细胞分离液

用体外方法对机体各种具有免疫反应的细胞分别作鉴定、计数和功能测定，是观察机体免疫状态的一种重要手段。为此，须将各种参与免疫反应的细胞从血液或脏器中分离出来。参与免疫反应的细胞主要包括淋巴细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等。由于检测的目的和方法有同，分离细胞的需求和技术也异。有的仅需分离白细胞，有的则需分离单个核细胞（mononuclearcell），其中含淋巴细胞和单核细胞（monocyte），有的则需分离T细胞和B细胞以及其亚群。分离细胞选用的方法应力求简便可行，并能获得高纯度、高获得率、高活力的细胞。现用分离细胞群的原则，一是根据各类细胞的大小、沉降率、粘附和吞噬能力加以组分，另一则按照各类细胞的表面标志，包括细胞表面的抗原和受体加以选择性分离。 一、白细胞的分离 （一）血液中红细胞与白细胞比例约600～1000:1，两者的比重不同其沉降速度亦异，通常用两种方法加以分离。 本法是利用血细胞自然沉降率的分离法，采集血液后应及时抗凝，通常选用肝素抗凝法。肝素能阻止凝血酶原转化为凝血酶，从而抑制纤维蛋白原形成纤维蛋白而防止血液凝固。操作原则是将含抗凝血的试管直立静置室温30～60min后，血液分成明显三层，上层为淡黄色血浆，底层为红细胞，紧贴红细胞层上面的灰白层为白细胞，轻轻吸取即得富含白细胞的细胞群，离心洗涤后加入少量蒸馏水或含氯化铵的Gey溶液，经短时间的低渗处理，使红细胞裂解，经过反复洗涤可得纯度较高的白细胞悬液。 （二）聚合物加速沉淀法 本法是利用高分子量的聚合物如明胶、右旋糖酐、聚乙烯吡喀烷酮（polyvinylpyrolidone，PVP）等使红细胞凝集成串，加速红细胞沉降，使之与白细胞分离。本法的细胞获得率比自然沉降法高。

组织材料若来自血液、羊水、胸水或腹水的悬液材料，最简单的方法是采用1000r/min的低速离心10分钟，若悬液量大，可适当延长离心时间，但速度不能太高，延时也不能太长，以避免挤压或机械损伤细胞，离心沉淀用无钙、镁PBS洗两次，用培养基洗一次后，调整适当细胞浓度后再分瓶培养，若选用悬液中某些细胞，常采用离心后的细胞分层液，因为，经离心后由于各种细胞的比重不同可在分层液中形成不同层，这样可根据需要收获目的细胞。不同比重的分层液的配制和具体分离方法详见淋巴细胞分离培养的章节。　　　　实体组织材料的细胞分离方法　　　　对于实体组织材料，由于细胞间结合紧密，为了使组织中的细胞充分分散，形成细胞悬液，可采用机械分散法(物理裂解)和消化分离法。　　　　(一)机械分散法　　　　所取材料若纤维成分很少，如脑组织，部分胚胎组织可采用剪刀剪切、用吸管吹打分散组织细胞或将已充分剪碎分散的组织放在注射器内(用九号针)，使细胞通过针头压出，或在不锈钢纱网内用钝物压挤(常用注射器钝端)使细胞从网孔中压挤出。此法分离细胞虽然简便、快速，但对组织机械损伤大，而且细胞分散效果差。此法仅适用于处理纤维成分少的实验室试剂软组织。　　　　(二)消化分离法　　　　组织消化法是把组织剪切成较小团块(或糊状)，应用酶的生化作用和非酶的化学作用进一步使细胞间的桥连结构松动，使团块膨松，由块状变成絮状，此时再采用机械法，用吸管吹打分散或电磁搅拌或在摇珠瓶中振荡，使细胞团块得以较充分的分散，制成少量细胞群团和大量单个细胞的细胞悬液，接种培养后，细胞容易贴壁生长。　　　　1、酶消化分离法　　　　酶消化分离法常采用胰蛋白酶和胶原酶，其分离方法如下：　　　　(1)胰蛋白酶分散技术　　　　胰蛋白酶(简称胰酶)是广泛应用的消化剂。胰蛋白酶是一种胰脏制品，对蛋白质有水介作用，主要作用于赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，使细胞间质中的蛋白质水介而使细胞分散开，在常用人血清 AB的蛋白酶中由于产品的活力和纯度不同，对细胞的消化能力也不同，胰蛋白酶对细胞的作用，取决于细胞类型、酶的活力、配制的浓度、消化的温度、无机盐离子、pH以及消化时间的长短等。　　　　①细胞类型胰蛋白酶适于消化细胞间质较少的软组织,能有效地分离肝、肾、甲状腺、羊膜、胚胎组织、上皮组织等。而对含结缔组织较丰富的组织,如乳腺、滑膜、子宫、纤维肉瘤、肿瘤组织等就无效，但若与胶原酶合用,就能增加其对组织的分离作用。　　　　②酶的活力市售的胰蛋白酶,其活力都经过测定而有效，但配制时必须新鲜，需保存在低温冰箱中，消化时的pH和温度都要适宜，否则会影响活力，细胞的分散直接与酶的活力有关，最终使用活力为1:200或1:250，56℃pH8.0时活力最强。　　　　该酶为粉剂，保藏时要防潮，室内温度不宜过高，保存时间不能太长，若粉剂结团块,说明该部分受潮或失效。　　　　③酶的浓度胰蛋白酶一般采用的浓度为0.1%-0.25%(活力1:200或1:250),但遇到难消化的组织时，浓度可适当提高，消化时间适当延长。浓度高对细胞有毒性，而较低浓度的胰蛋白酶在培养液中可促进细胞的增殖，若培养液中加入血清，其少量胰蛋白酶可被血清中抗胰蛋白酶因子所清除。　　　　④温度一般认为胰蛋白酶在56℃时活性最强，但由于对细胞有损害而不能被采用，常使用的温度为37℃，通常在37℃进行消化比室温作用快。　　　　⑤pHpH8~pH9是胰蛋白酶活力适宜范围，但随碱性的增加其活力也随之减少，活性强分散快，细胞也容易被消化下来，消化分离细胞时PH只能选用7.6～8.0之间，否则对细胞有损伤。　　　　⑥无机盐离子若用含有钙和镁的盐类溶液来配制胰蛋白酶时，可以发生抑制胰蛋白的消化作用。因此,在配制时应采用无钙镁离子的PBS配制。　　　　⑦消化时间如果细胞消化时间过长，可以损害细胞的呼吸酶，从而影响细胞的代谢，一般消化时间为20分钟为宜，冷消化时使用低浓度消化液，于4℃过夜也可。　　　　分离方法如下：　　　　①过夜冷消化将取得的组织用Hanks液洗三次，剪成碎块大小为4毫米左右，用Hanks液洗2~3次以除去血球和脂肪组织，再加入0.25%的胰蛋白酶，摇匀后放4℃过夜，次日再用Hanks液洗涤，弃去上清，共洗2~3次，然后，加入少量营养液吹打分散，细胞计数，按适当的浓度分瓶培养。　　　　②多次提取消化法多次提取消化法有以下三种：　　　　热消化多次提取将剪碎的细胞块加入0.25%胰蛋白酶37℃水浴中消化15~20分钟，然后经洗涤后用营养液分散制成细胞悬液，按合适的浓度分瓶培养，然后将留下的未彻底消化的组织按上述方法操作，再消化提取细胞。　　　　冷消化多次提取方法同上，只是消化温度为4℃。　　　　先热消化后冷消化将组织块先用胰蛋白酶于37℃下消化20分钟经洗涤后用营养液分散，制成悬液，剩余未消化的小组织块经洗涤后用胰酶于4℃下过夜，次日再提取细胞，分散成悬液，分瓶培养。　　　　(2)胶原酶(Collagenase)消化法　　　　胶原酶是一种从细菌中提取出来的酶，对胶原有很强的消化作用。适于消化纤维性组织、上皮组织以及癌组织，它对细胞间质有较好的消化作用，对细胞本身影响不大，可使细胞与胶原成分脱离而不受伤害。该酶分离效果好，即使有钙、镁离子存在仍有活性，故可用PBS和含血清的培养液配制，即操作简便又可提高细胞成活率，最终浓度200u/mL或0.1～0.3mg/mL。细胞培养此酶消化作用缓和，无需机械振荡，但胶原酶价格较高，大量使用将增加实验成本。　　　　经过胶原酶消化后的上皮组织，由于上皮细胞对酶有耐受性，可能有一些上皮细胞团块尚未被完全消化开。成小团块的上皮细胞比分散的单个上皮细胞更易生长，因此不必要再进一步消化处理。　　　　鉴于胰蛋白酶和胶原酶的生物学活性和在不同浓度下消化各种组织小块所需的时间(小时)有差异，以及两者价格不等，有人采用胶原酶与胰蛋白酶并用，同时还可加透明质酸酶(对细胞表面糖基有作用)，采用两者的联合消化作用，对分散大鼠和兔肝、癌组织非常有效。　　　　除上述两种最常用的消化酶外，还有链霉蛋白酶、粘蛋白酶、蜗牛酶、弹性蛋白酶、木瓜蛋白酶，近年来，还有一种从灰霉菌中提取的Pronase新酶分散细胞更佳。　　　　2、非酶消化法(EDTA消化法)　　　　EDTA是一种非酶消化物，又称螯合剂或Versene，全名为乙烯二胺四乙酸。常用不含钙、镁离子的PBS配成0.02%的工作液，对一些组织，尤其是上皮组织分散效果好，该化学物质能与细胞上的钙、镁离子结合形成螯合物，利用结合后的机械力使细胞变圆而分散细胞或使贴壁细胞从瓶壁上脱离，缺点是细胞易裂解或贴壁细胞从瓶壁上脱离时呈片状，有团块，常不单独使用，但可与胰蛋白酶混合使用(1:1或2:1)，不仅利于细胞脱壁又利于细胞分散，可降低胰酶的用量和毒性作用。　　　　消化分离法的操作步骤：　　　　(1)剪切把组织块剪碎，呈1~5mm3大小的组织块。　　　　(2)加液漂洗将碎组织块在平皿(或三角烧瓶)中用无钙镁PBS洗2-3次(采用倾斜，自然沉降法)。　　　　(3)消化加入消化液(胰蛋白酶或胶原酶或EDTA)于37℃水浴中作用适当时间(中间可轻摇1~2次)，若组织块膨松呈絮状可终止，若变化不大可更换一次消化液，继续消化直至膨松絮状为止。胰蛋白酶消化时间不宜过长。　　　　(4)弃去消化液采用倾斜自然沉降或低速离心法尽量弃去消化液。　　　　(5)漂洗将含有钙、镁离子的培养基沿瓶壁缓缓加入，中止消化反应，采用漂洗法洗2-3次后，加入完全培养基。　　　　(6)机械分散采用吸管吹打或振荡法，使细胞充分散开后用纱网或3~4层无菌纱布过滤后分瓶培养，若要求不高可采用倾斜自然沉降5~10分钟，吸上层细胞悬液进行分瓶培养。

