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脱氧核苷

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脱氧核苷相关的资讯

  • 生物惰性液相质谱联用系统提升寡核苷酸定量分析性能
    样品流路中分析物与金属表面相互作用引起的金属吸附是寡核苷酸分析中的主要问题之一。使用传统的 LC系统(基于不锈钢材质)通常会导致峰形不佳、灵敏度和定量性能受损。本文介绍了使用为解决金属吸附问题而开发的 Nexera XS inert系统分析寡核苷酸的示例。对灵敏度、定量性能和残留进行了评估,结果显示,与在流路中使用不锈钢的 HPLC 系统相比,该生物惰性系统在整体性能上明显改善。Nexera XS inert系统对金属配位化合物表现出优异的分析性能。通常用于 HPLC 流路的不锈钢 (SUS) 具有出色的耐压性,但含有磷酸基团的化合物可以通过金属配位作用与润湿不锈钢表面吸附。金属吸附会对峰形、检测灵敏度和重现性产生负面影响,并降低定量分析的性能。一般通过重复注入高浓度样品来抑制吸附,但这种方法既费时又昂贵。另一种方式是使用含有螯合剂的溶液来抑制吸附。但是此方法不适用于 LC/MS 分析,因为它可能导致污染和灵敏度降低。为了评估金属吸附抑制效果,采用常规HPLC系统(Nexera XR)和生物惰性UHPLC系统(Nexera XS inert)进行分析,并分别使用不锈钢色谱柱和无金属色谱柱。寡核苷酸的反相色谱分析中通常采用离子对试剂,本实验中使用HFIP(1, 1, 1, 3, 3, 3-六氟-2丙醇)和DIPEA(N, N-二异丙基乙胺)。样品信息:序列:5'-dG-dC*-dC*-dT-dC*-dA-dG-dT-dC*-dT-dG-dC*-dT-dT-dC*-dG-dC*-dA-dC* -dC*-3',(*) 表示 5-C 或 5-U 甲基化 (d) 2'-脱氧核苷分子量:6431.72色谱及质谱条件:略。图 1 显示了使用 Nexera XR 和不锈钢色谱柱以及 Nexera XS inert和无金属色谱柱分析的 10 ng/mL 标准寡核苷酸溶液的色谱图。与 Nexera XR 相比,Nexera XS inert 的峰强度增加了约 1.7 倍。图1 寡核苷酸标准溶液(10 ng/mL)的MRM色谱图图2 (a) Nexera XR,(b)Nexera XS inert 交叉污染比较分析浓度为1000 ng/mL的寡核苷酸溶液后,立即将样品溶剂水作为空白进样以评估残留情况。图2(a)显示了Nexera XR空白分析的色谱图,图2(b)显示了Nexera XS inert空白分析的色谱图,可以看到两者的残留水平分别为0.0790%和0.0033%。这些结果表明,Nexera XS inert系统显著抑制了金属吸附并最大限度地减少了交叉污染。样品流路中分析物与金属表面相互作用引起的金属吸附是寡核苷酸以及其他金属敏感化合物分析中的主要问题之一。Nexera XS inert在样品接触流路中使用生物惰性材料,对易被吸附的化合物具有出色的峰形、分离度、灵敏度、重现性和定量性能。而且,该系统耐压超过100MPa,适用于超快速分析,显著提高实验室分析通量。Nexera XS inert系统与MS的结合是分析金属敏感化合物的理想解决方案。本应用中使用的仪器(Nexera XS inert+LCMS-8060)参考文献:1、LCAV-0001-0274,Improvement of Quantitative Performance in LC/MS Analysis of Oligonucleotides using Nexera XS inert本文内容非商业广告,仅供专业人士参考。
  • 技术分享 | 如何准确测试含脱氧剂的包装氧气透过率
    脱氧剂主要应用于食品、饮料和药品等行业,它帮助提高包装的性能及提供所需的保质期。脱氧剂吸收包装中的氧气,使包装内呈无氧状态,因此产品得以保持保鲜。另外脱氧剂可以有效地抑制霉菌和需氧菌的生长,延长产品货架期。作为产品保鲜的材料,脱氧剂与产品装在同一包装中,测试这种状态下的包装材料的透氧性会非常耗时,必须在常规消耗脱氧剂和无脱氧剂两种状态下测量氧气传输率 (OTR),以全面了解产品在整个生命周期内的包装性能。含脱氧剂包装材料检测确保包装性能符合预期的货架期在实践中,脱氧剂可以以多孔小袋、包装内涂层的形式出现,也可以内置于聚合物中,如瓶壁或瓶盖衬里。无论是哪种形式,都必须在消耗脱氧剂之前和之后测试氧气透过率,以确定与没有脱氧剂的原始包装相比的有效脱氧能力。这种类型的渗透测试需要更长的时间来完成,因为他们必须等待脱氧剂完全的被耗尽。这通常会在实验室中造成瓶颈。有三种方法可以帮助缓解这类包装测试的瓶颈。 01.更高的温度下测试高温加速氧气和脱氧剂之间的化学反应。通常温度每升高10°C,估计的OTR就增加一倍,从而减少脱氧剂耗尽所有氧气的总时间。 02.较高的氧气浓度下测试扁平样品如果使用100%的氧气代替室内空气 (20.9% 氧气) 进行测试,则可以消耗更多的氧气分子。与使用室内空气测试所需的时间相比,这将导致测试时间缩短约20%。 03.离线预处理系统以上两种方法都可以“加速”脱氧剂的消耗以减少整体测试时间,在比较不同的涂层、涂层方法或脱氧剂材料层时,它们可以提供有用的数据。但是对于实际产品来说,这两种方法都有实施的限制性。MOCON离线预处理系统提供真实的测试条件,可与仪器同步运行。仪器用于测试,而消耗脱氧剂所需的时间可以离线完成,这提高了实验室的测试效率。MOCON提供可离线预处理的包装测试解决方案离线预处理系统提供了最真实的测试条件,同时缓解了仪器测试瓶颈。可按照下列步骤操作:• 测试完全相同的不含脱氧剂的包装作为参考样品,这将提供基本的OTR水平和测试时间• 对使用脱氧剂的包装进行初始OTR评估。由于包装内含脱氧剂,测试数据可能低于检测限• 当到达参考样品的测试时间时停止测试• 相同条件下开始离线预处理• 定期将包装重新连接到仪器并检查OTR水平• 直到OTR与参考样品测试结果相同或接近(向上滑动可查看)延迟渗透曲线显示脱氧剂的效果注:了解脱氧剂的吸收能力有助于估计离线预处理的时间。另外,许多脱氧剂会被水分激活,在指定的RH条件下进行OTR测试至关重要。 方案优势:• 在没有加速条件的情况下,离线预处理进行真实的脱氧剂包装样品测试• 当样品离线预处理时,仪器可以测试其他样品,提高实验室效率• MOCON OX-TRAN 2/40包装件测试分析仪带有可选的预处理架或PackRack夹具,满足不同形状的包装的离线预处理MOCON OX-TRAN 2/40包装件OTR分析仪带预处理架选项对带有脱氧剂的包装进行渗透测试整个过程需要很长的测试时间。MOCON提供离线预处理的包装测试解决方案:不仅提升仪器测试效率,还满足提供准确和一致的测试结果,提高了实验室的经济效率。
  • 恒创立达发布急速脱氧在线随时膜脱气仪新品
    恒创立达产品介绍: 急速脱氧在线随时膜脱气仪和排液,没有容量限制,最小250ml,主要对纯水、蒸馏水进行脱气。主要特点:1.设计简便界面:高分辨率液晶屏显示和触控操作,交互界面简单直观。单人即可独立完成溶出介质脱气和加注工作。2.在线加热功能:溶出介质在进行脱气前进行预加热(极限可达45℃ ) ,提高了脱气效率。同时节约了溶出介质在溶出仪中的加热等待时间。3.高精度供液系统:溶出介质加注体积精度为设定体积的±3%4.可处理多种溶出介质:溶出实验常用的纯水、蒸馏水。6.可变温度设定功能:温度调节范围为室温到45℃7.易于维护和保养,机内所有配件可快速更换及维护。 技术指标:定量分配体积容量:无容积限制,设定精度0.1L体积分配精度值:±3%加热功率:1500W可大加热能力:极限可达45°C的供液温度(视初始温度而定)温度精确度值:±1°C极大真空度:-96.0KPa脱气效果:目标含氧量≤2.8mg/l过滤器:前置40um/25um/20um金属丝网过滤器可选外型尺寸:主机500*340*295( mm)创新点:1.设计简便:高分辨率液晶屏显示和触控操作,交互界面简单直观。单人即可独立完成溶出介质脱气和加注工作。 2.在线加热:溶出介质在进行脱气前进行预加热(最高可达45℃ ) ,提高了脱气效率。同时节约了溶出介质在溶出仪中的加热等待时间。 3.高精度供液:溶出介质加注体积精度为设定体积的± 3% 急速脱氧在线随时膜脱气仪
  • 向“RNA世界”假说发起挑战,地球首个生命由RNA-DNA混合产生
    DNA示意图。  图片来源:《每日科学》杂志  近日,美国斯克里普斯研究所科学家在化学研究领域核心期刊《德国应用化学》上发表论文称,一种名为苯基磷二酰胺(DAP)的简单化合物在生命出现之前可能就已存在于地球上,它可以通过化学手段将名为脱氧核苷酸的微小DNA结构单元编织在一起,形成原始的DNA链。  该发现指出了DNA与RNA作为相似化学反应的产物一起出现的可能性,而第一批自我复制的分子,即地球上第一批生命的形式,正是这两种分子的混合体。近几十年来,“RNA世界”假说在生命化学领域一直占据主导地位,认为早期生命分子完全基于RNA,而DNA仅在后来作为RNA进化的产物才出现。而本次发现对该假说提出了挑战,进一步解释了地球生命是如何起源的这一古老问题。  一条RNA链可以吸引其他单个RNA结构单元,粘附在RNA链上形成一种镜像链。如果新链可以脱离模板链,并开始通过相同的过程作为模板结合其他新链,那么它就实现了构成生命的自我复制的“壮举”。  然而RNA链可能擅长结合互补链,但却不太擅长与这些链分离。现代生物体产生的酶可迫使RNA(或DNA)双链分开成两条,从而实现复制,但目前尚不清楚在没有酶的世界里如何做到这一点。  该研究资深作者、斯克里普斯研究所化学副教授克里希纳穆尔蒂指出,部分DNA和部分RNA的“嵌合”分子链或解决了这个问题,因为它们可以一种粘性较小的方式结合互补链,从而使它们相对容易分离。  在过去的研究中,科学家们已经发现,简单的核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸(分别是RNA和DNA的构成单元),可能是在早期地球非常相似的化学条件下产生的。有机化合物DAP起到了修饰核糖核苷酸,并将它们串在一起形成第一条RNA链的关键作用。而此次研究表明,在类似条件下,DAP也可以对DNA起到同样作用。  这一发现为更广泛地研究自我复制的DNA-RNA混合物如何在原始地球上进化和传播,构建更完善的现代生物学铺平道路。  RNA真的独自完成了生命起源的关键任务吗?近些年来,大量证据表明RNA和DNA可能几乎同时出现在最初的生命形式中,随后很快,二者又凭借各自的优势和缺陷进行了合理又明确的“分工”:DNA负责遗传信息长期稳定的存储,RNA则负责遗传信息的短期储存和运输,以及制造蛋白质——就像人们今天在细胞中看到的那样。而在“零”的起点上,或许仍是RNA和DNA两个必不可少的因素共同协作,才有了今天地球上的生机勃勃、生命不息。
  • 科学家发明体内DNA合成可视化新技术
    瑞士苏黎士大学的研究人员研发了一种新物质,可用来标记和观察动物体内的DNA合成过程。该技术的应用为药物研发提供了新策略。相关研究论文于12月5日在线发表在美国《国家科学院院刊》(PNAS)上。   详细了解动物体内DNA和蛋白质等大分子合成是理解生物系统和设计疾病治疗策略的必要条件。通常,通过人工合成小分子标记物掺入生物体自身合成过程来达到可视化DNA合成的目的。但是,直到现在该方法有一个重大的局限性:标记物具有毒性并导致细胞死亡。内森利德基(Nathan Luedtke)领导的小组研发了一种叫“F-ara-Edu”的核苷。用它来替换胸腺嘧啶脱氧核苷,标记DNA对生物体基因组功能几乎没有影响,毒性也大为降低,检测也更灵敏。   利德基表示,通过可视化新DNA的合成,就能够鉴定病毒感染和肿瘤增长的位点。这将引领药物研发新策略。(科学网 任春晓/编译)   相关仪器及方法:热型质谱仪   完成人:内森利德基课题组   实验室:瑞士苏黎士大学有机化学研究所   更多阅读   PNAS发表论文摘要(英文)
  • 科学家发明DNA温度计 未来将实现纳米级温度监控
    Vallée-Bélisle等人用DNA制造出了温度计,用于纳米级别的测温。这些纳米级温度计极大地帮助人们了解在微观世界中温度是如何存在的。  本周《纳米通讯》上发表了一项新的研究成果,蒙特利尔大学的研究者利用DNA发明了一种温度计。这种人工编码的DNA,大小只有头发的1/20000。这种温度计可以测量微观环境的温度,这将极大地加深了人们对自然和纳米技术的了解。  60年前,科学家发现DNA是存储人类遗传信息的关键生物分子,DNA双链在受热的时候会解开(这个过程称为解链)。Alexis Vallée-Bélisle教授说:“近年来生化学家发现,蛋白质和RNA等生物分子在生物体内也会随着温度的变化而发生状态的改变。我们的团队受此启发,制造了各种编码的DNA温度计,这些DNA可以在特定的温度下解链,这样就实现了温度的测量。”  使用DNA作为温度计最主要的好处就是结构简单、可以人工编码。David Gareau是这篇论文的第一作者,他解释说:“DNA中包含了4中脱氧核苷酸:ATGC,其中A和T配对,G和C配对。碱基之间是由氢键连接的,AT之间有两个氢键,GC之间有三个氢键。所以当GC配对在DNA中比例较大时,解链就需要更多的能量。利用这样的结构特点,我们可以制造出在特定温度条件下解链的DNA。”另一位作者Arnaud Desrosiers补充说:“为了能看到这些微观的变化,我们在这些DNA结构中加上荧光标记,这样我们就制造出了长度仅有5纳米的温度计。”  因为DNA温度计的发明,纳米科技向我们敞开了新的大门,而且这帮助我们更深层次地了解分子生物学。“现在生物学中仍然有很多亟待解决的问题。比如,我们知道人体的正常体温是37.5℃,但是我们不清楚在细胞内温度是否更高。”这一团队正在研究的问题就是,在细胞高速生产分子时,是否会过热。“相信在不久的将来,我们可以将这一研究成果应用于电子设备,从而实现纳米级别的温度监控。”
  • 154名院士“落户”江苏 142家企业建院士工作站
    4月5日,中国工程院院士、南京大学环境学院教授张全兴院士工作站落户无锡高新区的江苏江达生态科技有限公司,江达公司研发中心同时宣告成立,这意味着无锡在运用高科技团队力量治理太湖上又迈出了新的一步。江达公司将投资1亿元建设研发中心,打造国内规模最大、实力最强的河海湖泊生态修复企业,并将科研成果推向更广的领域。   为促进企业与高校院所建立产学研长效合作机制,引进高层次人才创新创业,加快以企业为主体的技术创新体系建设,2009年江苏省科技厅启动了企业院士工作站创建工作。新机制建立以来,这项产学研对接的长效机制备受关注,不仅帮企业解决了重大技术难题,还为金融危机下企业创新发展增添了信心。   共建平台,院士支撑企业研发走向高端   2009年初,为适应率先发展和应对金融危机的新形势,江苏推出了企业院士工作站这一创新平台。一年过去了,154名院士带着他们多达1672人的创新团队在142家企业安了家,而江苏的科技部门和企业也拿出了18亿元作为配套,与院士团队围绕456项技术难题开展联合攻关,推动近百项最新科研成果在企业实施产业化。   中国工程院李正邦院士为此评价说:“江苏在全国率先建设企业院士工作站是科技工作的一个创举,是重视人才、重视科技成果转化的重要举措,是院士及其团队到地方创新创业的重要舞台,意义十分重大。”   企业引院士,院士也在挑企业。据了解,这142家企业基本都建有成熟的企业研发机构,有的甚至是省级、国家级,正是一流的研发平台为院士提供了良好的科研环境,也是吸引院士来江苏共创大业的有利条件。   扬子江药业集团有限公司在创建企业院士工作站之前,就注重构建完善的研发创新体系,先后成立了“国家级企业技术中心”、“博士后科研工作站”、“中药制药工艺技术国家工程研究中心”、“药物制剂新技术国家重点实验室”,并整合国内外研发资源,筹建江苏省“十一五”重大科技基础设施建设项目——“江苏(泰州)新药研究院”。   而江苏雨润食品产业集团有限公司也建有国家肉品质量安全控制工程技术研究中心 江苏先声药业有限公司建立了国家认定企业技术中心、江苏省工程技术研究中心……   这并非巧合,而是科技部门引导布局的结果。江苏省科技厅朱克江厅长认为,企业要想进入产业技术高端环节,首先必须拥有承载高端技术的能力。   长澳医药是南京一家专门开展新药研发的企业。听说科技部门要在企业建一批院士工作站,而且还有经费支持,公司老总大声叫好,“这简直就是为我们量身定做的!”其实,长澳公司早在2003年就与宋湛谦、谢毓元、金国章三位院士的团队建立合作关系。趁着这次建站的东风,公司再次投入2600万元,建设了高标准实验室和中试研究基地,并与院士共同开展国家一类新型抗菌药物的研发,推动抗糖尿病新药、新型心绞痛治疗药物、新型抗帕金森病药物等的成果迅速转化,大幅提升了企业的自主创新能力。   瞄准前沿,企业与院士共享产业化成果   “院士工作站,区别于以往的产学研对接形式,不仅对接层次高端,而且还建立了固定化的对接模式与平台”,朱克江厅长强调,院士工作站不只是依靠院士个人,而是利用院士团队的整体研发力量,与企业开展长效合作,推动企业攻坚克难、转型升级。   院士站在世界科技发展的最前沿,掌握着一大批最新先进适用的科技成果,他们不仅为企业带来科研成果,而且还对企业进行技术指导,为企业战略发展把好舵。创建企业院士工作站以来,直接推动院士携带100多项重大科技成果到江苏企业实施产业化,促使科技成果转化为现实生产力,实现规模效益,促进企业又好又快发展。   无锡爱邦辐射技术有限公司与中科院高能物理研究所陈森玉院士及其科研团队早在2007年就已开展合作,进行高频高压电子辐照加速器的研发及产业化研究,成立院士站后院士团队中有5人直接进入企业开展成果转化,加快了高效节能用电子辐照加速器的研发及项目产业化的推进。   目前该院士站正进行先进工业辐照加速器的研发,该产品在国内外同类产品中处于领先地位,广泛应用于食品、医疗器械和卫生材料的辐射消毒灭菌,口岸辐照检疫处理等领域。2009年爱邦公司完成销售1.4亿元,同比增长30%,成功地抵御了金融危机的影响。   长期以来,电梯弯曲变形问题是制约“长江润发”进入高速电梯市场的障碍,根本问题在于缺少高精度矫扭矫直机。院士工作站建立后,清华大学吴澄院士主动承担起该项目的攻关任务,供需对路的产学研对接模式,让院士专家和企业取得双赢。企业更在攻克难题的同时,在参与项目的人员中培养在读研究生,增强了企业人才和技术储备。   “虽然工作刚刚展开,短期内未必能对企业带来明显的效益,但从长远发展角度看,企业作为创新主体,凭借院士团队这支学科和行业的云梯,必定能登上市场竞争的制高点。”远东控股集团人力资源部高级总监张艳宝如是说。   院士进到企业进行技术创新,还吸引集聚千余名教授、博士等院士团队成员,共同服务企业技术创新。在充分满足企业对高端人才的需求外,还将为江苏企业联合培养上千名创新人才,为企业从培养创新骨干人才到进一步培养高层次人才,从输血变造血,大幅提升企业自主创新能力。   借梯登高,院士携手企业共破产业核心关键技术   企业院士工作站作为创新载体,不仅要提升企业核心竞争力,更肩负促进产业发展为主线的使命。   一年多来,江苏新建的企业院士工作站主要面向新能源、新材料、新医药、电子信息、装备制造、节能环保、现代农业等高新技术领域,在电子信息、生物医药、新材料、新能源、装备制造等优势领域建设的共116家,占81.7%,纺织、化工等支柱产业以及农业和交通、节能环保等社会发展领域建有26家,有力提升了产业技术创新水平,促进了高新技术产业向高端攀升。   以生物医药为例,该领域已建院士工作站19家,共引进院士20人,院士团队科研人员共计300余人,强有力地支撑企业科研创新。目前,生物医药领域在研重大项目共计40余项,其中国家重大专项9项 科研成果丰硕,共申请专利20项,发表sci论文17篇 4个新药获得临床批件,实现了7项重大技术突破 帮助抗禽流感药物“扎那米韦”和1类创新药“复方左卡尼汀注射液”获得临床研究批件 实现了高纯度脱氧核苷和脱氧核苷酸的规模化制备,该技术填补了国内空白,打破了日本对于这些技术和产品的垄断。
  • 欧罗拉发布欧罗拉混合精斑DNA前处理工作站(差异裂解法)VERSA1100新品
    欧罗拉差异裂解法,DNA前处理工作站,混合精斑前处理工作站differential digestion workstation在法医学实践中,混合斑检材以精阴混合斑最为常见,即精液与阴道分泌液的混合物。Forensic sexual assault cases with mixed samples of semen and epithelial cells are very common.对于此类检材,都必须采用差异裂解法进行精子细胞分离。For such samples, differential digestion method must be used to separate sperm cells. 随着技术改进,结合脱氧核苷酸酶Dnase Ⅰ和改良的碱性裂解液,以及自动化液体工作站平台,即可轻松快速从含有精斑的混合液中获得精子DNA。With the improvement of technology, sperm DNA can be easily and quickly obtained from the sample mixture by combining deoxynucleotidase Dnase I with improved alkaline lysate and automated liquid workstation platform.应用: Application: √ 食品安全检测 _Food safety testing √ 血液/血清中维生素D萃取 Extraction of Vitamin D from Blood/Serum √ 公安药物实验室中滥用检测 _Detection of Toxic Substance Abuse in Public Security Drug Laboratory √ 血液中促进生长剂的检测 _Detection of growth-promoting agents in blood √ 水产品中禁用药物,如孔雀石绿 _Prohibited drugs in aquatic products, such as malachite green √ 药物研发化合物纯化 _Purification of Drug R&D Compounds √ 尿液中异黄酮分离 Detection of Isoflavonoides from urine samples √ 海产品中的黄曲霉素检测 _Detection of Aflatoxin in seafood √ 非挥发或半挥发分析化合物处理 _Treatment of Non-volatile or Semi-volatile Analytical Compounds √ 食品中氯霉素 _Chloramphenicol in Food如何给欧罗拉留言?