唾液酸化酶

唾液酸具有促进新生儿大脑发育的功能，中国科学家刚刚研发了一项新的测定婴儿配方乳粉中唾液酸的量的方法。 　　N-乙酰神经氨酸(N-acetylneuraminic acid，Neu5Ac)是大多数哺乳动物组织中最重要的唾液酸。它与婴儿记忆力和智力的发育非常相关。Neu5Ac在肝脏中合成，而新生儿肝脏合成唾液酸速度较慢。因此，一些婴幼儿乳粉厂家在乳粉中添加Neu5Ac以达到唾液酸自然水平。 　　最近，《国际乳品技术期刊》(International Journal of Dairy Technology)发表了中国科学家研发的有关测定婴儿配方乳粉中Neu5Ac含量的新方法。此方法是超高效色谱与质谱的结合技术，有助于婴儿配方乳粉中唾液酸的质量控制。 　　婴儿配方乳粉样品中的Neu5Ac以游离态和结合态两种形式存在。在前处理过程中，通过糖类和蛋白质的水解作用可以得到结合态的唾液酸。得到的两种形式的Neu5Ac需要通过固相萃取柱的净化和色谱柱的分离后，最终采用质谱检测。 　　该方法测定范围涵盖了一般乳基婴儿配方食品中唾液酸的浓度范围。前处理过程需要一个多小时的时间，但是检测过程仅需5分钟左右。&ldquo 该方法不仅适用于乳品工业，也可满足实验室内产品评估控制。&rdquo 研究小组公开表示。 编译：郭浩楠

&zwnj 唾液酸的测定不仅可以用于鉴定燕窝及其制品的真实性和品质，&zwnj 还为其他食品如液态乳、&zwnj 乳粉、&zwnj 糕点和饮料&zwnj 提供了更广泛的检测依据。根据GB 31614.1-2023，有三种方法测定食品中的唾液酸，第一法，液相色谱-紫外检测法：适用于燕窝及其制品中结合态唾液酸的测定；第二法液相色谱-荧光检测法和第三法液相色谱-质谱/质谱法，适用于液态乳、乳粉、糕点、饮料中唾液酸的测定。以下简述三种方法中标准溶液的配置：1.液相色谱-紫外检测法中标准溶液的配置唾液酸标准储备液（1000mg/L）：准确称取适量唾液酸标准品（按纯度进行折算），用水溶解并配制成质量浓度为1000mg/L的标准储备溶液，于4℃下避光保存，保存期6个月。采用20mL规格的opus电子瓶口分配器，stepper模式，设置5个分液体积0.1、0.5、1.0、5.0、10.0mL，然后按分液键，将唾液酸标准储备液（1000mg/L）分别加入5个100mL容量瓶中，再设20mL体积分入第六个100mL容量瓶中；再用0.1%磷酸溶液-乙腈（4+6）定容至刻度，混匀。唾液酸标准系列工作液的质量浓度分别为1.0、5.0、10.0、50.0、100.0和200.0mg/L临用现配。2.液相色谱-荧光检测法中标准溶液的配置唾液酸标准储备液（1000mg/L）：准确称取适量唾液酸标准品（按纯度进行折算），用水溶解并配制成质量浓度为1000mg/L的标准储备溶液，于4℃下避光保存，保存期6个月。采用20mL规格的opus电子瓶口分配器，stepper模式，设置5个分液体积0.2、1.0、2.0、4.0、10.0mL，然后按分液键，将唾液酸标准储备液（1000mg/L）分别加入5个100mL容量瓶中，再设20mL体积分入第六个100mL容量瓶中；再用乙腈-水溶液（1+9）定容至刻度，混匀。唾液酸标准系列工作液的质量浓度分别为2.0、10.0、20.0、40.0、100.0和200.0mg/L，临用现配。3.液相色谱-质谱/质谱法中标准溶液的配置唾液酸标准储备液（1000mg/L）：准确称取适量唾液酸标准品（按纯度进行折算），用水溶解并配制成质量浓度为1000mg/L的标准储备溶液，于4℃下避光保存，保存期6个月。唾液酸标准中间液（100mg/L）：用Miragen电动移液器移取标准储备液（1000mg/L）10mL于100mL容量瓶中，加水定容至刻度，混匀，于4℃下避光保存，保存期1个月。唾液酸标准系列工作液：准备5个100mL容量瓶，用5mL规格的Miragen电动移液器，用单吸多排模式，设置吸入3.8mL，5次排出（体积分别为0.1、0.2mL、0.5、1.0和2.0mL），然后取唾液酸标准中间液（100mg/L）进行一次单吸多排移液，排入5个100mL容量瓶中，用乙腈-水溶液（1+9）定容至刻度，混匀。唾液酸标准系列工作液的质量浓度分别为0.1、0.2、0.5、1.0和2.0mg/L，临用现配。移取液体的一般是量筒和移液管，存在三个缺点：一是敞口操作，对强腐蚀、有毒有害、挥发性的液体，存在安全隐患；二是操作上环节多，需目视确认凹液面，实现精度难以保证；三是效率较低，无法满足日益增加的液体移取的工作需求。实验室移取小体积（几微升到10毫升）的液体，一般采用移液器。Miragen电动移液器，数值靠设定或选定，电机控制活塞运动，吸液和排液也更加稳定，还有步骤少、调数快、模式多等诸多优势。Miragen电动移液器可给电机多段信号，从而达到吸液和排液分次数且各段体积可调。可实现单吸多排、多吸单排等效果。赫施曼的opus电子瓶口分配器分辨率可达微升，不仅可用于常规的等体积分液，一次装液还可完成10个不同体积的连续分液，可用于毫升级的母液添加和分液，大体积的型号可代替烧杯、玻璃棒、洗瓶，用于稀释液的快速、准确地添加，非常适合做标准曲线和毫升级大批量灌装。

唾液酸（SA）是酸性单糖的家族名称，包括 N-乙酰神经氨酸 (NeuAc) 和 N-羟乙酰神经氨酸 (NeuGc)，主要存在于聚糖的非还原末端。是一种天然存在的碳水化合物，最初由颌下腺粘蛋白分离出，因此而得名。唾液酸通常以低聚糖，糖脂，糖蛋白的形式存在。唾液酸可以以 α2,3- 或 α2,6- 键类型存在。这样的连接异构体在生物学上很重要，因为不同连锁类型可能与各种疾病有关，例如病毒感染和癌症。 近年来，质谱技术已被广泛应用于分析聚糖。然而，鉴定含有多个唾液酸残基的复杂聚糖的唾液酸键类型仍然具有挑战性。本研究工作通过使用“SialoCapper-ID 试剂盒”进行独特的衍生化，然后进行 MALDI-8020 MS分析，从而鉴定2-氨基吡啶（PA）标记的聚糖上的酸谱系类型。 SialoCapper-ID 试剂盒是一种用于聚糖预处理的新型试剂盒，可简化获得专利的唾液酸键特异性烷基酰胺化 (SALSA 方法）步骤。SALSA通过中和残留物来防止在聚糖预处理和 MS 分析过程中唾液酸残留物的损失。此外，它允许通过以特定键的方式衍生残基来基于 MS 区分唾液酸键异构体。 SALSA法的衍生方案 本实验中，N-连接聚糖通过肼解作用从51只大鼠102只耳蜗血管纹衍生的糖蛋白中释放出来的。N-聚糖的还原端用PA标记。然后根据唾液酸的数量通过 DEAE 阴离子交换 HPLC 对 PA 标记的聚糖进行分离，并在 ODS 柱上使用反相 (RP) HPLC 进一步分离。使用酰胺柱和 LC-MS 通过正相 (NP) HPLC 分析分级的 N-聚糖，并根据二维 (2-D) HPLC 分析 (RP/NP) 的结果确定 N-聚糖的结构 和 LC/MS 分析。最后，使用 SialoCapper-ID Kit 进行唾液酸键特异性衍生化，用于未确定唾液酸键类型的分离。 在用碳芯片对 14 份 PA 标记的聚糖进行脱盐后，使用 SialoCapper-ID 试剂盒在试管中以液相反应的形式进行唾液酸键特异性衍生化。除了通过 2-D HPLC 和 LC/MS 进行结构测定外，研究者另辟蹊径，使用MALDI-8020+ SialoCapper-ID 试剂盒根据唾液酸键特异性衍生化产生的质量变化来区分唾液酸键类型。相对于LC/MS，MALDI-MS有利于轻松快速鉴定唾液酸键类型，特别是在分析多个样品时。 A1-14 组分的质谱图和唾液酸键型鉴定结果A2-16 组分的质谱图和唾液酸键型鉴定结果 MALDI-8020+SialoCapper-ID 试剂盒唾液酸结合异构体鉴定优势1 无需与标准聚糖样品的分析结果进行比较，即可识别复杂聚糖的唾液酸键类型。2 SialoCapper-ID Kit可应用于标记糖链，无需改变常规分析流程即可进行唾液酸键联分析。3 无需 LC 分离， MALDI-MS 直接鉴定唾液酸键类型。 MALDI-8020是岛津MALDI家族一款体积小巧，性能卓越的特色产品。荣获2018 IBO工业设计大奖银奖。 主要特点：● 线性台式MALDI-TOF● 200Hz固态激光器，355nm波长● 进样速度快● TrueClean™ 自动源清洁功能。配备大口径离子光学系统，使仪器长期使用中源的污染风险降到最低。配备基于紫外激光器的源清洁功能，可自动快速实现源自清洁。● 静音（55dB）● 可视化工作状态 参考文献：岛津应用新闻：Sialic Acid Linkage Isomer Discrimination of N-glycansderived from Rat Cochlea using SialoCapper-ID KitM. Inuzuka, T. Nishikaze 本文内容非商业广告，仅供专业人士参考。

