酪蛋白胨

细胞治疗的福音--PeproTech多种无动物成分(Animal Free)蛋白大促销细胞治疗是将人体细胞经体外培养、诱导增殖活化后回输入人体的一种治疗肿瘤等疾病的方法，因安全、有效，并能提高生活质量而广为人们所关注和采用。细胞治疗离不开细胞培养，而培养过程中细胞因子或活性蛋白的加入不可或缺，这些细胞因子或活性蛋白目前基本上都是重组表达而来。左图显示细胞因子和活性蛋白的传统表达法。在该法的表达阶段，对于原核细胞表达，培养时需在培养基中加入蛋白胨；而真核细胞表达时，则需在培养液中加入牛血清。蛋白胨和牛血清都是动物成分，因此用传统表达法表达出来的细胞因子或活性蛋白不可避免的会混入动物成分。举个简单的例子，如果想用传统方法表达人IL-2，则最后得到的重组人IL-2中可能会有牛的IL-2或其它成分，这样的人IL-2用于临床时可能会给患者带来安全问题，治疗效果也可能会受到影响。无动物成分(Animal Free)的细胞因子和蛋白则是在传统表达法的基础上，对原核和真核细胞的培养体系进行了改进，其中不加入蛋白胨和牛血清，因此最后所得的细胞因子和蛋白中不会含有动物成分，这样也就具有了以下几个突出的优势：1. 传统蛋白可能会给患者引入疯牛病病毒或其他未知病原体，而无动物成分(Animal Free)蛋白不会。2. 传统蛋白中的动物抗原可能会引起临床使用时的异种排斥和过敏反应，而无动物成分(Animal Free)蛋白不会。3. 传统蛋白中的痕量动物激素或其它活性成分可能会给患者带来副作用，而无动物成分(Animal Free)蛋白不会。为给国内的细胞治疗，无论是免疫细胞治疗，还是干细胞治疗提供更安全的、更经济实惠的蛋白产品，PeproTech公司推出无动物成分(Animal Free)蛋白促销活动，与传统蛋白同价。抓住这次机会，以更优惠的价格获得PeproTech高端产品。 阅读原文：http://www.liankebio.com/ProductCenterShow/articleID/2014040008.html

21世纪，全球各个国家都处在一个经济、信息、科技多方面高速发展的时期。经济的发展提高了绝大多数人们的生活水平，信息科技的大爆炸拓展了人们的视野和见识，科技的进步为人类的持续发展和安全提供源动力。然而，事物通常都具有两面性，给我们带来便捷和效益的同时，也将衍生诸多问题。食品安全问题愈发严峻，便是当今经济、信息、科技发展的副产物。食品企业追求经济利益最大化时，往往利用一些不法的伪科学手段来降低企业生产成本，损害人们的身心健康安全。层出不穷的食品安全事件，尤其在乳制品行业年年都接连不断地爆发，如同挥之不去的梦魇，在这个信息大爆炸的时代，迅速传播，不断地刺痛着人们越来越越敏感脆弱的神经。 日前，香港商业调查机构CER公司公布报告称，某洋品牌配方奶粉远未达到国际标准甚至是中国所能接受的最低标准，被指最差洋奶粉。质量最差门主要是该品牌1段婴幼儿配方奶粉，乳清蛋白和酪蛋白比例不合格。说明称，乳清蛋白中含有高浓度、比例恰当的必需氨基酸，还含有为新生儿必需的半胱氨酸。乳清蛋白还含有包括免疫球蛋白和双歧因子等免疫因子。对于宝宝而言，乳清蛋白是一种优质蛋白，因为它容易被消化，蛋白质的生物利用度高，从而有效减轻肾脏负担。酪蛋白中含有丰富的必需氨基酸，还含有婴儿特别需求的蛋氨酸、苯丙氨酸及酪氨酸。酪蛋白中结合了重要的矿物元素，如钙、磷、铁、锌等。但是，酪蛋白是一种大型、坚硬、致密、极困难消化分解的凝乳。过量的酪蛋白会产生较高的肾溶质负荷，给宝宝肾脏带来较重的负担，对宝宝是不安全的。 乳清蛋白和酪蛋白各有好处，但合适的比例还是应该以母乳作为黄金标准。母乳中乳清蛋白和酪蛋白的比例为60 : 40(而普通牛奶中乳清蛋白和酪蛋白的比例为18 : 82)。而此次被检测出的该品牌奶粉，乳清蛋白和酪蛋白的比列为41 : 59。国际食品法典委员会（CAC）在&ldquo 婴儿配方食品及特殊医学用途婴儿配方食品&rdquo 标准中，没有对产品中乳清蛋白的比例提出要求，而推荐以必需和半必需氨基酸的含量是否接近母乳作为婴儿配方食品中蛋白质质量的判定依据。其他国家和地区（包括美国、欧盟和澳大利亚、新西兰等）均未规定乳清蛋白在蛋白质中所占比例。我国国家标准GB10765－2010《婴儿配方食品》中，要求&ldquo 乳基婴儿配方食品中乳清蛋白含量应&ge 60%&rdquo ，即以乳或乳蛋白制品为主要原料的婴儿配方食品中，乳清蛋白所占总蛋白质的比例应大于等于60%。该要求主要是参考了母乳中乳清蛋白和酪蛋白的比例，沿用了我国GB10766－1997《婴儿配方乳粉ⅡⅢ》中关于乳清蛋白比例的相关规定。 各种品牌的婴儿奶粉都在宣称"接近母乳"，其中乳清蛋白和酪蛋白的比例是一个重要的指标，因为它能提供最接近母乳的氨基酸组合，更好地满足宝宝的成长需要。实际上，牛奶中酪蛋白含量的测定对于乳制品和奶酪制品生产商也都具有重大的经济意义。厂商通过测定酪蛋白含量，可以精确预测利用牛奶生产奶酪的产量。目前，市场上已经有一种快速测定乳清蛋白和酪蛋白比例的方法，是由美国CEM公司提出，在一些实验室应用推广。原理上是利用快速真蛋白测定仪，测得总蛋白含量后，沉淀及过滤酪蛋白，再测量乳清蛋白含量，能够快速精确得出酪蛋白含量，从而确定乳清蛋白和酪蛋白比例。整个过程仅需约15分钟,精确度和重复性相比其它凯氏定氮法和凝胶色谱法等更高，且没有污染性、腐蚀性试剂。这种高效而环保的方法值得推广，使用。 美国 CEM SPRINT 真蛋白质测试仪 更多详情，请联系培安公司： 电话：北京：010-65528800 上海：021-51086600 成都：028-85127107 广州：020-89609288 Email: sales@pynnco.com 网站：www.pynnco.com

牛奶中蛋白质主要有乳清蛋白和酪蛋白两大类。酪蛋白中又分β-酪蛋白、keppa-酪蛋白和alpha-酪蛋白，其中β-酪蛋白约占蛋白总量的30%，是氨基酸的重要来源，同时在体内传递重要的矿物质（如钙、磷等），促进其消化吸收。A2β-酪蛋白是现代奶牛β-酪蛋白的天然原型。最初，所有家养的牛生产的牛奶中只含有A2β-酪蛋白，后来因自然基因突变，出现了A1蛋白的变体。研究表明，A2β-酪蛋白与母乳中的β-酪蛋白更接近，更有利于促进婴幼儿的生长发育。福斯MilkoScan™ FT3快速检测牛奶中A2β-酪蛋白A2β-酪蛋白的常规测定方法比较繁琐、耗时长、单样成本高。现在，MilkoScan™ FT3乳品分析仪通过建立A2β-酪蛋白的定标模块，可以直接检测A2β-酪蛋白。快速了解MilkoScan™ FT3FTIR技术40秒快检，结果准确可靠应用A2β-酪蛋白定标模块无需样品制备，直接上机检测掺假筛查MilkoScan™ FT3检测巴氏杀菌奶中的A2β-酪蛋白，定标样品和验证样品分布如下:FT1检测巴氏杀菌奶中的A2β-酪蛋白，定标样品和验证样品分布如下:

3月16日，厦门大学医学院神经科学研究所张杰教授、冷历歌副教授团队在PLOS Biology发表题为“Hypothalamic Menin regulates systemic aging and cognitive decline”的研究论文。该研究表明，下丘脑中一种叫Menin的蛋白质的下降可能是衰老的一个关键驱动因素，而通过食物简单地补充一种氨基酸就可能逆转衰老带来的一些生理变化。 Menin是一种重要的蛋白质，它由Men1基因编码，在人类体内广泛表达。Menin的功能十分复杂，已有的一些研究表明，Menin可以与DNA结合，并与许多转录因子相互作用，调节基因表达。此外，Menin还可以参与蛋白质泛素化、修饰、细胞周期等多种生物学过程。在肿瘤发生中，Menin被认为是一个关键的肿瘤抑制因子，可以调控多种肿瘤相关基因的表达。 下丘脑被认为是生理衰老的一个重要调节器，通过随着时间的推移增加神经炎症信号的过程来发挥作用，而炎症会促进大脑和外围的多种与年龄有关的过程。 在最新的这项研究中，张杰、冷历歌团队表明，Menin，是下丘脑神经炎症的一个关键抑制剂，这引发了他们对Menin在衰老中的作用的探究。 在下丘脑中，他们观察到Menin的水平随着年龄的增长而下降，星形胶质细胞或小胶质细胞则不会。为了探究Menin水平下降带来的后果，研究人员开发了可以阻断 Menin 活性的条件性基因敲除小鼠。结果发现，在年轻小鼠身上，Menin的减少导致下丘脑神经炎症增加、出现包括骨密度降低、皮肤厚度降低、认知下降等衰老相关表型，寿命一定程度缩短。 Menin减少带来的另一个变化是氨基酸D-丝氨酸的降低。D-丝氨酸是一种神经递质，对神经元突触可塑性和学习记忆等认知功能至关重要。D-丝氨酸广泛存在于大豆、鸡蛋、鱼和坚果等食物中。研究人员指出，Menin水平的降低调节了一种与D-丝氨酸合成相关酶的活性，因而影响了D-丝氨酸的水平。 Menin水平的降低推动了衰老进程 那么，阻止与年龄相关的Menin丢失，是否可以可以逆转生理衰老的症状呢？ 为此，研究人员将Men1基因植入老年（20个月大的）小鼠的下丘脑来进行验证。结果表明，30天后，小鼠的皮肤厚度和骨量有所改善，学习、认知和平衡能力也有所提升，这与海马体中D-丝氨酸的增加有关，海马体是非常重要的一个大脑中枢区域，参与学习和记忆等过程。 更为惊奇的是，通过三周的D-丝氨酸膳食补充，可以在认知方面获得类似的好处，但对于外周衰老的症状并无显著改善。 冷历歌在一份新闻稿中表示：“我们推测，下丘脑Menin表达的下降可能是衰老的一个驱动因素。Menin可能作为关键蛋白连接着衰老的遗传、炎症和代谢等因素。用D-丝氨酸治疗于认知衰退富有极大的前景。” 不过，研究人员还指出，关于Menin在衰老中的作用还有很多需要了解的地方，包括导致其下降的上游机制。需要进一步的研究来评估利用这个新发现的通路的潜力，以及减缓表型衰老的程度和持续的时间。还有待确定的是，补充D-丝氨酸是否会引起其他不可预料的变化。 文章链接：https://journals.plos.org/plosbiology/issue

根据标准化工作的总体安排，现将申请立项的《猫砂》等108项轻工行业标准计划项目予以公示（见附件1），截止日期为2023年6月12日。如对拟立项标准项目有不同意见，请在公示期间填写《标准立项反馈意见表》（见附件2）并反馈至我部，电子邮件发送至qgbz445@163.com（邮件注明：轻工行业标准立项公示反馈）。联系电话：010-68396445附件: 1. 2023年6月轻工行业标准制修订计划（征求意见稿）2.标准立项反馈意见表中国轻工业联合会质量标准部2023年6月6日 相关标准如下：序号体系编号标准项目名称代替标准项目周期（月）标准化技术组织1210000003000000005CP聚合级γ-氨基丁酸24中国轻工业联合会2210000003000000006CP生物基聚丁内酰胺24中国轻工业联合会3041010001000000007JC轻工机械 智能化通用技术要求24全国轻工机械标准化技术委员会4045510003050000001CP降膜式蒸发器QB/T 1163-200018全国食品加工机械标准化技术委员会5045510003050000002CP外循环列管式真空蒸发器QB/T 1829-199318全国食品加工机械标准化技术委员会6045510001000000011JC乳品机械名词术语QB/T 3921-199918全国食品加工机械标准化技术委员会7045510001000000010JC乳品机械型号编制方法QB/T 1823-199318全国食品加工机械标准化技术委员会8084100006020399002CP金属保温饭盒24全国金属餐饮及烹饪器具标准化技术委员会9081740101040100055CP旅行剪刀QB/T 1234-199118全国五金制品标准化技术委员会日用五金分技术委员会10201190720010105001CP冷库保温门24全国制冷标准化技术委员会冷藏柜分技术委员会11093770003010000011CP玻璃容器 化妆品瓶罐24全国日用玻璃标准化技术委员会12152950001000000024GL食盐安全信息追溯体系规范QB/T 5279-201818全国盐业标准化技术委员会13061410403040500177CP滤嘴棒纸QB/T 2689-201518全国造纸工业标准化技术委员会14041010201010200020CP连续式软管吹瓶机24全国轻工机械标准化技术委员会制酒饮料机械分技术委员会15041010201010100059CP白酒灌装旋盖一体机24全国轻工机械标准化技术委员会制酒饮料机械分技术委员会16041010201010200002CP饮料灌装旋盖机QB/T 2371-199818全国轻工机械标准化技术委员会制酒饮料机械分技术委员会17041010201019900021CP果蔬汁(含颗粒)饮料热灌装生产线QB/T 4441-201218全国轻工机械标准化技术委员会制酒饮料机械分技术委员会18140640014030800025CP植物提取物 螺旋藻多糖24全国食品工业标准化技术委员会19140640000040200011FF食品中L-阿拉伯糖的测定24全国食品工业标准化技术委员会20140640001040000105FF乳制品中A2型β-酪蛋白的测定24全国食品工业标准化技术委员会21140640016050000025GL芒果粉加工技术规程24全国食品工业标准化技术委员会22140640016040000026FF大蒜制品中蒜氨酸的测定24全国食品工业标准化技术委员会23140640014030400026CP抗性淀粉24全国食品工业标准化技术委员会24140640011050000001GL灵芝孢子油加工技术规范24全国食品工业标准化技术委员会25140640001050000100GL婴幼儿配方乳粉行业产品质量安全追溯体系规范QB/T 4971-201818全国食品工业标准化技术委员会26140640001040000101FF生乳及纯奶中钙的快速测定方法24全国食品工业标准化技术委员会27140640001040000102FF乳及乳制品中低聚果糖的检测24全国食品工业标准化技术委员会28140640001040000103FF乳及乳制品中蛋白酶活力的检测24全国食品工业标准化技术委员会29140640001040000104FF生乳及液态乳中脂肪酶活力的检测24全国食品工业标准化技术委员会30140640019040101029GL预制菜加工技术规范24全国食品工业标准化技术委员会31140640000040200017FF食品中叶酸的测定 预包被微孔板式微生物法24全国食品工业标准化技术委员会32140640000040200018FF食品中泛酸的测定 预包被微孔板式微生物法24全国食品工业标准化技术委员会33140640000040200012FF食品及食品生产过程中致敏原的测定 第1部分：麸质致敏原的免疫分析检测方法24全国食品工业标准化技术委员会34140640000040200013FF食品及食品生产过程中致敏原的测定 第2部分：乳致敏原的免疫分析检测方法24全国食品工业标准化技术委员会35140640000040200014FF食品及食品生产过程中致敏原的测定 第3部分： 花生致敏原的免疫分析检测方法24全国食品工业标准化技术委员会36140640000040200015FF食品及食品生产过程中致敏原的测定 第4部分：蛋致敏原的免疫分析检测方法24全国食品工业标准化技术委员会37140640000040200016FF食品及食品生产过程中致敏原的测定 第5部分：芝麻致敏原的免疫分析检测方法24全国食品工业标准化技术委员会38140640017030600005CP素肉 第4部分：熏煮素肉24全国食品工业标准化技术委员会39140640017030700006CP素肉 第5部分：素肉干24全国食品工业标准化技术委员会40140640019020100005CP方便菜肴QB/T 5471-202018全国食品工业标准化技术委员会41140640019030100026FF预制菜肴消费者喜好测试规范24全国食品工业标准化技术委员会42140640019030100027FF预制菜肴感官货架期确定规程24全国食品工业标准化技术委员会43140640019030100028FF预制菜肴感官品质评价规范24全国食品工业标准化技术委员会44140640014030500027CP食用食叶草粉24全国食品工业标准化技术委员会45140640014050000028GL食用食叶草粉生产技术规范24全国食品工业标准化技术委员会46140640007040218033CP氨基酸、氨基酸盐及其类似物 第18部分：L-组氨酸及其盐酸盐24全国食品工业标准化技术委员会47140640007040123034CP氨基酸、氨基酸盐及其类似物 第23部分：羟脯氨酸24全国食品工业标准化技术委员会48140640007040124035CP氨基酸、氨基酸盐及其类似物 第24部分：四氢甲基嘧啶羧酸24全国食品工业标准化技术委员会49140640007040126036CP氨基酸、氨基酸盐及其类似物 第26部分：麦角硫因24全国食品工业标准化技术委员会50140640007040127037CP氨基酸、氨基酸盐及其类似物 第27部分：N-乙酰基-L-半胱氨酸24全国食品工业标准化技术委员会51140640007040128038CP氨基酸、氨基酸盐及其类似物 第28部分：L-丙氨酰-L-谷氨酰胺24全国食品工业标准化技术委员会52140640007050102005CP核苷（酸）及其衍生物 第2部分：胞嘧啶核苷24全国食品工业标准化技术委员会53140640007070100084CP乳酸菌类后生元24全国食品工业标准化技术委员会54140640007089900006CP酵素制品通则24全国食品工业标准化技术委员会55140640007069900062FF食源性多糖的分子量及其分布测定-高效凝胶渗透色谱法24全国食品工业标准化技术委员会56140640007020300029CP海藻糖酶制剂24全国食品工业标准化技术委员会57140640007060200025CP伊代欣糖（浆）QB/T 4916-201618全国食品工业标准化技术委员会58140640007010100018CP谷胱甘肽酵母粉24全国食品工业标准化技术委员会59140640007010100019CP富营养素酵母24全国食品工业标准化技术委员会60140640007079900082JC工业用菌种基因组追溯管理通则24全国食品工业标准化技术委员会61140640007060300056CP阿拉伯木聚糖24全国食品工业标准化技术委员会62140640007079900083JC食品生产用微生物工程菌鉴定和检测技术规程24全国食品工业标准化技术委员会63140640000050000007GL食品中微量营养素混合均匀度技术评价规范24全国食品工业标准化技术委员会64140640000040200019FF茶叶及制品中茶多糖总量的测定-分光光度法24全国食品工业标准化技术委员会65140640004030400025CP葛根全粉24全国食品工业标准化技术委员会66140640115000000001GL冷熏海水鱼加工技术规程24全国食品工业标准化技术委员会67140640115000000002GL冻熟小龙虾加工技术规程24全国食品工业标准化技术委员会68140640115000000003CP预挂浆鱼片（冻预调制淡水鱼片）24全国食品工业标准化技术委员会69140640115000000003GL冻预调制淡水鱼片加工技术规程24全国食品工业标准化技术委员会70140640019040300037GL预制菜肴产品追溯体系规范24全国食品工业标准化技术委员会71 140640001010100106JC乳制品工业术语24全国食品工业标准化技术委员会72140640000030000019GL短保食品检验规则24全国食品工业标准化技术委员会73140640006080300084CP盐渍青梅24全国食品工业标准化技术委员会74140640004010000025JC 冻干食品术语和分类24全国食品工业标准化技术委员会75140640205010300006CP海参罐头和海胆罐头24全国食品工业标准化技术委员会罐头分技术委员会76140640205000000005CP肉酱类和蔬菜酱类罐头QB/T 4630-201418全国食品工业标准化技术委员会罐头分技术委员会77140640205000000005JC罐头食品包装、标志、运输和贮存QB/T 4631-201418全国食品工业标准化技术委员会罐头分技术委员会78144710008040000121CP特种葡萄酒 第2部分：加香葡萄酒24全国酿酒标准化技术委员会79203830020020601001JC食品机械通用技术条件 基本技术要求SB/T 222-201318全国饮食加工设备标准化技术委员会80203830020020601002JC食品机械通用技术条件 机械加工技术要求SB/T 223-201318全国饮食加工设备标准化技术委员会81203830020020601003JC食品机械通用技术条件 装配技术要求SB/T 224-201318全国饮食加工设备标准化技术委员会82203830020020601004JC食品机械通用技术条件 铸件技术要求SB/T 225-201718全国饮食加工设备标准化技术委员会83203830020020601005JC食品机械通用技术条件 焊接、铆接技术要求SB/T 226-201718全国饮食加工设备标准化技术委员会84203830020020601006JC食品机械通用技术条件 电气装置技术要求SB/T 227-201718全国饮食加工设备标准化技术委员会85203830020020601007JC食品机械通用技术条件 表面涂漆SB/T 228-201718全国饮食加工设备标准化技术委员会86203830020020601008JC食品机械通用技术条件 产品包装技术要求SB/T 229-201318全国饮食加工设备标准化技术委员会87203830020020601009JC食品机械通用技术条件 产品检验规则SB/T 230-201318全国饮食加工设备标准化技术委员会88203830020020601010JC食品机械通用技术条件 产品的标志、运输与贮存SB/T 231-201318全国饮食加工设备标准化技术委员会89203830020020202001CP绞肉机技术条件SB/T 10130-200818全国饮食加工设备标准化技术委员会90213970405030102003CP玻璃器皿 醒酒器24全国食品直接接触材料及制品标准化技术委员会91213970505040200003FF食品金属容器内壁腐蚀的测定 第2部分：电化学法24全国食品直接接触材料及制品标准化技术委员会

