莱伯泰科:PITC为柱前衍生试剂的氨基酸分析
摘要: 采用异硫氰酸苯酯(PITC)为柱前衍生试剂进行氨基酸衍生,二元流动相程序洗脱方法分离17种常见氨基酸,分离效果好,无需柱后反应装置,反应速度快,保留时间重现性好。实验部分:仪器与试剂:Labtech LC600高效液相色谱仪;Labtech 氨基酸色谱柱(5um, 250×4.6mm);17种氨基酸标样;乙腈(色谱纯);水(超纯水);醋酸钠(分析纯);醋酸(分析纯);三乙胺;异硫氰酸苯酯。色谱条件:流动相A:乙腈/B=1/1(V:V),流动相B:50mmolNaAC缓冲溶液(PH=6.5)流速:1ml/min,进样1uL(自动进样方式),检测波长:254nm,柱温为40℃。梯度程序:Time(min)Mobile phase A(V/V)Mobile phase B(V/V)0109051090203070456040509555595555:101090751090柱前衍生步骤:1.17种氨基酸混合标准溶液:分别称取适量天门东氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、胱氨酸于容量瓶中,以0.1N盐酸定容,得到2.5mmol/L混合标准贮备液(其中胱氨酸1.25mmol/L)。2.1mol/L三乙胺乙腈溶液:取三乙胺139ul,加乙腈860ul。3.1mol/L异硫氰酸苯酯(PITC)乙腈溶液:取12ulPITC加乙腈988ul。4.对照品溶液的衍生:取氨基酸溶液800ul置离心管中,加1mol/L异硫氰酸苯酯(PITC)乙腈溶液400ul,1mol/L三乙胺乙腈溶液400ul,混匀,室温放置1小时,加入正己烷1.6ml,放置10分钟,取下层溶液进样。 结果与讨论: 取衍生好的氨基酸标准溶液样品,连续测定10次,因**次进样系统未完全平衡好,保留时间有漂移,**一次进样由于室内温度较高,考虑到样品放置时间长可能会对峰面积有影响,故舍去**与**一次进样,统计8次进样结果和重叠色谱图如下, 氨基酸重复性结果(n=8)Amino AcidRetention timeAreaRSD%RSD%Asp0.316.97Glu0.257.19Ser0.157.08Gly0.126.59His0.116.50Arg0.116.97Thr0.116.26Ala0.137.29Pro0.116.70Tyr0.116.81Val0.156.69Met0.156.75Cys-Cys0.1917.04Lle0.196.73Leu0.206.90Phe0.176.62Lys0.158.90 8次重复进样色谱图 从数据可得知保留时间有较好的重现性,**RSD0.31%,由于进样1ul,进样量较小,所以峰面积的RSD稍大,在实际测定工作当中可以加大进样量和添加内标的方式改善。