基本原理本分离单核细胞所用方法是Percoll非连续性密度梯度离心法，主要是根据不同细胞间密度的差别进行细胞分离。此法易操作，且使用通常的实验设备即可完成。试剂与器材•外周血单个核细胞（参见实验1）•PBS1×和PBS10×（无Ca2+、Mg2+），含0.5mM EDTA•胎牛血清（56℃，30分钟加热灭活）•HCl 1mol/l•Percoll分层液（密度=1.130g/ml,商品）•4g/l台盼蓝染液（溶解在PBS液中）•50ml聚丙烯圆锥管•毛细吸管•移液管（1、2、10ml）•CO2孵箱•超净台•有旋转桶转子装置的离心机•PH计操作步骤所有的操作应该在无菌条件下进行一．不同密度Percoll分层液的配制1. Percoll分层液储备液的制备：取未稀释的Percoll原液（从瓶中取）9ml+1ml PBS 10×（无Ca2+、Mg2+），用HCl 1PH至7.42. Percoll分层液（Ⅰ）（密度=1.080g/ml）的配制：取Percoll储备液3.12 ml（前一步配制）+1.88 ml PBS1×（无Ca2+、 Mg2+）3. Percoll分层液 （Ⅱ）（密度=1.069g/ml）的配制：取Percoll分层液（Ⅰ）2.68 ml+2.32ml PBS 1×（无Ca2+、Mg2+）4. Percoll分层液（Ⅲ）（密度=1.060g/ml）的配制：取Percoll分层液（Ⅱ）2.32 ml +2.68 ml PBS 1×（无Ca2+、Mg2+）二．不连续密度梯度制备1. 将洗涤过的8×107外周血单个核细胞重新悬浮在2ml的Percoll分层液（Ⅰ）（密度=1.080g/ml）在这层液体的表面上轻轻铺上2ml Percoll分层液（Ⅱ）（密度=1.069g/ml），后再于第二层液面上轻轻铺上2ml的Percoll分层液（Ⅲ）（密度=1.060g/ml）2. 20℃，在旋转转子中1000×g离心上步所形成的密度梯度90分钟（慢慢增加速度，无制动停转）。三．单核细胞的分离1. 离心后单核细胞存在于Percoll分层液（Ⅱ）和（Ⅲ）（密度较小的部分）之间的界面中。 （图1）图略(暂时)图1. Percoll非连续性密度梯度离心分离法2. 用毛细吸管仔细收集单核细胞。3. 用含1-5%胎牛血清的PBS 1×液洗涤细胞3次，4℃，400×g离心5分钟，弃上清液。4. 若需要进一步实验，将细胞重新悬浮于培养基中。5. 用台盼蓝拒染法测定细胞存活率。（参见第一章第一篇第一节）结果本法回收的细胞中单核细胞占70-100%（存活率应大于90%），淋巴细胞占0-20%，粒细胞占0-5%，红细胞占0-7%，血小板小于0.5%。实验要点1. 为了得到较好的结果，外周血单个核细胞分离后应立即使用。2. 所有操作过程应在18-20℃中进行。3. 仔细覆盖各种Percoll分层液，避免破坏其界面。4. 洗涤分离细胞3次，以除去残存的Percoll分层液和血小板。5. 如果所制备的细胞仍不纯，可使用包被有抗CD2、抗CD3、抗CD19抗体分子的磁珠， 以除去残存的NK、T、B淋巴细胞。

现如今市场上的ELISA试剂盒种类繁多，但是要如何找到适合你的那款呢？一款合适的细胞分离试剂盒可以说是实验成功的保障，因为只有获得正确的细胞，下游的分析结果才可能准确。目前，市面上有多种多样的分离试剂盒可供选择，它们的主要区别在于分离方法和筛选标志。正向选择VS负向选择细胞分离试剂盒的工作原理主要有两种，正向选择和负向选择。正向选择的试剂盒，使用与目标细胞直接结合的抗体来进行捕获。这种抗体通常与磁珠相连，可以利用磁铁将悬液中的抗体-磁珠-细胞复合物提取出来，再通过二抗将磁珠与目标细胞分开。负向选择的试剂盒也采用类似的抗体包被磁珠，不过这种试剂盒是通过去除样品中的非目的细胞，来间接捕获目的细胞。这两种细胞分离试剂盒如何取舍，主要取决于目标细胞的表面是否具有特异性强的筛选标志。这样的筛选标志能够实现特异性的捕获，避免所获得的细胞被非目标细胞污染。如果你的目标细胞刚好具有这样的筛选标志，那么正向选择的细胞分离试剂盒就是最佳选择。但如果目标细胞并不具有特异性强的筛选标志，那我们最好还是选用负向选择的细胞分离试剂盒。