冷冻干燥蛋白酶是在生物制药、生物化学实验和分子生物学研究等领域中常见的操作，该过程能够保留蛋白酶的活性，延长其保存时间。以下是冷冻干燥蛋白酶的一般操作流程：1. 准备工作：选择蛋白酶： 根据实验需求选择合适的蛋白酶，确保其适用于冷冻干燥的过程。准备样品： 准备含有蛋白酶的溶液。注意溶液的浓度和成分，确保其适用于冷冻干燥处理。 2. 冷冻：样品冷冻： 将蛋白酶溶液以合适的体积倒入冷冻盘或其他冷冻容器中，然后放入冷冻设备冷阱室中，确保冷冻过程中样品均匀冷却。冷冻温度： 控制冷冻温度，通常是零下温度，使蛋白酶迅速冻结。 3. 冷冻干燥：转移： 将冷冻的样品迅速从冷阱室内转移到冷冻干燥机的干燥架上。真空抽气： 启动冷冻干燥机的真空泵，建立真空环境，抽除样品中的水分。升温阶段： 开始升温（提供样品中水分升华时所需的热量），使蛋白酶在真空条件下升华，从而去除水分。等温阶段： 在升温后的一定温度下保持稳定，确保样品中的水分充分升华。 4. 收集和存储：冷冻干燥结束： 当冷冻干燥结束后，停止真空，关闭冷冻干燥机。收集样品： 从冷冻干燥机中取出样品。注意避免受潮，尽快妥善保存。存储： 将冷冻干燥后的蛋白酶样品存储在防潮、密封的容器中，最好在-20°C以下的低温环境中保存，以确保长期稳定性。 注意事项：操作过程中要防止样品过度升温，以免影响蛋白酶的活性。确保冷冻干燥机和其他设备的清洁和维护，以保证实验的准确性和重复性。操作过程中要避免样品受到空气湿度的影响，尽量在湿度低的环境中进行。这个操作流程是一般性的指导，具体操作可能因使用的冷冻干燥机型号和蛋白酶种类而略有不同。在操作过程中，请参考设备和试剂的使用说明书，确保按照正确的步骤进行操作。

为什么要用冻干的方法制备稳定的蛋白药物产品？在蛋白药物治疗的早期研发中，有必要设计一种在运输和长期储存期间稳定的配方。显然，水溶剂的液体产品对于生产来说是很容易且经济的，对于终端使用者也是十分方便的。水溶剂的液体产品存在的问题1. 大多数的蛋白以液体状态存在时，易于化学（脱酰胺或氧化）和/或物理降解（聚合，沉淀） 2. 如果严格控制水溶剂蛋白的储存条件，并且对配方进行合理设计，可以减缓其降解，但是在实际的运输过程中，精确控制储存条件通常是行不通的，蛋白会因受到多种应力的作用而变性，包括摇动，高低温，冷冻等 3. 尽管会设计配方和运输条件尽可能规避这些应力导致的损害，但是仍然不能足够阻止在长期储存过程中造成的损害。例如，在某些情况下，尽量减少化学降解的条件会导致物理损伤，反之亦然，那么就无法找到提供必要的长期稳定性的折衷条件。解决方案：冻干配方设计合理的冻干配方，理论上可以解决以上存在的所有这些问题。在干燥的样品中，降解反应可以得到充分的抑制或减缓，蛋白产品在室温状态可以仍然维持其稳定性，保存期可达到数月或数年的时间。而且，在运输过程中，短期的温控偏离，冻干的蛋白样品通常也不会受到损害。即使在两种或多种降解途径需要不同条件才能实现最大热力学稳定性的情况下，干燥产品中反应速率的降低也可以实现长期的稳定性。因此，一般来说，当配方前研究表明在液体配方中不能获得足够的蛋白稳定性时，冷冻干燥提供了颇有吸引力的替代方案。冻干蛋白配方可能遇到的问题然而，相对水针剂产品，只需要简单灌装即可来说，冻干过程较为复杂，且耗时、成本高，再有，一个十分关心的问题，如果配方中没有合适的稳定赋形剂，大多数蛋白制剂在冻干的过程中至少部分会因冻结应力和脱水应力而变性，结果通常是不可逆的聚合，通常是在冻结之后立即聚合或在储存过程中，小部分蛋白分子发生聚合。因为大多数的蛋白药物是非肠道给药，即使只有百分之几的蛋白聚合也是不可以接受的。因此，只是简单的设计一个配方，允许蛋白能承受冻干过程中的应力，但是无法确保冻干后的样品能有长期的稳定性。一个较差的冻干配方，蛋白很容易发生反应，须要求在零度以下储存，这样的配方应当认为是不成功的。本文将提供一些实践的指导，用于配方的设计，可以在冻结和干燥过程中保护蛋白，并且在室温条件下长期储存和运输过程中具有很好的稳定性。再有，会简要地讨论，配方设计须考虑到工艺条件的物理限制，已获得最终低水分含量的良好蛋糕。我们将不讨论冻干工艺的设计和优化，也不会偏离关于赋形剂选择的实用建议，以解决关于这些化合物稳定蛋白质的机制的争论。有丰富经验的药物科学家可能跟这篇文章的内容也没有很大的关系，但是可以将蛋白药物产品推向市场，然而，我们的目标主要是针对对于稳定的冻干蛋白配方设计还不太了解以及具有很大挑战的那些研发人员提供一个很好的开始。 配方设计的主要制约因素有哪些？当合理设计冻干配方时，需要考虑的因素很多，从整体来看，工作会比较复杂，但如果能很好的理解决定最终成功的主要限制因素，那么就会容易很多。01蛋白的稳定性首先记住蛋白产品选择冻干方法的主要原因是其不稳定性，整个配方中最敏感的成分也是蛋白质，那么在配方设计中首要关心的是赋形剂的选择，能够提供蛋白好的稳定性。02最终药物配置在配方研发开始之前，须确定好最终药物的配置，需要考虑的问题包括给药途径（常为非肠道给药），共同给药的其他物质，产品体积，蛋白浓度，冻干盛装容器（西林瓶、预充针或其它）等，如果最终药物需要多次使用，在配方中需要加入防腐剂，这个可能会降低蛋白的稳定性。03配方张力在选择赋形剂时，可能会考虑设计等张溶液，甘露醇和甘氨酸通常是良好的张力调节剂，这些赋形剂经常优于NaCl,因为NaCl具有较低的共晶融化温度和玻璃态转变温度，使得冻干更难进行。另外，如果样品中含有相对低的蛋白量，经常会加入填充剂，避免在冻干的过程中蛋白损失，甘露醇和甘氨酸同时也可以充当这个角色，因为他们会最大程度的结晶并且形成机械强度较高的蛋糕结构。然而，须意识到单独使用晶体类的赋形剂通常不能够在冻干过程和储存期间给蛋白提供足够的稳定性。04产品的蛋糕结构最终冻干的样品须具有优雅的外观结构，较强的机械强度并且没有出现任何塌陷和/或共晶融化，水分残留要相对较低（1g水/100g 干物质），如果产品发生塌陷，不仅外观不能接受，而且会导致样品最终的水分含量较高，复水时间延长。05产品玻璃化转变温度为了确保干燥后蛋白具有长期稳定性，非晶态成分（包含蛋白）的玻璃转化温度要高于计划的储存温度。水是无定形相的增塑剂，需要保持较低的水分含量确保样品的Tg 要高于运输和储存的最高温度。06产品塌陷温度一般来说，达到最终的目标，在整个冻干过程中，需要维持产品温度在其玻璃转化温度以下。在干燥过程中，当冰晶升华时，对于非晶态样品，产品温度须维持在其塌陷温度以下，塌陷温度通常与热致相变温度（也就是最大冻结浓缩无定形相的玻璃态转变温度Tg’）一致，同时，也有必要维持产品温度在任何晶体成分的共晶融化温度以下。在实际中，这些温度可以通过差示扫描量热仪DSC或冻干显微镜来测定。在配方开发中有必要测定产品的塌陷温度。 冻干显微镜Lyostat5及搭配使用的DSC模块为什么要测定塌陷温度？在低于产品的塌陷温度下干燥是需要付出代价的，产品的温度越低，干燥的速度越慢，干燥的成本就越高。通常，在-40℃以下干燥是不实际的，同时样品能降低到的温度还受一些物理条件的限制，比如冻干机的性能以及产品的配方。在配方开发过程中，药物研发人员应该与工艺工程师（设计冻干工艺人员）紧密配合，并且清楚了解放大化生产型冻干机与实验室研发冻干机的区别是非常重要的，通常情况下，生产型冻干机和实验室冻干机在工艺参数控制方面会有所不同，一部分原因是生产型冻干机较大，在冻干过程中每瓶样品的产品温度差异较大。因此，如果对冻干过程熟悉的研发人员可以提供有用的信息帮助配方科学家做出正确的判断，避免由于误判导致将较好的配方排除在外。对于塌陷温度较低的产品，也有一些方法，如可以通过控制过程参数来实现短时快速干燥。配方设计需平衡蛋白稳定性和塌陷温度很明显，配方设计的一个目标是保证蛋白稳定性的前提下提供较高的塌陷温度，产品的塌陷温度主要取决于配方的组成，如果蛋白的含量超过所有溶质的20%，会对Tg’有较大的的影响。尽管单纯的蛋白溶液通常用DSC很难测出Tg’，根据实验得出，增加蛋白含量，对于大多数的配方来说，均可以提高Tg’。通过外推法得到纯的蛋白溶液的Tg’，大约为-10℃，远远高于大多数的单一赋形剂的Tg’(如蔗糖的Tg’为-32℃)，因此，从工艺过程的经济角度考虑，更期望配方中较高的蛋白质和稳定剂比例，然而，蛋白的稳定性通常随着稳定剂与蛋白含量比例的增加而提高，因此须在高的塌陷温度和较好的稳定性方面做出平衡。并且，如下文讨论的内容，随着蛋白浓度的增加，蛋白质在预冻过程中抵抗冻结应力损伤的能力就会得到改善，那么在高蛋白浓度和高稳定剂和蛋白重量比的情况下，稳定性是最好的，这样，就会导致整个配方较高的固形物浓度，给工艺带来困难，总浓度超过10%的配方将比较难冻干。如何改变Tg'？在升华之前对配方进行一些处理可以改变Tg’，如经常使用的退火处理，在退火处理过程中，会从无定形相中移走一小部分成分，如使用甘氨酸作为晶体的填充剂，取决于预冻的方法，可能一部分的甘氨酸分子会保留在样品的无定形相中，甘氨酸具有相对较低的Tg’(-42℃)，因此让甘氨酸尽可能的结晶是非常重要的，这样可以提高样品中无定形相的Tg’，加快干燥，节省成本。对于赋形剂结晶，设计理想完善的方案，可以用DSC模仿冻结和退火工艺的条件来进行，这个方法可以参考Carpenter 和 Chang的文章内容。 在哪些步骤蛋白需要维持稳定性？实际上，从灌装到最终干燥的产品复水，每一步均会对蛋白造成损伤，并且要求配方的成分能够抑制蛋白的降解。在快速处理步骤（如灌装，预冻，干燥和复水等）中，主要的问题通常是物理损害，如低聚物的形成和/或蛋白沉淀；通常，蛋白从液体到固体的转变，相对与减缓化学变化，更多的会减缓蛋白的物理变化的速率，因此，储存过程中的化学降解经常是更严重的稳定性问题。在储存期间或复水时，蛋白也会发生聚合。在预冻和干燥过程中，受到冻结和干燥应力的作用，蛋白的结构很容易遭到破坏，如果在这些过程中，能够抑制蛋白去折叠（变性），那么降解过程就会达到最小化，因此，配方设计主要的关注点就是在这些过程中能够保护蛋白，在干燥后的样品中具有较高的Tg及较低的含水量，能阻止样品内部发生化学反应，更好的保持蛋白的天然性能。01在预冻过程中的蛋白的稳定性特定的蛋白是否易受冷冻破坏的影响取决于许多因素，除了在配方中包含适当的稳定剂外。一般来说，会考虑三个很重要的参数：蛋白浓度，缓冲液的种类以及预冻方法。蛋白浓度增加蛋白质的浓度能够提高蛋白对冻结变性的抵抗力，可以通过简单地测定冻融后蛋白聚合的百分比，该百分比与蛋白质浓度呈反比。通常，如果预冻过程中去折叠的蛋白分子部分与浓度无关，那么预计增加蛋白浓度会增加蛋白聚合。然而，现在人们认为，增加蛋白质浓度会直接减少冷冻诱导的蛋白质去折叠。据推测，冻结阶段的损伤包括蛋白在冰水界面的变性，假设只有有限数量的蛋白分子在这个界面变性，增加蛋白的初始浓度会导致较低比例的变性蛋白。处于实际的目的，将蛋白浓度作为一个重要的考虑因素，在配方开发过程中尽可能保持较高的浓度，就显得特别简单了。缓冲液种类缓冲液的选择也是非常关键，主要引起问题的是磷酸钠和磷酸钾，在预冻和退火过程中，二者的pH值会有明显的变化。对于磷酸钠，其二元碱形式的容易结晶，导致在冷冻样品中，剩余的无定形相中的pH会降到4或更低。对于磷酸钾，其二氢盐结晶后，pH会变到接近9. pH改变的风险以及对蛋白的损害可以通过提高最初的冷却速度，限制退火步骤的时间，降低缓冲液的浓度等来控制，所有这些措施可以降低盐类结晶的机会。快速冷冻，不进行退火也限制了蛋白质在暴露在冷冻状态下的时间。尽管其他的赋形剂能够辅助抑制pH的改变，较好的方法是避免使用磷酸钠和磷酸钾。在预冻阶段pH有较小变化的缓冲液包括柠檬酸盐，组氨酸，Tris溶液等。预冻方法排除由于pH变化造成的问题，在实验中发现，预冻过程中，蛋白质受破坏的程度跟冷却的速率有关系，较快的冷却速度形成的冰晶体较小，冰的比表面积越大，受破坏的程度越大，这个推测是由于蛋白在冰水界面变性导致。冷却的速度通常受冻干机设备本身性能的限制，然而，一些对冷冻敏感的蛋白，即使慢速冷却也会导致其变性。02、在干燥和储存过程中蛋白的稳定性尽管整个蛋白分子在预冻过程中保持了其原有的结构，然而，在后续的脱水干燥过程中如果不加入合适的稳定剂也会面临变性的风险。简单的说，当去除蛋白分子的水合外层时，蛋白质天然的结构便遭到破坏。对多个蛋白的红外光谱研究表明：无合适的稳定剂存在时，在干燥的蛋白样品中，其结构将会遭到去折叠。如果样品迅速复水，损伤的程度（如，聚合百分比）与干燥蛋白质的红外光谱的非天然表现直接相关。因此，降低复水后结构的破坏需要减小预冻和主干燥过程中蛋白结构的去折叠。而且，即使样品立即复水后100%的天然蛋白分子被恢复，干燥的固体中也会有相当一部分去折叠的分子。在复水过程中分子内的再折叠可以主导分子间的相互作用，从而导致聚集，在复水后表现为100%的天然分子。适当的赋形剂可以阻止或至少减轻蛋白结构的去折叠，配方是否成功可以通过红外光谱检查干燥后蛋白的二级结构来立即判断，更重要的是，发表的一些研究显示，干燥样品的长期稳定性取决于干燥过程中天然蛋白的保留量，如果干燥后的蛋白样品存在结构上的去折叠，即使样品在低于其Tg温度以下储存，蛋白也会很快被破坏，因此，红外光谱法可作为蛋白配方的另外一种工具，研发人员可以在冻干后对样品进行检测，确定其结构是否遭到破坏。欢迎先关注我们，下一期内容将继续为大家带来“实用建议：如何合理设计稳定的冻干蛋白配方（二）”，详细分享：蛋白样品冻干的首选赋形剂有哪些、基于成功蛋白冻干配方会导致最终失败的一些细节问题等。莱奥德创冻干技术分享关注“莱奥德创冻干工场“，立即获取冻干线上技术分享内容。基于对于冻干研发的一些考量，莱奥德创创建了金字塔冻干技术分享平台：包含了从冻干理论基础，到配方和工艺开发，再到放大及生产，以及进阶的设备管理和线上线下专题内容分享。内容结合了来自Biopharma的冻干理论指导体系、来自于莱奥德创产品经理及应用工程师的实践经验总结及国内外专家的专题内容。获取方式Step 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本篇继上一篇“实用建议：“如何合理设计稳定的冻干蛋白配方（一）”继续为大家分享蛋白样品冻干的理想赋形剂有哪些、基于成功蛋白冻干配方会导致Final失败的一些细节问题等。 》》》对于蛋白样品，理想的赋形剂有哪些？从冻干对蛋白的所有危险以及我们需要在各个环节考虑的所有因素来看，快速开发一个稳定的蛋白配方看起来似乎是不可能的。幸运的是，如果我们能够采用合理的方法对配方进行很好的设计，大多数的配方问题是可以得到快速解决。这里，我们主要是对初始配方成分的选择提供基础。在一些情况下，初始的配方很有可能就是走向市场的Final产品。给定的组分，进行不同微小的修改，已经被成功地用于蛋白药物。需要强调的是对于冻干配方，在能够提供良好稳定性和结构的情况下，成分越简单越好。所加入的赋形剂都须要有数据证明对配方起有益的作用。01给定蛋白质维持稳定性的具体条件对于一些通用型的稳定剂，可以有效地保护绝大多数的蛋白质，在选择这些稳定剂之前，我们有必要通过优化影响蛋白物理和化学稳定性的具体因素来选择合适的稳定剂。影响蛋白物理和化学稳定性的具体因素：1. 避免极端的pH值可以显著降低蛋白脱氨基的几率。而且，通过优化溶液的pH值，可以显著提高蛋白在冻干过程中抵抗去折叠的能力。2. 还应该研究其他能提高蛋白质稳定性的特异性配体（通过增加去折叠的自由能）。肝素和其他聚阴离子对生长因子的稳定性影响就是一个很好的例子。3. 其它需要考虑的重要因素是离子强度对蛋白的去折叠和聚合的影响。须意识到，在预冻过程中，由于冰的形成将溶液浓缩，离子强度可增加50倍。因此负责原料药纯化和做药物配方前研究的人员已经对这些问题有了深刻的认识，配方科学家应该在着手设计冻干配方之前与他们进行沟通。即使在针对蛋白质稳定性优化的特定的溶液条件下，但是如果样品需要幸免于冻干的损害并长期保存，有必要加入一些其它的保护剂。首先，我们考虑一些已经用在冻干蛋白配方中的成分，但它们不能提供蛋白的稳定性，而且可能会促进蛋白在储存期间的破坏。我们将提供一个简单、有效的思路，并且讨论选择这些成分的原理。02不能提供蛋白稳定性的赋形剂部分多聚物作为赋形剂的优缺点在冻干工艺的快速开发过程中，为了获得一个强壮的蛋糕结构，一些多聚物，如葡聚糖，羟乙基淀粉，因具有较高的塌陷温度，导致Final产品的Tg也会比较高，常常是受欢迎的赋形剂。不好的是，这些多聚物在冻干过程中不能抑制蛋白结构的去折叠，因此在后续的储存中不能提供稳定性。无法抑制冻干诱导变性的原因大概是聚合物过大而无法与蛋白质氢键合，无法代替脱水过程中损失的水，或者是因为聚合物与蛋白质形成了分离的无定形相。尽管当这些多聚物单独使用时不是一种很好的稳定剂，但是经证实，如果其结合双糖稳定剂可以具有较好好的作用。冻干过程中的有效稳定剂对大量的化合物进行测定，显示在冻干过程在较有效的稳定剂是双糖，但是避免使用还原性糖。还原性糖在冻干过程中可以有效抑制蛋白结构的去折叠，但是在干燥样品的储存过程中，可以通过美拉德反应（糖的羰基和蛋白质上的游离氨基）降解蛋白，结果形成含有降解蛋白的棕色糖浆，而不是含活性蛋白的白色蛋糕状结构。通常，我们减缓这个过程的方法是将样品储存在零度以下，这就失去了产品冻干的意义，这些还原性的糖包括：葡萄糖，乳糖，麦芽糖，麦芽糊精等。在早期的研究中，晶体类的填充剂如甘露醇，甘氨酸在冻干过程中不能提供蛋白很好的稳定性，但是，一些配方使用了这两种物质的混合物，并且成功地推向了市场。在这些案例中，甘露醇和甘氨酸适当的比例可以导致一大部分的化合物保持无定形状态。这部分无定形状态的化合物足以抑制冻干过程中蛋白的去折叠并且提供长期储存的稳定性。但是建议谨慎选择这种方法，因为达到合适的工艺条件再加上合适的赋形剂比例，既耗时又很难办到的。03赋形剂的合理选择如何合理的选择赋形剂？案例分享举个具体的案例说明，假设：1. 蛋白药物的浓度定在2mg/ml；2. 主要的降解途径是冻干后或复水后蛋白的聚合以及储存期间蛋白的脱氨基；3. 优化具体的条件（如用柠檬酸盐缓冲液控制pH为6）只能将冻干和复水后聚合程度降到10%，尽管样品在低于Tg温度的20℃下进行储存脱氨基速度仍然不能接受。加入晶体类的膨胀剂，如甘露醇，保持样品强壮的结构及良好的外观。在这种情况下，主要缺少的成分是非还原性双糖，其在干燥样品中会与蛋白形成无定形的结构，作为主要的稳定剂，主要选择蔗糖或海藻糖。它们在预冻阶段能够很有效地保护蛋白并且能够很好的抑制复水过程中蛋白结构的去折叠。预冻阶段的保护取决于初始糖的总浓度，有时，超过5%（w/t）的浓度可以尽可能大程度地保持蛋白的稳定性。相反，在干燥阶段，蛋白的保护取决于Final糖和蛋白的质量比。一般来说，糖和蛋白的重量比至少为1:1时，可以提供较好的稳定性，当达到5:1时，可以达到很佳的稳定性。保持蛋白的浓度不变，选取一定范围的糖浓度进行筛选和检测，通过干燥样品中天然结构保留率以及复水后蛋白聚合降低的程度来确定最合适的浓度。一般来说，合适的糖浓度，可以在冻干过程中提供蛋白很好的稳定性，并且如果Final样品的Tg高于储存温度，在后期的储存期间也可以提供蛋白较好的稳定性。例如，假定最高的储存温度为30℃，那么Final产品的Tg ＞50℃应该是稳定的，但前提是Final样品的含水量需要达到允许的水平，因为水分的存在会降低样品的Tg。可以使用DSC检测每种样品的Tg值。蔗糖/海藻糖如何选择？蔗糖和海藻糖，作为两种常用的稳定剂，均有其优势和劣势，可根据不同的情况进行选择：● 在任何水分含量的样品中，海藻糖均会有较高的Tg，因此较为容易冻干。另外Tg ＞50℃的条件可以允许样品有较高的残留水分。然而，技术工程师应该能够针对这两种双糖设计经济有效的工艺。如果样品中蛋白浓度较高，可以提高Tg，这样就会弱化海藻糖的作用；● 与蔗糖相比，海藻糖更能抵抗酸解，双糖水解后会产生还原性的单糖，这是需要避免的。通常情况下，如果pH不是很低，如pH4左右或更低，这个应该不是很大的问题；● 蔗糖在冻干过程中抑制蛋白去折叠方面看似比海藻糖更有优势，当蛋白在预冻阶段非常不稳定（需要较高的糖浓度）和/或蛋白浓度较高时，这种优势更明显。海藻糖的相对不稳定性是由于在预冻和干燥过程中其更易于与蛋白之间产生相分离。对于给定的配方，这是否会有问题不能被预测，因此，每种制剂配方都需要检查其保护蛋白的能力。表面活性剂的作用在这里，我们案例中的配方可能就比较完整了，就像许多蛋白质的情况一样。然而，我们假设，即使蔗糖完全抑制可检测的蛋白质去折叠，正如用红外光谱对干燥固体的结构分析所评估那样，在复水后，仍然有1%的聚合蛋白。因为在原始的样品中是没有任何聚合的，假设在冻干过程中，一小部分蛋白发生了去折叠，在复水后，部分这些分子又重新折叠，但是部分聚合在一起。这个实际上看起来是个很普遍的问题，就像在冻干之前一些处理造成的聚合。幸运的是，通过在配方中加入一些非离子型表面活性剂，如聚山梨醇酯（吐温）通常可以抑制蛋白的聚合。要求的浓度通常比较低（＜0.5% w/v），通过将表面活性剂滴定到包含所有其它组分的冻干制剂中，可以识别出理想浓度。应避免加入过量，因为表面活性剂在室温下是液体的状态，如果浓度较高，会降低配方的玻璃态转变温度。然而，通常在优化蛋白质稳定性所需的非常低的浓度下，不会有问题。表面活性剂看作是画龙点睛，通常在冻干产品配方中加入表面活性剂是有利的，可以抑制处理过程中界面引起的去折叠和聚集（如起泡夹带或瓶-液界面引起的）。最重要的是表面活性剂在冻干/复水过程中抑制聚合的能力，目前还不太清楚表面活性剂的保护在哪一步起作用的。有资料证明，表面活性剂在冻融及复水过程中可减少蛋白聚合并且在预冻阶段有助于抑制蛋白的去折叠，对干燥固体中聚集物特定红外波段的检查表明，表面活性剂可以抑制冻干过程中产生的聚集。在复水过程中，曲折叠分子的聚合能通过表面活性剂得到抑制，猜测是通过分子之间的相互作用和/或作为一种润湿剂，加速冻干产品的溶解。如果显示表面活性剂在复水过程中是有益的，则可以通过在稀释剂中加入表面活性剂来达到这种效果。 》》》还有哪些意想不到的危险可能会导致失败？尽管根据上述给出的建议，对于给定蛋白，我们可以设计出成功的配方，但是，还有其他一些问题可能会导致Final失败，特别是在长期储存期间。● 赋形剂中经常会有一些污染物，这些会导致蛋白快速的化学降解，糖类和甘露醇中会含有过渡金属元素，表面活性剂可能被过氧化物污染，所有的这些可以促进蛋白的氧化；● 在储存过程中，水分从胶塞转移到产品，引起水分参与的降解，直接损坏蛋白，并且降低蛋白的Tg,加速蛋白的降解，特别是当储存温度高于Tg 时；● 即使在高温（如40℃）下的储存稳定性研究中，一切都表现出理想的状态，但有一个常见的，但很少报道的事件可能是灾难性的，这个问题可以用下面的故事来说明。产品在实验室中在40℃下储存可以保持几个月的稳定性，在冬季，产品在运输过程中也保持良好的稳定性，没有来自消费者的问题报告，然而，有时在夏季，运输后，在室温下储存仅2周后发现产品过度降解，用差示扫描量热仪DSC对一开始的干燥粉末进行了检查，给出了合理的解释，结果发现，制剂中的甘露醇没有全部结晶，而是形成了Tg约为45℃的亚稳玻璃态，当在夏季运输过程中，超过了这个温度时，甘露醇变发生结晶，最先与甘露醇结合的水被转移到了剩余的无定形相中，蛋白相的水含量增加，降低了它的玻璃化转变温度，因此，加速了蛋白质的降解。这个问题可以使用DSC设计合理的退火方案使甘露醇再预冻阶段全部结晶来避免，另外也可以通过调整甘露醇的浓度，降低残留水分含量，使甘露醇即使在45℃的条件下也不会结晶。 》》》对于给定的蛋白药物，这些信息足够吗？对于大多数的蛋白，上面给出的建议一般会设计出成功的配方，但是，每种蛋白都有其独特的物理化学特性和稳定性要求。因此，针对每种不同的蛋白，配方也需要自定义设计。结合蛋白本身的特性知识以及选择合理的赋形剂可以快速设计出稳定的冻干蛋白配方。最后，在快速冻干工艺中保持干物质的物理性质和在干燥后获得天然的蛋白质之间需要折衷，研究表明：当蔗糖结合葡聚糖一起使用时，由于蔗糖的作用，蛋白质的天然结构可以保留在干燥的固体中；葡聚糖的存在提高了制剂的Tg，并提供了一种无定形的填充剂，快速干燥的同时保留了所需的蛋糕性质；其他的一些聚合物有可能提供与葡聚糖相同的优势，如羟乙基淀粉也具有较高的Tg，通常比葡聚糖更容易接受用于肠胃外给药。期望可以合理地利用这些多聚物作为Tg的调节剂，使得制剂更稳定，更容易快速冻干。莱奥德创冻干技术分享关注“莱奥德创冻干工场“，立即获取冻干线上技术分享内容。基于对于冻干研发的一些考量，莱奥德创创建了金字塔冻干技术分享平台：包含了从冻干理论基础，到配方和工艺开发，再到放大及生产，以及进阶的设备管理和线上线下专题内容分享。内容结合了来自Biopharma的冻干理论指导体系、来自于莱奥德创产品经理及应用工程师的实践经验总结及国内外专家的专题内容。获取方式Step 1：关注公众号 扫码关注莱奥德创公众号Step 2：点击菜单栏“冻干讲堂” Step 3：点击你感兴趣的内容Banner Step 4：开始学习 如果您对上述设备或冻干服务感兴趣，欢迎随时联系德祥科技/莱奥德创，可拨打热线400-006-9696或点击下方链接咨询。译自：《Rational Design of Stable Lyophilized Protein Formulations:Some Practical Advice》 John F.Carpenter,Michael J.Pikal,Byeong S.Chang,Theodore W.RandolpH pHarmaceutical Research, Vol.14,No.8,1997* 如有理解错误之处，还请参考原文关于莱奥德创冻干工场上海莱奥德创生物科技有限公司专注于提供前沿的冻干设备应用和制剂开发相关服务，依托于合作伙伴加拿大ATS集团SP品牌和英国Biopharma Group等的紧密合作，致力于促进中国生物医药技术创新升级，助力中国大健康行业的持续发展。莱奥德创在上海及广州设有实验室，拥有专业的技术团队及国内外专家支持体系。莱奥德创面向生物制药、食品科学等各个领域行业客户，提供冻干研发、放大、委托生产及培训等服务。前期研发● 产品配方特征研究:共晶点温度(Te)、塌陷温度(Tc)、玻璃态转化温度(Tg'、Tg)测定等；● 实验室工艺开发：冻干工艺开发:冻干制剂配方开发，工艺确定，申报材料撰写；● 冻干工艺优化：利用中试冻干机上PAT工具优化及缩短工艺；● 冻干产品质量指标测试：水分含量，冻干饼韧度分析；● 咨询服务：如产品外观问题、产品质量问题、其他troubleshooting等；工艺放大/技术转移● 冻干工艺转移/放大: 远程技术指导+现场服务；● 小批量冻干生产(NON-GMP)，临床一期生产（GMP）；其他业务● 企业小团队线上线下培训服务：冻干原理，工艺开发，设备使用维护等；● 冻干设备租赁服务。400-006-9696www.lyoinnovation.com莱奥德创冻干工场中国(上海)自由贸易试验区富特南路215号自贸壹号生命科技产业园4号楼1单元1层1002室德祥科技德祥科技有限公司成立于1992年，总部位于中国香港特别行政区，分别在越南、广州、上海、北京设立分公司。主要服务于大中华区和亚太地区——在亚太地区有27个办事处和销售网点，5个维修中心和2个样机实验室。30多年来，德祥一直深耕于科学仪器行业，主营产品有实验室分析仪器、工业检测仪器及过程控制设备，致力于为新老客户提供更完善的解决方案。公司业务包含仪器代理，维修售后，实验室咨询与规划，CRO冻干工艺开发服务以及自主产品研发、生产、销售、售后。与高校、科研院所、政府机构、检验机构及知名企业保持密切合作，服务客户覆盖制药、医疗、商业实验室、工业、环保、石化、食品饮料和电子等各个行业及领域。德祥始终秉承诚信经营的理念，致力于成为优秀的科学仪器供应商，为此我们从未停止前进的脚步。我们始终相信，每一天都在使这个世界变得更美好！

