脱镁叶绿素

无水乙醇热浴超声法测定淡水中的叶绿素a--测量篇自然水体中往往滋生各种藻类，不同藻类具有不同的色素组成，但都含有叶绿素a，不仅含量高，而且是整个光合作用的能量传递中心，因此把叶绿素a作为浮游植物现存量的指标。采用分光光度法测量叶绿素a，萃取剂主要有丙酮、乙醇和DMF,出于安全、保健的考虑，建议使用乙醇。乙醇法多采用单波长法，计算公式为： Chla=27.9×665-B750)-(A665-A750)]·V乙醇/V水样式中，Cla：叶绿素a浓度，mg/m3;B665:波长665nm处的吸光值；B750：750nm处的吸光值；A665： 665nm处吸光值；A750： 750nm处吸光值；V乙醇：乙醇萃取液定容后体积，ml；V水样：取样体积，L；使用1cm比色皿。叶绿素a是卟啉化合物，卟啉环的中心有一个镁（Mg）原子， 当卟啉环缺少中心部分的镁原子时便成为脱镁叶绿素。在光合器官中除含有叶绿素a和b外，还含有少量脱镁叶绿素。脱镁叶绿素是否具有光合作用，暂不讨论。叶绿素经酸处理， Mg被H取代降解为去镁叶绿素a，上述公式的计算结果应是扣除去镁叶绿素a的叶绿素a浓度。采用单色法测定时，加酸量、酸化稳定的时间非常关键。根据韩桂春研究结果[2]，酸化时间为15分钟，但盐酸浓度和用量目前还没有统一的意见[3，4]。酸化在比色皿中进行，不利于样品匀化和多样品测量。丙酮法采用多波长法[5]，从各波长的吸光度中减去波长750nm的吸光度，作为校正过的吸光度，计算公式：Chla=(11.64D663-2.16D645+0.10A665)]×V乙醇/V水样·δδ-比色皿光程cm[color=#333333][url=http://h.hiphotos.baidu.com/zhidao/pic/item/1f178a82b9014a90096c762ca9773912b21beed5.jpg][color=#2d64b3][img=,384,290]data:image/png;base64,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

与第四版比较，《水质叶绿素a的测定 分光光度法 HJ897-2017》的变与不变叶绿素a是浮游植物光合作用的载体，常用来表征浮游植物现存量，是湖泊水库富营养化评价指标之一。国内外叶绿素a测定方法繁杂多样，不同研究者采用的方法各式各样，导致研究结果之间少有可比性。环境监测普遍采用的是《水和废水监测分析方法》（第四版）（以下称第四版）叶绿素a的测定方法-丙酮研磨提取法[sup][/sup]。2017年12月21日环境保护部首次发布《水质叶绿素a的测定 分光光度法 HJ897-2017》[sup][/sup]，与第四版比较，做了一些改动，核心内容依然是丙酮研磨提取法，标准实施过程仍有诸多疑问和困难，写下来，希望同行不吝赐教。1.方法检出限HJ897-2017规定了方法检出限和测定下限，明确规定测定结果有效数字的保留。[img=,690,69]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/07/201807300911232717_1558_3247383_3.png!w690x69.jpg[/img]图1 HJ897-2017关于方法检出限的规定《水和废水监测分析方法》（第四版）对检出限的定义[sup][/sup]是：为某特定分析方法在给定的置信度内从样品中检出待测物质的最小浓度或最小量。但没有严格规定检出限的计算方法，以下三种与分光光度法有关。①.《全球环境监测系统水监测操作指南》的计算方法为 D.L=4.6δ式中：δ——空白平行测定（批内）标准偏差（重复测定20次以上）②美国EPA SW-846规定MDL=3.143δ(δ重复测定7次)③某些分光光度法以扣除空白值后的与0.01吸光度相对应的浓度值为检出限。方法检出限受样品基质、前处理和仪器水平的影响，因此有必要说明取样体积、测量条件。“本标准测定丙酮提取液中叶绿素a的检出限为0.04mg/L”，“提取液”必然与提取方式有关，而这里没有说明提取条件，我的理解是分光光度法的检出限，即扣除空白值后的与0.01吸光度相对应的浓度值，那么这句话改成“本标准测定叶绿素a丙酮溶液的检出限为0.04mg/L”是不是严谨一些？