[url=http://www.hexiyiqi.com/]离心机[/url]是一种结构复杂的高速旋转机械，它是利用离心力，不同物质在离心场中沉淀速度的差异，对混合溶液进行快速分离的专门设备，是一种将装有样品溶液的离心管、瓶或袋通过离心机转子置于离心轴上，利用转头绕轴高速旋转所产生的强大离心力，使样品中不同性质颗粒相互分离的特殊装置。可以实现样品的分析、分离。从转速看，台式离心机基本属于低速、高速离心机的范畴，因此，具有低速、高速离心机的特点。与落地式离心机相比，只不过只是尺寸和容量小一些。[align=center][url=http://www.hexiyiqi.com/hexi2012chanpinzhongxin/taishigaosulengdonglixinji/2012-10-17/69.html][b][img]http://www.hexiyiqi.com/d/file/hexi2012chanpinzhongxin/taishigaosulengdonglixinji/2012-10-17/0e080cd46b2ee061b55caabaaee8cbf2.jpg[/img][/b][/url][/align][align=center][b]台式低速离心机TD5A[/b][/align]离心机的式样和型号很多，有国产的和进口的，按用途可分为分析式离心机和制备式离心机；按转速可划分为：普通离心机（低速）80000r／min；特定细胞株的功能、行为和生化特性的分析在现有技术水平上只能通过相对纯的细胞株才能弄清，然而从组织、血液和其它体液标本中获得的细胞都是不同类型细胞的混合物，并且不同细胞或同一细胞株的不同周期与其它细胞相比，其代谢过程、生物特性和理化参数大多都有差异。细胞分离技术包括离心技术、流式细胞术和细胞电泳。离心是研究如细胞核、线粒体、高尔基体、溶酶体和微体，以及各种大分子基本手段。流式细胞术是对单个细胞进行快速定量分析与分选的一门技术。细胞电泳是指在一定PH 值下细胞表面带有净的正或负电荷，能在外加电场的作用下发生泳动。分离不同细胞株的方法概括起来可分为两大类：一是：根据细胞的物理学特性差异分离，包括低速离心机分离法、物理吸附法、凝胶色谱法和细胞电泳法等 二是：根据细胞的生物学特性差异分离，包括花环形成法和单层细胞免疫吸收法等。在诸多分离方法中，[url=http://www.hexiyiqi.com/hexi2012chanpinzhongxin/taishigaosulengdonglixinji/]低速离心机[/url]分离法根据细胞大小和密度进行分离，分离介质选择广泛，原理简单，对细胞损伤小，可适用于各种不同的研究目的，已成为生物学实验室最常规的分离工具。[align=center][url=http://www.hexiyiqi.com/hexi2012chanpinzhongxin/disulengdonglixinji/2013-06-15/228.html][b][img=台式低速冷冻离心机,550,550]http://www.hexiyiqi.com/d/file/hexi2012chanpinzhongxin/taishigaosulengdonglixinji/2019-05-14/73cd477dd28d613eb3c077a58b94614a.jpg[/img][/b][/url][/align][align=center][b]台式低速冷冻离心机TDL5M[/b][/align]

[b][url=http://www.f-lab.cn/cell-analyzers/puncher.html][b]单细胞转移分离系统[/b][/url]是可用于单细胞转移,单细胞分离和单细胞隔离,单细胞成像应用的多功能单细胞分离操作仪器,它可以实现从微孔芯片转移单细胞到细胞收集管中。单细胞转移分离系统[/b][color=#666666]集单细胞成像,单细胞隔离,单细胞选择功能于一体,自动聚焦成像。[/color][b]单细胞转移分离系统转移单细胞到Eppendorf微管，PCR微孔板或其它反应微管中,[/b][color=#666666]在隔离单细胞后，它可以对选定收集的细胞进行扫描并成像。[/color][b]单细胞转移分离系统[/b][color=#666666]采用Nikon Ti-2倒置荧光显微镜,配备自动扫描显微镜载物台,自动聚焦器件,高灵敏度荧光CCD相机和LED激发光源组建而成。[/color][img=单细胞转移分离系统]http://www.f-lab.cn/Upload/single-cell-isolation.JPG[/img][b]单细胞转移分离系统[/b]特点完全自动化，步进系统高质量单细胞荧光成像单细胞分离的效率超过90% 超过70%分离的细胞增殖 分离后兼容所有的单细胞的WGA工具包（放大器的‐1，picoplex，复制‐G）实惠微Wells基于硅微孔微腔。由薄膜封闭70µ m，井底直径（1µ m），包含一个单孔。样品流体进入威尔斯并从底部的孔隙中流出。单个细胞被拖着走。一旦单个细胞降落到孔隙上，流动停止，其他细胞就不会进入井内。有用的细胞被识别出来。选定的细胞穿孔从微孔到384孔PCR板或离心管等等。单细胞转移分离系统：[url]http://www.f-lab.cn/cell-analyzers/puncher.html[/url]

一、目的流感病毒的MDCK细胞分离方法是流感实验的关键技术，用于流感病毒的分离、培养。本SOP是为确保MDCK细胞分离流感病毒的操作准确、规范和可靠而制定。二、范围适用于实验室所有技术人员进行流感病毒的MDCK细胞分离。三、程序（一）生物安全要求H5,H7亚型高致病性禽流感病毒，H2N2亚型流感病毒的MDCK细胞分离实验室生物安全级别：BSL-3。实验操作人员需进行BSL-3防护，具体详见“生物安全个人防护SOP”。H5,H7亚型高致病性禽流感病毒，H2N2亚型流感病毒的MDCK细胞分离操作必须在BSL-3级实验室的生物安全柜中进行。其余流感病毒的MDCK细胞分离实验室生物安全级别：BSL-2。实验操作人员需进行BSL-2防护，具体详见“生物安全个人防护SOP”。其余流感病毒的MDCK细胞分离操作必须在BSL-2级实验室的生物安全柜中进行。（二）材料1、75％～90％成片的MDCK细胞，选用合适大小的细胞培养瓶和细胞培养板来用做病毒分离2、胰酶（牛胰腺来源Ⅷ型）3、HEPES缓冲液，1M母液 4、D-MEM培养基，Hank's液5、青、链霉素母液（10000U/mL 青霉素G；10000µg/mL硫酸链霉素 6、牛血清白蛋白组分Ⅴ，7.5%溶液7、临床样品0.5mL8、1mL无菌移液管9、10mL无菌移液管10、15mL无菌离心管（三）实验步骤1、准备病毒生长液（1）细胞维持液准备500mL D-MEM液中加入①青、链霉素母液 5mL（终浓度达：100U/mL青霉素；100µg/mL链霉素）②牛血清白蛋白组分Ⅴ 12.5mL（终浓度：0.2%）③HEPES缓冲液 12.5mL（终浓度：25mM）（2）病毒生长液每500mL细胞维持液中加入0.5mL的TPCK-胰酶（母液浓度为2mg/mL）使TPCK-胰酶的终浓度为2µg/mL。2．流感病毒MDCK细胞分离步骤：（1）75％～90％成片细胞的准备，以选取T25细胞瓶为例。①用40×物镜观察细胞生长状态。②轻轻倒出细胞生长液，用10mL的无菌移液管吸取6mL Hank's液分别清洗细胞3遍。（2）细胞培养瓶的接种①用无菌的移液管将清洗细胞的Hank's液从细胞培养瓶中移出。②用无菌的移液管吸取适量临床标本置于细胞培养瓶中，温和摇动数次。③然后放于37℃，5%CO2培养箱中吸附1～2h。④吸出接种物，用10mL的无菌移液管吸取6mL Hank's液分别清洗细胞2遍。然后加入6mL病毒生长液于细胞培养瓶中。⑤放置于33～35℃培养箱培养。⑥每日观察细胞病变情况。（细胞病变的特征是细胞肿胀圆化，细胞间隙增大，细胞核固缩或破裂，严重时细胞部分或全部脱落）。（3）细胞培养物的收获当75%～100%细胞出现病变时进行收获，收获之前可以将细胞放于-70℃冰箱，冻融1～2次，以提高收获标本的病毒滴度。即使无细胞病变也应该于接种后第7天收获。收获病毒液时，先温和摇动细胞瓶数次，然后用10mL的无菌移液管吸取病毒液置于15mL无菌离心管中，混匀病毒。收获的病毒液可以立即进行后续试验，或冻于-80℃冰箱待以后试验使用。