如何测定奶酪中的蛋白质奶酪，又名芝士、起司，是一种发酵而成的浓缩奶制品。大约 5000 年前，奶酪诞生于西亚地区，之后在世界上多个奶源地被发扬光大。时至今日，世界上有近千种奶酪，口味各异但又都营养健康，正成为一种受到越来越多人喜爱的美食。下图为世界上较为著名的一些奶酪品种，多达数十种，可以提供选择丰富的口感和味道：奶酪相当于浓缩的牛奶，制作 1 公斤奶酪，通常需要使用 10 公斤鲜奶。漫长的制作过程，让奶酪保留了鲜奶中的营养物质，并剔除鲜奶中的乳糖，对乳糖不耐受人士十分友好。奶酪中丰富的营养物质，可以帮助我们补充钙质、促进维生素吸收。每 100 克奶酪中平均含钙量达到了 700 毫克，这相当于 1 升牛奶的含钙量。根据《中国居民膳食营养素参考摄入量》建议：我国成年人每日推荐钙质摄入量为 800-1000 毫克/天。也就是说，选择用奶酪补钙，每天吃大约 120 克奶酪就可以满足日常钙质所需。但是如果选择喝牛奶，每天大概需要喝掉 1 升牛奶才能补充足够多的钙质。而且，奶酪中富含大量的脂溶性维生素。每 100 克奶酪，含有 263 微克维生素 A 、7.4 微克 维生素 D。而且奶酪中丰富的脂肪，还可以帮我们把这些脂溶性维生素长久留在身体中，以备不时之需。当然，何种美食都需要适量摄取，过量的奶酪摄入也有可能导致肥胖问题。奶酪中的蛋白质含量也十分丰富，食品中蛋白质的测定是质量保证和营养标签的常规流程。下面为大家简单介绍遵循国家标准测定奶酪中的氮和蛋白质含量的简单快速流程。使用 Buchi 快速消解仪 K-436 或 K-439 用硫酸消解样品，然后使用 Buchi 凯氏定氮仪 K-375 （内置滴定仪）进行蒸馏和滴定，测定的蛋白质含量对应于标记值。 1实验原理蛋白质测定是食品工业中执行的关键分析之一。样品需要用硫酸消解，将氮转化为硫酸铵。通过氢氧化钠碱化转化为氨后，通过蒸汽蒸馏将样品蒸馏到硼酸接收器中，然后用硫酸溶液滴定。将氮含量乘以样品特定因子（奶酪为 6.38）以获得蛋白质含量。 2实验简介仪器：Buchi 快速消解仪 K-436、K-439，Buchi 凯氏定氮仪 K-375样品：奶油奶酪和爱蒙塔尔奶酪，研磨，标记蛋白质含量分别为 6% 和 33%。▲奶酪样品测定：将约 0.5-2g 样品（取决于蛋白质和有机基质的浓度）直接加入样品管中。加入一部分 20ml 硫酸和 2 片 Buchi 凯氏定氮片，使用表1中规定的参数进行消化。消化完成后，通过水蒸气蒸馏将样品的氨蒸馏成硼酸溶液，并用硫酸滴定（表2）。以 0.18g 色氨酸为对照品验证了该方法的准确性。表 1：使用 Buchi 快速消解仪 K-436、K-439 进行消解的实验数据：表 2：Buchi 凯氏定氮仪 K-375 蒸馏和滴定参数结果：色氨酸回收率为 99.5%，RSD 0.36%（K-439）和99.4%，RSD 0.41%（K-436）。测定的蛋白质含量如表 3 所示。 表3：奶酪中蛋白质含量的测定（括号中为相对标准偏差，n=4） 3结论使用 Buchi 快速消解仪 K-436、K-439 和 Buchi 凯氏定氮仪 K-375 根据凯氏定氮法测定奶酪中的蛋白质含量，可提供可靠且可重现的结果，这些结果可对应于相对标准偏差较低的标记值。总消化时间约为 85 分钟（K-439）或 100 分钟（K-436）。能提供丰富蛋白质的肉蛋奶都是很好的美食，蛋白质对青少年儿童的成长或中老年人的养生与健康都极为重要。Buchi 凯氏定氮系统的一系列设备，为您餐桌上的高蛋白美味提供可靠的营养指标保障。

喷雾干燥和冷冻干燥技术在蛋白多肽领域的应用蛋白多肽应用”Bart 的第 100 篇博客文章！在这个很有纪念意义的时间点，Bart 继续对喷雾干燥和冷冻干燥技术在蛋白多肽领域的应用进行剖析，完成他的蛋白多肽三部曲《如何让您的蛋白质配方稳定持久更持久？》和《当你制定蛋白质和多肽配方时，你是“喷雾干燥党”还是“冷冻干燥党”呢？》，让我们一同看看这次 Bart 给我们带来哪些应用干货吧！亲爱的读者们，我简直不敢相信，但我正坐下来写博客的第 100 篇文章!我们在这里涵盖了色谱，旋转蒸发，冷冻干燥和喷雾干燥的主题，我希望我们在接下来的 100 篇文章中继续这样做。由于这是一个有点特别（好吧，非常特别）的帖子，我决定做一些与往常不同的事情。我想和大家分享一下我最近读到的一篇非常有趣的研究论文中的发现，我认为把这篇文章专门献给我们的新成员：喷雾干燥。首先，文献链接如下：文献链接https://www.mdpi.com/2227-9717/9/3/425/htm（Sweeny C, et al. Using Peptidomics and Machine Learning to Assess Effects of Drying Processes on the Peptide Profile within a Functional Ingredient. Processes 2021, 9(3), 425 https://doi.org/10.3390/pr9030425）其次，让我告诉你他们所发现的令人兴奋的事情，是关于冷冻干燥和喷雾干燥对生物活性肽的影响以及为什么你首先应该关注这部分。 高蛋白成分因其在食用时的营养和功能益处而越来越受欢迎。然而，这些蛋白成分及其酶解产物在加工处理中可能会碰到问题，特别是在干燥过程中，因为这一步有可能会导致蛋白质变性和肽聚合。 问喷雾干燥和冷冻干燥是将一种成分转化为粉末的常用方法？提高产品稳定性提供更有效的运输选择 由于减少了水分活性，提高了产品的保质期在之前发布的一篇文章中，我已经解释了喷雾干燥和冷冻干燥的工作原理。但我将在这里再次总结这些技巧：_喷雾干燥 冷冻干燥 工作原理将溶液或悬浮液从液体转化为干燥状态，其中液体悬浮液在热干燥腔体中雾化，蒸发液滴并产生低水分含量的细颗粒水通过升华在低压环境中以冰冻状态被去除 优势快速 简单 制备定制尺寸的颗粒 包埋成分以保护其免受环境影响的可能性 相对便宜 有助于保持多肽的物理化学和生物活性的稳定性技术限制可能导致关键活性物质损失 可能导致原料中存在的营养价值成分损失 会破坏热敏性蛋白 在技术上具有挑战性 相对来说成本更高 实验过程漫长 需要较少的监督和管理 应用推荐适合低成本、高规模生产适用于关注产品稳定性和较小产品体积的应用范畴其他考虑因素包括物化性质，如溶解度、味道、密度和颜色等，需要评估冷冻干燥和喷雾干燥效果，以确定符合最终产品所需的配方。 现在，上面提到的文献中， 研究者使用肽组学和机械学习技术来观察植物蛋白水解物的干燥方法是否会影响肽谱和随后的预测功能。 研究者想要研究冷冻干燥和喷雾干燥技术不仅对样品的物理特性和蛋白质含量有影响，而且还会对肽含量产生影响。生物活性肽是活性成分功能的组成部分。天然多肽具有抗衰老、抗癌、抗炎、抗氧化、降胆固醇等特性。许多多肽物质已被证明具有一种及以上的生物活性。 有趣的是，研究者没有发现喷雾干燥和冷冻干燥制备的产品在肽谱成分和功能上有很大差异。 他们确实指出了他们在自己的研究和现有的科学工作中注意到的不同点，关于冷冻干燥和喷雾干燥对制剂的几个影响差异，包括：影响差异喷雾干燥样品颜色稍深 部分报道称喷雾干燥中随着干燥温度升高热诱导蛋白质聚集(多肽数量减少) 与喷雾干燥相比，冷冻干燥制剂中含有Asp、His 和 Lys 氨基酸的肽有所增加(如先前报道的那样，Lys 在喷雾干燥过程中特别容易受到损害) 制备得到的冷冻干燥制剂稍趋向于链更长、分子量更高、带更多正电荷的肽(可能会考虑到冷冻干燥比喷雾干燥更温和) 与冷冻干燥制剂相比，喷雾干燥制剂所得的是具有更大比例的负电荷肽(通常与喷雾干燥粉末相关的是可能有助于增加粉体溶解度) 冻干制剂制备的多肽所带负电荷略少，为0.24，这与多肽长度、分子量和物理特性的增加相关，可能导致与冻干粉末相关的溶解度降低 当使用生物信息学方法时，预测喷雾干燥的疏水性增加了 1.74%，这可能与喷雾干燥制剂里多肽中疏水氨基酸(Ala, Met, Phe, Pro, Try和Val)的轻微增加有关 根据预测，喷雾干燥和冷冻干燥的抗炎生物活性相当 以上就是冷冻干燥和喷雾干燥一个很好的对比，主要重点针对生物活性成分多肽成分。 下次见！

潜力巨大的市场背后，是胶原蛋白功效的多次争议，更似乎是厂家们的一场商业忽悠。 　　继近日被卷入胶原蛋白“无效”风波后，东宝生物的胶原蛋白产品“圆素”又因未获得“保健食品”(俗称“蓝帽子”)批号而卷入涉嫌虚假宣传漩涡。 　　与此同时，市场上胶原蛋白的宣传推广攻势正此起彼伏。贵州百灵(002424.SZ)邀请了章子怡作为形象代言人，东方海洋邀请了赵雅芝，颜如玉邀请了林志玲，LUMI的代言人是杨幂。东宝生物2012年销售费用大增57.79%，为推广胶原蛋白投放了大量广告。 　　《第一财经日报》记者查询国家食品药品监督管理总局(下称“CFDA”)保健食品数据库后发现，涉及“胶原蛋白”的国产保健食品产品仅有32个，上市公司的相关产品几乎“全军覆没”。 　　九成胶原蛋白产品未获认证 　　“实际上，市面的上百个胶原蛋白类产品，其中九成以上都是普通食品。” 广州颜如玉医药科技有限公司董事长谢易麟告诉本报。 　　《食品广告管理办法》明文禁止普通食品宣传疗效，普通食品出现医疗术语、易与药品混淆的用语，以及无法用客观指标评价的用语都是违规的。CFDA药品评价中心专家孙忠实表示，有保健品批号的产品尚且不能对适应证、疗效进行描述 作为普通食品，则更无资格在宣传中鼓吹暗示各种功效。 　　东宝生物的“圆素”同样是普通食品，因其在天猫和京东商城等官方旗舰店上充斥着“骨骼强健”、“保湿补水”、“延缓衰老”、“淡斑祛黑”、“不只是水嫩肌，更是补骨素”等描述，而被外界质疑涉嫌虚假宣传。 　　然而，本报记者近日走访广州多家连锁药店、屈臣氏和广百商场等零售网点后发现，市面上形形色色的胶原蛋白产品，都在打着“保健食品”的擦边球宣传功能。辉瑞中国出品的善存沛优胶原蛋白粉在外包装上宣称“为皮肤真皮层提供养分” 杨幂代言的LUMI液态胶原蛋白宣称“补水保湿、亮白祛黄、紧致毛孔” 昂力莱胶原蛋白片则更为夸张，在外包装上宣传产品主要作用是美白淡斑、预防乳房下垂等。这些产品均未获得“保健食品”批号。 　　而此番东宝生物“圆素”之所以涉嫌“虚假宣传”，还因其一份用以佐证胶原蛋白口服产品“美容功效”的“研究报告”《口服骨胶原蛋白改善皮肤生理状况的临床研究》被媒体证实为造假。 　　值得注意的是，目前食药总局正在严打保健食品“四非”，其中一项就是非保健食品冒充保健食品及虚假宣传。 　　“蓝帽子”需苦候三年 　　申请胶原蛋白类产品“蓝帽子”并非易事。广州金康连锁药房有限公司董事长郑浩涛告诉本报，由于国内保健食品法规不健全，所有在国外获得保健食品资质的进口产品在国内均无法获得健字号，所以像日本FANCL、美国自然之宝的胶原蛋白产品在国内无法申请“蓝帽子”。 　　贵州百灵市场部一位前员工向本报透露，一开始贵州百灵“爱透”胶原蛋白口服液也想申请健字号，但他们发现要做很多验证，至少要花两三年时间，这与当时公司高层快速打开胶原蛋白市场的意愿不符合，所以没有申请。 　　而谢易麟则对本报称，颜如玉从2007年就开始申请保健食品资质，2010年获批，花了整整三年时间。 　　据谢易麟介绍，胶原蛋白类产品申请“蓝帽子”首先有很高的技术门槛，原料必须符合海洋鱼皮低聚肽分子量1000道尔顿以下的国家标准，这一点代表优质原料的可吸收性，但多数厂家无法达到。 　　其次，申请健字号的胶原蛋白产品，需要经过严格的动物、人体试验证明其安全性和有效性，在批准的功能上也有严格的限制。 　　东宝生物董秘刘芳称，公司长期重点发展胶原蛋白的计划不会因此次舆论针对胶原蛋白的质疑而改变。但连日来的质疑已经让东宝生物的股价持续走低，昨日跌幅达5.26%，报收11.16元。