欢迎点击【一键咨询】,【发送留言】后我们会马上联系您,为您的实验或应用需求推荐合适的仪器配置Applications Genomics • Automated Isolation of Genomic DNA using the MACHEREY- NAGEL NucleoMag® Plant kit by Aurora Biomed’s VERSA 1100 • Automated Isolation of Genomic DNA using the MACHEREY-NAGEL NucleoMag® Blood 200μL kit by Aurora Biomed’s VERSA 1100 • 采用性犯罪试剂盒差异消化方法在VERSA 1100自动化应用 • VERSA™ 1100 GENE在下一代测序(NGS)文库制备自动化的可行性验证 • 全血样品中核酸提取应用报告 • 植物样品中核酸提取应用报告 • Automation of DNA Extraction • PCR Setup • Automation of Reverse Transcriptase PCR • Automation of Real time PCR • Automation ofRNA Sequencing • Automation ofNext Generation Sequencing • Automation of DNA Microarray • Automation of Miniprep • Automation of Sanger Sequencing • Automation of On-Slide (Amplislide) PCR Setup using VERSA™ 110 PCR Setup Workstation • Food Safety Monitoring using VERSA™ 110 NAP Workstation • Hot-Start PCR using VERSA™ 110 PCR Workstation • DNA Isolation from Saliva (Invitek Forensic DNA Isolation Kit) • Nucleic Acid Prep for Avian Flu Viral RNA • β-Actin and Whole Genome Amplification (Sigma & Promega kits) • Genomic DNA Isolation from Blood (Promega) • Automation of Molecular Pathology Applications on the VERSA™ 10 PCR Setup Workstation • Automated System for High Throughput PCR SetupExtraction • 高通量固相萃取&气相色谱-质谱联用方法定量检测吸毒者尿液中甲基苯丙胺和苯丙胺 • HTS Flux Assay Automation • Validation of Automated Liquid Liquid Extraction of 25-hydroxy vitamin D • Automation of Sample Preparation and Introduction into NMR Tubes • Liquid Liquid Extraction of β-carotene • Automation of Protein PurificationGeneral Liquid Handling • High-Density Peptide Array Printing • Specimen Staining for TEM (Array printing) • Automated Slide-Based Assay Setup using VERSA™ 110 Workstation • VERSA™ Spotter Workstation for Solid-Phase Peptide Synthesis • Automated Protein Crystallography Plate Setup using VERSA™ 110如何给欧罗拉留言?欢迎点击【立即咨询】,【发送留言】后我们会马上联系您,为您的实验或应用需求推荐合适的仪器配置创新点:仪器针对法医学实践中的混合检材,尤其是精阴混合斑,采用特殊的差异裂解法进行精子细胞分离。 现混合精斑DNA前处理工作站,将差异裂解法在液体工作站中特色设计为自动化,结合脱氧核苷酸酶DnaseⅠ和改良的碱性裂解液,,即可轻松快速从含有精斑的混合液中获得精子DNA。 现特色模块如实际冷槽,对缓冲液、生物酶、试剂等低温保存,提高提取效率。 典型案例: 加利福尼亚州奥克兰警察局采用我司VERSA1100差异裂解法进行法医分析,并发表了论文证明了他们的成功。论文链接https://www.ncjrs.gov/pdffiles1/nij/grants/242773.pdf 欧罗拉混合精斑DNA前处理工作站(差异裂解法)VERSA1100
  • 三代测序技术相关仪器工艺创新概述
    DNA 测序是一种确定 DNA 分子中碱基(A、T、C 和 G)顺序的技术,在生物学、医学、法医学和其他领域有着广泛的应用,例如基因组学、遗传学、分子生物学、疾病诊断和个性化医疗。 DNA 测序技术自 1970 年代以来经历了多次革命性的发展,从第一代测序到第二代测序,再到第三代测序。这些测序技术在原理、方法、优势和局限性方面有着显著的差异。本文将对基于这三代测序技术的相关仪器工艺创新进行概述,并比较其特点和应用。  一、第一代测序仪  基于桑格测序方法,该方法使用链终止双脱氧核苷酸(ddNTP)生成不同长度的DNA片段,通过电泳分离并通过荧光检测。 代表性仪器是 Applied Biosystems 及其 3730xl DNA 分析仪。 工艺创新主要有自动毛细管电泳、荧光标记和碱基识别算法的开发 。  a. 自动毛细管电泳:通过向填充有凝胶或聚合物基质的细毛细管施加电场来分离不同长度的 DNA 片段的过程。 DNA 片段根据其大小和电荷在毛细管中迁移,较小的片段比较大的片段移动得更快。 毛细管电泳系统可以自动并行加载、进样、分离和检测多个样品,从而提高 DNA 测序的通量和效率 。  b. 荧光标记:将荧光染料附着到链终止核苷酸 (ddNTP) 上的过程,用于在测序反应中生成 DNA 片段。 荧光染料根据 ddNTP 的碱基类型(A、T、C 或 G)发出不同颜色或波长的光。 荧光信号由毛细管电泳末端的激光和相机或扫描仪检测 。  c. 碱基识别算法:分析毛细管电泳产生的荧光信号并确定 DNA 片段中碱基序列的过程。 碱基检出算法使用各种方法来校正信号中的噪声、伪影和错误,例如峰检测、峰对齐、峰归一化、峰反卷积和质量评分。 碱基检出算法以各种格式输出序列数据,例如色谱图、跟踪文件或 FASTA 文件 。  二、第二代测序仪  基于大规模并行边合成边测序 (SBS),它使用修饰的核苷酸或探针,在每个循环后终止 DNA 合成(或允许可逆终止终止子、可切割探针)。 DNA 分子通过聚合酶链式反应 (PCR) 或桥式 PCR 在固体表面或乳液液滴中进行扩增,并通过光学或化学检测进行测序。 代表性仪器主要有Illumina的基因组分析仪、HiSeq和MiSeq平台 罗氏及其 454 平台 以及 Ion Torrent 及其个人基因组机器和 Proton 平台。 工艺创新主要有测序反应的小型化、光学/化学检测方法和核苷酸化学方法。  a. 测序反应小型化:减少第二代测序仪中 DNA 样本和测序反应的大小和体积的过程,涉及使用微流体装置或显微孔阵列来限制 DNA 分子,并通过聚合酶链式反应 (PCR) 或桥式 PCR 对其进行扩增,减少了所需的 DNA 量并增加了测序反应的密度。  b. 光学/化学检测方法:测量第二代测序仪中 DNA 合成过程中碱基掺入所产生的光或化学信号的过程,涉及使用荧光标记的核苷酸或探针,根据碱基类型发出不同的颜色或强度。 光学/化学检测方法根据测序平台和化学成分而有所不同,通常遵循以下步骤:  i. 在测序反应中,DNA 模板与引物和 DNA 聚合酶杂交。  ii. 测序反应提供标记的核苷酸或探针,它们在每个循环后终止 DNA 合成或允许可逆终止(例如可逆终止子、可切割探针)。  iii. 根据碱基配对规则将标记的核苷酸或探针添加到DNA模板的互补链上。  iv. 荧光信号或化学信号(例如 pH 值变化)由高分辨率相机或扫描仪捕获并转换为数字数据。  v. 通过计算分析信号以确定碱基身份和序列。  c. 核苷酸化学方法:涉及使用修饰核苷酸或探针影响第二代测序仪中 DNA 合成的过程。 它基于互补碱基配对的原理,其中A与T配对,C与DNA中的G配对。 核苷酸化学方法根据测序平台和化学方法的不同而有所不同,通常遵循以下步骤:  i. 在测序反应中,DNA 模板与引物和 DNA 聚合酶杂交。  ii. 测序反应提供经过修饰的核苷酸或探针,它们在每个循环后终止 DNA 合成或允许可逆终止(例如可逆终止子或可裂解探针)。  iii. 根据碱基配对规则将修饰的核苷酸或探针添加到DNA模板的互补链上。  通过光学/化学方法检测修饰的核苷酸或探针,然后通过化学或酶促步骤去除或灭活,从而允许下一个循环进行。  三、第三代测序仪  基于单分子实时(SMRT)测序,不需要扩增或终止DNA分子。 通过监测将荧光标记的核苷酸或探针掺入互补链的 DNA 聚合酶的活性,对 DNA 分子进行测序。 代表性仪器主要有 Pacific Biosciences 及其 PacBio RS II 和 Sequel 平台 Oxford Nanopore Technologies 及其 MinION、GridION 和 PromethION 平台 以及 Ultima Genomics 及其 Ultima 平台。 工艺创新主要有使用零模波导(ZMW)、纳米孔或纳米通道来限制和观察单个 DNA 分子 使用磷酸化核苷酸或纳米孔接头来实现连续测序 以及使用人工智能来提高碱基识别准确性。  a. 零模波导 (ZMW)、纳米孔和纳米通道是三种类型的纳米结构,可以限制和观察单个 DNA 分子以进行第三代测序。  i. ZMW 是金属薄膜中的纳米级孔径,可产生高度受限的光学观察空间。 当激光照射在金属薄膜上时,只有少量的光可以进入ZMW并激发内部的荧光分子。 这样可以检测通过 DNA 聚合酶掺入 DNA 链的单个荧光标记核苷酸或探针。 Pacific Biosciences 在其 SMRT 测序技术中使用 ZMW。  ii. 纳米孔是膜上的纳米级孔,可在膜上产生电势差。 当 DNA 分子穿过纳米孔时,它会破坏离子电流并产生反映 DNA 碱基序列的特征信号。 纳米孔可以是生物的(例如蛋白质孔)或合成的(例如固态孔)。 Oxford Nanopore Technologies 在其 MinION、GridION 和 PromethION 测序平台中使用了纳米孔 。  iii. 纳米通道是表面上的纳米级凹槽,为 DNA 分子拉伸和排列创造了一个有限的空间。 当荧光染料应用于 DNA 分子时,可以通过显微镜对它们进行成像,并且可以通过将荧光图案映射到参考基因组来确定它们的序列。 纳米通道可以通过多种方法制造,例如蚀刻、光刻或模制。 Ultima Genomics 在其 Ultima 测序平台中使用了纳米通道。  b. 磷酸化核苷酸和纳米孔接头是两种类型的修饰核苷酸或探针,可对单个 DNA 分子进行连续测序。  i. 磷酸化核苷酸是荧光标记的核苷酸,其磷酸基团上连接有可移除的接头。 连接体可防止焦磷酸盐的释放,否则会终止 DNA 合成。 连接子还允许在每个掺入循环后裂解荧光染料,从而可以在多个循环中重复使用相同的 ZMW。 Pacific Biosciences 在其 SMRT 测序技术中使用了磷酸化核苷酸 。  ii. 纳米孔接头是具有发夹结构和条形码序列的合成寡核苷酸。 这些接头连接到 DNA 分子的两端,形成可以多次通过纳米孔的环状 DNA 分子。 条形码序列允许对同一 DNA 分子的重复读取进行识别和比对,从而提高准确性和共识质量。 Oxford Nanopore Technologies 在其 MinION、GridION 和 PromethION 测序平台中使用 Nanopore 适配器 。  c. 人工智能是计算机科学的一个分支,它使用机器学习、深度学习、神经网络和其他方法来执行需要人类智能的任务,例如自然语言处理、图像识别、语音识别和决策。 人工智能通过以下方式提高第三代测序中的碱基检出准确性:  i. 使用来自不同测序平台和化学物质的原始信号和相应序列的大型数据集来训练神经网络。  ii. 开发可以纠正原始信号中的噪声、伪影和错误的算法,例如信号漂移、同聚物错误、插入/删除错误和碱基修饰。  iii. 实施可以利用多个来源信息的方法,例如参考基因组、共识序列、质量评分和元数据。  iv. 优化方法,适应不同的测序条件,例如读长、覆盖深度、测序速度和样品质量。  d. 用于第三代测序中碱基检出的人工智能方法的一些示例:  i. DeepNano:一种深度循环神经网络,使用原始电流信号执行碱基识别。  ii. Guppy:一种基于神经网络的软件工具,使用原始电流信号执行 Oxford Nanopore MinION 读取的碱基识别。  iii. DeepMod:一种双向循环神经网络,使用原始电流信号进行碱基识别和碱基修饰检测。  iv. NanoMod:一种卷积神经网络,使用原始电流信号进行碱基修饰检测。  v. Megalodon:一种软件工具,可使用原始电流信号读取执行碱基识别、碱基修饰检测和选择性剪接检测。  vi. DeepSimulator:一种深度卷积生成对抗网络,模拟 Oxford Nanopore MinION 从参考基因组中读取的内容。  vii. Clairvoyante:一种多任务卷积神经网络,使用原始信号强度值对 Pacific Biosciences SMRT 读取执行变体识别。  viii. IsoPhase:一种深度卷积神经网络,使用原始信号强度值读取执行单倍型感知亚型重建。  ix. DeepIso:一种深度卷积神经网络,使用原始信号强度值读取进行异构体量化。  总之,第一代、第二代和第三代测序是DNA的三种不同读取方法,在原理、方法、优势和局限性方面有着显著的差异。第一代测序是基于桑格测序方法,使用链终止双脱氧核苷酸(ddNTP)生成不同长度的 DNA 片段,并通过电泳分离和荧光检测,工艺创新主要有自动毛细管电泳、荧光标记和碱基识别算法的开发。第二代测序是基于大规模并行边合成边测序 (SBS),使用修饰的核苷酸或探针,在每个循环后终止或可逆终止 DNA 合成,并通过光学或化学检测进行测序,工艺创新主要有测序反应的小型化、光学/化学检测方法和核苷酸化学方法。第三代测序是基于单分子实时(SMRT)测序,不需要扩增或终止 DNA 分子,而是通过监测将荧光标记的核苷酸或探针掺入互补链的 DNA 聚合酶的活性进行测序,工艺创新主要有使用零模波导(ZMW)、纳米孔或纳米通道来限制和观察单个 DNA 分子;使用磷酸化核苷酸或纳米孔接头来实现连续测序;以及使用人工智能来提高碱基识别准确性。这三代测序技术各有优缺点,适用于不同的目标和场景。选择合适的测序技术需要考虑多种因素,例如读长、准确性、速度、成本和样品质量。随着科技的进步,DNA 测序技术仍在不断发展和改进,为生命科学领域带来新的机遇和挑战。
  • 纳米孔单分子检测技术新进展 有望大幅度降低DNA测序成本
    p style=" LINE-HEIGHT: 1.75em" & nbsp & nbsp & nbsp & nbsp DNA测序能够从血液或唾液中分析测定基因全序列,预测罹患多种疾病的可能性,同时可以帮助患者精准治疗。但目前的DNA测序技术,昂贵的价格让普通大众望其项背。寻找低成本、快速的DNA测序技术,成为科学家们研究的热点,生物纳米孔单分子分析技术因其低成本、快速和无需荧光标记等优点被视为最具前景的DNA测序技术之一。 /p p style=" LINE-HEIGHT: 1.75em"   近期,华东理工大学化学与分子工程学院的龙亿涛科研团队在生物纳米孔超灵敏单核苷酸分辨领域取得独创性突破,该研究成果以华东理工大学作为独立研究单位,于4月25日在《Nature Nanotechnology》(自然-纳米技术)发表了题为“Discrimination of oligonucleotides of different lengths with a wild-type aerolysin nanopore”的研究论文。 /p p style=" LINE-HEIGHT: 1.75em"   生物纳米孔单分子分析技术的原理是通过电场力驱动单链DNA穿过纳米尺寸的孔道,由于不同的脱氧核苷酸通过纳米孔道时产生了不同阻断程度和阻断时间的电流信号,由此可根据电流信号读出每条DNA序列上的碱基信息。但在实际实验过程中,单链DNA穿过纳米孔的速度极快(约1微秒/碱基),造成了的电流阻断信号极小(皮安级),阻碍了纳米孔测序技术发展。 /p p style=" LINE-HEIGHT: 1.75em"   基于自主研制的超低电流检测装置,龙亿涛课题组首次使用野生型且无任何修饰的Aerolysin(气单胞菌溶素)生物孔,将单链DNA的过孔速度降低了三个数量级(2.0毫秒/碱基),从而极大地提高了电流检测的灵敏度,完成了对仅有单个碱基差异DNA分子的超灵敏识别,并实现了混合复杂体系的超灵敏检测和核酸外切酶“分步降解”单链DNA过程的实时观测。此外,该研究还通过改变检测体系的酸碱度,调节了气单胞菌溶素孔道内腔的电荷分布,同时结合单链DNA在孔内有效电荷数的计算,获得了纳米孔表/界面上电荷的分布信息,促进了对DNA与气单胞菌溶素孔道内腔表面氨基酸残基相互作用的深入理解。 /p p style=" LINE-HEIGHT: 1.75em"   据介绍,气单胞菌溶素来源于嗜水气单胞菌,主要存在于水生环境包括海水、湖泊、蓄水池和供水系统中,是一种天然的纳米蛋白孔,具有成本低、简单易得的特点。早在2006年,龙亿涛教授就发现气单胞菌溶素能够作为一种纳米蛋白孔,并具有实现高灵敏单分子检测的潜力。该论文的第一作者曹婵,于2011年进入龙亿涛课题组以来一直从事生物纳米孔的相关研究,通过大量的实验尝试和经验积累,实现了气单胞菌溶素纳米通道的成功制备和单分子信号的获取。 /p p style=" LINE-HEIGHT: 1.75em"   “这一独创性研究成果不仅进一步降低纳米孔单碱基分辨的成本,同时也将大大提高纳米孔DNA测序的精确度。”据龙亿涛介绍,未来,结合高带宽低噪音的电流检测仪器,气单胞菌溶素纳米孔有望实现单碱基直接分辨以及对DNA损伤的检测,这将大大推动DNA测序技术以及个性化医疗的发展。 /p p br/ /p
  • 上海首个核酸产业园7月正式开工,一起来聊聊寡核苷酸药物解链温度
    导 读近年来,以核酸药物为首的功能性核酸备受关注,2021年底治疗罕见病脊髓性肌肉萎缩的反义寡核苷酸药物诺西那生钠进入中国医保,几乎同一时间,诺华降血脂的小干扰RNA药物Leqvio获FDA批准上市,据悉一年只需用药两次。寡核苷酸药物已经从罕见病过渡到了常见慢性病,并可大大降低患者用药频率。随着寡核苷酸类药物的陆续上市,核酸药物已成为当前生命科学和药物研究的热点之一。为了更好促进核酸药物的快速发展,上海首个核酸产业园于7月中旬在上海杭州湾经济技术开发区正式开工,该产业园是以生物医药产业为发展方向,基于核酸开发各种疫苗及药物。今天,我们就一起来聊聊核酸药物以及解链温度等话题。01核酸药物小科普核酸类药物核酸类药物是各种具有不同功能的寡聚核糖核苷酸(RNA)或寡聚脱氧核糖核苷酸(DNA),能够直接作用于致病靶基因或者靶mRNA,在基因水平上发挥治疗疾病的作用。常见的寡核苷酸药物主要包括反义寡核苷酸(ASO)、小干扰RNA(siRNA)、微小RNA(microRNA)、小激活RNA(saRNA)、适配体(Aptamaer)、信使RNA(mRNA)。解链温度在这些核酸药物中,对于具有双链结构的药物,需要对其解链温度进行分析。解链温度是衡量双链结构核酸类物质热稳定性的重要指标,它是控制结构和功能的关键因素。例如小干扰RNA(siRNA)药物等具有双链结构,当温度升高时,氢键断裂,双链逐渐解体,形成单链结构。这种现象称为核酸的“溶解”,将双链和单链所占比例相等的温度定义为解链温度(Tm)。因为核酸类物质在260 nm附近有一个紫外吸收峰,吸收值在解链过程中增加,通过测试该吸光度变化,以确定Tm值。因此在进行核酸药物Tm值分析时,可以利用紫外分光光度计加上控温附件和对应的数据分析软件来完成。02分析利器对于核酸解链温度Tm测试,岛津拥有成熟的方法和分析设备,该设备一般为UV-1900i配Tm分析系统(TMSPC-8)。Tm分析系统由8列控温支架、专用8列微量比色池、温度控制器和Tm分析软件构成,最多可同时测定8个样品。UV-1900i和Tm分析系统专用8列微量比色池(光程10 mm)03案例分享接着小编带您看看具体的寡核苷酸分析案例,操作步骤简单快捷,结果直观。测试样品为M13-25mer核酸,测试前先进行样品溶液脱气的预处理,通过UV-1900i和Tm分析系统可以轻松获得Tm 曲线(绘制260nm处的吸光度对温度曲线,如下图所示),该曲线可以显示升温时和降温时的结果。样品的Tm曲线测试完成后,可以通过中线法和微分法两种方法计算Tm值,最终得到的Tm值结果基本一致。Tm计算结果结 语核酸分子的解链温度对核酸药物的稳定性、有效性等研究有重大意义,在核酸药物研发生产过程是一个重要的参数指标。岛津紫外配合Tm分析系统,可以满足轻松获取Tm曲线,通过中线法或者微分法均可计算Tm温度,满足测试要求,为核酸药物质量控制提供了可靠数据。更多寡核苷酸药物分析,敬请持续关注。撰稿人:王娟娟本文内容非商业广告,仅供专业人士参考。
  • 浅议基因测序技术的代际