根据HJ897-2017关于检出限和测定下限的数据，推测计算过程：当取样体积200ml，丙酮提取液体积为10ml，方法检出限=0.04mg/Lx10 ml/200ml=0.002mg/L=2μg/L美国EPA SW-846规定4MLD为定量下限，所以测定下限=4x2μg/L=8μg/L如果取样体积为500ml,方法检出限=0.04mg/Lx10 ml/500ml=0.8μg/L取样100ml,检出限4μg/L方法检出限与取样体积有关，那么测定下限是否随着检出限而变化？2.防酸化问题第四版和HJ897-2017都规定样品采集后，立即做样品预处理：每升样品加1ml1%碳酸镁悬浊液，“以防酸化引起色素溶解”。叶绿素a是卟啉化合物，之所以呈绿色，是卟啉环中的电子和Mg决定的，卟啉环极易失去镁原子，分解生成暗褐色的脱镁叶绿素。水污染的地方、或者样品采集、保存、制备过程，因为酸性条件、高温、光照，浮游植物细胞被破坏，叶绿素变成脱镁叶绿素造成测量误差[sup][/sup]。酸化是脱镁反应的条件之一，加入碳酸镁是防止脱镁而非防酸化。3.修改了过滤水样的滤膜，用玻璃纤维滤膜代替乙酸纤维滤膜，并规定滤膜直径及孔径，增加配真空泵的玻璃砂芯过滤装置。3.1材质乙酸纤维滤膜过滤水样没问题，但用丙酮萃取叶绿素时，滤膜会被溶解成胶状，萃取液无法正常分离。HJ897-2017改用玻璃纤维滤膜，不存在滤膜溶解问题。3.2孔径滤膜孔径的选择很重要，要保证藻类细胞有效截留，另外要保证过滤效率。[img=,690,517]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/07/201807300911487270_7582_3247383_3.jpg!w690x517.jpg[/img]图2几种浮游植物的细胞直径 [sup][/sup]细胞大小是浮游植物分类的重要依据，比较常见的藻类细胞绝大多数大于0.7μm，个人认为选择0.7μm的玻璃纤维滤膜比较合适。4.修改水样过滤时的操作。第四版是水样抽完后继续抽1-2min,减少滤膜上的水分。HJ897-2017是在水样刚刚完全通过滤膜时结束抽滤，最后用滤纸吸干水分；有些藻类没有细胞壁或者细胞壁很薄，强大负压作用下，可能造成原生质破坏，叶绿素溶出，造成测量误差。HJ897-2017用滤纸吸干的做法尽可能避免在样品制备过程中叶绿素流失，但“注”中关于富营养化水样用离心法浓缩水样并不可取。因为水分的存在严重影响有机溶剂萃取效率，而离心法去除水分不完全。如果藻类密度较大，适量少取就好了。5.取样体积[img=,690,125]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/07/201807300912335267_3403_3247383_3.jpg!w690x125.jpg[/img]图3（第四版）关于取样体积的规定[img=,690,151]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/07/201807300913206267_7656_3247383_3.png!w690x151.jpg[/img]图4 HJ897-2017中取样体积的规定取样体积直接关系到试样制备效率，是叶绿素a测定精密度准确度重要影响因素，HJ897-2017规定按水体的营养状况确定取样体积，并按营养状态给出相应的参考值。根据湖泊（水库）富营养化评价方法及分级技术规定（总站生字090号）评价标准，计算综合营养状态指数需要取得总氮、总磷、透明度、高锰酸盐指数和叶绿素a数据，是比较复杂的计算过程，用它来指导叶绿素测定的取样量，个人认为不适用。第四版的规定视浮游植物分布而定，少则多取，提高实验精密度；多则少取，提高实验效率，更具可操作性。6.低温保存样品过滤后，第四版规定滤膜在冰箱中低温干燥6-8h再研磨。“低温”让细胞质形成冰晶、膨胀，达到破碎细胞的目的，尤其是细胞壁坚硬的硅藻或者有胶被的蓝藻群体，低温处理有利于叶绿素顺利溶出，提高萃取效率。水分的存在影响有机试剂萃取效率，所以“干燥”也是必要的措施，低温保存具有双重效果。HJ897-2017则是过滤后马上研磨。7.