使用沃特世公司SYNAPT High Definition质谱系统， 利兹大学就所获得的结果发表文章 沃特世（Waters® ）公司(股票代码NYSE: WAT) 2007年12月3日宣布利兹大学爱斯布理Astbury结构分子生物学中心使用最近购买的沃特世公司SYNAPT High Definition MS™ (HDMS) 质谱系统，在Journal of the American Society of Mass Spectrometry (JASMS) 美国质谱协会杂志上发表了蛋白研究的成果。 Ashcroft实验室正在使用SYNAPT® HDMS质谱系统研究生物分子功能。在2007年12月刊的一篇文章中，利兹的研究人员描述了对几种蛋白，如细胞色素C和贝塔-2-微球蛋白，的成功分离和分析，Ashcroft希望该成就可以通向对某些生物过程的完全了解，如淀粉纤维形成，细菌纤毛集结以及病毒衣壳的装配，这些过程都与衰老症有关。 蛋白质被人体小心地折叠，经三维长链分子装配而成。当正确地被折叠时，蛋白调节正常身体功能。当某些蛋白被折叠成特殊形状而变成错误折叠时，引起一系列反应，可导致自身聚集和淀粉纤维形成，因此一些高发疾病可能发生，包括老年痴呆症，疯牛病和帕金森氏综合症。在利兹大学，Alison Ashcroft艾利森艾斯克劳福特博士和她的同事Sheena Radford诗娜拉德福德教授就是研究这样一种蛋白，贝塔-2-微球蛋白，试图探索它是如何形成纤维，在透析病人的关节聚集，并与透析相关的淀粉样变性病有关。对这些过程在分子水平的完全了解将有助于治疗方法的设计。 新型质谱为生物学研究带来新领域 作为工具，常规质谱是区分不同质量蛋白质的优秀方法。然而，一个特定蛋白的不同构象或不同的折叠形式具有同一质量数，使用常规的方法是无法区分开来的。这就是沃特世公司SYNAPT HDMS质谱系统和镶嵌其中的离子淌度技术帮助利兹大学的方式。 “一个蛋白可以折叠成紧密的三维结构，或者在某些条件下，蛋白可以打开成伸展的结构。即使这些三维结构拥有相同的质量和质荷比(m/z)，SYNAPT HDMS的离子淌度功能可以分离这些蛋白，并告诉您多少蛋白在折叠的形式而多少在非折叠的形式。而且，由于两种蛋白构象的横截面积不同，因为能够基于形状分离，SYNAPT HDMS质谱系统使我们能够区分各种不同的蛋白形状。 ”结果确实令人惊奇。”Alison Ashcroft艾利森艾斯克劳福特博士说，她是生物分子质谱研究员，质谱室主任。 来自沃特世公司的SYNAPT 质谱系统为实验室带来研究聚集过程的新的洞察力。“它为我们的研究提供新一维的空间。我们现在可以对原始状态的蛋白质定量，也可对非折叠或部分折叠的蛋白进行定量。我们也可以监测某种特定的蛋白构象在聚集过程被消耗。这为生物分子在分子水平如何工作提供了重要的新层面。”艾斯克劳福特博士补充道。 沃特世公司于2006年6月在美国西雅图美国质谱年会上推出SYNAPT HDMS质谱系统。它是第一台商业化的，在质量之外，基于尺寸，形状和电荷数分析离子的质谱。 一个管理万亿字节科学数据的决策 在生物技术和生物科学院(BBSRC) 和维尔康姆信托的资助下，艾斯克劳福特实验室拥有五台不同形式的质谱仪器，而管理其产生的数据是一个巨大的挑战。为了更有效地管理数据文件，该实验室选择沃特世公司NuGenesis Scientific Data Management System (SDMS)科学数据管理系统。 “每天在DVD上备份数据已经不需要了。科学数据管理系统SDMS 每天一次从五台质谱仪上将数据自动备份，我们的研究生和博士后可以直接从他们办公室的计算机上看到数据。存档文件对我们很重要，因为政府资助部门要求我们自建成之日起存储五或十年的数据。研究生花四年的时间拿到博士学位，所以他们需要四年或更长时间查看数据，特别是如果在拿到博士学位后要写文章” 艾斯克劳福特博士评论道。 “非分析化学背景的人们认为一台质谱就是一个复杂的称重机器。通常他们没有意识到使用这台仪器可以看到蛋白功能和行为。但是当他们发现了之后，会感到无比惊奇。”艾斯克劳福特博士说。 艾斯克劳福特博士在美国质谱协会杂志的文章全文参考: Monitoring co-populated conformational states during protein folding events using ESI-IMS-MS, D. P. Smith, K. Giles, R. H. Bateman, S. E. Radford,A. E Ashcroft, J. Am. Soc. Mass Spectrom., 2007 Dec 18 (12): 2180 – 90, DOI:10.1016/j.jasms.2007.09.017 文章再版要求请寄至A. E. Ashcroft 博士, Astbury Centre for Structural Molecular Biology, Astbury Building, Faculty of Biological Sciences, University of Leeds, Leeds LS2 9JT UK，或发电子邮件email: a.e.ashcroft@leeds.ac.uk 关于利兹大学生物科学系，请浏览(http://www.fbs.leeds.ac.uk/) 利兹大学的生物科学系是英国最大的生命科学研究团体之一，拥有将近一百五十名学者和四百多名博士后和研究生。该系目前活跃的研究基金约六千万英镑，资助者包括慈善，研究院，欧盟和企业。该系拥有杰出的研究成果，在上一期政府研究评价检查(HEFCE)中，所有主要评估项目均获得第五级。 关于利兹大学爱斯布理Astbury中心， 请浏览(http://www.astbury.leeds.ac.uk/) 爱斯布理Astbury结构分子生物学中心是利兹大学一个跨学科研究中心。成立该中心的目的是在结构分子生物学的各个领域从事国际水平的研究课题。Astbury中心汇集了五十多位来自利兹大学各学科的学者，拥有共同的学术兴趣。该中心以 W.T.Astbury 的名字命名，他是生物物理学家，在利兹大学长期从事科学研究(1928-1961)，工作期间在该领域成立了多个基金会。 艾利森艾斯克劳福特博士，(http://www.astbury.leeds.ac.uk/facil/mass.htm) 是生物分子质谱研究员，利兹大学，生物科学系，爱斯布理Astbury结构分子生物学中心质谱室主任。她的研究着重于开发和使用质谱方法探索生物分子功能。 诗娜拉德福德教授，(http://bmbsgi10.leeds.ac.uk/)，是利兹大学，生物科学系，爱斯布理Astbury结构分子生物学中心结构分子生物学教授。她的研究着重于蛋白质折叠，非折叠和聚集机理。 生物技术和生物科学研究院(BBSRC) (www.bbsrc.ac.uk)是英国生命科学资助机构。 政府投资的生物技术和生物科学研究院BBSRC 每年在很大范围的研究领域投资三亿八千万英镑，为英国国民的生活质量做出突出贡献。 维尔康姆信托(www.wellcome.ac.uk)是英国最大的慈善机构。它资助英国国内和国际创新生物医学研究，每年投资额在五亿英镑左右。 (Waters, SYNAPT, High Definition MS, High Definition Mass Spectrometry, NuGenesis 和 HDMS 是沃特世公司商标。)

自然生命，有情众生，都难逃衰老的命运。从微观的调度来看，衰老会导致细胞适应性的下降和蛋白质功能的丧失。然而，衰老导致蛋白质聚集的机制还没有被完全理解。实际上，科学家们已经知道，随着年龄增长的蛋白质聚集是一个与许多疾病相关的问题。因此，深入研究这些疾病的基本生物学，了解导致它们的机制，可以帮助我们选择更好的治疗方法。衰老的根源在于核糖体？Nature最新研究发现，衰老加剧核糖体暂停，破坏共翻译蛋白质稳态！近日，斯坦福大学的研究人员在国际顶尖学术期刊 Nature 发表了题为：Ageing exacerbates ribosome pausing to disrupt cotranslational proteostasis 的研究论文。该研究提出，随着细胞衰老，核糖体翻译暂停将不断增加，导致核糖体相关质量控制（RQC）超载和新生多肽聚集，从而在衰老过程中至关重要地促进了蛋白平衡障碍和全身衰退。该论文开辟了一个新的研究方向，将衰老如何导致蛋白质聚集的问题追溯到了核糖体的年龄依赖性损伤。核糖体（Ribosome）是细胞内普遍存在的一种细胞器，主要由rRNA和蛋白质构成，“中心法则”中mRNA翻译成蛋白质这一过程就发生在核糖体。其功能是按照mRNA的指令将遗传密码转换成氨基酸序列并从氨基酸单体构建蛋白质聚合物。因此，核糖体也被称为细胞内蛋白质合成机器。核糖体的结构和功能本研究的第一作者 Kevin C. Stein 博士表示：“衰老伴随着细胞蛋白平衡的失调，这是许多与年龄相关的蛋白质错误折叠疾病的基础。然而，衰老是如何破坏蛋白质平衡的仍不清楚。由于新生多肽对蛋白平衡网络构成了巨大的负担，我们假设，衰老过程中翻译效率的改变可能有助于推动蛋白平衡的崩溃。”在这项最新研究中，研究团队发现衰老改变了秀丽隐杆线虫和酿酒酵母的翻译延伸过程的动力学。在衰老的线虫和酵母的特定位置（例如多碱基区域）核糖体暂停被加剧，导致核糖体碰撞增加，从而触发核糖体相关质量控制（RQC）。事实上，长寿的酵母突变体减少了年龄依赖的核糖体暂停，并且延长了寿命，具体与更大通量的RQC途径相关。研究人员还发现，线虫中显示年龄依赖核糖体暂停的新生多肽在年龄依赖的蛋白聚集体中强烈富集，进一步将核糖体翻译停顿与蛋白平衡崩溃联系起来。研究衰老对翻译动力学和协同翻译的影响通过结合实验和计算数据分析，研究人员发现核糖体的功能会随年龄的增长而退化，与此同时，有缺陷的蛋白质也会不断增加，使得原本会阻止蛋白质聚集的质量控制失效保护机制无法发挥作用。斯坦福大学生物学和遗传学教授、本研究的通讯作者 Judith Frydman 博士说道：“蛋白质在生命中最脆弱和最关键的时刻——也就是它最容易发生错误折叠的时候——恰恰是它形成的时候。”衰老加剧了酵母中核糖体在多碱基区域的暂停研究团队使用了一种称为核糖体图谱的技术，这种技术可以让他们准确地看到在翻译过程中核糖体是如何在mRNA上移动的。他们观察到，在年龄较大的细胞中，核糖体的周期性移动变得更慢，并且核糖体性能的下降与年龄相关的错误折叠蛋白质聚集的增加相一致。核糖体暂停后，被截断的新生多肽的年龄依赖性聚集对此，论文第一作者 Kevin C. Stein 博士解释道：“有两种情况，衰老导致核糖体碰撞的增加和停滞，但细胞失去了处理它的安全网络。”核糖体暂停和截断的新生多肽在衰老过程中的聚集本研究的另一位主要作者 Fabián Morales-Polanco 博士兴奋地表示，这个发现只是一个非常迷人的未来的开端，这开创了一个新的研究方向，也随之而来了无数个等待回答的问题，并可能因此产生数百篇论文。总而言之，这项研究提出，随着细胞衰老，核糖体翻译暂停将不断增加，导致核糖体相关质量控制（RQC）超载和新生多肽聚集，从而在衰老过程中至关重要地促进了蛋白平衡障碍和全身衰退。 论文链接：https://www.nature.com/articles/s41586-021-04295-4

冷冻电镜（cryo-EM）解析了一种帮助调节血压的蛋白质，即血管紧张素转换酶（ACE）的详细结构。这些结构提供了迄今为止对ACE的最全面的看法，将有助于改善心脏病的药物设计。这项工作是由开普敦大学（UCT）的研究人员与英国同步辐射光源"DIAMOND"的电子生物成像中心（eBIC）合作完成的。研究人员在《EMBO Journal》上发表了他们的研究结果（"冷冻电镜揭示了血管紧张素I转化酶的异构化和二聚化机制"）。ACE会产生激素血管紧张素II，使血管收缩并提高血压。高血压是心脏病和中风的主要风险因素。与以前的方法相比，冷冻电镜使研究人员能够在更多的功能相关状态下观察到ACE。他们的工作为其生物功能和潜在的药物结合特性提供了关键性的见解。ACE蛋白的一个副本（即单体形式）是由两个结构相似但功能不同的结构域连接而成的。二聚体化（即两个ACE单体的相互作用）发生在一个小的表面空腔附近，改变了对ACE功能至关重要的核心氨基酸的构象。研究人员提出，这种二聚体化可能像一个 "关闭开关"，触发蛋白质核心的变化，并可能抑制它。如果能设计出一种类似药物的分子在腔内结合并引起同样的效果，它就能提供一种新的手段来使该酶失活。目前，许多ACE抑制剂在临床上可用于治疗高血压。但这些抑制剂非选择性地针对两个ACE结构域，并因此会在一些患者中引发副作用。开普敦大学教授、该研究的主要研究者Edward Sturrock博士解释说:“了解这些新发现的ACE结构和动态至关重要，这可能针对结构域选择性抑制剂的设计提供新的结合位点，进而规避副作用。”ACE蛋白在Sturrock的实验室生产，在UCT的电子显微镜单元（EMU）进行成像前的准备，并在之后转运到eBIC，在Titan Krios上进行冷冻电镜成像。图像处理在南非的CSIR高性能计算中心（CHPC）和EMU进行。“即使有高分辨率的成像，ACE的独特形状、小分子量和高度动态等特征也带来了许多挑战。"该研究的共同作者之一Jeremy Woodward博士解释道。该研究的第一作者Lizelle Lubbe博士解释说："最近开发的冷冻电镜图像处理方法对解析这些结构至关重要。"我们必须通过广泛的分类来计算分离图像，这一过程相当于' 数字纯化' ，因为生化方法无法分离ACE的单体和二聚体形式。然后，我们可以将三维细化的重点依次放在结构的不同部分，从而解析这两种ACE结构"。该研究的发现独特地揭示了ACE的高度动态特征，以及其不同结构域之间发生二聚体化和交流的机制--这可能启发治疗心脏病的新药。DIAMOND科学组组长克里斯-尼克林博士说：“我们对非洲的杰出科学家团队利用eBIC先进的冷冻电镜取得的这项研究结果感到高兴。世界迫切需要针对致命的心脏病和其他慢性健康状况的可持续解决方案。我们非常高兴的是，这项研究的结构见解可以为改进抗高血压药物设计铺平道路。”相关文献：Cryo-EM Structures of a Key Hypertension Protein to Aid Drug DesignCryo-EM揭示了血管紧张素I转化酶的异构化和二聚化的机制高血压（高血压）是心血管疾病的一个主要风险因素，而心血管疾病是全世界死亡的主要原因。血管紧张素I转化酶（sACE）的体细胞异构体在血压调节中起着关键作用，因此ACE抑制剂被广泛用于治疗高血压和心血管疾病。我们目前对sACE结构、动力学、功能和抑制作用的理解是有限的，因为截短的、最小的糖基化形式的sACE通常被用于X射线晶体学和分子动力学模拟。在这里，我们首次报告了全长的、糖基化的、可溶性的sACE（sACES1211）的冷冻电镜结构。这个高度灵活的apo酶的单体和二聚体形式都是由一个数据集重建的。单体sACES1211的N端和C端结构分别在3.7和4.1Å被解析，而负责二聚体形成的相互作用的N端结构则在3.8Å被解析。此外，观察到两个结构域都处于开放构象，这对设计sACE调节剂有意义。参考资料："Cryo-EM reveals mechanisms of angiotensin I-converting enzyme allostery and dimerization"

乳清蛋白含量新国标有指标规定无检测标准 卫生部正研制新检验方法 　　雅培事件新闻追踪 　　南方日报讯 最近雅培奶粉身陷“质量门”事件，再度引发了人们对新国标的质疑。在新国标中明确规定乳清蛋白与酪蛋白比例指标，该指标被部分专家认为是判别奶粉是否易为幼儿消化。然而令人困惑的是，新国标里没有该项目的检测标准，在日常监管中，也非常规抽查项目。对此，国家食品安全风险评估中心也承认，由于采用现行乳清蛋白测定方法的测定结果与实际含量存在一定的误差。据悉，目前卫生部正在组织研制新的乳清蛋白的检验方法。 　　最近雅培与香港CER公司的“口水战”，引发人们对我国新国标乳清蛋白和酪蛋白比例指标的争议。根据我国国家标准规定，婴幼儿配方奶粉中这个比例应为6：4，而CER公司检测的结果是41：59，故CER检测报告得出雅培涉事奶粉“质量最差”。 　　记者昨天从国家食品安全评估中心获悉，我国《婴儿配方食品》国标中，确有要求以乳或乳蛋白制品为主要原料的婴儿配方食品中，乳清蛋白所占总蛋白质的比例应大于等于60%。“该要求主要是参考母乳中乳清蛋白和酪蛋白的比例”，国家食品安全风险评估中心在一则《对婴儿配方食品中乳清蛋白比例的说明》中称，乳清蛋白是蛋白质的一种，为人体提供必需氨基酸等成分。 　　值得一提的是，虽然目前婴幼儿配方奶粉新国标中规定有乳清蛋白与酪蛋白的比例要求，在日常监管部门的抽查中，这并不是一个常规抽查项目。有乳品专家指出，目前国内缺少配方奶粉工艺标准，甚至连检测标准都没有。 　　国家食品安全风险评估中心也坦承，目前卫生部正在组织有关单位研制新的乳清蛋白的检验方法。

图1：通过定向固定抗冻蛋白，发现抗冻蛋白的冰结合面和非冰结合面对冰核形成的“janus”效应。图2：分子动力学模拟揭示了抗冻蛋白的冰结合面和非冰结合面上界面水性能具有显著差异，从而提供了抗冻蛋白对冰核形成具有的“janus”效应的分子机制。抗冻蛋白是生活在寒冷区域的生物经过长期自然选择进化产生的一类用于防止生物体内结冰而导致生物体死亡的功能性蛋白质。对于抗冻蛋白抗冻机制的研究有助于揭开冰晶成核、生长和冰晶形貌调控的分子层面的机理。因而，自上世纪60年代首次发现抗冻蛋白以来，科研人员对这类蛋白的抗冻机制进行了近半个世纪的研究。但是，科研人员对抗冻蛋白调控冰晶成核的机制一直有争议，即有些科研人员认为抗冻蛋白能促进冰核的形成，而另一些科研人员认为抗冻蛋白可以抑制冰核的生成。在国家自然科学基金委、科技部和中国科学院的大力支持下，中科院化学研究所研究员王健君课题组与中科院上海应用物理研究所副研究员王春雷、研究员方海平和新疆大学教授马纪合作，根据抗冻蛋白的冰结合面 (ice-binding face)和非冰结合面 (non-ice-binding face)具有截然不同官能团的特性，将抗冻蛋白定向固定于固体基底，选择性地研究了抗冻蛋白冰结合面与非冰结合面对冰核形成的影响。研究表明抗冻蛋白的不同面对冰核的形成表现出完全相反的效应：冰结合面促进冰晶成核，而非冰结合面抑制冰晶成核（图1）。他们通过分子动力学模拟进一步研究了抗冻蛋白的冰结合面和非冰结合面界面水的结构，发现了冰结合面上羟基和甲基有序间隔排列使得冰结合面上形成类冰水合层，从而促进冰核生成；而非冰结合面上存在的带电荷侧链及疏水性侧链，使得非冰结合面上的界面水无序，从而抑制冰核形成。揭示了抗冻蛋白对冰成核“janus”效应分子层面的机制。该研究大大加深了人们对抗冻蛋白分子层面防冻机制的理解，同时对仿生合成防覆冰材料和低温器官保存材料有着重要的指导意义。相关结果发表在《美国科学院院刊》（pnas, 2016, doi: 10.1073/pnas.1614379114）上。