研究背景蛋白质分子在真实生命条件下的结构和功能特性往往受多种环境因子调控，包括配体分子、缓冲条件以及各种类型翻译后修饰等。作为一种常见的翻译后修饰，蛋白不稳定聚糖修饰，例如糖基化中的唾液酸化修饰，在各种生物过程中发挥着至关重要的作用。然而，由于天然可变性和环境敏感性，在完整蛋白水平研究唾液酸化修饰的构效关系一直缺乏合适的结构分析手段。论文简介近日，南开大学李功玉课题组（研究方向：大分子结构质谱分析）与福州大学李金宇课题组（研究方向：计算化学生物学与药物化学）合作，发展《糖型分辨去折叠离子淌度质谱》方法，利用课题组自主开发的《结构质谱指引下的分子动力学模拟》技术，成功揭示了唾液酸化修饰与糖蛋白构象稳定性之间的复杂关系（Chem. Sci. 2024, DOI: 10.1039/D4SC03672G）。该研究通过对唾液酸化模式、化学计量学信息及其对构象稳定性影响的综合分析，系统阐明唾液酸化调节蛋白质动态三维结构的分子机制，为蛋白低丰度翻译后修饰结构的快速高效解析提供一种新思路。该工作是李功玉课题组在《构象分辨质谱分析》领域的应用方法学拓展与深化，通过发展全离子去折叠、非变性离子淌度质谱和全原子分子动力学模拟技术，使构象分辨质谱分析从小肽（Angew. Chem. Int. Ed. 2023, e202314578 Chem. Sci. 2023, 5936-5944 Anal. Chem. 2023, 2221-2228）跨越至大蛋白（Chem. Sci. 2024, DOI: 10.1039/D4SC03672G Anal. Chem. 2023, 10895-10902 Anal. Chem. 2022, 2142-2153），成功实现微小差异的蛋白动态构象的快速高效分辨分析，有效提高了结构质谱解析气相蛋白动态构象的结构分辨率（Nat. Commun. 2019, 10, 5038），属于化学测量学领域质谱分析方向的前沿研究课题。研究亮点开发了一种糖型分辨蛋白构象去折叠策略，通过课题组前期报道的全离子去折叠 (AIU) 与非变性离子淌度质谱 ( Native IM-MS ) 联用技术，实现了对不同糖型蛋白质构象的稳定性快速分析和动态去折叠过程的可视化追踪（Chem. Sci. 2024, DOI: 10.1039/D4SC03672G）。通过自主构建的定量分析构象参数，定量揭示唾液酸化对蛋白构象稳定性的调控作用，首次发现唾液酸化可以稳定蛋白质构象，并限制其动态构象转变（Chem. Sci. 2024, DOI: 10.1039/D4SC03672G）。将课题组前期（Chem. Sci. 2023, 5936-5944）提出的《结构质谱指引下的分子动力学模拟》新思路，首次拓展至大蛋白（ 80 kDa）结构解析。利用这种独创结构质谱解析平台，课题组近期成功解析蛋白气相去折叠的新型分子机制（Chin. Chem. Lett. 2024, in press），发现富含片层的结构域优先去折叠，并观察到 β-片层到 α-螺旋的动态转变，同时证明 α-螺旋比 β-片层具有更高的稳定性。该方法具有较强的广泛适用性，未来可应用于几乎所有蛋白体系。研究内容首先，为了表征不同胎球蛋白的唾液酸化模式，作者进行了基于 EThcD 的自下而上的糖蛋白质组学实验，图 1b 总结了牛胎球蛋白（bFT）和人胎球蛋白（hFT）的位点特异性糖基化模式。值得注意的是，具有两个唾液酸的糖型在 bFT 中占主导地位，而具有一个唾液酸的糖型在 hFT 中最为丰富（图 1c）。图1. bFT 和 hFT 的糖基化模式为了探究完整蛋白质结构与特定糖型之间的联系，作者开发了一种糖型分辨去折叠策略，该方法结合了非变性离子淌度质谱（Native IM-MS）与全离子去折叠（AIU）技术。通过优化转移池电压， hFT 的氧鎓离子和主要蛋白形式（电荷状态 12+ 、 13+ 和 14+）都得到了很好的分离，通过糖型分辨去折叠实验确定的糖型也与糖蛋白组分析一致（图 2b）。为了更加直观地比较蛋白质构象，作者为每种糖蛋白生成了 AIU 指纹图谱。实验结果表明，随着唾液酸数量的增加，第二个构象与第三个构象之间的 CCS 值差异逐渐缩小。此外，三唾液酸化的 hFT 具有四个构象，而其他唾液酸形式则具有五个构象，由此说明唾液酸的数量可能与胎球蛋白的构象灵活性有关（图 2c）。图2. 糖型分辨全离子去折叠可视化图谱为了进一步阐明唾液酸化诱导的蛋白质结构变化，作者量化了一系列的构象参数，包括 CCS 、 AIU50 等。第一个构象转变（T1）的 AIU50 值随着唾液酸个数增加而升高（图 3b 和 3f），这意味着唾液酸化会稳定糖蛋白结构，作者推测这可能是通过促进唾液酸和蛋白质结构域之间的额外静电相互作用和氢键作用实现的。值得注意的是，在 hFT 的第二个转变（T2）中观察到了相反的趋势，作者推测可能是唾液酸化在一定程度上促进了蛋白质的构象灵活性（图 3f）。之后，作者利用展开曲线来量化去折叠比例，并绘制了关于唾液酸化构象稳定性和动态转换的图谱。通过监测 CCS 变化百分比与碰撞电压的关系，绘制了展开曲线（图 3c 和 3g）。展开曲线显示，随着唾液酸数量的增加，去折叠起始能量逐渐增加，这表明存在明显的依赖唾液酸数量的展开趋势。同时，糖型分辨去折叠策略放大了构象差异， bFT 和 hFT 的 RMSD 分别为 5.9%~20.8% 和 7.7%~20.9% （图 3d 和 3h）。这些发现凸显了基于 AIU 方法在表征由不稳定的聚糖修饰诱导的细微构象变化方面的优势。图3. 糖型分辨去折叠定量分析胎球蛋白构象稳定性最后，为了研究唾液酸化与蛋白质结构之间的相互作用，作者使用唾液酸水解酶对 bFT 进行消化，同时通过分子动力学模拟进一步阐明了气相中 Asn99 和 Asn156 唾液酸化对蛋白动态构象变化的影响。唾液酸化与去唾液酸化牛胎球蛋白的 MD 结果都表现出四个构象，且具有可接受的 CCS 误差（图 4d）。唾液酸化亚型（646.8 K）的熔解温度（Tm）高于去唾液酸化亚型（642.1 K），表明唾液酸化有助于维持蛋白质构象（图 4e）。对去折叠中间体中 α-helix 和 β-sheet 结构占比的分析表明，唾液酸化有利于维持 bFT 中二级结构的适当折叠（图 4f）。加热过程中的代表性展开特征（图 4g ）表明唾液酸化聚糖可以包裹并紧实蛋白质结构。综上，作者认为末端唾液酸化稳定了胎球蛋白构象并限制了其动态结构波动。图4. 唾液酸化对胎球蛋白构象的稳定作用该研究为深入理解蛋白质不稳定聚糖修饰的结构和功能提供了新的见解，为疾病诊断和治疗提供了新的理论基础。同时，该研究也为开发新的蛋白质结构解析方法提供了新的思路。相关研究成果以“Sialylation-induced stabilization of dynamic glycoprotein conformations unveiled by time-aligned parallel unfolding and glycan releasing mass spectrometry”(《构象分辨质谱助力微小差异蛋白构象高效解析》)为题在线发表于化学领域重要期刊、英国皇家化学会旗舰期刊 Chemical Science 上。 南开大学化学学院 2022 级硕士研究生王雅梅、科研助理贾翼菲以及南通大学刘以畅博士为该文共同一作。李功玉研究员和李金宇教授为本文共同通讯作者。美国威斯康星大学麦迪逊分校李灵军教授和刘源博士对本项目提供了重要的技术支持。本文主要质谱数据均采集于天津《物质绿色创造与制造海河实验室》结构质谱分析平台。本研究工作获国家重点研发计划、国家高层次人才计划、国家自然科学基金和中央高校基本科研业务费等项目资助。另附：南开大学李功玉课题组（详细信息请参考课题组主页：李功玉课题组 ( x-mol.com )）常年招聘科研助理和师资博士后，欢迎对大分子结构质谱感兴趣的同仁联系（ligongyu@nankai.edu.cn），重点引进具有有机合成化学、计算化学、细胞生物学和蛋白质组学等背景的相关研究方向人才。论文信息Sialylation-induced stabilization of dynamic glycoprotein conformations unveiled by time-aligned parallel unfolding and glycan releasing mass spectrometryYifei Jia, Yichang Liu, Yamei Wang, Jinyu Li* and Gongyu Li*Chem. Sci., 2024https://doi.org/10.1039/D4SC03672G作者简介 王雅梅 硕士研究生南开大学本文第一作者，2022 年本科毕业于南京师范大学，同年保送至南开大学化学学院攻读硕士学位（导师：李功玉研究员），研究课题主要聚焦疾病相关蛋白的结构质谱解析新方法开发。 刘以畅 讲师 南通大学 本文共同第一作者，2022 年于福州大学获物理化学博士学位（导师：李金宇教授），现任南通大学药学院讲师，研究方向为计算化学生物学与药物化学。 李功玉 研究员南开大学本文通讯作者，南开大学化学学院，特聘研究员、博士生导师。国家高层次青年人才计划入选者、国家重点研发计划青年项目首席科学家。2017 年博士毕业于中国科学技术大学化学系，随后在密西根大学和威斯康星大学麦迪逊分校完成博士后研究，于 2021 年 2 月加入南开大学化学学院，研究方向为大分子结构质谱分析。 李金宇 教授福州大学本文共同通讯作者，教授、博士生导师，福州大学化学学院院长助理。2011 年于荷兰阿姆斯特丹大学和法国里昂高等师范学院获化学与材料学双硕士，2015 年于德国亚琛工业大学医学院获生物学博士学位，同年于德国于利希研究中心先进模拟研究院从事博士后研究，2016 年加入福州大学化学学院、生物药光动力治疗技术国家地方联合工程研究中心。研究方向为蛋白质计算化学生物学理论方法开发与应用。本文说明了离子淌度技术在蛋白构象研究中的重要作用。沃特世一直致力于不断开发创新质谱相关技术，如特色离子淌度技术、特色成像技术等，同时以“助力客户成功”为使命，期待更多的用户合作及科学成果！