    编者按 NGS技术,到底是下一代测序,还是二代测序?NGS到底包含了哪些技术?关于NGS的定义,一直困扰着业内外人士。曾参与“国际人类基因组单体型图计划中国卷”项目 、“炎黄一号” 等多个重大科研项目的基因测序专家王威博士,近期发表了文章《浅议基因测序技术的代际》,文中清晰地解释了测序技术代际问题。小编特将该文转载,欢迎各位交流探讨。 正文: 相对于较早出现的Sanger双脱氧核苷酸测序技术(简称Sanger测序),2005年后出现的NGS测序技术,使得基因组研究进入高通量时代,促进了基因组学科学研究及技术转化应用。 在基因组学领域,NGS通常是next-generation sequencing的缩写,意为下一代或者新一代测序技术,亦有人称之高通量测序技术(High-throughput sequencing,HTS)、二代测序技术(second-generation sequencing)。至于到底哪些测序技术属于NGS,并无明确统一的界定,目前主要有两种观点,存在些许差别。 01 对NGS的最初种理解 自动化的Sanger测序技术,以Sanger技术为起点,新出现的技术被称为下一代测序技术(简称NGS)1。 这些新技术涉原理,依赖不同的模板制备方法(例如乳液PCR、DNA纳米球、桥式扩增 、单分子模板)、序列测定方法(焦磷酸测序、基于可逆终止化学测序、基于连接反应的测序、磷酸连接荧光核苷酸或实时测序)、基因组比对与组装方法等。 这种观点认为目前的大规模并行测序技术都属于NGS,包括Roche/454测序、Illumina/Solexa测序、Life的SOLiD与ION系列以及华大基因的BGISEQ/MGISEQ系列等;此外,持这种观点的学者还将Helicos BioScience、Pacific BioSciences以及Oxford Nanopore的单分子及纳米孔测序技术均纳入NGS技术,并未单独将其定义为第三代测序技术1~3。 02 对NGS第二种理解 另一种理解认为 NGS主要是指基于大规模并行测序(massively parallel sequencing,简写MPS)的测序技术4。 大规模并行测序的关键技术诞生于上世纪90年代,于2005年商业化进入市场。这一技术同时对成百上千万的待检测DNA模板分子进行测序,加大了测序反应的效率与通量,使得一次测序实验便能够完成一个或更多的人类基因组序列的测定。尽管不同的大规模并行测序技术原理各不相同,但有一些共同特点,杨焕明老师有非常简洁的总结5:(1)“裸”、“密”并行,每一个分子簇为一个裸露的测序反应,使得测序通量提高了几个数量级;(2)测序通量 的提高,损失了下机的读长(初期只有约20个碱基,现在已有显著提升)。 尽管MPS的标本制备和测序原理不同于Sanger测序,但它与Sanger 测序一样,仍需要对测序分子进行扩增,因而也不可避免的增加引入序列误差的概率和GC偏差,也不能直接分析不同修饰的核苷酸5。 按照这一观点,单分子测序不属于NGS,而是更加新的技术。 03 NGS:Next-generation 还是 Now-generation? 随着MPS成熟稳定,在2008~2010年左右,NGS有了一个新的含义,即Now-generation sequencing6、7,直译为“当代”或者“现代“测序技术。 也就是说,“下一代”测序技术变成了“现代”测序技术。不过,Now-generation sequencing这一说提法并未被广泛使用。因此在多数情况下,NGS主要是指Next-generation sequencing。 在高通量测序技术刚刚问世时,人们并没有预料到测序技术的后续发展如此迅猛。因此,无论是Next-generation 还是Now-generation,其实都是一个比较笼统的提法,本身也意味着变化和发展。这也就不难理解为什么目前对于哪些技术属于NGS会存在不同观点了。 04 关于测序技术的代际 上述话题牵涉出所谓的测序技术代际的问题。然而目前来看似乎并没有统一的认定。 如果按照上文对NGS的理解,目前的代际划分似乎更多的用来区分Sanger 测序与非Sanger 测序。这两类技术在原理和测序通量上都有存在较大差异,但也有相通之处。例如,无论是Sanger双脱氧核苷酸测序,还是高通量测序中的边合成边测序技术,或者是基于连接反应的测序,其原理都依赖核苷酸的聚合反应。 目前测序仪代际划分的分歧点主要围绕“二代测序”和“三代测序”技术。“三代测序”这种提法出现于2008~2009年,当时主要是指有别于NGS的新型测序技术。一些学者认为单分子测序、实时测序以及核心方法有别于已有技术的方法,应是三代测序技术的定义性特征。目前,三代测序通常是指无需DNA扩增的单分子测序技术4。这种技术从原理与特点来看,有其自身优势(比如测序能够获得较长的读长,有望解决单倍体基因组组装和结构变异识别),是测序技术发展的重要思路。 有学者指出,目前测序技术代际划分,也许更多的是出于商业上的考虑,因为人们通常习惯性的认为技术代际升级代表了技术的演化。例如,Pacific BioSciences 公司在其发表的论文中,将单分子实时测序技术与NGS进行了区分,被归入三代测序技术8,其用意是不言而喻的。 单分子测序技术早在2003年就有概念性的论文发表9。2008年,Helicos BioSciences推出了单分子测序仪,随后Pacific BioSciences与Oxford Nanopore也推出了各自商业化的测序仪。不过,也许是由于单分子测序对技术体系要求更高,这项技术的发展远不如当初人们预想得那般迅猛,直至今日尚未达到NGS这样的市场规模。这期间,Helicos BioScience已于2012年破产,尽管其技术符合目前对三代测序技术的界定。 随着更多的应用,单分子技术也陆续暴露出一些技术问题。例如,在近期的一篇论文中,研究人员对利用长读长测序技术组装的人类基因组进行分析,发现与短读长组装相比,长读长组装的蛋白编码区域含有更多的错误10。尽管有学者指出,新的生物信息学工具已经能够改善纳米孔测序的组装结果,有望从Oxford Nanopore和PacBio的测序数据中获得高质量的序列11。但是,真正的长读长技术,只有达到或超越现有技术的性能和准确度时,才有实用意义。 从测序技术应用角度来看,某些应用也许并不需要长读长的单分子测序技术。例如,基于外周血游离DNA测序的无创产前检测,因目标DNA本身就是一百多个碱基的短片段,采用NGS就能够比较好的进行检测与分析,且成本也在逐渐下降。此外,通过一些间接技术手段,比如华大智造近期推出的stLFR测序12,也能够在全基因组范围内提供基因组长片段信息,包括分型、突变及基因组结构变异。 单分子测序技术从原理上具备潜力与优势,值得进一步研发完善。但是未来能否达到预期的市场规模,甚至成为主流测序技术,还需要经过实践检验。技术发展代际内的升级相对比较频繁,而代际间的升级则相对缓慢,只有核心原理有创新并且跨越式超越前一代的技术,也许才更适合被定义为新一代技术。 总之,目前测序技术代际划分较为模糊,且测序技术目前仍处于快速发展中。其中,SANGER与 NGS均引领了基因组技术,推动了基因组学科技进步。前者为人类基因计划(HGP)做出了主要贡献,目前仍在是很多生物学与医学实验室的常规技术;后者则是当前基因组研究与应用的主流技术,直接为基因组测序的广泛应用扫清了经济上的障碍,使其不仅能更好的服务于科研,也正在成为医学界以及其他应用领域的重要工具。单分子技术则是测序技术发展的重要方向,开始崭露头角,但成熟与完善尚需时日。以上这些测序技术,均有各自的特点,也有其适合的应用范围与应用场景。 附笔: 写这篇小文的初衷,是近期因为有朋友提出过此类问题,也有人常将测序技术类比IT技术的发展。因此在这里分享自己的观点,也期望与持不同意见的朋友交流探讨。 特别感谢两位曾经参与过水稻基因组计划等早期基因组大项目的同事张建国博士与李胜霆博士,在春节假期期间分享了各自的观点,并协助完善本文。 目前测序技术的代际划分并没有统一的认定。即使一个人,其观点也会随时间与认知的改变而发生某些变化。在2008年前后,我们单位的NGS平台刚刚进入规模化稳定运行阶段。也正是那个时候,出现了“三代技术”。业内不少人都认为这类单分子技术很快将取代NGS。但事实并非如此。我曾经的观点认为单分子测序技术属于三代技术,而目前则倾向于将其归入NGS。 关于测序技术的代际,可以看看IT的代际。百度上是这样划分的:初代计算机被称为电子管计算机,第二代计算机被称为晶体管计算机,第三代计算机成为中小规模集成电路计算机,第四代计算机成为大规模和超大规模集成电路计算机,第五代计算机,指具有人工智能的新一代计算机。IT的代际划分主要源自技术原理的革新(第五代感觉主要是软件上的革新),是认识计算机发展史和技术原理的需要,具有客观存在的价值。新一代在性能上全面超越前一代。 从认识论的角度来讲,大家习惯于根据技术划分代际,代际升级代表了技术的演化。只有核心原理新并且跨越式超越前一代的技术才能被称为新一代。新一代的出现首先是从技术原理上提出,有希望和潜力超越现有技术,然后从商业角度宣传,有一些最终行不通的被淘汰,能发展成熟超越前一代的才会真正成为新一代。也有可能方向是对的,但是技术暂时跟不上,会经历曲折的发展。这种代际认识在回顾历史的时候最清楚。 王威 博士 华大智造副总裁,医学遗传学研究员,科学技术委员会成员。 先后参与、负责完成“国际人类基因组单体型图计划中国卷”项目 (简称 HapMap 计划) 北京区域的基因分型任务、初个中国人基因组图谱的绘制工作 (简称“炎黄一号”) 等多个重大科研项目。主要从事基因组医学新技术开发、推广与应用。
  • 【飞诺美色谱】罕见遗传性疾病的救星——寡核苷酸药物
    新冠疫情促使mRNA技术快速发展的同时也使人们开始高度关注核酸药物这一领域。核酸药物包括反义核酸(ASO)、小干扰RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)、小激活RNA(saRNA)、信使RNA(mRNA)、适配体(aptamer)、核酶(ribozyme)、抗体核酸偶联药物(ARC)等,是基因治疗的一种形式。除mRNA药物外,其他几种核酸药物,基本上都是由100个以内的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸单链或双链组成,所以也称为寡核苷酸药物。与mRNA药物编码产生目的蛋白不同的是,寡核苷酸药物主要是通过碱基互补配对原则与DNA、mRNA或者pre-mRNA配对,通过基因沉默、非编码RNA抑制、基因激活等一系列机制来调节基因表达。已上市寡核苷酸药物化学结构(Nature reviews drug discovery)寡核苷酸药物对比于小分子药物及蛋白药物,具有多方面的优势,首先可根据目标靶点设计碱基序列,靶点明确、特异性强;其次寡核苷酸药物从转录后水平进行治疗,可选择的靶点丰富,特别是能覆盖蛋白质不可成药的靶点以及开发由基因缺陷导致的遗传性疾病的相关靶点;另外寡核苷酸药物由于序列短,可采用化学合成方法,完成目标序列的装配,并结合生物学测试筛选有效序列,能够避免盲目开发,节省研发时间。但是寡核苷酸药物在研发中也面临着诸多挑战。寡核苷酸在细胞外稳定性低,易被核酸酶降解,加上分子量及负电荷的因素,难以进入细胞,因此在研发过程中,使其保持稳定的结构以及能够有效递送的传递载体是主要考虑的两个因素。寡核苷酸核酸分子的改造主要包括磷酸骨架,碱基以及糖环的修饰,在改造中需要考虑多个因素,包括稳定性、药代动力学、碱基配对的亲和力等,最重要的是能够保留被功能酶及功能蛋白所识别的功能。因此,在前期研发过程中,需要对寡核苷酸进行精确的结构表征及定量。丹纳赫生命科学旗下SCIEX 的高分辨质谱ZenoTOF&trade 7600系统具有一系列对寡核苷酸进行分析的方案,可进行寡核苷酸的分子量分析并进行杂质检测,可对寡核苷酸进行碱基序列鉴定。由于Zeno TOF 7600具有EAD和CID两种互补的碰撞模式,不但能产生丰富的离子碎片信息,还会保留完整的核酸低丰度修饰信息。寡核苷酸分子量及碱基序列的检测高分辨质谱ZenoTOF&trade 7600系统另外,高分辨质谱ZenoTOF&trade 7600系统还能实现对寡核苷酸的定量分析,线性范围可达 5 ng/mL – 10000 ng/mL,可以完成寡核苷酸药物在研发阶段的药代及多种代谢产物同时鉴定及定量分析。在研发阶段,对于采用同一种仪器进行鉴定及定量,可避免定量方法转移时造成的方法优化时间浪费,可帮助用户加快研发进度。艾杰尔-飞诺美寡核苷酸定量分析前处理试剂盒高分辨质谱对寡核苷酸进行定量分析在寡核苷酸药物种类中,反义寡核苷酸由于是单链,分子量小,递送较其他寡核苷酸容易,且反义寡核苷酸功能多样,可上调或下调基因表达,成为研发罕见遗传性疾病药物中最关注的种类。为了帮助研究人员开发这类针对罕见遗传性疾病患者的ASO疗法,FDA还发布了指导这类ASO疗法非临床检测的指南。在已上市的寡核苷酸药物中,大部分都是用于治疗罕见遗传性疾病的反义寡核苷酸药物,特别是杜氏型肌营养不良,已经上市了针对不同基因位点的四款产品。药品名治疗疾病药物种类上市时间Fomivirsen巨细胞病毒视网膜炎反义寡核苷酸1998.8(已退市)Pegaptanib年龄相关性黄斑变性核酸适配子2004.12Mipomersen纯合性家族性高胆固醇血症(hoFH)反义寡核苷酸2013.1(已退市)Defibrotide肝静脉闭塞反义寡核苷酸2016.3Eteplirsen杜氏型肌营养不良(DMD基因外显子51)反义寡核苷酸2016.9Nusinersen脊髓性肌萎缩症 (SMN2基因外显子7)反义寡核苷酸2016.12Patisiran遗传性甲状旁腺素淀粉样变性小干扰RNA2018.8Inotersen遗传性甲状旁腺素淀粉样变性反义寡核苷酸2018.10Waylivra家族性乳糜微粒血症综合征反义寡核苷酸2019.5Givosiran急性肝卟啉症小干扰RNA2019.11Golodirsen杜氏型肌营养不良(DMD基因外显子53)反义寡核苷酸2019.12Viltolarsen杜氏型肌营养不良(DMD基因外显子53)反义寡核苷酸2020Lumasiran原发性高草酸尿症I型小干扰RNA2020Inclisiran成人高胆固醇血症及混合性血脂异常小干扰RNA2020Casimersen杜氏型肌营养不良(DMD基因外显子45)反义寡核苷酸2021.2.25已上市的寡核苷酸药物(根据网上资料整理)由此可见,对罕见病的诊断也非常重要,很多罕见遗传病是由几十甚至上百种突变引起的,而且不同区域的患者可能存在不同的基因变异位点,NGS是现在进行高通量基因检测的重要手段。丹纳赫生命科学旗下Integrated DNA Technologies(IDT)公司(中文名称:埃德特)是全球领先的NGS试剂供应商,其外显子捕获产品Exome Research Panel V2特别适合进行遗传性疾病的全外显子组测序,助力遗传性疾病的诊断。V2由 415,115 条单独合成且经过质控检验的 xGen Lockdown 探针组成。探针组跨越人基因组的 34 Mb 目标区域(19,433 个基因),并且覆盖 39 Mb 的探针空间(即由探针覆盖的基因组区域)。探针是使用全新的“捕获感知”(capture-aware) 算法进行设计的,并进行了专有的脱靶分析,确保实现完整的设计覆盖度。探针组中的所有探针均严格按照 ISO 13485 标准进行生产。每条探针均经过质谱法和双定量测量检验,确保探针的质量及在探针库中具有适当的代表性。IDT Exome Research Panel试剂盒
  • 一文知晓:纳米孔测序技术
    在基因测序领域,谁控制仪器,谁就会赢得天下,从ABI的3730测序仪到后来的illumina的测序仪,都可以证明这点,这个行业目前是由上游技术驱动的,对技术的依赖度很强。测序公司、诊断公司都加大对测序技术领域的投资,以期能在未来基因测序爆发时期,获得可观的市场份额。根据安永的最近一份报告显示,未来5年内,基因测序的仪器市场规模同基因测序服务基本相当。   罗氏、illumina公司都加大对新技术的投资。2012年,Roche公司宣布基因测序仪454从测序市场退出时,就加紧在纳米测序技术领域的布局,先后投资了Genia Technologies公司和Stratos Genomics公司。illumina公司也早就盯上了纳米孔测序技术,是牛津Nanopore公司的主要股东之一。然而令illumina公司恼火的是,2013年10月,牛津Nanopore公司回购了illumina公司持有的13.5%股份,从而保持该公司更加独立运营,此次回购价值共超过5640万美元。   纳米孔测序原理   在A,T,G,C四种不同的脱氧核苷酸通过纳米孔进入的时候,其所引起的电流变化也是不一样的,随即可通过电流来检测DNA序列。双链DNA直径为2nm,单链DNA直径为1nm,所以采用的纳米孔尺寸有着近乎苛刻的要求。纳米孔:分为生物纳米孔和固体纳米孔,生物纳米孔:a溶血素(一般嵌入在双层脂膜当中),最窄直径尺寸为1.5nm,可允许单链DNA分子通过。但是生物纳米孔对稳定性、电流、噪声等方面有很高的要求。固态纳米孔:由硅及其衍生物制造,通过电子束和离子束在硅或其他材料薄膜上钻出纳米尺度的孔洞。固态纳米孔在稳定性、电流噪声、工艺集成方面有着显著的优势,但是目前有技术瓶颈,以及造价高昂。   固态纳米孔工艺   固态纳米孔的制作与半导体工艺的结合使得DNA测序芯片的大规模生产成为可能. 2001年,Li等人使用聚焦离子束在 Si3N4 薄膜上制作出了直径61 nm 的孔,随后又采用 Ar将孔径缩小到了1.8nm。2003年, Storm等人用高能电子束在SiO2薄膜上制作出了直径2 nm的孔. 如今, 人们已经可以在很多材料上制作出亚 10 纳米尺度的固态纳米孔,例如,SiNx,SiO2,SiC,Al2O3等. 此外, 石墨烯因其本身超薄的结构和特殊的电子特性也作为薄膜材料的一种新选择,它的超薄的单原子层结构十分适合隧道电流的测量。   纳米电极制作   纳米电极的制作在测序用纳米孔制造工艺中也是一项重要的挑战。前文提到, 纳米电极的形状、与纳米孔重合度的好坏直接影响到电流信号的好坏, 因此要在纳米尺度制作出形状规则、 电学特性良好的电极并不容易。   目前研究者们所做的工作都是在实验室中对单个纳米孔进行研究, 而无法将其运用到商业中. 到目前为止, 还没有办法能够快速制作出直径大小均一且都在5 nm以下的纳米孔阵列, 在DNA测序芯片向商业化转变的道路上, 这是必须解决的一个问题. 但是, 相信随着半导体制造工艺和纳米电子学的不断发展, 人们一定会制作出高质量的纳米孔芯片。   产品:Minion   由英国公司Oxford Nanopore开发设计MinION测序仪则拥有很长的读长,而且只有普通U盘大小,由一个传感器芯片,专用集成电路和一个完整的单分子感应测试所需的流控系统构成,可随身携带,理论上可实现想测就测。日前该测序仪已投入市场使用,或许未来它将基因测序仪变得如同手机一样普通、便捷、廉价。该技术被MIT Technology Review杂志评为&ldquo 2012年10大年度科技突破之一&rdquo 。但是其错误率很高,据称有35%的错误率,平均10个碱基,就有3.5个测序错误。这也意味着基因突变检测成为纳米孔测序的禁区,也成为纳米孔测序的致命弱点,并让其长读长的优势黯淡无光。   面临挑战   虽然纳米孔测序的优点十分明显,与前几代技术相比在成本、速度方面有着很大优势,但是目前还处在起步阶段,从测序原理到制造工艺都存在有许多问题,许多技术也都只停留在理论阶段。其面临的挑战主要是如下几个部分:   电流检测系统:电流识别最短距离为3nm,而且目前的材料几乎很难寻找到孔径这么小的材料。   纳米膜系统:限制目前的纳米孔大小,目前有关纳米孔制作方面仍有很大的阻力   数据分析系统:即使很多人获取这些数据,但是对于数据的运行和分析仍旧存在很大障碍。   主要纳米孔技术公司   Base4, UK   Fullgen, Argentina   Genia, USA, California   INanoBio, USA, Arizona   Ionera, Germany   Izon Science, New Zealand   Nabsys, USA, Providence   Nanion, Germany   Nanopore, USA, New Mexico   Noblegen Biosciences, USA, Massachusetts   Oxford Nanopore Technologies, UK   Quantapore, USA, California   Quantum Biosystems, Japan   中国从事相关技术研究学者   龙亿涛   华东理工大学,上海市曙光学者,&ldquo 东方学者&rdquo 特聘教授,研究方向纳米光谱电化学,纳米通道单分子分析,仿生界面等。   赵清   北京大学凝聚态所副教授,主要从事ZnO、AlN纳米线的制备、掺杂,表征,电学,光学,场致电子发射性能方面的研究。   注:部分内容来自生物通和贺建奎博客
  • 双刃剑?—与全球最聪明的基因测序公司面对面
    人类基因组测序的成本真的已经降到了约1000美元了吗?完成一次测序只需要一天时间?这些听起来很神奇的事情,究竟是如何发生的?基因测序,会不会是一把双刃剑?   近日在上海自贸试验区内,由美国麻省理工学院《麻省理工科技评论》最新评出的&ldquo 2014年度全球创新企业50强&rdquo 第一名&mdash &mdash 伊卢米纳公司的首席执行官杰· 弗拉特利与中国媒体面对面。   伊卢米纳,这个名字在科学界比较有名,对大众而言依然很陌生。他们从事着比谷歌和微软更&ldquo 神秘&rdquo 的行业&mdash &mdash 制造基因测序仪。记者就一连串基因测序的话题,提问这家全球&ldquo 最聪明&rdquo 的创新企业。   基因测序之&ldquo 变&rdquo   在中国人的记忆中,认识基因遗传理论是从中学课本里介绍孟德尔的豌豆杂交试验开始的。遗传定律被发现是在19世纪60年代。到了20世纪初,遗传学家摩尔根通过果蝇遗传实验,认识到基因存在于染色体上,并且在染色体上呈线性排列。   再过了大约半个世纪,随着分子遗传学的发展,尤其是沃森和克里克发现DNA的双螺旋结构以后,人们进一步认识了基因的本质,即基因是具有遗传效应的DNA片断。研究结果还表明,每条染色体一般含有一个长长的DNA分子,每个DNA分子上有成百上千个基因,每个基因含有成百上千个脱氧核苷酸。   不过中学老师都会告诉你,就算知道了这些,人类依然无法了解人类自身的基因图谱。要测出成人染色体中所包含的30亿个碱基对组成的核苷酸序列,依靠的是&ldquo 人类基因组计划&rdquo ,它由美国科学家于1985年率先提出,于1990年正式启动,美、英、法、德、日以及中国科学家共同参与了这一预算达数十亿美元的人类基因组计划。   有人把人类基因组测序计划与阿波罗登月计划相提并论,认为它对人类历史而言十分伟大。这项计划集合了全世界顶尖科学家的力量,最终在2000年完成了人类基因组草图的绘制,并于2001年公之于众。到2005年,人类基因组计划的测序工作宣告基本完成。   显然,在2005年之前,动辄上亿美元的高额测序成本,使得人类基因组测序还停留在高端研究的领域。不过,这样的情况在2005年-2007年发生了变化,多家公司相继推出了&ldquo 高通量测序仪器&rdquo ,使得测序成本下降到了几百万美元的级别,这种通过技术改进实现的测序,也被称为&ldquo 二代基因测序&rdquo 。   杰· 弗拉特利告诉记者,时隔不到10年,又经过了数轮技术改进与革新,到了2013年,伊卢米纳公司发布了&ldquo Hiseq XTM Ten&rdquo 成套设备,又将人类基因组测序成本大幅降低,速度再次提升。   不过,对普通人而言&ldquo 1000美元测人类基因&rdquo ,听上去好像还是一个神话。   &ldquo 快捷&rdquo 与&ldquo 低成本&rdquo 是如何实现的?   来自伊卢米纳公司的消息说,今年年中,上海自贸试验区就将迎来一整套&ldquo Hiseq XTM Ten&rdquo ,它将完全服务于自贸区内的研发平台企业&mdash &mdash 诞生于中国的药明康德公司的科学研究。   这将是全球第九套、中国第二套投入科研运用的此类大型设备,在中国境内的另一套设备目前在北京服务于一家名叫&ldquo 诺禾致源&rdquo 的公司。此外,此类大型设备的购买和应用者主要分布在美国、澳大利亚、韩国等。   在基因测序领域,这样的&ldquo 快捷&rdquo 与&ldquo 低成本&rdquo 是如何实现的?   弗拉特利告诉记者,公司的核心竞争力是&ldquo 多重合一&rdquo 的,这一强大的设备将激光技术、生物分子技术、表面化学、软件分析、电子学等多学科相关的新兴技术综合在一起,实现了测序数据的高效产出。   药明康德方面介绍说,这样的成套设备好比是一个&ldquo 测序工厂&rdquo ,适合运行于大型基因组测序中心,为各类生命科学和生物医学研究提供海量、高效率的测序服务。据测算,在一天24小时内,此类设备可同时完成一套或多套人类基因组测序任务。   基因测序是双刃剑吗?   除了在基础研究、遗传学分析、生物制药等方面的应用,基因测序设备正在发挥更多的作用,人们也听到如今在医疗领域有一些机构和医院提到&ldquo 测序&rdquo 。   就在今年2月,中国国家食品药品监管总局和国家卫计委叫停未经审批准入的包括产前基因检测在内的二代基因测序(指获得技术改进后的高通量测序)产品和技术等在医疗机构临床诊断中的应用。   对此,记者采访从事相关领域研究的中国科学家和伊卢米纳公司时,他们也都表示理解中国政府迅速规范基因测序领域的政策意图,并认为政府监管和实施认证具有必要性。   &ldquo 对遗传性疾病有诊断与咨询意义的基因测序应当是在政府授权、各部门严格监管下展开,卫计委等叫停的测序,与近年来一些测序服务机构、厂家宣称可以提供基于基因测序的咨询与诊断服务,以及出具那些未获认证的咨询及诊断书有关,没有经过充分基础与临床研究的基因咨询与诊断极易出现假阳性、假阴性,对接受测序者是极不负责的。&rdquo 中国科学院上海生命科学研究院神经科学研究所研究员仇子龙说。   据了解,所谓高通量的&ldquo 二代测序&rdquo ,曾被一些机构异化为&ldquo &lsquo 一滴血&rsquo 包测百病&rdquo 等噱头,其背后则裹挟着巨大的商业利益。   仇子龙分析,叫停临床诊断中的基因测序,不意味着在科研领域不能使用测序方法和仪器。在规范的科学研究过程中,若使用基因测序方法应用人类样本对遗传性疾病进行研究,首先必须与医生团队进行合作,得到医院的医学伦理批准,在获得国家相关政府部门的许可、监管后进行。   仇子龙说,科研人员期望对诸多重大疾病如癌症、自闭症等进行有针对性的基因测序,最终确认基因突变与复杂重大疾病的关系,从而推动科研突破,惠及普通患者。但这是一个漫长的过程,必须循序渐进。   专家强调,随着基因测序技术的不断进步,蕴藏于人类遗传领域的众多信息和奥秘将逐步被&ldquo 破译&rdquo 。在利于前沿高科技解码基因信息的同时,也要尊重人类本身,即必须是依法合规的,秉持伦理性和公益性,并保护隐私和信息安全。
  • 北京基因测序仪共享市场分析 赛默飞竟然险胜Illumina!