第四版和HJ897-2017都用研磨法作为提取方法，不同的是第四版少量多次研磨，每次研磨后转移至离心管，离心后将上清液倒入容量瓶，最后用丙酮定容。HJ897-2017规定研磨5分钟以上，最后与滤膜一并转入离心管，定容至10ml，放置4℃避光浸提2-24h，离心取上清液，然后用针式过滤器过滤，测定。手动研磨费时费力，且不易把细胞完全磨碎，多次研磨、转移不可避免见光，还会造成样品流失，离心后很难得到上清液同时不能保证萃取液与滤膜完全分离，导致结果准确度、精密度不够，而且操作人员长时间接触丙酮，不利身体健康。多年以来，很多研究者提出用乙醇代替丙酮，用直接浸提、超声法、加热、反复冻融等多种细胞破碎方法代替研磨法，实验数据表明，经过改良的提取方法测得的叶绿素a水平明显高于研磨法，标准偏差变小，缩短实验操作时间。8.修改了测定波长及计算公式：第四版测定波长750nm、663 nm、645 nm、630 nm，HJ897-2017测定波长750nm、664nm、647 nm、630 nm。9.增加了空白试验和平行样测定等质控措施，试验过程增加质量保证注意事项。参考文献：国家环境保护总局《水和废水监测分析方法》编委会．水和废水监测分析方法．4版．北京：中国环境科学出版社，2002：670-671．环境保护部.水质 叶绿素a的测定 分光光度法：HJ 897-2017[s].北京：中国环境出版社，2017.国家环境保护总局《水和废水监测分析方法》编委会．水和废水监测分析方法．4版．北京：中国环境科学出版社，2002：28-29.陈文峻，[color=#333333]蒯本科，植物叶绿素降解[/color].植物生理学通讯2001，37（4）：336-338. 胡鸿钧, 魏印心. 中国淡水藻类——系统、分类及生态. 北京: 科学出版社,2006. HU Hongjun, WEI Yinxin. The freshwater algae of china: Sys- tematics,taxonomy and ecology. Beijing:Science Press, 2006. (in Chinese)[/s]

[align=center][font='黑体'][size=29px]叶绿素铜钠盐[/size][/font][/align][align=center]杨宗琦[/align]叶绿素是植物进行光合作用所必需的催化剂，是由四个吡咯环与镁离子相互配合而形成的镁卟啉类化合物。它是天然生物活性物质之一，具有排毒养颜，抗病强身，抑菌除臭等功效，一方面被广泛应用于日用品、食品、色素、脱臭剂等方面，另一方面在医药上也可用来治疗多种疾病，并应用于各种牙膏的开发中。但游离的叶绿素卟啉环中的镁离子在酸性条件下容易被氢离子取代，生成脱镁叶绿素使色泽褪去，且对光、酸和热比较敏感，使叶绿素的应用受到严重限制。近年来，有不少研究者试图对叶绿素的结构进行修饰，使其变成相对稳定的金属卟啉结构，而叶绿素铜钠盐就是极其重要的一种。叶绿素铜钠盐具有很高的稳定性，在医学上，叶绿素铜钠盐是一类重要的药物，甚至可用叶绿素铜钠盐用于治疗白血病。本文将从基本性质、制备工艺、含量测定等方面介绍叶绿素铜钠盐。[font='黑体'][size=18px]一、基本性质[/size][/font] [align=left]叶绿素，英文名Chlorophyllin，中文别名叶绿素镁钠盐 、叶绿酸粉末、 叶绿素铜三钠，呈墨绿色粉末，着色力强，色泽亮丽，其水溶液呈蓝绿色澄清透明液，[font='宋体'][size=13px][color=#000000]易溶于水，几乎不溶于低醇，不溶于氯仿。水溶液透明、无沉淀。在酸性情况下（[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]pH 6.5 [/color][/size][/font][font='宋体'][size=13px][color=#000000]以下[/color][/size][/font][font='宋体'][size=9px][color=#000000]）[/color][/size][/font][font='宋体'][size=13px][color=#000000]或钙离子存在时，则有沉淀析出。[/color][/size][/font]当其水溶液pH 值小于6 时，染液底部出现粉末状沉淀，这是由于平面空间结构的叶绿素铜钠分子在酸性条件下易于聚集 。