近年来，吸毒人员驾驶车辆即“毒驾”导致的交通事故和公共安全事故时有发生，预防和减少因吸毒驾驶引发的交通事故迫在眉睫。但是以往排查嫌疑人员是否吸毒的尿液检验方法不仅耗费大量人力、物力，而且检验时间过长，不适用于路边筛查。 　　中国科学院生物物理研究所下属中生朗捷生物技术有限公司经过多年攻关，在国内率先研制出利用唾液对吸毒驾驶人员进行快速检测的唾液检测卡，并于近日获得国家食品药品监督管理局颁发的医疗器械注册证。 　　北京市公安局组织的专家验收意见认为，唾液检测甲基苯丙胺和吗啡等毒品的技术操作简便、快捷，避免了常规尿液检测取样不便的问题，适合娱乐场所和道路交通的吸毒筛查工作。

大家好，本周为大家分享一篇发表在Current Opinion in Structural Biology上的文章，Understanding glycoprotein structural heterogeneity and interactions: insights from native mass spectrometry，通讯作者是英国牛津大学化学系的Carol V . Robinson教授。　　蛋白质糖基化的过程会产生具有多种组成、连接和结构的聚糖，这些聚糖具有多种生物学功能。哺乳动物的主要两类糖基化修饰为 N糖和粘蛋白型O糖(图1 a,b)。N-聚糖的分支结构、单糖延伸、岩藻糖基化和唾液酸化是主要特征 粘蛋白型O-聚糖根据其核心结构分为四类。解读聚糖异质性对于了解糖蛋白的结构和功能至关重要。高分辨率nMS在完整水平上提供聚糖组成的全景图，并且将糖蛋白结构的异质性与相互作用的化学计量和功能联系起来。这篇文章集中讨论了利用nMS阐明糖蛋白结构异质性和生物分子功能的最新进展。　　图1 糖基化特征可以用native MS方法表征　　一、描绘糖型组成异质性　　糖蛋白的主要特征包括聚糖占据、N-聚糖分支/延伸、岩藻糖基化和唾液酸化。通过native MS 和糖蛋白组学的方法表征人胎球蛋白糖型，native MS确定全局宏观和微观异质性，而糖蛋白组学描述了位点特异性糖基化信息，可以根据特定于位点的信息对蛋白native MS谱中每种糖型的详细组成进行注释(图1c)。　　使用凝集素的亲和纯化质谱(AP-MS)有助于靶向分析糖蛋白上具有感兴趣结构的糖型。例如，特异性识别α1-3岩藻糖残基的凝集素 (AAL)，揭示了人类α1-酸糖蛋白(AGP)上的 α1-3岩藻糖残基的化学计量 使用与糖基β1-6分支相互作用的凝集素PHA-L，表明 β1-6 分支在所有 AGP 糖型上的普遍存在。　　外切糖苷酶处理在糖组学中广泛用于区分具有不同键的单糖残基。一项最近的工作使用了α-神经氨酸酶、β-半乳糖苷酶、β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶和α-岩藻糖苷酶的组合外切糖苷酶，揭示了 AGP 在完整糖蛋白水平上核心和触角岩藻糖基化的化学计量。对于同时具有 N-连接和 O-连接聚糖的高度糖基化生物治疗药物，例如依那西普、使用外切糖苷酶、内切糖苷酶和蛋白酶的综合酶处理对于全面了解糖蛋白的整体异质性至关重要(图2)。　　图2 (a) 依那西普的结构 (b) 唾液酸酶(一种外糖苷酶)和PNGase F(一种内糖苷酶)处理的依那西普的native MS。　　2、描绘结构异质性　　蛋白质O-糖基化在许多细胞表面蛋白质中普遍存在，如 SARS-CoV-2 刺突蛋白受体结合域 (S-RBD)，该蛋白具有核心 1 和核心 2 粘蛋白型O糖。最近的一项突破将软着陆 MS 和扫描隧道显微镜 (STM) 相结合，能够对单个聚糖的构象和结构进行成像。　　以前的报告表明，N-聚糖分支和核心岩藻糖基化受到糖基化位点局部构象的限制，远离蛋白质表面的唾液酸化和末梢岩藻糖基化被认为受蛋白质骨架结构的影响较小。随着 nMS 分辨率的进步，通过比较位点特异性和全局异质性直接重新审视这一假设是可行的。如果每个位点上的糖基化事件是独立的，那么全局异质性应该与位点特异性信息一致。对于核心岩藻糖基化IgG和携带简单 N糖的人胎球蛋白，位点特异性糖基化完美地解释了整体异质性。然而，最近对高度分支和唾液酸化的 rhEPO 和 S-RBD 的研究表明，糖基分支上唾液酸化打破了native MS 和糖蛋白组学数据之间的这种相关性。因此，这些情况表明唾液酸化并非完全独立于所有糖基化位点。　　3、破译N聚糖生物合成途径 监测N-聚糖宏观和微观异质性提供了对其生物合成途径的见解。N-聚糖分支由一系列N-乙酰胺基葡萄糖转移酶催化，它们将单糖依次连接到糖基的不同分支上。对敲除了个别N-乙酰胺基葡萄糖转移酶基因的细胞表达的糖蛋白进行分析，可以揭示糖基的生物合成偏好。除了N聚糖的分支合成以外，岩藻糖基化过程也可以通过native MS揭示。人类AGP最多能携带11个岩藻糖, 用连续的外切糖苷酶消化和native MS来区分 AGP 上的核心和分支岩藻糖基化N-聚糖，揭示了岩藻糖基化在完整糖蛋白水平上的联系和化学计量(图3)。　　图3 (a)人AGP结构。(b)外切糖苷酶处理可区分AGP上N糖的核心和分支岩藻糖基化。(c) 外糖苷酶消化的AGP的native MS揭示了在完整糖蛋白水平上岩藻糖基化的联系和化学计量学。　　四、将糖的异质性与糖蛋白相互作用联系起来　　通过保留完整的蛋白质与配体/药物的复合物，nMS 为蛋白质相互作用的化学计量和动力学提供了信息。AGP 与抗凝药物华法林的研究表明，单岩藻糖基化可减弱蛋白质-药物相互作用(图4)。　　图4 (a)人 AGP在其疏水袋中特异性结合抗凝药物(华法林)。 (b) 将 AGP-华法林复合物的native MS绘制为华法林浓度的函数 (c)华法林浓度和与华法林结合的非岩藻糖基化AGP或单岩藻糖基化AGP的百分数的对应曲线。非岩藻糖基化为蓝色，单岩藻糖基化为红色。 (d) 不同糖型解离常数的比较表明，N-聚糖分支和岩藻糖基化降低了 AGP 对华法林的亲和力。　　native MS的分辨率革命已经使糖组学、糖蛋白组学和top-down MS之间建立了联系，以揭示糖基的宏观异质性。未来，蛋白质糖基化的数学模型和多组学方法的整合将为我们理解“不可解析”的糖蛋白复合物提供新的思路。