    测序技术在几十年发展历程中不断吸收其他领域的技术,如物理领域的纳米技术和激光技术,化学领域的荧光标记核苷酸技术,生化领域的毛细管先用分析技术和信息领域的高密度芯片技术,并将他们融为一体,形成了现代科学研究中的强力工具。测序技术和生物信息学得迅速发展进一步扩大了基因测序在临床诊断领域的应用,其在家庭和消费级基因检测领域的应用落地持续发展推进。NGS关键技术在国外企业手中 国产企业艰难发力自2010年开始,中国整个基因测序行业的市场规模一直处在高速发展阶段,中位同比增速达40%。据估计,2020年国内基因测序市场规模近140亿元。考虑到国内人口数量带来的巨大红利,基因测序产业在中国发展潜力巨大。基因测序仪是基因检测产业链上游仪器平台,对仪器设备研发企业来说,实际创造大量利润的却是与设备配套的耗材和试剂。垄断测序仪与配套试剂耗材的企业具有“绝对话语权”。2014年Illumina试剂提价,曾导致华大基因利润急速下滑,年底其净利润增长率为-79.3%,可见上游设备生厂商对中游服务提供商的影响力之巨大。与其余仪器设备不同,由于研发技术门槛较高,上游基因测序仪厂家数量很少。据统计,目前全球范围内的 NGS 基因测序仪不足 8000 台,分布于 60 多个国家和地区,其中 Illumina 公司的 HiSeq 2000、Genome Analyser 2x、MiSeq 和 NextSeq 等测序平台市场份额占比高达 83.9%;赛默飞的 SOLiD、Ion Torrent 和 Ion Proton 等测序平台市场份额占到 9.9%;Roche 公司的 454 平台市场份额占比 5.3%。Illumina 和 Thermo Fisher 设备占比超过 90%,上游基因测序设备制造已形成垄断。近年来,国产企业开始发力基因测序上游,涉足基因测序仪器研发。出现诸如华大智造、真迈生物、中科紫鑫、塞纳生物、齐碳科技等几家具有自主研发能力的国产基因测序仪企业。其中华大智造无疑是佼佼者。华大智造DNBSEQ-T7基因测序仪(原名MGISEQ-T7) 国产华大基因在2013年反向收购美国测序上市公司CG,之后设立华大智造专注国产基因测序仪研发。近几年华大智造发展迅猛,市场占有率不断提高,据华大智造,公司占据了中国二代测序(NGS)35%的市场份额。但下游应用企业平台迁移成本巨大,目前国产二代测序厂商发展依然面临巨大压力。二代测序辉煌十载 三代测序引领未来DNA测序技术起源于上世纪70年代,Sanger提出了双脱氧核苷酸末端终止法,同年A.M.Maxam和W.Gilber也提出了化学酶解法,第一代测序技术诞生。2005年,454 Life Sciences公司开发出全球第一台商业化边合成边测序测序仪,第二代测序仪诞生,由此拉开了基因产业发展的序幕。2008年,Helicos Biosciences推出了首台单分子测序仪,标志第三代测序技术来临。尽管三代测序未来前景可期,当前全球基因测序行业的基石依然还是第二代基因测序仪。单分子实时测序和纳米孔测序这两种技术在当下长读长测序领域占据主导地位。SMRT 和纳米孔测序技术分别于 2011 年和 2014 年商业化发布,目前 SMRT 技术的主要拥有者为 Pacific Biosciences,纳米孔测序技术则由牛津纳米孔领衔,中国的齐碳科技也于 2020 年 9 月发布了首款自主研发的纳米孔测序仪 QNome-9604。赛默飞、Illumina势均力敌 Miseq系列为最大赢家进入21世纪,基因测序技术已经进入遍地开花的阶段,层出不穷的新应用接踵而至,而基因测序仪也已经开始进入寻常百姓家,为广大科研单位和企事业单位提供了坚实可靠的仪器工具。根据全国大型共享科学仪器平台显示,全国有近600台基因测序仪可供共享借用。其中北京、上海成为共享数量最多的地区,超共享基因测序仪总量三成。仪器信息网对北京地区的共享基因测序仪用户单位、仪器型号及学科领域进行了分析。测序仪应用学科领域分布共享测序仪单位包括北京大学、中国农业大学、清华大学这样的高校,也包括中国检验检疫科学研究院、北京市心肺血管疾病研究所、北京生命科学研究所等科研机构,亦有公安部物证鉴定中心等政府部门。其中测序仪在生物学领域的研究与应用占比最高,为41.2%,其次是医学领域,占比为27.1%。此外还包括农学、林学、畜牧兽医、法医等基因测序科研和典型应用领域。共享测序仪品牌分布有意思的是,在北京地区所有共享基因测序仪品牌中,赛默飞占比略超测序巨头Illumina,以41.9%的占比险胜位居第一。Illumina以39.5%的占比紧随其后,位列第二。赛默飞旗下Life Technologies早年生产的SOLiD 4、Ion Torrent、3500XL、Ion PGM等成为测序仪的经典机型,在应用市场颇受用户认可。共享测序仪型号分布共享基因测序仪型号近30种,多为二代测序,一代测序也有部分。共享数量最多的前十个型号分别为MiSeq、Hiseq 2000、3130XL、PyroMark、3500、Ion Torrent、GeXP、3500XL、3730和NextSeq 500。Miseq系列基因测序仪在共享单位中使用量最多,能占到15.5%,用目前一句潮流的话来说,Illumina的Miseq系列基因测序仪是YYDS(永远的神)。MiSeq采用可逆链终止物和合成测序法,于2018年正式在中国发布,也是Illumina唯二拥有的NMPA测序仪产品之一。单个仪器上整合了扩增、测序和数据分析的新一代测序仪,每次运行能产生超过1 Gb的数据,且占地面积仅为2平方英尺。具有革命性的流程和准确性,这让它成为快速且经济高效的遗传分析的理想平台。Hiseq2000是Illumina于2010年推出的二代测序仪。其测序原理与Genome Analyzer II测序系统相似,仍采用可逆终止法的边合成边测序技术。该技术通过将基因组DNA的随机片断附着到光学透明的表面,这些DNA片断通过延长和桥梁扩增,形成了具有数以亿计cluster的Flowcell,每个cluster具有约1000拷贝的相同DNA模板,然后用4种末端被封闭的不同荧光标记的碱基进行边合成边测序。这种新方法确保了高精确度和真实的一个碱基接一个碱基的测序,排除了序列方面的特殊错误,能够测序同聚物和重复序列。Hiseq 2500是Hiseq 2000的升级版。3130xL-3730xL是赛默飞旗下Life Technologies 早年发布的一代基因测序仪产品。采用桑格-毛细管电泳测序法,具有高读长,准确度一次性达标率高,能很好处理重复序列和多聚序列。但其通量低,样品制备成本高,使之难以做大量的平行测序。其余型号不再作一一分析。需要说明的是,许多共享的基因测序仪采购年份较久远,甚至有2002年采购并启用的仪器设备,所以以上数据不能代表现今测序市场的份额占比,结果仅供读者参考。附:基因测序仪专场
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    一. 测序仪对比测序技术代表仪器读长通量准确度成本Sanger法ABI 3730xl DNA Analyzer500-800bp0.096Gbp/天99.99%0.24美分/bpIlluminaHiSeq X Ten System150bp1800Gbp/运行99.9%0.01美分/bp华大智造MGISEQ-2000200bp(单端)或2×150bp(双端) 60Gbp/运行 99.9% 0.015美元/bpRoche 454GS FLX+ System700bp0.7Gbp/运行99.9%0.02美元/bpABI SOLiDSOLiD System 5500xl75bp120Gbp/运行99.94%0.13美分/bpPacBioSequel II System10kb60Gbp/运行99%0.15美元/bpNanoporeMinION Device100kb30Gbp/运行90%0.02美元/bpHelicosHeliScope Single Molecule Sequencer25-50bp28Gbp/运行未知  1. ABI 3730xl DNA Analyzer图源自thermofisher官网  1.1. 相关原理   DNA测序:基于Sanger法的原理,利用DNA聚合酶在体外DNA复制过程中随机掺入带有荧光标记和终止子的双脱氧核苷酸(ddNTPs),从而得到不同长度的DNA片段。这些片段经过电泳分离后,通过激光激发和CCD检测,得到每个碱基发出的荧光信号,从而确定DNA的碱基序列。   片段分析:基于荧光检测的原理,利用不同颜色的荧光染料标记不同长度或类型的DNA片段,如微卫星、SNP、AFLP等。这些片段经过电泳分离后,通过激光激发和CCD检测,得到每个片段发出的荧光信号,从而确定片段的大小或等位基因。  1.2. 主要组成  ABI 3730xl DNA Analyzer仪器是一种高通量的DNA测序和片段分析的平台,它可以同时使用48或96根毛细管进行电泳分离和荧光检测。   测序仪主机:包含电泳系统、自动进样系统、激光系统、光学系统、温控系统、聚合物输送系统等多个模块,用于控制仪器的运行和数据的采集。   计算机工作站:预装用于仪器控制、数据收集和样品文件自动分析的软件,如Data Collection Software、Sequencing Analysis Software、SeqScape Software、GeneMapper Software等。   毛细管阵列:提供预组装的48根或96根毛细管阵列,它们与业界标准的96孔和384孔板配合使用。毛细管为内部无涂层毛细管,可提供300次的运行质保。   DNA测序试剂和耗材:包括BigDye Terminator循环测序试剂盒、GeneScan分子量标准品、片段分析标准品、POP-7聚合物分离胶等。  1.3. 主机模块   电泳系统:负责将DNA片段在毛细管中进行电泳分离,根据不同长度的DNA片段在电场中的迁移速度不同,将它们按照从小到大的顺序排列。电泳系统由高压电源、电泳缓冲液、毛细管阵列等组成。  o 高压电源:提供高达30kV的电压,使DNA片段在电场中迁移。  o 电泳缓冲液:提供电导性和pH稳定性,使DNA片段在毛细管中顺利运行。  o 毛细管阵列:提供预组装的48根或96根毛细管,它们与业界标准的96孔和384孔板配合使用。毛细管为内部无涂层毛细管,可提供300次的运行质保。   自动进样系统:负责将样品从96孔或384孔板中自动吸取,并注入到毛细管阵列中。自动进样系统由进样针、进样泵、进样阀等组成。  o 进样针:用于从样品板中吸取样品,并通过进样阀将样品注入到毛细管中。  o 进样泵:用于控制进样针的吸取和释放动作,以及进样量的大小。  o 进样阀:用于控制进样针与毛细管之间的连接和断开,以及进样时间的长短。   激光系统:负责将激光光束照射到毛细管阵列的出口处,激发荧光信号。激光系统由激光器、光纤、光学开关等组成。  o 激光器:提供单波长、505nm、固态、长寿命的激光光源,用于激发荧光染料。  o 光纤:用于将激光光束从激光器传输到毛细管阵列上。  o 光学开关:用于控制激光光束的开启和关闭,以及激光功率的大小。   光学系统:负责将荧光信号收集并转换为电信号。光学系统由滤光片、透镜、CCD相机等组成。  o 滤光片:用于选择不同颜色的荧光信号,并过滤掉背景噪声。  o 透镜:用于聚焦和放大荧光信号,并将其投射到CCD相机上。  o CCD相机:用于将荧光信号转换为数字化的电信号,并传输给计算机工作站进行数据采集和分析。   温控系统:负责控制仪器的温度,保证测序的稳定性和可靠性。温控系统由温度传感器、风扇、加热器等组成。  o 温度传感器:用于监测仪器内部和外部的温度,并反馈给温控器进行调节。  o 风扇:用于散热和通风,维持仪器的适宜温度。  o 加热器:用于加热和保温,防止仪器的过冷。   聚合物输送系统:负责将聚合物分离胶从储存瓶输送到毛细管阵列中,作为电泳介质。聚合物输送系统由压力罐、气压调节器、流量计等组成。  o 压力罐:用于储存聚合物分离胶,并提供一定的压力,使聚合物分离胶能够流动。  o 气压调节器:用于控制压力罐的气压,以及聚合物分离胶的流速。  o 流量计:用于测量聚合物分离胶的流量,以及毛细管中的胶量。  2. HiSeq X Ten System图源自Illumina官网  HiSeq X Ten System是Illumina公司的产品。Illumina是一家生物技术公司,它的测序仪是基于桥式PCR和荧光检测的技术,也是目前最流行的二代测序平台之一。它的测序仪有多个系列,如NovaSeq、HiSeq、MiSeq、MiniSeq等,它们的核心技术原理是相同的,但在通量、读长、准确度、成本等方面有所不同。  2.1. 相关原理   文库构建:将待测DNA打断成小片段,并在两端加上特殊的接头(Adaptor),这些接头包含与流通池表面探针互补的序列(P5/P7)、用于区分不同文库的索引(Index)、以及用于测序引物结合的序列(Rd1 SP/Rd2 SP)。文库构建后需要进行质量检测和定量。   聚集体生成:将文库DNA片段注入到流通池中,并与表面探针杂交结合。然后进行桥式PCR扩增,使每个DNA片段形成一个聚集体。聚集体生成后需要进行温度变化和化学处理,使其单链化并去除P5端的DNA链,只留下P7端的DNA单链。   边合成边测序:将带有荧光染料和可逆终止子的四种dNTPs逐一加入到流通池中,并利用DNA聚合酶将它们连接到聚集体的DNA链上。每次只能加入一个碱基,然后用激光激发荧光信号,并用CCD相机记录每个聚集体发出的荧光信号,从而确定碱基序列。然后用化学剂去除荧光染料和可逆终止子,使下一个碱基可以继续加入。重复这个过程,直到完成所有的测序循环。   数据分析:将CCD相机收集到的荧光信号转换为原始数据(BCL文件),并进行质量控制和过滤,去除低质量的聚集体和信号。然后根据索引将不同文库的数据分离,并进行碱基识别(Base calling),将荧光信号转换为碱基序列(FASTQ文件)。最后根据不同的测序目的,进行后续的数据分析,如比对、变异检测、表达量计算等。  2.2. 主要组成   流通池(Flow cell):是一个微型的玻璃芯片,它的表面覆盖了数亿个固定在不同位置的寡核苷酸探针,这些探针与文库DNA片段的接头互补,可以通过杂交结合。流通池内部有多个通道,每个通道可以进行不同的测序反应。   聚集体(Cluster):是指通过桥式PCR在流通池表面扩增形成的由相同DNA片段组成的簇,每个聚集体可以发出荧光信号,从而被检测为一个读长(Read)。聚集体的密度和质量会影响测序的效率和准确度。   荧光染料(Fluorescent dye):是指用于标记不同碱基的四种荧光分子,它们分别对应A、T、C、G四种碱基,并发出不同颜色的光。荧光染料还带有可逆终止子,可以控制每次只加入一个碱基。   激光器(Laser):是指用于激发荧光染料发光的光源,它可以提供单波长、固态、长寿命的激光光束。   CCD相机(CCD camera):是指用于捕捉和记录荧光信号的设备,它可以将荧光信号转换为数字化的电信号,并传输给计算机进行数据分析。   计算机系统(Computer system):是指用于控制测序仪运行和处理数据的设备,它预装了用于仪器控制、数据收集和样品文件自动分析的软件,如BaseSpace Sequence Hub、Sequencing Analysis Software等。  3. MGISEQ-2000图源自华大智造官网  MGISEQ-2000测序仪是一种基于荧光检测的第二代测序技术,可以实现高通量、高精度、低成本的基因组测序。  3.1. 相关原理  o DNA测序:基于双端测序的原理,利用DNA聚合酶在体外DNA复制过程中随机掺入带有荧光标记和终止子的双脱氧核苷酸(ddNTPs),从而得到不同长度的DNA片段。这些片段经过桥式扩增后,形成单分子簇,然后通过四色荧光检测,得到每个碱基发出的荧光信号,从而确定DNA的碱基序列。  o 片段分析:基于荧光检测的原理,利用不同颜色的荧光染料标记不同长度或类型的DNA片段,如微卫星、SNP、AFLP等。这些片段经过桥式扩增后,形成单分子簇,然后通过四色荧光检测,得到每个片段发出的荧光信号,从而确定片段的大小或等位基因。  3.2. 主要组成  o 测序仪主机:包含流体控制系统、温控系统、激光系统、光学系统、信号采集系统等多个模块,用于控制仪器的运行和数据的采集。  § 流体控制系统:负责控制样品和试剂的输送,以及测序反应的进行。流体控制系统由进样针、进样泵、进样阀等组成。  § 进样针:用于从样品板中吸取样品,并通过进样阀将样品注入到芯片上。  § 进样泵:用于控制进样针的吸取和释放动作,以及进样量的大小。  § 进样阀:用于控制进样针与芯片之间的连接和断开,以及进样时间的长短。  § 温控系统:负责控制仪器和芯片的温度,保证测序的稳定性和可靠性。温控系统由温度传感器、风扇、加热器等组成。  § 温度传感器:用于监测仪器和芯片内部和外部的温度,并反馈给温控器进行调节。  § 风扇:用于散热和通风,维持仪器和芯片的适宜温度。  § 加热器:用于加热和保温,防止仪器和芯片的过冷。  § 激光系统:负责将激光光束照射到芯片上,激发荧光信号。激光系统由激光器、光纤、光学开关等组成。  § 激光器:提供单波长、532nm、固态、长寿命的激光光源,用于激发荧光染料。  § 光纤:用于将激光光束从激光器传输到芯片上。  § 光学开关:用于控制激光光束的开启和关闭,以及激光功率的大小。  § 光学系统:负责将荧光信号收集并转换为电信号。光学系统由滤光片、透镜、CCD相机等组成。  § 滤光片:用于选择不同颜色的荧光信号,并过滤掉背景噪声。  § 透镜:用于聚焦和放大荧光信号,并将其投射到CCD相机上。  § CCD相机:用于将荧光信号转换为数字化的电信号,并传输给计算机工作站进行数据采集和分析。  § 信号采集系统:负责对数字化的电信号进行滤波、校准、分段、碱基识别等处理,最终生成测序结果。信号采集系统由数据采集卡、数据处理软件等组成。  § 数据采集卡:用于将CCD相机传输的电信号接收并转换为数字信号,以及进行一定的滤波和校准处理。  § 数据处理软件:用于对数字信号进行进一步的分段、碱基识别、质量评估等处理,以及生成测序结果文件。  o 计算机工作站:预装用于仪器控制、数据收集和样品文件自动分析的软件。  o 芯片:芯片是MGISEQ-2000测序仪的核心部件,它是一种微流控芯片,上面有数百万个微孔,每个微孔都可以进行单分子簇测序,实现高通量的数据产出。芯片有不同的规格和类型,如单端测序芯片、双端测序芯片、片段分析芯片等,可以根据不同的需求选择合适的芯片。  4. GS FLX+ System图源自罗氏官网  GS FLX+ System测序仪是一种基于焦磷酸测序(Pyrosequencing)技术的二代测序平台,它可以提供高通量、高准确度和超长读长的DNA测序服务。  4.1. 相关原理   文库构建:将待测DNA打断成小片段,并在两端加上特殊的接头(Adaptor),这些接头包含与DNA捕获珠表面探针互补的序列(A/B)、以及用于测序引物结合的序列(P1/P2)。文库构建后需要进行质量检测和定量。   乳液PCR:将文库DNA片段与DNA捕获珠混合,并加入油相形成乳液滴。每个乳液滴中只包含一个DNA捕获珠和一个文库DNA片段。然后进行PCR扩增,使每个DNA捕获珠上形成一个单分子聚集体。乳液PCR后需要进行破乳液和洗涤处理,去除多余的油相和PCR试剂。   PTP装载:将经过乳液PCR处理后的DNA捕获珠注入到PTP中,并使每个微孔中只有一个DNA捕获珠。然后进行温度变化和化学处理,使聚集体单链化并去除A端的DNA链,只留下B端的DNA单链。   边合成边测序:将带有荧光染料和可逆终止子的四种dNTPs逐一加入到PTP中,并利用DNA聚合酶将它们连接到聚集体的DNA链上。每次只能加入一个碱基,然后用激光激发荧光信号,并用CCD相机记录每个聚集体发出的荧光信号,从而确定碱基序列。然后用化学剂去除荧光染料和可逆终止子,使下一个碱基可以继续加入。重复这个过程,直到完成所有的测序循环。   数据分析:将CCD相机收集到的荧光信号转换为原始数据(SFF文件),并进行质量控制和过滤,去除低质量的聚集体和信号。然后进行碱基识别(Base calling),将荧光信号转换为碱基序列(FASTA/FASTQ文件)。最后根据不同的测序目的,进行后续的数据分析,如比对、变异检测、表达量计算等。  4.2. 主要组成   测序仪主机:包含电泳系统、自动进样系统、激光系统、光学系统、温控系统、聚合物输送系统等多个模块,用于控制仪器的运行和数据的采集。   计算机工作站:预装用于仪器控制、数据收集和样品文件自动分析的软件,如Data Collection Software、Sequencing Analysis Software等。   PicoTiterPlate(PTP):是一个微型的塑料板,它的表面覆盖了数百万个微孔,每个微孔可以容纳一个DNA捕获珠(DNA Capture Bead),并进行单分子测序反应。   DNA捕获珠(DNA Capture Bead):是一种直径约28微米的磁性珠子,它的表面覆盖了数千个固定在不同位置的寡核苷酸探针,这些探针与文库DNA片段的接头互补,可以通过乳液PCR(Emulsion PCR)扩增形成单分子聚集体(Single Molecule Cluster)。   荧光染料(Fluorescent dye):是指用于标记不同碱基的四种荧光分子,它们分别对应A、T、C、G四种碱基,并发出不同颜色的光。荧光染料还带有可逆终止子,可以控制每次只加入一个碱基。   激光器(Laser):是指用于激发荧光染料发光的光源,它可以提供单波长、固态、长寿命的激光光束。   CCD相机(CCD camera):是指用于捕捉和记录荧光信号的设备,它可以将荧光信号转换为数字化的电信号,并传输给计算机进行数据分析。  