近日，美国麻省理工学院利用造价低廉的激光开发出一种从样品中分离某些细胞的新系统。该系统能在普通的玻璃载玻片上分离出1万多种细胞，这将有助于研究人员轻松完成许多在以前看来不可能的生物实验。而且，与其他细胞分离方法相比，该系统分离速度快、操作简单且价格便宜。这一研究结果刊登在12月15日的《分析化学》（Analytical Chemistry）上。 此前，细胞分离系统都是将样品与可跟特定蛋白质或其他成分反应的标记物混合，然后根据样品是否发出荧光来分离细胞。新系统将根据细胞中某些特定部分的反应来进行更加细致的细胞分离。另外，系统还能根据反应速度的快慢以及持续时间的长短来分离细胞，而用传统分离办法完成这些工作是不可能的。 新系统仅利用一个固定在普通玻璃载玻片上的透明有机硅薄层。硅层中分布了很多小空穴，使样品溶液中的细胞能沉淀在其中。经过如此改装的载玻片就能帮助研究人员分离出上万个细胞。 通过显微镜，研究人员或计算机系统能仔细察看细胞是否在特定区域或时间发出荧光。一旦发现发出荧光的细胞，计算机将自动记录其位置。然后，所有被记录下来的细胞将在激光束的作用下从空穴中浮出，最后这些细胞经液体冲刷后就可收集到容器中。 该系统的研发人员称，用激光束使细胞从空穴中浮出来，就像用消防管的水推动一个充气球。但激光的作用非常轻柔，不会使细胞受到损伤。 与光镊等昂贵的分离技术不同，这个系统的成本仅为几千美元，因此可广泛应用于生物实验室和临床研究机构。研究人员预计，该系统将在临床试验与诊断、基因筛选以及克隆研究等方面发挥重要作用。（来源：科技日报 徐玢） （《分析化学》（Analytical Chemistry），79 (24), 9321 -9330, 2007. 10.1021/ac071366y S0003-2700(07)01366-2，J. R. Kovac and J. Voldman）

骨髓间充质干细胞总结 2003年8月，为给大家提供一个网上交流干细胞研究经验的平台，我们干细胞版设立了骨髓间充质干细胞培养讨论区，经过近三个月的讨论学习，我们既学习丰富了自己的知识体系，也对间充质干细胞尤其是分离培养方面有了更为详实的认识，为了大家阅读的方便，我们决定把本版中的相关内容，同时参考部分书目和文献，做一总结。一、骨髓间充质干细胞的分离 目前常用的分离MSC的方法有全骨髓法和密度梯度离心法，全骨髓法即根据干细胞贴壁特性，定期换液除去不贴壁细胞，从而达到纯化MSC的目的。密度梯度离心法即根据骨髓中细胞成分比重的不同，提取单核细胞进行贴壁培养。随着对MSC表面抗原认识的深入，有人利用免疫方法如流式细胞仪法、免疫磁珠法等对其进行分离纯化，但经过流式或磁珠分选后的细胞出现了增殖缓慢等一些问题，加之耗费较大和技术的难度，在某种程度上限制了这些方法的广泛应用。1. 直接培养法（全骨髓培养法） 1987年，Friedenstein等发现在塑料培养皿中培养的贴壁的骨髓单个核细胞在一定条件下可分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞和成肌细胞，而且这些细胞扩增20－30代后仍能保持其多向分化潜能，这类细胞即为骨髓间充质干细胞（BMSC），其工作对今后MSC的研究具有重要意义，不仅证实了骨髓MSC的存在，而且创建了一种体外分离和培养MSC的简便可行的方法，得到了广泛的应用。culture-spirit采用直接贴壁法，24-36小时首次换液，换液时用PBS洗两次，7-10天传第一代，以后2-3天传代。培养基采用Hyclone的DMEM/F-12（1：1），血清是天津TBD的FBS（顶级），得到了较好的培养结果。布兰卡根据自己培养大鼠MSC的经验，详细介绍了实验步骤：（1）接种后60-80分钟,换液去除悬浮细胞（2）原代培养24 h,48 h各换液一次（3）观察细胞情况，在原代培养7天左右时，如观察到成片的典型形态的细胞，在瓶底用Marker笔标记，0.25%胰酶消化，镜下观察控制，约5-10分钟（室温太低时应放置到孵箱中），加入全培养基终止消化，瓶体朝上，吸管轻轻吹打4-8分钟，尤其是标记部位。不要用力吹打，以免把贴壁较牢的成纤维细胞，上皮样细胞吹打下来。（4）传代到新瓶中，加入少量培养基，孵箱静置20-30分钟后，MSC大多牢固贴壁。瓶底朝上，轻轻吹打，丢弃悬浮以及贴壁不牢的细胞（大多是上皮样细胞），加入全培养基开始传代培养，如观察仍有较多杂细胞，可重复上述步骤。（5）经上述处理后，原代的那瓶细胞仍有一些MSC生长，可继续按原代培养，如观察到MSC的克隆，仍可按上述步骤纯化处理。（6）原代或传代的细胞如观察的少量成片的杂细胞，可直接镜下瓶底标记后，超净台里用长吸管尖端机械刮除，吸出去掉。菊花与刀用的是全骨髓培养法，直接用含10%的FBS培养基冲洗大鼠的股骨和胫骨，为了避免冲起许多气泡应缓慢冲，冲的次数不应太多。冲洗后不用离心直接接种在培养瓶里，48 h~72 h后首次换液，一般7~10天可传代。天之饺子介绍的小鼠MSC的分离方法：取6 w小鼠的股骨和胫骨，直接用含培养基冲出骨髓，一定要尽量把干垢端的骨髓冲干净。冲洗后不离心直接接种在培养瓶里，24－48 h后去悬浮，再接下来的每3－4天换液一次，直到需要传代。2. 密度梯度离心法 裴雪涛等用比重为1.073 g/ml的percoll分离（400 g×20 min）人骨髓MSCs，取界面处细胞层，离心后洗涤以2×105/cm2的密度接种，72 h后更换培养液，弃掉未贴壁细胞，以后每3 d换液一次。细胞长到80％汇合时1：1传代。菊花与刀利用PERCOLL密度1.073分离大鼠MSC 时，用2400 rpm×20 mins后可见中间有一层约1～2 mm厚的白色层，仔细用吸管吸取这一层再用PBS离心2遍即可加培养基和胎牛血清培养即rMSCs。周进明等利用密度为1.082的percoll分离小鼠MSCs，500g×30min离心后，取中间的单个核细胞层，PBS洗两次，接种于IMDM培养基，1 d后换液，去掉非贴壁细胞，以后每3-4天换液。jetter用过FICOLL,FERCOLL,上海二分厂的淋巴细胞分离液分离MSC细胞效果都不错，当然所获细胞群的纯度不一，Percoll最纯，而上海二分厂的淋巴细胞分离液所获细胞群的传代能力优秀（35 PASSAGE）。本版的部分园友认为MSC贴壁培养得到的细胞不均一，但是多能分化能力和增殖力好，percoll分离得到的细胞较为均一，多能分化性和增殖力不如贴壁培养的，尤其是增殖力相差很远，有人添加bFGF或/和表皮生长因子发现可以增强增殖能力。二、骨髓间充质干细胞的培养 天之饺子认为，间质干细胞的培养一定要用塑料培养瓶，不能用玻璃的。因为象间质干这类的基质细胞不易贴玻璃，而且现在买的进口好品牌的培养瓶都涂有一层促细胞贴壁的物质，多数园友培养时都添加10－15％胎牛血清。分离培养结果的差异可能是由于各个研究小组标本来源、采用的分离方法不同从而所获得的细胞不同，或者用来检测的细胞代数不同，或者培养过程中用的胎牛血清不同，导致MSCs获得或失去这些表面标记物的表达。三、骨髓间充质干细胞的特性 体外培养的MSC体积小，成梭形，核浆比大。不表达分化相关的细胞标志，如I、II、III型胶原、碱性磷酸酶或Osteopontin；也不表达SH2、SH3、CD29、CD44、CD71、CD90、CD106、CD120a、CD124、CD166和多种表面蛋白，这群细胞特性稳定，扩增一代和两代后的细胞同质性分别达到95％和98％。MSC联系传代培养和冷冻保存后仍能具有多向分化潜能，而且保持正常的核型核端粒酶活性，但不易自发分化，在体外特定的诱导条件下，MSC可以分化为骨、软骨、脂肪、肌腱、肌肉、神经等多种细胞。四、其他相关内容 Jiang将从成人以及成年大鼠和小鼠骨髓分离的间充质干细胞（CD45－TER119－）命名为多潜能成年祖细胞，他们证明，MAPC高表达端粒酶，而且随着细胞的扩增，端粒的长度不变，单个MAPC来源的细胞群不仅能在体外向3个胚层的细胞分化，而且能在体内能够向各种组织细胞分化，相比较而言，形态与MSC相似的体外培养的皮肤成纤维细胞则不具有类似的分化潜能。参考文献 生理学报2003.55（2）：153－159 人骨髓间充质干细胞在成年大鼠脑内的迁移及分化中华放射医学与防护杂志.2002,22(3).-167-169 培养小鼠骨髓间充质干细胞及其移植后在体内的定位分布Exp Biol Med Vol. 226:507 520, 2001 Mesenchymal Stem CellsNATURE |VOL 418 | 4 JULY 2002 Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow干细胞生物学 裴雪涛 主编