本研究人员日前报告说，他们开发出一种新技术，只需分析人体唾液，即可筛查口腔癌、乳腺癌和胰腺癌等癌症，而且准确度很高。 　　日本庆应义塾大学在新闻公报中说，癌细胞比正常细胞增殖迅速，受其影响，唾液中的数百种物质也会出现浓度变化。他们通过比对癌症较早期患者与正常人的唾液，发现有54种氨基酸的浓度存在重大差异。 　　研究人员进而对这54种氨基酸进行分析，发现可以利用它们准确筛查多种癌症，其中，口腔癌的筛查准确率为80%，乳腺癌为95%，胰腺癌为99%。 　　与血液检查筛查癌症相比，唾液检查更为便捷，且不会增加身体负担。下一步，研究人员还准备开发成本更低、更易操作的唾液分析仪器，以早日达到实用化水平。

p 　　据央视财经消息，日前，以色列最大医疗机构谢巴医疗中心公开了最新研发的新冠病毒“唾液检测法”,不到1秒出结果。 /p p 　　检测时，测试对象往嘴里倒入主要成分为生理盐水的漱口水。漱口后，吐回试剂瓶。检测人员随后取样，并将样品放入检测机，连接电脑进行检测。检测用时仅需不到一秒，就能在电脑屏幕上显示出检测结果。 /p p style=" text-align: center" img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 600px height: 350px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202008/uepic/42719703-09a6-4a5a-837c-e07ba432bd5b.jpg" title=" 微信图片_20200817113444.png" alt=" 微信图片_20200817113444.png" width=" 600" height=" 350" border=" 0" vspace=" 0" / /p p 　　据悉，“唾液检测法”不同于目前的鼻咽试纸检测，其主要是针对测试对象的唾液进行光谱分析，因此检测设备仅需一个比手掌稍大一点的盒子。 /p p 　　连接电脑后，基于前期累计的大量数据和人工智能分析，检测算法能够及时给出结果。初步临床试验显示，“唾液检测法”的准确率达到了95%。 /p p style=" text-align: center" img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 600px height: 328px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202008/uepic/056fd965-7db3-449f-ac55-326337245cf9.jpg" title=" 微信图片_20200817113448.png" alt=" 微信图片_20200817113448.png" width=" 600" height=" 328" border=" 0" vspace=" 0" / /p p 　　以色列“唾液检测机”研发公司光谱业务负责人埃雷兹· 列夫表示，“唾液检测法”不需要实验室场景，可以在家、机场、剧院等场合进行检测，可在任何场景下进行快速的大规模检测。 /p p 　　此外，除了使用便捷、用时短的优势，“唾液检测法”还能大幅降低检测的成本。据估算，大规模投产后，每一台唾液检测机的定价将略低于200美元，即不到人民币1390元，每一次检测的费用仅为0.25美元，约合人民币1.7元。 /p p 　　目前，以色列各大医疗机构仍在关注这种检测方法的有效性，尤其是随着检测数据的积累，“唾液检测法”在未来能否有效检测出无症状感染者。 /p p br/ /p

以色列卫生部、国防部及巴尔伊兰大学7日发表联合声明说，该国已开始试点实施新冠病毒唾液检测法。 声明说，新冠病毒唾液检测试点工作已在该国中部城市特拉维夫开展，试点工作为期两周。在此期间，医务人员将对数百名不同年龄段的民众进行新冠病毒唾液检测及标准鼻咽拭子检测，对比两种方式的“采样舒适度和安全性”以及“检测结果有效性”。　　据介绍，新冠病毒唾液检测试点工作所使用的试剂由巴尔伊兰大学开发。实验室测试显示，其性能和灵敏度与标准鼻咽拭子检测相似。唾液检测法大约45分钟即可出结果，短于标准鼻咽拭子检测法的几个小时。　　以色列卫生部7日发布的数据显示，该国6日报告新增新冠确诊病例2351例，累计确诊近130万例，累计死亡7865例。截至7日，该国930万人口中约617万人已接种至少一剂新冠疫苗，约567万人完成两剂接种，约367万人完成第三剂接种。

大家好，本周为大家介绍的是一篇发表在Analytical Chemistry上的文章Charting the Proteoform Landscape of Serum Proteins in Individual Donors by High-Resolution Native Mass Spectrometry1，文章通讯作者是来自荷兰乌得勒支大学的Albert J. R. Heck教授。　　血清中大多数蛋白都是糖基化蛋白，这些糖蛋白对疾病诊断有着重要意义，基于质谱的糖链释放后分析和糖肽分析是目前普遍使用的糖蛋白分析方法，但仍存在一些局限，例如可能遗漏同时发生的翻译后修饰、缺乏对O-糖的研究、遗漏某些糖肽覆盖不到的糖基化位点等。高分辨非变性质谱为完整糖蛋白的分析提供了新的思路，本文开发了一种基于离子交换色谱的分离纯化方法，能够从150μL血清中分离和分析20多种血清(糖)蛋白，质量范围在30-190 kDa之间。　　图1为血清糖蛋白的分离和分析方法。150μL血清首先经过亲和柱以快速去除大量的白蛋白、IgG和血清转铁蛋白等，这一步骤使用的是作者内部制造的机器人，可以加快过柱子的速度。接着血清被送入离子交换(IEX)色谱，使用40分钟的梯度时，大多数蛋白在14-27分钟内洗脱，故作者在13-30分钟内每隔0.5分钟收集一次级分，并将每个级分缓冲液换为乙酸铵溶液，最后进行Thermo Exploris Orbitrap质谱仪分析。　　　　图1.血清糖蛋白非变性质谱分析方法　　作者使用该方法分离了大约24种血清蛋白，并在文中详细介绍了其中4种蛋白的分析过程：α-1抗胰蛋白酶、补体C3、血红素结合蛋白、铜蓝蛋白。　　(1)α-1抗胰蛋白酶(A1AT)是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，在呼吸系统的功能中起重要作用，作者使用唾液酸酶和PNGase F确认了蛋白上的糖型，又通过TCEP的还原处理发现大部分血清样品的A1AT都是半胱氨酸化的，也确认了A1AT存在N端截短的特征，综上，作者共统计出了13个A1AT异质体。针对捐献者提供的血清，作者区分出了携带V237A和E400D突变的A1AT蛋白的供体。　　(2)补体C3蛋白在免疫调节过程中发挥作用，在血清中浓度相对较高，分子量为187kDa。与该蛋白共流出的还有两种约137kDa和80kDa的蛋白，在唾液酸酶处理后，只有80kDa的蛋白质量减少很多，证明其存在唾液酸，而C3和137kDa蛋白的糖型上无唾液酸。通过对级分的糖肽分析确定N糖位点在Asn 63和Asn 917。137kDa蛋白鉴定为C3缺失α链后降解而成。　　(3)血红素结合蛋白(HPX)在血清中的主要功能是结合和运输游离的血红素，进行血红素和铁的再循环。非变性质谱显示HPX质量范围在58-63 kDa，而蛋白质主链质量仅50 kDa。本文首次解析了血清HPX的蛋白型谱，证明了4-5个N-糖和1个O-聚糖的存在，共17种独特的糖型。　　(4)铜蓝蛋白(CER)负责在人体内转运大部分的铜，分子量132kDa，每个CER分子可以携带6-7个铜离子。CER在非变性质谱检测后的分子量比理论质量多409±5Da，作者将其归为6个铜离子和1个钙离子的结合所致，并发现了CER完全去糖后失去结合金属离子的能力。　　　　图2.绘制血清糖蛋白组的全貌图。观察到的血清蛋白质量范围为30-190 kDa，浓度范围为0.2-50g/L　　总结：本文开发了一种从少量人血清中分离多种糖蛋白的方法，并通过高分辨非变性质谱表征了蛋白型谱，为蛋白全貌提供完整视图。该方法的优势在于非变性质谱需要的样品处理步骤少，最大程度的还原了蛋白的生理状态，劣势在于目前通过完整质量只解析了20余种蛋白中的8种，后续需要结合自下而上或自上而下的蛋白质组学方法进行辨别。在未来的研究中，作者建议联用分子排阻色谱和离子交换色谱，实现高通量在线血清蛋白分离分析。　　撰稿：英语佳 编辑：李惠琳　　原文：Charting the Proteoform Landscape of Serum Proteins in Individual Donors by High-Resolution Native Mass Spectrometry