4.3. 主机组成   电泳系统:是指用于将带有荧光染料和可逆终止子的四种dNTPs逐一加入到PTP中,并利用DNA聚合酶将它们连接到聚集体的DNA链上的系统。每次只能加入一个碱基,然后用激光激发荧光信号,并用CCD相机记录每个聚集体发出的荧光信号,从而确定碱基序列。   自动进样系统:是指用于将经过乳液PCR处理后的DNA捕获珠注入到PTP中,并使每个微孔中只有一个DNA捕获珠的系统。然后进行温度变化和化学处理,使聚集体单链化并去除A端的DNA链,只留下B端的DNA单链。   激光系统:是指用于激发荧光染料发光的光源,它可以提供单波长、固态、长寿命的激光光束。   光学系统:是指用于捕捉和记录荧光信号的设备,它可以将荧光信号转换为数字化的电信号,并传输给计算机进行数据分析。   温控系统:是指用于控制PTP板和反应液的温度,以保证测序反应的稳定性和效率的系统。   聚合物输送系统:是指用于将不同类型和浓度的聚合物溶液输送到PTP板中,以提供不同阶段所需的反应条件和试剂的系统。  5. SOLiD System 5500xl图源自thermofisher官网  SOLiD System 5500xl测序仪是一种基于连接法测序(Sequencing by Ligation)技术的二代测序平台,它可以提供高通量、高准确度和中等读长的DNA测序服务。  5.1. 相关原理   文库构建:将待测DNA打断成小片段,并在两端加上特殊的接头(Adaptor),这些接头包含与DNA捕获珠表面探针互补的序列(P1/P2)、以及用于测序引物结合的序列(Rd1 SP/Rd2 SP)。文库构建后需要进行质量检测和定量。   乳液PCR:将文库DNA片段与DNA捕获珠混合,并加入油相形成乳液滴。每个乳液滴中只包含一个DNA捕获珠和一个文库DNA片段。然后进行PCR扩增,使每个DNA捕获珠上形成一个单分子聚集体。乳液PCR后需要进行破乳液和洗涤处理,去除多余的油相和PCR试剂。   FlowChip装载:将经过乳液PCR处理后的DNA捕获珠注入到FlowChip中,并使每个微孔中只有一个DNA捕获珠。然后进行温度变化和化学处理,使聚集体单链化并去除P1端的DNA链,只留下P2端的DNA单链。   边连接边测序:将带有荧光探针和可逆终止子的四种dNTPs逐一加入到FlowChip中,并利用DNA连接酶将它们连接到聚集体的DNA链上。每次只能加入一个碱基对,然后用激光激发荧光信号,并用CCD相机记录每个聚集体发出的荧光信号,从而确定碱基对序列。然后用化学剂去除荧光探针和可逆终止子,使下一个碱基对可以继续加入。重复这个过程,直到完成所有的测序循环。   数据分析:将CCD相机收集到的荧光信号转换为原始数据(BCL文件),并进行质量控制和过滤,去除低质量的聚集体和信号。然后进行碱基识别(Base calling),将荧光信号转换为碱基对序列(FASTQ文件)。最后根据不同的测序目的,进行后续的数据分析,如比对、变异检测、表达量计算等。  5.2. 主要组成   测序仪主机:包含电泳系统、自动进样系统、激光系统、光学系统、温控系统、聚合物输送系统等多个模块,用于控制仪器的运行和数据的采集。   计算机工作站:预装用于仪器控制、数据收集和样品文件自动分析的软件,如Data Collection Software、Sequencing Analysis Software等。   FlowChip:是一个微型的玻璃芯片,它的表面覆盖了数百万个微孔,每个微孔可以容纳一个DNA捕获珠(DNA Capture Bead),并进行单分子测序反应。   DNA捕获珠(DNA Capture Bead):是一种直径约28微米的磁性珠子,它的表面覆盖了数千个固定在不同位置的寡核苷酸探针,这些探针与文库DNA片段的接头互补,可以通过乳液PCR(Emulsion PCR)扩增形成单分子聚集体(Single Molecule Cluster)。   荧光探针(Fluorescent probe):是指用于标记不同碱基对的四种荧光分子,它们分别对应A/T、T/A、C/G、G/C四种碱基对,并发出不同颜色的光。荧光探针还带有可逆终止子,可以控制每次只加入一个碱基对。   激光器(Laser):是指用于激发荧光探针发光的光源,它可以提供单波长、固态、长寿命的激光光束。   CCD相机(CCD camera):是指用于捕捉和记录荧光信号的设备,它可以将荧光信号转换为数字化的电信号,并传输给计算机进行数据分析。  5.3. 主机组成   电泳系统:是指用于将带有荧光探针和可逆终止子的四种dNTPs逐一加入到FlowChip中,并利用DNA连接酶将它们连接到聚集体的DNA链上的系统。每次只能加入一个碱基对,然后用激光激发荧光信号,并用CCD相机记录每个聚集体发出的荧光信号,从而确定碱基对序列。   自动进样系统:是指用于将经过乳液PCR处理后的DNA捕获珠注入到FlowChip中,并使每个微孔中只有一个DNA捕获珠的系统。然后进行温度变化和化学处理,使聚集体单链化并去除P1端的DNA链,只留下P2端的DNA单链。   激光系统:是指用于激发荧光探针发光的光源,它可以提供单波长、固态、长寿命的激光光束。   光学系统:是指用于捕捉和记录荧光信号的设备,它可以将荧光信号转换为数字化的电信号,并传输给计算机进行数据分析。   温控系统:是指用于控制FlowChip板和反应液的温度,以保证测序反应的稳定性和效率的系统。   聚合物输送系统:是指用于将不同类型和浓度的聚合物溶液输送到F
  • 生物医药色谱会闭幕 12人获优秀青年报告奖
    仪器信息网讯 2010年5月9日,历时2天的2010年全国生物医药色谱会在“瓷都”景德镇落下圆满落下帷幕。闭幕式前是精彩的专家报告。 中国科学院大连化学物理研究所的关亚风研究员   中国科学院大连化学物理研究所的关亚风研究员以“多维色谱-质谱在线联用分析植物成份”为题,介绍其针对复杂痕量样品分析的方法。复杂样品的痕量分析对样品前处理、二维色谱分离、质谱检测都有很高的要求。关老师对此的解决方案是,针对挥发与半挥发样品采用毛细管液相×毛细管气相-MS在线联用 针对不挥发样品,采用 LC×GC-MS真空辅助溶剂蒸发接口技术。但是,目前毛细管液相×毛细管气相-MS在线联用面临HPLC流量与CGC进样量存在差别、接口的死体积和样品残留、第二维分离速度较长等三大难点,关亚风课题组研制出馏分存储型接口及新型的溶剂排出技术,搭建了微柱液相×毛细管气相-四极联用仪平台,并用此平台成功应用于植物中有机组分和生物大分子组分的分离。 解放军总医院医学实验测试中心的廖杰主任   解放军总医院医学实验测试中心的廖杰主任的报告题目是 “茶油中脂肪酸的分析及临床应用研究”。 地中海地区冠心病发病率低的重要原因是当地的“地中海膳食结构”(榄油+深海鱼+生蔬果 ,其中橄榄油起关键作用)。橄榄油与其它食用油的区别在于其油酸含量高(大于70%),茶油可视为中国的橄榄油。由此背景,廖杰老师研对茶油化学成份及其对健康促进机理进行研究,并分别做了动物实验、化学成份分析、临床研究,结果表明,富含、MUFA(单不饱和脂肪酸)的茶油对高脂饲料诱发的兔肝脂肪变性和血管周样硬化有抑制作用。 中科院化学所的聂宗秀研究员   中科院化学所的聂宗秀研究员介绍了其在生物颗粒质谱方面的研究工作。聂宗秀研究员在报告中提到,常规质谱的测量的分子量上限是100道尔顿,主要是因为随着粒子质量的增大,其传输速率迅速下降,而传统的检测器依赖于离子的碰撞速度。通常的ESI源是一个非常软性的电离方法,而MALDI在一定程度上会破坏生物颗粒,所以这两种方法都不太适用于研究生物颗粒样品。如果能够把一单个的粒子放入一个装置中,使其长时间的囚禁,那么其灵敏度将大大提高。聂宗秀研究员在实验中使用离子阱作为质量分析器,采用激光诱导软电离作为离子源,得到了正常人的红血球和病人的红血球的质量,还获得了白血病癌细胞的质量、牛痘病毒的质量等。通过采用圆柱型粒子阱,结合现代光学技术,使实验结果大大改进。聂研究员还表示,今后将在更小的病毒颗粒——80nm~10nm肝炎病毒颗粒方面展开研究。 东曹达(上海)贸易有限公司技术服务中心张琳先生   东曹达(上海)贸易有限公司技术服务中心张琳先生带来了报告“新型无孔离子交换色谱柱-TSKgelSTAT系列柱的性能评价及其在生物样品高分离快速分析中的应用”。张琳先生介绍, TSK-GEL STAT是一系列可用于分离生物大分子(如:蛋白质、多肽、核酸)的聚合物基质的离子交换色谱分析柱。采用了无孔树脂填料,可以在常用液相系统下实现高通量和高分辨率分离,其具有超高通量、可应用于低分子量化合物、低反压、更高的载量等特点。这些特性使得该系列柱子可以用于核酸分离、PCR产物的分离制备、β-乳球蛋白的PEG化过程监测、牛血清蛋白酶解产物分析等方面。 北京工商大学化学与环境工程学院、北京市植物资源研究开发重点实验室曹学丽教授   北京工商大学化学与环境工程学院、北京市植物资源研究开发重点实验室的曹学丽教授向大家介绍了“高速逆流色谱及其在生物活性成份分离中的应用”。高速逆流色谱(High-speed countercurrent chromatography, HSCCC)是二十世纪八十年代发展起来的一项连续高效的液-液分配色谱分离技术。该技术特别适合于生物活性成份的分离。同时由于被分离物质与液态固定相之间能够充分接触,使得样品的制备量大大提高,也是一种理想的制备分离手段。该技术相对于传统的固-液柱层析技术具有适用范围广、操作灵活、高效、快速、制备量大、费用低等优点。曹教授从溶剂体系的选择、大分子的分离、工业化放大三个方面就自己进行的研究与大家交流。其中,溶剂体系的选择是HSCCC构成体系的关键环节。曹教授表示,今后逆流色谱的发展趋势为:1)微型化以及与多种检测技术的联用 2)工业化仪器设备的研制及应用 3)在蛋白等生物大分子活性成份分离中的应用。   另西北大学现代分离科学研究所、现代分离科学陕西省重点实验室的耿信笃教授做了题为“液相色谱法分离整体蛋白速度极限探讨”的报告、中科院化所学刘国诠研究员做了题为“液相色谱柱进展与展望之填料三议”的报告,请见:快速&高分离度——色谱技术永恒不变的主题。   随后进行了简短的闭幕式和“东曹达”优秀青年报告奖的颁奖。刘虎威教授介绍了评奖委员会的成员、评选的标准、评奖程序及获奖名单。 颁奖瞬间   2010年全国生物医药色谱学术交流会“东曹达”优秀青年报告奖颁奖嘉宾与获奖者合影  (颁奖嘉宾从左至右依次为:中国科学院化学所赵睿研究员、中国科学院大连化学物理研究所许国旺研究员、中国色谱学会常务副理事长武杰研究员、东曹达贸易有限公司日本总部市场部部长饭国泰男先生、西北大学现代分离科学研究所耿信笃教授、中国科学院化学所刘国诠研究员)   评奖委员会:   北京大学化学与分子工程学院分析化学研究所 刘虎威 教授   中国科学院化学研究所 刘国诠 研究员   中国科学院化学研究所 赵睿 研究员   解放军总医院医学实验测试中心 廖杰 主任   中国科学院大连化学物理研究所 张丽华 研究员   评奖标准:   1. 报告人年龄不大于35周岁   2. 报告人论文收录在论文集中   3. 报告人所做工作是否具有创新性   4. 报告人讲解十分清楚生动   5. 报告人问题回答十分明了   6. 报告人所做研究工作的意义大小。   评奖程序:   各分会场主持人根据每个会场报告情况推荐0-1名候选人   评奖委员会讨论决定获奖人名单。   获奖人名单(12名) 报告人 题 目 单 位 推荐人 王 瑜 莽草酸分子印记聚合物的制备及其低压制备色谱研究 华东理工大学 吴海龙 汪海林 韩 彬 离子液体对胰酶解效率的影响 中国科学院生态环境中心 中国科学院大连化学物理所 齐 莉 张维冰 郑姝宁 抑郁症模型大鼠代谢指纹谱的色谱研究 沈阳药科大学 卫引茂 白 玉 刘 一 双环铂及卡铂与脱氧核苷酸相互作用的CE-MS分析 北京大学 刘 霞 屈 峰 王蔚芝 微流控芯片阵列多肽合成与HPLC分析 中国科学院化学所 张祥民 张书胜 韩晔华 植物激素茉莉酸的手性分离及CE-MS检测 北京大学 廖 杰 齐美龄 黄嫣嫣 吲哚类化合物显色体系的色谱分离分析 中国科学院化学所 赵书林 胡育筑 韦露莎 采用β2-肾上腺素受体色谱测定药物的EC50 西北大学 张经华 陈东英 张惠萍 加压毛细管电色谱法用于胰腺癌患者代谢指纹图谱的研究 上海交通大学 李晓东 徐远金 尹瑞川 丙烯醛-DNA加合物的鉴定和分析 中国科学院生态环境中心 胡春华 金美兰 刘 昭 聚合物整体柱微萃取与亲水作用色谱串联质谱联用定量分析植物样品中的细胞分裂素 武汉大学 牟世芬 颜流水 张 璐 毛细管区带点泳检测细胞调往方法学研究 北京理工大学 赵 睿 刘虎威
  • 2021年最受资本青睐的5种科学仪器
    资本向来是敏感的,哪里有机会,资本就往哪里钻。  2021年中国科学仪器市场官宣了不下40起融资事件,创造了超越40亿元的融资记录,最大一笔金额超过4亿元。后疫情时代,科学仪器市场成为一片投资热土。尤其是科创板推出、北交所成立以及“专精特新”概念爆火之后,嗅觉敏锐的投资机构们蜂拥而至,拼命寻找着这个行业下一个“小巨人”。  究竟谁才是真正的未来之星,透过资本市场犀利的眼光,我们来看看中国科学仪器市场藏着哪些“优质股”。2021年科学仪器企业融资情况  纵观2021年,资本市场重点关注临床质谱、基因测序、数字PCR、流式细胞仪、电子显微镜这5个细分赛道。它们究竟有何魅力,仪器信息网进行了追踪:  赛道一:临床质谱  据仪器信息网统计,2021年一级市场共有11家临床质谱企业完成融资,其中佰辰医疗3月获得CPE领投的3亿元人民币C轮融资,为目前临床质谱行业最大的一笔融资。  临床质谱检测是指质谱技术在临床检验的应用。近年来,随着国内外质谱技术飞速发展,质谱仪市场需求迅猛,虽然我国质谱技术临床应用起步较晚,但市场发展较快,2018年更是被业内称为临床质谱爆发元年,2018年我国临床质谱检测行业的市场规模已经达到24.8亿元,2020年达到30亿元左右。目前,中国临床应用正处于高速发展的前期,而北美质谱在临床检验整体业务当中占20-30%的比例,且在持续增长。所以将来市场前景前途不可估量,行业面临着巨大的发展机会。  现阶段,主流的临床质谱检验项目包括新生儿筛查、维生素、激素、药物浓度监测等,主要应用在妇幼、心血管、内分泌、精神卫生、药学、体检等领域。而作为一项平台性技术,质谱技术优势明显,应用领域很广,在常规检测项目上可以对生化、发光等传统方法学做不好、不能做的项目上提供更优的解决方案,对应数百亿的市场规模。下一步,结合蛋白质组学、代谢组学,并辅以大数据人工智能分析的创新检测应用,临床质谱在肿瘤、心血管、神经等领域的落地,则将进一步推高市场天花板。  与此同时,质谱仪价格昂贵、设备国产化率极低、检测项目少、临床认知不足也制约着质谱临床的落地。临床质谱企业融资主要用于创新标志物发现、转化,新产品的研发生产、注册报证、产能扩建及商业化应用战略的全面推进。  赛道二:基因测序  据统计,2021年共有5家基因测序企业完成融资,真迈生物与齐碳科技各自获得4亿元融资,前者双线布局“单分子测序仪”加“高通量测序仪”,后者打破第四代基因测序技术国外垄断。单细胞测序 “新秀”墨卓生物、德运康瑞也受到资本关注。  从上世纪70年代Sanger发明的双脱氧核苷酸末端终止法和Gilbert与Maxam发明的化学降解法为标志的第一代测序技术诞生以来,到目前为止,基因测序技术的发展一共涌现了4代测序技术。目前,二代测序技术为市场主流,其中典型代表有Illumina公司的Solexa技术、罗氏公司的454技术以及Life tech公司的SOLID技术。近几年来,以Heloscope的单分子测序技术和PacBio的SMRT技术为代表第三代技术以及第四代纳米孔测序技术相继出现,标志着测序技术未来的发展方向。到2020年,第四代基因测序技术已经得到较快的发展。  随着基因测序下游应用的不断繁荣和普及,近年来,基因测序平台的市场规模也一直保持高速增长。行业数据显示,预计到2030年,基因测序平台在全球范围的市场容量将超过240亿美元,其中中国市场将超过300亿人民币。基因测序下游应用中,科研用基因测序占比最高,超过50%,临床研究和医院诊断的比例仅为18%和14%,预计未来临床用基因测序应用占比还有进一步提升的空间。  2020年,全球单细胞基因组学产品市场销售额达到5.2亿美元。单细胞测序技术在胚胎发育、肿瘤检测、免疫细胞治疗等领域表现出了巨大的应用前景,随着相关技术不断突破,单细胞测序在临床的应用将更加深入。  赛道三:数字PCR  2021年PCR市场发生近10起融资事件,其中6起与数字PCR相关。惠每资本领投的思纳福医疗B轮融资达2亿元,领跑数字PCR市场。  新冠疫情带火了核酸检测,也让PCR这一细分领域成为资本眼中的黄金赛道。数字PCR是一种新的核酸检测与定量方法,与传统的PCR和qPCR相比,具有更高的检测精确度、准确度和灵敏度,能实现精准的绝对定量分析。同时,作为突破性的“第三代PCR技术”,数字PCR操作简单、质量可控,成为当下PCR的研发方向。疫情防控常态化,核酸检测已成为常规项目,数字PCR具有巨大的技术优势和应用前景,引发仪器企业和资本纷纷布局。  从市场规模来看,目前数字PCR市场规模并不大,全球约1.5亿至2.5亿美元,占到qPCR市场总规模(约20亿美元)的10%,但增长趋势显著。行业报告分析指出,全球定量PCR和数字PCR市场将以8.9%的年复合增长率增长,到2022年将达到53.1亿美元。  当前数字PCR应用于临床仍然是挑战,多家企业融资主要用于创新型设备平台与诊断试剂的开发、临床试验及注册报证,加快数字PCR产品的临床落地进程。  赛道四:流式细胞仪  流式细胞仪是一种能够探测和计数以单细胞液体流形式穿过激光束的细胞检测装置,具有速度快、精度高、准确性好等特点,是生命科学和细胞分析领域重要的分析工具,应用场景涵盖科学研究、临床体外诊断、生物制药、细胞疗法等多个领域,其终端用户包括商业组织、医院、学术机构、临床测试实验室等。  2018年(含)以来,包括红杉、斯道资本、北极光创投、弘晖、幂方、松禾、辰德、本草等在内的TOP VC先后涌入流式赛道纷纷布局,国产流式领域的厂家如雨后春笋般涌现。根据不完全统计,2018年(含)至今,国内流式细胞赛道上超十家企业先后共获得超20笔融资,超50家机构纷纷进场布局。新冠疫情爆发无疑加速了流式领域的发展,在流式细胞仪成为二级医院标配的大背景下,2021年又有3家国产流式企业获得融资,金额从数千万到上亿元不等。  当前,流式细胞应用主要集中在生物学研究、制药工业等科研领域,但临床应用正加速,呈现反超之势。新冠肺炎诊疗方案(第七版)中明确了流式细胞仪在细胞因子检测和淋巴细胞亚群检测中的应用,这带动了医疗用流式细胞仪的需求增长。据市场调研机构的报告显示,全球流式细胞仪市场规模约为40亿美元,2019-2025年预期复合年增长率为8.3%。全球市场由北美和欧洲主导,而亚太地区在预测期内增速最快。我国流式细胞产业起步较晚,外资品牌依然主导国内市场,行业进口替代空间广阔。  赛道五:电子显微镜  电子显微镜是人类探知微观世界最有力的工具,广泛应用于科学研究及工业检测,在材料、半导体、医学、生物、冶金等领域有不可替代的作用。在全球来看,电子显微镜处于仪器仪表行业的金字塔尖,2017年其细分领域冷冻电镜的三位科学家共同获得了诺贝尔奖。2021年电镜及其相关技术仍然受到资本关注,国仪量子、金竟科技两家设备商与冷冻电镜服务商佰翱得获得融资。  近年来随着全球对生命科学、材料研究的探索和研究持续深入,以及对半导体需求不断扩大等,全球电子显微镜行业市场规模呈现不断增长趋势。2016年全球电子显微镜行业市场规模为23.61亿美元,至2019年涨至26.82亿美元。2020年受全球安全卫生事件影响,全球电子显微镜行业增速有所放缓,约为27.84亿美元。不过据预测,未来全球电子显微镜将保持5.85%的复合增速保持快速增长,到2026年全球电子显微行业市场规模将超过38亿美元。
  • 分子诊断发展简史:一场由 “螺旋双杰”引发的发明