叶绿素铜钠盐可以菠菜或蚕粪为原料，用丙酮或乙醇提取叶绿素，添加适量硫酸铜、叶绿素卟啉环中的镁原子被铜置换即生成。[/align]1.1物理化学性质沸点：801.6℃at 760 mmHg分子式：C[font='calibri'][size=13px]34[/size][/font]H[font='calibri'][size=13px]31[/size][/font]CuN[font='calibri'][size=13px]4[/size][/font]Na[font='calibri'][size=13px]3[/size][/font]O[font='calibri'][size=13px]6[/size][/font]分子量：724.148闪点：438.6℃储存条件：密封于2-8℃阴凉干燥处溶解性：易溶于水，略溶于醇和氯仿。[img]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2021/08/202108061804161897_7669_1608728_3.png[/img] [img]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2021/08/202108061804162109_5211_1608728_3.png[/img]1.2中毒症状和影响，急性和迟发效应系统性铜中毒症状包括：毛细血管损伤、头痛、冷汗、脉搏微弱、肝肾损伤、中枢神经系统兴奋继而抑制、黄疸、抽搐、麻痹和昏迷。休克和肾衰会导致死亡。慢性铜中毒包括肝硬化、脑损伤和脱髓鞘、肾损害；铜沉积在角膜引起人威尔逊病。还有报道铜毒性导致血红蛋白贫血和加剧动脉硬化。目前，其化学、物理和毒性性质尚未经完整的研究。1.3安全操作的注意事项在有粉尘生成的地方,提供合适的排风设备。1.4安全储存的条件,包括任何不兼容性贮存在阴凉处。 容器保持紧闭，储存在干燥通风处。建议的贮存温度:2 - 8℃，对光线敏感[font='黑体'][size=18px]二、制备工艺[/size][/font]工艺流程：原料→预处理→浸提→过滤→皂化→回收乙醇→石油醚洗涤→ 酸化铜代→抽滤水洗→ 溶解成盐→过滤→干燥→ 成品2.1方法一将富含叶绿素的原料( 国内生产以蚕沙为主) 于40~ 50℃烘干后，研细成粉末状。加粉末量3倍的乙醇丙酮混合液( 1/ 1)于40~45℃提取2.5h，抽滤,滤渣用同等体积乙醇丙酮的混合液再提取 一次。合并两次提取液并加NaOH 调pH 值为11，加热皂化( 50°C左右) 30min。皂化是否完全可用石油醚萃取来判断，上层液呈黄色即为皂化完全 。皂化完全后蒸馏浓缩回收混合液( 60°C左右) 直至体积为原来的1/4~ 1/ 3 即可。再用石油醚萃取4次。下层用盐酸调至pH 值为7，加硫酸铜后调pH值为2, 并在50℃下铜代2h。反应结束即有颗粒状沉淀形成，静置冷却。室温下收集沉淀， 先用50~ 60℃水洗涤，再用30% ~ 40% 的乙醇洗涤至乙醇层为浅绿色。再用石油醚洗涤至石油醚层为浅绿色。滤饼用丙酮溶解，用5%的NaOH 乙醇溶液沉淀，pH 值为12，收集沉淀，用无水乙醇洗涤即得产品。在制备过程中反应温度不易过高，调节pH 值时要小心，温度过高以及pH 值过大或过小都能使叶绿素分解 。此为百度文库提供的制备方法。通过查阅知网，我们了解到以下几种从不同原材料出发的制备叶绿素铜钠盐的方法。2.2方法二：螺旋藻制取叶绿素铜钠盐基本思路：利用硫酸铜对螺旋藻进行浸泡铜化，再用丙酮乙醇混合液浸提得到叶绿素的有机溶液，再经过皂化、萃取、浓缩、干燥等步骤将叶绿素改造为叶绿素铜钠盐。具体步骤：材料：螺旋藻主要试剂：AR乙醇（沸点 78.1℃），AR 丙酮（沸点 56.1℃），AR氢氧化钠，AR 石油醚，AR 盐酸，硫酸铜晶体（CuSO[font='calibri'][size=13px]4[/size][/font].5H[font='calibri'][size=13px]2[/size][/font]O），食盐，白砂糖，可溶性淀粉，用时配成各种所需浓度。