冻干可以通过去除样品中的水分，限制分子的流动性，减慢药物成分的物理/化学反应来延长产品的保质期，然而固体状态的配方也不是一直稳定的，由于在干燥过程中，蛋白质暴露在许多应力作用下，在长期的储存过程中，仍然容易发生物理/化学反应。在冻干及储存过程中，我们常常会加入一些稳定剂来保护蛋白免受应力的影响，主要有两种稳定机理来解释：水替代假说和玻璃化假说；但是两种稳定机制都需要将蛋白质分子分散在稳定剂中，使得蛋白质和稳定剂都处于相同的单一无定形相，即不发生相分离。那么相分离是如何发生的？为什么会发生？相分离主要发生在冻干的预冻步骤，在一定程度上取决于冻干的工艺和配方成分。1、相分离的机理 图1：冻干分为三个步骤冻干主要分为三个步骤：预冻，主干燥及次级干燥。（如图1所示）在预冻过程中，溶液被降到一个很低的温度，晶核形成并且生长，样品中的溶质浓度不断浓缩，可以达到初始浓度的约50倍，如果在热力学和动力学上均利于反应发生的条件下，高浓度的溶质可以导致相分离。2、相分离热力学当溶液为成分A 和成分B的混合物，会发生下面的相互作用（如图2所示）。熵和焓之间的竞争决定了相分离的过程。相分离的热力学基于混合物的自由能（弗洛里-哈金斯理论），聚合物由于尺寸大小和连通性，不能充分利用可用体积，大分子量聚合物的熵变化较小，因此，混合物热力学更容易受到较大焓贡献的支配，当ΔGmix 0: 热力学上有利于相分离 (A-A和B-B相互作用优于A-B相互作用)。 图2：溶液A和B发生的相互作用如果相分离是热力学自发以及动力学上利于反应（足够的移动性和时间），蛋白和稳定剂会分离成两个不同的相，富含稳定剂的无定形相以及富含蛋白的无定形相，后者由于缺乏稳定剂的保护，蛋白更易于降解。（如图3所示）图3：蛋白和稳定剂会分离成两个不同的相3、相分离的检测方法无定形-无定形物质的相分离不容易检测，由于检测方法有限，证据不足，目前主要有如下检测方法：检测技术方法局限性调制DSC配方中有多个Tg’表示有多个无定形相通常，富含蛋白的相不能被DSC检测到，因为在Tg’温度下具有较小的ΔCP；要求高浓度的蛋白配方。拉曼成像技术非重叠成分峰的线谱分析范围：2-50微米；不能检出低于检测限的成分波动。固体核磁共振利用弛豫时间来探测2-5 nm, 20-50 nm分子大小物质的混溶性动态实验需要大量的样品。X射线衍射/散射在纳米尺度上探测结构特征对于两个组分，均包含重要的结构层次，无法区分相分离；成本高，动态实验。SEM肉眼观察物质的形态结果会存在模棱两可的现象；需要较大的容易辨认的相。电介质技术依赖于电场中的分子迁移率响应存在不确定性。4、工艺参数对相分离的影响过冷度-----成核温度❖热力学冻结温度和首次成核温度之间的差值为过冷度；（如图4所示）❖较高的成核温度会更易导致相分离；（由于溶质在远高于Tg’温度下进行浓缩） 图4：过冷度冷却速度❖控制达到给定过冷度的速度；❖缓慢的冻结速度会更容易导致相分离；退火❖主要用于填充剂结晶，控制冰晶形态或增加冰晶体的大小，缩短一次干燥时间；❖如果两相热力学更稳定，退火时间和迁移率的增加可能会提供相分离的机会；灌装体积❖较大的灌装体积会对相分离有较大的影响，因为在样品中具有较大的热梯度。案例分享成核温度和冷却速度对相分离的影响对已知的相分离聚合物体系 1:1 PVP29K:DEX10K(100 mg/ml) 进行研究，将冷却台放在拉曼显微镜下进行观察。（如图5所示） 图5：已知相分离聚合物体系在拉曼显微镜下的观察成核温度对相分离的影响 图6：成核温度对相分离的影响与每个单一组分相比，成核温度较高的一组（-5℃）对相分离具有较大的影响；其余的成核温度对相分离影响较小。（如图6所示）冷却速度对相分离的影响 图7：冷却速度对相分离的影响所有的冷却速度均会在一定程度上提高相分离的倾向，但是影响较小。（如图7所示）*结论在没有热历史的情况下，成核温度和冷却速率对相分离的影响较小。成核温度和灌装体积对相分离的影响 图8：成核温度和灌装体积对相分离的影响较大的灌装体积（1ml VS 0.2ml）和较高的成核温度（-5℃ VS -10 ℃）会导致相分离,可能是由于样品内部存在较大的温度梯度。（如图8所示）5、配方成分对相分离的影响在冻干过程中配方成分的兼容性是阻止相分离的关键，如研究表明聚合物体系的不混溶性随着聚合物分子量的增加而增加。对于蛋白而言，相分离的倾向性可能与稳定剂大小，静电相互作用（盐类），稳定剂类型（填充剂、表面活性剂），稳定剂浓度，蛋白质特性（等电点，大小），配方PH值等有关。案例分享——配方组分对相分离的影响❖实验进行了系统的研究，探索蛋白质:糖的比例以及蛋白质(分子量，电荷)和糖(分子量，单糖亚基和长度)的特性如何影响配方在冻干过程中的混溶性。（如图9,10,11所示）❖蛋白质和糖(200mg /mL)的混合物按以下比例(w:w)：蛋白质：糖——0:1,1:9,1:4,1:2.3,1:1.5,1:1,1:5:1,2.3:1,4:1,9:1❖多个Tg’的存在表明存在相分离。 图9 图10 图11实验表明● 在所有的蛋白-糖体系均观察到了相分离现象（两个不同的Tg’），尽管不同的比例出现相分离的时间不同；● 不同蛋白-糖混合物Tg’的宽度不同，有可能多个Tg’会重叠在一起，形成一个较宽的Tg’, 导致无法检测到相分离现象；● 其中在牛血清蛋白和海藻糖混合物中，当二者比例为1:1.5和1:1 时，观察到存在相分离现象；（如图12所示） 图12● 对于蛋白-糖体系中，二者比例从1:2.3 到4:1 均观察到存在相分离现象；（如图13所示）图13结论● 对于几乎所有被研究的体系中，当配方中蛋白质和糖的比例为1:1和1.5:1时确定会发生相分离现象，这表明蛋白质和糖的比例和系统的相分离倾向之间可能存在相关性；● 在系统的相分离趋势和以下属性之间似乎没有明显的相关性: # 蛋白质电荷/等电点 # 蛋白质分子量 # 糖的分子量 # 单糖亚基；● 在几乎所有研究的配方中，当蛋白和糖的比例为1:1时会发生相分离；● 本研究结果表明，冻干蛋白配方中应加入过量的稳定剂。6、冻干蛋白配方中相分离的重要性● 相分离取决于具体的操作过程和组分；● 在预冻过程中，温度/时间和浓度是关键因素，会影响系统相分离的趋势；● 蛋白和稳定剂的物理化学特性会影响相分离；● 在冻干过程中保护不足会导致长期储藏过程中不稳定性的增加；● 当缺乏稳定剂时，蛋白在干燥过程中会发生改变（即形成反应型结构），这可能会导致储存过程中潜在的稳定性问题；● 需要了解相分离如何影响冻干制剂的保质期；● 相分离检测是稳定性欠佳的指标；● 未检测到的相分离会影响蛋白质稳定性和整体产品质量；● 需要更好的检测方法!当前的方法可以证明样品存在相分离，但不能证明样品不存在相分离。参考文献[1] Padilla,A.M.et.Al.(2011).”The Study of Phase Separation in a Model Polymer Phase Separating System Using Raman Microscopy and a Low-Temperature Stage: Effect of Cooling Rate and

原位变温低场核磁共振系统用于抗冻蛋白分子动力学分析什么是抗冻蛋白？抗冻蛋白是一种能抑制冰晶生长的蛋白质或糖蛋白质.自二十世纪发现以来,研究对象先后从极区鱼类,昆虫,转移到植物材料上。抗冻蛋白是生活在寒冷区域的生物经过长期自然选择进化产生的一类用于防止生物体内结冰而导致生物体死亡的功能性蛋白质。对于抗冻蛋白抗冻机制的研究有助于揭开冰晶成核、生长和冰晶形貌调控的分子层面的机理。抗冻蛋白生长机制的模型抗冻蛋白吸附在冰晶表面,通过EAFC3效应抑制其生长.机制的模型为:一般晶体的生长垂直于晶体的表面,假如杂质分子吸附于冰生长通途的表面,那么需要在外加一推动力(冰点下降),促使冰在杂质间生长.由于曲率增大,使边缘的表面积也增加.因表面张力的影响,增加表面积将使体系的平衡状态发生改变,从而冰点降低。通过对抗冻植物抗冻活性的研究,认为抗冻植物形成了一种特殊的控制胞外冰晶形成的机制,即抗冻蛋白和冰核聚物质的协同作用.在植物体内,热滞效应并不明显,而冰重结晶抑制效应显著.吸附抑制学说是否适应于植物有待于进一步的证实.原位变温低场核磁共振系统用于抗冻蛋白分子动力学分析原位变温低场核磁共振系统是指可以实现在线原位改变样品温度，并在设置温度下对样品进行原位测量的低场核磁共振系统。该系统可同时实现弛豫分析和磁共振成像功能。传统的低场核磁共振系统是常温测试系统，测试过程中样品的温度保持与实验室温度（环境温度）一致，检测到的数据与样品在室温下的特性相关。而原位变温低场核磁共振系统可对样品进行程序控温（高低温），并进行原位检测，可研究不同温度下样品的特性。可对样品进行冷冻过程、干燥过程、蒸煮过程、样品冰点、食品变性过程等相关研究。 原位变温低场核磁共振系统是在常规低场核磁共振系统上加配了变温探头、控温硬件以及控温软件。系统样机如下图：

结构生物学领域有一条不成文的观点：结构决定功能。只有知道生物分子的原子排布，科学家们才能了解这个蛋白的功能。几十年来，分析蛋白结构有一个无冕之王——X射线晶体衍射。在X射线晶体衍射中，科学家们让蛋白结晶，然后利用X射线照射，随后根据X射线的衍射来重建蛋白的结构。在蛋白质数据银行(Protein Data Bank)的100000多条蛋白词目里，超过90%的蛋白结构是利用X射线晶体衍射技术解析得到的。　　尽管X射线晶体衍射一直是结构生物学家的最佳工具，但是它存在较大的限制。科学家们将蛋白进行大块结晶通常需要多年的时间。而很多基础蛋白分子，例如嵌在细胞膜上的蛋白，或是形成复合体的蛋白却无法被结晶。　　X射线晶体衍射技术(X-ray crystallography)即将成为历史，低温电子显微技术(cryo-electron microscopy, 也称作electron cryomicroscopy, cryo-EM)引发结构生物学变革。　　低温电子显微镜适用于研究大的、稳定的分子，这些分子能够承受电子的轰击，而不发生变形——由多个蛋白组成的分子机器是最好的样本。因此由RNA紧紧围绕的核糖体是最佳的样本。三位化学家用X射线晶体衍射研究核糖体溶液的工作在2009年获得了诺贝尔化学奖，但这些工作花了几十年。近几年，低温电镜研究者们也陷入了“核糖体热”。多个团队研究了多种生物的核糖体，包括人类核糖体的首个高清模型。X射线晶体衍射的研究成果远远落后于LMB的Venki Ramakrishnan实验室，Venki获得了2009年的诺奖。Venki表示，对于大分子来说，低温电子显微镜远比X射线晶体衍射要实用。　　这几年，低温电子显微镜的相关文章有很多：2015年一年，这个技术就用于100多个分子的结构研究。X-射线晶体衍射只能对单个、静态的蛋白晶体成像，但低温电子显微镜能够对蛋白的多种构象进行成像，帮助科学家们推断蛋白的功能。　　现在低温电镜迅猛发展，专家们正在寻找更大的挑战作为下一个解析目标。对很多人来说，最想解析的是夹在细胞膜内的蛋白。这些蛋白是细胞信号通路中的关键分子，也是比较热门的药物靶标。这些蛋白很难结晶，而低温电子显微镜不大可能对单个蛋白进行成像，这是因为很难从背景噪音中提取这些信号。　　这些困难都无法阻挡加利福利亚大学(University of California)的生物物理学家程亦凡。他计划解析一种细小的膜蛋白TRPV1。TRPV1是检测辣椒中引起灼烧感的物质的受体，并与其它痛感蛋白紧密相关。加利福利亚大学病理学家David Julius等人之前尝试结晶TRPV1，结果失败。用低温电子显微镜解析TRPV1项目，一开始进展缓慢。但2013年底，技术进步使得这一项目有了重大突破，他们获得了分辨率为0.34纳米的TRPV1蛋白的结构。该成果的发表对于领域来说，无异于惊雷。因为这证实了低温电子显微镜能够解析小的、重要的分子。　　尽管低温电子显微镜发展迅速，很多研究者认为，它仍有巨大提升空间。他们希望能制造出更灵敏的电子探测器，以及更好地制备蛋白样本的方法。这样的话，就能够对更小的、更动态的分子进行成像，并且分辨率更高。5月，有研究者发表了一篇细菌蛋白的结构，分辨率达到了0.22纳米。这也显示了低温显微镜的潜力。　　1997年时，英国医学研究委员会分子生物学实验室结构生物学家Richard Henderson非常坚定地宣称，低温电镜会成为解析蛋白结构的主流工具。在将近20年后的今天，他的预测比当年有了更多底气。Henderson表示，如果低温电镜保持这样的势头继续发展，技术问题也得以解决，那么低温电镜不仅会成为解析蛋白结构的第一选择，而是主流选择。这个目标已经离我们不远了。　　1. 施一公小组在《Science》发两篇论文报道剪接体三维结构　　　　U4/U6.U5 tri-snRNP电镜密度及三维结构示意图。　　2015年8月21日，清华大学生命科学学院施一公教授研究组在国际顶级期刊《科学》(Science)同时在线发表了两篇背靠背研究长文，题目分别为“3.6埃的酵母剪接体结构”(Structure of a Yeast Spliceosome at 3.6 Angstrom Resolution)和“前体信使RNA剪接的结构基础”(Structural Basis of Pre-mRNA Splicing)。第一篇文章报道了通过单颗粒冷冻电子显微技术(冷冻电镜)解析的酵母剪接体近原子分辨率的三维结构，第二篇文章在此结构的基础上进行了详细分析，阐述了剪接体对前体信使RNA执行剪接的基本工作机理。清华大学生命学院博士后闫创业、医学院博士研究生杭婧和万蕊雪为两篇文章的共同第一作者。　　这一研究成果具有极为重大的意义。自上世纪70年代后期RNA剪接的发现以来，科学家们一直在步履维艰地探索其中的分子奥秘，期待早日揭示这个复杂过程的分子机理。施一公院士研究组对剪接体近原子分辨率结构的解析，不仅初步解答了这一基础生命科学领域长期以来备受关注的核心问题，又为进一步揭示与剪接体相关疾病的发病机理提供了结构基础和理论指导。详细新闻报道参见：施一公研究组在《科学》发表论文报道剪接体组装过程重要复合物U4/U6.U5 tri-snRNP的三维结构。(Science, 20 Aug 2015, doi: 10.1126/science.aac7629 doi: 10.1126/science.aac8159)　　2. Science：HIV重大突破!史上最详细HIV包膜三维结构出炉!　　　　这项研究首次解析出HIV Env三聚体处于自然状态下的高分辨率结构图，其中HIV利用Env三聚体侵入宿主细胞。图片来自The Scripps Research Institute。　　在一项新的研究中，TSRI的研究人员解析出负责识别和感染宿主细胞的HIV蛋白的高分辨率结构图片。相关研究结果发表在2016年3月4日那期Science期刊上，论文标题为“Cryo-EM structure of a native, fully glycosylated, cleaved HIV-1 envelope trimer”。　　这项研究是首次解析出这种被称作包膜糖蛋白三聚体(envelope glycoprotein trimer，以下称Env三聚体)的HIV蛋白处于自然状态下的结构图。这些也包括详细地绘制这种蛋白底部的脆弱位点图，以及能够中和HIV的抗体结合位点图。(Science, 04 Mar 2016, doi: 10.1126/science.aad2450)　　3. Nature：史上最详细转录因子TFIID三维结构出炉，力助揭示人类基因表达秘密　　在一项新的研究中，来自美国加州大学伯克利分校、劳伦斯伯克利国家实验室和西班牙国家研究委员会(CSIC)罗卡索拉诺物理化学研究所的研究人员在理解我们体内被称作转录起始前复合物(pre-initiation complex, PIC)的分子机构(molecular machinery)如何发现合适的DNA片段进行转录方面取得重大进展。他们史无前例地详细呈现一种被称作TFIID的转录因子所发挥的作用。相关研究结果于2016年3月23日在线发表在Nature期刊上，论文标题为“Structure of promoter-bound TFIID and model of human pre-initiation complex assembly”。论文通信作者是劳伦斯伯克利国家实验室生物物理学家Eva Nogales，论文第一作者是Nogales实验室生物物理学研究生Robert Louder。其他作者是Yuan He、José Ramón López-Blanco、Jie Fang和Pablo Chacón。　　这一发现是非常重要的，这是因为它为科学家们理解和治疗一系列恶性肿瘤铺平道路。Eva Nogales说，“理解细胞中的这种调节过程是操纵它或当它变坏时修复它的唯一方式。基因表达是包括从胚胎发育到癌症在内的很多重要生物学过程的关键。一旦我们能够操纵这些基本机制，那么我们就能够要么校正应当或不应当存在的基因表达，要么阻止这种过程[即基因表达]失去控制时的恶性状态。”(Nature, 31 March 2016, doi:10.1038/nature17394)　　4. Science：科学家成功解析人类剪接体关键结构　　　在最近发表的一篇Science研究论文中，来自德国的科学家们利用冷冻电镜技术首次在分子级分辨率水平上重现了人类剪接体中一个关键复合体——U4/U6.U5 tri-snRNP的结构。剪接体是一种由RNA和蛋白质组成的用于切掉mRNA前体中内含子的分子机器。该研究解析的U4/U6.U5 tri-snRNP是构成剪接体的一个重要组成部分，研究人员利用单颗粒冷冻电镜获得了人类U4/U6.U5 tri-snRNP的三维结构，该复合体分子量达到180万道尔顿，解析分辨率达到7埃。该研究模型揭示了Brr2 RNA解螺旋酶如何在分离的人类tri-snRNP中通过空间结构阻止未成熟的U4/U6 RNA发生解链，还展现了泛素C端水解酶样蛋白Sad1如何将Brr2固定在预激活位置。　　研究人员将他们获得的结构模型与酿酒酵母tri-snRNP以及裂殖酵母剪接体的结构进行了对比，结果表明Brr2在剪接体激活过程中发生了显著的构象变化，支架蛋白Prp8也发生了结构变化以容纳剪接体的催化RNA网络。(Science, 25 Mar 2016, doi: 10.1126/science.aad2085)　　5.北京大学毛有东、欧阳颀课题组与其合作者在Science发表炎症复合体冷冻电镜结构　　　　炎症复合体三维结构　　北京大学物理学院毛有东研究员、北京大学物理学院/定量生物学中心欧阳颀院士与哈佛医学院吴皓教授合作利用冷冻电子显微镜技术解析了近原子分辨率的炎症复合体的三维结构，首次阐释了其复合物在免疫信号转导过程中的单向多聚活化的分子结构机理。该研究工作以“Cryo-EM Structure of the Activated NAIP2/NLRC4 Inflammasome Reveals Nucleated Polymerization”为题于2015年10月8日在线发表在国际期刊Science。　　先天免疫是人类免疫系统的重要组成部分，炎症复合体在触发先天免疫响应的过程中起到了关键信号转导的效应器作用，从而启动细胞凋亡等免疫应答和炎症反应。炎症复合体是胞浆内一组复杂的多蛋白复合体，是胱天蛋白酶活化所必需的反应平台，其复合物单体由多个结构域构成，并在上游蛋白的激活下诱导组装形成环状复合物。炎症复合体的结构对于认识先天免疫的信号转导过程、免疫调控和病原诱导活化等免疫响应机理具有关键的核心价值，因而成为国内外一流结构生物学和免疫学实验室追捧的研究对象。(Science, 23 Oct 2015, 10.1126/science.aac5789)　　6. Nature：施一公团队揭示γ -分泌酶原子分辨率结构　　　　人体γ -分泌酶3.4埃三维结构　　日前，清华大学教授施一公团队与国外学者合作，构建了分辨率高达3.4埃的人体γ -分泌酶的电镜结构，并且基于结构分析了γ -分泌酶致病突变体的功能，为理解γ -分泌酶的工作机制以及阿尔茨海默氏症的发病机理提供了重要基础。相关成果8月18日在《自然》发表。　　阿尔茨海默氏症是最为严峻的老年神经退行性疾病之一，但其发病机理尚待揭示。目前研究已知β -淀粉样沉淀是该病的标志性症状之一。而β -淀粉样沉淀的产生是APP蛋白经过一系列蛋白酶切割产生的短肽聚集而来。在此切割过程中，最关键的蛋白酶是γ -分泌酶。γ -分泌酶由四个跨膜蛋白亚基组成，其中，编码Presenilin(PS1)蛋白的基因中有200多个突变与阿尔茨海默氏症病人相关。γ -分泌酶在阿尔茨海默氏症的发病中扮演着重要角色。　　研究人员通过收集更多的数据、大量的计算并升级分类方法，计算构建出3.4埃原子分辨率γ -分泌酶的三维结构，可以观察到绝大部分氨基酸的侧链以及胞外区部分糖基化修饰和结合的脂类分子。在高分辨结构的基础上，施一公研究组对PS1上的致病性突变体进行了研究，发现这些突变主要集中在两个较为集中的区域内。他们对于其中一些突变体进行了生化性质的研究，发现这些突变会影响γ -分泌酶对于底物APP的酶切活性，然而对切割活性的影响却有所不同。(Nature, 10 September 2015, doi:10.1038/nature14892)　　7. Nature：人类核糖体结构终于被解析!　　　　核糖体是进行蛋白质翻译的机器，能够催化蛋白质合成。目前，许多研究已经对多种生物的核糖体结构进行了原子水平的结构解析，但获得人核糖体结构一直存在很大挑战，这一问题的解决对于人类疾病的深入了解以及治疗手段和策略的开发都有重要意义。　　近日，著名国际学术期刊nature在线发表了法国科学家关于人类核糖体结构解析的最新研究进展。　　在该项研究中，研究人员利用高分辨率单颗粒低温电子显微镜以及原子模型构建的方法获得了人类核糖体接近原子水平的结构。该核糖体结构的平均分辨率为3.6A，接近最稳定区域的2.9A分辨率水平。这一研究成果对人类核糖体RNA，氨基酸侧链的实体结构，特别是转运RNA结合位点以及tRNA脱离位点处的特定分子相互作用提供了深入见解，揭示了核糖体大小亚基接触面的原子细节，发现在核糖体大小亚基的旋转运动过程中，其接触面发生了强烈的重构过程。(Nature, 30 April 2015, doi:10.1038/nature14427)　　8. Nature：日本科学家成功解析代谢关键因子受体结构　　近日，著名国际学术期刊nature在线发表了日本科学家的最新研究进展，他们利用结构生物学方法对脂联素(adiponectin)受体，AdipoR1和AdipoR2，进行了结构解析，发现脂联素受体具有与G蛋白偶联受体不同的七次跨膜螺旋，对于靶向脂联素受体的肥胖及其相关代谢疾病治疗方法开发具有重要意义。　　在该项研究中，研究人员对人类AdipoR1和AdipoR2的晶体结构进行了解析，分辨率分别达到2.9 ?和2.4 ?，他们通过解析发现脂联素受体是具有不同结构的一类新受体。脂联素受体的这种七次跨膜螺旋在构象上与G蛋白偶联受体的七次跨膜螺旋不同，在这种新的 七次跨膜螺旋中，由三个保守组氨酸残基协同一个锌离子形成了一个大的腔体。这种锌结合结构可能在adiponectin刺激的AMPK磷酸化和UCP2表达上调方面具有一定作用。(Nature, 16 April 2015, doi:10.1038/nature14301 )　　9. Molecular Cell：中国科学家揭示A型流感病毒RNA聚合酶复合体的三维冷冻电镜结构　　2015年1月22日，中科院生物物理所刘迎芳研究组与清华大学王宏伟研究组在著名期刊Molecular Cell杂志在线发表了题目为 “Cryo-EM Structure of Influenza Virus RNA Polymerase Complex at 4.3 ? Resolution”的论文，揭示了流感病毒RNA聚合酶复合体的结构和功能。　　生物物理所刘迎芳和清华大学王宏伟课题组等中外多方参与的实验室通过使用最新的高分辨率单颗粒冷冻电镜三维重构技术，解析了含有A型流感病毒RNA聚合酶大部分成分的4.3埃分辨率的四聚体电镜结构。该复合体涵盖了流感病毒聚合酶催化活性的核心区域。从三维重构密度图中可以清晰识别出该空腔内PB1上的催化结构域以及结合的RNA复制起始链，据此，研究人员推测这是进行RNA合成反应的区域。这一活性中心结构与正链RNA聚合酶具有相似性，研究人员也因此提出了流感病毒合成新生RNA链的机制。(Molecular Cell, 5 March 2015, doi:10.1016/j.molcel.2014.12.031)　　10. Cell：科学家获得首个中介体复合物精确结构图　　　　中介体复合物(Mediator Complex)是细胞中最大也最为复杂的分子机器之一。现在，来自斯克利普斯研究所(TSRI)的科学家们在《细胞》杂志上报告称，他们利用用电镜获得了首个中介体复合物(Mediator)的精确结构图。　　Mediator是所有动植物细胞中的关键分子机器，对于绝大多数基因的转录有着至关重要的调控作用。Mediator拥有二十多个蛋白亚基，解析它的结构是基础细胞生物学的一大进步。这一成果能够为许多疾病提供宝贵的线索(从癌症到遗传性的发育疾病)。论文资深作者，TSRI副教授Francisco Asturias表示："明确这些大分子机器的结构和作用机制，可以帮助我们理解许多关键的细胞过程。"　　在这项新研究中，研究人员获得了高纯度的酵母Mediator，并通过电镜成像得到了迄今为止最为清晰的Mediator3D模型，分辨率达到约18埃。随后他们又进行了多种生化分析，例如在逐个去除蛋白亚基的同时观察电镜图像发生的改变。他们由此确定了酵母Mediator25个蛋白亚基的精确定位。　　项新研究获得的结构图谱，全面修正了之前的Mediator' 粗略模型。论文第一作者Kuang-LeiTsai表示："定位了所有的蛋白亚基之后，我们发现头部模块应该位于Mediator的顶部而不是底部。"此外，研究人员还对人类Mediator进行了深入研究。Tsai说："大体上看，人类和酵母的Mediator总体结构颇为类似。"最后研究人员在结构数据的基础上，为人们展示了Mediator调控转录时的构象变化。(Cell, 29 May 2014, doi: 10.1016/j.cell.2014.05.015)