我想问超声破碎仪能用于细胞器分离吗？有人做过相关实验吗？其中的原理是怎么样的呢，是用不同的能量打碎不同的细胞器吗？还是……？

谁有细胞CE分离方面的经验或书籍（综述）？

名 称：骨髓细胞的提取目的：分离并培养骨髓间充质干细胞原理：先分离出单核细胞然后再通过培养分离出骨髓间充质干细胞内容：步骤一：小鼠骨髓细胞的获取1． 断颈处死小鼠（7-12周，雌雄均可），投入盛有250ml左右的0.1%新洁尔灭或75%酒精中浸泡3-5分钟，拎出后将小鼠仰面翻铺于超净台上一个消毒托盘上。2． 用眼科镊小心捏起小鼠两髋关节之间的腹部皮肤，用眼科剪小心剪开皮肤，并分离两下肢的皮肤，往下在脚踝处剪断，往上在髋关节处剪断，这样可以游离出小鼠的两条下肢。将它们放入另外一个消毒托盘中，并换一套新的剪子和镊子。手术器械事先均必须消毒。3． 小心剥离肌肉，分别剪下Femurs and Tibias, 剪去两端软骨，露出红色的骨髓腔。注意尽可能少的剪走骨髓腔。4． 拿两支5ml无菌注射器，每支吸取5ml IMDM(10%FBS, 50/50u/ml Pen/Strep)，换装一个4号针头（又称皮针）或1ml注射器的针头，并用无菌的针头套管将之轻轻拧弯。轻轻插入骨髓腔，对准一个无菌15ml离心管，将细胞冲出。每根骨用2.5ml IMDM培养液左右即可基本冲下骨髓腔内的细胞。5． 300C下离心，1200转/10分钟，去上清，但留1ml，以便用于在振荡器上悬浮细胞。6． 加进氯化铵溶液（NH4Cl: 8.99g/L, KHCO3: 1g/L, Na4-EDTA: 0.037g/L ，过滤灭菌, 40C储存）裂解红细胞，按1: 9比例，即1ml 细胞悬液，加进9ml氯化铵溶液，混匀，冰上10分钟。 7． 300C离心，1200转/10分钟，去上清。步骤二：淋巴细胞分离液分离小鼠骨髓细胞1． 按步骤二方法采集小鼠骨髓细胞，并破红细胞2． 细胞用4ml培养液悬浮，缓慢留置于8ml淋巴细胞分离液液面上，2000rpm for 20min.3． 小心吸取云雾状底层的基质细胞约1.5ml的体积，置于1个盛有1ml无菌细胞培养用PBS的15ml离心管中，颠倒混匀，1200rpm for 10min, 去上清4． 如果是注射用细胞，则用5ml PBS洗涤细胞2次；5． 离心沉淀下来的细胞用50-200ul PBS，计数细胞，并计算所需细胞体积数铺板培养

（1）细胞核的分离： 将培养的细胞制成细胞混悬液，或以胰蛋白酶消化法于培养盖上收集培养细胞。应用MgSO4染色分离方法分离细胞核（Van den Engh et al 1986, 在Traok和Van Den Engh 34章　）。细胞混悬液浓度为5×106/ml。利用RNA酶消化后，使核从细胞分离，细胞核混悬液浓度为4～5×106细胞核/ml。（2）细胞固定和酸的处理：在5 ml试管内加冷的100%酒精不断旋转以达到满意的固定。在冰上停留10 min。在4 ℃离心（×150 g）10 min。重复加三次冷的100%酒精入试管内，离心，倾去。置于冰上10 min，再离心。然后加入相当核悬液1/2量的0.1 n HCl , 0.5% Triton X-100。室温停留10 min。加入IBM-0.25%Triton X-100（IBM配方：50 mmol/l KCl, 10 mmol/L MgSO4, 5 mmol/L HEPES pH8.0）。再离心，重复IBM漂洗（这时细胞核可在不染色情况下，以荧光显微镜观察）后，以2×SSC-0.1%Tween漂洗1×3min，继之加入等量2%的多聚甲醛在1×PBS-5 mmol/l MgSO4。在室温静置站立10min。倾去上清液，加IBm -Triton X-100漂洗，离心，使细胞核混悬液最终浓度为108/ml，（可用IBM-Triton X-100稀释约50倍，在血球计数器计数），混悬液镜检应含单个，完整的细胞核。（3）细胞核混悬液杂交①配制杂交混合液：甲酰胺5份，20×SSC1份，50%硫酸葡聚糖2份，pH调至7.0。此原液（stock solution）可贮存在4 ℃冰箱内。应用时加1份10 mg/ml鲱鱼精子DNA（herring sperm DNA）。②混合1 μl的细胞核混悬液（108/ml）与18μl的杂交混合液，充分混匀。将此19 μl混合液移入1.5 ml容积的Eppendorf 管中（核含量约为105）。③加入100 ng/每管的AAF标记DNA探针（如为生物素标记DNA探针浓度为20～40 ng/每管）。④置70 ℃10min使DNA探针和核DNA变性。⑤和组织切片与DNA探针杂交方法相较，不同的是在加热变性后切勿置冰上迅速冷却以终止反应，而应迅速转入37 ℃孵育过夜。（4）杂交后漂洗在每管中加入1.25 ml 50%甲酰胺-2×SSC（pH7.0），在42 ℃静置10～15min。偶尔旋转以助混匀。冷却至室温。加100 μl经dimethylsuberimidate(DEMS)处理的血细胞（107/ml）混匀，离心，室温，10min，轻弹试管使沉淀的小块散开，加入1.25 ml 2×SSC(pH7.0)，42 ℃，继之，静置于室温10～15min，如前离心，再加1.25 ml IBM-Triton X-100,室温静置5min，离心。注：DEMS处理红细胞方法：经漂洗并离心去除白细胞和血清的红细胞在盐液如PBS中，细胞含量为108/ml，以K2CO3和DEMS溶液处理3次，第1次：K2CO3为20 mmol/L,DEMS为3 mmol/L，以后2次：K2CO3依然为20 mmol/L，而DEMS为10 mmol/L。在应用前将K2CO3和DEMS液混合加入红细胞混悬液中。在最后2次漂洗液中，应用100 mmol/l K2CO3将pH调至9～10。在25 ℃，15min后，加入50 μl，100 mmol/l 的柠檬酸（citric acid）/每ml细胞混悬液的浓度以达固定红细胞的目的。固定的红细胞离心倾去上清液后，用2×SSC稀释到108/ml，加0.1%叠氮钠可在4 ℃保存至少1年。（5）AFF标记的荧光显示：加200 μl的PBS含0.05%Tween和2%正常血清（NGS），轻轻振荡混匀，室温静置10min，加20 μl 1：100的单克隆抗AFF抗体，37 ℃孵育45min，加1.25 ml的PBS-Tween，室温静置10min，加20间歇性振荡，离心，倾去上清液，加200 μlPBS含0.05%Tween –2%NGS,振荡，室温静置10min，加20 μl的羊抗小鼠–FITC荧光标记抗血清，稀释度1：100～1：300。孵育于37 ℃ 45min，加1.25 ml PBS –Tween,室温静置10min，离心，倾去上清液。（6）生物素标记探针的荧光显示：加200 μl 4×SSC含0.1%Trion X-100 和5%BSA。室温静置10 min后，加20 μl抗生物素标记FITC抗血清15 μg/ml，孵育在37 ℃ 30min，以1.5 ml 4×SSc –0.1% Trion X-100洗1次，加入1.25 ml IBm –Triton X-100,室温静置10～15min，间歇振荡、离心。（7）荧光显微镜观察：将细胞核混悬液稀释于250 μl的IBM-Trion X-100中，轻加振荡混匀。为抗荧光褪色可加等量的抗褪色溶液至载片上的细胞核涂片上，选择适当的激发波长观察。（8）流式细胞计：将750 μl的细胞核混悬液通过流式细胞仪（Flow cytometry, FCM），DEMS处理过的红细胞作为对照（Df 530/30nm, Omega ·Optical Inc, Brattleboro, VT）。