工艺流程：螺旋藻→粉碎→铜化（5%CuSO[font='calibri'][size=13px]4[/size][/font]溶液）→洗涤、脱水→浸提(丙酮乙醇混合液)→过滤→浓缩→皂化（5%NaOH溶液）→萃取（石油醚）→干燥→叶绿素铜钠盐产品具体步骤：称量 5.0g 粉碎好的螺旋藻于试管中铜化 13h 后，洗涤脱水于锥形瓶中，加入 70：30 的丙酮乙醇混合液 300mL,加盖在室温下浸提 2h，过滤，浓缩，皂化（5%NaOH 溶液），萃取（石油醚），干燥，可制得墨绿色带金属光泽的叶绿素铜钠盐产品。该文献还对叶绿素铜钠盐的稳定性进行实验分析，实验结果表明，螺旋藻叶绿素铜钠盐的耐光性较较差，需在避光条件下保存；热稳定性较好，但不能高于85 ℃；不耐强酸；食盐、白砂糖、淀粉等食品添加剂无不良影响。2.3方法三：剑麻膏中叶绿素铜钠盐的制备基本思路：以从剑麻膏中萃取得到的叶绿素为原料，研究了酸化、铜代、皂化条件对叶绿素铜钠盐产率的影响。该文献指出，叶绿素铜钠盐的制备过程可分为两种，一种是先皂化，后铜代，目前大多数文献都采用这种方法，但由于叶绿素的耐酸性较差，所得产品纯度不够，产率不高 另一种是先铜代后皂化，即将提取出的叶绿素首先脱镁铜代，使叶绿素变成比较稳定的叶绿素铜，再经皂化成盐得到产品。这种方法对反应温度和时间的要求不太苛刻，有利于提高叶绿素的稳定性。故他们采用先铜代后皂化的方法，遵循节能降耗，提高效率的原则，对反应条件进行优化，并对所得叶绿素铜钠盐的性能和质量进行检测。实验试剂与仪器：剑麻膏，由广西武鸣东风农场提供 乙醇、丙酮、盐酸、氢氧化钠、石油醚、硫酸铜均为分析纯。BSA224S电子天平 FZ102 微型植物试样粉碎机 HH-2数显恒温水浴锅 723N可见分光光度计 R201L 旋转蒸发仪。具体步骤：[font='宋体']①[/font]叶绿素的提取称取30 g 剑麻膏于250 mL的三口烧瓶中，用 85% 的乙醇在 60 ℃水浴锅中提取3 h。提取液减压浓缩，得到含有叶绿素的提取膏状物。加入丙酮，萃取叶绿素，回收丙酮，得到叶绿素膏状物。[font='宋体']②[/font]叶绿素铜的制备 叶绿素加入少量乙醇溶解，用 10%的盐酸调 pH 为酸性，这时溶液由绿色变成黄褐色，酸化脱镁 45 min 后，边搅拌边加入10%CuSO[font='calibri'][size=13px]4[/size][/font]溶液进行铜代，有絮状沉淀生成，抽滤，用热水反复洗涤，得叶绿素铜。[font='宋体']③[/font]叶绿素铜钠盐的制备 叶绿素铜用少量乙醇溶解，加入 10% NaOH 溶液，75 ℃皂化 1 h，加入等量的石油醚，充分摇动，静置分层。除去上层黄色的叶黄素等脂溶性杂质，将下层深绿色的叶绿素铜钠盐收集于小烧杯中，水浴蒸干水分，在 60 ℃下烘干，即得目标产物。 该文献还讨论了酸化脱镁的条件优化，他们发现，叶绿素铜的产率随着溶液 pH 的增大而逐渐减小，pH＞3时，产率下降。说明当 pH较大时，酸度不够，一部分叶绿素卟啉环中的镁离子没有脱落下来，导致叶绿素铜得率下降。所以，以pH =3 为宜。对于[font='fzktk--gbk1-00'][size=13px][color=#000000]酸化时间对叶绿素铜得率的影响[/color][/size][/font][font='fzktk--gbk1-00'][size=13px][color=#000000]，研究发现[/color][/size][/font][font='ssj4'][size=13px][color=#000000]，[/color][/size][/font]酸化时间超过 60 min 时，叶绿素铜的产率增大不太明显，说明酸化反应基本完成。为了节约实验时间，酸化时间以 60 min 为宜。对于酸化温度对叶绿素铜得率的影响，发现叶绿素铜得率在45-65℃随着酸化温度的升高呈上升趋势在65-85 ℃产率变化不大，超过85 ℃时，产率突然下降。可能是高温使叶绿素铜中的环状结构氧化，四吡咯环破坏而被降解，使叶绿素铜的产率降低。所以，酸化温度以65℃为宜。对于加铜量对叶绿素铜得率的影响，研究发现随着硫酸铜量的增加，叶绿素铜的得率增加，加入量大于 15 mL 时，增大幅度不明显，基本保持稳定。实验过程中还发现，加铜量太多时，溶液中游离铜的量也会增多，会延长叶绿素铜的洗涤时间。考虑到实验效率和能耗问题，加铜量以15 mL为宜。