    p    span style=" color: rgb(255, 0, 0) " strong 分子诊断发展四阶段 /strong /span /p p    strong 第一阶段: /strong 利用分子杂交技术进行遗传病基因诊断:通过婴儿胚胎期进行产前诊断,超早期预知某些疾病发生、发展和预后。1978年著名没计划以科学家简悦威等应用液相DNA分子杂交成功进行了镰形细胞贫血症的基因诊断。 /p p    strong 第二阶段: /strong 以PCR为基础的分子诊断:PMullis发明PCR技术后迅速发展,标志着传统基因诊断发展到更全面的分子诊断技术。 /p p    strong 第三阶段: /strong 以生物芯片技术为代表的高通量检测技术:1992年美国Affymetrix制作出第一章基因芯片,标志着分子诊断进入生物芯片技术阶段。生物芯片技术解决了传统核酸印迹杂交技术复杂、自动化程度低、检测目的分子数量少、低通量的问题。 /p p    strong 第四阶段: /strong 以NIPT为代表的第二代测序技术:Ronaghi分别于1996年与1998年提出了在固相与液相载体中通过边合成边测序的方法-焦磷酸测序。目前常见的高通量第二代测序平台主要有Roche454、IlluminaSolexa、ABISOLiD和LifeIon Torrent等,其均为通过DNA片段化构建DNA文库、文库与载体交联进行扩增、在载体面上进行边合成边测序反应,使得第1代测序中最高基于96孔板的平行通量扩大至载体上百万级的平行反应,完成对海量数据的高通量检测。 /p p style=" text-align: center" img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201709/insimg/44c4a78c-c7f0-4147-bc28-189d0c1a1a1a.jpg" title=" 1_副本.jpg" / /p p   span style=" color: rgb(255, 0, 0) " strong  分子诊断三座丰碑 /strong /span /p p   1953年,沃森和克里克发现了DNA双螺旋的结构,开启了分子生物学时代,使遗传的研究深入到分子层次,“生命之谜”被打开,人们清楚地了解遗传信息的构成和传递的途径。在以后的近50年里,分子遗传学、分子免疫学、细胞生物学等新学科如雨后春笋般出现,一个又一个生命的奥秘从分子角度得到了更清晰的阐明。DNA双螺旋结构的出现时分子生物学行程的重要标志,对人们认识蛋白质合成、DNA复制和突变具有重要意义,为分子诊断的蓬勃发展奠定基础。 /p p style=" text-align: center" img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201709/insimg/600d8dc5-4c9d-43c9-a330-64be4a9b876b.jpg" title=" 2_副本.jpg" / /p p style=" text-align: center " “DNA之父”Watson、Crick /p p   50年前,科学界的“八大恶棍”之一凯利?穆利斯还只是美国某制药公司的小职员,整天做着把先天致病基因给剔除掉的白日梦,然而先要复制DNA,才有足够的时间慢慢修复。1966年,穆利斯尝试磕了一次药,并从此不可自拔。后来,迷幻剂被列为违禁药品,于是穆利斯自己调配迷幻剂的替代品。在制作迷幻剂时,他居然想到了复制DNA的办法——聚合酶链式反应(PCR),并最终凭他跟迷幻剂的结晶PCR获得了诺贝尔奖。从此开启了分子诊断的PCR时代,标志着传统的基因诊断发展到更全面的分子诊断。 /p p style=" text-align: center" img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201709/insimg/0f7acbc8-43a3-4135-bef7-29fe056abd8f.jpg" title=" 3_副本.jpg" / /p p style=" text-align: center " “PCR之父”Kary Mullis /p p   “只是个在实验室里乱搞的家伙”弗雷德里克· 桑格开拓人类基因研究,被尊为“基因学之父”,他与同事合作研发的快速为DNA定序,成为绘制人类基因组图谱的先驱。桑格完整定序了胰岛素的氨基酸序列,证明蛋白质具有明确构造 他上世纪70年代提出快速测定脱氧核糖核酸(DNA)序列的技术“双去氧终止法”,即双脱氧核苷酸链中止法,又称“桑格法”。“双去氧终止法”测序法拉开了DNA测序的序幕,解开了人体4万个基因30亿个碱基对的秘密。 /p p style=" text-align: center" img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201709/insimg/c670b38c-a6a8-4703-9828-075f6514a808.jpg" title=" 4.jpg" / /p p style=" text-align: center " “基因学之父”Frederick Sanger /p p    span style=" color: rgb(255, 0, 0) " strong 分子诊断临床应用 /strong /span /p p span style=" color: rgb(255, 0, 0) " /span /p p style=" text-align: center" img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201709/insimg/e00b548e-abf8-45e0-8581-999297a8e186.jpg" title=" 5_副本.jpg" / /p p    strong 感染性疾病分子诊断: /strong /p p   目前主要应用在HBV、HCV、HIV、HSV、TB沙眼衣原体(CT)、淋球菌(NG)、解脲支原体等检测。 /p p    strong 遗传疾病分子诊断: /strong /p p   遗传性疾病可分为Mendelian遗传病、多因素遗传病和染色体异常遗传病。分子诊断在遗传病中的四种基本应用为:遗传病基因携带者筛查、遗传易感性筛查、产前筛查(地中海贫血、血友病、耳聋基因检测等)和新生儿筛查。 /p p    strong 肿瘤分子诊断: /strong /p p   目前我国肿瘤患者人数超过450万人,居世界首位,每年新发病例160-200万,近130万人死于癌症。目前肿瘤治疗的治愈率仍然不高,主要原因就在早期诊断及正确选择治疗方式方面存在较大困难。 /p p   肿瘤分子诊断主要分为肿瘤早期筛查(肿瘤易感基因检测,适合有机组病史的人群)、肿瘤辅助诊断(肿瘤标志物检测,可在体液或组织中检测到能够反映肿瘤的存在、分化程度、预后估计和判断治疗效果等)、肿瘤个体化治疗(通过检测肿瘤患者生物标本中生物标记物的基因突变、基因SNP分型、mRNA基因定量表达及蛋白表达状态,可预测药物疗效和评价预后,指导临床个体化治疗)三个方面。 /p p    span style=" color: rgb(255, 0, 0) " strong 中国分子诊断发展历史 /strong /span /p p   中国分子诊断行业在20世纪60-70年代开始萌芽,20世纪80年代出现了以核酸探针的放射性核素标记、点杂交、Southern印迹杂交和限制性片段长度多态性连锁分析为代表的分子诊断技术。北京、上海、广州等地的一些研究单位开始陆续建立了地中海贫血、苯丙酮酸尿症、血友病、杜兴肌营养不良、G-6-PD缺乏症等几个常见遗传病的分子诊断方法。但整个80年代,分子诊断概念尚未普遍接受,分子诊断技术尚未从大学、研究所走向临床实验室。 /p p style=" text-align: center" img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201709/insimg/8fa8b22e-8e8c-4533-ba2f-cb83d768a2a8.jpg" title=" 6.jpg" / /p p   90年代PCR在国内应用开始推广,分子诊断技术从研究所走向临床试验,PCR成为时代的宠儿,成为肿瘤、感染性疾病、基因多态性、多基因遗传病诊断的重要手段。但由于缺乏严格监管,大量假阳性出现。1998年卫生部发文:卫医发[1998]第9号 关于暂停临床基因扩增(PCR)检验的通知,暂停了PCR的临床应用。并于2002年就临床基因扩增检测发布实验室管理暂行办法,分子诊断重回发展正轨。 /p p   经过近70年的发展,从沃森和克里克提出DNA双螺旋结构,“生命之谜”被打开,经过PCR技术、生物芯片技术、DNA测序技术之后分子诊断正在快速成为人类疾病诊断的最有效方式之一。 /p
  • 盘点:分子诊断常用技术50年的沿革与进步
    一、基于分子杂交的分子诊断技术  上世纪60年代至80年代是分子杂交技术发展最为迅猛的20年,由于当时尚无法对样本中靶基因进行人为扩增,人们只能通过已知基因序列的探针对靶序列进行捕获检测。其中液相和固相杂交基础理论、探针固定包被技术与cDNA探针人工合成的出现,为基于分子杂交的体外诊断方法进行了最初的技术储备。  (一)DNA印迹技术(Southernblot)  Southern于1975年发明了DNA印迹技术,通过限制性内切酶将DNA片段化,再以凝胶电泳将长度不等的DNA片段进行分离,通过虹吸或电压转印至醋酸纤维膜上,再使膜上的DNA变性与核素标记的寡核苷酸探针进行分子杂交,经洗脱后以放射自显影鉴别待测的DNA片段-探针间的同源序列。这一方法由于同时具备DNA片段酶切与分子探针杂交,保证了检测的特异性。因此,一经推出后便成为探针杂交领域最为经典的分子检测方法,广为运用于各种基因突变,如缺失、插入、易位等,及与限制性酶切片段长度多态性(restrictionfragment length polymorphism,RFLP)的鉴定中。Alwine等于1977年推出基于转印杂交的Northernblot技术也同样成为当时检测RNA的金标准。  (二)ASO反向斑点杂交(allele-specificoligonucleotide reverse dot blot,ASO-RDB)  使用核酸印迹技术进行核酸序列的杂交检测具有极高的特异性,但存在操作极为繁琐,检测时间长的缺点。1980年建立的样本斑点点样固定技术则摆脱了传统DNA印迹需要通过凝胶分离技术进行样本固定的缺点。通过在质粒载体导入单碱基突变的方法,构建了首条等位基因特异性寡核苷酸探针(allele-specificoligonucleotide,ASO),更使对核酸序列点突变的检测成为可能。1986年,Saiki[3]首次将PCR的高灵敏度与ASO斑点杂交的高特异性结合起来,实现了利用ASO探针对特定基因多态性进行分型。其后为了完成对同一样本的多个分子标记进行高通量检测,Saiki[4]又发明了ASO-RDB,通过将生物素标记的特异性PCR扩增产物与固定于膜上的探针杂交显色,进行基因分型、基因突变的检测。该法可将多种寡核苷酸探针固定于同一膜条上,只需通过1次杂交反应,即可筛查待检样本DNA的数十乃至数百种等位基因,具有操作简单、快速的特点,一度成为基因突变检测、基因分型与病原体筛选最为常用的技术。  (三)荧光原位杂交(fluorescencein situ hybridization,FISH)  FISH源于以核素标记的原位杂交技术,1977年Rudkin首次使用荧光素标记探针完成了原位杂交的尝试。在上世纪8090年代,细胞遗传学和非同位素标记技术的发展将FISH推向临床诊断的实践应用。相比于其它仅针对核酸序列进行检测的分子诊断技术,FISH结合了探针的高度特异性与组织学定位的优势,可检测定位完整细胞或经分离的染色体中特定的正常或异常DNA序列 由于使用高能量荧光素标记的DNA探针,可实现多种荧光素标记同时检测数个靶点。  如今,FISH已在染色体核型分析,基因扩增、 基因重排、病原微生物鉴定等多方面中得到广泛应用。通过比较基因组杂交(comparativegenomic hybridization,CGH)与光谱核型分析(spectralkaryotyping,SKY)等FISH衍生技术,使其正在越来越多的临床诊断领域中发挥作用。  (四)多重连接探针扩增技术(multiplexligation-dependent probe amplification,MLPA)  MLPA技术于2002年由Schouten等[6]首先报道。每个MLPA探针包括2个荧光标记的寡核苷酸片段,1个由化学合成,1个由M13噬菌体衍生法制备 每个探针都包括1段引物序列和1段特异性序列。在MLPA反应中,2个寡核苷酸片段都与靶序列进行杂交,再使用连接酶连接2部分探针。连接反应高度特异,只有当2个探针与靶序列完全杂交,连接酶才能将2段探针连接成1条完整的核酸单链 反之,如果靶序列与探针序列不完全互补,即使只有1个碱基的差别,就会导至杂交不完全,使连接反应无法进行。连接反应完成后,用1对荧光标记的通用引物扩增连接好的探针,每个探针扩增产的长度都是唯一的。最后,通过毛细管电泳分离扩增产物,便可对把核酸序列进行检测。由于巧妙地借鉴了扩增探针的原理,MLPA技术最多可在1次反应中对45个靶序列的拷贝数进行鉴定。  该技术具备探针连接反应的特异性与多重扩增探针杂交的高通量特性。经过MRC-Holland公司10余年的发展,MLPA技术已成为涵盖各种遗传性疾病诊断、药物基因学多遗传位点鉴定、肿瘤相关基因突变谱筛查、DNA甲基化程度定量等综合分子诊断体系,是目前临床最为常用的高通量对已知序列变异、基因拷贝数变异进行检测的方法。  (五)生物芯片  1991年Affymetrix公司的Fordor[7]利用其所研发的光蚀刻技术制备了首个以玻片为载体的微阵列,标志着生物芯片正式成为可实际应用的分子生物学技术。时至今日,芯片技术已经得到了长足的发展,如果按结构对其进行分类,基本可分为基于微阵列(microarray)的杂交芯片与基于微流控(microfluidic)的反应芯片2种。  1.微阵列芯片  (1)固相芯片:微阵列基因组DNA分析(microarray-basedgenomic DNA profiling,MGDP)芯片:将微阵列技术应用于MGDP检测中已有超过十年的历史,其技术平台主要分为2类,即微阵列比较基因组杂交(array-basedcomparative genome hybridization,aCGH)和基因型杂交阵列(SNParray)。顾名思义,aCGH芯片使用待测DNA与参比DNA的双色比对来显示两者间的拷贝数变异(CNV)的变化,而单核苷酸多态性(singlenucleotide polymorphism,SNP)芯片则无需与参比DNA进行比较,直接通过杂交信号强度显示待测DNA中的SNP信息。随着技术的不断进步,目前市场上已出现可同时检测SNP与CNV的高分辨率混合基因阵列芯片。MGDP芯片主要应用于发育迟缓、先天性异常畸形等儿童遗传病的辅助诊断及产前筛查。经验证,使用MGDP芯片进行染色体不平衡检测与FISH的诊断符合率可达100%,表达谱芯片(geneexpression profiling array,GEParray):1999年,Duggan等首次使用cDNA芯片绘制了mRNA表达谱信息。随着表观遗传学在疾病发生发展中的作用日益得到重视,目前也已出现microRNA芯片、长链非编码RNA(longnoncoding RNA,lncRNA)芯片等。类似于MGDP芯片,GEP芯片使用反转录后生成的cDNA文库与固定于芯片载体上的核酸探针进行杂交,从而检测杂交荧光信号的强度判断基因的表达情况。  相较于基因组杂交,GEP芯片对生物学意义更为重要的转录组信息进行检测,对疾病的诊断与预后判断具有特殊的意义。目前使用GEP芯片对急性髓细胞白血病、骨髓增生异常综合征等血液病及神经退行性变等进行诊断、分类及预后评估已经获得了令人满意的效果   (2)液相芯片:传统固相芯片将检测探针锚定于固相载体上捕获目的序列,而Luminex公司的xMAP技术则通过搭配不同比例的2种红色荧光染料,将聚苯乙烯微球标记为不同的荧光色,并对其进行编码得到具有上百种荧光编号的微球。通过xTAG技术将不同的特异性杂交探针交联至编码微球上,使得不同的探针能够通过微球编码得以区分。利用混合后的探针-微球复合物与待测样本进行杂交,使微球在流动鞘液的带动下通过红绿双色流式细胞仪,其中红色激光检测微球编码,绿色荧光检测经杂交后核酸探针上荧光报告基团的信号强度,一次完成对单个样本中多种靶序列的同时鉴定。目前,该技术已在囊性纤维化等遗传性疾病诊断、多种呼吸道病毒鉴定及人乳头瘤病毒分型取得了广泛的应用。  2.微流控芯片  1992年Harrison等首次提出了将毛细管电泳与进样设备整合到固相玻璃载体上构建“微全分析系统”的构想,通过分析设备的微型化与集成化,完成传统分析实验室向芯片上实验室(lab-on-chip)的转变。微流控芯片(microfluidicchip)由微米级流体的管道、反应器等元件构成,与宏观尺寸的分析装置相比,其结构极大地增加了流体环境的面积/体积比,以最大限度利用液体与物体表面有关的包括层流效应、毛细效应、快速热传导和扩散效应在内的特殊性能,从而在1张芯片上完成样品进样、预处理、分子生物学反应、检测等系列实验过程。  目前使用微流控芯片进行指导用药的多基因位点平行检测是主要临床应用领域。  二、核酸序列测定  测序反应是直接获得核酸序列信息的唯一技术手段,是分子诊断技术的一项重要分支。虽然分子杂交、分子构象变异或定量PCR技术在近几年已得到了长足的发展,但其对于核酸的鉴定都仅仅停留在间接推断的假设上,因此对基于特定基因序列检测的分子诊断,核酸测序仍是技术上的金标准。  (一)第1代测序  1975年Sanger与Coulson发表了使用加减法进行DNA序列测定的方法,随后Maxam在1977年提出了化学修饰降解法的模型,为核酸测序时代的来临拉开了序幕。  Sanger等于同年提出的末端终止法(Sanger测序法)利用2' 与3' 不含羟基的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)进行测序引物延伸反应,ddNTP在DNA合成反应中不能形成磷酸二酯键,DNA合成反应便会终止。如果分别在4个独立的DNA合成反应体系中加入经核素标记的特定ddNTP,则可在合成反应后对产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamidegel electrophoresis,PAGE)及放射自显影,根据电泳条带确定待测分子的核苷酸序列。AppiedBiosystems公司在Sanger法的基础上,于1986年推出了首台商业化DNA测序仪PRISM 370A,并以荧光信号接收和计算机信号分析代替了核素标记和放射自显影检测体系。该公司于1995年推出的首台毛细管电泳测序仪PRISM 310更是使测序的通量大大提高。Sanger测序是最为经典的一代测序技术,仍是目前获取核酸序列最为常用的方法。  (二)第2代测序  1.焦磷酸测序(Pyro-sequencing)  不同于Sanger测序法所使用的合成后测序理念,Ronaghi分别于1996年与1998年提出了在固相与液相载体中通过边合成边测序的方法-焦磷酸测序。其基本原理是利用引物链延伸时所释放的焦磷酸基团激发荧光,通过峰值高低判断与其相匹配的碱基数量。由于使用了实时荧光监测的概念,焦磷酸测序实现了对特定位点碱基负荷比例的定量,因此在SNP位点检测、等位基因(突变)频率测定、细菌和病毒分型检测方面应用广泛。由于荧光报告原理不同,其对于序列变异的检测灵敏度从Sanger测序的20%提高到了5%。但由于该技术的仪器采购与单次检测成本较高,目前尚未得到大规模的临床使用。  2.高通量第2代测序  目前常见的高通量第二代测序平台主要有Roche454、IlluminaSolexa、ABISOLiD和LifeIon Torrent等,其均为通过DNA片段化构建DNA文库、文库与载体交联进行扩增、在载体面上进行边合成边测序反应,使得第1代测序中最高基于96孔板的平行通量扩大至载体上百万级的平行反应,完成对海量数据的高通量检测。该技术可以对基因组、转录组等进行真正的组学检测,在指导疾病分子靶向治疗、绘制药物基因组图谱指导个体化用药、感染性疾病的病原微生物宏基因组鉴定及通过母体中胎儿DNA信息进行产前诊断等方面已经取得了喜人的成绩。然而,由于该技术需要对DNA进行片段化处理,测序反应读长较短(如Solexa与SOLiD系统单次读长仅50bp),需要对数据进行大规模拼接,因此对分子诊断工作者掌握生物信息学知识提出了更高要求,以利于后期的测序数据分析。  (三)第3代测序  第3代测序技术的核心理念是以单分子为目标的边合成边测序。该技术的操作平台目前主要有Helicos公司的Heliscope、PacificBiosciences公司的SMRT和OxfordNanopore Technologies公司的纳米孔技术等。该技术进一步降低了成本,可对混杂的基因物质进行单分子检测,故对SNP、CNV的鉴定更具功效。但是目前其进入产品商业化,并最终投入临床应用仍有很长的距离。  三、基于分子构象的分子诊断技术  (一)变性梯度凝胶电泳(denaturinggradient gel electrophoresis,DGGE)与单链构象多态性(singlestrand conformation polymorphism,SSCP)  1970~1980年间,Fischer等与Orita等分别提出了利用核酸序列变异所导至双链变性条件差异与单链空间折叠差异,通过变性与非变性PAGE对变异序列进行分离鉴定的方法,即DGGE与SSCP。上述2项技术均通过变异核酸分子在空间构象上的差异,通过特定条件下电泳速率的变化进行检测。正因为核酸分子构象具有序列特异性,且对于序列的改变非常敏感,常常1个碱基的变化也能得到鉴定。但由于DGGE与SSCP均必须进行PCR后开盖电泳的操作,现已不常见于临床检测。  (二)变性高效液相色谱(denaturinghigh-performance liquid chromatography,dHPLC)  1997年,Oefner和Underhill建立了利用异源双链变性分离变异序列、使用色谱洗脱鉴定的技术,称为dHPLC,可自动检测单碱基置换及小片段核苷酸的插入或缺失。对于存在一定比例变异序列的核酸双链混合物,其经过变性和复性过程后,体系内将出现2种双链:一种为同源双链,由野生正义链-野生反义链或变异正义链-变异反义链构成的核酸双链 另一种为异源双链,即双链中1条单链为野生型,而另1条为变异型。由于存在部分碱基错配的异源双链DNA与同源双链DNA的解链特征不同,在相同的部分变性条件下,异源双链因存在错配区而更易变性,被色谱柱保留的时间短于同源双链,故先被洗脱下来,从而在色谱图中表现为双峰或多峰的洗脱曲线。由于该技术使用了较高分析灵敏度的色谱技术进行检测,可快速检出5%负荷的变异序列。但需注意的是,由于该技术主要通过异源双链进行序列变异检测,其不能明显区分野生型与变异型的纯合子。  (三)高分辨率熔解分析(high-resolutionmelting analysis,HRMA)  2003年,Wittwer等首次革命性地使用过饱和荧光染料将PCR产物全长进行荧光被动标记,再通过简单的产物熔解分析对单个碱基变化进行鉴定。