类致癌物阿斯巴甜究竟是什么？ 自20世纪80年代起，阿斯巴甜就广泛用于各种食品和工业，作为一种人造甜味剂，它的甜度大约是糖的200倍，且1克阿斯巴甜仅产生约4卡路里的热量。在世界卫生组织建议限制糖类摄入后，阿斯巴甜更是以“代糖”的身份广泛出现在消费市场，市面上常见零度可乐、无糖饮料、糖果、调制酒、酸奶、蛋糕等日常食品饮料都有着阿斯巴甜的身影。阿斯巴甜由苯丙胺酸及天冬胺酸这两种胺基酸所合成，含有50%苯丙氨酸、40%天门冬胺酸、10%甲醇。除了提供甜味外，阿斯巴甜中的苯丙氨酸是人体必需的且不能自身合成的氨基酸之一，它在人体内能合成重要的神经递质与激素，对人体有许多作用，例如可以令情绪变得高昂，消除抑郁情绪，降低饥饿感等等。但阿斯巴甜也并非适合所有人食用，如孕妇、婴幼儿、苯丙酮尿症患者就必须避免食用阿斯巴甜，以免对身体产生健康危害。被列为致癌物，和“无糖”饮食说再见？IARC大致将致癌性分为5个等级，包括1类（有确认致癌性）、2A类（很可能有致癌性）、2B类（有可能致癌）、3类（尚不能确定是否致癌）、4类（基本无致癌作用）。2A和2B的界定类似但又有区别：2A类致癌物是对人很可能致癌，此类致癌物对人的致癌性证据有限，对实验动物致癌性证据充分。2B类致癌物则是对人可能致癌，此类致癌物对人致癌性证据有限，对实验动物致癌性证据并不充分，或对人类致癌性证据不足，对实验动物致癌性证据充分。阿斯巴甜此次被列为致癌物的分类处于2B类——可能对人类有致癌性但缺乏充分科学证据。其分类低于日常接触频率更多的食用红肉、烟酒槟榔等。粮食及农业组织食品添加剂联合专家委员会（JECFA）认为，评估的数据表明没有足够的理由改变先前确定的阿斯巴甜每日可接受摄入量（ADI）0-40 毫克/公斤体重。因此，委员会重申，一个人每天的摄入量在这个限度内是安全的。例如，假设没有从其他食物来源摄入，一罐含有 200 或 300 毫克阿斯巴甜的无糖软饮料，一个体重 70 公斤的成年人每天需要消耗 9-14 罐以上才能超过可接受的每日摄入量。IARC的 Mary Schubauer-Berigan 博士表示，“在人类和动物中致癌证据有限，如何致癌的机制证据同样有限，需要更多的研究来完善对食用阿斯巴甜是否构成致癌危害的理解。”同样，我国对食品安全有着严格的国家标准，对阿斯巴甜的使用范围、最大使用量等进行严格规范管理。依据的《食品添加剂使用标准》（GB2760），在食品添加剂批准使用前都会经过一系列严格的程序，保证其安全性和工艺必要性。国家食品安全风险评估中心联合国家癌症中心结合JECFA最新评估结果和我国居民消费情况进行安全性评估，阿斯巴甜按照我国现行标准规范使用可以保障安全。捍卫食品安全标准，海岸鸿蒙提供优质解决方案食品安全是保障人类健康和生命安全的基础，关系到每位公民的生活，因此确保食品安全是一个国家的重要任务，是相关企业应尽的责任义务。海岸鸿蒙深耕标准物质领域27年，拥有一系列食品检测用标准物质，助力检测检验机构的工作，共同捍卫食品安全标准。编号名称质量浓度介质规格标准值BW0826阿斯巴甜溶液标准物质1000μg/mLH2O5mLBW0777纽甜溶液标准物质1000μg/mLH2O5mLGBW(E)100166食品甜味剂糖精钠溶液标准物质10.0mg/mLH2O10mlGBW(E)100171食品甜味剂乙酰磺胺酸钾溶液标准物质10.0mg/mLH2O5mLGBW(E)100172食品甜味剂乙酰磺胺酸钾、糖精钠溶液标准物质10.0mg/mLH2O5mLGBW(E)100173食品甜味剂环己基氨基磺酸钠（甜蜜素）溶液标准物质10.00mg/mLH2O5mLBW0815苯甲酸、山梨酸、糖精钠、安赛蜜混合溶液标准物质100μg/mLH2O10ml

陷入丑闻的日本奥林巴斯表示，两月前被辞退的前CEO伍德福德也是公司新CEO的候选人之一。 　　综合媒体12月15日报道，日本陷入财务丑闻的奥林巴斯公司(Olympus Corp)15日表示，将会考虑重新聘请两月前被辞退的英国籍首席执行官伍德福德(Michael Woodford)，而正是后者揭开了奥林巴斯财务作假丑闻的序幕。 　　伍德福德的回归奥林巴斯现在董事会戏剧性的屈服，正是他们在10月份一致决定辞退伍德福德。之前他曾对公司的账务提出质疑，随后公司承认曾隐瞒亏损17亿美元。 　　奥林巴斯总裁高山修一(Shuichi Takayama)在讨论董事会选择新CEO的问题时告诉记者说：“关于伍德福德先生的问题，他肯定也是选择之一。” 　　但是外界依然严重怀疑伍德福德能够战胜其他候选人，重新担任CEO一职。 　　在伍德福德离开之后，又有几名高管辞职，高山现在是公司最资深的高管，他表示，他没有与伍德福德会晤的计划。一些日本大股东和债权人私下里对伍德福德持表示反对。 　　高山曾表示，他与几名董事将很快辞职，为股东将在3月和4月会议选举的全新董事会让位，而董事会希望在退出之前选定继任者。 　　但是伍德福德曾指责现在的董事会完全缺乏公信力，称它没有权利选择继任者。他正在为新董事会组建自己候选团队，并且将提名自己为CEO，此举被认为是要控制住奥林巴斯。 　　高山在15日还表示，现在一些董事可能不会辞职。到目前为止，只有几名董事已经辞职，包括前董事长和内部审计主管。 　　他说：“那些对不当行为没有责任的没有必要辞职。” 　　奥林巴斯下一任CEO和董事会面临很多重大挑战，首先需要修复曾经令人骄傲的资产负债表。根据14日的信息披露，资产状况比之前假报告中披露的少了11亿美元。 　　在14日修正报表公布之后，奥林巴斯股价大跌月20%，投资者现在担忧公司可鞥需要合并、出售资产或融资。 　　高山15日表示，公司正考虑资本与经营联姻，还包括其它方案，以缓解资产负债表压力。 　　奥林巴斯预测相机业务将在当前财年出现亏损，但是称销售量在9月截止半年里同比增加15%。 　　奥林巴斯主要利润来自于内窥镜业务，公司在周三最后期限前补交了二季度财报，成功避免从东京证交所(Tokyo Stock Exchange)自动摘牌，使投资者的担忧有所缓解。 　　但是如果东京证交所认为公司财务欺诈情况严重，仍可能要求将这家拥有92年历史的公司摘牌。

近日，世界卫生组织(WHO)正积极推进于巴西的巴西利亚召开的第35届年度国际药物监测计划会议。该计划的目的是加强世界的药物警戒行动以确保药物市场的安全及有效性。本次会议将由巴西国家卫生监督局(Anvisa)全力支持，并已于2012年11月12日召开。 　　世界卫生组织于2001年接受巴西参加该项计划。这是巴西首次承办这项会议。此次第35届会议是加强拉丁美洲和加勒比海地区药物警戒行动的一次重要机会。在区域内创建一个独特而有效的后市场监测体系将是与会者讨论的一项重要议题。 　　Anvisa主席Dirceu Barbano以及泛美卫生组织(PAHO)代表Joaquín Molina出席会议开幕式。会议持续到14号，来自加拿大、美国、日本、中国、意大利和阿根廷等59个国家的代表参加了该次会议。 　　据悉，在过去的三十年内，WHO国际药物监测计划的国家成员每年举行一次会议。大多数的会议在欧洲和亚洲举办。这类会议是讨论药物安全的一个重要论坛，由位于瑞典乌普萨拉的WHO国际药物监测协作中心进行协调。

企业高管陈尸儿童乐园 　　2月20日上午，印度新德里郊区的卫星城古尔冈，园林工人兰姆库玛来到社区，开始上班。这个由豪华高层公寓楼组成的社区居住着众多外企主管。八点三十分左右，库玛准备对灌木进行修剪。就在此时，园区围墙处的一个人影引起了他的注意。库玛定睛一看，那竟是一具挂在铁栅栏上的尸体! 　　不久，警车呼啸而至。死者的身份很快被确认——奥林巴斯印度分公司医疗系统部主管大森都富。年仅48岁、家庭美满、身居知名跨国公司高层……有着令人羡慕生活的大森都富为何如此结束自己的生命? 　　据日本大使馆一名官员透露，大森在过去两年一直远离家人单独生活在新德里。他的一位同事表示，在最近两个星期里，大森一直情绪低落。在调查过程中，印度警方发现了死者留下的两份遗书。其中一封是留给家人的，由于是用日语写成，警方对其确切内容还不得而知。而另一封用英语写的遗书写道：“我为造成的麻烦感到羞愧，对不起大家!”短短的一句话引发了外界的众多揣测。 　　目前，全球领先的精密光学仪器制造商——奥林巴斯正深陷造假丑闻，涉案金额高达17亿美元。 　　就在大森都富死前不到一个星期，日本东京地方检察厅特搜部刚刚于16日以违反《金融商品交易法》逮捕了奥林巴斯前董事长菊川刚、前常务监事山田秀雄及前副总裁森久志。而大森之死无疑让外界再次将目光投向这一号称“日本安然案”的世纪大案。 　　史上任期最短的CEO 　　2011年10月14日，奥林巴斯董事会以“独断专行”、“长期不在日本”等理由，开除了上任仅两周的原CEO——英国人迈克尔?伍德福德，此举最终导致造假丑闻曝光。 　　2011年10月1日，英国人伍德福德正式成为日本企业历史上首位非日籍CEO。此前，伍德福德已在奥林巴斯欧洲分公司工作了30年。担任高管期间，他成功地使公司扭亏为盈。 　　刚刚上任的伍德福德希望通过削减成本来扭转公司业务。然而，他的第一把火，却让自己身陷风险。2011年7月，一家名为《FACTA》的日本小众月刊杂志登出报道，声称奥林巴斯于2008年以约22亿美元的价钱收购伦敦上市医疗器械公司塞勒斯集团，并向两家咨询公司支付了接近并购额三分之一、高达6.87亿美元的费用。更为蹊跷的是，其中一家名为“AXAM投资”的公司由于未缴纳执照费，已于2010年6月注销。在知晓此事后，伍德福德向前CEO、时任董事长菊川刚等董事会成员以及负责财务的下属打听此事，却屡被搪塞。无奈之下，他开始委托普华永道暗中调查。 　　调查结果显示，作为咨询费的一部分，AXAM投资于2008年9月30日获得了票面价值为1.77亿美元的塞勒斯优先股。仅仅2个月后，奥林巴斯便同意斥资5.57亿美元从该公司手中买下这些股票。双方随后又展开谈判，希望进一步上调交易额。奥林巴斯最终于2010年3月花费6.2亿美元买下这些股份。而塞勒斯早已于2008年1月30日摘牌。奥林巴斯并未就上调费用的问题咨询过外部法律顾问，董事会也没有正式通过第二份协议。而在塞勒斯集团发行股票时，1985年版的《公司法》已明文规定，通过股权进行财务援助属非法行为。此外，调查显示，奥林巴斯还于2006至2008年间花费约7.73亿美元收购3家私有公司，却在事后将这些并购的价值减记了5.86亿美元。伍德福德称，这些公司主要制作面霜和塑料制品，与奥林巴斯的主业几乎毫无关系。 　　正是这一调查，断送了伍德福德的CEO之路。在拿到普华永道报告的10月12日当晚，伍德福德交给董事长菊川刚一份复印件，同时要求其辞职。为了施压，伍德福德还表示，已向其他董事分别提供了英文和日文版的报告。13日晚，他接到通知，公司总部将于14日上午召开临时董事会会议。此时的伍德福德天真地认为，自己发起公司管理层变革已经收到成效。然而，当他第二天兴致勃勃地来到会场时，却发现气氛不对。极为守时的董事长菊川刚迟到了7分钟。而菊川刚一进办公室，就用日文对董事会成员宣布，CEO伍德福德因“与公司利益存在冲突”，在会议上禁止发言。10分钟后，会议以罢免伍德福德职务的结果结束。这位日企首位非日籍CEO同时也创下了另一项纪录——史上在位时间最短的CEO。 　　失控的局面 　　然而，真正的风暴才刚刚开始。CEO的被炒不但导致股东纷纷要求菊川刚就塞勒斯并购案中的巨额咨询费用做出解释，还致使奥林巴斯股价疯狂下跌。自罢免伍德福德当天开始，奥林巴斯在7个交易日中股票累计下跌56%，市值蒸发45亿美元。与此同时，东京警视厅、日本证券交易监察委员会、英国重大欺诈案件调查局、美国联邦调查局及美国司法部先后介入调查。 　　面对逐渐失控的局面，2011年11月8日，在130余名记者面前，奥林巴斯新任CEO高山修一鞠躬九十度向投资人致歉。奥林巴斯首次承认在财务方面存在“非常不恰当的”行为，并把主要责任推在前董事长兼总裁菊川刚、负责财务的副总裁森久志、审计师山田秀雄这三个人身上。此时，持续下跌的奥林巴斯公司股价已在短短一个多月的时间内跌去近3/4，市值缩水额最高时超过70亿美元。 　　随着调查的深入，一个时间跨度长达20年之久的“假账门”事件正逐渐清晰。上世纪80年代，日本经济进入泡沫期，股市行情一片大好。同大多数日本公司一样，奥林巴斯也把主营业务之外的闲散资金投向一路飙升的股市。但到了九十年代初，泡沫破裂，股市跳水，奥林巴斯所购的有价证券等金融商品出现了大幅贬值。据估算，公司当时的总资产不过1300亿至1900亿日元(约17至24亿美元)。这千亿日元规模的损失一旦曝光，将严重影响其自有资本，管理层还将被问责。于是，公司高层决定隐瞒不报，并开始不断造假，通过并购等方式，将投资亏损转移至账外。 　　首先，奥林巴斯通过海外子公司将资金转移到貌似毫无关联的投资基金，再由投资基金以原价购回已经出现亏损的有价证券或金融商品，从而把账做平。这与安然公司的暗箱操作方法如出一辙。 　　据报道，奥林巴斯黑洞交易中的大约2000亿日元有可能流向了黑社会集团。这一次丑闻的爆发，不仅动摇了外界对整体日本企业的投资信心，也让这家有着92年历史和4万名职工，在全球医用内窥镜领域占据垄断地位的日本光学器材公司前景堪忧。目前，此次印度公司高管自杀事件已表明，危机正从总部向分公司蔓延。或许，另一个安然帝国就要轰然倒塌。

喹噁啉类药物的危害及检测目的喹噁啉类药物是一类化学合成类的抗菌促生长剂，它们的基本结构是喹噁啉-1,4-二氧化物，即喹噁啉环。主要包括喹乙醇、卡巴氧、喹喔啉、喹赛多、喹多辛、西诺喹多、德那资多（肼多司）、乙酰甲喹和喹烯酮等药物。研究表明，喹噁啉类药物对DNA致突变、致损伤，破坏细胞抗氧化作用系统，可以引起细胞自由基的产生，导致细胞DNA发生氧化性损伤，还会引起细胞周期阻滞和细胞凋亡。传统喹噁啉类药物喹乙醇和卡巴氧，由于其对人体危害最/大，世界各国和国际组织对这两种兽药制定了严格的残留限量规定。欧盟1998年发文禁止喹乙醇和卡巴氧在食品动物生产中作为促生长添加剂使用。2020年我国生效实施的GB 31650-2019《食品安全国家标准食品中兽药zui/大残留限量》中规定了猪肌肉和猪肝脏组织中喹乙醇残留标志物的zui/大残留限量。同年我国农业农村部公告第250号规定卡巴氧及其盐、酯为食品动物中禁止使用的药品。但是，这些药物在生产实践中被大量地非法使用或滥用，其残留对消费者健康造成了巨大的潜在威胁。喹乙醇和卡巴氧进入动物体内后，能够在短时间内代谢成十多种产物，研究表明，3-甲基-喹噁啉-2-羧酸（MQCA）是喹乙醇在动物体内代谢后的主要产物，喹噁啉-2-羧酸（QCA）是卡巴氧在动物体内代谢后的主要产物，且该产物在动物体内滞留时间较长，因其含量与总残留关系稳定，所以将MQCA定为喹乙醇在动物体内代谢的残留标示物，将QCA定为卡巴氧在动物体内代谢的残留标示物。本文阐述了如何将卡巴氧、喹乙醇及代谢物从样品基质中分离提取出来，并经过净化后，转化成液质联用仪可以检测的形式。以提取、净化为重点，依据国标GB/T 20746-2006，为检测人员和相关领域研究人员提供一定的参考。检测项目：卡巴氧、脱氧卡巴氧、喹噁啉-2-羧酸（QCA）、3-甲基-喹噁啉-2-羧酸（MQCA）应用范围：牛、猪肝脏和肌肉液相色谱-串联质谱法方法原理：卡巴氧：用乙腈+乙酸乙酯（1+1）溶液提取肌肉和肝脏组织中的卡巴氧，提取液经正己烷脱脂后，旋转蒸发至干，残渣用甲酸（0.1 %）+甲醇（19+1）溶液溶解。样液供液质测定，内标法定量。脱氧卡巴氧、QCA、MQCA：用甲酸溶液消化试样，使组织中天然存在的酶失活，然后加入蛋白酶水解，盐酸酸化，离心过滤后，过Oasis MAX固相萃取柱或相当者净化。先用二氯甲烷洗脱脱氧卡巴氧，再用2 %甲酸乙酸乙酯溶液洗脱QCA和MQCA，氮气吹干洗脱液，残渣用甲酸+甲醇（19+1）溶液溶解，样液供液质测定，内标法定量。 前处理仪器：固相萃取装置；氮气浓缩仪；液体混匀器；分析天平（感量0.1 mg和0.01 g）；真空泵；均质器；移液器（10 μL～100 μL和100 μL～1000 μL）；聚丙烯离心管（50 mL具塞）；pH计（测量精度±0.02 pH单位）；低温离心机（可制冷到4 ℃）；玻璃离心管（15 mL）。检测仪器：HPLC-MS/MS+ESI源试样制备与保存将牛、猪肝脏和肌肉组织样品充分搅碎，均质，分出0.5 kg作为试样，置于清洁样品容器中，密封，并做上标记。将制备好的试样于-18 ℃以下保存。前处理方法1. 卡巴氧的前处理步骤称取5 g试样（精确至0.01 g），置于50 mL聚丙烯离心管中，加入5 g中性氧化铝，加入25 mL乙腈+乙酸乙酯（1+1）溶液，于液体混匀器上充分混合5 min，以5000 r/min离心5 min，将上清液移取至另一干净的50 mL离心管，加入10 mL正己烷到管中，振荡2 min，以5000 r/min离心5 min，弃去上层正己烷，将下层清液转移至150 mL鸡心瓶中。加入25 mL乙腈+乙酸乙酯（1+1）溶液，重复提取一次，正己烷除脂后合并两次提取液于同一鸡心瓶中，加入一定量的喹噁啉-2-羧酸-d4（QCA-d4）标准溶液，使其浓度为2.0 ng/g，40 ℃水浴减压旋转蒸发至干。准确加入1.0 mL 0.1 %甲酸-甲醇（19+1）溶液溶解残渣，过0.2 μm滤膜后，供液质测定。2. 脱氧卡巴氧、喹噁啉-2-羧酸、3-甲基-喹噁啉-2-羧酸的前处理步骤称取5 g试样（精确至0.01 g），置于50 mL聚丙烯离心管中，加入10 mL 0.6 %甲酸溶液，混匀后，置于（47±3）℃振荡水浴中振摇1 h；先加入3 mL1.0 mol/LTris溶液混匀，再加入0.3 mL 0.01 g/mL蛋白酶水溶液，充分混匀后，置于（47±3）℃振荡水浴中酶解16 h～18 h。加入20 mL 0.3 mol/L盐酸溶液，振荡5 min，在10 ℃以5000 r/min离心15 min，上清液过滤。将滤液移入Oasis MAX固相萃取柱（3 mL甲醇和3 mL水活化）中，待样液全部流出后，用30 mL 0.05 mol/L乙酸钠-甲醇（19+1）溶液淋洗固相萃取柱，真空抽干15 min。在一支干净的玻璃管内加入一定量的喹噁啉-2-羧酸-d4（QCA-d4）标准溶液，使其浓度为2.0 ng/g，再用4×3 mL二氯甲烷将脱氧卡巴氧洗脱至管内，在45 ℃用氮气浓缩仪吹干。固相萃取柱再用3×3 mL甲醇、3 mL水、3×3 mL 0.1 mol/L盐酸溶液和2×3 mL甲醇-水（1+4）溶液分别淋洗，真空抽干15 min，然后用2 mL乙酸乙酯再淋洗固相萃取柱，弃去全部淋出液，最后用3 mL 2 %甲酸乙酸乙酯溶液洗脱喹噁啉-2-羧酸（QCA）和3-甲基-喹噁啉-2-羧酸（MQCA）到上述吹干的试管中，在45 ℃用氮气浓缩仪吹干。准确加入1.0 mL 0.1 %甲酸-甲醇（1.标准物质分别用甲醇配制成100 m-d4）同位素内标进行回收率的校正，也可以配合使用各个化合物相对应的同位素内标。