丝素是最早利用的动物蛋白质之一,它作为纤维材料在纺织领域中具有无可比拟的优越性。随着科学技术的进步和人们对蚕丝结构、性质研究的不断深入,丝素在生物材料及医药领域中的应用越来越引人注目。 丝素蛋白可用作手术缝线、隐形眼镜、人工皮肤等,还可以与其他材料混合制作人工肌肉。丝素具有独特的氨基酸组成和丝阮蛋白的二级结构,并且其中部分氨基酸对人体具有保健、医药功效，丝素蛋白作为生物医药材料的研究更加广阔而深入,特别在创面覆盖材料、药物释放材料、活性酶的载体及其生物传感器的应用、生物材料等方面的研究已取得了十分显著的成效。 丝素蛋白冻干粉是丝素蛋白再经技术处理后，通过冷冻干燥技术制备出来的丝素蛋白的冻干态，丝素蛋白冻干粉结构稳定，可溶于水，同时在室温下能长期保存和运输。丝素蛋白冻干粉经水调配后会再次形成丝素蛋白溶液，继而用于生物材料的制备和其他科学研发领域。广泛应用于组织工程、化妆品等领域，本文为您提供专业的应用方法来检测丝素蛋白冻干粉中的水分含量。使用仪器：禾工AKF-2010V智能卡尔费休水分测定仪配置：全封闭安全滴定池组件；铂针电极；滴定池搅拌台；10ul微量注样针；样品称量舟；电子天平（0.1mg）使用试剂：滴定剂：容量法单组份试剂，当量3mg/ml；溶剂：无水甲醇； 实验步骤：使用AKF-2010V水分仪的“吸溶剂”功能向滴定池内注入约40ml的无水甲醇溶剂，再通过”打空白“功能滴定至终点，以去除滴定池内的水分，仪器就绪并保持终点的状态，用经过干燥处理的微量进样针精确抽取5ul的纯水，拭干针头后放入天平称量选择仪器标定仪功能，将纯水注入到滴定池内液面以下，拭干针头后放入天平称量，将前后两次称量只差作为纯水的重量输入到仪器，开始标定。重复操作3-5次，仪器自动保存标定结果并计算出平均值作为试剂的滴定度。用称量舟称取一定量的样品加入滴定池，将进样前后称量舟的重量之差作为样品进样量输入仪器，并开始测量。 结果表明通过使用禾工AKF-2010V直接进样法测量，不但为分析测试人员省去了宝贵的时间，还同样有效的检测出了丝素蛋白冻干粉当中的含水量。

p 　　蛋白酶体是细胞中发现和降解不需要或者受损蛋白的分子机器。这些需要被降解的蛋白会被标上特殊的标签，然后蛋白酶体上一个由6个亚基组成的“机械手”依靠ATP提供的能量，将需要降解的蛋白“抓”到蛋白酶体的降解室中。 /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201812/uepic/8fab9fd2-0c33-4660-89ee-41c68e895067.jpg" title=" 冷冻电镜.png" alt=" 冷冻电镜.png" / /p p style=" text-indent: 2em " 美国斯克里普斯研究所(The Scripps Research Institute)的研究人员使用冷冻电镜技术，解析了这一“机械手”与需要降解的蛋白相结合时的结构。这项研究揭示了这一“机械手”的6个亚基如何利用ATP水解的能量，改变自身构象，将需要降解的蛋白装入蛋白酶体的过程。 /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201812/uepic/6c510877-c48f-4cb9-a059-6e0d883903da.jpg" title=" 冷冻电镜 FEI Titan Kiros 300kV .jpg" alt=" 冷冻电镜 FEI Titan Kiros 300kV .jpg" / /p p style=" text-align: center " span style=" color: rgb(127, 127, 127) " FEI& nbsp Titan& nbsp Kiros& nbsp 300kV& nbsp 冷冻电镜（示例图） /span /p

简单生物体的细胞，如细菌，以及人类细胞，都被一层膜包围着，它可以完成各种任务，包括保护细胞免受压力。在一个联合项目中，来自美因茨约翰内斯古腾堡大学 (JGU)、德国于利希研究中心（Forschungszentrum Jülich） 和海因里希海涅大学杜塞尔多夫 (HHU) 的研究人员在细菌中发现的一种膜蛋白与一组负责重塑和重建人体细胞膜。根据研究人员的说法，这两个蛋白质组之间没有联系之前是已知的。然而，此次研究过程中，通过冷冻电子显微镜，发现细菌和人类的膜蛋白惊人地相似。细菌应激反应大约 30 年前，噬菌体休克蛋白 (Psp) 系统在细菌中被发现。“今天，我们知道 Psp 系统会响应多种类型的膜应力而被激活。然而，一些分子细节仍然令人费解，” 美因茨约翰内斯古腾堡大学膜蛋白组负责人德克施耐德（Dirk Schneider） 教授解释说。 “这就是为什么我们决定仔细研究 Psp 系统的核心蛋白。”施耐德及其同事最近发现了 Psp 代表 IM30 如何在细胞膜上形成保护性地毯状结构以应对膜应力。在他们的最新工作中，他们仔细研究了噬菌体休克蛋白 A (PspA)，它在 Psp 系统中起着关键作用。 人类 酵母 细菌不同膜蛋白之间的结构相似性 [Benedikt Junglas、Dirk Schneider、Carsten Sachse]冷冻电子显微镜显示 PspA 形成长的螺旋形管，可以将生物膜包裹在内腔中。高分辨率图像首次显示了 PspA 如何局部溶解单个膜，然后将它们重塑为更大的单元，甚至介导新膜结构的形成。PspA 的原子低温电子显微结构：细长的分子是螺旋纳米棒的基本构建块（左）。灰度低温电子显微照片和示意图模型显示了掺入脂质的 PspA 管。“数千个 PspA 构建块可以组装成大型螺旋结构。因此，它们是我们冷冻电子显微结构分析的理想研究对象，”来自 Forschungszentrum Jülich 和 HHU Düsseldorf 的 Carsten Sachse 教授说。“在显微镜下，我们意识到 PspA 具有类似于 ESCRT-III 蛋白质的结构，我们的实验室已经在研究它，”他补充道。“这完全出人意料，表明阐明蛋白质结构是多么重要细节......数十亿年后，这两组蛋白质在遗传上已经发生了分歧，以至于只能根据它们的结构来检测它们的相似性。”“基于 PspA 和真核 ESCRT-III 蛋白的相似结构和功能特性，我们已将 PspA 鉴定为进化上保守的 ESCRT-III 膜重塑蛋白超家族的细菌成员，”作者在 Cell 中写道。研究发表在Cell 《细胞》上。符斌 供稿

Toxic, hot, and spicy: Nanodiscs improve membrane protein resolution in cryo-EM(作者：Cube Biotech)Nanodisc结合冷冻电镜应用时 ，Nanodisc提升了通过冷冻电镜对膜蛋白的解析率，同时揭示了功能性磷脂所扮演的重要角色。The last few years have seen a tremendous increase in high-resolution protein structures solved by cryo electron microscopy (cryo-EM). Novel electron detecting cameras and sophisticated analysis software have expanded the capacity of cryo-EM to smaller and asymmetric proteins (1). As a true competitor to X-ray crystallography, cryo-EM is particularly interesting for hard-to-crystallize targets such as membrane proteins.在过去的几年里，使用冷冻电子显微镜（冷冻电镜）对蛋白结构高分辨率结构解析的应用有着很大地增长。新型的电子探测相机和复杂的分析软件使冷冻电镜的应用延伸到更小和不对称的蛋白结构解析（1）。作为X射线晶体法的真正强势的替代方法，冷冻电镜能把如膜蛋白等难以结晶的蛋白作为应用目标，并引起了各界广泛的兴趣。The importance of sample preparation methods for high-resolution cryo-EM data cannot be underestimated. Two recent Nature publications have shown that nanodiscs are not only excellent tools for membrane protein stabilization, but that they can also improve resolution, in particular of the transmembrane region, and enable analysis of interacting phospholipids.在应用的过程中，样品制备方法对得到高分辨率冷冻电镜数据的重要性是不可低估的。从最近的两篇发表到Nature的文章来看，Nanodisc不仅是膜蛋白稳定的优良工具，而且它也可以提高在电镜解析的分辨率，特别是膜蛋白的跨膜部分，同时能实现磷脂相互作用的分析。Toxic: Near-atomic detail of a bacterial Tc toxin membrane insertion (2). Stefan Raunser' s team at the Max-Planck Institute in Dortmund, Germany unveiled the mechanism used by bacterial Tc toxin as it enters the cell. Besides the high medical relevance of this project - Tc toxins include anthrax, plague, and scarlet-like fever toxins - the conformational changes these toxins undergo are simply fascinating. Secreted by bacteria as soluble proteins, toxins fold into channels that perforate the host membrane by a putative entropic spring mechanism. In previous attempts with detergent-solubilized protein, it was not possible to resolve the transmembrane region of the toxin. Now, using nanodisc-stabilized TcdA1 protein, researchers were able to achieve an overall resolution of 3.5 Angstrom, allowing them to describe this mechanically enforced membrane insertion mechanism for the first time.Toxic: Near-atomic detail of a bacterial Tc toxin membrane insertion (2)。德国马克斯普朗克研究所的Stefan Raunser团队阐述了细菌Tc毒素进入细胞的机制。除了这个项目的高度医学相关性价值外( Tc毒素包括炭疽，鼠疫，猩红热样毒素)这些毒素所经历的构象变化是有极大吸引力的。由细菌分泌的可溶性蛋白，毒素折叠成通道穿过宿主细胞膜。以前尝试使用去污剂溶解带跨膜区域蛋白进行分析，并不能很好地解析带跨膜区域的毒素。而现在使用Nanodisc稳定TcdA1蛋白，研究人员能够获得到3.5埃的解析度，这让他们有机会首先发现并描述了这种机械的强制膜插入的机制。阅读更多Nature原文Hot & spicy: Functional lipids enable detection of heat and hot spices (3). Yifan Cheng' s team at UCSF analyzed the tetrameric transient receptor potential vanilloid 1 (TRPV1) ion channel at 2.9 Angstrom resolution. TRPV1 reacts to many physical and chemical stimuli, including heat and capsaicin, an ingredient of chilli peppers. Nanodiscs were crucial to obtain a high resolution structure, as previous attempts with amphipol-stabilized complexes had only yielded a 3.8 A resolution.But nanodiscs played another important role in this analysis: By providing a phospholipid bilayer,they enabled the discovery of lipids with a structural function in ligand binding. Similar to the results of the Dortmund group, the transmembrane regions were those with the highest resolution, stressing the value of nanodiscs for cryo-EM analysis.Hot & spicy: Functional lipids enable detection of heat and hot spices (3).加州大学旧金山分校的程亦凡团队分析了瞬态电压感受器阳离子通道1(TRPV1一种在疼痛和热知觉中起中心作用的蛋白质）在2.9埃分辨率离子通道结构。TRPV1对许多物理和化学刺激，包括热、辣椒素(一种辣椒的成分)都有反应。Nanodisc是此研究中获得高分辨率的结构十分重要的因素，而以前的尝试使用双极性稳定复合物只得到了3.8个埃的分辨率。在这一研究中，Nanodisc还扮演了另一个非常重要的角色：通过提供一个磷脂双分子层，研究人员得以发现磷脂具有配基结合的结构功能。类似于Stefan Raunser团队的结果，跨膜区具有最高的分辨率，大大提升了Nanodisc在结合冷冻电镜分析膜蛋白应用中的价值。阅读更多Nature原文参考文献：1.Kühlbrandt, W. Cryo-EM enters a new era. eLIFE (2014) doi:10.7554/eLife.036782. Gatsogiannis, C. et al. Membrane insertion of aTc toxin in near-atomic detail. Nature structural and molecular biology (2016),23,884-890. doi:10.1038/nsmb.32813.Gao, Y. et al. TRPV1 structures in nanodiscs reveal mechanisms of ligand and lipid action. Nature (2016) 534(7607):347-351. doi:10.1038/nature17964

概念蛋白质芯片技术是在ＤＮＡ芯片技术基础上发展的一项蛋白质组学技术。其原理是将大量不同的蛋白质分子（如酶、抗原、抗体、受体、配体、细胞因子等）通过微阵列的形式有序排列在固相载体表面，利用蛋白质与蛋白质或者蛋白质与其他分子之间的特异性结合，获得与之特异性结合的待测蛋白（如血清、血浆、淋巴、间质液、尿液、渗出液、细胞溶解液、分泌液等）的相关信息，便于我们分析未知蛋白的组分、序列，体内表达水平、生物学功能、与其他分子的相互调控关系、药物筛选、药物靶位的选择等。蛋白质芯片技术的出现，为我们提供了一种比传统的凝胶电泳、Western blot和Elisa更为方便和快速研究蛋白质的方法。该方法具有高通量，微型化和快速平行分析等优点，不仅对基础分子生物学的研究产生重要影响，也在临床诊断、疗效分析、药物筛选及新药研发等领域有着广泛应用。特点①蛋白芯片具有高特异性、重复性、准确性。这是由抗原抗体之间、蛋白与配体之间的特异性结合决定的。②蛋白芯片具有高通量和操作自动化的特点，在一次实验中可对上千种目标蛋白同时进行检测，效率极高。③可发现低丰度、小分子量蛋白质，并能测定疏水蛋白质，特别是膜蛋白质。④蛋白芯片具有高灵敏性，只需0.5-5μL样品，或2000个细胞即可检测。蛋白芯片技术在分子生物学及生物化学基础研究中的应用01 在蛋白质水平上检测基因的表达由于基因转录产物mRNA数量并不能准确反映基因的翻译产物蛋白质的质与量，因此在蛋白质水平上检测基因的表达对于了解基因的功能非常重要。蛋白质芯片技术产生前，蛋白质双向电泳技术是蛋白质组规模上进行蛋白质表达研究的唯一方法，但这种技术操作繁琐而且难以快速检测样品中成百上千种蛋白质的表达变化。蛋白质芯片的特异性、灵敏性和高通量等特点，在检测基因表达终产物蛋白质谱的构成及变化中发挥着不可替代的作用。02 高通量筛选抗原/抗体相互作用目前蛋白质芯片检测利用最广泛的生物分子相互作用是抗原抗体的特异性识别和结合，单克隆抗体是蛋白质芯片检测中使用最广泛的生物分子。运用蛋白质芯片可以研究不同抗原/抗体的特异性作用，而且对于检测样品中极微量的抗原/抗体分子作用非常有利。03 蛋白质/蛋白质相互作用分析酵母双杂交系统是近年来基因组规模上研究蛋白质相互作用的主要方法，但存在体内操作、假阳性、假阴性和外源蛋白质折叠、修饰等局限。蛋白质芯片技术不依靠任何生物有机体而在体外直接检测目标蛋白质，实验条件可随意控制，同时实验步骤自动化程度高，一次分析的蛋白质数量巨大，因而成为目前除酵母双杂交系统外进行大规模研究蛋白质相互作用的主要方法。04 酶/底物作用分析耶鲁大学的Snyder小组用蛋白芯片对酵母基因组编码的119种蛋白激酶的底物专一性进行了研究。实验中将蛋白激酶表达为谷胱甘肽转移酶（GST）融合蛋白，针对17种不同的底物，平行测定了119种GST2蛋白激酶融合蛋白的底物专一性，发现了许多新的酶活性，大量蛋白激酶可以对酪氨酸进行磷酸化，而这些激酶在催化区域附近有共同的氨基酸残基。也证明了蛋白质芯片可作为高通量筛选酶-底物作用的良好平台。蛋白芯片的检测目前蛋白芯片的检测主要有两种方式。一种是以质谱技术为基础的直接检测法，采用表面增强激光解析离子化-飞行时间质谱技术，用激光解析电离的方法将保留在芯片上的蛋白质解离出来。具体过程为：芯片经室温干燥后，加能量吸附因子如芥子酸，使其与蛋白质结合成混合晶体，以促进蛋白质在飞行时间质谱检测中的解析和离子化，利用激光脉冲辐射使芯池中的分析物解析成荷电粒子，根据不同质荷比离子在仪器场中的飞行时间长短不一，通过飞行时间质谱来精确地测定出蛋白质的质量，并由此绘制出一张质谱来，以分析蛋白质的分子量和相对含量。另一种为蛋白质标记法，样品中的蛋白质预先用荧光染料或同位素等标记，结合到芯片上的蛋白质就会发出特定的信号，用CCD照相技术及荧光扫描系统等对激发的荧光信号进行检测。与飞行时间质谱相比，该方法定量更加准确，操作也更加简便。与DNA芯片一样，蛋白质芯片同样蕴含着丰富的信息量，必须利用专门的计算机软件进行图像分析、结果定量和解释。其中应用最广的是荧光染料标记法，原理较为简单、使用安全、灵敏度高，且有很好的分辨率。可直接用广州博鹭腾 GelView 6000Plus进行拍摄。图1.GelView 6000Plus智能图像工作站GelView 6000Plus 配备600万像素科学级制冷CCD相机，制冷温度为环境温度下 55℃，极低的暗电流，很大程度降低背景干扰。而且独有的红外感应开关，自动控制样品台的开启与关闭，同时也减少了实验时对仪器的污染。