【序号】：1【作者】： 林凯【题名】：一次性表皮细胞分离器的有效性、可操作性及安全性【期刊】：温州医科大学【年、卷、期、起止页码】：【全文链接】：[url]https://d.wanfangdata.com.cn/thesis/D02148878[/url]

测红细胞膜表面DHA DHA的分离度不是很好 怎么解决？

请问下, 我现在想用离子交换柱来将细胞中复杂多肽样品，简化为多个样品进行分析，怎么选择柱子，洗脱液等，麻烦指教下

【序号】：3【作者】：周年1,2,3刘波1,4徐彭【题名】：大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养和分化能力鉴定【期刊】：江西中医药. 【年、卷、期、起止页码】：2018,49(05)【全文链接】：https://kns.cnki.net/kcms2/article/abstract?v=3uoqIhG8C44YLTlOAiTRKibYlV5Vjs7i0-kJR0HYBJ80QN9L51zrP3ylMAV4CgQ9wpp7ZMmE5O8NBqbZq4aly75LaltU8u1l&uniplatform=NZKPT

一、酶消化法1、胰酶。这是用得最多的。一般浓度在0.25-0.5%。作用时间根据细胞种类、作用温度等因素而变化很大，从几分钟到几十分钟不等。0.25%的胰酶作用于单层贴壁的细胞，在37度条件下，一般消化1-5分钟就足够了。终止是用血清。主要作用于细胞间。配制时不能用含钙、镁的平衡液，否则影响活性。保存于-20度。2、胶原酶。这种方法比较少，一般是用原代培养时，从组织消化下细胞。这种方法作用温和，对细胞损伤较小，但是，价格也较贵。中止同样是用血清。二、离子螯合剂 不破坏细胞表面分子，仅与CAMs螯合，因此，如果检测细胞表面分子的话，尽量，甚至是一定不要用酶消化法。1、EDTA。用得也是非常多。一般浓度在0.02%左右。作用于细胞与间质，对细胞间也有一定作用。注意，它能显著影响pH值，而且在弱碱性条件下才易溶。因此，配制时应调节好酸碱度。它不能被终和。因此，消化下来的细胞要洗一遍。2、商品化的无酶消化液。个人的使用经常觉得对细胞的损伤比较大，但是分离成单细胞悬液的能力确实比较强。三、物理法 直接吹打或用细胞刮子将细胞刮下来。四、冷冻法 这是本人做细胞培养时发现的方法。此方法仅能用于细胞传代时。无法使组织上的细胞脱落下来。本方法的原理，我想是因细胞冷冻后收缩，从而从培养瓶上脱落下来。优点是：对细胞损伤小，不需要中止或洗细胞，方便，不需要另外配制消化液。特别适用那些贴壁不是特别紧，又特别娇气的细胞。不足是细胞常成小片脱落。此种方法曾用于因用其它方法传代导致大量细胞死亡操作的间充质干细胞、DC细胞的培养，效果非常满意。具体过程是：1、用较多的4度的PBS洗涤一遍细胞(以6孔板为例，加1.5 ml/孔)；2、再加0.5 ml 4度的PBS，静置操作台上，很快细胞就小片脱落；3、轻轻吹打，细胞即完全脱落；4、按一定比例传代。

[url=http://www.f-lab.cn/cell-analyzers/punch-needle.html]细胞钻孔针[/url],punch needle是为细胞转移和细胞分离应用而设计的细胞打孔针,用于细胞打孔和细胞钻孔应用。细胞钻孔针作为细胞转移分离系统的重要配件，方便用户把细胞从微孔芯片转移到各种微管中。细胞钻孔针经过精密设计,它可以精密在微孔板上钻孔而不接触到细胞，经过酒精消毒后可重复使用。[img=细胞钻孔针]http://www.f-lab.cn/Upload/punch-needle.JPG[/img]细胞钻孔针：[url]http://www.f-lab.cn/cell-analyzers/punch-needle.html[/url]

如果不小心，液氮罐可能会意外地掉进细胞中，对细胞造成严重损害。那么，当液氮罐掉进细胞时，我们该如何处理呢?　　1. 立即移除液氮罐　　当液氮罐掉进细胞中时，第一步是立即移除液氮罐。这可以通过使用钳子或其他合适的工具将液氮罐从细胞中取出。在这个过程中，需要注意不要进一步损伤细胞或污染实验环境。　　2. 冲洗细胞　　一旦液氮罐被移除，下一步是冲洗细胞。这可以通过将细胞置于含有适当缓冲剂的培养基中进行。缓冲剂可以帮助稀释液氮和减轻细胞受到的损害。同时，冲洗还有助于清除细胞表面的残留液氮。　　3. 检查细胞状态　　冲洗后，需要对细胞进行检查，以确定其状态。这可以通过使用显微镜观察细胞形态和结构来完成。如果细胞出现明显的损伤或死亡，那么可能需要重新开始实验或采取其他措施修复细胞。　　4. 细胞培养和恢复　　如果细胞没有受到严重损害，那么接下来的步骤是将细胞继续培养和恢复。这可以通过将细胞放入新的培养皿中，并提供适当的培养基和条件来完成。在此过程中，可以使用细胞培养技术和方法来促进细胞的生长和再生。　　5. 监测细胞恢复　　一旦细胞开始恢复，我们需要密切监测细胞的恢复情况。这可以通过定期观察细胞形态、增殖和功能来完成。如果发现细胞的恢复速度较慢或存在其他异常情况，可能需要调整培养条件或采取其他干预措施。　　总之，当液氮罐掉进细胞时，及时处理是至关重要的。通过立即移除液氮罐、冲洗细胞、检查细胞状态、细胞培养和恢复以及监测细胞恢复等步骤，我们可以最大程度地减少细胞受损并帮助其恢复。当然，在实验室操作中，预防措施也是非常重要的，包括正确使用液氮罐、操作时保持专注和谨慎等。只有这样，我们才能更好地保护细胞并确保实验的准确性和可靠性。　　预防措施　　在实验室工作中，事故的发生往往可以通过采取预防措施来避免。对于液氮罐掉进细胞的情况，以下是一些预防措施的建议：　　1. 储存和运输细胞时，确保液氮罐被正确放置并固定。使用适当的支架和保护装置可以降低液氮罐掉入细胞的风险。　　2. 在操作期间保持专注和谨慎。避免在操作液氮罐时分心或急躁，以免发生意外。　　3. 定期检查液氮罐的状态。确保液氮罐没有损坏或出现其他问题，以减少安全隐患。　　通过采取这些预防措施，可以降低液氮罐掉落细胞的风险，保护细胞和实验的安全。[url=http://www.mvecryoge.com/]金凤液氮罐[/url]　　应对不同情况　　[url=http://www.yedanguan365.com/]液氮罐[/url]掉进细胞的情况可能会有所不同，因此我们需要根据具体情况采取不同的应对策略。以下是一些常见的情况及相应的处理方法：　　1. 液氮罐只接触到细胞表面而未完全陷入细胞：在此情况下，可以尝试使用吸管或其他工具轻轻将液氮罐从细胞上移开，然后进行细胞冲洗和恢复。　　2. 液氮罐陷入细胞内部：在这种情况下，需要谨慎地将液氮罐从细胞中取出，以避免进一步损伤细胞。然后进行细胞冲洗和恢复。　　3. 细胞受到严重破坏或死亡：如果细胞受到严重损害或死亡，可能需要重新开始实验或采取其他措施来修复细胞。这可能包括使用新的细胞系或进行其他细胞培养操作。