背景介绍近年来，肿瘤发病率逐年上升，推动了相关疗法药品的研发。从全球销售排名前列的药物来看，抗体药物在市场中占据重要份额，其在肿瘤治疗市场的需求日益上涨。同时，抗体偶联药物（ADC）因其在精准癌症治疗方面的巨大潜力，备受关注。Protein A亲和层析作为抗体药物纯化的核心工艺步骤，在抗体药物生产中扮演着至关重要的角色。随着生物制药上游工艺的优化，表达量不断提升，对下游纯化工艺提出了更高的要求。传统的Protein A亲和层析填料虽然性能稳定，但在处理高表达量的抗体类纯化时，效率和经济性方面仍存在不足。为了更好地满足行业发展的需求，并助力生产工艺的降本增效，博格隆推出了新一代重组耐碱Protein A亲和层析介质——AT Protein A Diamond Ultra。新品介绍AT Protein A Diamond Ultra亲和层析介质是将重组耐碱的Protein A配基偶联到高刚性琼脂糖基架上的新一代Protein A亲和层析介质，适用于单抗、双抗、多抗和Fc融合蛋白类生物大分子的分离纯化。与前一代AT Protein A Diamond Plus相比，AT Protein A Diamond Ultra具有高动态结合载量（≥75mg 人IgG/mL介质）。AT Protein A Diamond Ultra亲和层析介质能够满足从实验室到工业化大规模生产的各种需求。Table 1.AT Protein A Diamond Ultra 与AT Protein A Diamond Plus技术参数对比+颗粒大小呈正态分布，D50值对应的粒度代表小于此粒度的颗粒体积之和与大于此粒度的颗粒体积之和相同。++动态结合载量为3mg/mL的静脉注射用人IgG在PBS缓冲液中，接触时间为6min时的10%动态结合载量。AT Protein A Diamond Ultra的优势载量高，耐碱性好：有效减少介质的使用量，延长介质寿命，降低生产成本。反压低，流速快：优越的压力流速表现，有效提高生产效率，更适合工业化大规模生产。批间一致性稳定： 稳健的工艺流程，确保产品质量稳定和生产稳步进行。载量高、耐碱性好AT Protein A Diamond Ultra亲和层析介质采用优化后的Protein A配基密度，使其具有高动态结合载量；经过重组耐碱改造的Protein A配基，也赋予了层析介质良好的耐碱性，可耐受0.1~0.5M NaOH。以人IgG抗体为例，使用0.1M NaOH浸泡温度23℃进行浸泡处理，每间隔20h进行一次10%DBC测试，共累积浸泡160h。结果显示（见Fig. 1），AT Protein A Diamond Ultra亲和层析介质的起始10%DBC高达75mg/mL，在0.1M NaOH浸泡140h后，动态结合载量仍保持80%以上的初始载量水平。AT Protein A Diamond Ultra亲和层析介质的高载量和良好的耐碱性，可以有效减少生产中的介质使用量并提高介质使用次数，从而有效地降低生产成本，提高生产效率。Fig. 1 0.1M NaOH碱处理的介质10%DBC数据层析柱：EzScreen 4.6mL；样品：人IgG；保留时间：6min层析柱柱效：泡碱测试前As1.09/7106；泡碱160h后As1.15/7041反压低、流速快AT Protein A Diamond Ultra亲和层析介质采用高刚性的琼脂糖基架，具有优异的机械性能，在宽泛的线性流速范围内可以保持良好的压力流速性能，具有反压低、流速快的特点。如Fig. 2所示，在600mm*26cm装柱规格下，使用1M NaCl作为流动相进行测试，当线性流速为360cm/h时，柱前压仅为2.183bar。AT Protein A Diamond Ultra亲和层析介质优越的压力流速性能和柱床稳定性，有利于亲和层析的工业化放大生产，提高抗体和Fc融合蛋白的生产纯化效率，减少设备投入和工艺耗时，降低生产成本。Fig. 2 AT Protein A Diamond Ultra层析介质压力流速曲线（流动相1M NaCl）层析柱直径：600mm；柱床高度：26cm批间一致性稳定通过10%DBC测试和抗体纯化重复实验对AT Protein A Diamond Ultra亲和层析介质的批间一致性进行检测。Fig. 3 介质批间一致性测试（10%DBC）样品：人IgG；保留时间：6minFig. 4 不同批次介质纯化结果比较层析柱规格：EzScreen 4.6mL；样品：mAb IgG2；保留时间：6min；上样载量：58mg/mL结果显示，AT Protein A Diamond Ultra亲和层析介质具有稳定的批间一致性，为生产工艺的稳健保驾护航。总结AT Protein A Diamond Ultra具有载量高、耐碱性好，反压低、流速快，批间一致性稳定等综合优势，其问世将进一步提升抗体药物纯化的效率，助力制药企业提升生产效率。订购及试用申请更多产品信息请联系当地技术支持或客户经理。

导读 在全球和中国医药市场上，抗体药物已连续多年占据销售榜单前几位。当前，随着国家医改政策的改革和完善，国际、国内市场打通，抗体市场也开始进入“你方唱罢我登场”群雄逐鹿的竞争阶段，生产企业如何在确保产品质量的基础上，通过改进工艺，来降低成本、提高生产效率和市场竞争力？江博士文章给读者提供了一条切实可行的思路和方法，请看“如何突破抗体生产瓶颈”。抗体药物市场及发展趋势 全球生物制药产业发展迅猛，根据frost&sullivan市场调研，2018年全球生物制药市场规模约为2642亿美元。单抗类药物由于特异性好，靶向性高，副作用小，疗效显著成为发展最快的一类生物药。单抗药物在全球生物药中所占市场份额超过50%，达到1353亿美金。 中国巨大的市场潜力，国际重磅抗体药专利到期，大量的海归人才回流及中国日益强大的资本助力，都为中国抗体制药发展提供了前所未有的历史机遇。但是中国抗体制药企业也面临巨大的挑战。首先中国药企无论是技术、规模、经验，人才还是资金，跟国际生物制药巨头相比，都有着较大的差距。其次中国加入ich和国际药监管体系接轨，降低药品进口关税，对进口抗癌药物实施零关税等系列政策，降低了国外原研药进入中国市场的门槛，给中国生物药企业带来了巨大压力和挑战。另外，越来越多的制药企业进入抗体药的开发领域，每个重磅抗体药物基本上都有几十家企业在仿制研发申报，因此国内抗体药企不仅要面临国外原研药巨头的打压，还要面对国内众多同行及印度廉价药企业激烈的竞争。最后带量采购新政允许通过一致性评价的仿制药与原研药可以一起同台竞标，低价中标，消除了销售渠道的壁垒使得国内外生物药企的竞争回归到技术创新，产品质量和成本的竞争。 因此国内生物药企是否能在激烈的竞争中取得优势取决于其生产工艺的先进性，因为制药工艺水平决定了产品的质量和成本。抗体药物的生产工艺进展 抗体药物生产是个非常复杂的过程，大致分为上游的发酵及下游的分离纯化：上游工艺主要包括细胞复苏、传代、发酵生产。而下游工艺主要包括膜过滤及多步层析分离纯化。过去十多年来，基因工程获得突飞猛进的进步，细胞培养的表达量从原来的不到0.5 g/l 到现在普遍达到5g/l，有的甚至超过10g/l。这些进步是由细胞表达载体的开发，克隆筛选以及细胞培养基优化等技术创新所驱动的。由于发酵产率的大幅度提升，使得上游细胞培养成本大幅度降低（表1）。表1 表达量与抗体生产成本关系与上游十多倍生产效率提升相比，下游分离纯化技术进步明显滞后，导致下游工序成为生产瓶颈，抗体主要生产成本也转移到下游。下游工艺在整个生物制药生产中占据60%以上生产成本，也被认为是最需要改进的技术领域。下游工艺先进性决定了药品的质量，及药品生产效率和成本，也成为生物制药企业的核心竞争力所在。生物制药下游生产工艺目的就是把目标药物分子从复杂发酵液体系中分离出来以满足药品纯度及质量的需求。一方面监管部门对生物药的纯度和质量要求越来越高，另一方面生物分子具有结构复杂，且对外部条件敏感，稳定性差，杂质多，浓度低等特点，使得生物药分离纯化的挑战更大。比如说治疗用抗体不仅对含量有严格的要求，还必须去除各种潜在的杂质如宿主hcp, dna，endotoxin, 抗体聚集体及降解片段等（表2）。表2 抗体药物对各种杂质的要求 层析技术具有分离纯化效率高，条件温和且容易保持目标分子的生物活性，因此成为生物制药分离纯化最主要工具。但下游层析分离纯化技术牵涉到材料、生物、化学及设备等交叉技术领域。因此研究下游分离纯化技术的人才较少，另外上游基因工程技术几乎在所有高校都有专业研究团队，而且培养了大量的人才，而下游分离纯化技术却很少在高校有专门研究，也缺乏相关的专业课程来培养分离纯化的人才。过去10多年上游基因工程的迅猛发展虽然带来上游发酵成本的大幅度下降，但下游分离纯化技术进步缓慢使其成本居高不下。因此要降低抗体生产成本关键就是要解决下游分离纯化的瓶颈问题。 抗体的层析分离步骤基本都可以采用标准化的三步曲：第一步用protein a介质进行抗体捕获和浓缩；第二步用离子交换进行中间纯化以去除多聚体，宿主蛋白等杂质；第三步是精纯去除剩余dna，endotoxin,protein a 等微量杂质。在这三步抗体的分离纯化过程中，第一步的protein a亲和捕获占据分离纯化成本80%以上，也是下游分离纯化的瓶颈所在。亲和层析之所以成本高的主要原因：首先是protein a 价格昂贵，其价格是普通层析介质十几倍；第二，protein a使用寿命短，一般离子交换填料使用寿命多达1000次，而亲和填料寿命通常在100-200次；第三，protein a 用于抗体的捕获和浓缩，需要处理大体积的发酵液，而亲和步骤载量往往又低于阴阳离子交换层析，使得亲和层析介质使用量比中间纯化或精纯的要多得多。因此，要降低抗体的生产成本，解决抗体的生产瓶颈关键在于改进第一步protein a 亲和捕获。 下游分离纯化核心的工艺流程 protein a 亲和层析是利用protein a 配基与目标抗体具有专一亲和吸附作用从而达到分离纯化抗体的目的。野生型protein a蛋白是金黄色葡萄球菌细胞壁锚钉蛋白。三维空间上，抗体fc端ch2-ch3区域与protein a蛋白b结构域上两条反相平行的α螺旋结构相互结合。因此protein a与抗体分子特别是与igg1、igg2、igg4有特异性结合，使得抗体分子与发酵液中不具fc端结构的杂质如宿主蛋白与核酸等有效分离，进而达到纯化目的。protein a 亲和层析介质是通过把proteina 配基偶联到微球介质上制备而成的。因为protein a配基与目标抗体的作用的专一性，因此亲和层析的分离纯化工艺和方法与抗体样品杂质含量和种类多少影响不大，使用protein a 介质一步纯化目标抗体就可以达到95%以上纯度，回收率达到90%以上。亲和纯化效率也基本不受杂质多少影响，而其它分离模式如离子交换，疏水，分子筛等的分离工艺方法及效率大多取决于与目的蛋白同时存在的杂质种类和含量。因此，只要样品杂质不同，即使是纯化同样的目标生物分子，采用的分离工艺和方法就不同。以重组胰岛素分离纯化为例，不同厂家虽然生产的是同一目标胰岛素，但采用分离纯化方法完全不一样，主要原因就是每家生产的胰岛素杂质组成和含量不一样，因此需要不同的纯化工艺。而比胰岛素分子量更大，结构更复杂的抗体基本可以采用标准化的三步曲，主要原因就是protein a 亲和介质的出现大大简化抗体的分离纯化工艺，但protein a 价格昂贵让抗体生产厂家爱恨交加。 protein a 介质价格高的主要原因是其生产工艺复杂，proteina 配基是通过生物发酵生产的，经过纯化后偶联到介质上成为protein a 亲和介质，因此生产成本远高于传统的离子交换、疏水、分子筛等介质。另一方面protein a产品主要由欧美几家供应商垄断，也是价格居高不下的原因之一。为了降低抗体生产成本，不少研究工作者在寻找可以取代protein a且价格低廉的新型层析介质来纯化抗体，虽然可能在一些个案中获得成功，但都无法撼动protein a 在整个抗体分离纯化的垄断地位。proteina 亲和层析成为过去近30年里抗体纯化捕获的金标准。因此要降低抗体亲和层析这一步的成本首要的方案是实现protein a 介质的国产化以降低产品价格；其次是通过采用创新的连续层析工艺技术或其它新工艺以提高protein a 介质的利用率并提高抗体生产效率。当然不断改进protein a 介质性能使其具有更高的载量和更长的使用寿命也可以降低抗体的生产成本。 protein a 介质国产化创新之路 目前市场上主流protein a产品是ge生产的以琼脂糖为基质的产品，也是最早商业化的产品。琼脂糖为基质的protein a 介质具有载量高，亲水性能好，非特异性吸附低等优点，但琼脂糖介质天然缺陷是机械强度差，因此也被称为软胶。由于该介质耐压性能差，生产中需要降低柱高、减小流速以防止压力过高造成柱床塌陷，限制了抗体批处理量及抗体生产效率。软胶protein a 另外一个缺陷是传质速度慢，主要原因是软胶孔径较小，排阻大。因此软胶protein a 都需要驻保留时间长，流速慢条件下，抗体吸附载量才会比较高，但在高流速下动态载量下降的非常快。因此一个理想的抗体纯化用protein a 介质需要具有高流速，高载量，高机械强度，及更长的使用寿命等特点。protein a 介质载量是由微球孔径，比表面积，配基密度来决定的；机械强度则是由proteina基球材料化学组成，交联度及孔隙率来决定的；protein a 配基脱落及使用寿命主要由配基，基球性能及偶联方式来决定。实现高性能protein a 亲和介质的国产化需要从底层创新开始。抗体结构示意图创新之一：单分散基球替代多分散基球 层析介质粒径大小和粒径分布是影响层析分离的重要参数。粒径分布越均匀，装柱越容易、柱床越稳定、柱效越高、流速越均匀、洗脱越集中、分离效率越高、流动相用量越少，柱与柱重复性也越好；protein a 介质被誉为层析介质皇冠上的明珠，价格昂贵，可是市场上protein a 介质都是采用粒径分布较宽的基球。主要原因是单分散微球制备技术难度极大，世界上可以规模生产的单分散多孔微球只有dynal公司一家，ge销售的source 系列单分散聚苯乙烯色谱填料就是dynal生产的。但source 产品的粒径最大只有30微米，不能满足protein a 介质对粒径一般要大于40微米的要求。纳微经过多年的努力开发出世界领先的微球精准制备技术，突破大单分散大粒径多孔微球的制备难题，成为全球第一家生产单分散protein a 亲和层析介质的公司。纳微单分散protein a介质与传统软胶基质微观结构对比传统多分散protein a亲和软胶与unimab液流路径对比示意图 创新之二：通透大孔径基球微替代小孔微球 protein a 基球孔径大小会影响生物分子在介质的传质速度和有效载量，孔径越大，分子传质速度越快，在高流速下具有高载量。基于软胶基质的ge protein a亲和介质孔径较小，比表面积高，其静态吸附载量高，但传质阻力大，在驻留时间短，流速快的条件下，动态载量下降的很快。纳微经过优化筛选，专门设计的大孔结构基球，其孔径达到ge protein a 介质的一倍左右。因此该介质传质速度快，使得介质在高流速下具有高载量。从实验测试数据可以看到，纳微unimab与ge mabselectsure在驻留时间大于4分钟时，载量都差不多，当驻留时间小于2分钟时unimab的载量比mabselectsure载量高50%以上, 而且速度越快unimab载量优势越明显。抗体生产效率是由动态载量和流速共同决定，流速越快载量越高，生产效率越高，成本越低，但亲和层析介质的动态载量与流速成反比，流速越快，载量越低，因此对于每个protein a亲和介质纯化抗体效率都会随着流速升高效率逐步提高，到了一个最优的流速后，如果继续增加流速，纯化效率反而降低。林东强教授实验证明对于批次亲和层析，驻留时间是2分钟时生产效率达到最高，而驻留时间在2分钟条件，unimab的动态载量比mabselectsure 高50%以上。对于连续层析驻留时间是1分钟时生产效率最高，而这个保留时间，unimab的动态载量更是mabselectsure一倍以上。另外从抗体流穿曲线对比图也可以看出具有大孔结构及高度粒径均匀性的单分散protein a亲和层析介质与多分散软胶porteina 介质相比具有更陡的穿透曲线，说明纳微单分散层析介质具有更畅通的孔道结构，分子扩散速度快，抗体流穿少，回收率高。因此利用纳微大孔结构微球不仅可以提高分子传质速度，提高抗体生产效率，降低成本，而且在连续层析中，具有更明显的优势。unimab与mabselectsure产品不同驻留时间动态载量对比不同protein a 层析介质驻留时间与抗体生产效率与关系对比抗体流穿曲线对比图 创新之三：高度交联聚丙烯酸酯基球替代软胶或低交联的聚丙烯酸酯基球 高机械强度介质不仅可以耐受更高流速、更高压力、更大粘度样品，还可以装更高的柱床，以增加抗体批处理量、提高抗体生产效率、减少设备投资、减少厂房占用面积。因此纳微protein a 介质是选择高度交联的聚丙烯酸酯基球，与市场上以琼脂糖或低交联度聚丙烯酸酯为基球生产的protein a 介质相比具有溶胀系数小、压缩比例低、而且机械性能强。实验证明 unimab在2公斤装柱压力下，其柱床压缩比例只有5%，而无论是ge 生产的以琼脂糖为基球还是tosoh 生产的低交联聚合物为基球的protein a 介质压缩比例往往超过15%。unimab与软胶与压力流速曲线对比 创新之四：表面亲水化改性微球替代亲水性微球 用于抗体或蛋白纯化分离的层析介质必须具有很好的表面亲水性，因此市场上主要的protein a 产品要么是基于亲水多糖类材料，或者是用亲水单体做的基球，这种基球虽然亲水性能好，非特异性吸附低但机械强度差。为了保持基球的机械强度并解决介质亲水性问题，纳微采用先合成高机械强度高交联的聚丙烯酸酯微球，然后通过多步表面亲水化改性，再进行protein a配件偶联。这种方法虽然工艺复杂，但生产的介质既有高机械强度，又有表面亲水性能好，非特异性吸附低等特性。因此unimab在抗体分离过程中，hcp去除效果好, 可以达到软胶protein a 的同等水平。纳微unimab与对照填料的hcp去除效果 创新之五：protein a 配基创新 除了基球之外，protein a 配基也是影响介质性能重要因素，尤其是介质的寿命。ge之所以垄断protein a 亲和层析介质市场，最主要的是ge拥有耐碱性protein a 专利技术，其核心专利技术是通过基因工程改变b domain 不耐碱的3个氨基酸以改善其耐碱性能。纳微通过优化组合不同片段设计出新序列的protein a 配基，不仅耐碱性好，而且具有自主知识产权，并能自主实现大规模生产。纳微独有的耐碱性配基加上具有卓越性能的基球，及优化偶联工艺开发出高性能的protein a 亲和介质。以下是某单抗项目上unimab介质载量随使用次数增加的衰减变化表。每个cycle采用0.1m氢氧化钠cip，接触时间1小时。连续200个cycle 后dbc10%依然在初始值的75%左右，充分体现了纳微proteina介质的良好耐碱性。纳微世界领先的微球精准制造技术，可以对微球的材料组成、粒径大小、粒径均匀性、孔径大小及表面性能达到前所未有的精准控制。纳微利用这一技术平台开发出新一代单分散多孔聚丙烯酸酯为基质的protein a 亲和层析介质克服了传统proteina 软胶的缺点，也为实现下一代连续层析技术产业化提供理想的介质。unimab载量随使用次数增加的衰减变化表 protein a介质创新和生产工艺创新实现抗体生产效率提升 单抗药物的市场竞争越来越激烈，降低抗体生产成本，高效、稳定的产出合格的产品是每个抗体生产厂家追求的目标。亲和层析作为单克隆抗体分离纯化的关键步骤，关系到下游的主要成本及生产效率，产品质量，也是目前下游生产的主要瓶颈。因此纳微通过底层技术创新不仅实现protein a 介质的国产化，而且克服了现有产品的缺陷，必将大幅度提供抗体生产效率，降低抗体生产成本，更重要的是纳微创新性单分散层析介质可以推动下游工艺技术的创新和进步。比如说高机械强度的protein a 介质就使得通过增加柱床提高批处理量成为可能。而高流速下的高载量及耐高压特性为最终实现抗体连续层析工艺打下基础。新型连续层析工艺（右）连续流层析分离过程示意图(来源于林东强教授课题组文章)

如何满足药物化合物氮含量测定的要求凯氏定氮法是药品生产质量控制 QC 中测定氮的主要参考方法，广泛测定于原料药，疫苗 ，保健品， 生物制品，血浆制品，生物制药，药用辅料等。问为什么选用 BUCHI 凯氏定氮法?瑞士步琦拥有多年的蛋白质检测的丰富经验和配套的完整解决方案，通过提供高品质的凯氏定氮仪助力制药行业氮及蛋白质测定。我们拥有精确的检出限(LOD): 0.008 mgN 精准的定量限(LOQ): 0.02mg，可提供 IQ/ OQ ，通过自动滴定以及自动进样器等功能，实现完全自动化的高效工作流程。并提供生物医药包进行选择升级，符合 21 CFR 第 11 部分。问我们支持 21 CFR第11部分的主要方面？子部分 A —— 一般规定§ 11.1 - 范围§ 11.2 - 实施§ 11.3 - 定义子部分 B —— 电子记录§ 11.10 - 封闭系统的控制§ 11.30 - 开放系统的控制§ 11.50 - 签名表现形式§ 11.70 - 签名/记录链接子部分 C —— 电子签名§ 11.100 - 一般要求§ 11.200 - 电子签名组件和控制§ 11.300 - 识别码/密码的控制1部分A:§11.3 定义要求封闭系统：限制用户访问更改项目的系统开放系统：具有扩展用户访问权限以更改项目的系统生物识别认证：使用特征识别，如指纹或视网膜扫描非生物识别认证：使用非生物特征来确定身份，比如密码或其他识别BUCHI 提供：KjelMaster K-375 是一种非生物识别认证的封闭系统2部分B:§11.10 封闭系统的控制要求:§11.10a 无效记录系统必须能够检测是否适用无效的记录，例如无效的字段条目、留空的字段、包含超出限制的数据值的字段系统必须能够检测到自上次批准以来记录是否被更改§11.10b 记录必须能够查看和打印记录的全部内容必须能够以电子方式生成所有记录，其格式必须能够存储在便携式介质上或以电子方式传输§11.10c 查询数据必须保护数据记录，防止有意或意外的修改或删除§11.10a-c 封闭系统控制数据记录 BUCHI 如何支持:无效的字段项被系统识别，例如条目超出限制电子记录可以保存，并且可以从硬盘驱动器导出到便携式介质或通过本地网络导出数据记录不会被任何用户更改§11.10d 访问级别要求:系统必须允许基于用户职责的不同级别的访问，如适当的普通用户管理员BUCHI如何支持：数据访问仅限于未经授权的人员，并提供三个级别的用户(Admin, Lab-Manager和Operator)Admin：访问除删除用户以外的所有功能能够删除和导出/批准测量结果，但是系统事件日志是完全可跟踪的Lab-manager：有权修改仪器方法能够导出/批准测量结果Operator：能够执行测量功能以产生结果3S11.10e 电子审计跟踪要求:对于非必要的自动后台报告(如内部缓存、数据交换文件和临时文件)不需要的记录的创建、修改和删除，必须自动生成电子审计跟踪除了对审计跟踪文件的只读访问外，电子审计跟踪必须完全不受用户访问的控制必须不允许用户禁用审计跟踪功能BUCHI 如何支持：为所有与质量有关的数据生成电子审计跟踪审计跟踪功能永久运行，不可关闭审计跟踪中的所有条目都不受任何用户的更改4电子纪录及签署电子签名部分 B: $ 11.50 电子记录要求：§11.50a 电子签名记录电子签名记录必须包含以下与签名相关的信息:签名者的全名、日期戳、时间戳、签名的含义§11.50g 电子签署的授权系统必须先验证个人是否有权对记录进行电子签名，然后才允许其他人这样做子部分C:§11.100-电子签名：§11.100a 电子签名使用规则电子签名必须永远不能被重用或重新分配给原始所有者以外的任何人禁止使用他人的电子签名，即使该等使用已获该等个人授权电子纪录及签署：BUCHI如何支持:测量方法和结果自动签名用户信息:姓名，日期戳和时间戳，用户级别5§11.100a 电子签名使用规则要求:电子签名绝不能被重用或重新分配给原始所有者以外的任何人禁止使用他人的电子签名，即使该等使用已获该等个人授权BUCHI如何提供可追踪和安全的签名：签署与有关的电子纪录相连签名是通过用户名和密码的组合实现的签名被唯一地分配给一个用户，不能重新分配给其他用户符合 §11.50 & 11.1006§11.300 登录安全要求:安全 §11.300a,b 密码密码文件必须加密或以其他方式保护，因此密码不能被包括系统管理员在内的普通手段读取密码必须定期过期并修改§11.300d 未经授权使用未经授权通过非生物特征签名的重复尝试必须导致电子签名自动禁用BUCHI 如何支持：用户名和加密密码的组合是访问系统的唯一方法密码在 90 天后过期，必须进行相应的修改用户登录失败 3 次后被锁定符合 §11.300BUCHI的KjelMaster K-375（全自动凯氏定氮仪）是目前市场上技术最新、功能最强、自动化程度最高的全自动凯氏定氮仪。拥有用户管理权限保障数据安全、数据可追溯、支持审计追踪，支持电子签名，可提供IQ/OQ认证，完全满足FDA CFR 21 part 11 。可提供电位滴定、颜色滴定及反滴定等解决方案，完全符合欧洲药典、美国药典、中国药典以及中国国家标准的要求。强大的数据传输功能，仪器可以外接天平、打印机、USB 接口、网络、 LIMS 数据交换等。可连接自动进样器，保证最高样品输出，实现无人值守操作。