p 　　 strong 仪器信息网讯 /strong 2020年1月16日，《Science》杂志刊登了美国科学家David Hoffman和Gleb Shtengel在Hess和加州大学伯克利分校高级研究员Eric Betzig的指导下的一项关于融合超分辨率荧光和电子显微镜技术的显微表征新技术成果，该技术称为cryo-SR / EM，结合使用超低温超高分辨率荧光显微镜和聚焦离子束铣削扫描电子显微镜，可以在整个细胞的三个维度上可视化蛋白质-超结构关系。凭借其重要性，该研究也荣登本期《科学》杂志封面。 /p p style=" text-indent: 2em " span style=" color: rgb(112, 48, 160) " Eric Betzig同时也是该文章的通讯作者，Eric Betzig何许人也？他正是2014 年诺贝尔化学奖得主，获奖理由是实现了单分子水平的超高分辨率荧光显微技术。 /span /p p style=" text-align: center" img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 500px height: 159px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202001/uepic/5b338d9a-b6c7-40e6-b266-e27727951cdd.jpg" title=" 0.png" alt=" 0.png" width=" 500" height=" 159" border=" 0" vspace=" 0" / /p p style=" text-align: center" img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202001/uepic/de61b3cc-2d43-4121-bbff-f6911b77bfd0.jpg" title=" 01.png" alt=" 01.png" / /p p 　　封面为哺乳动物小脑颗粒神经元的半透明彩色核，这张3D效果图展示了由电子显微镜(EM)和低温超分辨率荧光显微镜所成像的组蛋白重叠所定义的特异性异染色质亚区类型。围绕细胞核的半透明薄壳代表核膜，而3D渲染的电镜数据(灰色)薄片则穿过细胞核。右下角的圆圈是线粒体的剖视图。 /p p style=" text-align: center" img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202001/noimg/775b649e-a426-4670-8069-b079cce58d46.gif" title=" zooming_into_cell_2~2.gif" alt=" zooming_into_cell_2~2.gif" / /p p 　　 span style=" color: rgb(0, 176, 240) " 一种新的显微镜技术将电子显微镜和光学显微镜相结合，以生成细致的三维细胞图像，如图所示。 span style=" color: rgb(127, 127, 127) " 图片来源：D. Hoffman et al./Science 2020 /span /span /p p 　　有触须的的囊泡在很小的空间内穿梭负责将“货物”进行分类，相邻的神经元通过类似网络的界面相互依附。随着干细胞分化成神经元，DNA在核内重新排列。而一项新的显微镜技术可以将所有这些细节展现得淋漓尽致。 /p p 　　这项技术被称为cryo-SR/EM，它将电子显微镜和超分辨率光学显微镜捕捉到的图像融合在一起，以3D的形式呈现出细胞内部明亮、清晰、详细的图像。 /p p 　　 strong 技术背景 /strong /p p 　　多年来，科学家一直在探索细胞内部的微观世界，开发新的工具来观察这些基本的生命单位。但是每种工具都需要综合权衡。光学显微镜可以通过荧光分子标记特定细胞结构能够轻松识别，随着超分辨(SR)荧光显微镜的发展，可以更加清晰的观察这些结构。但是，在一个给定的时间内，荧光只能揭示细胞中10000多种蛋白质中的一小部分，因此很难理解这几种蛋白质与其他物质之间的关系。另一方面，电子显微镜(EM)可以在高分辨率的图片中显示出所有的细胞结构——但是仅仅通过EM来描述一个特征与其他特征是很困难的，因为细胞内部的空间是如此的拥挤。 /p p 　　霍华德· 休斯医学研究所珍妮莉亚研究园区的高级负责人Harald Hess说，“将这两种技术结合在一起，可以使科学家清楚地了解特定细胞特征如何与其周围环境相关联，这是一种非常强大的方法。” /p p 　　Janelia科学家David Hoffman和高级科学家Gleb Shtengel在Hess和加利福尼亚大学伯克利分校HHMI研究人员Eric Betzig的高级研究员Eric Betzig的带领下率先开展了该项目。 /p p 　　首先，科学家在高压下冷冻细胞。这样可以迅速停止细胞的活动，防止冰晶的形成，而冰晶会破坏细胞并破坏成像的结构。接下来，研究人员将样品置于低温室中，在绝对零度以上10度的温度下，用超分辨率荧光显微镜对样品进行三维成像。然后，它们被移除，嵌入树脂中，并在Hess实验室开发的强大电子显微镜中成像，该显微镜向细胞表面发射一束离子，一点一点地研磨，同时为每一层新暴露的细胞拍照。然后，计算机程序将这些图像拼接成三维重构的图像。 /p p 　　最后，研究人员叠加了两个显微镜的三维图像数据。结果：令人震惊的图像以惊人的清晰度揭示了细胞的内部细节。 /p p 　　下面，此图像的一些示例说明了科学家如何使用该技术。 “已经引起了很多兴趣，” Hess说， “还有很多实验要做——整个世界的细胞都需要研究。” /p p style=" text-align: center" img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202001/uepic/850d6bc4-7e47-419b-8a2f-fb37e009dc71.jpg" title=" 1.png" alt=" 1.png" / /p p 　　 strong 全细胞相关成像 /strong 。高压冷冻细胞的低温超高分辨率荧光显微镜与聚焦离子束扫描电子显微镜(FIB-SEM)结合使用，可以在全局超微结构背景下对蛋白质进行多色三维纳米可视化。 从左上方顺时针方向：体积渲染的细胞，具有线粒体和内质网(ER)蛋白相关的正交排列(插图) 形态各异的溶酶体区室 由转录活性的蛋白质报道分子定义的异染色质亚结构域 与小脑接触处膜粗糙度相关的粘附蛋白颗粒神经元 过氧化物酶体(粉红色)与ER薄片(红色)和线粒体(青色)并置。 /p script src=" https://p.bokecc.com/player?vid=1AD2E183304AD28E9C33DC5901307461& siteid=D9180EE599D5BD46& autoStart=false& width=600& height=490& playerid=5B1BAFA93D12E3DE& playertype=2" type=" text/javascript" /script p 　　在细胞开始(成年)之前(左)和之后(右)，神经元的细胞核看起来截然不同。随着细胞的成熟，DNA被重新包装在细胞核内以开启新的一组基因。这些变化反映在两个细胞内部的灰色斑点和彩色荧光的不同模式中。 “这项技术为分化前后的细胞核状态提供了惊人的详细快照，”参与该项目的圣犹达儿童研究医院的David Solecki表示。 span style=" color: rgb(127, 127, 127) " 图片来源：D. Hoffman et al./Science 2020 /span /p script src=" https://p.bokecc.com/player?vid=7CADAA470388AB6D9C33DC5901307461& siteid=D9180EE599D5BD46& autoStart=false& width=600& height=490& playerid=5B1BAFA93D12E3DE& playertype=2" type=" text/javascript" /script p 　　发育中的神经元粘在一起。这段视频准确地展示了这些细胞是如何相互粘附的，揭示了类似瑞士奶酪一样的联系，帮助年轻的神经元正确地迁移到它们在神经系统中的最终目的地。黏附蛋白的紫色和绿色超分辨荧光图像与电子显微镜下详细显示膜结构的图像相互关联。资料来源: D. Hoffman et al./Science 2020 /p script src=" https://p.bokecc.com/player?vid=09DED3BA4931A08E9C33DC5901307461& siteid=D9180EE599D5BD46& autoStart=false& width=600& height=490& playerid=5B1BAFA93D12E3DE& playertype=2" type=" text/javascript" /script p 　　细胞内充满了小囊泡——这是一种膜囊，帮助细胞储存蛋白质、分解细胞垃圾和运输货物。仅在电子显微镜下，这些不同种类的囊泡是无法区分的。但通过cryo-SR / EM，它们的明显特征变得清晰起来。这段视频放大了核内体，核内体负责将货物运送到细胞内的不同区域。 span style=" color: rgb(127, 127, 127) " 资料来源: D. Hoffman et al./Science 2020 /span /p p br/ /p

p style=" text-indent: 2em " strong style=" text-indent: 2em " 仪器信息网讯 /strong span style=" text-indent: 2em " & nbsp 2020年2月15日，美国卫生总署(NIH)与美国得克萨斯大学奥斯汀分校Jason S. McLellan研究组合作在预印本平台bioRxiv上发表论文：Cryo-EM Structure of the 2019-nCoV Spike in the Prefusion Conformation（ span style=" text-indent: 2em color: rgb(127, 127, 127) " DOI: 10.1101/2020.02.11.944462 /span ），报道了新冠病毒（2019-nCoV）S蛋白的首个冷冻电镜结构，利用冷冻电镜技术分析了新型冠状病毒表面S蛋白的近原子结构。 /span /p p style=" text-align: center" img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 600px height: 206px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202002/uepic/29be9fbf-7286-475f-807a-ea01b409b72a.jpg" title=" 1.png" alt=" 1.png" width=" 600" height=" 206" border=" 0" vspace=" 0" / /p p style=" text-indent: 2em " span style=" color: rgb(127, 127, 127) " （注：预印本网站bioRxiv的所有论文未经同行评议， bioRxiv在所有2019-nCoV相关论文页面增加了突出字体说明（上图黄底黑字）：“bioRxiv收到了许多关于2019年ncov冠状病毒的新论文。提醒一下:这些是没有经过同行评审的初步报告。他们不应被视为结论性的，指导临床实践/健康相关的行为，或在新闻媒体中作为既定信息进行报道。”） /span /p p style=" text-indent: 2em " 作者通过生物物理以及结构方面的证据发现，新冠病毒的S蛋白结合人体ACE2（宿主细胞受体血管紧张素转化酶2）的亲和力要远高于SARS-CoV的S蛋白，或解释了新型冠状病毒传染性很强的主要原因。 /p p style=" text-align: center" img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 450px height: 322px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202002/uepic/4ad16a73-5442-4584-899c-bca9a93d4e04.jpg" title=" 2.png" alt=" 2.png" width=" 450" height=" 322" border=" 0" vspace=" 0" / /p p style=" text-align: center " span style=" color: rgb(0, 176, 240) text-align: center text-indent: 0em " & nbsp 预融合构象 /span span style=" color: rgb(0, 176, 240) text-align: center text-indent: 0em " 中的2019-nCoV S结构 /span /p p style=" text-indent: 2em " 新型冠状病毒（2019-nCov）的爆发代表了一种流行病威胁，已宣布为国际关注的突发公共卫生事件。CoV突刺（S）糖蛋白是疫苗、治疗性抗体和诊断方法的关键靶标。此前的大量研究均基于2019-nCoV突刺蛋白的预测结构或相关病毒（如SARS）的突刺蛋白的已知结构展开。为促进医学对策（MCM）的开发，论文中确定了预融合构象中的2019-nCoV S蛋白三聚体冷冻电镜结构，为3.5埃分辨率。三聚体的主要状态为三个受体结合结构域（RBD）之一向上旋转为受体可及构象。同时，生物物理和结构证据表明， 2019-nCoV S以比SARS-CoV S更高的亲和力结合ACE2（宿主细胞受体血管紧张素转化酶2）。此外，作者测试了几种已发布的SARS-CoV RBD特异性单克隆抗体，发现它们与nCoV-2019没有明显的结合。这表明两种病毒RBD之间的抗体交叉反应性可能受到限制。 /p p style=" text-align: center" img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 450px height: 200px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202002/uepic/96b62197-7abe-467b-b461-e70a6a2a6f3f.jpg" title=" 3.png" alt=" 3.png" width=" 450" height=" 200" border=" 0" vspace=" 0" / /p p style=" text-align: center " span style=" color: rgb(0, 176, 240) text-align: center text-indent: 0em " 2019-nCoV S.和SARS /span span style=" color: rgb(0, 176, 240) text-align: center text-indent: 0em " -CoV S.之间的结构比较（A） /span /p p style=" text-indent: 2em " span style=" text-align: center text-indent: 0em color: rgb(0, 0, 0) " 新型冠状病毒利用高度糖基化的同源三聚体S蛋白进入宿主细胞。S蛋白经历结构变化将病毒融合进入宿主细胞的细胞膜。此过程包括病毒的S1亚基结合到宿主细胞受体上，引发三聚体不稳定性的发生，进而造成S1亚基脱落S2亚基形成高度稳定的融合后结构。 /span /p p style=" text-indent: 2em " 通过该结构分析，作者发现S1亚基中的RBD经历铰链类似运动，此移动特点与SARS-CoV以及MERS-CoV均非常相似，但新型管冠状病毒中则RBD结构则更靠近三聚体的中央部位，其S蛋白中3个RBP中的1个会向上螺旋突出从而让S蛋白形成能够轻易与宿主受体ACE2结合的空间构象。这也说明，新型冠状病毒引发病毒的机制虽然与其他的冠状病毒科的病毒机制异曲同工，但传染性更强。 /p p style=" text-indent: 2em " 论文受到业界的广泛关注，研究中，John Ludes-Meyers博士对细胞转染给予很大帮助，德克萨斯大学奥斯汀分校Sauer结构生物学实验室的Aguang Dai博士在显微镜对准方面做了大量工作。 /p p style=" text-indent: 2em " 论文链接： a href=" https://www.instrument.com.cn/download/shtml/932743.shtml" target=" _self" style=" color: rgb(127, 127, 127) text-decoration: underline " span style=" color: rgb(127, 127, 127) " https://www.instrument.com.cn/download/shtml/932743.shtml /span /a /p

9月11日，美国化学会杂志JACS 在线发表了中国科学院生物物理研究所王江云研究组的最新研究成果&mdash &mdash 《基因编码非天然氨基酸作为光致电子转移探针扩展荧光蛋白的传感性质》。该研究利用基因密码子扩展技术，实现了在活细胞中编码一系列卤代酪氨酸(3-氯代酪氨酸(ClY)、3,5-二氯代酪氨酸(Cl2Y)、3,5-二氟代酪氨酸(F2Y)、2,3,5-三氟代酪氨酸(F3Y)、2,3,5,6-四氟代酪氨酸(F4Y))，在荧光蛋白中实现了大分子中的光致电子转移现象，基于光致电子转移原理发展了对pH及Mn(III)敏感的荧光传感器。 　　基因编码和荧光蛋白传感器是生物学研究中的重要技术手段。在过去的几十年中，人们已经开发出多种荧光蛋白传感器，用于监测金属离子，pH值，第二信使和翻译后修饰，这对于解析它们在体内信号转导网络中的作用是至关重要的。这些荧光蛋白传感器通常依赖于荧光共振能量转移或者绿色荧光蛋白GFP荧光团酚基的质子化/去质子化来发挥作用。尽管它们现在已被广泛应用，但是在分析物结合前后，这些荧光蛋白传感器的荧光强度变化通常都在两倍以内。相比之下，光致电子转移(photo-induced electron transfer，简称PET)机制开始越来越广泛地被引用到荧光传感器设计中来，最重要的原因在于分析物结合前后，荧光蛋白传感器可以展现出显著的荧光强度变化(通常可以增强10至100倍)。PET同时也是光合作用中的主要反应，PET过程广泛存在于生物系统中，如细胞色素c氧化酶、核苷酸还原酶、DNA光解酶等，其对磁感应等生物过程也具有非常重要的意义。 　　该研究将一系列卤族元素取代的酪氨酸通过基因密码子扩展的手段定点插入到荧光蛋白(iLov2)中，发现在非天然氨基酸与荧光蛋白发光中心FMN之间的发生了快速的光致电子转移，并测量到电子转移发生在0.2 纳秒。通过荧光检测科研人员得到了一系列对pH具有不同响应能力的荧光蛋白突变体，利用该传感器他们检测了细胞质的酸化过程，该传感器将适用于研究活细胞中的pH值变化过程。同时科研人员首次得到了可以基因编码的对Mn(III)敏感的荧光蛋白，这将有利于检测与生物和环境相关的Mn(III)的浓度，为筛选高效的锰过氧化物酶提供了平台，为实现高效的木质素降解及生物质转化提供了研究工具。该研究为蛋白动态构象变化研究提供了新的研究手段，为利用合成生物学手段生产可再生能源提供了新的研究思路，为蛋白设计提供了新的工具。 　　该研究得到科技部国家重点基础研究&ldquo 973&rdquo 计划、国家自然科学基金委员会的资助。 　　 图示：基因编码非天然氨基酸作为光致电子转移探针扩展荧光蛋白的传感性质

胞内细胞器实时发生快速的结构和分布变化，这些改变受到细胞内部环境的调控，反过来作为调控手段去影响细胞内环境，进而执行复杂的细胞功能。细胞器分布的调节对细胞健康至关重要。细胞器通过motor和adaptor蛋白沿着微管双向移动，进而建立和维持其适当的分布和功能【1】。微管通过可逆的翻译后修饰（包括乙酰化、去酪氨酸化和谷氨酰化）获得调节特异性，这些修饰共同构成了微管蛋白密码（tubulin code）的关键元素【2】。研究表明，tubulin code参与微管cargo选择以及细胞器定向运动【2】，但细胞如何破译这些tubulin code以选择性地调节细胞器定位尚不清楚。内质网（Endoplasmic reticulum, ER）是一个由不同形态组成的相互连接的网络，在整个细胞质中混杂延伸，与其他细胞器形成丰富的接触。内质网形态失调与神经系统疾病和癌症密切相关。2021年12月15日，来自美国国立卫生研究院的Craig Blackstone团队在Nature杂志上在线发表了题为ER proteins decipher the tubulin code to regulate organelle distribution的研究论文，阐释了内质网蛋白调控细胞器分布的具体机制。研究人员证明了三种膜结合的内质网蛋白优先与不同的微管群体相互作用：CLIMP63结合中心体微管，KTN1结合核周多聚谷氨酰化微管，p180结合单谷氨酰化微管。这些内质网蛋白质的敲除或微管群的操纵和谷氨酰化状态改变均会导致内质网定位的显著变化，进而引起其他细胞器在胞内的重新分布。大多数关于ER shaping和细胞器接触的研究都集中在外周管状ER，而更致密的核周ER是如何形成和不对称分布的目前还不清楚。三种ER膜结合蛋白— CLIMP63，p180和KTN1—主要定位于核周ER，被认为是内质网片状形成（sheet-forming）蛋白【3】。作者首先探究了这三个蛋白在调控内质网形态和分布中的功能。如图1所示，在CLIMP63和KTN1单敲除细胞的外周ER中的致密基质或片状结构数量增加，该现象定义为“分散（dispersed）”表型；而p180敲除细胞中的ER则表现出一种相反的“聚集（clustered）”表型——其外周网络保持管状，但核周 ER 在核的一侧不对称地塌陷成较小的区域；CLIMP63-KTN1双敲导致更明显的“dispersed”ER，而CLIMP63-p180双敲细胞中的ER与野生型中的类似；值得注意的是，p180-KTN1双敲造成比p180单敲更多的ER聚集；在CLIMP63-p180-KTN1三敲的细胞中，高密度的ER基质或片状结构在核周区域富集。为了更好地定量评估ER形态和分布的变化，作者开创了互补算法（complementary algorithms），利用基于概率密度估计的统计方法来分析荧光标记的ER和其他细胞器的空间分布，使用实验得出的空间概率质量函数来量化图像上的荧光变化，以计算细胞器的径向分布和细胞不对称程度。数据显示，CLIMP63 和 KTN1 单敲除或双敲除增加了 ER 平均分布半径 （Mean distribution radius, MDR），说明ER 的外周分布更广；相反，p180敲除或p180-KTN1双敲增加了ER不对称性。其中微管MDR和不对称性仅略有变化。图1. CLIMP63、p180 和 KTN1 差异性调节 ER 形态及分布随后，作者通过co-sedimentation实验评估了多种ER蛋白与微管的结合能力。与预期的结果一致，CLIMP63、p180和KTN1均可以结合大量微管。作者发现，只有能够进行微管结合的野生型蛋白质或突变体才能恢复相应敲除细胞系中的ER形态。例如，CLIMP63错义突变体R7A，K10A和R70A不能结合微管或抑制CLIMP63敲除细胞中的ER分布缺陷，而结合微管的CLIMP63（H69A）可以拯救表型；对于KTN1，只有结合微管的缺失突变体可以抑制异常的ER表型；缺乏kinesin-1结合结构域的p180s仍然可以抑制p180-敲除细胞中的ER聚集表型。这些数据表明CLIMP63-、p180-和KTN1-敲除细胞中ER形态的改变可能都与微管结合改变相关。因此，作者推测这些蛋白质可以结合不同的微管群体，并采用邻近连接测定（proximity ligation assay, PLA）来可视化它们在细胞中的微管结合情况。作者使用centrinone B耗尽中心体微管，并通过敲除AKAP450去除高尔基源性微管。结果显示CLIMP63-microtubule association对中心体耗竭敏感，但高尔基体微管耗竭不敏感；KTN1-microtubule association对两者都敏感；p180-microtubule association对中心体或高尔基微管的消耗都不敏感。进一步分析证明，CLIMP63优先结合中心体微管，KTN1优先结合来自中心体或高尔基体的核周微管，p180优先结合更多的外周微管。为了获得调节特异性，微管经历可逆的翻译后修饰，包括乙酰化、去酪氨酸化和谷氨酰化【2】。虽然 CLIMP63、p180 或 KTN1 敲除不影响这些修饰的总体水平，但微管蛋白多聚谷氨酰化在中心体或高尔基体微管耗尽的细胞中降低。因此，作者纯化了含有微管结合域的p180、KTN1和CLIMP63片段，并在体外探究它们与谷氨酰化微管的结合。与KTN1相比，p180与单谷氨酰化微管表现出更高的体外结合，而p180和KTN1与多聚谷氨酰化微管结合能力相似。同时，KTN1更倾向于结合具有多聚谷氨酸链的微管，而不是具有多位点单谷氨酸链的微管。与p180和KTN1相反，CLIMP63对微管谷氨酰化的反应较差，不同的微管蛋白修饰或相互作用可能介导了CLIMP63与中心体微管的优先结合。总的来说，如图2所示，CLIMP63，p180和KTN1分别优先结合中心体、多聚谷氨酰化和谷氨酰化微管，进而协同调节ER分布。图2. CLIMP63结合中心体微管，KTN1结合多聚谷氨酰化微管，p180结合谷氨酰化微管。接下来，作者对其他细胞器的分布进行了分析。通过同时对六个细胞器的活体成像显示，大多数细胞器的分布与ER相似，提示 ER 可能广泛调节细胞器分布。值得注意的是，在CLIP63-，p180-和KTN1-敲除细胞中，所有细胞器都表现出与ER相似的分布变化：在CLIMP63-或KTN1-敲除细胞中更分散，在p180-敲除细胞中更不对称。此外，分散ER的CCP1过表达也增加了野生型细胞中溶酶体，线粒体和过氧化物酶体的MDR。最后，作者探究了在自噬过程中ER和溶酶体的迁移活动。核周溶酶体聚集是早期自噬的标志性事件，对于适当的自噬通量很重要【4-5】。与溶酶体类似，ER 在早期自噬期间迁移至核周，随后重新分布到外周。CLIMP63蛋白水平在早期自噬期间显着增加，CLIMP63敲除可以阻止ER向核周区域移动，并抑制自噬体-溶酶体融合和自噬降解，但并不影响溶酶体活性。p180和KTN1蛋白水平在早期自噬期间保持不变，KTN1-microtubule association不变，但p180-microtubule association增加，进而重新分布ER和溶酶体。p180-敲除细胞中的ER和溶酶体始终留在核周。作者还阐释了p180与微管结合的生理学意义，如图3所示，p180L的核糖体结合区（主要的异构体）包含41个带正电荷的十肽重复，该区域在正常细胞条件下（Normal）被核糖体占据，但在饥饿条件下（Starved），与核糖体发生解离，暴露出这些带正电的区域，随后结合微管。图3. (e) p180结构域组成；(f) p180在正常和饥饿条件下与微管结合。总的来说，该研究证明了CLIP63，p180和KTN1优先结合微管的不同子集以维持核周ER的特征性分布，从而解释了它们缺失的差异效应。微管在细胞器分布中起着关键作用，它们选择性分配细胞器的能力依赖于“tubulin code”。该研究表明：（1）ER分布是通过特定的膜结合蛋白介导的，与不同水平和类型的微管谷氨酰化有差异结合，广泛影响大多数其他细胞器的分布；（2）细胞不是通过赋予每个细胞器自己的感知和响应机制，而是通过将ER作为一线传感器和响应器来实现组织效率。作者认为可能还有其他ER蛋白也可以破译tubulin code，对ER在健康和疾病中的功能具有重要意义。原文链接:https://doi.org/10.1038/s41586-021-04204-9制版人：十一