对于铜代时间对叶绿素铜得率的影响，研究发现叶绿素铜的得率随着铜代时间的延长呈增大趋势，铜代时间超过2h时，叶绿素铜得率的增大幅度不大。所以，铜代时间以2h为宜。对于皂化温度对叶绿素铜钠盐得率的影响，叶绿素铜钠盐的产率随着皂化温度的升高不断提高，当温度高于85℃时，产率稍有下降，这可能是因为生成的叶绿素铜钠盐在较高的温度下会部分分解，导致产率下降，为了保证叶绿素铜钠盐的质量，皂化温度选择75 ℃为宜。对于皂化时间对叶绿素铜钠盐得率的影响，研究发现叶绿素铜钠盐的得率随着皂化时 间的延长而增大，≥60 min 后得率趋于稳定。皂化时间较短时，用石油醚萃取的过程中，分层不明显，醚相呈绿色，说明没有皂化完全。所以，皂化时间以60 min 为宜。对于pH 对叶绿素铜钠盐得率的影响，研究发现，当pH＞11 时，叶绿素铜钠盐的得率趋于稳定，在实验过程中发现，当 pH为9或10时，用石油醚萃取酯溶性物质时，界面会有固体颗粒，分层界面不清晰，醚相为绿色，这都是因加碱量不够，导致皂化不完全。所以，皂化时以pH = 12为宜。该文献还对叶绿素铜钠盐的性质进行了探究。对于耐光性，研究表明叶绿素铜钠盐在强光下不稳定，但与叶绿素相比，已经大大提高了耐光性。对于耐热性，实验结果为在90 ℃以内，叶绿素铜钠盐的吸光度基本保持不变，颜色均为绿色 温度高于90 ℃时，吸光度开始有下降趋势，但幅度不大，即使是在110 ℃时，叶绿素的保存率也为96.9%，说明叶绿素铜钠盐的耐热性还是比较理想的，可添加到处理温 度在100 ℃以内的食物中。对于耐酸碱性，从实验数据可以看出溶液的吸光度随着pH的增大而升高，pH在3～6 范围内，吸光度变化幅度不大，溶液颜色呈土绿色 pH = 7时，吸光度值有个比较大的跳跃 在 7～12 范围内，吸光度的变化幅度也不太大，溶液颜色呈碧绿色。在实验过程中发现，当 pH＜3时，溶液中会出现大量沉淀，这可能是因为叶绿素铜钠盐在强酸条件下生成了不溶于水的叶绿素铜酸 当pH＞11时，因碱性太强，加速脱酯反应，使叶绿素分解，溶液的吸光度迅速下降，但在碱性条件下，因不发生脱镁或碳环裂解反应，却能保持相对稳定的色泽，在使用中只要控制溶液 pH 值在近中性或偏碱水平，就能基本维持叶绿素铜钠盐的稳定性。综上可以得出，采用先铜代后皂化的方法制备叶绿素铜钠盐，即叶绿素提取出来后先脱镁铜代，增加中间产物的稳定性，在后续操作中，不必考虑因温度太高或时间太长而使叶绿素分解的问题，从而提高了产品的产率和纯度。从剑麻膏中萃取制备叶绿素铜钠盐的优化条件是: 酸化时 pH = 3，酸化时间 60 min，温 度 65 ℃ 铜代时硫酸铜加量1.5 g，时间2h 皂化时温度 75 ℃，时间 60 min，pH = 12。在此条件下，产率为 4.46% ，产品为墨绿色粉末，略带氨臭，易溶于水，水溶液呈绿色透明澄清液，微溶于或不溶于乙醇、乙醚、丙酮、氯仿等有机溶剂，有Ca[font='calibri'][size=13px]2+[/size][/font]，Mg[font='calibri'][size=13px]2+[/size][/font]存在时，产品中会有少许白色沉淀，在空气中容易吸潮，应隔绝空气保存。[font='黑体'][size=18px]三、含量测定[/size][/font]3.1试剂与材料氢氧化钠乙酸铵甲醇冰乙酸聚酰胺粉:粒径0.150mm~0.180mm。3.2试剂配制氢氧化钠溶液(4mol/L):称取16.0g氢氧化钠,用水溶解并定容至100mL。氢氧化钠溶液(0.1mol/L):称取0.40g氢氧化钠,用水溶解并定容至100mL。乙酸铵缓冲溶液(0.2mol/L):称取7.708g乙酸铵,用水溶解并定容至500mL。解吸液:0.1mol/L氢氧化钠溶液+甲醇=1+10(体积比)。3.3标准溶液配制精确称取经105℃±1℃干燥至恒重并按其纯度折算为100%质量的叶绿素铜钠标准品0.0500g,用水溶解并定容至100mL棕色容量瓶中,此溶液浓度为500μg/mL,当天配制,避光保存。3.4标准工作溶液准确移取500μg/mL标准溶液10mL至100mL烧杯中,加入0.2mol/L的乙酸铵溶液30mL,用4mol/L氢氧化钠溶液和冰乙酸调pH5~6。加入3.0g聚酰胺粉,充分搅拌2min,避光静置5min用约20mL蒸馏水转移至 G3砂芯漏斗中抽滤,弃去滤液。