3月3日，奥林巴斯发布声明《Olympus will join the global relief effort to help the people of Ukraine》。声明如下：奥林巴斯将加入全球救援行动，帮助乌克兰人民作为一家致力于让人们的生活更健康、更安全、更充实的全球医疗技术公司，奥林巴斯正在密切关注俄罗斯入侵乌克兰造成的人道主义危机。我们强烈谴责一切暴力行为。我们同乌克兰人同在，我们真诚希望，受灾地区的全体人民能够尽快恢复和平生活。本着我们的宗旨精神，我们不能袖手旁观，不加入向这场冲突的所有受害者和难民提供人道主义救济的全球努力。因此，我们决定向国际非政府组织或类似组织捐赠50万美元，这些组织在向世界各地冲突受害者提供支持方面有着悠久的历史。即使在全球日益动荡的形势下，我们也将继续尽一切努力，为有关地区和全球的所有客户和患者提供稳定的服务。原文：Olympus will join the global relief effort to help the people of UkraineMarch 3, 2022As a global medtech company committed to Our Purpose of making people' s lives healthier, safer and more fulfilling, Olympus is closely monitoring the humanitarian crisis caused by the Russian invasion of Ukraine. We strongly condemn all violent acts. Our thoughts are with the Ukrainians, and we sincerely hope that all the people in the affected areas will be able to return to a peaceful life as soon as possible.In the spirit of Our Purpose, we cannot stand idly by without joining the global effort to provide humanitarian relief to all victims and refugees by this conflict. So, we decided that we would donate 500,000 (USD) to international NGOs or similar organizations, who possess a long and established history in providing support to those who are the victims of conflict around the world.Even in the increasingly volatile global situation, we will also continue to make every effort to provide stable services to all of our customers and patients in the region concerned and across the globe.

供稿：温艳蓉成果简介2021年6月，南京大学刘震教授团队在Nature子刊Nature Protocols上发表了题为 “Probing low-copy-number proteins in single living cells using single-cell plasmonic immunosandwich assays”的论文，创新性地发展了单细胞等离激元免疫夹心法，成功实现了单个活细胞及活体动物内多种低拷贝数蛋白质的分析。背景介绍细胞是生物体结构和生命活动的基本单位，基于细胞的研究是生命科学的基础。其中，基于单细胞分析的生命科学研究能够从更深的层次上揭示生命活动的本质和规律，为探究重大疾病的起因、发展和治疗提供更可靠的科学依据。蛋白质是生物学功能的直接执行分子，在单个细胞内分子数目少于1000个拷贝数的蛋白质被称为低拷贝数蛋白质。虽然低拷贝数蛋白质的丰度极低，但它们在多种重要的生物学过程中起着关键的调控作用。纵观整个单细胞分析技术领域，蛋白质的分析手段远远滞后于基因组和转录组的分析方法，其最根本的原因是蛋白质的研究缺少类似于PCR的扩增工具，导致很多低丰度的蛋白质十分难以检测。因此，发展适用于单细胞内低拷贝数蛋白质的检测技术具有重要的科学意义和应用价值。刘震教授团队将免疫识别与等离激元拉曼检测技术相结合，创新性地发展了一种等离激元免疫夹心法（Plasmonic immunosandwich assays, PISA），成功实现了单个活细胞及活体动物内多种低拷贝数蛋白质的分析（Angewandte Chemie International Edition, 2016, 55, 13215）。此后，该方法还扩展到单个活细胞中的microRNA的分析（Chemical Science, 2018, 9, 7241）以及基于生理样品中的蛋白质和microRNA标志物的疾病诊断分析（Analytical Chemistry, 2016, 88, 12363；Analytical Chemistry, 2019, 2019, 91, 4831；Analytical Chemistry, 2019, 91, 9993；Biosensors and Bioelectronics, 2019, 145, 111729）。同时，该技术还被成功应用于单细胞信号通路研究和抗癌药物活性评价（Analytical Chemistry, 2020, 92, 12498）等应用。图文导读单细胞等离激元免疫夹心法（scPISA）的工作流程示意图如图1所示。包括三个主要步骤：细胞内萃取、标记和检测。1.将固定有亲和配基的金基微萃取探针在显微操作系统的控制下，准确地插入单个活细胞内特定部位进行目标蛋白的富集。2.萃取一定的时间后将微萃取探针从细胞内拔出，经过适当的清洗步骤降低微萃取探针表面的非特异性吸附，再用亲和配基功能化的银基纳米拉曼标签对富集到的目标蛋白质进行标记，从而在微萃取探针表面形成类似三明治夹心结构的微萃取探针-目标蛋白质-纳米拉曼标签免疫复合物。图1. 单细胞等离激元免疫夹心法的工作示意图3.将共聚焦拉曼光谱仪和细胞显微操作平台耦合（图2 c），使用拉曼光谱仪的DuoScan功能对悬挂在细胞显微操作臂上的微探针进行分析（图2 d），从拉曼的强度信息中得出细胞内低拷贝数蛋白的丰度，细胞内分布等信息（图2 f）。HORIBA共聚焦拉曼光谱仪的DuoScan功能可以对微萃取探针的各个区域进行原位分析，所得到的信号强度变化反应细胞内蛋白的相应变化，能够实现“所见即所得”。当激光照射在该免疫复合物的表面，金基微萃取探针和银基纳米拉曼标签之间纳米级间隙内由于等离激元耦合作用产生“热点”，显著地增强纳米标签的表面增强拉曼散射（SERS）信号，灵敏度达单分子水平，从而能够实现低拷贝数生物分子的检测。图2. 拉曼光谱采集与分析HORIBA XploRA INV多功能拉曼成像光谱仪集成研究级倒置显微镜，专为生命科学研究而设计。不仅具备通常的拉曼光谱测量功能，而且可以实现超快速拉曼光谱成像、荧光成像、超快速PL光谱成像等。HORIBA Scientific 创新的DuoScan™ 技术，将拉曼仪器的成像能力从亚微米级扩展到宏观尺度，从深紫外到红外，扫描共焦图像变得更快、更容易、更灵活。HORIBA XploRA INV多功能拉曼成像光谱仪如果您对上述产品感兴趣，欢迎扫描二维码留言，我们的工程师将会及时为您答疑解惑。文献信息Probing low-copy-number proteins in single living cells using single-cell plasmonic immunosandwich assays文章署名作者：JiaLiu, Hui He, Dan Xie, Yanrong Wen, Zhen Liu文章链接：https://doi.org/10.1038/s41596-021-00547-9刘震教授简介南京大学特聘教授，博士生导师，国家杰出青年基金获得者。英国皇家化学会会士、中国化学会高级会员、美国化学会会员，兼任国际分子印迹学会理事会理事、中国质谱学会常务理事、中国化学会质谱专业委员会委员、中国生物化学与分子生物学会蛋白质组学专业委员会委员、《Analytica Methods》副主编、《Electrophoresis》、《Separation Science Plus》等杂志编委。主要从事分子识别、亲和分离、疾病诊断、单细胞分析和癌症纳米治疗等研究，主持国家重大科研仪器项目和基金委重点项目等国家级科研项目10余项，已在Chemical Society Review，Accounts of Chemical Research，Angewandte Chemie International Edition，Nature Protocols，Chemical Science等期刊上发表论文150余篇，目前h因子49（谷歌学术），主编及合著著作2部，出版专章7章，获授权专利15项。

奥林巴斯公司近日宣布，目前调集捐赠总价值350万元人民币款物，用于新冠肺炎疫情的防控。其中包括价值330万元人民币的医疗设备，驰援湖北疫区前线，助力医护人员抗击新冠肺炎疫情。同时，奥林巴斯还通过中国外商投资企业协会投资性公司工作委员会捐赠给湖北省黄冈市红十字会20万人民币用于对抗疫情。奥林巴斯为爱驰援 据了解，这批由奥林巴斯公司生产的医疗设备，包括数十台疫情防控急需的纤维支气管镜(LF-TP)和生物显微镜(CX23)。纤维支气管镜将通过中国社会福利基金会捐赠给疫区医疗机构，显微镜则会捐赠给中国疾病预防控制中心，帮助疫区医务工作者和科研人员抗击疫情。奥林巴斯纤维支气管镜(LF-TP，图左)和生物显微镜(CX23，图右) 据介绍，纤维支气管镜(LF-TP)是在新冠病毒感染诊断时，用于“喀痰吸引”的喉头纤维支气管镜。在LF系列纤维支气管镜中，LF-TP具有最大的吸引管道，可轻易采集诊断精准度更高的痰，用于检测；同时，LF-TP内置便携光源，移动电池持久耐用，观察性能出色，具有很高的机动性，无论是在急救、病房、手术室还是在ICU，都是理想的选择。而生物显微镜(CX23)则能帮助急诊科、检验科等临床科室，高效率、高质量完成病患样品的日常诊断。作为临床使用的常规显微镜，CX23易于操作观察，移动方便、安装迅速、有助于医务人员快速开展检验工作，高质量完成病患血液、尿液等样品的观察和诊断，进而成为他们分析并发症、抗击疫情、保护生命的有力武器。奥林巴斯捐赠物资助力疫区在这个特殊的春节，无数医务工作者奋斗在疫情前线，成为“最美逆行者”，但医疗物资的短缺，却牵动着全国人民的心。奥林巴斯希望通过捐赠疫情重灾区急需的医疗设备，守护患者和医务工作者的生命健康，为抗击疫情贡献一份力量。后续，奥林巴斯将密切跟踪关注抗击疫情工作，与最美逆行者同行，与全国人民并肩，守望相助、众志成城、共克时艰，一起打赢这场没有硝烟的战役。

p 　　药物与受体相互作用研究在药物研发过程中发挥着非常重要的作用，其研究方法的便捷程度以及准确度直接影响 a title=" " style=" color: rgb(255, 0, 0) text-decoration: underline " href=" http://www.instrument.com.cn/application/industry-S22.html" target=" _self" span style=" color: rgb(255, 0, 0) " strong 药物研发 /strong /span /a 的效率。一般研究药物受体的相互作用均采用放射配基结合分析法和亲和色谱法，但因放射配基结合分析法操作复杂，需要制备特定的放射性配基，使应用受到一定的限制 而通常的亲和色谱法需要制备一定数量及一定纯度的受体，难度较大，且可能会影响受体对药物的选择性。 /p p 　　1996 年，西安交通大学贺浪冲教授提出细胞膜色谱法(cell membrane chromatography，CMC)，经过20 年的不断发展，CMC法已逐步成为研究药物与膜受体亲和作用的有力工具之一。CMC系统将完整的细胞膜包覆于硅胶表面，在仿生理条件下制备成色谱柱进行成分受体相互作用研究，可以快速筛选中药复杂体系中的活性成分，并准确计算出其与受体间的配位亲和常数。 /p p 　　近日，西安交通大学王嗣岑教授等人在《药学进展》杂志发表文章“ 细胞膜色谱法用于药物与受体相互作用研究进展”，详细介绍了细胞膜色谱法的前世今生及相关应用。 /p p 　　传统的CMC方法经历了2 次“更新换代”：首先，原CMC 模型中分离鉴别采用离线方式完成，即通过筛选发现在特定细胞膜固定相上有保留的中药部位，采用人工方法将保留组分接收并进行下一步分离及鉴定。十几年来通过对CMC 模型的改造，现已成功构建集“ 活性识别- 色谱分离- 分析鉴定”于一体的CMC/HPLC(GC)/MS 在线二维分析系统 利用“ 双捕集环” 和“ 双富集柱”交替富集- 分析模式，将原有色谱系统成功改造为新的在线二维分析系统 并成功研制了在线阀控切换装置，真正实现了高通量筛选。其次，原CMC法中，靶细胞是通过生物组织和一般培养方法获得的，其细胞膜上的非“目标”受体的表达数量很多，而“目标”受体表达数量有限且不可控，由此建立的CMC 法对配体的特异性、敏感性和选择性受到了不同程度的限制。近年来，随着生物技术的不断发展，研究者利用现代分子生物学手段，利用外源重组质粒构建了稳定高表达野生型表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)、血管内皮生长因子受体(vascular epidermal growth factor receptor，VEGFR)、成纤维生长因子受体-1 (fibroblast growth factor receptor-1，FGFR-1)等受体的人胚肾HEK293 细胞株，并以相应受体选择性拮抗剂为对照样品，成功建立了受体高表达CMC模型，发现了苦参、独活、虎杖、黄芪、川乌和红毛七中选择性作用于上述受体的活性组分 分子药理学实验证明筛选得到的化合物可以抑制相应受体蛋白的表达，并具有剂量依赖性。 /p p 　　药物-受体的亲和作用直接影响药物的代谢过程及药效学，细胞膜色谱作为一种全新的生物亲和色谱，实现了高效液相色谱分离和受体药理学的有机结合，用于表征药物- 受体的亲和作用并求解药物作用的解离常数。但这个过程往往不是几种简单理想的模型能够准确描述，所以如何避免测定中的干扰、增强方法的专属性是今后研究的重点所在。此外，细胞膜色谱有其特殊性，载体表面的细胞膜活性随时间不断衰减， 因此如何将亲和色谱理论应用到细胞膜色谱法中，在较短的时间内观察配体在细胞膜固定相上的保留特征，建立快速表征药物– 受体亲和作用的研究方法，也是一个非常重要的研究课题。 /p p br/ /p