培安公司 1. 三聚氰胺-中国食品安全评估体系综合缺陷的爆发点 中国食品安全最近几年出现的一个最大的事故，全世界范围内都引起轰动，就是三鹿公司的三聚氰胺事件。回溯起因，三聚氰胺问题在中国至少存在了10年以上，从奶农开始到各地的收购站，再到中国政府部门以及所有的乳制品公司都逃不了干系。 三聚氰胺（Melamine）（化学式：C3H6N6），俗称密胺、蛋白精，是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，被用作化工原料，可用于塑料及涂料工业，也可作纺织物防摺、防缩处理剂，对身体有害，不可用于食品加工或食品添加物。 一种主要用于工业，并且具有毒性的物资为何会出现在奶粉食品中呢？因它的性状是白色无臭无味粉末，与蛋白粉极为相似，且又价格低廉、易于生产购买。不法商贩为了追求更大利益，将三聚氰胺改名&ldquo 蛋白精&rdquo ，误导奶农向饲料和原料奶中添加。缺乏科学知识的奶农，并不懂得此事的后果，为了奶好卖而添加。多年来，由于三聚氰胺对成人肾脏的伤害没有明显广泛的临床症状，使之在乳品行业潜伏，成为一个乳品和饲料企业公开的行业秘密，一直得不到政府部门和厂家的重视。直到大规模的爆发婴幼儿肾结石病例，才东窗事发。此事产生的负面影响是恶劣且巨大的，造成的后果是人民付出巨大的健康代价，企业信用遭质疑，国家声誉损失惨重。一味把责任推给农民道德水准低的想法是非常片面的，而作为化学材料的三聚氰胺，一直都在各领域内使用。如何从根本上防止此类现象在中国再次发生，如何在复杂的各种因素相互影响的宏观系统内，找到造成严重后果的关键控制因素，是我们企业、学术、科技届和政府都必须要思考的一个课题。 追究出现三聚氰胺现象的原因，既是经济问题，更是体系问题。一方面，在于企业为了追求利益，散失了最起码的诚信和社会责任感；更重要的是，于中国食品安全质量控制体系中，相关法规存在三大直接先天性的重大缺陷： 1、中国牛奶里蛋白质含量标准脱离中国实际情况，一味迎合国外标准，规定得太高，高到比中国平均真正牛奶里蛋白质水平还高。这是因为，中国土地经过五千年的耕种养分缺失，导致草地营养含量和奶牛品质下降。与中国不同的是，美国和西方牛奶本身蛋白质含量就足够，企业不需要额外添加蛋白质来迎合标准。 2、蛋白质检测方法和相关法规存在缺陷，传统蛋白质检测方法是凯式定氮法，这种方法检测蛋白质是间接法，先测总氮含量，根据总氮含量再计算出蛋白质含量，而非直接测定蛋白含量。在奶源紧张遭抢购、原料奶粉暴涨近一倍的情况下，一些不法厂商就利用这个检测漏洞，加入高含氮量的三聚氰胺，骗过凯氏定氮法获得虚假的蛋白质含量，造成蛋白质检测值虚高，来蒙混过关。只要三聚氰胺含量添加到限量范围内，既不违背国家技术标准，又能节约成本。 3、牛奶生产涉及环节和监管机构复杂繁多，生产奶粉涉及奶牛饲养、中间商收购、乳品厂加工、中间商批发、终端商销售等环节，由农业、卫生、工商、质检等多个部门监管，这导致任何一个部门都无法对整个生产、销售链条全程监督。直到2009年3月，三聚氰胺事件爆发近半年后，国务院成立食品安全委员会，由卫生行政部门承担食品安全综合协调职责。 对中国来说，一切犯错误的理由都具备的时候，就出现了三聚氰胺事件。三聚氰胺是中国食品安全评估体系的综合缺陷的爆发点。问题是，为什么西方用凯式定氮法检测蛋白质多年也没有出问题，而在中国就出现了非常严重的安全事故？当然，我们会认为中国的企业家，如蒙牛的牛根生等，在早期市场经济环境下，往往通过恶劣竞争胜出，道德素质普遍偏低，思想上不能马上转型，与他们所应承担的社会责任不相匹配。加之奶农的科学知识水平低下，相关政府职能部门的缺失这些因素综合起来导致了这场恶劣事件的发生。而由于西方健全的商业法制系统和个人的法律意识，企业不敢冒这个风险添加三聚氰胺。 蛋白质检测方法的缺陷导致了致命的造假。在三鹿事件后经过反思，2008年9月14日起，检测项目中增加了三聚氰胺，成为乳制品必检项目。这种利用排他法来确保蛋白质含量的措施，虽然堵住了三聚氰胺添加到牛奶中的渠道，却并不能保证其他含氮量高的添加剂被加入。无疑不能解决根本问题。因为我们目的是为了检测蛋白质，而不是为了测三聚氰胺。这是一种舍本逐末的无奈之举，如果有未为列入检测范围的高含氮量添加剂出现，依然能骗过凯氏定氮法。 必须指出，从中央层面国家来看，非常重视食品安全，每次事故后都进行搞运动式的大量投资，而食品安全体系不完善的客观原因造成收效甚微，造成这些投资大量浪费，很多地方上连耗材都用不起。反问我们的专家系统，有没有责任帮国家和社会找到并建立更有效管理宏观经济的方法和勇气？ 我们认为，许多事故原因的专家分析都拘泥表层现象，用行政政策取代科学和法制精神，结果治标不治本。目前，中国食品安全体系已经到了一个关键时刻，一个需要反省传统方法和思路，并从思想上转变的创新时刻。食品安全评估应该从宏观控制系统中找到关键控制因素，利用巧实力进行安全质量管理。改变食品安全风险管理思路已经到了一个刻不容缓的时刻，我们必须思考如何建立具有中国特色的食品安全体系，如何建立更开放的专家体系，如何引进更深刻的全新思想概念。否则，中国的食品安全质量体系就会形成安全事故越多，投资越大，成本越高，成效越微这样的劳民伤财的恶性循环。 2. 非蛋白氮&mdash 传统蛋白质表征方法的本质缺陷 检测蛋白质含量的传统和现行标准方法依然是凯式定氮法和杜马斯燃烧定氮法，即还原无机氮或单质氮，用还原后无机氮或单质氮元素含量表征氨基酸，并反推蛋白质含量。在没有人往被测物里人为添加三聚氰胺等无机氮的前提下，传统方法是可行的。但是，如果有人就把无机氮加到系统中去，干扰反推法检测蛋白质的含量，因为含氮量的提高有助于蛋白质含量反推结果的提高，会导致蛋白质含量的虚高。 1.凯氏定氮仪：这种方法是Mr. Johan Kjeldahl在1883年发明的。凯氏定氮法，即采用化学方法，样品消解后含氮化合物转化成氨气，被吸收后经滴定后，测定出总氮元素含量，后经换算转化成蛋白质含量，由于不同的氨基酸序列，凯氏定氮法需要许多不同的校正因子。并且需要使用浓硫酸和较长时间的加热。所以造成了凯氏定氮法只能粗略的测量总蛋白质含量。更致命的缺陷是，测总氮指标后再换算成蛋白指标，造成非蛋白氮会干扰测定的漏洞和机会。 2.杜马斯燃烧定氮法：样品经完全燃烧后转变为氮气，后经测定出的总氮含量后转化为蛋白质含量，步骤是：燃烧&rarr 还原&rarr 净化&rarr 检测，问题依然在于只测总氮指标后再换算成蛋白指标，非蛋白氮会干扰测定，造成蛋白含量值虚高。 无机氮或单质氮在蛋白质里面是不存在的。只有把他烧完以后，有机物质经氧化还原后才会出现无机氮或单质氮。检测蛋白质这些传统方法如凯氏定氮、杜马斯定氮、都是需将蛋白质里面的有机氮经过还原转化为无机氮或单质氮元素来定量，造成不法商贩只要把无机氮或单质氮加进去以次充好，反正用反推法算出来就变成蛋白质含量了。都是以无机氮或单质氮含量来反推蛋白质含量，并不能分辨氮的来源。 无机氮或单质氮&ne 蛋白质 蛋白质中含有氮，不等价于测出的氮都是蛋白质中的氮。所以，用无机氮或单质氮来表征蛋白质含量是有问题的。只要无机氮或单质氮反推法依然是现行的蛋白质测试标准，就会形成一个开放性的动态的系统，利用反推原理，在这个动态系统中，在利益驱使下，不断有人往里面加各种含氮化合物，提高总氮含量，没完没了，防不胜防。 传统蛋白质测定一直采用凯氏定氮法。该法通过氧化还原反应，氧化低价氮为氨盐，通过标定氨盐中总氮元素的量进而换算成蛋白质的含量。凯氏定氮主要针对有机氮化合物，包括蛋白质、游离氨基酸、核酸、尿素等N3-化合物。检测过程中非蛋白氮同样被消化成氨盐，不能反应真实的蛋白质含量，使检测结果虚高，造成严重的国家食品安全的信用危机。只有真正基于蛋白质结构的真蛋白检测方法才能这个解决问题，才能从源头上杜绝再次出现三聚氰胺或其他非蛋白氮事件。寻找一个真蛋白的测定方法迫在眉睫。 3. 蛋白质的组成结构 事实上，蛋白质的基本组成结构是多肽，而多肽的基本组成是氨基酸分子，当然组成氨基酸的主要元素为碳、氢、氧、氮等元素。所以，从根本上说，蛋白质是由氨基酸组成，不是由无机氮或单质氮组成，无机氮或单质氮在蛋白质里面是不存在的。 蛋白质的组成是由氨基酸通过肽键连接而成的长链。组成蛋白质的常见氨基酸有20种。组成蛋白质的主要元素：C、H、O、N、S。蛋白质的含氮量约为16%。凯氏定氮和杜马斯燃烧法都是基于蛋白质的含氮量来计算的。目前，实践经验已经证明了这个方法的缺陷，并让我们付出了惨痛的代价。 20种常见的氨基酸 天冬氨酸 Asparagine 丙氨酸 Alanine 精氨酸 Arginine 天冬酰胺 Aspartate 胱氨酸 Cystine 酪氨酸 Tyrosine 谷氨酰胺 Glutamate 甘氨酸 Glycine 组氨酸 Histidine 异亮氨酸 Isoleucine 亮氨酸 Leucine 赖氨酸 Lysine 苯丙氨酸 Phenylalanine 蛋氨酸 Methionine 脯氨酸 Proline 丝氨酸 Serine 苏氨酸 Threonine 缬氨酸 Valine 色氨酸 Tryptophan 谷氨酸 Glutamine 4. 回到氨基酸的蛋白质表征方法&mdash 关键控制因素事实证明，凯氏定氮的总氮(无机氮或单质氮)，不能作为蛋白质表征的关键因素，继续下去，后患无穷，如果能找到以通过氨基酸为表征的原理测试蛋白质，以这个点为中心，进行宏观控制，这样就从本质上，杜绝了加三聚氰胺的风险。蛋白质是由氨基酸组成的，找到特征氨基酸标示，进行分子级别的身份证明，根据氨基酸的含量反推蛋白质的含量，从源头上，使加任何东西都没有用，包括添加皮革边角料，也都没有用。所以，如果找到一个以氨基酸为基础的方法，以氨基酸标示蛋白质。国家蛋白质检测标准建立在这个基础上，就不会有厂家再去加不需要加的东西，因为以特征氨基酸为表征蛋白质含量的时候，即使添加类似三聚氰胺的无机氮，也起不到提高蛋白质含量的作用。这是利国利民的、很有意义的事情。找到这个关键因素进行控制，今后没有人往食品里添加三聚氰胺，因为加了对检测结果也毫无影响。 解决检测漏洞最根本的办法是，检测牛奶中蛋白质的真正含量。为了解决以上这个问题，我们提出并研发了以特殊氨基酸作为蛋白质表征的iTAGTM的标签技术，iTAGTM的标签技术的核心，是基于用特殊氨基酸作为蛋白质的表征的原理。 iTAGTM的标签技术，直接检测真蛋白质含量，而非总氮含量传统的蛋白测定方法，通过iTAGTM标签技术实现了对真蛋白含量的测定，避免了非蛋白氮添加物、残留物对于测试结果的影响。使得蛋白测定结果更为科学可信。例如三聚氰胺、尿素、皮革水解蛋白等非法添加物不会造成测定结果虚高。 这和国家整体的思路有关系，如果中国食品安全质量控制体系的整体思路，回归到从复杂宏观系统找到并建立关键控制因素，如果以氨基酸为标示蛋白质的方法得到推广普及，从而今后没人有必要向牛奶中加非蛋白氮的物质，中国人民今后就不会受到三聚氰胺的困扰。用特殊氨基酸作为蛋白质的表征，这是我们研发iTAGTM的标签技术的理念。 5. 真蛋白质测定技术从根本解决三聚氰胺皮革奶的问题 蛋白质是由氨基酸组成的，不是由无机氮或单质氮组成的。iTAGTM标签技术是直接测量法，用氨基酸表征蛋白质，根据氨基酸含量反推蛋白质含量，非常精确。目前，iTAGTM标签技术非常成熟，与传统方法有本质的区别。目前凯氏定氮法和杜马斯燃烧定氮法都无法排除非蛋白氮的干扰，无法直接测定真实蛋白质含量。iTAGTM标签技术彻底超越了用无机氮或单质氮表征蛋白质含量，即凯式定氮法所出现的问题。 如果在中国采用这种欧美非常流行的方法检测真蛋白质，就不会出现以前企业为提高总氮含量，而往牛奶中添加三聚氰胺或皮革奶的问题，因为往牛奶中添加三聚氰胺只是提高假蛋白的含量，不会提高真蛋白质数据值。如果中国食品安全质量控制体系中检测蛋白质时，以氨基酸为标示的方法得到推广普及，中国人民就不会受到三聚氰胺皮革奶等的困扰。 CEM特殊配方的蛋白质标签技术iTAGTM标签技术，基于传统AOAC、AACC方法 Method 46-14B的技术突破，试剂经改性优化后具备更高的目标性和抗干扰能力，可直接区分及测量蛋白质含量（而非总氮元素），不受样品中过量含氮物质添加或被含氮物质污染所造成的结果失真的影响。iTAGTM 标签技术，直接标定蛋白质中的氨基酸，该技术优化了目标性和针对性，几乎没有干扰物质，因此结果更精确，重复性和再现性更好，优于并超越了传统标准的结果。绿色iTAGTM标签技术，直接准确检测真实蛋白质含量，不受非蛋白氮干扰，安全性更高、目标性更强、所以准确性更好。iTAGTM标签技术快速、安全、环保! iTAGTM 标签技术结合生物与食品技术，进行快速精确的蛋白质测定,可在２min得到准确的结果，精确度达到0.01%。当添加小麦面筋蛋白时不会产生蛋白质测量错误结果，加入三聚氰胺时也不会产生错误结果； iTAGTM标签技术解决了凯氏定氮检测缺陷，即非蛋白氮干扰，区别蛋白质与非蛋白氮的意义在于可以获得精确的蛋白质含量。这对需要进行准确蛋白质检测的行业如食品、饲料和蛋白研究领域具有极大的应用价值。 iTAGTM 标签技术覆盖AOAC 967.12 ，适合分析：乳品（成品或半成品）蛋白、巧克力饮料、脱脂奶及冰激淋等。 另外，iTAGTM 标签技术也符合美国联邦法规（CFR）Title 47。iTAGTM 标签技术可用于所有食品中蛋白质含量的检测，如乳制品、肉制品、粮油制品、果蔬、种子、坚果等。适合分析：谷粒、油籽、豆类、饲料（包括草料）、动物制品、乳制品等。 iTAGTM技术与凯氏法结果平行性对比 iTAGTM技术与凯氏法测试结果对比 Milk Run Sprint Kjeldahl 1 3.13 3.15 2 3.12 3.16 3 3.12 3.13 4 3.12 3.17 5 3.12 3.12 6 3.13 3.18 7 3.12 3.138 3.12 3.16 Average3.12 3.12 Std dev 0.005 0.017 % RSD 0.1% 0.5% Milk (Sample spiked with 0.3g melamine/100 g) RunSprint Kjeldahl 1 3.12 4.53 2 3.13 4.44 3 3.12 4.37 4 3.12 4.40 5 3.14 4.44 6 3.12 4.32 7 3.12 4.41 8 3.13 4.35 Average 3.14

虽然自今年5月来，胶原蛋白产品便遭遇持续质疑，但在短暂的低迷之后，行业又开始在逐渐恢复，暴利驱动之下，企业重复着一轮又一轮的营销攻势。 　　现在，市面上销售的胶原蛋白产品依然琳琅满目，商家变换着方式让消费者购买产品。为了让消费者方便携带，胶原蛋白食品出现的方式从果味饮料、粉剂到果冻条。 　　依靠制造胶原蛋白可以美容的概念，这个&ldquo 营销为王&rdquo 却缺乏技术含量的行业中，隐藏着诸多利益。 　　暴利行业 　　自Fancl进入中国后，中国企业开始在这一领域表现出极大的兴趣，中国的胶原蛋白产品如雨后春笋般的出现在人们的视野。 　　记者走访广州友谊、广百等商场了解到，1盒10支的口服胶原蛋白产品套装价格基本在200-400元不等。品牌销售人员通常推荐消费者按照疗程服用产品，一个疗程通常为3-4盒，要花费上千元。 　　大多数品牌打着&ldquo 进口原料&rdquo 的招牌，在中国获利颇丰。其中，汤臣倍健的客服表示其产品胶原蛋白来自&ldquo 法国&rdquo 罗非鱼，Lumi客服表示来自&ldquo 法国&rdquo 的深海鱼皮。 　　《消费者报道》记者查阅网站上胶原蛋白生产厂家的报价，一公斤胶原蛋白从几十元到几百元不等。在阿里巴巴[微博]的胶原蛋白栏交易排行栏中排名第一的上海某科技公司，其德国进口水解胶原蛋白只需要55元/公斤。 　　据了解，深海鳕鱼鱼皮胶原蛋白原料采用的深海天然打捞的鳕鱼鱼皮为原料，价格最高，大约在 150-220 元/kg 淡水鱼鳞胶原蛋白，原料采用的大多是淡水养殖的罗非鱼鱼鳞为原料，价格大约在 120-200 元/kg 水解胶原蛋白比较多见，技术要求不高，主要是以动物明胶为原料，然后进行酶解，价格大约在 50-100 元/kg。 　　在《消费者报道》送检的七款胶原蛋白中，无限极美姿力胶原蛋白就标明其来源为水解胶原蛋白。该产品一盒(10瓶装)价格为375元。若按照一盒为50000mg胶原蛋白，原料100元/kg计，一盒胶原蛋白的成本为0.5元。 　　而根据本刊送检的第三方检测结果，无限极产品里未含胶原蛋白，意味着连0.5元的成本都省了。 　　早前，央视《焦点访谈》的胶原蛋白报道中就提及，一瓶8g的胶原蛋白口服液，加上包装也才4块钱。 　　东山再起 　　广州某检测中心食品方面检测工程师告诉记者，&ldquo 这个行业目前太乱，弄虚作假的太多，我不看好它。&rdquo 　　然而，从各种市场分析来看，这个行业在蓬勃发展。 　　中国市场调研网研究显示，从2001年至2009年，全球胶原蛋白需求量的年均复合增长率超过17.25%。中国2006年胶原蛋白市场消费约为3000吨，2013年，中国的胶原蛋白市场规模有望达到85.78亿元，预计2015年消费量将达到20000吨，年均复合增长率达到23.47%。 　　今年5月份，口服胶原蛋白功效遭质疑，东方海洋、东宝生物，贵州百灵、汤臣倍健、同仁堂(21.99, -0.01, -0.等涉足该领域的公司受到严重影响。 　　同期，汤臣倍健诸多创始元老及高管密集减持公司股票。在5月份的短短4个交易日里，汤臣倍健三位高管合计减持230万股，减持总额高达1.12亿元。 　　贵州百灵原本3.97亿胶原蛋白项目，不得不嘎然而止，另谋出路。 　　6月，东宝生物胶原蛋白产品&ldquo 圆素&rdquo 因未获得保健食品批号，涉嫌违规宣传，产品被下架。这段风波告一段落。 　　不过，9月，东宝生物以&ldquo 新圆素，新平衡&rdquo 为全新理念，发布圆素牌胶原蛋白全新包装并启动销售。此前，东宝生物的董秘刘芳曾向媒体表示，胶原蛋白产品是公司未来主要增长点，公司会继续加大对产品推广的投入。 　　东宝生物2012年年报显示，该公司胶原蛋白系列产品营收1510万元，毛利率为32.89%。看来在利润面前企业前进的步伐并未受阻。 　　《消费者报道》记者浏览东宝生物天猫[微博]旗舰店发现，圆素不再宣传产品功效。但在网页上提供的第三方检测报告中，检测项目并没有他们宣称含量高的&ldquo 羟脯氨酸&rdquo 。其所检测的蛋白质含量并不能代表胶原蛋白的含量。 　　一位生物科技有限公司的刘姓工作人员则向记者表示，&ldquo 我们做原料的主要是出口。前段时间是低谷期，现在慢慢回升了。&rdquo 　　屡被质疑却又为何能够有持无恐地继续卷土重来?利益之外，监管缺失也是重要因素之一，对此，《消费者报道》后续将继续深入报道。