用75mL 解吸液分3次解吸色素:每次倒入约25mL解吸液,浸泡2min,再振摇2min,抽滤并用20mL解吸液洗净抽滤瓶中残液。收集滤液,用解吸液定容至100mL,配制成浓度为50μg/mL的标准溶液,此溶液临用时配制。[font='e-bz'][size=12px][color=#000000] [/color][/size][/font]3.5被测样品溶液后期处理向含有被测样品粉末或样品浆液的100mL烧杯中加入0.2mol/L的乙酸铵溶液30mL,溶解并混匀样液,用4mol/L氢氧化钠溶液和冰乙酸调pH5~6。加入3.0g聚酰胺粉,充分搅拌2min。将样品溶液用约20mL60 ℃±2 ℃蒸馏水转移至 G3砂芯漏斗中抽滤,弃去滤液。再用75mL 解吸液分3次解吸色素,抽滤并用20mL解吸液洗净抽滤瓶中残液,收集滤液,用解吸液定容至100mL。3.6仪器条件测定波长:405nm。比色皿:1cm。3.7标准曲线的制作分别取标准工作液0mL、5.0mL、10mL、20mL、30mL、40mL、50mL至100mL容量中，用解吸液稀释至刻度,配制成浓度为 0μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL的标准系列。以0μg/mL溶液为空白,测定其吸光值。以浓度为横坐标,以吸光值为纵坐标绘制标准曲线。试样溶液的测定取经过前处理的样品的制备液,以标准曲线的0μg/mL为空白,测定其吸光值,根据标准曲线获得样品溶液中叶绿素铜钠的浓度。本标准检出限为0.001g/kg,定量限为0.005g/kg。3.8总铜含量试样处理[align=left][font='宋体'][size=13px][color=#000000]准确称取 [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]0.1g [/color][/size][/font][font='宋体'][size=13px][color=#000000]试样，精确至 [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]0.000 2g[/color][/size][/font][font='宋体'][size=13px][color=#000000]，置于硅皿中，在不超过 [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]500[/color][/size][/font][font='宋体'][size=13px][color=#000000]℃下灼烧至无碳，用[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]1[/color][/size][/font][font='宋体'][size=13px][color=#000000]滴[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]~2 [/color][/size][/font][/align][font='宋体'][size=13px][color=#000000]滴硫酸湿润，再次灰化。用质量分数为[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]10%[/color][/size][/font][font='宋体'][size=13px][color=#000000]的盐酸溶液分[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]3[/color][/size][/font][font='宋体'][size=13px][color=#000000]次（每次[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]5mL[/color][/size][/font][font='宋体'][size=13px][color=#000000]）煮沸溶解灰分，并过滤[/color][/size][/font]于100mL容量瓶中，冷却后用水定容至刻度，此为试样液。