用棉签在口腔内蘸取唾液后，在试剂盒中加入几种不同的检测试剂，30分钟就可快速检验出是否感染艾滋病。5月4日，记者从北京生物技术和新医药产业促进中心获悉，国内首个艾滋病唾液检测试剂已获批上市。 　　早在2009年，在国家“艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治”科技重大专项的支持下，北京万泰生物药业股份有限公司与厦门大学成功研制出“HIV(1+2型)口腔黏膜渗出液抗体检测试剂盒”。这款艾滋病唾液检测试剂采用先进的免疫渗滤法，操作简便，采样时无痛，不会对受试者皮肤造成针刺损伤，极大降低了被检测者和医护人员受感染的风险。 　　这种唾液检测试剂，还适用于一些不宜使用静脉采血的人群，比如儿童、肥胖者、静脉萎缩者等，便于医疗条件较差、采血困难的边远地区以及大规模人群初筛使用。 　　艾滋病病毒感染者，除了血液外，他们的尿液、口腔黏膜渗出液、精液及泪液中均含有HIV抗体。当前，利用人体的唾液、尿液标本进行艾滋病检测排查，再结合常规的血液标本检测，已成为全球HIV监测的发展趋势。 　　此前，该试剂已分别在中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心、中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所和新疆维吾尔自治区疾病预防控制中心，进行了系统权威的临床研究，并在全国范围的高危人群中采集了1271份唾液样本。最终的临床考核显示，该试剂与进口的HIV抗体酶联免疫试剂阳性符合率达99.09%，阴性符合率99.79%，总符合率99.61%。 　　“目前，这款试剂每人份售价在百元左右，不属于非处方药物范畴，药店买不到，只适用于疾控中心的流行病学调查。”北京万泰药业总经理邱子欣说，由于唾液的收集简便易行，该试剂同时也可用于医院对HIV感染的辅助诊断。“未来，它也有望进入家庭，成为人们自我检测艾滋病的一种方式。” 　　目前，我国现有的各种HIV诊断试剂均针对血液标本，需要进行侵袭性采样，难以满足人群监测的需求，同时还增加了采血过程中可能出现的交叉感染风险。此外，我国前两代艾滋病检测试剂都属于批量检测试剂，其特有的96孔板不适用于个体检验，且须在专业检测仪器的辅助下才能操作。 　　诊断试剂发展史 　　上世纪90年代中期，我国第三代艾滋病诊断试剂依赖进口，国产试剂还停留在第二代的水平。1999年，万泰公司和厦门大学科研人员共同研制出国内唯一一个能完全满足艾滋病毒抗体诊断试剂盒生产要求的艾滋病毒重组抗原，填补了国内的空白。 　　此后，双方研制出了国内第一个第三代艾滋病毒抗体诊断试剂盒，质量与国际一流产品水平一致，与国产第二代产品相比，在灵敏度和特异性上实现了质的飞跃，2000年获得国家二类新药证书，结束了外国公司的垄断。同时，将科研成果迅速转让给占我国HIV诊断试剂市场75%以上的科华、华美、新创、金豪等十余家主要诊断试剂厂商和临床单位，使国产艾滋病毒诊断试剂盒在2001年实现全面更新换代，并获得“国家科技进步二等奖”。 　　2003至2006年，北京承担了国家发改委高新技术产业化示范工程“艾滋病毒重组抗原与抗体诊断试剂产业化”项目 2008年，万泰公司推出国内首家上市的国产HIV第四代诊断试剂，进一步提升了我国的艾滋病诊断能力，使国产试剂达到国际领先水平。

据英国《每日电讯报》13日报道，科学家正在研究一项10分钟内仅靠唾液在家即可完成的癌症检测。　　美国加州大学肿瘤学教授大卫王(David Wong)表示，这种检测能够查出肿瘤DNA是何时在体液内循环的，也被称之为“液体活检”。　　此项唾液检测可达到100%的精确程度，并且操作也很简单，不仅药剂师和牙医能够操作，而且在家也可完成。　　目前，科学家仅可通过血液测试来检测癌症，前提是已经接受活检并测序某一肿瘤，从而得知该追踪的基因特征。不过，尽管这种办法可以检测癌症的扩散，但却不能被用作初期测试，并且会出现假阳性的结果。　　大卫王教授的检测显示一滴唾液便可提供足够的数据，以便尽快给出一个确切的诊断。而且，其优点不仅在于其无创性，同时也因其仅仅15英镑的费用。　　这项检测今年晚些时候会应用到肺癌患者的临床试验当中，并有望在两年之内获得美国食品和药物管理局的审批。王教授相信它还可应用于其他类型癌症的检测，如口腔癌。他在华盛顿举办的美国科学促进协会年会上表示：“如果某患者的血液或唾液中存在肿瘤循环的迹象，那么这项检测即可找到它。我们只需一点唾液，10分钟内即可完成。”　　同时他还表示：“癌症的早期检测至关重要，查出致命肿瘤越早越好。有了这项检测，患者可自行在家进行，抑或在牙医处、药店里都可以。”　　该检测旨在寻找血液中携带肿瘤的突变基因。王教授继续道：“如果人们能拥有一种可靠的早期检测技术，可以自己或者在牙科和药店进行操作，那么这项技术就是关键。

胆固醇作为具有四环的脂质，是一种难以分解的强促炎分子，可加速动脉粥样硬化和非酒精性脂肪性肝炎。高胆固醇是心血管疾病的主要危险因素，目前没有药物能够通过直接促进胆固醇排泄来降低胆固醇。人类遗传学研究发现，功能丧失的去唾液酸糖蛋白受体1 (Asialoglycoprotein receptor 1, ASGR1) 变体与低胆固醇和降低心血管疾病风险有关。ASGR1仅在肝脏中表达并介导血液去唾液酸糖蛋白的内化和溶酶体降解。然而，ASGR1影响胆固醇代谢的机制尚不清楚。2022年8月3日，武汉大学宋保亮团队在Nature 在线发表题为“Inhibition of ASGR1 decreases lipid levels by promoting cholesterol excretion”的研究论文。该论文发现Asgr1缺乏通过稳定肝X受体α (liver X receptor α, LXRα) 来降低血清和肝脏中的脂质水平，LXRα上调ABCA1和ABCG5/G8，这分别促进胆固醇转运到高密度脂蛋白和排泄到胆汁和粪便。ASGR1缺乏阻断糖蛋白的内吞作用和溶酶体降解，降低溶酶体中的氨基酸水平，从而抑制mTORC1并激活AMPK，一方面AMPK通过减少其泛素连接酶BRCA1/BARD1来增加LXRα；另一方面，AMPK抑制控制脂肪生成的甾醇调节元件结合蛋白 (sterol regulatory element-binding protein, SREBP1)。抗ASGR1中和抗体通过增加胆固醇排泄来降低血脂水平，并显示出与阿托伐他汀或依折麦布这两种广泛使用的降胆固醇药物的协同有益作用。总之，该研究表明靶向ASGR1可上调LXRα、ABCA1和ABCG5/G8，抑制SREBP1和脂肪生成，从而促进胆固醇排泄并降低血脂水平。胆固醇稳态是通过肠道胆固醇吸收、血浆脂蛋白摄取、从头生物合成以及胆固醇分解代谢和排泄之间的复杂相互作用实现的。迄今为止，降胆固醇药物主要分为三大类：他汀类药物是3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶 (HMGCR) 的竞争性抑制剂，通过降低胆固醇生物合成和上调低密度脂蛋白 (LDL) 受体 (LDLR) 提高低密度脂蛋白 (LDL) 摄取来降低血浆胆固醇；依折麦布是一种肠道胆固醇吸收抑制剂，通过抑制Niemann-Pick C1样1的内吞作用来阻止胆固醇摄入；PCSK9抑制剂通过稳定LDLR4增加肝脏LDL摄取。尽管这些药物已被广泛使用，但仍有很大一部分患者患有复发性心血管疾病 (cardiovascular disease, CVD)，他们的 LDL 胆固醇水平未能达到指南中推荐的目标水平。最重要的是，这些现有的降胆固醇药物都没有通过直接促进胆固醇分解代谢或排泄来降低胆固醇。mTORC1和AMPK是感知细胞营养和控制新陈代谢的两个主要调节器，它们通过多种机制受到反向调控。尽管AMPK已被提议作为代谢疾病的潜在治疗靶点，但泛AMPK激动剂会导致心脏肥大，从而阻碍其临床应用。除了激活AMPK的组织特异性作用外，细胞AMPK还受药物、营养物质和AMP的不同调节，导致不同靶点的磷酸化。因此，选择性激活AMPK对于在没有副作用的情况下开发药物至关重要。胆固醇通过ABCG5和ABCG8异二聚体排泄到胆汁和肠腔。ABCG5或ABCG8突变导致谷甾醇血症，这是一种以甾醇积累和过早动脉粥样硬化为特征的罕见疾病。小鼠肝脏中过表达ABCG5/G8基因增加了肝胆分泌胆固醇同时降低了血浆胆固醇。ABCG5/G8的表达主要受LXR在转录水平上的调节，LXR的药理激活通过上调ABCG5/G8增加胆固醇流出。然而，LXR也增加了SREBP1（也称为 ADD1），它驱动脂肪酸生物合成基因的表达，导致肝脏脂肪有害变性和高甘油三酯血症。因此，在临床上直接使用LXR激动剂不能用于治疗高胆固醇血症。该研究揭示mTORC1和AMPK可以被ASGR1所调控。mTORC1被去唾液酸糖蛋白的溶酶体消化释放的氨基酸激活，这些氨基酸通过ASGR1介导的内吞作用进入肝细胞。抑制ASGR1会阻断受体介导的内化和随后的去唾液酸糖蛋白的溶酶体消化，从而激活AMPK并抑制mTORC1。这种机制为选择性激活AMPK提供了高度定位的信号。ASGR1的调控LXR的机制模型（图源自Nature ）胆固醇流出通过增加LXRα和ABCG5/G8，LXRα使ABCA1升高，显示更高的高密度脂蛋白 (HDL) 胆固醇和更低的低密度脂蛋白 (LDL) 胆固醇，也改善了脂蛋白谱。由于mTORC1抑制和AMPK激活，SREBP1被抑制，因此阻止了脂肪生成。此外，缺失Ttc39b增加了LXRα和ABCG5/G8而没有激活SREBP1，证实ABCG5/G8的表达可以与SREBP1的表达分离。由于ASGR1几乎只在肝细胞中表达，因此靶向ASGR1绕过了泛AMPK激动剂的不良副作用，为肝脏特异性激活AMPK和抑制mTORC1 铺平了道路。总之，该研究提供了一种独特的降低胆固醇的方法，抑制ASGR1会增加胆汁和粪便中的胆固醇排泄，ASGR1的功能丧失变体与降低非HDL胆固醇和减少复发性心血管疾病相关，这提示抑制ASGR1是治疗心血管疾病安全有效的方法。原文链接https://www.nature.com/articles/s41586-022-05006-3