随着分子生物学的快速发展，许多实验的目标物质都是细胞内物质，要进行实验研究或产物收集就必须将细胞破壁，使产物得以释放，才能进一步提取，因此细胞破碎就变成了提取胞内产物的关键步骤，破碎方法的得当与否，直接影响到所提取产品的产量、质量和生产成本。现将常用的几种细胞破碎方法介绍如下。1.超声波破碎 　 利用超声波高强度声能产生的空化现象引起冲击波和剪切力进行细胞破碎。超声破碎的效率与超声频率、超声功率、处理时间、细胞浓度及处理量等因素有关。 　 不足及须加强的问题：超声波破碎在实验室规模应用较普遍，处理少量样品时操作简便，液量损失少，但超声波产生的化学自由基团可能使某些敏感性活性物质变性失活影响实验结果。且大容量装置声能利用率低，装置散热性差。2.生物酶溶法 　　就是用生物酶将细胞壁和细胞膜消化溶解的方法。常用的溶酶有溶菌酶β-1．3-葡聚糖酶、蛋白酶等。 　　不足：易造成产物抑制作用，这可能是导致胞内物质释放率低的最主要因素。而且溶酶价格高，限制了大规模利用。若回收溶酶，则又增加分离纯化溶酶的操作。另外酶溶法通用性差，不同菌种需选择不同的酶。3.物理珠磨法 　　微生物细胞悬浮液与极细的研磨剂在搅拌浆作用下充分混合，珠子之间以及珠子和细胞之间和互相剪切、碰撞，使细胞壁破碎，释出内容物，在珠波分离器的协助下，珠子被滞留在破碎室内，浆液流出，从而实现连续操作，破碎中产生的热量由夹套中的冷却液带走。缺陷：效能利用率仅为1％左右，且破碎过程产生大量的热能无法利用。4.化学渗透法 　　某些有机溶剂（如苯、甲苯）、抗生素、表面活性剂、金属螯合剂、变性剂等化学药品都可以改变细胞壁或膜的通透性从而使细胞内容物物有选择地渗透出来。其作用机理；化学渗透取决于化学试剂的类型以及细胞壁和膜的结构与组成。 　　不足：时间长，效率低；化学试剂毒性较强，同时对产物也有毒害作用，进一步分离时需要用透析等方法除去这些试剂；通用性差。

注意事项： 1.配制溶液时必须用新鲜的蒸馏水。2.安装蔡式滤器时通常使用孔径 0.45 微米 和 0.22 微米滤膜各一张，放置位置为 0.45 的位于 0.22 微米的滤膜上方，并且要特别注意滤膜光面朝上。 3.配制 RPMI1640 培养基时因为还要加入小牛血清，而小牛血清略偏酸性，为了保证培养液 PH 值最终为 7.2 ，可在配制时调 PH 至 7.4 。 细胞培养的一般过程 一、准备工作准备工作对开展细胞培养异常重要，工作量也较大，应给予足够的重视，推备工作中某一环节的疏忽可导致实验失败或无法进行。准备工作的内容包括器皿的清洗、干燥与消毒，培养基与其他试剂的配制、分装及灭菌，无菌室或超净台的清洁与消毒，培养箱及其他仪器的检查与调试，具体内容可参阅有关文献。二、取材在无菌环境下从机体取出某种组织细胞（视实验目的而定），经过一定的处理（如消化分散细胞、分离等）后接入培养器血中，这一过程称为取材。如是细胞株的扩大培养则无取材这一过程。机体取出的组织细胞的首次培养称为原代培养。R 理论上讲各种动物和人体内的所有组织都可以用于培养，实际上幼体组织（尤其是胚胎组织）比成年个体的组织容易培养，分化程度低的组织比分化高的容易培养，肿瘤组织比正常组织容易培养。取材后应立即处理，尽快培养，因故不能马上培养时，可将组织块切成黄豆般大的小块，置 4℃的培养液中保存。取组织时应严格保持无菌，同时也要避免接触其他的有害物质。取病理组织和皮肤及消化道上皮细胞时容易带菌，为减少污染可用抗菌素处理。由组织并分离分散细胞的方法可参阅有关文献。 三、培养将取得的组织细胞接入培养瓶或培养板中的过程称为培养。如系组织块培养，则直接将组织块接入培养器皿底部，几个小时后组织块可贴牢在底部，再加入培养基。如系细胞培养，一般应在接入培养器皿之前进行细胞计数，按要求以一定的量（以每毫升细胞数表示）接入培养器皿并直接加入培养基。细胞进入培养器皿后，立即放入培养箱中，使细胞尽早进入生长状态。正在培养中的细胞应每隔一定时间观察一次，观察的内容包括细胞是否生长良好，形态是否正常，有无污染，培养基的 PH是否太酸或太碱（由酚红指示剂指示），此外对培养温度和 CO2浓度也要定时检查。一般原代培养进入培养后有一段潜伏期（数小时到数十天不等），在潜伏期细胞一般不分裂，但可贴壁和游走。过了潜伏期后细胞进入旺盛的分裂生长期。细胞长满瓶底后要进行传代培养，将一瓶中的细胞消化悬浮后分至两到三瓶继续培养。每传代一次称为“一代”。二倍体细胞一般只能传几十代，而转化细胞系或细胞株则可无限地传代下去。转化细胞可能具有恶性性质，也可能仅有不死性（Immortality）而无恶性。培养正在生长中的细胞是进行各种生物医学实验的良好材料。四、冻存及复苏为了保存细胞，特别是不易获得的突变型细胞或细胞株，要将细胞冻存。冻存的温度一般用液氮的温度?－196℃，将细胞收集至冻存管中加入含保护剂（一般为二甲亚砜或甘油）的培养基，以一定的冷却速度冻存，最终保存于液氮中。在极低的温度下，细胞保存的时间几乎是无限的。复苏一般采用快融方法，即从液氮中取出冻存管后，立即放入 37℃水中，使之在一分钟内迅速融解。然后将细胞转入培养器皿中进行培养。冻存过程中保护剂的选用、细胞密度、降温速度及复苏时温度、融化速度等都对细胞活力有影响。