p 　　摘 要：随着抗体药物上游大规模高效培养技术的飞速发展，抗体蛋白的表达浓度有了大幅度的提高，这给下游纯化工艺带来了巨大的压力。为了突破下游技术瓶颈，整个世界生物制药产业都加大了对下游技术的革新力度，近年来也取得了丰硕的成果。本文就抗体药物的纯化策略、最新技术进展以及技术应用等方面做一个调研，以期能对本部门的相关研究工作有所助益。 /p p 　　关键词：抗体 下游工艺 纯化 技术进展 /p p 　　自1997年来，全球抗体药物市场经历了一个快速发展的阶段，总销售额从1997年的3.1亿美元增长到2008年的400亿美元，复合增长率高达55%，而且增长势头还在持续 [1]。国际上通常把年销售额超过10 亿美元的品牌药称为“重磅炸弹”药物，很大一部分抗体药物都已迈入“重磅炸弹”行列。在2008年全球15大药品中，抗体药物占据了1/3，且排名仍在上升，这意味着几乎每种单抗药物的成功开发都代表着巨大的市场前景[2]。受益于此，全球主要的生物制药公司都获利颇丰，可见抗体药物具有巨大的经济价值和社会价值。 /p p 　　抗体药物生产技术门槛高，需要掌握抗体筛选、抗体重组、高表达细胞株构建和大规模悬浮培养等核心技术，其下游关键技术是长期以来的薄弱之处。哺乳动物细胞表达系统具有活性高、稳定性好等优点，已成为抗体等生物制品最重要的系统之一，为抗体药物的产业化提供可能。目前，国际上该项技术发展较快，已趋成熟，以默克公司为代表的流加培养生产规模达10000L以上，以贝尔公司为代表的灌流培养生产规模达200L以上，蛋白表达浓度为1-10g/L。我国在该技术领域起步较晚，基础较差，但近年来经过努力，已经实现了该项技术的突破，流加培养规模达500L以上，灌流培养规模达100L以上，蛋白表达浓度为0.2-2g/L[2]。 /p p 　　随着动物细胞表达抗体产品大规模高效培养技术的快速发展，下游纯化工艺越来越成为抗体药物生产中主要的技术瓶颈[3]。因此，如何提高下游工艺的生产效率就成为了抗体药物研发必须解决的问题。本文就国际上高表达抗体蛋白下游工艺的研究进展做一个调研，使本人及同事们能了解国际上的研究成果和发展趋势，以期能对本部门的相关研究工作有所助益。 /p p 　　1. 抗体药物纯化策略 /p p 　　每个单抗的等电点、电荷密度、疏水性、糖基化程度等生化性质各不相同。选择单抗的纯化方法，既要了解它们的共性，又要了解它们的个性，从而制定相应的纯化策略(表1)。 /p p 　　1.1 抗体药物下游工艺一般策略 /p p 　　CHO和NSO等哺乳动物细胞表达系统主要用来生产治疗性单抗，临床剂量大(数十至几百毫克/dose)，批产量达公斤级，纯度要求极高。层析技术是抗体分离纯化的核心技术，一般采用经典的三步纯化策略：粗纯-中间纯化-精细纯化。粗纯的主要目的是捕获、浓缩和稳定样品，约80%的下游工艺用Protein A亲和层析进行快速捕获，一步即可达到95%以上的纯度。治疗用抗体一般使用动物细胞大规模高密度无血清悬浮培养进行生产，不仅对终产品的单体含量有严格的规定，还必须去除各种潜在的杂质以满足药品安全的要求，因此在粗纯之后还需要进行中间纯化和精细纯化，去除宿主细胞蛋白(HCP)、宿主DNA、抗体聚集体和变体等，常用的层析技术有离子交换、凝胶过滤、疏水层析等[4]。 /p p 　　2003 年初，中国SFDA下属的中国药品与生物制品检定所(NICPBP)公布了《人用单克隆抗体质量控制技术指导原则》[5]。生产者除须保证最终抗体产品纯度，还需要验证所用的纯化方法能有效对潜在的污染物，如HCP、免疫球蛋白、宿主DNA、用于生产腹水抗体的刺激物、内毒素、培养液成分、层析凝胶析出成分(脱落的Protein A配基)进行去除 并能有效的去除/灭活病毒。也就是说，在设计下游工艺时，需多角度综合考虑抗体本身的性质、抗体的来源、发酵培养技术、发酵液蛋白浓度、宿主杂质、抗体批间的差异、潜在污染及病毒灭活等问题。此外，治疗用抗体在生产和纯化过程中还会由于糖基化程度不同、蛋白酶作用、以及脱氨基和脱酰胺等反应而产生带电性质不同的多种抗体变体 另外，抗体氧化、聚集和片段化也是常见的降解途径[4]。针对这些变体，一方面，在表达和纯化过程中选择参数(如pH、盐浓度等)时要充分考虑到目标抗体的稳定性 另一方面，应控制细胞培养的条件(DO、渗透压等)，同时加快下游分离纯化的速度，最大程度上避免抗体在纯化过程中产生变体，从而保证终产品的均一性和高的比活，也有利于控制终产品的内毒素水平。 /p p style=" text-align: center " span style=" font-size: 14px " 　　表1 单抗特性及纯化策略 /span /p p style=" text-align: center " img title=" 11111.png" style=" float: none " src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201808/insimg/e2693d21-e711-4b42-bb9c-53b5b7848f82.jpg" / /p p style=" text-align: center " img title=" 2222.png" style=" float: none " src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201808/insimg/5035b8d3-81f1-4e6b-96d7-3e12b347a344.jpg" / /p p 　　1.2 新型的两步层析技术与纯化工艺整合 /p p 　　近年来，GE Healthcare公司开发出了新型的亲和捕获介质Mabselect SuRe和混合作用模式的强阴离子交换介质Capto adhere(这两种介质的主要特点将在下文详细介绍)。凭借着MabSelect SuRe的卓越性能以及Capto adhere的复合多除杂功能，使得抗体纯化工艺由经典的三步层析转变为两步层析得以实现。这种新型的两步层析技术的工艺流程是：在细胞培养表达以后，采用0.2-0.45μm的中空纤维膜技术进行澄清，然后用MabSelect SuRe捕获，酸性条件洗脱后直接pH 4.0 病毒灭活，澄清过滤后穿透方式上Capto adhere，这一步离子交换之前或之后会有一步20nm纳滤去病毒，最后50K膜超滤浓缩和洗滤进行缓冲液置换。整个工艺如图1,这一工艺平台已经尝试过多个不同的抗体并取得成功(表2),同时很多实验表明这一工艺平台适合多数抗体的生产。有些抗体如果通过优化结果不甚满意, 通过增加一步Capto Q也基本上可以达到要求或是采用Capto S-Capto Q(这两种介质的主要特点将在下文详细介绍)的工艺步骤[4]。 /p p style=" text-align: center " 　 img width=" 450" height=" 374" title=" 1.jpg" style=" width: 435px height: 258px " src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201808/insimg/401b7d6a-ad5b-4c9a-9eee-2376ebef51fa.jpg" / /p p style=" text-align: center " 　 span style=" font-size: 14px " 图1　抗体生产两步层析法主导的抗体纯化最新工艺[6] /span /p p 　　Mabselect SuRe可以达到99%以上的抗体纯度，亲和洗脱峰使用Capto adhere的流穿模式进行精纯：使抗体分子流穿而聚合体、HCP、脱落的Protein A配基等杂质结合在柱上加以去除。这样仅用两步层析就可以得到符合药用级质量要求的高纯度抗体产品，大大缩短了工艺时间，提高了生产效率，同时增加了收率，降低了生产成本。 /p p style=" text-align: center " img width=" 599" height=" 164" title=" 2.jpg" style=" width: 580px height: 159px " src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201808/insimg/ce7191a4-3940-4315-8122-856bbbadbc24.jpg" / /p p style=" text-align: center " 　　 span style=" font-size: 14px " 表2 两步法用于多种抗体的纯化结果(括号内数值为纯化前)[4] /span /p p 　　2. 抗体药物下游技术最新研究进展 /p p 　　2.1 样品澄清 /p p 　　2.1.1 中空纤维膜过滤技术 /p p 　　中空纤维膜是近年来发展起来的新型切向流膜分离技术,与盒式膜包相比,中空纤维膜可以直接处理高固含量和高黏度的粗料液,具有容尘量高、速度快、剪切力小、成本低等优点。目前,中空纤维微滤膜已经广泛用于生物制药的各个领域[7]。 /p p 　　对于动物细胞培养液,可以将高密度的培养液直接用中空纤维微滤膜(0.22或0.45μm)进行澄清,而无需事先经过离心和预过滤,步骤少,速度快,收率高,成本低。和离心机比较,具有极高的澄清度,因此中空纤维澄清后的细胞培养液可直接Protein A亲和层析进行纯化。 /p p 　　中空纤维膜澄清细胞培养液的优势有：(1)步骤少,速度快,收率更高(通过有效的洗滤可使样品收率稳定而且高于离心机)，同时最大程度上避免抗体降解而影响产品均一性。(2)成本低：不仅省去了连续流高速离心机昂贵的前期投资和运转的日常维护成本，还节省了离心后死端过滤的成本。中空纤维膜物理化学性质稳定，可以通过清洗而反复使用，成本低廉。(3)有利于内毒素控制：中空纤维膜稳定的化学性质可以耐受1M NaOH 40-50℃和氧化剂NaClO的清洗，从而有效去除内毒素 封闭的系统，也更有利于生产过程中内毒素的控制。此外，大部分中空纤维滤柱还可以进行高压灭菌。(4)低剪切力：中空纤维采用低剪切力的开放式流道，不仅可以处理含有高固含量的料液，还避免了蛋白质活性分子在高剪切力下的聚集变性，有利于抗体的稳定。(5)工艺耐用性强：相比死端过滤，中空纤维澄清具有很好的操作灵活性和耐用性，可以通过调整操作参数(流速、TMP)处理不同性质的细胞培养液。(6)易于线性放大：通过维持切向流速、TMP 等参数恒定，方便地进行线性放大，生产规模的处理量可达几千升料液，目前国内销售最大的中空纤维膜过滤系统已达400m2且生产稳定[8]。 /p p 　　2.1.2 深层过滤介质 /p p 　　深层过滤采用两种机制去除颗粒。首先是拦截，颗粒由于自身的物理尺寸在过滤器内被截留。它们可能被困在过滤器表面，因此根本没有进入基质，或在通过深层过滤基质的曲径时被俘获(筛选)。颗粒拦截伴随过滤器压差增高，因为它的基质被不断累积的颗粒堵塞。第二种机制是吸附，比过滤器拦截精度更小的颗粒能够从流体中被吸附去除。这种机制是通过深层过滤基质上的净电荷实现的[26]。 /p p 　　目前应用比较广泛的双层膜深层过滤介质有Millipore公司的Millistak+HC、Sartorius公司的Sartobran-P、Pall公司的Supradisc HP等。Millistak+HC深层过滤介质由纤维素和无机助滤剂(聚丙稀粘合的硅藻土)组成，包裹在聚丙烯外壳内 它由两层全厚度深层滤板(上游一层粗过滤和下游一层精细过滤)组成，附带一层RW01纤维素膜终过滤。Sartobran-P深层过滤介质由醋酸纤维素滤膜、聚丙烯外壳和支撑层组成，加强型的滤膜有良好的机械强度，有利于在反复的过滤和灭菌过程中保持完好无损 采用了折叠膜，在体积小巧的同时还保证了超大的过滤面积。Supradisc HP深层过滤介质由纤维素、硅藻土、带正电荷树脂和聚丙烯组成 也由两层全厚度深层滤板(上游一层粗过滤和下游一层精细过滤)组成。 /p p 　　2.2最新抗体捕获技术 /p p 　　2.2.1 MabSelect介质 /p p 　　MabSelect是第一个使用高流速琼脂糖凝胶作为骨架的新型Protein A层析介质，专为大规模抗体纯化而设计，适合快速高效的进行抗体生产和放大，已经成为单抗纯化和放大的标准介质。 /p p 　　MabSelect的特点有：(1)更高的流速和动态载量：Protein A经基因工程改造，C端含一个半胱氨酸，形成一个定向的硫酯键，同时增加了对IgG的有效结合。Protein A和凝胶偶联时采用了全新的单点偶联工艺，降低了空间位阻，因此可以在使用更高流速的条件下增加动态载量：在线形流速为500cm/hr和柱床高度为20cm(停留时间2.4min)的条件下，每毫升MabSelect的动态载量可以达到& gt 30mg IgG。(2)更低的非特异性吸附，抗体纯度更高：Mabselect介质高度亲水性的琼脂糖骨架最大程度上降低了非特异性吸附，使得洗脱峰中杂蛋白和DNA更少，有利于后期抗体的精细纯化。著名的抗体生产商IDEC公司以及R.Hahn的研究显示，Mabselect对CHO细胞HCP的吸附比其它Protein A介质低7倍[9-10]。R.L.Fahrner等的研究显示，Mabselect所得抗体的DNA残留量比其它Protein A介质低30%[11]。(3)更低的Protein A脱落：MabSelect由于通过新型环氧共价交联技术，Protein A的脱落比其它同类介质低，这不仅有利于抗体纯化，还延长了介质的使用寿命，降低了生产成本。(4)更易于工艺的线性放大：通过实验室条件的优化，MabSelect 可以在保持线性流速和上样比例等参数不变的条件下，通过增加柱直径进行线性放大。(5)MabSelect 易于清洗与除菌，寿命更长、更经济：在长期连续的生产中，有效的在位清洗(CIP)有助于延长介质使用寿命，但一般的Protein A介质往往不能耐受NaOH，只能使用高浓度的尿素或盐酸胍进行清洗，效果远不如NaOH且成本非常高。而MabSelect的CIP和除菌程序简单，用很常规、经济的试剂如50mM NaOH+1M NaCl或50mM NaOH+0.5M Na2SO4就可以有效去除沉淀和变性物质 用非离子去污剂或酒精可以去除通过疏水作用结合的物质 用0.1M醋酸和20%酒精可以在位灭菌(SIP)。经测试，Mabselect配合CIP(50mMNaOH+1M NaCl)纯化三百次后，抗体产品纯度与收率不变[12]。 /p p 　　2.2.2 MabSelect Xtra介质 /p p 　　Mabselect Xtra介质是在Mabselect介质的基础上优化而来，是目前市场上所有的商品化Protein A介质中载量最高的亲和层析介质之一。它除了具有MabSelect介质的全部特点外，还具有载量最高和非特异性吸附更低的特点。 /p p 　　Mabselect Xtra介质使用孔径更大的多孔高流速琼脂糖作为骨架，同时减小介质粒径。这样不仅增加了比表面积和配基密度，还降低了传质阻力，从而有效的增加了动态载量。其动态载量超过41mg/ml，在工艺生产过程中可以有效减少层析柱的体积，从而降低生产成本。R.Hahn的研究显示，Mabselect Xtra对CHO细胞HCP的吸附比其它Protein A介质更是低了近10倍[13]。 /p p 　　2.2.3 MabSelect SuRe介质 /p p 　　MabSelect SuRe介质也是在Mabselect介质的基础上优化而来，是目前市场上唯一耐强碱的Protein A亲和层析介质，寿命最长，稳定性最好[10]。它除了具有MabSelect介质的全部特点外，还具有以下特点：(1)可以耐受0.1-0.5M NaOH：MabSelectSuRe具有不同于其它Protein A介质的同型四聚体配基-SuRe配基，即使在强碱条件下也不易变性或脱落，可以用高达0.5M NaOH进行CIP和SIP，能有效去除沉淀和变性物质，大大降低了抗体产品被内毒素污染和批间交叉污染的风险，有利于延长介质使用寿命，同时还大大降低了CIP和SIP的成本。(2)更温和的洗脱，避免抗体聚集，提高收率：同型四聚体配基避免了不同配基与抗体Fc段亲和性的差异，也消除了某些域对Fab段的亲和作用，使得洗脱条件更加均一而温和。Mabselect SuRe介质可以用更高的pH进行洗脱，有效避免了抗体在低pH下的聚集，产品纯度和均一性更高，浊度也更低[14]。(3)不同抗体洗脱所需pH差异小：由于消除了对抗体Fab段的亲和作用，使得同一种属亚型的不同抗体分子洗脱所需的条件更接近，有利于平台技术的建立，进一步降低了不同的抗体分离纯化工艺的研发成本。(4)SuRe 配基稳定性更好：SuRe配基对碱和蛋白酶更稳定，纯化过程中脱落更少(& lt 10ppm)，有利于后期脱落配基的进一步去除。 /p p 　　2.2.4 ProSep-vA Ultra介质 /p p 　　ProSep-vA Ultra介质是将自然界非动物性来源的Protein A交联于700Å 的多孔性玻璃珠骨架上，是刚性和不可压缩的介质。ProSep-vA Ultra介质具有如下特点：低反压性 不收缩、不溶胀 高动态载量 极低的Protein A脱落 高重复使用性，标准化的清洗和除菌操作[27]。 /p p 　　2.2.5 ProSep Ultra Plus介质 /p p 　　ProSep Ultra Plus介质是在ProSep-vA Ultra介质基础上优化而来，也是目前市场上所有的商品化Protein A介质中载量最高的亲和层析介质之一。它除了具有ProSep-vA Ultra介质的全部特点外，还具有载量最高、纯化效率更高、工艺更易于放大、成本更低等特点[28]。 /p p 　　2.2.6 MEP Hypercel介质 /p p 　　MEP Hypercel复合作用模式介质是一种灵活的层析介质设计，也称之为疏水电荷诱导层析(HCIC)，用于捕获和纯化从实验室到生产规模的抗体和各种重组蛋白。MEP Hypercel介质由一个独特的连接4-巯基乙基吡啶(4-MEP)的刚性纤维素骨架组成。纤维素骨架赋予高孔隙率、化学稳定性和低非特异性吸附。平均直径80-100μm，在低反压下有优良的流速特性。MEP Hypercel介质在大规模使用时具有显著优势，基于它的配基结构，可选择性地捕获免疫球蛋白。组合其它传统的方法如离子交换、疏水作用，甚至用在Protein A之后从不同的料液中直接捕获或中度纯化抗体，以增强对宿主DNA、HCP和聚合体的清除。MEP Hypercel介质有助于建立一个简化的工艺流程，节省操作步骤(例如洗滤、超滤等) 预计有更长的使用寿命，因为它可以耐受苛刻的CIP方法(0.5-1M NaOH，30-60分钟接触时间)，而所有因素都有利于降低成本[29]。 /p p 　　2.3最新精细纯化技术 /p p 　　2.3.1 CaptoFamily系列介质 /p p 　　新型的Capto S，Q系列介质是以高流速琼脂糖为骨架，同时交联了非常“柔软”的葡聚糖链，这样不仅增加了比表面积，同时降低了传质阻力和空间位阻，使得介质在高流速下的动态载量大大增加，有利于提高生产效率，降低成本。 /p p 　　Capto S，Q系列介质可以装填在直径60cm的工业层析柱中使用高达500cm/h 的流速进行纯化(柱高30cm)。这样不仅有利于工艺放大后大规模层析柱的填装，还大大提高了生产效率，每步层析更短的操作时间也有效避免了抗体分子在分离纯化过程中产生各种变体和聚合体，使得收率更好，终产品的活性更高、性质更均一。 /p p 　　2.3.2 Captoadhere介质 /p p 　　为了进一步减少抗体分离纯化步骤，提高特定杂质的去除效率，以满足日益增长的治疗用抗体的生产需要，2007 年初，GE Healthcare公司推出了新型复合作用模式的强阴离子交换介质：Capto adhere介质。Capto adher介质专为治疗用抗体的分离纯化而设计，其配基综合了阴离子交换、氢键和疏水等多种复杂的作用方式，因此对于抗体的聚合体具有非常独特而高效的去除能力。此外，通过有效的实验设计(DoE)，流穿模式的Capto adher介质还可以同时有效去除脱落的Protein A配基、HCP、宿主DNA、内毒素和潜在的病毒，并使得结合MabSelect SuRe的抗体两步层析纯化工艺成为现实(表3)。Capto adhere还具有很强的病毒去除能力，如MVM病毒的去除能力可达5.9个Log。目前，新型的两步法抗体层析纯化工艺已经被国内外诸多知名药企广泛用于多种抗体的分离纯化，各项指标均符合治疗用抗体的要求。Capto adher层析还可以和阴离子交换(Capto Q)和疏水层析等结合使用，以达到更高的质量要求[15]。 /p p style=" text-align: center " 　　 img title=" 3.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201808/insimg/4aa1c980-c9be-44e9-82b5-899ba9f7eec9.jpg" / /p p style=" text-align: center " span style=" font-size: 14px " 表3 两步层析纯化工艺对污染物的去除效果[15] /span /p p 　　2.3.3膜层析技术 /p p 　　PALL Life Science公司自10余年前颠覆性地开发出独一无二的层析产品-Mustang膜层析系列产品后，经过不断地技术改造，于近年推出全新Mustang Q XT家族，扩展了膜层析工艺放大产品线。膜层析技术，相对于传统的柱层析，无需层析填料和层析柱等复杂构件，直接通过膜式过滤器，经过简单的过滤环节即可达到纯化目的。Mustang Q以16层超级打褶的聚醚砜过滤膜作为基架，上面偶联了季胺基等功能基团，可以使生物分子流经的时候与功能位点迅速结合，具有高流速和高动态载量等优点。 /p p 　　Sartorius Stedim公司也开发出了一整套膜层析技术，包括Sartobind S,Q,C和D离子交换、Sartobind IDA(亚氨基二乙酸)金属螯合、Sartobind醛、Sartobind环氧基和Sartobind Protein A(重组)等膜层析系列产品。Sartobind在很多蛋白和病毒纯化应用中可以取代传统耗时、繁琐的层析步骤。膜吸附器的快速纯化特点使蛋白分离可以在高流速下获得高收率，较传统柱层析流速最高能提高100倍，达到20-40 CV/min。传统颗粒胶95%以上的结合位点集中在颗粒胶内部。Sartobind膜层析的结合位点是均一地交联到交叉偶联的增强纤维素骨架内0.5-1μm厚的薄层上。大孔结构和快速吸附结合特性使膜吸附器可以忽略扩散时间因素。同时多微孔膜结构不存在传统颗粒胶的孔内扩散问题。在对流情况下，流动相的分子运动只由泵压力决定。因此，膜吸附器具有操作周期极短、流速和处理能力极高的特点[30]。 /p p 　　与离子交换柱层析相比，离子交换膜层析技术已经被证明利用高动态结合能力吸附大量的生物分子，如病毒、HCP和宿主DNA。最近，阴离子交换膜层析技术已经被作为柱层析技术的替代技术用于Protein A亲和捕获后的mAb中微量污染物的去除[16]。 /p p 　　2.4终产品的浓缩洗滤 /p p 　　多维纯化得到的洗脱峰可以用Kvick Lab/Process盒式膜包进行快速浓缩和缓冲液置换。Kvick盒式膜包的优点有：(1)无热原：很多时候，仅用0.5M NaOH 清洗难以彻底去除膜表面的热原。Kvick盒式膜包化学性质非常稳定，可以使用1M NaOH在40-50℃下进行彻底的SIP/CIP，避免最终超滤浓缩时引入热原而影响产品质量。(2)孔径均一、速度快：Kvick盒式膜包孔径更均一，甚至可以使用50-100K的膜包进行抗体浓缩而不漏过，速度更快，大大节省了操作时间。(3)易于线性放大：通过保持流速、TMP等参数恒定，可以直接线性放大到生产规模。 /p p 　　Amicon Ultra系列超滤离心管可以用来进行抗体的快速浓缩、脱盐及缓冲液置换。它具有如下特点：(1)效率高：一步法离心达到25到80倍浓缩。(2)节省时间：垂直结构的膜，避免堵膜，减少浓差极化，可以用超快离心速度极短时间完成 最少10分钟即可完成浓缩、脱盐或缓冲液置换。(3)收率高：独特的反转离心设计，有利于取得最大回收率且避免了人为移液误差 低吸附滤膜和聚丙烯内壳，使回收率高达90%以上。(4)不漏液、无损失：100%完整性测试确保不漏液 独特的死体积设计避免过度离心至干，没有样品损失。(5)广泛的化学相容性：与广泛的溶剂兼容，适用于pH1-pH9，热封膜杜绝了粘合剂和下游溶出物污染。 /p p 　　Vivaspin系列超滤离心管同样是进行蛋白质快速浓缩和缓冲液置换的常用产品。获得专利的垂直膜配合狭长的流道设计，有效地避免滤膜堵塞，提高浓缩速度 同时在浓缩管底部设计有死端结构，确保即使离心时间过长也不会发生样品被甩干的现象。Vivaspin可灵活选用三种不同材质的超滤膜：聚醚砜、三醋酸纤维和Hydrosart。它的另一个特点是有两种回收浓缩液的方法，既可以直接用移液器从浓缩管底部吸取，也可以将浓缩液反转离心到回收管内，加盖密封保存，这两种方法都保证了高回收率。Vivaspin经过一次离心，最高可以将蛋白溶液浓缩300倍。 /p p 　　2.5终产品的除菌除病毒过滤 /p p 　　浓缩后的样品，最终经过0.22μm无菌滤器进行除菌过滤。ULTA Pure SG，HC除菌滤器具有过滤速度快、化学稳定性好、载量高和溶出物少等优点，细菌挑战实验表明其除菌能力大于7log。除菌过滤过程的优化主要从三个方面入手：操作过程中过膜压力的控制、过膜流速以及单位膜载量控制，这三个参数优化以后，可以在同种类型、材质的NFF膜上进行线性放大，否则很容易影响收率。 /p p 　　Durapore除菌级亲水性滤膜由亲水性PVDF材料制造，具有可靠的除菌保证以及低蛋白吸附量、低析出、无纤维脱落、广泛的化学兼容性等优点，是常用的除菌滤膜。Durapore 0.22μm亲水性滤膜用于液体除菌或去除微粒，0.1μm亲水性滤膜用于液体中去除微粒、微生物和支原体。装有Durapore亲水性滤膜的滤器有Millipak、Opticap XL、Opticap XLT、筒式滤器和Optiscale等。Millipak滤器独特的堆叠盘状设计使残留量最小并且无颗粒脱落，因此适合于高附加值产品的终端过滤和灌装。Millipak和Opticap XL滤器都有O型圈垫片和软管倒钩连接的上游排气阀和排空阀设计，使操作简单易控。Opticap XL和XLT滤器的结构设计，特别耐高温、高压条件，在除菌过程中提供更高的稳定性和可靠性，同时更易清洗。Optiscale一次性滤器专为小规模工艺筛选和工艺放大所设计，是工艺评估的理想工具。 /p p 　　目前被广泛应用的生物制品病毒去除的方法是纳米膜过滤。纳米膜过滤有如下优点：(1)针对性强，实用性广：纳米膜过滤只与病毒和目的蛋白的大小有关，无论病毒是否有脂包膜外壳、是否耐热，纳米膜过滤都能将之去除。(2)毒性小，下游污染少：能有效去除杀灭病毒后可能留下的如抗原和核酸蛋白混合物等病毒标志物，有效降低下游污染，是纳米膜的另一特点。大多数病毒灭活处理都使用有毒或致突变的理化试剂，从而必须在使用后从蛋白质溶液中清除，而纳米膜过滤不存在毒性问题，只是在验证中要考虑到滤器浸出物的风险。(3)蛋白活性高，回收率高：纳米膜过滤是在正常条件下的pH、渗透压和温度下进行的温和的生产步骤，其蛋白回收率和活性都很高，通常在90%—95%。基于体外分析、实验研究和临床经验，纳米膜过滤试验都没有显示出蛋白质改变或是新抗原的产生。纳米膜过滤不改变制品特性，这一特点促进了监管机构认可和产品的注册。 /p p 　　日本Asahi Kasei公司于1989年推出了第一款专门为清除生物制药产品中病毒颗粒而设计的过滤器Planova，由亲水铜铵再生纤维素制成的中空纤维微孔膜，装入聚碳酸酯壳体中。Millipore公司的Viresolve NFP膜是一种复合PVDF膜，过滤盒被设计来从高纯蛋白溶液中移除小型病毒，如B19，蛋白质溶液中，B19的去除量通常& gt 4 log。PALL Life Science公司的Ultipor VF DV50和DV20膜式过滤器可以从生物流体中去除显著数量级的病毒，同时目标蛋白可以很好地通过。滤芯由三层独特的亲水、低蛋白吸附的PVDF滤膜经新月型打褶方式构成，过滤面积大，具有可靠、安全和高流量等特点。Sartorius Stedim生产的Virosart CPV为聚醚砜过滤器，能去除& gt 4 log的PPV和& gt 6 log的逆转录病毒。 /p p 　　2.5扩张柱床吸附层析技术 /p p 　　扩张柱床吸附层析技术(EBA)是上世纪九十年代初期进入下游生产，整合了发酵和下游纯化的技术。新一代STREAMLINE Direct扩张柱床设备及介质是EBA技术中最成熟的产品。通过条件优化，STREAMLINE能直接从浑浊的发酵液中捕获目标生物分子，细胞碎片及不吸附的杂质穿过扩张床内悬浮的介质被冲洗掉，将以往澄清、浓缩、捕获等步骤整合为一步，达到粗纯化的效果(图2)[17]。 /p p 　　STREAMLINE的操作过程如下[17-18]：(1)起始：将STREAMLINE介质倒入扩张柱中。(2)平衡：从下向上流的缓冲液，将STREAMLINE柱内的吸附介质悬浮起来，形成稳定的、充分平衡好的扩张床。(3)上样：发酵液带菌体从柱底进入，目标生物产品吸附在STREAMLINE介质上 不吸附的宿主杂质及菌体碎片随液流从柱顶排出。(4)淋洗/穿透：进一步用缓冲液将不吸附的杂质洗掉。(5)洗脱：洗脱液洗脱目标生物产品。(6)CIP/再生：用1M NaOH+1M NaCl进行CIP。整个操作过程如图3所示。 /p p style=" text-align: center " img title=" 4.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201808/insimg/07a79270-4b7d-4fe5-bc9a-125837562297.jpg" / /p p style=" text-align: center " 　 span style=" font-size: 14px " 　图2　传统纯化工艺与STREAMLINE [17] /span /p p style=" text-align: center " img title=" 5.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201808/insimg/333de887-f92b-405d-9094-9ec89635f74d.jpg" / /p p style=" text-align: center " span style=" font-size: 14px " 　　图3 STREAMLINE的基本工作原理和操作过程[18] /span /p p style=" text-align: center " 　 span style=" font-size: 14px " 　(箭头示液体过柱时的流向) /span /p p 　　STREAMLINE介质是一系列包裹着石英芯，以琼脂糖为骨架的介质。特殊设计的STREAMLINE扩张柱床可以产生稳定的向上拔的扩张液流，每一颗不同比重的STREAMLINE介质，悬浮在自身重力和扩张升力平衡的位置原地扰动。STREAMLINE 技术是稳态扩张，样品流均匀分布整个床体，目标产物吸附均匀，穿透小，回收率高，类似于固定床吸附性层析[19]。 /p p 　　3. 抗体最新下游技术应用实例 /p p 　　Lonza Biologics公司是全球最大的抗体合同生产商之一，为了开发一个稳定的20000L的抗体生产工艺，其纯化开发部门对多个不同的抗体亲和层析凝胶进行了有效的比较，他们发现Mabselect SuRe的动态载量高、使用寿命最长、Protein A脱落最低，实验数据明确支持放大到1.4m直径的柱子用于20000L培养规模的经济生产[4]。 /p p 　　德国的Roche公司一种用于肿瘤治疗的单抗已进入临床Ⅲ期。他们将目前几种Protein A介质进行充分的比较之后，选择了高载量、更易于装柱和寿命更长的Mabselect。目的抗体是通过无血清培养的转染的杂交B淋巴细胞表达的IgG1。将过滤后的无细胞上清上样到Mabselect填充的FineLINE柱，直径300cm，柱高20cm，上样的浓度是30mg/ml。洗脱后，洗脱液立即用磷酸钾中和pH值到6.8-7.0，再用凝胶过滤检测，结果表明比活超过90%，纯度在95%以上[20]。 /p p 　　Cytheris公司是法国一家生物制药公司，目前正在研制一种用CHO细胞表达的免疫调节剂(临床Ⅱ期)。原先的工艺采用传统层析法，但不能稳定去除病毒。改进后，在工艺的第一步使用Mustang Q对污染物进行捕获，取得了25%去除率的良好结果 同时对MVM、MLV和Re03三种病毒也达到超过4个Log的滴度降效果，而整个工艺对病毒的去除效率普遍提高了7-11个Log。说明Mustang Q的使用对下游层析起到了很好的保护作用。 /p p 　　在第五届生物制药工艺优化大会上，Crucell公司介绍了他们对腺病毒(AAV)纯化工艺的摸索。与传统的层析填料相比，Mustang Q膜层析的开放孔道的设计使对病毒的动态载量大大提高30倍左右，回收率在80%以上。用40L的膜层析柱相当于1000L的传统层析柱的效果，节省了验证工作，提高了工艺经济性，十分有利于放大生产。 /p p 　　德国的Boehringer Mannheim公司生物制药部，用STREAMLINE技术代替传统工艺生产400L CHO细胞培养的Fc融合蛋白，结果样品回收率提高14%，缓冲液减少25%，时间缩短47%[17]。 /p p 　　世界最大的制药公司-GlaxoSmithKline公司，使用特别设计的BioProcess全自动层析系统和STREAMLINE扩张柱生产药用脂蛋白疫苗，比原工艺产品体积缩小2倍，纯化系数1.5，内毒素减少100倍[17]。 /p p 　　日本YOSHITOMI公司正在使用多套STREAMLINE 1000系统生产人重组白蛋白，与原生产工艺产品纯度相同，产率提高30%，时间减少一半，年产量为12.5吨[17]。 /p p 　　AVECIA公司重新设计临床Ⅲ期药品生产工艺，选用STREAMLINE技术及SOURCE新型凝胶，生产效率提高12倍，回收率提高1倍[17]。 /p p 　　2001年，ILEX制药公司的CAMPATH获得FDA批准。该单克隆抗体使用Sartobind Q离子交换层析模块以流穿的方式进行精制，这是膜吸附器首次被批准应用于治疗性蛋白的生产，证明了膜层析技术通过了证实和测试[30]。 /p p 　　4. 展望 /p p 　　随着抗体产品上游大规模高效培养技术的进一步发展,实验室规模哺乳动物细胞表达水平可以达到25g/L，如果这一水平能够有效放大到生产,将对下游生产纯化带来更大的压力。所以下游纯化工艺的技术发展也是势在必行。 /p p 　　以下一些发展方向可能成为下游工艺未来发展的重要关注点：(1)刚性更好、载量更高、耐碱性更好的完全亲水琼脂糖凝胶的开发[4]。(2)优化操作次序，降低缓冲液消耗的更大规模生产线的应用[21]。(3)通过单抗的氨基酸序列预测下游工艺关键参数：亲和层析洗脱pH条件、离子交换层析洗脱pH和盐浓度条件、病毒灭活pH等[22]。(4)下游工艺的成本消耗占全部成本的50-80%，亲和捕获是下游工艺的最关键步骤，通过改进亲和配体，提高捕获能力，节省成本[23]。(5)新型层析系统全程实时控制纯化过程，在线检测HCP、宿主DNA、Protein A等的含量[24]。(6)由于在去除杂质方面的优势，膜层析将会得到飞速的发展，未来工艺甚至可能完全基于膜层析而不是柱层析[25]。 /p p 　　参考文献 /p p 　　[1] 刘亚明,薛章.生物制药：迎接抗体药物的黄金时代.医药细分子行业研究报告,2009. /p p 　　[2] 陈志南.基于抗体药物的我国生物制药产业化发展前景.2008中国药学会学术年会暨第八届中国药师周论文集,2008. /p p 　　[3]Gail Dutton.Trends in Monoclonal AntibodyProduction.Feature Articles,2010, 30(4). /p p 　　[4]孙文改,苗景赟.抗体生产纯化技术.中国生物工程杂志,2008,28(10):141-152. /p p 　　[5]《人用单克隆抗体质量控制技术指导原则》.NICPBP(中国药品与生物制品检定所),2003. /p p 　　[6]Capto adhere：用于生产单抗的两步纯化操作.GE Healthcare公司技术资料. /p p 　　[7]中空纤维滤柱分离纯化应用集锦.GE Healthcare公司技术资料. /p p 　　[8]中空纤维膜过滤技术在单抗生产中的应用.GE Healthcare公司技术资料. /p p 　　[9]Amersham Biosciences.Downstream Gab’02 Abstracts,Extended Reports from the 2nd International Symposium on DownstreamProcessing of Genetically Engineered 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BioPharm International技术资料. /p p 　　[22] T.Ishihara,T.Kadoya.Accelerated purification process development ofmonoclonal antibodies for shortening time to clinic:Designand case study of chromatography processes.J Chromatogr A,2007，1176(1-2)：149-156. /p p 　　[23] A.Cecilia,A.Roque,et al.Antibodies and Genetically Engineered RelatedMolecules:Production and Purification.BiotechnolProg,2004，20：639-654. /p p 　　[24] S.Flatman,I.Alam,et al.Process analytics for purification of monoclonal antibodies.JChromatogr B,2007，848：79-87. /p p 　　[25]ProcessChromatography:Five Decades of Innovation.BioPharmInternational技术资料. /p p 　　[26]双层滤板膜堆在单抗工艺上的大规模澄清过滤应用评估.BioProcessInternational技术资料. /p p 　　[27]Affinity Chromatography Media.Millipore公司技术资料. /p p 　　[28]ProSep Ultra Plus ChromatographyMedia.Millipore公司技术资料. /p p 　　[29]MEP Hypercel混合模式层析填料. PALL LifeScience公司技术资料. /p p 　　[30]Sartobind膜层析技术高效的蛋白纯化工具. SartoriusStedim公司技术资料. /p p /p