PerkinElmer最新推出的BeadBoost™ 珠磨均质器是一台集研磨、裂解、均质为一体的灵活、高效和快速的样本匀质器。它通过高效三维高速运动，辅助研磨珠撞击，优化研磨珠运动减少涡流，可处理多种生物样品。BeadBoost™ 珠磨均质器特点：可适用于多种规格的研磨管—24x2ml/1.5ml/0.5ml、12x7ml、3x15ml、6x30ml、3x50ml、96x0.1-1.2ml样品管（需选配适配器）用于提取DNA、RNA、蛋白质和小分子药物成分时的各类生物样品均质前置式开盖，方便样品加载触摸屏界面，优化的Optimate™ 软件，99个可编程内存设置和多语言用户界面运行结束后无需等待即可再次运行，提高了实验效率单管操作，不会出现交叉污染均质处理时间短，不会导致样品降解内置盖锁，安全性高全球新冠疫情已经造成了巨大的社会、经济和公共卫生压力。快速准确地检测SARS-CoV-2是控制新冠疫情的关键。SARS-CoV-2病毒的检测已应用于各种临床标本，鼻咽拭子、口咽拭子样本是目前推荐用于COVID-19诊断测试的标准上呼吸道样本。唾液样本是SARS-CoV-2检测的理想样本类型，因为它具有采集样本简单、无创的特点。唾液样品在核酸检测时的样品操作和检测灵敏度等方面具有一定的挑战。PerkinElmer优化的唾液样品新冠病毒核酸检测工作流程中包含了BeadBoost™ 珠磨均质器。在核酸分离之前，使用BeadBoost™ 珠磨均质器添加一个均质步骤，均质后的唾液样本易于操作，并提高样本中SARS-CoV-2检测的敏感性。实验案例日前来自美国佐治亚州奥古斯塔大学Augusta University的多位科学家利用PerkinElmer的SAR-CoV-2检测方案对来多个自医疗机构和社区收集到的429份对应的鼻咽拭子和唾液样品进行新冠病毒检测，以分析唾液样品、鼻咽拭子的新冠检测效果，以及利用唾液样品新冠检测优化方案后的检测效果。样本处理和SARAS-CoV-2分析工作流程示意图概述：对在医疗机构和社中采集的对应鼻咽拭子和唾液样本进行测试和验证。1、U方案：使用U方案对鼻炎拭子或唾液样本进行SARS-CoV-2检测流程（唾液样品不经过均质，直接用于RNA提取）；2、SalivaAll方案：使用SalivaAll方案对唾液样本进行新冠病毒核酸检测流程（在唾液样品提取RNA之前利用珠磨机均质器进行唾液均质化步骤）；3、SalivaAll混样方案：唾液样本均质后按5:1进行混样，然后进行RNA提取、RT-PCR检测。实验流程及结果如下U方案通过RT-PCR检测240个对应的鼻咽拭子和唾液样本的新冠病毒SARS-CoV-2。结果显示 28.3%（68/240）的样本从唾液、鼻咽拭子或两者中检测出SARS-CoV-2阳性。唾液中的检出率50.0%（34/68）低于鼻咽拭子的检出率89.7%（61/68）。SalivaAll方案对189个对应的鼻咽拭子和唾液样本进行了检测，在提取RNA之前利用BeadBoost珠磨均质器对唾液样品进行样本均质化步骤，然后进行核酸提取、RT-PCR。结果显示，50.2%（95/189）的样本从唾液、鼻咽拭子或两者中检测出SARS-CoV-2阳性。唾液中SARS-CoV-2的检出率97.8%（93/95）高于鼻咽拭子检出率78.9%（75/95）。U方案与SalivaAll方案比较：对U方案检测的85份唾液样本用SalivaAll方案再次进行检测，对两种方案进行评估。在两种方案评估的85份唾液样本中，57.6%（49份）的SARS-CoV-2检测呈阳性，在U方案、SalivaAll方案或两者皆有。唾液样品SalivaAll方案的检出率为100%（49/49），而U方案的检出率为36.7%（18/49）。SalivaAll混样方案根据FDA5:1的混样建议，分别利用1个阳性样品和4个阴性样品混成阳性混样，利用5个阴性样品混成阴性混样。阳性混样和阴性混样各混20个样品。利用SalivaAll混样方案，唾液样本均质后每个样品取60ul进行混样，5个样品总体积为300ul混样，然后进行RNA提取、RT-PCR检测。结果显示，20个阳性混样的检测准确性为95%，阴性混样的检测准确性为100%。研究表明传统的SARS-CoV-2核酸检测流程在唾液样本的操作和检测灵敏度等方面具有一定的挑战。通过PerkinElmer优化的唾液样品检测方案，在RNA提取之前加上唾液样品均质处理步骤，检测结果灵敏性大幅提升，检测灵敏度高于鼻咽拭子，同时可以对唾液样品进行混样检测。此款BeadBoost珠磨均质器先进技术来自OMNI International公司，PerkinElmer已于 2021年1月正式收购OMNI International，这是一家全球领先的样品均质技术公司。OMNI的珠磨均质技术是PerkinElmer新推出并获CE认证的SARS-CoV-2唾液检测流程的一个关键组成部分。此次收购进一步完善了PerkinElmer基因组学全流程解决方案。PerkinElmer致力于为客户提供满足其科研和临床测试需求的完整解决方案。参考文献1.Landry ML, Criscuolo J, Peaper DR. Challenges in use of saliva for detection of SARS-CoV2 RNA in symptomatic outpatients. J Clin Virol. 2020 130: 104567. doi:10.1016/j.jcv.2020.104567.2.Sahajpal, N. S., Mondal, A. K., Ananth, S., Njau, A., Ahluwalia, P., Chaubey, A., . . . Kolhe, R. (2020). SalivaAll: Clinical validation of a sensitive test for saliva collected in healthcare and community settings with pooling utility for SARS-CoV-2 mass surveillance. doi:10.1101/2020.08.26.20182816