测定[align=left][font='宋体'][size=13px][color=#000000]除试样处理外，其他步骤按[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]GB/T 5009.13[/color][/size][/font][font='宋体'][size=13px][color=#000000]规定的方法测定。[/color][/size][/font][/align]游离铜含量3.9试样处理[align=left][font='宋体'][size=13px][color=#000000]准确称取[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]0.1g[/color][/size][/font][font='宋体'][size=13px][color=#000000]试样，加水约[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]50mL[/color][/size][/font][font='宋体'][size=13px][color=#000000]溶解后，用[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]1mol/L [/color][/size][/font][font='宋体'][size=13px][color=#000000]盐酸调节[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]pH[/color][/size][/font][font='宋体'][size=13px][color=#000000]至[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]4.0[/color][/size][/font][font='宋体'][size=13px][color=#000000]，定容至[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]100mL[/color][/size][/font][font='宋体'][size=13px][color=#000000]，过 [/color][/size][/font][/align][align=left][font='宋体'][size=13px][color=#000000]滤，此为试样液。[/color][/size][/font][/align]测定[align=left][font='宋体'][size=13px][color=#000000]除试样处理外，其他步骤按[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]GB/T 5009.13[/color][/size][/font][font='宋体'][size=13px][color=#000000]规定的方法测定。[/color][/size][/font][/align]参考文献[align=left][font='宋体'][size=13px][color=#000000]【1】韩敏.直接皂化法制备叶绿素铜钠盐[J].应用化工,:,2014.43(4):704-707.[/color][/size][/font][/align][align=left][font='宋体'][size=13px][color=#000000]【2】赖海涛.螺旋藻制取叶绿素铜钠盐的稳定性研究[J].化学工程与装备,:,2020.3(3):14-15.[/color][/size][/font][/align][align=left][font='宋体'][size=13px][color=#000000]【3】李祥.剑麻膏中叶绿素铜钠盐的制备及性能测定[J].应 用 化 工,:,2018.47(2):262-267.[/color][/size][/font][/align][align=left][/align][align=left][/align][align=left][/align]