该技术的原理也是通过异源双链进行序列变异鉴定。待测样本经PCR扩增后,若存在序列变异杂合子,则形成异源双链,其熔解温度大大下降。此时由于双链被饱和染料完全填充,其产物熔解温度的变化便可通过熔解曲线的差异得以判定。对于变异纯合子而言,HRMA也可利用其较高的分辨率完成PCR产物单个位点A:T双键配对与G:C三建配对热稳定性差异的鉴定,但是对于Ⅱ、Ⅲ类SNP的纯合子变异则无法有效区分。  如何利用DNA构象对序列进行推测,从而避免成本较高的序列测定或操作繁琐的杂交反应一直是分子生物学研究与应用的热点问题。目前,使用构象变化对序列变异进行间接检测的便捷性已得到一致肯定,尤其是HRMA可完成对变异序列单次闭管的扩增检测反应。但需要注意的是,由于基于构象变化的分子检测手段多无法通过探针杂交或核酸序列测定对检测的特异性进行严格的保证,因此其只适合大规模的初筛,而真正的确诊仍需要进行杂交或测序的验证。  四、定量PCR(quantitativePCR,qPCR)  相比于其他分子诊断检测技术,qPCR具有2项优势,即核酸扩增和检测在同一个封闭体系中通过荧光信号进行,杜绝了PCR后开盖处理所带来扩增产物的污染 同时通过动态监测荧光信号,可对低拷贝模板进行定量。正是由于上述技术优势,qPCR已经成为目前临床基因扩增实验室接受程度最高的技术,在各类病毒、细菌等病原微生物的鉴定和基因定量检测、基因多态性分型、基因突变筛查、基因表达水平监控等多种临床实践中得到大量应用。但伴随着qPCR技术的迅猛发展,有关这项技术的质量管理问题也日益突出,如何消除各类生物学变量所引起的检测变异,减少或抑制实验操作与方法学中的各种干扰因素是qPCR技术面临的难题。  (一)实时荧光定量PCR(real-timePCR)  1.双链掺入法  1992年Higuchi等通过在PCR反应液中掺入溴乙锭对每个核酸扩增热循环后的荧光强度进行测定,提出了使用荧光强度与热循环数所绘制的核酸扩增曲线,定量反应体系中初始模板的反应动力学(real-timePCR)模型,开创了通过实时闭管检测荧光信号进行核酸定量的方法。核酸染料可以嵌入DNA双链,且只有嵌入双链时才释放荧光,在每1次的扩增循环后检测反应管的荧光强度,绘制荧光强度-热循环数的S形核酸扩增曲线,以荧光阈值与扩增曲线的交点在扩增循环数轴上的投影作为循环阈值(Cyclethreshold,Ct),则Ct与反应体系中所含初始模板数量呈负指数关系,推断初始模板量。随后Morrison[22]提出了使用高灵敏度的双链染料SYBR GreenI进行反应体系中低拷贝模板定量的方法。这一方法操作简便,但由于仅使用扩增引物的序列启动核酸扩增,其产物特异性无法得到充分保证。虽然在实时荧光定量PCR反应后可通过熔解曲线对产物特异性进行检验,但其特异性明显逊于使用荧光探针进行检测,因此双链掺入法并未在临床实践中得到认可。  2.Taqman探针  由于双链掺入法存在特异性较低的问题,1996年Heid[23]综合之前发现的Taq酶的5' 核酸酶活性与荧光共振能量转移(fluorescenceresonance energy transfer,FRET)探针的概念提出了使用Taqman探针进行qPCR的方法。TaqMan探针的本质是FRET寡核苷酸探针,在探针的5' 端标记荧光报告基团,3' 端标记荧光淬灭基团,利用Taq酶具有5' 3' 外切酶活性,在PCR过程中水解与靶序列结合的寡核苷酸探针,使荧光基团得以游离,释放荧光信号。从而使能够与靶序列杂交的探针在扩增过程中释放荧光,通过real-timePCR的原理对其进行定量。由于其超高的特异性与成功的商品化推广,Taqman探针已经成为目前临床使用最为广泛的qPCR方法,其在各种病毒基因定量检测、基因分型、肿瘤相关基因表达检测等方面具有着不可替代的地位。  3.分子信标  同样在1996年,Tyagi等提出了使用分子信标(moleuclarbeacons)进行qPCR的方法,分子信标是5' 与3' 端分别标记有荧光报告基团与淬灭基团的寡核苷酸探针,其两端具有互补的高GC序列,在qPCR反应液中呈发夹结构,荧光基团与淬灭基团发生荧光共振能量转移(FRET)而保持静息状态。当PCR反应开始后,茎环结构在变性高温条件下打开,释放荧光 在退火过程中,靶序列特异性探针则与模板杂交保持线性,不能与模板杂交的探针则复性为茎环结构而荧光淬灭,通过检测qPCR体系中退火时的荧光信号强度,便可以real-timePCR原理特异性检测体系中的初始模板浓度。相比于Taqman探针,分子信标使用发卡结构使荧光基团与淬灭基团在空间上紧密结合,大大降低了检测的荧光背景,其检测特异性较Taqman探针更高,更适合等位基因的分型检测。  4.双杂交探针  1997年,Wittwer等发表了使用分别标记荧光供体基团与荧光受体基团的2条相邻寡核苷酸探针进行qPCR的方法。双杂交探针所标记的供体基团和受体基团的激发光谱间具有一定重叠,且2条探针与靶核酸的杂交位置应相互邻近。仅当2条探针与靶基因同时杂交时,供体与受体基因得以接近,从而通过FRET发生能量传递,激发荧光信号,荧光信号强度与反应体系中靶序列DNA含量呈正比。由于使用了2条探针进行靶序列杂交,该方法的特异性比传统单探针检测体系得到了极大地提升。  (二)数字PCR  早在上世纪90年代就出现了使用微流控阵列对单次qPCR反应进行分散检测的概念。基于这一理念,Vgelstein与Kinzter于1999年发表了数字PCR(digitalPCR)的方法,对结肠癌患者粪便中的微量K-RAS基因突变进行了定量。相比于传统的qPCR方法,数字PCR的核心是将qPCR反应进行微球乳糜液化,再将乳糜液分散至芯片的微反应孔中,保证每个反应孔中仅存在≤ 1个核酸模板。经过PCR后,对每个微反应孔的荧光信号进行检测,存在靶核酸模板的反应孔会释放荧光信号,没有靶模板的反应孔就没有荧光信号,以此推算出原始溶液中待测核酸的浓度。因此,数字PCR是1种检测反应终点荧光信号进行绝对定量的qPCR反应,而非以模板Ct值进行核酸定量的real-timePCR。  经由Quantalife公司开发(已于2011年被BIO-RAD收购)的微滴式数字PCR是首款商品化的数字PCR检测系统,目前已被广泛运用于微量病原微生物基因检测、低负荷遗传序列鉴定、基因拷贝数变异与单细胞基因表达检测等多个临床前沿领域。与传统qPCR相比较,该技术具有超高的灵敏度与精密度,使其成为目前qPCR领域的新星。  五、对未来5年的展望  半个世纪以来分子诊断的高速发展离不开分子生物学技术日新月异的进步。概而言之,在过去的50年中分子诊断技术取得了三大转化与3项提升:即报告信号检测从放射核素标记向荧光标记转化,操作方法由手工操作向全自动化转化,检测分析通量从单一标志物向高通量多组学联合判断转化 检测灵敏度、精密度、特异性的快速提升。  在未来5年中,我国分子诊断事业将迎来两方面的进步。随着卫生监管部门对分子诊断重要性的认识不断深入与越来越多高学历、高素质人才的进入,分子诊断将会出现理念的革命性进步,高通量技术将更多的进入临床的实际应用中。随着技术的进一步发展,传统针对特定基因异常、病原微生物感染鉴定的方法学,也将在检测的各项分析性能与操作便捷程度上取得长足的进步。对于传统人力与时间成本较高的检测方法学,将出现两极分化的态势,即Southern等经典的检测金标准将得到保留 而ASO-RDB等灵敏度、特异性均不能满足实际临床需求的方法将快速被新型技术所取代。最终,分子诊断也必将一改目前仅仅用于病原微生物基因检测与部分遗传性疾病诊断的局面,形成由肿瘤学、遗传学、微生物学、药物基因组学四足鼎立,快速发展的景象。
  • Cepheid为PCR技术带来新理念——访美国Cepheid公司首席执行官John L.Bishop先生
    历经20多年的发展,分子诊断市场已成为全球体外诊断行业增长最快的市场,特别是在传染性疾病的快速诊断、肿瘤早期诊断、新生儿疾病筛查等方面的应用更成为各国科学家研究和关注的热点,而目前以PCR(聚合酶链锁反应)技术为基础的分子诊断是应用最为广泛的分子诊断技术,占据了分子诊断市场的主流。   美国Cepheid公司就是一家以PCR技术为平台,致力于临床快速分子诊断产品研究与生产的知名公司,在院内感染检测方面更是业界的领先者。值此美国Cepheid公司高层访问中国、考察中国市场之际,仪器信息网编辑就分子诊断技术现状、仪器平台、检测试剂及公司中国发展战略等采访了美国Cepheid公司首席执行官John L.Bishop先生,Cepheid公司全球业务经营执行副总裁Nicolaas Arnold先生、Cepheid公司法律事务及业务拓展高级副总裁Joseph H.Smith先生、Cepheid公司国际销售部Lifeng He博士及Cepheid公司中国代理天津仪美科技有限公司总经理畅志强先生等陪同专访。 美国Cepheid公司首席执行官John L.Bishop先生 突破传统PCR仪的设计 实现更快、更精确、更易操作   以PCR仪为仪器平台的分子诊断技术虽然是分子诊断技术中应用广泛并比较成熟的技术,但是还存在一些局限:(1)尽管方法简单,但是操作过程复杂,特别是样品的制备过程,对操作人员的要求很高 (2)很容易被“污染”,PCR技术具有高特异性、高灵敏度的优势,但这些优势也常常成为PCR技术的“烦恼”,环境中的病菌或操作人员的一点失误都会被几何级数的放大,造成检测结果的“假阳性”。   Bishop先生说到,“Cepheid公司与传统的PCR仪生产商不同,没有经历化学法到免疫标记法,再到PCR技术这样的发展阶段,而是直接从一个全新的平台上开发PCR仪,在仪器设计理念上突破传统的96孔板设计,采用了独立的反应槽 开创独特的样品制备系统,采用微珠试剂。目前,Cepheid公司开发的实时荧光定量PCR仪分为两个系列:从样品中核酸的提取到完成PCR检测完全实现自动化的GeneXpert系列和需要实现核酸提取后进行PCR检测的半自动SmartCycler系列。” Cepheid公司GeneXpert IV型PCR仪   独特的样品制备系统实现样品制备与测试的一体化   “传统的PCR实验,需要对样品进行裂解、核酸提取、纯化及浓缩等繁杂的样品制备,通常耗时2-3小时,而Cepheid公司的GeneXpert PCR仪包含微流样品管、超声装置、注射装置、旋转装置、直角光路设计的特殊定量PCR反应管等几个部分,将样品制备和实时定量PCR反应全部自动实现,从样品制备到完成测试最快仅需30分钟左右,大大缩减了样品的制备时间,消除了操作中的人为误差,提高了反应结果的准确性,并且大大减轻了操作人员的工作强度。”   独立的PCR反应系统使检测更加准确   “与传统定量PCR仪96孔板的设计不同,GeneXpert PCR仪采用独立的I-CORE模块设计,每个样品槽都集成有独立的加热/冷却系统以及光学信号激发与检测系统,每一个模块就相当于一台独立的定量PCR仪。这样设计的好处在于,其一温控更加精确,检测时光程差异可忽略,保证了检测结果的精确性 其二可以同时进行多种不同病原微生物的检测,相对于目前传统实时定量PCR仪的单一病原体检测,采用I-CORE模块设计GeneXpert 和SmartCycler PCR仪就显得非常灵活,根据用户的需求可以配备从1个模块到16个模块,32个模块,而最新推出的GeneXpert Infinity 48 PCR仪可以配备多达48个的模块。”   微珠试剂设计提升测试操作的简易性   “传统的试剂盒里包含有样品制备过程各步所需的试剂,在操作的时候需要测试人员手工一步步加入 而Cepheid公司的试剂盒则是将酶、dNTPs(三磷酸脱氧核苷)、缓冲液等全部浓缩在一个微珠(Bead)中,而基因特异性引物、荧光探针、内参则包含于另一个微珠中,检测时,只需将两个微珠加入cartridge中,GeneXpert PCR仪就可以自动完成样品测试。独特的微珠试剂设计一方面可保持样品和试剂在常温下的稳定性,以及在微流样品管中的快速溶解,另一方面也便于精确操作减少误差,使得同一反应在任何时候任何地点都可以得到高度一致的检测结果。”   Bishop先生总结说到,“Cepheid公司的GeneXpert PCR仪将样品制备和检测整合在一起,是目前世界上唯一全自动封闭式实时荧光定量PCR仪 它与Cepheid公司提供的相应检测试剂盒完美结合,省去所有的手动加样环节,完全实现‘Sample In,Answer Out’,从而做到了更快、更精确、更易操作。我们的技术使得临床分子诊断从高端实验室、顶尖医院步入小型实验室、诊所,降低了对环境及操作人员的要求。为分子诊断技术在临床上的应用普及提供了广阔的前景。” PCR仪器平台已很完善 未来重点在于丰富试剂盒的种类   “目前,Cepheid公司的PCR系统已经很完善,全自动封闭式平台,并且在通量上具有扩展性,可以从1个模块扩展至48个模块。与业内其他PCR仪生产商相比,我们的PCR仪已经领先2-3代,故今后公司将更多地关注试剂盒的研发,拓展现有试剂盒的种类。”Bishop先生谈及公司未来发展重点时说到。   增加院内感染相关试剂盒种类   “病人入院治疗以前没有感染,在入院治疗48小时后有感染症状”定义为院内感染,这是目前很多医院困扰的问题,仅美国每年就有约二百万人患院内感染,近十万人死于院内感染。   Bishop先生说,“Cepheid公司是院内感染诊断的领先者,特别是在多重耐药金黄色葡萄球菌(MRSA)及耐药性结核分枝杆菌(MTB)方面。2010年公司还将有6种病原体检测试剂盒获批上市,其中一种与流感相关的病原体试剂盒及一种与万古霉素(VanA)相关的试剂盒已经获批上市销售。”   涉足肿瘤诊断试剂盒领域   Bishop先生介绍说,“Cepheid公司2010年一个新的研发项目是基于MricroRNA的肺癌诊断试剂盒。研发中的关键标记物可在肺癌早期和晚期阶段的血清中检测到,我们希望基于多重标记物的分子诊断不久可以取代切片检查。此外,Cepheid公司还与与美国强生公司合作,开发乳腺癌早期诊断的相关产品。” 从仪器到试剂 进军中国临床分子诊断市场   Cepheid公司的产品进入中国市场已经多年,不过以前主要是以仪器为主,主要用在研究领域。Bishop先生说,“此次中国之行,Cepheid的高层将访问中国北京与上海,并与相关的医院进行商谈,我们希望一方面把先进的技术带给中国,另一方面取得优异的商业成绩。今年我们将通过代理商天津仪美科技有限公司大力拓展中国的临床分子诊断市场,除了技术领先的PCR仪产品外,相关配套试剂也是我们推出的重点。以前我们的主要市场在美国和欧洲,未来中国是我们重点开发的市场。”   获取国家食品药品监督管理局(SFDA)的批准   在中国,分子诊断技术要应用到临床必需得到SFDA的批准,相关的仪器及试剂要注册成为医疗器械。作为Cepheid在中国的代理,天津仪美科技有限公司总经理畅志强先生表示,目前Cepheid公司的GeneXpert及SmartCycler 荧光定量PCR仪,以及相关试剂都已向SFDA提交了申请,相信不用多久时间就可以获得批准。Bishop先生说,“我们的产品均获得美国FDA的批准,我们很有信心能够获得SFDA的批准。”   与中国的医院、科研机构开展科研项目合作   “院内感染问题在中国也比较突出,中国政府对此很关注,而Cepheid公司的相关产品能够帮助中国应对这方面的问题。此行考察中国,我们将在中国选取一些医院或科研机构开展这方面的研究工作。此前,我们主要是与美国及欧洲的研究院所合作。” Bishop先生说到。   针对中国市场采取合适的价格战略   “Cepheid公司的GeneXpert PCR仪是针对已知样品、已知基因的快速检测,因此,不同的样品及检测目标都需要研发人员预先研究和优化程序,专业的微珠化试剂使得成本很高。但是针对中国市场,我们会设定合适的价格。”Bishop先生补充说,“但是我们希望中国的用户可以理解,试剂价格里包含了对照组,并且比其他试剂使用更加方便,测定更加精确,性价比更高。”   筹划推出简单易懂的“中文名称”   谈及公司英文名Cepheid的含义时,Bishop先生解释到,“Cepheid在英文里是指一个光很强的星球,用其来衡量其他星球的亮度。顾名思义,我们希望Cepheid公司的技术与产品可以在行业内担当这样的角色。考虑到要在中国市场推广,公司正计划推出一个简单易懂的中文名称。” 美国Cepheid公司高层与其中国代理合影 (从左至右分别是:Lifeng He博士、Nico Arnold先生、Joseph H.Smith先生、John L.Bishop先生、畅志强先生 )  后记   采访Cepheid前夕,恰逢第一届中国分子诊断技术大会在北京召开。会议上获悉,在中国,PCR技术用于临床诊断始于上世纪90年代初,可是随着一系列“假阳(阴)性”问题的出现,1998年卫生部暂停了临床PCR检验,直至2002年卫生部颁发了“临床PCR实验室管理暂时办法”,同年深圳人民医院检验医学部分子实验室首个获批为临床PCR实验室,至此PCR技术用于临床诊断在中国才正式恢复。   如今,随着各类流行性疾病的频繁爆发及此技术在欧美国家的广泛应用,中国鼓励医疗机构采用有效、价廉的分子诊断新技术,为提高人民的健康水平服务。未来中国的临床分子诊断市场前景可谓一片光明。   当笔者问及未来分子诊断应用前景时,Bishop先生表示,其一应用的范围会越来越广,从如今的高尖端的中心实验室将普及至小型诊所,并且可以检测的疾病的种类也将更加广阔 其二可以实现床旁诊断,未来分子诊断可以不需要在实验室检测,而是在病人的床边就可以进行检测与诊断。   采访编辑:杨娟   附录:美国Cepheid公司网站   http://www.cepheid.com/   天津仪美科技有限公司网站   http://www.yimeisci.com/   http://yimei.instrument.com.cn
  • 【飞诺美色谱】RP-LC-MS/MS法定量mRNA中游离/非结合核苷
    这种方法可以检测和定量合成类mRNA中大多数修饰的核苷。这不仅包括在体外转录过程中有意通过三磷酸盐引入的修饰,还包括商业化NTP原料变化引入的杂质,核苷被氧化产生的杂质等。该方法还能检测从帽结构释放的m7G或核糖甲基化修饰。使用LC-MS/MS,可以在核苷水平上分析mRNA,从而在单次运行中检测和量化数十种不同的修饰核苷。该方法可以很容易地对体外转录的NTP进行质量控制。溶液A:5mM醋酸铵缓冲液。乙酸调pH到5.3溶液B:乙腈。必须使用LC-MS级梯度条件:见下表样品制备用0.6U的核酸酶P1、0.2U的蛇毒磷酸二酯酶、0.2U的牛肠磷酸酶和10U的Benzonase核酸酶,在5mM Tris (pH8)和1mM氯化镁溶液中,37℃酶解2小时,将10μg的RNA酶切至核苷水平。另外,可以选择性地添加脱氨酶抑制剂,如喷司他汀(腺苷脱氨酶抑制剂,200ng)和四氢尿苷(胞苷脱氨酶抑制剂,500ng),以避免核苷降解。标样:腺苷或另一种主要核苷(C, U或G)色谱系统色谱柱:Synergi Fusion, 4μm, 80&angst 孔径, 250×2.0mm Phenomenex柱温:35℃流速:0.35mL/min检测器:UV 254nm仪器参数质谱仪:配备电喷雾离子源(ESI)的三重四极杆(QQQ)模式:正离子模式,dMRM(动态多反应监测)ESI参数:气体温度300℃,气体流量7L/min,雾化器压力60psi,鞘气温度400°C,鞘气流量12L/min,毛细管电压3000v,喷嘴电压0vQQQ参数:取决于必须检测的修饰核苷。建议对每台质谱仪的仪器参数(破碎器、碰撞能量、加速器电压)进行优化,以达到最佳灵敏度分析——相对定量用MS/MS法测定各修饰核苷的峰面积。修饰核苷的量用腺苷校正,以消除进样量不同带来的差异。为此,从254nm处记录的紫外色谱中获取腺苷的峰面积。通过在每个样品中加入同位素标记的标准物进行定量。A(MS mod)=修饰核苷酸的MS峰面积n(ISTD)=每个样品的内标量A(MS ISTD)=内标质谱峰的面积A(UV腺苷)=腺苷的峰面积或者,可以选择另一种主核苷(C、U或G)进行校正。例如,在酶促多聚腺苷酸化的情况下,它会导致未知或不同数量的腺苷。分析——绝对定量用MS/MS法测定各修饰核苷的峰面积。修饰核苷的量用腺苷校正,以消除进样量不同带来的差异。为此,从254nm处记录的紫外色谱中提取腺苷的峰面积。使用外部校准溶液进行绝对定量。准备浓度为0.1、0.5、1、5、10、50、100和500nM的校准溶液,用于MS/MS检测修正,每个修饰含有等量的内标。每种稀释液注入10μL,在1-5000fmol范围内进行校准。对于腺苷,准备浓度为0.1、1、10和100fmol的校准溶液。每种稀释液注入5μL,在0.5-500pmol范围内进行校准。响应因子对应于校准曲线线性拟合的斜率(峰面积对应于各自的量)。X(每个修主核苷的修饰量)=绝对定量,每个主核苷修饰量A(MS mod)=各自修饰的MS峰面积A(MS ISTD)=内标质谱峰的面积n(ISTD)=每个样品的内标量rf(MS mod/MS ISTD)=各自修饰物与内标物之比的响应因子A(UV腺苷)=腺苷的紫外峰面积RF(UV腺苷)=相应修饰的响应因子对于已定义的已知序列的mRNA:修饰核苷的数量可以归一化为RNA分子的数量。X(mod/RNA)=绝对定量,每个RNA分子的修饰量N(腺苷)=RNA序列中各自修饰的数目或者,可以选择另一种主核苷(C、U或G)进行归一化。防止在酶促聚腺苷酸化的情况下,导致未知数量的腺苷。参考文献:USP:Analytical Procedures for mRNA Vaccine Quality (Draft guidelines: 2nd Edition)
  • 核酸降解知多少