2015年核磁共振国际研讨会暨药物开发暑期学校 在国家蛋白质科学中心&bull 上海成功举办 　　&ldquo 国家蛋白质科学中心&bull 上海前沿论坛&mdash &mdash 2015年核磁共振国际研讨会暨药物开发暑期学校&rdquo 于2015年5月30日-6月2日在上海生科院生化与细胞所蛋白质中心海科路园区举行。会议旨在加强我国生物大分子核磁共振波谱学领域与国际间的交流与合作、培养应用最新核磁共振方法进行蛋白质科学研究的高技术人才及年轻后备人才，体现我国在结构生物学领域的综合实力。 会议现场 　　核磁共振波谱学是唯一一项包揽过诺贝尔物理、化学、医学奖的技术，自1930年Rabi发现核磁共振现象开始，已有八位著名科学家因从事核磁共振或与核磁共振相关的研究而获得诺贝尔奖。现代高场液体核磁共振主要应用于生物大分子结构与功能研究，特点是可以获得原子分辨率的溶液结构、可以从不同时间跨度的动力学信息中(皮秒 - 秒)捕捉到蛋白质的位点特异性信息。蛋白质是生命活动的真正执行者，对其功能的研究具有重要的生物学意义和利用价值。而蛋白质三维结构的解析为蛋白质功能的确定提供重要线索。 　　核磁共振波谱在&ldquo 定量地了解细胞内部蛋白质分子动态运动过程、膜蛋白三维空间结构和动态特性、蛋白质折叠、研究弱相互作用的超大蛋白分子复合体&rdquo 等方面具有其独特的优势，与其它结构生物学研究方法如：X射线晶体衍射学、冷冻电镜等形成很好的合作互补。 　　近年来溶液核磁共振波谱在新的实验方法和应用上有了很大的突破，特别是基于蛋白质靶点的药物筛选，理性药物设计及研发和评价方面的应用受到越来越多的关注。 　　本次大会会议执行主席为蛋白质中心主任雷鸣研究员，周界文研究员和中心主任助理许琛琦研究员。参会人员包括来自美国、德国、英国和日本的核磁专家十余名，国内高校和科研单位学者，学生代表百余人，生物医药企业包括罗氏研发(中国)有限公司，礼来(中国)研发有限公司，深圳市海普瑞药业股份有限公司代表10余人，以及作为本次会议的主要赞助商布鲁克公司及相关领域重要仪器及设备公司代表10余人。 　　大会分为两个部分： 　　大会第一部分&ldquo 蛋白质核磁共振暨药物开发暑期学校&rdquo ，邀请核磁共振研究领域的多位专家讲授核磁共振基础理论、蛋白质溶液核磁共振技术、RDC，PRE和蛋白质溶液结构计算、核磁共振在基于片段的先导药物筛选和优化中的应用，使青年学者和研究生有机会与本领域权威科学家面对面交流，并得到高层次的技术培训和实际实验操作，包括快速核磁数据采集方式(非均匀采样)和波谱数据处理技术、药物分子片段核磁筛选技术、新动力学参数的测量方法和溶液三维动态结构计算软件XPLOR-NIH等。会议将为参会的国际和国内科学家提供高端学术交流平台和合作契机，提升国内蛋白质溶液核磁共振研究的整体水平，培训一批高技术核磁人才。 　　大会第二部分高端国际研讨会以&ldquo 生物大分子核磁共振波谱未来&rdquo 为主题，特邀美国科学院院士、美国国立卫生研究院(NIH)Adriaan Bax 研究员, 日本东京都立大学Masatsune Kainosho教授，美国哥伦比亚大学Arthur G Palmer教授, 德国慕尼黑赫尔姆霍茨中心结构生物学研究所Michael Sattler教授，美国哈佛大学医学院Gerhard Wagner教授，美国哈佛大学医学院教授、蛋白质中心周界文研究员和中国科学院院士、中国科学技术大学施蕴渝教授等七名生物大分子溶液核磁共振研究的国际权威专家来共同交流核磁前沿领域的最新进展，包括核磁共振波谱新方法、蛋白质分子动力学与功能关系研究、膜蛋白质溶液结构与功能研究、超大分子复合体与相互作用研究、蛋白质-RNA复合体研究和综合溶液核磁共振、X射线晶体衍射研究生物学问题等，探讨和展望溶液核磁共振在蛋白质相关研究中未来5-10年的研究发展趋势，存在的机遇及可能遇到的挑战。 　　蛋白质中心已经建成国际先进的液体核磁共振设施，不但拥有五套 600 至 900 兆赫兹的核磁共振谱仪，而且拥有专业人员提供配套技术支撑。蛋白质中心许琛琦，欧阳波和周界文研究团队使用核磁分析系统在淋巴细胞的信号转导和膜蛋白结构与功能研究方面取得突破，成果发表在国际知名期刊如《自然》(Nature)杂志上。 　　此次会议将为我国生物分子溶液核磁共振技术的展示提供一个窗口，搭建平台，打造具有国际影响力、世界一流水平的生物大分子核磁共振中心，加强国内核磁同行的实效性合作，达到信息、仪器等资源共享，推动核磁共振波谱在我国蛋白质科学基础研究和药物开发领域的拓展与应用。 合影 　　附录一：会议主席团成员简介： 　　雷鸣：中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所副所长、国家蛋白质科学中心&bull 上海主任、国际蛋白质学会执委、中国生物化学与分子生物学会蛋白质专业委员会副秘书长。近期研究工作包括人类端粒结合蛋白调控端粒结构与端粒酶的分子机制、端粒与DNA修复因子的关系、表观遗产调控过程中重要蛋白质复合物的结构与功能，具有显著的国际影响力。 　　周界文：中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所、国家蛋白质科学中心&bull 上海研究员，美国哈佛大学医学院教授。应用溶液核磁共振技术测定膜蛋白结构，探索他们的工作机制。近年来研发了一系列的用于膜蛋白研究的核磁共振与生物化学技术，世界上第一个用NMR测定了肌浆网受磷蛋白的溶液高分辨结构。研究组首次用NMR对丙型肝炎病毒感染宿主过程中的一个重要蛋白p7以及它与抑制剂金刚烷胺类药物结合位点的精细三维空间结构进行详细描述,这是目前使用核磁共振技术解析出的最大离子通道结构，此研究成果将有助于推动以p7为靶点的抗丙型肝炎病毒药物研究。 　　许琛琦：中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所、国家蛋白质科学中心&bull 上海主任助理，研究员。研究方向为淋巴细胞的信号转导，运用多种分子生物学和结构生物学的手段研究(1)T淋巴细胞活化机制 (2) T淋巴细胞在疾病中的作用，在阐明人体免疫机制方面取得原创性和突破性进展。 　　附录二：学者代表简介： 　　Adriaan Bax： 美国国家科学院院士，美国国立卫生研究院(NIH)研究员。Bax 院士是国际蛋白质溶液核磁共振领域内最重要的推动者之一，他在多维核磁共振波谱学、发展核磁共振新方法和计算生物学方面做出了系统性贡献。 　　Masatsune Kainosho: 日本东京都立大学教授，发展新的蛋白质标记方法：立体阵列同位素标记(SAIL: Stereo-Array Isotope Labelling)，应用于分子量为17kDa 的钙调蛋白(Calmodalin)和分子量为41kDa的麦芽糖糊精(Maltodextrin)结合蛋白质的合成。此方法所得到的NMR谱图比利用传统技术得到的NMR谱图更简单，信噪比更高，有可能将常规溶液核磁蛋白结构测定方法所能测定的分子量范围扩大两倍以上。 　　Arthur G. Palmer: 美国哥伦比亚大学教授, 研究方向包括核磁共振波谱方法的开发、分子动力学的计算和理论分析以及在蛋白质折叠上的应用、分子识别和催化。Palmer教授是生物核磁共振波谱学的必备教科书《Protein NMR Spectroscopy: Principles and Practice》(Academic Press, 1996 and 2007)的作者之一。他由于用多维NMR技术在测定溶液中蛋白质动力学方面的创造性学术成就获得2015年Laukien奖。(Laukien奖是核磁共振领域的最高奖项之一，创立于1999年的Laukien奖是为了纪念Bruker的创始人Gunther Laukien而设立，主要表彰杰出和前沿且有巨大潜在影响的磁共振实验研究。) 　　Michael Sattler：德国慕尼黑赫尔姆霍茨中心结构生物学研究所教授，主要研究方向包括多维核磁共振波谱学以及大分子量蛋白质蛋白质、蛋白质核酸相互作用。 　　Gerhard Wagner：美国国家科学院院士，美国哈佛大学医学院教授。近期主要工作包括大分子量蛋白质的结构解析以及蛋白蛋白的相互作用研究，以及发展核磁共振新的核磁采样方法和膜蛋白质体系实验方法。任Journal of Magnetic Resonance杂志编委，Journal of Biomolecular NMR杂志编委，Biochemistry杂志编委，Cell杂志副主编等。 　　施蕴渝： 中国科学技术大学教授，中国科学院院士，第三世界科学院院士。中国生物化学与分子生物学学会蛋白质科学专业委员会副主任。近期主要工作包括：用多维核磁共振波谱及计算生物学研究与重大疾病或重要生理功能相关的蛋白质结构，动力学与功能关系，以及蛋白质与蛋白质、核酸、配基的相互作用。 　　附录三：背景介绍 　　蛋白质是由基因编码、多种氨基酸聚合而成的生物大分子，是所有生命形式与生命活动的主要物质基础和功能执行者。蛋白质研究的突破将促进揭示生命现象的本质 从根本上阐明人类重大疾病的机理，为临床诊治提供新的方法和途径 推动医药、生物能源、生物材料等新型生物技术产业的发展。为此，我国&ldquo 中长期科技发展战略规划&rdquo 将蛋白质研究列为基础研究四大科学研究计划之一，并将建设蛋白质科学研究设施纳入国家重大基础设施计划予以支持。 　　国家蛋白质科学研究上海设施(简称&ldquo 上海设施&rdquo )围绕蛋白质科学研究的前沿领域和我国生物医药、农业等产业发展需求，建设高通量、高精度、规模化的蛋白质制取与纯化、结构分析、功能研究等大型装置，实现技术与设备的集成化、通量化和信息化，成为我国蛋白质科学研究和技术创新基地，形成具有国际一流水平和综合示范作用的蛋白质科学研究支撑体系，全面提升我国蛋白质科学研究能力。 　　上海设施总投资7.56亿元，主体位于上海市张江高科技园区海科路333号，总建筑面积3.3万平方米，拥有用于蛋白质结构研究的9大技术系统，即规模化蛋白质制备系统、蛋白质晶体结构分析系统、蛋白质核磁共振分析系统、集成化电镜分析系统、蛋白质动态分析系统、质谱分析系统、复合激光显微镜系统、分子影像系统和数据库与计算分析系统。其中蛋白质晶体结构分析系统与蛋白质动态分析系统依托 &ldquo 上海光源&rdquo 建设蛋白质结构分析的&ldquo 五线六站&rdquo 。上海设施是继上海光源后第二个落户浦东张江的国家重大科技基础设施。上海设施于2010年12月26日正式开工，2014年3月竣工，至今已完成各项专业组验收及工艺鉴定，即将迎来国家验收。 　　上海设施作为当今全球生命科学领域第一家综合性的大科学装置，集先进科学装置和大型设备之大成，是探索生命奥秘的国之利器 上海设施的建成引起了国内外同行的高度关注 为上海率先建成世界级蛋白质科学中心奠定了良好的基础。 　　自2014年5月上海设施开放试运行以来，上海设施的运行维护团队为用户承担的国家科技战略先导专项、973、863、和国家自然科学基金的项目任务提供了强有力的科研保障和支撑服务：共执行用户课题210个，约2200人次 用户课题组120家，涉及40多家单位，以中科院和高校科研单位为主 地域覆盖主要有北京、上海、常州、杭州、石家庄、武汉、南京、厦门、长春、广州、澳门、香港等地。同时吸引了一批国际药企和国外优秀科学家开展前沿课题研究。用户使用设施的设备和服务做出了一系列优秀的成果，并在各领域的国际知名期刊上发表论文多篇。 　　上海设施技术团队坚持以自主创新为主，并与国际先进技术相结合，自主研发了国内首套将软件控制、硬件设备和生物应用进行整合的规模化蛋白质制备系统，实现了蛋白质制备全流程的高度集成和流水线作业，在样品处理通量上超过半自动化和传统的人工系统10-100倍，居于国际领先水平。自主研发了高精度激光双光镊系统：采用激光辐射压对微米级粒子进行捕获，通过高精度的测量技术实现亚纳米级位移和亚皮牛级力的测量，在蛋白质折叠、RNA聚合酶等研究领域提供单分子层次的信息。 　　上海设施建设同步组织建设国家蛋白质科学中心&bull 上海(简称&ldquo 蛋白质中心&rdquo )，负责设施运行管理。蛋白质中心依托中科院上海生科院，委托生化与细胞所实施管理，开展科学研究和国内外交流，力争在5-10年的时间逐步建设成为一个国际一流的蛋白质科学研究中心。目前中心已经到位学术带头人(PI)17名，其中包括中组部&ldquo 千人计划&rdquo 3人(含千人计划B类1人)，国家&ldquo 杰出青年&rdquo 科学基金的资助2人，中组部&ldquo 青年千人计划&rdquo 5人，中科院&ldquo 百人计划&rdquo 或&ldquo 引进杰出技术人才&rdquo 7人。中心学术带头人作为首席科学家共承担国家科技部重大科学研究计划3项，科研团队承担中科院战略性先导(B类)专项&ldquo 生物超大分子复合体结构、功能与调控&rdquo 近三分之一研究任务。近两年来，中心科研团队使用蛋白质设施开展相关研究，并取得一系列重要研究成果，发表在《自然》《癌症细胞》等一系列国际权威学术期刊上。 　　&ldquo 大科学中心&rdquo 建设是中国科学院实施&ldquo 率先行动&rdquo 计划的研究所分类改革举措之一。2014年11月，依托上海设施与上海光源的&ldquo 中科院上海大科学中心&rdquo 作为首批试点&ldquo 大科学中心&rdquo 正式启动筹建，努力建设成为高效率开放共享、高水平国际合作、高质量创新服务的大科学研究中心，有效集聚国内外科研院所、大学、企业，开展跨学科、跨领域、跨部门协同创新，为中科院研究所分类改革起到了示范引领作用。 　　未来，&ldquo 上海设施&rdquo 将围绕蛋白质科学研究的前沿领域和国家人口健康与现代农业的战略需求，打造开放、协作、创新的国际一流蛋白质科学研究平台，充分发挥大科学装置的优势，助力国内生物医药产业，为实现上海创新驱动发展战略并带动长三角地区经济发展、建设全球有影响力的科创中心提供强有力的科技支撑。