近日,大连化物所生物技术研究部生物分离与界面分子机制研究组（1824组）卿光焱研究员团队开发了一种超精准内毒素分离材料。该团队通过“量体裁衣”的材料设计理念,提出了一种基于噬菌体展示筛选和血液相容性肽基聚合物设计的策略,实现了在血液中对特定内毒素的原位、快速、精准清除。　　脓毒症是ICU高发病率、高死亡率、高治疗成本的危重病症,每年造成全球超1100万患者死亡。基于内毒素清除的血液净化策略,在脓毒症治疗中具有重要临床意义。然而,内毒素的结构复杂性、血液成分的复杂性以及内毒素在血液中的低丰度,导致血液中的特异性内毒素清除极具挑战。针对当前血液净化材料特异性不足所导致的内毒素清除效率低、活性药物在血液净化过程中大量流失等问题,团队创新性地提出了超精准内毒素分离材料的研发策略。在本工作中,团队以大肠杆菌内毒素为模型,通过噬菌体表面展示迭代亲和筛选和内毒素解毒活性筛选,发现了一种对靶标内毒素具有高亲和力、高特异性和高解毒活性的内毒素亲和肽(HWKAVNWLKPWT)。该多肽不仅可以实现对内毒素与其他血液成分的精确区分,而且能够实现对特定种类内毒素分子的精准识别与清除。由此设计的肽基聚合物[poly(PEGMEA-co-PEP-1)]可以将脓毒症家兔血液中的内毒素水平从2.63±0.01降低到0.78±0.05 EU/mL (清除率 70%),显著缓解内毒素引起的多器官损伤和脓毒症预后。　　该项工作为超精准内毒素分离材料的开发提供了一个通用范例,有望通过打造一个内毒素系列分子全覆盖的高选择性吸附材料库,全面提升血液净化材料对内毒素的清除选择性,实现对特定内毒素分子的精准识别与清除。此外,这种自上而下的配体筛选策略也适用于其他内源性和外源性血液毒素的特异性清除,有助于推动“个性化”精准医疗在全球重症血液净化领域的探索与应用。　　卿光焱团队致力于开发生物分离分析新材料、新方法,提出了生物分子响应型聚合物的设计思想,研制了多磷酸化肽智能富集材料（Nat. Commun. 2017）、磷酸化肽、唾液酸型糖肽同步富集材料（Anal. Chem. 2020）；提出基于动态共价化学的唾液酸糖肽富集新策略,改变了科学家对富集材料稳定性的认识（J. Am. Chem. Soc. 2020）；利用赖氨酸侧链氨基和18-冠-6间的选择性络合,高效分离甲基化肽（Anal. Chem. 2020）；展望新一代翻译后修饰富集材料的典型特征,以及智能聚合物在该领域的应用前景（Adv. Mater. 2017； TRAC Trends Anal. Chem. 2020）。　　上述工作以“Specific Clearance of Lipopolysaccharide from Blood Based on Peptide Bottlebrush Polymer for Sepsis Therapy”为题,于近日发表在《先进材料》（Advanced Materials）上。该工作的第一作者是我所1824组博士后施振强。上述工作得到国家自然科学基金、辽宁省兴辽英才计划、我所创新基金等项目的支持。

大家好，本栏目供稿来自于中山大学李惠琳课题组，以后将定期为大家带来质谱新技术、新方法领域的前沿文献与工作交流，欢迎评论互动。本周为大家分享一篇发表在mAbs上的文章，Non-targeted characterization of attributes affecting antibody-FcγRIIIa V158 (CD16a) binding via online affinity chromatography-mass spectrometry1，通讯作者是美国加利福尼亚州Amgen公司的Pavel V. Bondarenko。Fcγ受体（FcγR）是免疫球蛋白（Ig）超家族的膜结合糖蛋白，存在于免疫系统的许多造血细胞表面。这些受体可以结合IgG免疫复合物，在免疫反应的调节中发挥重要作用。FcγRIIIa（CD16a）是一种低亲和力Fc受体，与抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）有关。研究表明FcγRIIIa结合亲和力与治疗性单克隆抗体（mAb）的ADCC效力之间存在良好的相关性，测量这种相互作用的亲和力是体外评估单克隆抗体疗法ADCC效力的一个重要部分。Fc上保守N糖基化位点（N297）的聚糖组成对CH2结构域的构象动力学和灵活性有显著的影响，并进一步关系到该结构域与Fcγ受体的亲和力，这种亲和力的差异为区分单克隆抗体糖型提供了一种独特的方法。在文章中，作者描述了一种使用固定化FcγRIIIa受体的亲和层析方法，通过在线质谱（MS）和离线馏分收集，在单个非靶向大规模实验中研究影响FcγRIIIa亲和性的因素。一、基于Fcγ受体亲和层析的抗体糖型鉴别图1显示了利妥昔单抗的糖型分离。从个体保留时间来看，半乳糖基化在与受体的结合亲和力中起着重要作用，更高水平的半乳糖导致亲和力增加（图1b）。几种糖型在提取质谱图（XMC）中含有多个峰（图1c），例如G1F/G1F。这是因为可能存在质量相同的位置异构体（例如G1F/G1F和G0F/G2F含有相同数量的糖，但排列方式不同）。此外，一次只有一个Fc-聚糖与Fc-γRIIIa相互作用，因此不对称糖基化单抗的一侧比另一侧具有更高的亲和力，这可以表现为两个不同的亲和力峰。此外还检测到两种无核心岩藻糖基化物种（M5/M5和G0F/G0）。据报道，这些物种的亲和力和ADCC效价显著增加，但这似乎并未反映在本实验中的保留时间上。最值得注意的是，据报道，M5/M5糖型对FcγRIIIa的亲和力增加了4-6倍，但在所有糖型中洗脱时间最早。仅观察到相对于岩藻糖基化G0F/G0F，无岩藻糖基化G0F/G0糖型的亲和力略有增加，保留时间偏移的幅度与G1F/G1F糖型相当，而不是文献中报道的增加10-50倍。作者推测，与大多数已发表的结合研究中使用的糖基化FcγRs相比，这种偏离预期保留行为的现象可能源于柱上的FcγRIIIa受体是无糖基化的。观察到具有唾液酸化的抗体分子的洗脱时间比其无唾液酸化的对应物稍早。例如，在图1c中，糖型G0F/S1G1F的洗脱时间与G1F/G1F相同。G0F/S1G1F的结构类似于G0F/G2F，在一个半乳糖上带有末端唾液酸，但其洗脱时间更早（类似于G1F）。这表明唾液酸残基可能阻止或抑制第二半乳糖与FcγRIIIa的相互作用，使其更类似于G1F聚糖。图1 利妥昔单抗的FcγRIIIa亲和LC-UV-MS表征。（a） 整个样品的去卷积质谱；（b） 280 nm紫外检测的LC色谱图。星号表示A1G0F的洗脱。（c） 提取的质谱图（XMC）用于检测含有M5/M5、G0F/G0F、G0F/G1F、G1F/G1F、G1F/G2F和G2F/G2F聚糖的单个完整抗体分子。二、亲和层析结果与AlphaLISA结合分析结果的相关性 图2显示了根据平均加权保留时间（根据峰面积加权）排列的四种治疗蛋白质的亲和色谱图。图2b和c显示了平均保留时间与AlphaLISA结合试验的相对亲和力百分比之间的线性相关性。这两种试验报告了类似的趋势，其中糖基化Fc融合蛋白显示无结合，mAb3（IgG2）显示非常弱的结合，与mAb1相比，mAb2（具有高水平半乳糖基化的IgG1）的结合增加。这为使用FcγRIIIa亲和层析方法表征影响结合的产品属性的影响提供了验证。图2 （a） 四种具有代表性的治疗蛋白模式的FcγRIIIa亲和色谱图：无糖基化Fc融合蛋白（紫色）、IgG2单抗（红色）和两种具有不同糖基化模式的IgG1单抗（蓝色和绿色）。（b） 相关图显示了相对结合亲和力与平均加权保留时间之间的关系，去除了异常样本。（c） 相对结合亲和力与加权保留时间的相关图，包括异常样本。三、受体亲和力的差异导致IgG亚类效应器功能的变化IgG亚类（IgG1、IgG2、IgG3和IgG4）的Fc区域具有高度的序列同源性，但在几个关键残基上有所不同，这决定了它们与各种Fc受体的亲和力。为了探究不同Fc结构域的角色，作者对具有相同Fab结构域，但Fc结构域分别来自IgG1、IgG2和IgG4的mAb2变体，以及一种工程化稳定效应器无功能变体（SEFL2）进行亲和分离（图3b）。SEFL2变体是一种无糖基化IgG1变体（N297G），带有额外的工程铰链二硫键，设计为不具有ADCC功能。保留时间数据表明，工程SEFL2-IgG1模式的亲和力最低，其次是IgG2、IgG4，然后是IgG1，这些样品的整体洗脱顺序与已有文献报道的结果一致。然而，IgG4变体的洗脱时间似乎高估了结合亲和力，洗脱时间仅略早于IgG1变体。这种增加的表观亲和力或许与柱上受体的糖基化性质有关，不应用于评估FcγRIIIa对IgG4亚类单克隆抗体的亲和力。图3 （a） 人类IgG重链CH2区域的对齐序列（EU编号）。参与FcγRIIIa结合的IgG Fc残基以绿色突出显示（本研究中通过实验测量），蓝色和红色突出显示（文献报道），二硫键以黄色突出显示。与IgG1序列不同的残基以粗体显示。（b） 具有相同Fab区和不同Fc区的四种mAb2变体的紫外色谱图（λ=280 nm），对应于IgG1（蓝色）、IgG2（品红）、IgG4（褐红色）和带有N297G突变的IgG1 SEFL2（黑色）。插图显示了AlphaLISA测量的相对FcγRIIIa结合亲和力值。亲和力是相对于mAb2参考标准物质的IgG1变体测量的。四、二硫化物异构体对IgG2单抗中FcγRIIIa结合的影响鉴于IgG2亲和色谱图的异质性，作者选择具有二硫化物变体的IgG2（mAb3）进行进一步表征。该IgG2单抗存在几种天然的二硫键结构异构体，它们可以影响疗效和Fc受体结合行为。对二硫化物异构体的反相和FcγRIIIa亲和分离的并排比较（图4）。有趣的是，亲和分离方法中使用的类天然条件仍然能够区分这些结构异构体，这表明这些异构体对Fc和FcγRIIIa的结合亲和力也存在一定影响。图4 （a） 在280 nm处进行紫外检测的反相色谱图，显示天然产生的IgG2二硫化物变体和富集IgG2-a和IgG2-B的纯化样品的混合物分离。（B）相同样品的FcγRIIIa亲和紫外色谱图，显示IgG2二硫化物亚型的部分分辨率。六、在应力条件下识别对FcγRIIIa结合产生负面影响的修饰对受体结合位点或其附近的残基进行化学修饰可影响抗体-受体相互作用的亲和力，从而导致ADCC和疗效的变化。这种修饰可以在各种应激条件下诱导。本研究使用热应激利妥昔单抗样品（40°C，持续6周），通过LC-MS/MS肽图谱检测到200多个修饰。对比具有温度应力的样品和保持在4℃的对照样品的亲和色谱图，每个样品的主峰收集为四个组分（F1–F4）。40°C下的应力导致FcγRIIIa结合的最低亲和组分F1的峰面积略有增加（2%~4%）。对每个收集的组分进行肽图谱绘制，以确定组分中修饰相对百分比的趋势（图5）。馏分被分别赋值为0.1、0.2、0.3、0.4，以便斜率与R2进行比较，并且斜率的R2与绝对值之和可用作评分。具有正斜率的修饰（如半乳糖基化和唾液酸化）表明对受体结合有有利影响，而具有负斜率的修饰（如去酰胺化）表明对结合有不利影响。应激后，组分中的化学修饰斜率（N329脱酰胺）更高（图5b、d、f），而应激前后糖类的斜率（图5c、e、g）保持相似，表明斜率主要由聚糖对受体亲和力的影响以及组分中存在的糖类来定义。图5 （a）亲和色谱图突出显示了在40°C下热应激6周后，相对于4°C对照样品，mAb1峰值强度的变化。（b–g）FcγRIII亲和组分F1、F2、F3和F4中所选修饰的相对丰度变化。（h，i）R2与4°C组分中PTMs的百分比变化斜率的关系。R2与斜率的关系由组分中所有检测到的PTMs的线性回归确定。在所有面板中，红色表示热应力样本（40°C，6周），黑色表示4°C对照样本。所有统计分析中确定的关键属性汇总如表1所示。选择六个指标来评估数据的显著性，以确定修饰是否对FcγRIIIa结合至关重要。评估显示，利妥昔单抗P231（EU P227）、N301（EU N297）和N329（EU N325）三个残基上的11个修饰对结合的影响具有统计学意义。作者进一步分析了这些残基的空间分布，结果显示每个已鉴定的残基都与IgG1到FcγRIIIa的结合域非常接近，为确认这些属性对结合有重要影响提供了额外的信心。表1 确定关键性属性的统计分析总结撰稿：夏淑君编辑：李惠琳文章引用：1 Daniel W. Woodall, Thomas M. Dillon, Kevin Kalenian, et al. Non-targeted characterization of attributes affecting antibody-FcγRIIIa V158 (CD16a) binding via online affinity chromatography-mass spectrometry. mAbs, 2022, 14(1): 2004982.