    导语在实验过程中,最心累的莫过于好不容易提取的核酸却降解了。那么核酸为什么会发生降解呢,我们又该如何预防呢?关于核酸降解,你了解多少呢?让我们一起对核酸降解一探究竟吧。 什么是核酸 核酸是一种高分子化合物,核苷酸是构成核酸的基本单位。核酸水解后得到许多核苷酸,核苷酸是组成核酸的基本单位,即组成核酸分子的单体。一个核苷酸分子是由一分子含氮的碱基、一分子五碳糖和一分子磷酸组成的。根据五碳糖的不同可以将核苷酸分为脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。如果5-碳糖是核糖,则形成的聚合物是RNA;如果5-碳糖是脱氧核糖,则形成的聚合物是DNA。 核酸降解本质 核酸降解是DNA/RNA分子中的碱基和戊糖间的氮糖苷键,或磷酸二酯键在物理因素、化学因素和生物因素等作用下发生水解,使DNA/RNA链发生断裂。核苷磷酸化酶:能分解核苷生成含氨碱基和戊糖的磷酸酯酶。广泛存在于生物体内,催化的反应可逆。可在核苷水解酶作用下继续分解核苷成嘌呤碱、嘧啶碱和戊糖。核苷水解酶:主要存在于植物和微生物体内,只水解核糖核苷。 核酸降解原因 DNA降解的因素很多,主要分为物理因素,化学因素和生物因素。一、物理因素:温度,机械剪切力、核酸的反复冻融、高温煮沸及辐射等。二、化学因素:PH值,水解反应,氧化反应等。三、生物因素:酶解及微生物侵染等作用。一、物理因素的影响★ 温度:高温条件下,RNA不稳定,易加速磷酸二酯键的水解,使核酸降解;★ 机械剪切力:包括剧烈震荡、搅拌、细胞突然至于低渗溶液中,以及让溶液快速通过狭长的孔道;★ 核酸的反复冻融、高温煮沸及辐射等,均会导致核酸的降解。二、化学因素影响水解★ PH值:氢离子参与催化磷酸二酯键、糖苷键的水解,但糖苷键比磷酸二酯键更易被酸水解。过高或过低的PH值都易破坏复键。核酸(特别是RNA)在碱性溶液中十分容易降解;★ 氧化反应:会氧化碱基中的含氨杂环,使其变性,从而改变一级与二级的核酸构象;★ 苯酚在空气中被氧化生成醌,它能够产生自由基,直接用于DNA的分离,会使磷酸酯键断裂,造成DNA的降解。三、生物因素影响★ 酶解:核酸酶可以催化水解多聚核苷酸链中的磷酸二酯键,直接破坏核酸的一级结构,使其降解。1.核酸酶(磷酸二酯酶)核酸内切酶:在环境或生物体内具有识别双链DNA分子中特定核苷酸序列,并由此切割DNA双链的核酸内切酶统称为限制性核酸内切酶。作用方式从多聚核苷酸链中间开始,在某一个位点切断磷酸二酯键。如DNase,RNase等。核酸外切酶:核酸外切酶的作用方式是从多聚核苷酸链的一端(3' -端或5' -端)开始,逐个水解切除核苷酸。如蛇毒磷酸二酯酶,牛脾磷酸二酯酶等。2.核苷酸酶(磷酸单酯酶)专一性的磷酸单酯酶:3' -核苷酸酶,5' -核苷酸酶非专一性磷酸单酯酶。★ 微生物侵染:微生物会将DNA作为营养物质或是其分泌的化学物质含酶。 预防降解的方法 预防RNA降解的方法:★ 去除环境中RNase酶的污染或强有力地抑制其活性。★ 获取样品后最好立即提取RNA,若无条件立即实验,应于-80℃液氮中保存样品,提取时取出样品后立即在低温下研磨裂解细胞,以防RNA降解。★ 在总RNA提取分离的最初阶段,联合使用Rnase的特异抑制剂,尽可能的灭活胞内的Rnase的活性。★ 避免样品的反复冻融。★ 保证裂解液的质量,裂解液的用量不足,也会导致RNA降解。★ RNA提取后,放入-80℃保存,防止降解。预防DNA降解的方法:★ 简化操作步骤,缩短提取过程,以减少各种有害因素对核酸的破坏;★ 减少化学物质对DNA的降解,为避免过酸、过碱对DNA双链中磷酸二酯键的破坏;★ 防止基因组DNA的生物降解,主要是DNase降解基因组DNA,Dnase需要二价金属阳离子Mg2+等的激活,可用EDTA等金属离子整合剂整合Mg2+以抑制Dnase的活性;★ 减少物理因素对DNA的降解,物理降解因素主要包括机械剪切力(如剧烈震荡、搅拌等);★ 避免样品的反复冻融,可将DNA分装保存于缓存液中;★ 所有试剂应用无菌水配制,耗材经高温灭菌;★ 避免DNA的过高温处理等。
  • 前沿合作丨挖掘蓝藻中的遗传秘密—修饰核苷鉴定新思路
    特邀:海南大学南海海洋资源利用国家重点实验室林桓课题组林桓,海南大学南海海洋资源利用国家重点实验室副研究员,海南省领军人才,《Marine Resource and Ocean Science》编委,曾任岛津制作所全球应用技术开发中心副主任研究员。主要研究领域是基于高分辨以及定量质谱的核酸修饰生理学意义挖掘,在《Nature Communications》,Nucleic Acid Research等重要期刊发表过论文。 海南大学林桓副研究员团队以模式蓝藻(细长聚球藻 PCC 7942)为研究对象,与岛津广州分析中心展开深入合作,通过微流液相色谱仪(岛津Nexera Mikros)结合三重四级杆质谱仪(岛津LCMS-8050)建立了一套兼具灵敏度与特异性的修饰核苷鉴定方法,并对细长聚球藻PCC 7942 总tRNA组分中存在的修饰核苷进行了检测分析,为修饰核苷的鉴定提供了一种新思路。成果于2021年7月发表在《Journal of Separation Science》。 生物体中的RNA元件,包括核糖体RNA,信使RNA,转运RNA,剪接体RNA,miRNA等,均需要经历转录后修饰成为成熟的分子。这些修饰对实现RNA元件的功能至关重要,例如新冠病毒mRNA疫苗必须在RNA链上掺入修饰核苷才能在人体中稳定表达。RNA转录后修饰主要发生在核糖核苷(A/U/C/G)的碱基或核糖上,以共价结合的方式连接一个或多个化学基团。近年研究表明RNA修饰种类和修饰率的变化参与到RNA代谢及功能实现的全过程,具有重要生理学意义[1-5]。 ☆ 新思路 ☆ 分析方法灵敏度提高有三种途径:• 更高效的前处理技术以实现目标物的富集和基质/杂质的清除;• 更优越的分离手段,得到更纯、更集中流出的色谱峰以提高目标物的瞬间浓度;• 更先进的检测技术以提高目标物信号响应。 目前质谱仪因其通用性高、选择性好和灵敏度高,是主流的检测技术,其中,灵敏度是评价质谱等级的重要指标之一。质谱仪的灵敏度受多方面影响,其中可以通过降低进入离子源的液流,有效提高离子化效率,从而较大提高质谱检测灵敏度。如目前比较常见的Nano液相、Micro液相和Semi-micro常规分析型液相,我们来做一下性能对比。 三种液相系统的性能对比 Nano液相的液量有利于LCMSMS离子源的去溶剂化,从而提高质谱响应。但是由于液流过低,其通量较小;另外,纳升级的流速对输液泵的精度和脉冲控制要求非常高,再加上其精密的部件对使用和维护都有很高的要求。故现有技术下Nano液相的通量和稳定性无法达到常规分析型液相的水平。而Semi-micro常规型液相已成为相对成熟、应用范围相对广的分析手段,这两项指标非常优异,但是,由于较大的液流,导致进入离子源,尤其是ESI离子源之后,其去溶剂化效率较差,灵敏度无法进一步提高。 Micro液相的色谱柱内径介于0.1~1.0 mm之间,流速一般介于1~100 μL之间,这一流速下的仪器稳定性、耐用性和维护性都比Nano液相有大幅提高,通量接近半微量分析型液相,而其去离子效率相比半微量分析型液相大大提高。因此Micro液相没有明显的短板,理论上是三种液相中相对理想的技术。 岛津微流量液相质谱联用系统 Mikros-LC+LCMS-8060 ☆ 成果快览 ☆ • 在本研究中研究人员报道了尿苷及其衍生物在低温及高有机溶剂的条件下容易析出造成信号变动,指出了利用HILIC等亲水原理的核苷酸LCMS分析中需要注意的问题。• 利用岛津微流量液相质谱联用系统测试了总tRNA组分中24个核苷标样,确定了各个标样所用的母离子和子离子,以及在HILIC色谱柱中的保留时间。通过多反应监测及保留时间,可以区分这些修饰核苷及其同分异构体。 核苷标样微流量液质系统色谱图 • 测定了24个修饰核苷标样的最小检出量,运用微流液相色谱—三重四极杆质谱联用仪检出下限为0.1-1 fmol,而一般用于鉴定修饰核苷所用的半微流液相色谱—三重四极杆质谱联用仪的检出下限为1-10 fmol。• 运用上述建立的方法,对细长聚球藻 PCC 7942中的修饰核苷进行定量检测,仅需含25 ng总tRNA组分的样品,即可得到清晰的质谱结果,而在传统的半微流液相色谱—三重四极杆质谱联用仪上得到相同结果,至少需要含100 ng的总tRNA组分的样品[6, 7]。 细长聚球藻样品图 ☆ 专家观点 ☆ 海南大学林桓副研究员:修饰核苷中尿嘧啶核苷及其衍生物电离困难及各修饰核苷同分异构体之间不易区分的特点一直是质谱检测的难点。同时常规的半微流液相色谱—三重四极杆质谱联用仪检出限较高,需要的样品量较大,这也是不易提取的样品检测的制约条件之一。该研究依托岛津公司强大的质谱分析平台,首次使用微流液相色谱—三重四极杆质谱联用仪分离鉴定总tRNA组分中的修饰核苷,灵敏度较半微流液相色谱——三重四极杆质谱联用仪提高了10倍以上。该方法可支持表观转录组学的发展。 【参考文献】[1] Lin H, Miyauchi K, Harada T, Okita R, Takeshita E, Komaki H, Fujioka K, Yagasaki H, Goto Y-i, Yanaka K, Nakagawa S, Sakaguchi Y, Suzuki T. CO2-sensitive tRNA modification associated with human mitochondrial disease. Nature Communications. 2018 9: 1875.[2] Lian H, Wang Q H, Zhu C B, Ma J, Jin W L. Deciphering the Epitranscriptome in Cancer. Trends in Cancer. 2018: S2405803318300219.[3] Schimmel, Paul. The emerging complexity of the tRNA world: mammalian tRNAs beyond protein synthesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2017.[4] Thomas J M, Batista P J, Meier J L. Metabolic Regulation of the Epitranscriptome. Acs Chemical Biology. 2019.[5] Chionh Y H, Mcbee M, Babu I R, Hia F, Lin W, Zhao W, Cao J, Dziergowska A, Malkiewicz A, Begley T J. tRNA-mediated codon-biased translation in mycobacterial hypoxic persistence. Nature Communications. 2016 7: 13302.[6] Kimura S, Dedon P C, Waldor M K. Comparative tRNA sequencing and RNA mass spectrometry for surveying tRNA modifications. Nature Chemical Biology. 2020.[7] Su D, Chan C T Y, Gu C, Lim K S, Chionh Y H, Mcbee M E, Russell B S, Babu I R, Begley T J, Dedon P C. Quantitative analysis of ribonucleoside modifications in tRNA by HPLC-coupled massspectrometry. Nature Protocols. 2014 9: 828-841. 本文内容非商业广告,仅供专业人士参考。
  • 我国科学家揭示特殊DNA的合成机制
    脱氧核糖核酸(DNA)是生命体的遗传物质,决定生物的特征和多样性。生命的遗传信息存储在由腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)四种碱基组成的DNA序列中。1977年前苏联科学家在感染蓝细菌的一株噬菌体中发现由2,6-二氨基嘌呤(Z)、G、C、T组成的DNA,该类特殊DNA中的Z完全取代了正常的A,且Z与T配对形成更稳定的三个氢键,极大地改变了DNA的物理化学特征。长期以来,特殊DNA的合成机制及存在的普遍性和生理意义一直是未解之谜。  国家重点研发计划“合成生物学”重点专项“新天然与人工产物的定向挖掘和高效合成的平台技术”项目在该特殊DNA的合成机制研究上取得重大进展。天津大学研究团队联合上海科技大学、美国伊利诺伊大学等研究团队,解析了该特殊DNA的合成机制,其中包括关键酶参与的2,6-二氨基嘌呤脱氧核糖核苷酸(dZTP)的生成和脱氧腺苷三磷酸(dATP)的消除,并发现这种特殊DNA遍布全球,大量能感染细菌的噬菌体都含有这种DNA。该研究还发现该特殊DNA可以规避识别位点中含有A的限制性内切酶的切割,因此含有该种特殊DNA的噬菌体可以逃避宿主的免疫防御从而具有进化优势。  该项重大发现对生命起源、物种进化、系统生物学的研究具有重要理论意义,在超级耐药菌感染的治疗、绿色无抗生素畜牧饲料和食品保存技术开发、新型纳米材料制备、DNA信息存贮等领域具有潜在应用价值。该研究成果近期发表在《Science》杂志上。   论文链接:https://science.sciencemag.org/content/372/6541/512.full  注:此研究成果摘自《Science》杂志,文章内容不代表本网站观点和立场,仅供参考。
  • 沃特世解决方案——乳制品中核苷酸分析
    乳粉中添加尿苷酸(UMP)、胞苷酸(CMP)、腺苷酸(AMP)、鸟苷酸(GMP)、肌苷酸(IMP)等多种核苷酸,用来提高婴儿的免疫调节功能和记忆力。 核苷酸分析目前存在的挑战: 由于核苷酸极性很大,用反相色谱柱很难达到很好的保留和分离,所以为了提高核苷酸的保留往往会尝试离子对色谱方法,离子对色谱方法存在以下问题: 1. 容易起泡,管路中有气泡,影响分析 2. 平衡时间长,延长了分析工作时间 3. 难以清洗,对色谱柱有损伤 4. 易变质,容易堵塞管路,损伤仪器 沃特世公司(Waters® )解决方案: 1. 避免使用离子对试剂,仅需要使用挥发性乙酸铵、乙腈体系 2. 建议使用Oasis® HLB SPE小柱利用通过净化方式进行乳粉样品前处理,提供更洁净的样品,提高灵敏度、延长色谱柱及仪器寿命 3. 使用Amide色谱柱分析,用一般反相流动相保留极性化合物,方法简单快速 实验结果及色谱图 5种核苷酸混合标准品的6针连续进样分析结果 实际样品6针连续进样分析图谱 小结: 本实验采用Waters ACQUITY UPLC® H-Class 系统,BEHTM Amide 1.7&mu m 2.1*100mm色谱柱,对婴幼儿奶粉中的5种核苷酸进行分析方法的开发,实验结果表明: 1.在Waters ACQUITY UPLC H-Class 系统上,采用BEH Amide 1.7&mu m 2.1*100mm色谱柱能迅速分离奶粉中5种核苷酸标准品,且5种化合物的分离度均在3.0以上;对于实际的奶粉样品,5种核苷酸样品及杂质之间的分离度均在1.6以上。 2.该分析方法重现性好。其中,奶粉样品6次连续进样分析结果中,5种核苷酸保留时间RSD值均小于0.12%。 3.Waters ACQUITY UPLC H-Class 系统,具有四元溶剂的Auto&bull Blend PlusTM功能,因此,在该系统上进行方法开发非常灵活、方便,节约了溶剂配置的大量时间,大大提高了实验的效率,从而大幅度的降低了实验的溶剂消耗,降低了实验成本。 产品订购及促销信息: Oasis HLB 6cc/150mg P/N 186003379 XBridge Amide 3.5&mu m4.6*150mm column P/N 186004869 ACQUITY UPLC BEH Amide 1.7&mu m 2.1*100mm P/N 186004801 点击此处下载完整解决方案 联系方式: 叶晓晨 沃特世科技(上海)有限公司市场服务部 xiao_chen_ye@waters.com 周瑞琳(GraceChow) 泰信策略(PMC) 020-83569288 13602845427 grace.chow@pmc.com.cn
  • 发布DNA多通道肉源/毛发物种鉴别试剂盒新品
    产品类别DNA多通道肉品物种鉴定试剂盒,3种检测数量,针对鉴定原肉和加工食品,同时鉴定六种动物样本的DNA(牛肉、鸡肉、猪肉、马肉、羊肉、兔肉)DNA毛发物种鉴定试剂盒,2种检测数量,通过动物毛发样本对物种进行鉴定,可同时检测9种物种,猪、熊、猫、狗、人、家鼠、田鼠、兔、狸。DNA多通道肉源物种鉴别试剂盒,3中检测数量,针对鉴定原肉和加工食品,同时鉴定五种动物样本的DNA(猪肉、狗肉、家鼠肉、田鼠肉等)。DNA细菌病原体检测试剂盒,根据DNA信息快速筛选食品中的沙门氏菌、志贺氏杆菌、产生细胞毒素的大肠杆菌等。 优势特点分析快速,整个测试时长不超过3个小时;一份试剂可同时鉴定5-9种物种;DNA检测限为pg级别;肉类参假检测灵敏度在0.01-0.1%;整个检测过程无需电池操作;脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic acid,缩写为DNA)又称去氧核糖核酸,是一种最重要的生命基础分子,可组成遗传指令,以引导生物遗传、生物发育与生命机能运作。主要功能是长期性的信息储存,可比喻为“蓝图”或“食谱”。其中包含的信息,是建构细胞内其他化合物的最终源头。带有遗传信息的DNA片段称为基因,其他的DNA序列,有些直接以自身构造发挥作用,有些则参与调控遗传信息的表达。DNA是一种长链聚合物,其基本组成单位称为核苷酸,其中的脱氧核糖与磷酸借由酯键相连,组成DNA长链的骨架。每个糖单位都会与某一种碱基相连,组成生物界DNA的碱基主要有四种,分别称为A、T、C、G,这些碱基沿着DNA长链排列,形成的序列,即是遗传信息,用以指导RNA的合成,进而指导蛋白质的合成。创新点:全新的采用DNA技术同时鉴别多种物种,检测时间短,检测效率高,操作简单,打破传统单一物种检测技术。 DNA多通道肉源/毛发物种鉴别试剂盒
  • 博奥生物二代测序仪获准上市
    2015年2月12日,国家食品药品监督管理总局对博奥生物集团研制生产的BioelectronSeq 4000基因测序仪和胎儿染色体非整倍体(T21、T18、T13)检测试剂盒(半导体测序法)分别颁发了医疗器械注册证。   BioelectronSeq 4000基因测序仪通过生物电子芯片对核苷酸聚合反应中的酸碱度信号进行检测,用于人脱氧核糖核酸(DNA)测序,以检测基因的序列变化。该仪器可在临床上与此次由国家食品药品监督管理总局同时批准的体外诊断试剂以及仪器配套的专用生物信息分析软件配合使用,适用于胎儿染色体21三体、18三体、13三体的非整倍体检测。   胎儿染色体非整倍体(T21、T18、T13)检测试剂盒(半导体测序法)用于定性检测孕周为12-24周的高危、单胎孕妇外周血血浆中胎儿游离脱氧核糖核酸(DNA),通过分析样本中胎儿游离DNA的21号、18号及13号染色体数量的差异,对胎儿染色体非整倍体疾病21-三体综合征(唐氏综合征)、18-三体综合征(爱德华综合征)和13-三体综合征(帕托综合征)进行产前辅助诊断。   博奥生物集团是我国集成医疗(疾病的预测、预防和个体化治疗)领域的领军型企业,自2000年成立以来开发和推出了大量高水平的生物芯片创新性产品与服务,在科技部863和卫计委重大专项支持下构建了一套基于生物芯片的核酸提取、基因扩增、直至微阵列杂交测序和微流控测序的完整的分子诊断技术平台,为我国基因检测技术进入世界先进行列做出了重要贡献。   BioelectronSeq 4000基因测序仪、   胎儿染色体非整倍体(T21、T18、T13)检测试剂盒(半导体测序法)   BioelectronSeq 4000基因测序仪医疗器械注册证   胎儿染色体非整倍体检测试剂盒医疗器械注册证
  • 沃特世6月27日"肽药及寡核苷酸的最新分析技术"网络讲座即将启动
    日期: 2017年6月27日时间: 14:00-15:30地点: 网络讲座语言: 简体中文 肽药和寡核苷酸药物是新兴的药物研发热点,其明确的疗效吸引了众多的关注。作为有特定结构的化合物类型,两者的分析难点也非常突出。强极性基团的作用,导致其极易拖尾,如何保证对称的峰形至关重要。相对小分子,两类药物的杂质结构变化更小,对选择性的要求也就更高。如何做到完美的峰形,开发出一个成功的分析方法?怎样提高制备纯化的效率?本次讲座讲对这些问题提出切实的解答,提高您的研发效率。 讲座概要: 肽药的进展和分析挑战肽药的最新分析技术-研发到QC的无缝转换寡核苷酸的应用和分析挑战寡核苷酸多元分析技术-保证最高的纯度色谱柱的质量控制之道 建议参加人员:从事制药研发的制药企业,引物/探针的企业或CRO,以及进行相关研究的高校客户。 主讲人:胡学桥,沃特世高级应用工程师 讲座时间:2017年6月27日(周二),下午2:00-3:30 报名方式: 登录沃特世官网并搜索“肽药及寡核苷酸的最新分析技术”即可进行注册报名。 此网络讲座免费报名参加。您只需要使用一台链接网络的电脑即可参加,如果您需要在讲座中加入讨论或语音提问,请您提前准备好麦克风。收到您的注册信息后我们会筛选并在讲座前一天通过电子邮件给您发送讲座登录链接。如有任何问题请拨打电话:021-61562642或发送邮件至minxing_guo@waters.com,谢谢。
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