合肥工业大学成功研发出一种快速无标记的核酸适配体体外筛选方法，通过这一方法筛选的核酸适配体，对金属离子表现出高度的亲和力和特异性，提供了性能优良的金属离子亲和物质，从而实现了对重金属超标的快速实时检测。该成果论文近日发表在国际纳米材料领域顶级学术期刊之一《美国化学学会纳米》上。　　传统方法对金属离子的检测，需要借助质谱等大型仪器设备，成本高昂费时费力难以普及。如何摆脱对大型仪器的依赖，实现对金属离子的快速实时检测，关键就是找寻能够特异性识别并结合特定金属离子的“亲和物质”。由于金属离子在生物体内不会引起免疫反应，能够特异性结合金属离子的“标准”亲和物质——单克隆抗体非常难以生产，使用指数富集的配基系统进化技术等传统的筛选方法，仍需要对靶标进行化学标记或者修饰，这一要求对于金属离子和小分子靶标十分困难，且容易改变其结构和性质。　　合肥工业大学生物与医学工程学院瞿昊博士，通过使用乳液聚合酶链式反应和荧光激发细胞筛选两项技术，成功研发了以金属离子为特定靶标的核酸适配体高效筛选的革新方法。这一筛选方法无需对靶标进行任何标记或修饰，同时筛选周期短，非常适用于针对金属离子和小分子靶标的核酸适配体筛选。通过这一方法，瞿昊通过3—4轮筛选便获得了适用于二价汞离子的核酸适配体，其结合强度较传统核酸适配体提高了30倍，并首次获取了适用于二价铜离子的核酸适配体。　　“这一筛选方法可适用于所有金属离子和小分子靶标，将为针对其他离子和小分子靶标的核酸适配体的筛选工作提供非常高效的平台。”瞿昊说，这一成果突破了生物传感器领域匮乏性能优良的亲和物质这一瓶颈，不仅可以应用在金属污染治理上，同时在生物技术、医疗保健等领域具有广阔的应用前景。

p 　　随着抗体药物上游大规模高效培养技术的飞速发展，抗体蛋白的表达浓度有了大幅度的提高，这给下游纯化工艺带来了巨大的压力。为了突破下游技术瓶颈，整个世界生物制药产业都加大了对下游技术的革新力度，近年来也取得了丰硕的成果。本文就抗体药物的纯化策略、最新技术进展以及技术应用等方面做一个调研，以期能对本部门的相关研究工作有所助益。 br/ /p p 　　自1997年来，全球抗体药物市场经历了一个快速发展的阶段，总销售额从1997年的3.1亿美元增长到2008年的400亿美元，复合增长率高达55%，而且增长势头还在持续 [1]。国际上通常把年销售额超过10 亿美元的品牌药称为“重磅炸弹”药物，很大一部分抗体药物都已迈入“重磅炸弹”行列。在2008年全球15大药品中，抗体药物占据了1/3，且排名仍在上升，这意味着几乎每种单抗药物的成功开发都代表着巨大的市场前景[2]。受益于此，全球主要的生物制药公司都获利颇丰，可见抗体药物具有巨大的经济价值和社会价值。 br/ /p p 　　抗体药物生产技术门槛高，需要掌握抗体筛选、抗体重组、高表达细胞株构建和大规模悬浮培养等核心技术，其下游关键技术是长期以来的薄弱之处。哺乳动物细胞表达系统具有活性高、稳定性好等优点，已成为抗体等生物制品最重要的系统之一，为抗体药物的产业化提供可能。目前，国际上该项技术发展较快，已趋成熟，以默克公司为代表的流加培养生产规模达10000L以上，以贝尔公司为代表的灌流培养生产规模达200L以上，蛋白表达浓度为1-10g/L。我国在该技术领域起步较晚，基础较差，但近年来经过努力，已经实现了该项技术的突破，流加培养规模达500L以上，灌流培养规模达100L以上，蛋白表达浓度为0.2-2g/L[2]。 /p p 　　随着动物细胞表达抗体产品大规模高效培养技术的快速发展，下游纯化工艺越来越成为抗体药物生产中主要的技术瓶颈[3]。因此，如何提高下游工艺的生产效率就成为了抗体药物研发必须解决的问题。本文就国际上高表达抗体蛋白下游工艺的研究进展做一个调研，使本人及同事们能了解国际上的研究成果和发展趋势，以期能对本部门的相关研究工作有所助益。 /p p 　　1. 抗体药物纯化策略 /p p 　　每个单抗的等电点、电荷密度、疏水性、糖基化程度等生化性质各不相同。选择单抗的纯化方法，既要了解它们的共性，又要了解它们的个性，从而制定相应的纯化策略(表1)。 /p p 　　1.1 抗体药物下游工艺一般策略 /p p 　　CHO和NSO等哺乳动物细胞表达系统主要用来生产治疗性单抗，临床剂量大(数十至几百毫克/dose)，批产量达公斤级，纯度要求极高。层析技术是抗体分离纯化的核心技术，一般采用经典的三步纯化策略：粗纯-中间纯化-精细纯化。粗纯的主要目的是捕获、浓缩和稳定样品，约80%的下游工艺用Protein A亲和层析进行快速捕获，一步即可达到95%以上的纯度。治疗用抗体一般使用动物细胞大规模高密度无血清悬浮培养进行生产，不仅对终产品的单体含量有严格的规定，还必须去除各种潜在的杂质以满足药品安全的要求，因此在粗纯之后还需要进行中间纯化和精细纯化，去除宿主细胞蛋白(HCP)、宿主DNA、抗体聚集体和变体等，常用的层析技术有离子交换、凝胶过滤、疏水层析等[4]。 /p p 　　2003 年初，中国SFDA下属的中国药品与生物制品检定所(NICPBP)公布了《人用单克隆抗体质量控制技术指导原则》[5]。生产者除须保证最终抗体产品纯度，还需要验证所用的纯化方法能有效对潜在的污染物，如HCP、免疫球蛋白、宿主DNA、用于生产腹水抗体的刺激物、内毒素、培养液成分、层析凝胶析出成分(脱落的Protein A配基)进行去除 并能有效的去除/灭活病毒。也就是说，在设计下游工艺时，需多角度综合考虑抗体本身的性质、抗体的来源、发酵培养技术、发酵液蛋白浓度、宿主杂质、抗体批间的差异、潜在污染及病毒灭活等问题。此外，治疗用抗体在生产和纯化过程中还会由于糖基化程度不同、蛋白酶作用、以及脱氨基和脱酰胺等反应而产生带电性质不同的多种抗体变体 另外，抗体氧化、聚集和片段化也是常见的降解途径[4]。针对这些变体，一方面，在表达和纯化过程中选择参数(如pH、盐浓度等)时要充分考虑到目标抗体的稳定性 另一方面，应控制细胞培养的条件(DO、渗透压等)，同时加快下游分离纯化的速度，最大程度上避免抗体在纯化过程中产生变体，从而保证终产品的均一性和高的比活，也有利于控制终产品的内毒素水平。 /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201810/uepic/1eb75a7d-0f0f-4f60-8224-a3984ccff0e3.jpg" title=" 表1.png" alt=" 表1.png" / /p p style=" text-align: center " img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201810/uepic/f8ff0f67-6f0b-4295-ab81-05543e5efbd8.jpg" title=" 表2.png" alt=" 表2.png" / br/ strong 表1 单抗特性及纯化策略 /strong /p p 　　1.2 新型的两步层析技术与纯化工艺整合 /p p 　　近年来，GE Healthcare公司开发出了新型的亲和捕获介质Mabselect SuRe和混合作用模式的强阴离子交换介质Capto adhere(这两种介质的主要特点将在下文详细介绍)。凭借着MabSelect SuRe的卓越性能以及Capto adhere的复合多除杂功能，使得抗体纯化工艺由经典的三步层析转变为两步层析得以实现。这种新型的两步层析技术的工艺流程是：在细胞培养表达以后，采用0.2-0.45μm的中空纤维膜技术进行澄清，然后用MabSelect SuRe捕获，酸性条件洗脱后直接pH 4.0病毒灭活，澄清过滤后穿透方式上Capto adhere，这一步离子交换之前或之后会有一步20nm纳滤去病毒，最后50K膜超滤浓缩和洗滤进行缓冲液置换。整个工艺如图1,这一工艺平台已经尝试过多个不同的抗体并取得成功(表2),同时很多实验表明这一工艺平台适合多数抗体的生产。有些抗体如果通过优化结果不甚满意, 通过增加一步Capto Q也基本上可以达到要求或是采用Capto S-Capto Q(这两种介质的主要特点将在下文详细介绍)的工艺步骤[4]。 /p p style=" text-align: center " 　　 img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201810/uepic/a804fe1c-9660-4ab2-8cc4-177870630ce5.jpg" title=" 图1.png" alt=" 图1.png" style=" text-align: center " / /p p style=" text-align: center " strong 图1　抗体生产两步层析法主导的抗体纯化最新工艺[6] /strong /p p 　　Mabselect SuRe可以达到99%以上的抗体纯度，亲和洗脱峰使用Capto adhere的流穿模式进行精纯：使抗体分子流穿而聚合体、HCP、脱落的Protein A配基等杂质结合在柱上加以去除。这样仅用两步层析就可以得到符合药用级质量要求的高纯度抗体产品，大大缩短了工艺时间，提高了生产效率，同时增加了收率，降低了生产成本。 /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201810/uepic/3ef7b3a2-9f79-4e74-8a71-6a6cbcbea5ec.jpg" title=" 图2.png" alt=" 图2.png" / /p p style=" text-align: center " strong 表2 两步法用于多种抗体的纯化结果(括号内数值为纯化前)[4] /strong /p p 　　2. 抗体药物下游技术最新研究进展 /p p 　　2.1 样品澄清 /p p 　　2.1.1 中空纤维膜过滤技术 /p p 　　中空纤维膜是近年来发展起来的新型切向流膜分离技术,与盒式膜包相比,中空纤维膜可以直接处理高固含量和高黏度的粗料液,具有容尘量高、速度快、剪切力小、成本低等优点。目前,中空纤维微滤膜已经广泛用于生物制药的各个领域[7]。 /p p 　　对于动物细胞培养液,可以将高密度的培养液直接用中空纤维微滤膜(0.22或0.45μm)进行澄清,而无需事先经过离心和预过滤,步骤少,速度快,收率高,成本低。和离心机比较,具有极高的澄清度,因此中空纤维澄清后的细胞培养液可直接Protein A亲和层析进行纯化。 /p p 　　中空纤维膜澄清细胞培养液的优势有：(1)步骤少,速度快,收率更高(通过有效的洗滤可使样品收率稳定而且高于离心机)，同时最大程度上避免抗体降解而影响产品均一性。(2)成本低：不仅省去了连续流高速离心机昂贵的前期投资和运转的日常维护成本，还节省了离心后死端过滤的成本。中空纤维膜物理化学性质稳定，可以通过清洗而反复使用，成本低廉。(3)有利于内毒素控制：中空纤维膜稳定的化学性质可以耐受1M NaOH 40-50℃和氧化剂NaClO的清洗，从而有效去除内毒素 封闭的系统，也更有利于生产过程中内毒素的控制。此外，大部分中空纤维滤柱还可以进行高压灭菌。(4)低剪切力：中空纤维采用低剪切力的开放式流道，不仅可以处理含有高固含量的料液，还避免了蛋白质活性分子在高剪切力下的聚集变性，有利于抗体的稳定。(5)工艺耐用性强：相比死端过滤，中空纤维澄清具有很好的操作灵活性和耐用性，可以通过调整操作参数(流速、TMP)处理不同性质的细胞培养液。(6)易于线性放大：通过维持切向流速、TMP 等参数恒定，方便地进行线性放大，生产规模的处理量可达几千升料液，目前国内销售最大的中空纤维膜过滤系统已达400m2且生产稳定[8]。 /p p 　　2.1.2 深层过滤介质 /p p 　　深层过滤采用两种机制去除颗粒。首先是拦截，颗粒由于自身的物理尺寸在过滤器内被截留。它们可能被困在过滤器表面，因此根本没有进入基质，或在通过深层过滤基质的曲径时被俘获(筛选)。颗粒拦截伴随过滤器压差增高，因为它的基质被不断累积的颗粒堵塞。第二种机制是吸附，比过滤器拦截精度更小的颗粒能够从流体中被吸附去除。这种机制是通过深层过滤基质上的净电荷实现的[26]。 /p p 　　目前应用比较广泛的双层膜深层过滤介质有Millipore公司的Millistak+HC、Sartorius公司的Sartobran-P、Pall公司的Supradisc HP等。Millistak+HC深层过滤介质由纤维素和无机助滤剂(聚丙稀粘合的硅藻土)组成，包裹在聚丙烯外壳内 它由两层全厚度深层滤板(上游一层粗过滤和下游一层精细过滤)组成，附带一层RW01纤维素膜终过滤。Sartobran-P深层过滤介质由醋酸纤维素滤膜、聚丙烯外壳和支撑层组成，加强型的滤膜有良好的机械强度，有利于在反复的过滤和灭菌过程中保持完好无损 采用了折叠膜，在体积小巧的同时还保证了超大的过滤面积。Supradisc HP深层过滤介质由纤维素、硅藻土、带正电荷树脂和聚丙烯组成 也由两层全厚度深层滤板(上游一层粗过滤和下游一层精细过滤)组成。 /p p 　　2.2最新抗体捕获技术 /p p 　　2.2.1 MabSelect介质 /p p 　　MabSelect是第一个使用高流速琼脂糖凝胶作为骨架的新型Protein A层析介质，专为大规模抗体纯化而设计，适合快速高效的进行抗体生产和放大，已经成为单抗纯化和放大的标准介质。 /p p 　　MabSelect的特点有：(1)更高的流速和动态载量：Protein A经基因工程改造，C端含一个半胱氨酸，形成一个定向的硫酯键，同时增加了对IgG的有效结合。Protein A和凝胶偶联时采用了全新的单点偶联工艺，降低了空间位阻，因此可以在使用更高流速的条件下增加动态载量：在线形流速为500cm/hr和柱床高度为20cm(停留时间2.4min)的条件下，每毫升MabSelect的动态载量可以达到& gt 30mg IgG。(2)更低的非特异性吸附，抗体纯度更高：Mabselect介质高度亲水性的琼脂糖骨架最大程度上降低了非特异性吸附，使得洗脱峰中杂蛋白和DNA更少，有利于后期抗体的精细纯化。著名的抗体生产商IDEC公司以及R.Hahn的研究显示，Mabselect对CHO细胞HCP的吸附比其它Protein A介质低7倍[9-10]。R.L.Fahrner等的研究显示，Mabselect所得抗体的DNA残留量比其它Protein A介质低30%[11]。(3)更低的Protein A脱落：MabSelect由于通过新型环氧共价交联技术，Protein A的脱落比其它同类介质低，这不仅有利于抗体纯化，还延长了介质的使用寿命，降低了生产成本。(4)更易于工艺的线性放大：通过实验室条件的优化，MabSelect 可以在保持线性流速和上样比例等参数不变的条件下，通过增加柱直径进行线性放大。(5)MabSelect 易于清洗与除菌，寿命更长、更经济：在长期连续的生产中，有效的在位清洗(CIP)有助于延长介质使用寿命，但一般的Protein A介质往往不能耐受NaOH，只能使用高浓度的尿素或盐酸胍进行清洗，效果远不如NaOH且成本非常高。而MabSelect的CIP和除菌程序简单，用很常规、经济的试剂如50mM NaOH+1M NaCl或50mM NaOH+0.5M Na2SO4就可以有效去除沉淀和变性物质 用非离子去污剂或酒精可以去除通过疏水作用结合的物质 用0.1M醋酸和20%酒精可以在位灭菌(SIP)。经测试，Mabselect配合CIP(50mMNaOH+1M NaCl)纯化三百次后，抗体产品纯度与收率不变[12]。 /p p 　　2.2.2 MabSelect Xtra介质 /p p 　　Mabselect Xtra介质是在Mabselect介质的基础上优化而来，是目前市场上所有的商品化Protein A介质中载量最高的亲和层析介质之一。它除了具有MabSelect介质的全部特点外，还具有载量最高和非特异性吸附更低的特点。 /p p 　　Mabselect Xtra介质使用孔径更大的多孔高流速琼脂糖作为骨架，同时减小介质粒径。这样不仅增加了比表面积和配基密度，还降低了传质阻力，从而有效的增加了动态载量。其动态载量超过41mg/ml，在工艺生产过程中可以有效减少层析柱的体积，从而降低生产成本。R.Hahn的研究显示，Mabselect Xtra对CHO细胞HCP的吸附比其它Protein A介质更是低了近10倍[13]。 /p p 　　2.2.3 MabSelect SuRe介质 /p p 　　MabSelect SuRe介质也是在Mabselect介质的基础上优化而来，是目前市场上唯一耐强碱的Protein A亲和层析介质，寿命最长，稳定性最好[10]。它除了具有MabSelect介质的全部特点外，还具有以下特点：(1)可以耐受0.1-0.5M NaOH：MabSelectSuRe具有不同于其它Protein A介质的同型四聚体配基-SuRe配基，即使在强碱条件下也不易变性或脱落，可以用高达0.5M NaOH进行CIP和SIP，能有效去除沉淀和变性物质，大大降低了抗体产品被内毒素污染和批间交叉污染的风险，有利于延长介质使用寿命，同时还大大降低了CIP和SIP的成本。(2)更温和的洗脱，避免抗体聚集，提高收率：同型四聚体配基避免了不同配基与抗体Fc段亲和性的差异，也消除了某些域对Fab段的亲和作用，使得洗脱条件更加均一而温和。Mabselect SuRe介质可以用更高的pH进行洗脱，有效避免了抗体在低pH下的聚集，产品纯度和均一性更高，浊度也更低[14]。(3)不同抗体洗脱所需pH差异小：由于消除了对抗体Fab段的亲和作用，使得同一种属亚型的不同抗体分子洗脱所需的条件更接近，有利于平台技术的建立，进一步降低了不同的抗体分离纯化工艺的研发成本。(4)SuRe 配基稳定性更好：SuRe配基对碱和蛋白酶更稳定，纯化过程中脱落更少(& lt 10ppm)，有利于后期脱落配基的进一步去除。 /p p 　　2.2.4 ProSep-vA Ultra介质 /p p 　　ProSep-vA Ultra介质是将自然界非动物性来源的Protein A交联于700Å 的多孔性玻璃珠骨架上，是刚性和不可压缩的介质。ProSep-vA Ultra介质具有如下特点：低反压性 不收缩、不溶胀 高动态载量 极低的Protein A脱落 高重复使用性，标准化的清洗和除菌操作[27]。 /p p 　　2.2.5 ProSep Ultra Plus介质 /p p 　　ProSep Ultra Plus介质是在ProSep-vA Ultra介质基础上优化而来，也是目前市场上所有的商品化Protein A介质中载量最高的亲和层析介质之一。它除了具有ProSep-vA Ultra介质的全部特点外，还具有载量最高、纯化效率更高、工艺更易于放大、成本更低等特点[28]。 /p p 　　2.2.6 MEP Hypercel介质 /p p 　　MEP Hypercel复合作用模式介质是一种灵活的层析介质设计，也称之为疏水电荷诱导层析(HCIC)，用于捕获和纯化从实验室到生产规模的抗体和各种重组蛋白。MEP Hypercel介质由一个独特的连接4-巯基乙基吡啶(4-MEP)的刚性纤维素骨架组成。纤维素骨架赋予高孔隙率、化学稳定性和低非特异性吸附。平均直径80-100μm，在低反压下有优良的流速特性。MEP Hypercel介质在大规模使用时具有显著优势，基于它的配基结构，可选择性地捕获免疫球蛋白。组合其它传统的方法如离子交换、疏水作用，甚至用在Protein A之后从不同的料液中直接捕获或中度纯化抗体，以增强对宿主DNA、HCP和聚合体的清除。MEP Hypercel介质有助于建立一个简化的工艺流程，节省操作步骤(例如洗滤、超滤等) 预计有更长的使用寿命，因为它可以耐受苛刻的CIP方法(0.5-1M NaOH，30-60分钟接触时间)，而所有因素都有利于降低成本[29]。 /p p 　　2.3最新精细纯化技术 /p p 　　2.3.1 CaptoFamily系列介质 /p p 　　新型的Capto S，Q系列介质是以高流速琼脂糖为骨架，同时交联了非常“柔软”的葡聚糖链，这样不仅增加了比表面积，同时降低了传质阻力和空间位阻，使得介质在高流速下的动态载量大大增加，有利于提高生产效率，降低成本。 /p p 　　Capto S，Q系列介质可以装填在直径60cm的工业层析柱中使用高达500cm/h 的流速进行纯化(柱高30cm)。这样不仅有利于工艺放大后大规模层析柱的填装，还大大提高了生产效率，每步层析更短的操作时间也有效避免了抗体分子在分离纯化过程中产生各种变体和聚合体，使得收率更好，终产品的活性更高、性质更均一。 /p p 　　2.3.2 Captoadhere介质 /p p 　　为了进一步减少抗体分离纯化步骤，提高特定杂质的去除效率，以满足日益增长的治疗用抗体的生产需要，2007 年初，GE Healthcare公司推出了新型复合作用模式的强阴离子交换介质：Capto adhere介质。Capto adher介质专为治疗用抗体的分离纯化而设计，其配基综合了阴离子交换、氢键和疏水等多种复杂的作用方式，因此对于抗体的聚合体具有非常独特而高效的去除能力。此外，通过有效的实验设计(DoE)，流穿模式的Capto adher介质还可以同时有效去除脱落的Protein A配基、HCP、宿主DNA、内毒素和潜在的病毒，并使得结合MabSelect SuRe的抗体两步层析纯化工艺成为现实(表3)。Capto adhere还具有很强的病毒去除能力，如MVM病毒的去除能力可达5.9个Log。目前，新型的两步法抗体层析纯化工艺已经被国内外诸多知名药企广泛用于多种抗体的分离纯化，各项指标均符合治疗用抗体的要求。Capto adher层析还可以和阴离子交换(Capto Q)和疏水层析等结合使用，以达到更高的质量要求[15]。 /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201810/uepic/282961ea-e704-47d1-aabd-f044e108f59c.jpg" title=" 图3.png" alt=" 图3.png" / /p p style=" text-align: center " strong 表3 两步层析纯化工艺对污染物的去除效果[15] /strong /p p 　　2.3.3膜层析技术 /p p 　　PALL Life Science公司自10余年前颠覆性地开发出独一无二的层析产品-Mustang膜层析系列产品后，经过不断地技术改造，于近年推出全新Mustang Q XT家族，扩展了膜层析工艺放大产品线。膜层析技术，相对于传统的柱层析，无需层析填料和层析柱等复杂构件，直接通过膜式过滤器，经过简单的过滤环节即可达到纯化目的。Mustang Q以16层超级打褶的聚醚砜过滤膜作为基架，上面偶联了季胺基等功能基团，可以使生物分子流经的时候与功能位点迅速结合，具有高流速和高动态载量等优点。 /p p 　　Sartorius Stedim公司也开发出了一整套膜层析技术，包括Sartobind S,Q,C和D离子交换、Sartobind IDA(亚氨基二乙酸)金属螯合、Sartobind醛、Sartobind环氧基和Sartobind Protein A(重组)等膜层析系列产品。Sartobind在很多蛋白和病毒纯化应用中可以取代传统耗时、繁琐的层析步骤。膜吸附器的快速纯化特点使蛋白分离可以在高流速下获得高收率，较传统柱层析流速最高能提高100倍，达到20-40 CV/min。传统颗粒胶95%以上的结合位点集中在颗粒胶内部。Sartobind膜层析的结合位点是均一地交联到交叉偶联的增强纤维素骨架内0.5-1μm厚的薄层上。大孔结构和快速吸附结合特性使膜吸附器可以忽略扩散时间因素。同时多微孔膜结构不存在传统颗粒胶的孔内扩散问题。在对流情况下，流动相的分子运动只由泵压力决定。因此，膜吸附器具有操作周期极短、流速和处理能力极高的特点[30]。 /p p 　　与离子交换柱层析相比，离子交换膜层析技术已经被证明利用高动态结合能力吸附大量的生物分子，如病毒、HCP和宿主DNA。最近，阴离子交换膜层析技术已经被作为柱层析技术的替代技术用于Protein A亲和捕获后的mAb中微量污染物的去除[16]。 /p p 　　2.4终产品的浓缩洗滤 /p p 　　多维纯化得到的洗脱峰可以用Kvick Lab/Process盒式膜包进行快速浓缩和缓冲液置换。Kvick盒式膜包的优点有：(1)无热原：很多时候，仅用0.5M NaOH 清洗难以彻底去除膜表面的热原。Kvick盒式膜包化学性质非常稳定，可以使用1M NaOH在40-50℃下进行彻底的SIP/CIP，避免最终超滤浓缩时引入热原而影响产品质量。(2)孔径均一、速度快：Kvick盒式膜包孔径更均一，甚至可以使用50-100K的膜包进行抗体浓缩而不漏过，速度更快，大大节省了操作时间。(3)易于线性放大：通过保持流速、TMP等参数恒定，可以直接线性放大到生产规模。 /p p 　　Amicon Ultra系列超滤离心管可以用来进行抗体的快速浓缩、脱盐及缓冲液置换。它具有如下特点：(1)效率高：一步法离心达到25到80倍浓缩。(2)节省时间：垂直结构的膜，避免堵膜，减少浓差极化，可以用超快离心速度极短时间完成 最少10分钟即可完成浓缩、脱盐或缓冲液置换。(3)收率高：独特的反转离心设计，有利于取得最大回收率且避免了人为移液误差 低吸附滤膜和聚丙烯内壳，使回收率高达90%以上。(4)不漏液、无损失：100%完整性测试确保不漏液 独特的死体积设计避免过度离心至干，没有样品损失。(5)广泛的化学相容性：与广泛的溶剂兼容，适用于pH1-pH9，热封膜杜绝了粘合剂和下游溶出物污染。 /p p 　　Vivaspin系列超滤离心管同样是进行蛋白质快速浓缩和缓冲液置换的常用产品。获得专利的垂直膜配合狭长的流道设计，有效地避免滤膜堵塞，提高浓缩速度 同时在浓缩管底部设计有死端结构，确保即使离心时间过长也不会发生样品被甩干的现象。Vivaspin可灵活选用三种不同材质的超滤膜：聚醚砜、三醋酸纤维和Hydrosart。它的另一个特点是有两种回收浓缩液的方法，既可以直接用移液器从浓缩管底部吸取，也可以将浓缩液反转离心到回收管内，加盖密封保存，这两种方法都保证了高回收率。Vivaspin经过一次离心，最高可以将蛋白溶液浓缩300倍。 /p p 　　2.5终产品的除菌除病毒过滤 /p p 　　浓缩后的样品，最终经过0.22μm无菌滤器进行除菌过滤。ULTA Pure SG，HC除菌滤器具有过滤速度快、化学稳定性好、载量高和溶出物少等优点，细菌挑战实验表明其除菌能力大于7log。除菌过滤过程的优化主要从三个方面入手：操作过程中过膜压力的控制、过膜流速以及单位膜载量控制，这三个参数优化以后，可以在同种类型、材质的NFF膜上进行线性放大，否则很容易影响收率。 /p p 　　Durapore除菌级亲水性滤膜由亲水性PVDF材料制造，具有可靠的除菌保证以及低蛋白吸附量、低析出、无纤维脱落、广泛的化学兼容性等优点，是常用的除菌滤膜。Durapore 0.22μm亲水性滤膜用于液体除菌或去除微粒，0.1μm亲水性滤膜用于液体中去除微粒、微生物和支原体。装有Durapore亲水性滤膜的滤器有Millipak、Opticap XL、Opticap XLT、筒式滤器和Optiscale等。Millipak滤器独特的堆叠盘状设计使残留量最小并且无颗粒脱落，因此适合于高附加值产品的终端过滤和灌装。Millipak和Opticap XL滤器都有O型圈垫片和软管倒钩连接的上游排气阀和排空阀设计，使操作简单易控。Opticap XL和XLT滤器的结构设计，特别耐高温、高压条件，在除菌过程中提供更高的稳定性和可靠性，同时更易清洗。Optiscale一次性滤器专为小规模工艺筛选和工艺放大所设计，是工艺评估的理想工具。 /p p 　　目前被广泛应用的生物制品病毒去除的方法是纳米膜过滤。纳米膜过滤有如下优点：(1)针对性强，实用性广：纳米膜过滤只与病毒和目的蛋白的大小有关，无论病毒是否有脂包膜外壳、是否耐热，纳米膜过滤都能将之去除。(2)毒性小，下游污染少：能有效去除杀灭病毒后可能留下的如抗原和核酸蛋白混合物等病毒标志物，有效降低下游污染，是纳米膜的另一特点。大多数病毒灭活处理都使用有毒或致突变的理化试剂，从而必须在使用后从蛋白质溶液中清除，而纳米膜过滤不存在毒性问题，只是在验证中要考虑到滤器浸出物的风险。(3)蛋白活性高，回收率高：纳米膜过滤是在正常条件下的pH、渗透压和温度下进行的温和的生产步骤，其蛋白回收率和活性都很高，通常在90%—95%。基于体外分析、实验研究和临床经验，纳米膜过滤试验都没有显示出蛋白质改变或是新抗原的产生。纳米膜过滤不改变制品特性，这一特点促进了监管机构认可和产品的注册。 /p p 　　日本Asahi Kasei公司于1989年推出了第一款专门为清除生物制药产品中病毒颗粒而设计的过滤器Planova，由亲水铜铵再生纤维素制成的中空纤维微孔膜，装入聚碳酸酯壳体中。Millipore公司的Viresolve NFP膜是一种复合PVDF膜，过滤盒被设计来从高纯蛋白溶液中移除小型病毒，如B19，蛋白质溶液中，B19的去除量通常& gt 4 log。PALL Life Science公司的Ultipor VF DV50和DV20膜式过滤器可以从生物流体中去除显著数量级的病毒，同时目标蛋白可以很好地通过。滤芯由三层独特的亲水、低蛋白吸附的PVDF滤膜经新月型打褶方式构成，过滤面积大，具有可靠、安全和高流量等特点。Sartorius Stedim生产的Virosart CPV为聚醚砜过滤器，能去除& gt 4 log的PPV和& gt 6 log的逆转录病毒。 /p p 　　2.5扩张柱床吸附层析技术 /p p 　　扩张柱床吸附层析技术(EBA)是上世纪九十年代初期进入下游生产，整合了发酵和下游纯化的技术。新一代STREAMLINE Direct扩张柱床设备及介质是EBA技术中最成熟的产品。通过条件优化，STREAMLINE能直接从浑浊的发酵液中捕获目标生物分子，细胞碎片及不吸附的杂质穿过扩张床内悬浮的介质被冲洗掉，将以往澄清、浓缩、捕获等步骤整合为一步，达到粗纯化的效果(图2)[17]。 /p p 　　STREAMLINE的操作过程如下[17-18]：(1)起始：将STREAMLINE介质倒入扩张柱中。(2)平衡：从下向上流的缓冲液，将STREAMLINE柱内的吸附介质悬浮起来，形成稳定的、充分平衡好的扩张床。(3)上样：发酵液带菌体从柱底进入，目标生物产品吸附在STREAMLINE介质上 不吸附的宿主杂质及菌体碎片随液流从柱顶排出。(4)淋洗/穿透：进一步用缓冲液将不吸附的杂质洗掉。(5)洗脱：洗脱液洗脱目标生物产品。(6)CIP/再生：用1M NaOH+1M NaCl进行CIP。整个操作过程如图3所示。 /p p 　　 /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201810/uepic/dba748ae-d64e-479c-8fb1-ea738ef437da.jpg" title=" 图4.jpg" alt=" 图4.jpg" / /p p style=" text-align: center " strong 图2　传统纯化工艺与STREAMLINE [17] /strong /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201810/uepic/0f71d1a8-a218-43f5-8c1f-917bd4f432a5.jpg" title=" 图5.png" alt=" 图5.png" / /p p style=" text-align: center " strong 图3 STREAMLINE的基本工作原理和操作过程[18](箭头示液体过柱时的流向) /strong /p p 　　STREAMLINE介质是一系列包裹着石英芯，以琼脂糖为骨架的介质。特殊设计的STREAMLINE扩张柱床可以产生稳定的向上拔的扩张液流，每一颗不同比重的STREAMLINE介质，悬浮在自身重力和扩张升力平衡的位置原地扰动。STREAMLINE技术是稳态扩张，样品流均匀分布整个床体，目标产物吸附均匀，穿透小，回收率高，类似于固定床吸附性层析[19]。 /p p 　　3. 抗体最新下游技术应用实例 /p p 　　Lonza Biologics公司是全球最大的抗体合同生产商之一，为了开发一个稳定的20000L的抗体生产工艺，其纯化开发部门对多个不同的抗体亲和层析凝胶进行了有效的比较，他们发现Mabselect SuRe的动态载量高、使用寿命最长、Protein A脱落最低，实验数据明确支持放大到1.4m直径的柱子用于20000L培养规模的经济生产[4]。 /p p 　　德国的Roche公司一种用于肿瘤治疗的单抗已进入临床Ⅲ期。他们将目前几种Protein A介质进行充分的比较之后，选择了高载量、更易于装柱和寿命更长的Mabselect。目的抗体是通过无血清培养的转染的杂交B淋巴细胞表达的IgG1。将过滤后的无细胞上清上样到Mabselect填充的FineLINE柱，直径300cm，柱高20cm，上样的浓度是30mg/ml。洗脱后，洗脱液立即用磷酸钾中和pH值到6.8-7.0，再用凝胶过滤检测，结果表明比活超过90%，纯度在95%以上[20]。 /p p 　　Cytheris公司是法国一家生物制药公司，目前正在研制一种用CHO细胞表达的免疫调节剂(临床Ⅱ期)。原先的工艺采用传统层析法，但不能稳定去除病毒。改进后，在工艺的第一步使用Mustang Q对污染物进行捕获，取得了25%去除率的良好结果 同时对MVM、MLV和Re03三种病毒也达到超过4个Log的滴度降效果，而整个工艺对病毒的去除效率普遍提高了7-11个Log。说明Mustang Q的使用对下游层析起到了很好的保护作用。 /p p 　　在第五届生物制药工艺优化大会上，Crucell公司介绍了他们对腺病毒(AAV)纯化工艺的摸索。与传统的层析填料相比，Mustang Q膜层析的开放孔道的设计使对病毒的动态载量大大提高30倍左右，回收率在80%以上。用40L的膜层析柱相当于1000L的传统层析柱的效果，节省了验证工作，提高了工艺经济性，十分有利于放大生产。 /p p 　　德国的Boehringer Mannheim公司生物制药部，用STREAMLINE技术代替传统工艺生产400L CHO细胞培养的Fc融合蛋白，结果样品回收率提高14%，缓冲液减少25%，时间缩短47%[17]。 /p p 　　世界最大的制药公司-GlaxoSmithKline公司，使用特别设计的BioProcess全自动层析系统和STREAMLINE扩张柱生产药用脂蛋白疫苗，比原工艺产品体积缩小2倍，纯化系数1.5，内毒素减少100倍[17]。 /p p 　　日本YOSHITOMI公司正在使用多套STREAMLINE 1000系统生产人重组白蛋白，与原生产工艺产品纯度相同，产率提高30%，时间减少一半，年产量为12.5吨[17]。 /p p 　　AVECIA公司重新设计临床Ⅲ期药品生产工艺，选用STREAMLINE技术及SOURCE新型凝胶，生产效率提高12倍，回收率提高1倍[17]。 /p p 　　2001年，ILEX制药公司的CAMPATH获得FDA批准。该单克隆抗体使用Sartobind Q离子交换层析模块以流穿的方式进行精制，这是膜吸附器首次被批准应用于治疗性蛋白的生产，证明了膜层析技术通过了证实和测试[30]。 /p p 　　4. 展望 /p p 　　随着抗体产品上游大规模高效培养技术的进一步发展,实验室规模哺乳动物细胞表达水平可以达到25g/L，如果这一水平能够有效放大到生产,将对下游生产纯化带来更大的压力。所以下游纯化工艺的技术发展也是势在必行。 /p p 　　以下一些发展方向可能成为下游工艺未来发展的重要关注点：(1)刚性更好、载量更高、耐碱性更好的完全亲水琼脂糖凝胶的开发[4]。(2)优化操作次序，降低缓冲液消耗的更大规模生产线的应用[21]。(3)通过单抗的氨基酸序列预测下游工艺关键参数：亲和层析洗脱pH条件、离子交换层析洗脱pH和盐浓度条件、病毒灭活pH等[22]。(4)下游工艺的成本消耗占全部成本的50-80%，亲和捕获是下游工艺的最关键步骤，通过改进亲和配体，提高捕获能力，节省成本[23]。(5)新型层析系统全程实时控制纯化过程，在线检测HCP、宿主DNA、Protein A等的含量[24]。(6)由于在去除杂质方面的优势，膜层析将会得到飞速的发展，未来工艺甚至可能完全基于膜层析而不是柱层析[25]。 /p p 　　参考文献 /p p 　　[1] 刘亚明,薛章.生物制药：迎接抗体药物的黄金时代.医药细分子行业研究报告,2009. /p p 　　[2] 陈志南.基于抗体药物的我国生物制药产业化发展前景.2008中国药学会学术年会暨第八届中国药师周论文集,2008. /p p 　　[3]Gail Dutton.Trends in Monoclonal AntibodyProduction.Feature Articles,2010, 30(4). /p p 　　[4]孙文改,苗景赟.抗体生产纯化技术.中国生物工程杂志,2008,28(10):141-152. /p p 　　[5]《人用单克隆抗体质量控制技术指导原则》.NICPBP(中国药品与生物制品检定所),2003. /p p 　　[6]Capto adhere：用于生产单抗的两步纯化操作.GE Healthcare公司技术资料. /p p 　　[7]中空纤维滤柱分离纯化应用集锦.GE Healthcare公司技术资料. /p p 　　[8]中空纤维膜过滤技术在单抗生产中的应用.GE Healthcare公司技术资料. /p p 　　[9]Amersham Biosciences.Downstream Gab’02 Abstracts,Extended Reports from the 2nd International Symposium on DownstreamProcessing of Genetically Engineered 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PALL LifeScience公司技术资料. /p p 　　[17]整合发酵和下游纯化的新技术：扩张柱床吸附技术.GE Healthcare公司技术资料. /p p 　　[18]余晓玲,米力，姚西英，陈志南.扩张柱床吸附层析与固定柱床层析纯化单克隆抗体的比较.中国生物工程杂志,2003,23(1):61-64. /p p 　　[19]High-throughput monoclonal antibody purification.GE Healthcare公司技术资料. /p p 　　[20]抗体纯化手册.GE Healthcare公司技术资料. /p p 　　[21]Purification Strategies to Process 5 g/L Titers ofMonoclonal Antibodies. BioPharm International技术资料. /p p 　　[22] T.Ishihara,T.Kadoya.Accelerated purification process development ofmonoclonal antibodies for shortening time to clinic:Designand case study of chromatography processes.J Chromatogr A,2007，1176(1-2)：149-156. /p p 　　[23] A.Cecilia,A.Roque,et al.Antibodies and Genetically Engineered RelatedMolecules:Production and Purification.BiotechnolProg,2004，20：639-654. /p p 　　[24] S.Flatman,I.Alam,et al.Process analytics for purification of monoclonal antibodies.JChromatogr B,2007，848：79-87. /p p 　　[25]ProcessChromatography:Five Decades of Innovation.BioPharmInternational技术资料. /p p 　　[26]双层滤板膜堆在单抗工艺上的大规模澄清过滤应用评估.BioProcessInternational技术资料. /p p 　　[27]Affinity Chromatography Media.Millipore公司技术资料. /p p 　　[28]ProSep Ultra Plus ChromatographyMedia.Millipore公司技术资料. /p p 　　[29]MEP Hypercel混合模式层析填料. PALL LifeScience公司技术资料. /p p 　　[30]Sartobind膜层析技术高效的蛋白纯化工具. SartoriusStedim公司技术资料. /p