胎盘亚全能干细胞定义： 　　亚全能干细胞自胚胎形成的第5到7天开始出现，能分化形成200 多种人体组织器官细胞，但不能形成一个完整的人体。胎盘亚全能干细胞是来源于新生儿胎盘组织的一族亚全能干细胞，其在发育阶段与胚胎干细胞接近，具备分化形成三个胚层的组织细胞的能力，但不会形成畸胎瘤。 　　胎盘亚全能干细胞的主要特性与功能： 　　胎盘亚全能干细胞是取自胎盘组织的一类亚全能干细胞，胎盘亚全能干细胞具有以下特性： 　　1. 具有强大的增殖能力和多向分化潜能，在适宜的体内或体外环境下具有分化为间充质干细胞，上皮干细胞、神经干细胞、肝干细胞，肌细胞、成骨细胞、软骨细胞、基质细胞等多种细胞的能力。可以用来修复受损或病变的组织器官，治疗心、脑血管疾病、神经系统疾病、肝脏疾病、骨组织病、角膜损伤、烧伤烫伤、肌病等多种疾病。 　　2.具有免疫调节作用，通过负性免疫调节功能，抑制机体亢进的免疫反应，使机体免疫功能恢复平衡，从而可以用来治疗造血干细胞移植之后的免疫排斥反应以及克隆氏病、红斑狼疮，硬皮病等自身免疫系统疾病。 　　3.胎盘亚全能干细胞定向培养的间充质干细胞是人体微环境的重要组成部分，移植间充质干细胞可以改变造血微环境，重建免疫系统，促进造血功能恢复，与造血干细胞共移植能显著提高白血病和难治性贫血等的治疗效果。 　　4.具有来源方便，细胞数量充足，易于分离、培养、扩增和纯化，传代扩增30多代后仍具有干细胞特性。 　　胎盘亚全能干细胞的用途： 　　胎盘作为理想的亚全能干细胞来源，在抗衰老及疾病治疗领域显示了其独特的功能，治疗疾病种类如下： 　　心脑血管系统疾病 　　糖尿病 　　肝肾损伤 　　脑及脊髓神经损伤 　　自身免疫性疾病 　　移植物抗宿主病 　　与造血干细胞共移植治疗血液病 　　缺血性血管病 　　肺及其它组织器官纤维化 　　抗衰老，恢复健康体态 　　胎盘亚全能干细胞的储存流程： 　　在新生儿娩出、胎盘剥离子宫排出后，由接生的医生尽快按照干细胞库胎盘标准采集规程进行胎盘的采集，然后放置在干细胞库特定的装置工具中，在限定时限内运送到干细胞库，由专业的技术人员进行亚全能干细胞的分离、提取、培养、检测等技术流程，直到根据最终检测结果来确认所获得的干细胞是否具有长期保存的价值。 　　保存和期限 　　目前国际上通用的干细胞保存技术是将获得的干细胞储存在-196℃深低温状态，医学研究与临床实践证明保存一百多年的细胞仍然具有活性。干细胞保存已有几十年的历史，胎盘干细胞库在与客户签订的合同期限内对干细胞库中所保管的胎盘亚全能干细胞活性负责。 　　安全性 　　胎盘的采集简便易行，不会引起母亲和新生儿任何不适的感觉或产生任何不良的影响。过去胎盘通常作为废物丢弃，而从胎盘中提取亚全能干细胞进行保存，是宝贵的生命资源再生。 　　而干细胞行业数据显示，胎盘亚全能干细胞基因稳定、不易突变，动物实验证明无致瘤性，使用安全可靠，对适应症范围疾病治疗效果好，优于传统医疗手段。 　　胎盘亚全能干细胞的优势 　　1.取材方便，原料来源充足，是生命资源的再生。 　　2.分化能力强可以定向诱导分化为间充质干细胞、血管干细胞、上皮干细胞、神经干细胞和肝干细胞等多种干细胞。 　　3.数量充足，使用方便，增殖能力强，培养后数目可达10亿，可以供多人多次使用。 　　4.在人群中使用不需要配型，不会产生免疫排斥反应，同时，血缘关系越亲近，生物利用度会越高，使用的效果越好。 　　5.治疗疾病范围广，抗衰老，恢复健康体态，心脑血管系统疾病，糖尿病，肝肾损伤，脑及脊髓神经损伤，自身免疫性疾病，移植物抗宿主病等多种疾病。

简单介绍一下细胞培养技术，本人这段时间主要做细胞工作，和大家共勉吧！细胞培养技术一、细胞培养的条件和要求 二、细胞分离 三.体外培养细胞龄的计算四.细胞鉴别试验 五、细胞计数六、细胞传代 七、细胞的冻存和复苏 八、细胞培养用水处理 九、选择小牛血清的微量细胞培养检查法 十、葡萄糖测定法 十一、乳酸测定法十二、细胞培养方式

单细胞凝胶电泳步骤：1. 分离制备单细胞悬液：（1） 体外培养的细胞株：用胰酶消化，最后用PBS悬浮吹打成单细胞悬液，细胞要计数，具体的量我前边已经说过。（2） 体内脏器细胞：处死动物，取出脏器，于Hanks’液中制备成单个细胞悬液。2. 胶板制备：（1） 取100μl于45℃水浴中保温的0.5%NMA，铺于磨沙载玻片上，形成底胶。盖玻片推匀，不能有气泡，4度凝固5至8分钟。（2） 水平取下盖片，取100μl于37℃水浴中保温的0.5%LMA与20μl细胞悬液（约400个细胞）混匀，立即铺片，加上盖玻片，4度凝固5至8分钟。3. 细胞裂解与电泳：（1） 将制备好的胶板去掉盖玻片后，浸于4℃预冷的细胞裂解液中，在4℃下裂解2.5到3小时。（2） 取出胶板，用双蒸水浸没漂洗后放入电泳槽中，浸泡在4℃预冷的电泳液中解旋20分钟。（3） 玻片水平放置阳极端附近，4℃电泳20到25分钟（25V，300mA）。可在电泳槽周围加冰块以保持低温。4. 中和与染色：（1） 电泳结束，将胶板浸泡于中和液中，每次10分钟，共中和3次，每次要更换中和液。最后晾干。（2） 取出胶板，置于染色缸中，在2μg/ml的EB染色液中，暗处染色5到10分钟。（3） 蒸馏水漂洗2次，每次5分钟。稍晾干，滤纸吸去多余水分，尽快在荧光显微镜下观察。从胶板制备开始到最后都应该在暗光下操作。先讲这些，你们可以先开始摸索，真正做了才能发现具体的问题，到时我们再探讨。

如题，有谁能具体说说细胞培养液的基本组成及其注意事项？

随着重组DNA技术得到广泛应用以来，生物技术发生了质的飞跃。很多基因工程产物都是胞内物质，必须将细胞破壁，使产物得以释放，才能进一步提取，因此细胞破碎是提取胞内产物的关键步骤，破碎方法的得当与否，直接影响到所提取产品的产量、质量和生产成本。现将近年来常用的几种细胞破碎方法介绍一下。 　　1. 高压匀浆法 　　设备是高压匀浆器，它由高压泵和匀浆间组成，美国Microfluidics公司和ATS公司均有产品出售。其破碎机理：细胞在一系列过程中经历了高速造成的剪刀，碰撞以及由高压到常压的变化从而造成细胞的破碎。 　　存在的问题；较易造成堵塞的团状或丝状真菌，较小的革兰氏阳性首以及有些亚细胞器，质地坚硬，易损伤匀浆阀，也不适合用该法处理。 　　2. 高速珠磨法 　　设备是珠后机，瑞士WBC公司和德国西门子机械公司均制造各种型号的珠磨机，其破碎机下：微生物细胞悬浮液与极细的研磨剂在搅拌浆作用下充分混合，珠子之间以及珠子和细胞之间和互相剪切、碰撞，促使细胞壁破碎，释出内含物，在珠波分离器的协助下，珠子被滞留在破碎室内，浆液流出，从而实现连续操作，破碎中，生的热量由夹套中的冷却液带走。 　　存在的问题：操作参数多，一般赁经验估计并且珠子之间的液体损失30％左右。 　　3. 超声破碎 　　频高于15-20KHz的超声波在高强度声能输入下可以进行细胞破碎。其破碎机理：可能与空化现象引起的冲击波和剪切力有关。超声破碎的效率与声频、声能、处理时间、细胞浓度及首种类型等因素有关。 　　存在问题；超声波破碎在实验室规模应用较普遍，处理少量样品时操作简便，液量损失少，但是超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质变性失活。而且大容量装置声能传递，散热均有困难。 　　4. 酶溶法 　　就是用生物酶将细胞壁和细胞腊消化溶解的方法。常用的溶酶有溶菌酶β-1．3-葡聚糖酶、蛋白酶等。 　　存在的问题；易造成产物抑制作用，这可能是导致胞内物质释放率低的一个重要因素。而且溶酶价格高，限制了大规模利用。若回收溶酶，则又增加百分离纯化溶酶的操作。另外酶港法通用性差，不同菌种需选择不同的酶。 　　5. 化学渗透法 　　某些有机溶剂（如苯、甲苯）、抗生素、表面活性剂、金属螯合剂、变性剂等化学药品都可以改变细胞壁或膜的通透性从而使内合物有选择地渗透出来。其作用机理；化学渗透取决于化学试剂的类型以及细胞壁和膜的结构与组成。 　　存在的问题；时间长，效率低；化学试剂毒性较强，同时对产物也有毒害作用，进一步分离时需要用透析等方法除去这些试剂；通用性差：某种试剂只能作用于某些特定类型的微生物细胞。 　　本文介绍了几种细胞破碎的方法，可谓各有千秋，在实际应用中，应尽量考虑全面，选择最科学、有效的方法。