一、目的和依据奥克巴胺也叫章鱼胺，因首次于章鱼唾液中发现而得名，是一种天然的β3-肾上腺素能受体激动剂，具有对-羟苯-β-羟乙胺的化学结构，是去甲肾上腺素的同类物。世界反兴奋剂组织《世界反兴奋剂条例国际标准禁用清单》（WADA清单）中明确将其列为赛内禁用物质。研究表明奥克巴胺在水果、蔬菜、肉、奶和鱼等食品中被检出，然而，目前关于食品中奥克巴胺的研究和监测多关注动物源食品，对植物源食品关注较少。研究发现，奥克巴胺在柑橘类植物源性食品及相关制品中被广泛检出。此外，在某些保健食品或膳食补充剂中可能非法添加奥克巴胺用于减肥。适量的奥克巴胺对人体的健康有益，但过量摄入会引起人体的内分泌紊乱和新陈代谢失衡，引起诸如头痛、恶心、心悸、血压变化、血糖不稳、呼吸紊乱等反应，严重的还会危及生命。目前国内关于奥克巴胺的检测标准仅有GB 5009.208-2016《食品安全国家标准 食品中生物胺的测定》，其仅适用于酒类、调味品、水产品以及肉类，不包含柑橘类水果及其制品等植物源性食品，我国尚无适用植物源性食品中奥克巴胺检测的国家标准，无法满足大型赛事食源性兴奋剂防控及日常监管需求。为避免食用含奥克巴胺浓度较高的柑橘类水果及制品、保健食品或膳食补充剂给运动员带来兴奋剂检出风险，降低对人民群众身体健康的不良影响，北京市食品检验研究院制定了BJS202211《植物源性食品中奥克巴胺的检测》方法。二、在食品监管实际中的应用BJS202211《植物源性食品中奥克巴胺的检测》适用于柑橘类（柑橘、橙子、柚子）及其制品（橘子汁、橙子汁、柚子汁）中奥克巴胺含量的测定，可用于柑橘等植物源性食品中奥克巴胺分布情况、本底含量等情况的系统调研活动，用以在大型赛事过程中加强柑橘类及果汁制品中奥克巴胺的内部控制。该检测方法的制定可为食品安全监管提供技术支撑，对减少运动员兴奋剂检出风险具有重要意义。三、先进性和创新性本次是对《植物源性食品中奥克巴胺的检测 液相色谱-串联质谱法》的首次制定。试样中的奥克巴胺经1%甲酸50%乙腈溶液提取、固相萃取净化后，采用液相色谱-串联质谱仪进行分离和测定，内标法定量。由于食品基质中组分复杂，本方法引用了内标，可使基质效应得以矫正，使其具有更好的适用性，从而极大提高分析结果的准确度、精密度和方法的可靠性。使用的液相色谱-质谱联用技术是近年来广泛使用的检测技术，由于其准确、高效和高灵敏度，符合目前食品安全检测所追求的快速高效的要求。该方法填补了奥克巴胺在植物源食品中无检测方法标准的空白，对柑橘及其制品中奥克巴胺含量的检测，可以建立奥克巴胺的防控规范，避免运动员的误食风险，为供赛食品供应渠道把关筛选工作提供了技术支撑，为大型体育赛事供应食品食源性兴奋剂防控工作提供了技术手段。四、操作注意事项实验操作中需要注意的要点如下：1.称取样品后加入内标，再进行提取净化操作，在前处理步骤之前加入内标可以更好地校正前处理带来的目标物损失；2.由于内标离子(139.193.1)对附近存在较强的基质干扰，在选择色谱柱及流动相条件时，应着重考察此内容；3.试样中奥克巴胺的测定值超曲线范围时，须重新进行测定，建议适量减少称样量，并通过增加提取液、复溶液体积等方式，对样品进行重新测定。在此过程中，要注意对稀释倍数进行准确的计算，使最终溶液中内标含量与标准溶液上样浓度保持一致，使其上机浓度在线性范围内再进行定量。

8日是法国巴黎为应对空气污染实施车辆单双号限行的第三天。面对“10年来最严重的空气污染”，有关官员呼吁“公民的爱国心和责任感”，因为“污染影响到每个人的生活”。　　法国国际广播电台7日报道称，由于连续四天遭遇空气污染，巴黎当地时间6日起临时采取车辆单双号限行等紧急措施。警方严令巴黎市区和周边22个市镇从6日凌晨起对单号车牌限行，警车、消防车、救护车、出租车以及电动汽车不在此列。　　虽然人们对限制车辆行驶的措施效果提出异议，但巴黎市警察总局还是认真执行这一限行措施，在巴黎及周边地区设立抽查点。巴黎公交系统同时对公众免费开放。据法新社报道，除巴黎以外，里昂等大城市也受到空气污染的影响，采取对车辆限行的措施。　　《巴黎人报》报道称，虽有限行措施，但是许多人还是冒险驾车出行，仅7日早晨到下午，警方已经对1764人开出了罚单(单次罚款22欧元，约合163 元人民币)。而有关环保协会指出，正因如此，限行措施对减少污染的影响并不明显，直到7日晚间雾霾仍未消退。与此同时，由于大量驾车人放弃开车转乘公共交通工具，巴黎轨道交通出现拥挤与班次紊乱的现象，以至于巴黎大区议会主席呼吁警方对违法驾车人网开一面。　　按照巴黎空气质量检测协会的分析报告，造成此次雾霾的原因主要有两方面：冬季采暖使用的木材燃烧污染和汽车尾气排放增加。气象条件也是此次雾霾的关键因素，巴黎周边因无风天气造成污染物难以扩散 污染物中约六成来自本地，其余四成来自周边国家，尤其是碳排大户德国。　　《环球时报》记者8日看到，巴黎虽然晴朗、天空依旧呈现蓝色，但望远时空气能见度明显降低。这与想象中的雾霾锁城的天气不可同日而语。尽管如此，法国卫生健康当局还是发出警告，建议老年人与身体状况弱的人留在室内，以免吸入有害健康的微粒子。　　为控制大气污染，巴黎市政当局已经采取大量措施，如近年来投巨资改建街道，还路于行人，大力限制车辆的行驶与停留，同时积极发展公交等。此外，从明年1月15日起，巴黎市将成为环保限行区，所有在巴黎行驶的车辆必须通过排污监测，贴上专有标签。

“第二届含氟温室气体论坛——履行《基加利修正案》的科学与技术”在北京大学顺利召开。会上北京交通大学吴婧副教授作了题为“氢氟碳化物（HFCs）网格化排放清单构建及降解产物研究”的精彩报告。吴婧副教授在汇报中从基于物质流的网格化排放清单核算方法研究及模型构建、中国网格化排放清单建立及环境效应分析、降解产物三氟乙酸（TFA）大气监测及环境行为研究等三个方面作了详细报告。图1 吴婧副教授作报告吴婧副教授首先介绍了国家级、省级、网格化含氟温室气体排放清单核算方法以及多尺度高分辨率排放源空间分配模式的动态网格化排放清单模型。构建的排放清单方法学及清单结果已应用于国家温室气体清单编制相关工作。图2 动态网格化排放模型的总体架构图应用该模型，吴婧副教授课题组建立了中国8种HFCs 2005-2060 年长时间序列的动态网格化（1 度×1 度）排放清单并分析了其环境效应。同时，通过将NAME正向模型的模拟浓度与观测浓度进行比较，以验证了建立的网格排放量的准确性。根据清单和分析结果，行业、物质和空间的排放变化特征如下：（1）实物、GWP排放的关键物质均为HFC-134a、HFC-32、HFC-125。（2）制冷空调行业始终是HFCs排放的主要行业，消防行业排放也不容忽视。（3）整体空间规律表现为东部高于西部、南方高于北方的特征；热点网格主要集中在上海、广东和北京。在环境影响方面，中国HFCs温室气体排放对全球贡献逐年升高；减排HFCs会显著减少气候影响，但替代可能加速降解产物三氟乙酸（TFA）的累积。此外，吴婧副教授探讨了含氟温室气体降解产物三氟乙酸（TFA）大气污染特征、气粒分配机制及来源归趋。2021-2022研究期间TFA年均大气浓度为1081.5 ± 724.7 pg m-3 。年均颗粒相质量分数为10.8 ± 9.8% ，更易分配在气相。全年TFA沉降通量约为489.70 ± 64.26 μg m-2 yr-1 ，湿沉降占总沉降的74.6%。

2010年4月15日，全球科学服务领域的领导者赛默飞世尔科技公司携手全球领先的化学公司巴斯夫宣布，由两家公司共同合作的“热熔挤出技术药物创新工作坊”在上海正式创立，为中国医药行业的生产和科研单位免费提供最新的热熔挤出(HME)专用辅料和先进的HME仪器的操作体验。 　　最初由塑料工业开发， HME技术正在成为一种新型的药物传递技术，创造性地将加工技术与药学结合起来进行药物传递研究。该技术可将高分子材料在其玻璃化转变温度以上进行处理，促使热塑性粘合剂和/或聚合物、活性成分达到分子水平的有效混合。 　　HME技术结合了固体分散体技术和机械制备的诸多优势，实现了无粉尘、可连续化操作、良好的重现性以及极高的生产效率。该技术不仅可以促进难溶性活性成分溶解从而提高其生物利用度，还可用于延缓水溶性活性成分的溶解，制备缓控释或肠溶制剂 此外，还能应用于制备掩味微丸或者其它特殊形状的制剂，如膜剂、棒剂等。由于整个挤出过程持续时间很短且无须加入水或有机溶剂，因此不需加热干燥，不易发生水解等问题。 　　作为全球科学服务领域的领导者，赛默飞世尔科技公司所生产的热熔挤出机符合cGMP的要求，而此次专程运抵上海的Mini-Lab每次只需5克物料即可完成整个实验。作为全球领先的化学公司，巴斯夫提供的材料包括Soluplus--全球首个专门针对HME技术设计的新材料和Kollidon VA 64等已广泛用于制备固体分散体的材料。 　　自即日起至10月31日，本工作坊开始接受制药企业或科研单位的申请和预订，每月为客户提供1-2次实验机会。成功登记的单位将享受如下服务： 　　实验所需的设备和主要材料；实验的工艺参数报告；提供现场和后续技术支持。 　　请勿错失良机!试用机会有限，如果您对HME技术感兴趣或正在从事相关的研发项目，立即注册即有机会享受尊贵服务。详细信息请登陆：http://www.thermo.com.cn/workshop。 　　关于赛默飞世尔科技 　　赛默飞世尔科技(纽约证交所代码：TMO)是全球科学服务领域的领导者，致力于帮助客户使世界更健康、更清洁、更安全。公司年度营收达到100多亿美元，拥有员工35,000多人服务客户。这些客户包括：医药和生物技术公司、医院和临床诊断实验室、大学、科研院所和政府机构以及环境与工业过程控制装备制造商等。公司借助 Thermo Scientific 和 Fisher Scientific 这两大品牌，帮助客户解决从常规测试到复杂的研发项目中所面临的各种分析方面的挑战。Thermo Scientific像客户提供了一整套完整的高端分析仪器、实验室设备、软件、服务、耗材和试剂，以实现实验室工作流程综合解决方案。Fisher Scientific 为卫生保健、科学研究，安全和教育领域的客户提供完整的实验室装备、化学药品、供应品和服务的组合。赛默飞世尔科技将努力为客户提供最为便捷的采购方案，为科研的飞速发展不断地改进工艺技术，并提升客户价值，帮助股东提高收益，还为员工创造良好的发展空间。欲了解更多信息，请浏览公司网站: www.thermofisher.com 或中文网站www.thermo.com.cn www.fishersci.com.cn 。 　　关于巴斯夫 　　巴斯夫是全球领先的化工公司：The Chemical Company。公司的产品范围包括从化学品、塑料、特性化学品、农用产品、精细化学品到石油和天然气。作为值得信赖的合作伙伴，巴斯夫帮助各行各业的客户取得更大成功。通过提供高价值产品和智能解决方案， 巴斯夫在应对全球面临的问题中扮演重要角色，如气候保护、能源效率、营养以及交通运输与移动通讯领域等。巴斯夫2009 年全球销售额超过500 亿欧元，截至2009 年底员工约105,000 名。若想获得更多关于巴斯夫的信息，请访问: www.basf.com。

相关新闻专题：奥林巴斯“丑闻”引仪器行业深思 　　北京时间12月15日上午消息，奥林巴斯昨天提交的最新财报显示，其资产负债表出现缺口，导致外界担心该公司将通过融资修复财务状况，推动该股今天暴跌19.6%。 　　奥林巴斯在最新财报中减记了840亿日元(约合10.8亿美元)净资产。奥林巴斯还表示，截至9月末，该公司的净资产仅为460亿日元，远低于2007年3月的2250亿日元。 　　在截至9月的6个月内，该公司净亏损323.3亿日元。 　　奥林巴斯股价目前在1100日元左右运行，跌幅约为16%。盘中最高曾触及1056日元的最低点，跌幅高达19.6%。

核电作为一种成熟、经济、安全和清洁的能源，越来越受到“一带一路”沿线国家的青睐，也是目前国家要大力发展的重点科技项目。中国核电项目除了满足国内电力市场的需要，也在不断向国际市场推进。核电站的运行安全是民生问题也是广受瞩目的世界性问题。? 2018年9月5日-7日，第五届国际核电运维大会在深圳大亚湾盛大召开，本届核电运维大会由上海市核电办公室主办，以“共享运维经验，推进技术发展，树立行业标杆”为主旨，吸引了近600个参会代表参加。 工业视频内窥镜在核电站的应用非常之广泛，通过包括内窥镜在内的众多无损检测手段，使得核电站的运行安全得到了有效保障。正使得核电行业真正成为利国利民、绿色环保的新兴能源支柱。??奥林巴斯出席第五届国际核电运维大会奥林巴斯出席第五届国际核电运维大会?众多与会者聚集在奥林巴斯展位前询问并了解内窥镜产品与会者询问产品功能 核电站内部的结构非常复杂，主要分为核岛和常规岛，核岛包括反应堆等一次回路系统和蒸发器等二次回路系统，常规岛主要是蒸汽传输系统和汽轮机系统。各个系统之间都需要通过大量的管道进行连接。核电管道内部质量有着非常严格的检测标准和要求，除了在生产过程中要进行质量监检，在吊装、焊接过程中更要经过非常严格的把控，每一道焊口都要进行多种手段的探伤分析，比如焊接形状缺陷，气孔，未焊透，未溶合等。?奥林巴斯工业视频内窥镜 iplex nx?? iplex nx拥有独特的多点物距测量功能，能够实时测量从内窥镜镜头末端到检查表面上多个点之间的距离。该功能有助于用户实时了解目标物体的倾斜度或表面高度差。独有的抗辐射能力设计 1320 gy辐射量 1720 gy 辐射量? 工业视频内窥镜作为最直观的检测手段，被广泛应用在管道焊接后的内部质量控制上。除了通过视频手段检测焊缝质量外，同时也对管道内出现的任何异物进行发现和处理，从而确保每一个系统的工艺管线质量最优，在核电站建设的初始阶段就严把质量关，杜绝安全隐患。-END-

编辑| Rita润色| 孙平校阅| Lucy、Joanna12月19日，嫦娥五号采集的月球样品正式交接国家天文台，我国首次地外天体样品储存、分析和研究工作也将在这里拉开序幕。作为检测仪器之一，HORIBA拉曼光谱仪有幸参与其中，助力科研人员开展月球样品与科学数据的应用研究。图1 月球土壤现场交接（图片来源：新华网）01以月壤为支点，撬动宇宙发展奥秘，开发月球资源据悉，经初步测量，嫦娥五号任务采集的月壤约1731克。那么，经过千辛万苦取得的月壤究竟能用来干什么呢？中科院专家表示，月壤是从月球固体岩石圈到太阳系空间的过渡带，包含着相关区域的大量信息。对月壤的研究不仅涉及月球本身，还包含太阳系空间物质和能量的重要信息。其中包括太阳系早期演化的历史记录、月岩和月壤的宇宙线暴露与辐照历史、月球中挥发分的脱气历史、太阳风的组成、太阳表层的成分特征、小天体和微陨石撞击月球的历史记录等。图2 研究人员为月球样本称重（图片来源：新华网）除了探索月球历史之外，研究月球岩石还对开发月球资源意义重大。据全国空间探测技术首席科学传播专家介绍，研究月球样品的重要成果之一，就是发现其中含有氦-3。氦-3是世界公认的高效、清洁、安全的核聚变发电燃料。据计算，100吨氦-3所能创造的能源，相当于全世界一年消耗的能源总量。氦-3在地球上的蕴藏量极少，地球已知且易取用的只有500公斤左右，而在月球浅层的氦-3含量却多达上百万吨，足够解决人类的能源之忧。02现代科技助力科学研究，HORIBA拉曼成开路先锋为迎接月壤的归来，国家天文台已建成国内首个“月球样品实验室”，装备了最先进的仪器设备。目前已亮相的就包括HORIBA 拉曼光谱仪HR Evolution，它有幸成为月壤研究的开路先锋。拉曼光谱作为一种无损、非破坏的分析技术， 可以有效提供样品化学结构、结晶度、晶型等信息，这对于月壤这样稀有而珍贵的矿物样品来说至关重要。一般而言，矿物成分复杂未知，HR Evolution的高分辨有助于更加精准鉴定矿物成分及晶型，且真共焦三维滤光技术可有效去除非样品信号，提高灵敏度，为探测高复杂未知背景下的目标拉曼信号提供保障。另外，SWIFT 快速成像技术能够快速获得矿物整体成分分布信息，可以全面深入地研究矿物地质样品。图3 月球样品实验室的HORIBA拉曼光谱仪（图片来源：新华网）如果您对上述产品感兴趣，欢迎扫描如下二维码留言，我们的工程师将会及时为您答疑解惑。嫦娥五号“探月”归来，实现了我国航天史上多个重大突破，在后续的科学研究中，相信科研人员定会不负众望，倾尽全力，协同攻坚，做出佳绩。HORIBA拉曼光谱仪 HR Evolution有幸为此次科学研究贡献力量，希望能够发挥优势，再立新功。未来，HORIBA将承载着光荣与梦想，继续砥砺前行，奋力开拓，持续为客户提供优质技术产品和服务，助力科研人员接受挑战，铸就不凡。免责说明HORIBA Scientific 公众号所发布内容（含图片）来源于文章原创作者或互联网转载，目的在于传递更多信息用于分享，供读者自行参考及评述。文章版权、数据及所述观点归原作者或原出处所有，本平台未对文章进行任何编辑修改，不负有任何法律审查注意义务，亦不承担任何法律责任。若有任何问题，请联系原创作者或出处。

脂质体及聚合物作为纳米药物的常用载体，在药物合成方面已取得了巨大的成功，但在靶向递送方面，仍存在着诸多挑战，纳米药物该如何实现靶向递送呢？在谈论靶向之前，先要了解一个关键的药理学概念，以器官靶向为例：器官靶向药物输送不是将所有给药剂量都输送到目标器官，而是提供足够的剂量以达到所需的生物效果，同时限制脱靶积累的毒性；即使大部分注射剂量没有到达目标器官，也应该足以引起生理效应并为患者提供益处。靶向方式分类纳米药物靶向的方式多种多样，总的来讲，可以分为三大类（如图1）。图1. 靶向方式归类图被动靶向被动靶向依赖于调整纳米颗粒的物理性质，如大小、形状、硬度和表面电荷，使其与解剖学及生理学相结合。例如，调节纳米颗粒的大小可以确定纳米颗粒从不连续的血管（如肝脏和脾脏中的血管）外渗的趋势。主动靶向主动靶向包括用化学或生物的方法修饰纳米颗粒的表面，使其特异性地与靶器官高度表达的受体或其他细胞因子相结合。例如，用单克隆抗体修饰纳米颗粒，以使核酸传递到难以转染的免疫细胞中。内源性靶向内源性靶向包括设计纳米颗粒的组成，使其在注射时与血浆蛋白的一个不同的亚群结合，从而将其引导到目标器官并促进特定细胞的摄取。例如，参与体内胆固醇运输的蛋白质已被证明是脂质纳米颗粒有效的肝细胞传递所必需的。对比而言，被动靶向和内源性靶向的设计度与可控性相对较低，主动靶向自然成为了靶向递送的研究焦点。在肝外靶向的研究中，就涉及了较多的主动性靶向，表1也列出了多种肝外给药的纳米颗粒组合物。表1. 用于肝外给药的纳米颗粒组合物靶向修饰方法药物靶向本质上为官能团之间的相互作用，即纳米药物表面的核心基团与受体部位的基团进行化学结合。以脂质纳米颗粒为例，载体组分中的PEG脂质多位于颗粒表面且本身易于修饰，因此，可以在PEG脂质上加载受体部位的结合基团以实现靶向目的。以下列举了几种常见的PEG脂质修饰方法。马来酰亚胺修饰使用DSPE-PEG2000-马来酰亚胺作为功能化PEG脂质，替换LNP中一定摩尔量的聚乙二醇脂质，通过其取代的羧基端半胱氨酸直接与肽偶联，可以形成肽靶向的纳米粒子。再如SS-31，一种线粒体靶向的四肽，具有巯基，只需与马来酰亚胺标记的脂质纳米颗粒孵育，即可进行硫酰马来酰亚胺偶联。NHS修饰NHS酯通常用于标记胺基生物分子。NHS酯与胺基的反应具有pH依赖性，结合的较佳pH值与生理环境的pH值相同。使用DMG-PEG-COOH-NHS作为功能化PEG脂质，替换LNP中一定摩尔量的聚乙二醇脂质，通过在C端添加赖氨酸修饰MH42，并通过其侧链的伯胺偶联，可以形成肽靶向的纳米粒子。同样，许多具有胺基的抗体和靶向肽也可通过该反应偶联到脂质纳米颗粒上：乳铁蛋白可特异性结合活化的结肠巨噬细胞上的LRP-1，实现细胞靶向抗炎治疗；还有较为熟知的程序性死亡配体1单克隆抗体的应用。氨基修饰氨基有利于醛酮分子的化学选择性附着。甘露聚糖还原端醛基与氨基羧基修饰的脂质之间肟偶联反应的正交特性保证了脂质纳米颗粒表面多糖分子的取向。甘露聚糖受体靶向脂质体既可以作为抗菌药物递送的载体，也可以作为用于免疫治疗的重组疫苗的载体。DBCO修饰DBCO标记可促进巯基-炔反应，并可选择性偶联荧光探针、亲和标记和细胞毒性药物分子。例如，抗体scFv-N3可被有效地偶联到DBCO修饰的脂质纳米颗粒上。研究发现，抗体修饰的脂质纳米颗粒可穿越血脑屏障，并诱导脑特异性积累，以治疗中枢神经系统疾病。结论：人体复杂的生化环境给纳米药物的靶向递送制造了诸多阻力。在实际探索中，被动靶向，主动靶向和内源性靶向，可作为靶向设计的联合工具，在寻找绝对的靶向位点、真实的靶向机理与达到实际的靶向效果之间寻求平衡。在此当中，主动性靶向的尝试值得支持，正如文中所讲PEG脂质的各种修饰方式，大量的设计性尝试定能排除越来越多的靶向干扰因素，朝靶向机理的挖掘处更深一步。参考文献：1. Menon, Ipshita et al. “Fabrication of active targeting lipid nanoparticles: Challenges and perspectives.” Materials Today Advances (2022): n. pag.2. Dilliard, S.A., Siegwart, D.J. Passive, active and endogenous organ-targeted lipid and polymer nanoparticles for delivery of genetic drugs. Nat Rev Mater (2023).3. Herrera-Barrera, Marco et al. “Peptide-guided lipid nanoparticles deliver mRNA to the neural retina of rodents and nonhuman primates.” Science Advances 9 (2023): n. pag.应用范围:纳米药物制备系统:

癌症患者的治疗过程往往相当痛苦，一些抗癌药物&ldquo 威力巨大&rdquo ，在杀死癌细胞的同时也使大量正常细胞受损，有没有什么药物能只攻击&ldquo 坏细胞&rdquo ，绕过&ldquo 好细胞&rdquo ?记者从中科院合肥物质科学研究院获悉，近日，该院强磁场科学中心药物学研究团队和我市一家医药科技企业共建创新靶向药物联合实验室，重点研发靶向抗癌药物，从而最大程度上降低药物对人体的伤害。 　　什么叫靶向药物?靶向药物指被赋予了靶向能力的药物或其制剂，其目的是使药物或其载体能瞄准特定的病变部位，并在目标部位蓄积或释放有效成分。靶向制剂可以使药物在目标局部形成相对较高的浓度，从而在提高药效的同时抑制毒副作用，减少对正常组织、细胞的伤害。 　　对于普通药物而言，通常在进入体内后仅有极少一部分真正作用于病变部位，这是制约药物疗效，并导致药物毒副作用的根本原因。获取具有像导弹一样精准靶向能力的药物是人类的梦想，也是药物开发的终极目标。 　　据了解，2012年以来，中科院强磁场科学中心药物学研究团队以生命健康为出发点，以肿瘤精准治疗为目标，以转化医学为实施手段，成功建设了以高通量为特色的蛋白层次核磁筛选系统、计算机高通量虚拟筛选系统和常规细胞层次高通量、高内涵筛选系统的药物开发和测试硬件体系。快速开发了研究肿瘤精准治疗所需的单基因依赖性的全细胞筛选库软件体系，建立了不同组织来源和基因背景的癌症细胞系库，构建了包含商业小分子药物和自行设计合成的新型小分子药物库。 　　据研究团队负责人刘青松研究员介绍，目前，他们已经针对B细胞淋巴癌、前列腺癌、结直肠癌、急性白血病、非小细胞肺癌等研发出一批抗癌抑制剂，有望实现对这些肿瘤的精准靶向治疗。

J.T.Baker于2010年7月在SEMICON® West 2010（July 13-15, in San Francisco）发布一项新方案，以改善用于半导体制造的残留物清除工艺。 　　这项功能强大的新解决方案——BAKER CLk™ -168 post-ash cleaner，是MBI的最新产品，用于解决半导体的post-ash残留去除。 　　详情全文请见以下链接：http://www.mallbaker.com/news/documents/MBI_CLk_168.pdf 　　关于J.T.Baker 　　杰帝贝柯化工产品贸易（上海）有限公司（JTBs）于2009年正式成立，是美国MallinckrodtBaker Inc的全资子公司。MallinckrodtBaker Inc拥有的J.T.Baker和Mallinckrodt 两大品牌有130多年的历史，其化学品领域的高品质产品，最优化的应用方案和功能性检测可以满足客户的高端应用需求，并确保高精度和高重现性的结果。