11月15日—11月19日，第二十五届高交会在深圳会展中心和深圳国际会展中心两馆同时举行。今年的高交会以“激发创新活力，提升发展质量”为主题，持续打造专业化、国际化、便利化、高水平的科技成果交流交易平台。今年，香港中文大学（深圳）首次设独立展厅，展厅展出了人工智能与智能系统领域、大数据与计算机科学领域、新材料领域、生物医药与健康领域的前沿技术和创新成果。在生物医药与健康领域展示区，香港中文大学（深圳）医学院教授、生物医学工程学科负责人刘国珍，向深圳新闻网记者介绍了自己团队研发的高灵敏唾液尿酸检测试剂盒。她说，这款高灵敏唾液尿酸检测试剂盒是一种环境友好、无创无损、经济快速、精准舒适的POCT（即时检测）医疗器械产品，能有效用于高尿酸血症及痛风等慢性疾病的早筛预警和日常监管，也能用于健康人群的日常尿酸监测。该试剂盒是一款纸基芯片试纸条，通过手机APP读数，实现对唾液样品尿酸的实时定量检测。“目前市场上以指尖采血、静脉抽血尿酸检测为主，这两种方式耗时耗力，又会给患者留下创口，价格也比较昂贵，成为尿酸检测环节的痛点问题。我们这款试剂盒，小巧灵便，检测结果也显示得非常快，最重要的是，检测成本大大降低，检测一次，2到3块钱就可以了。”刘国珍说。在刚刚落幕的2023年第八届“创客中国”深圳市中小企业创新创业大赛暨“专精特新”企业创新创业大赛上，这款高灵敏唾液尿酸检测试剂盒获得了创客组第一名。刘国珍在生物传感器研究领域深耕近二十年，之前是澳大利亚新南威尔士大学教授，现在是香港中文大学（深圳）的教授。凭借对神经炎症精准诊疗的突出贡献, 刘国珍获得2020年度乔治娜斯威特定量生物医学女科学家奖，她是第一个荣获此奖项的华人女科学家。她说，自己非常喜欢深圳自由包容的氛围，这里的创业者们都有一股不屈不挠的精神，所以她选择离开“舒适区”，回国发展。她希望自己做一个“摆渡人”，培养更多生物医学器械方面的科研人才，运用自己多年积累的实验室技术帮助国内生物医疗器械解决“卡脖子”问题。

各有关单位：根据《苏州市计量测试学会团体标准管理办法（试行）》等相关规定，由苏州市计量测试学会提出并归口的《人唾液中葡萄糖浓度的测定 离子色谱法》(T/SZJL 4-2023)团体标准已按规定程序审查、审批通过，现予以发布，标准自2023年10月10日起实施。特此公告！苏州市计量测试学会2023年10月08日苏州市计量测试学会关于发布《人唾液中葡萄糖浓度的测定 离子色谱法》团体标准的通知.PDF

各有关单位：根据《苏州市计量测试学会团体标准管理办法（试行）》的有关规定，学会对《人唾液中葡萄糖浓度的测定 离子色谱法》》、《洁净室服装及织物空气粒子过滤效率检测方法》2项团体标准组织了立项评审会议，经专家评审，符合立项要求，现予以立项。特此公告！同时欢迎与本标准有关的高校、科研机构、技术机构及相关企业单位或个人加入本标准的起草制定工作，有意参与本团体标准起草制定工作的请与学会联系。 联系人及电话：胡学刚 0512-66587060电 子 邮 箱：huxg@szjl.com.cn 苏州市计量测试学会2023年04月17日关于《人唾液中葡萄糖浓度的测定 离子色谱法》团体标准的立项通知.PDF关于《洁净室服装及织物空气粒子过滤效率检测方法》团体标准的立项通知.PDF

作为今年海科会的重磅项目之一，首次举办的“海科杯”全球华侨华人创新创业大赛吸引了众多人关注。9月25日，从省长魏宏手中接过奖牌，川籍博士雷明说，这个奖牌是此行最大的惊喜。从川大毕业到留校任教，再到公派出国，雷明博士已在美国工作生活多年，且从事基因测序研究十多年。这次打飞的回国参加比赛，他带来的正是自己的最新研究：第三代快速廉价高通量高精度的DNA测序仪。作为当今最火爆、最前沿的基因检测技术，目前，雷明说，该项技术在国内还算一片空白。这次来参加比赛，他希望能在国内寻找投资人和合作伙伴。目前，他已决定能回川创业。　　国内富豪打飞的做检测 最贵可达十万美金或许你不知道基因测序，但是你肯定听说过这个新闻。美国影星安吉丽娜朱莉为了预防乳腺癌的困扰，预防性地切除了自己的乳腺。而之所以切除乳腺，原因就是她采用基因测序方法提前预知到了体内乳腺病变的先兆。这次从美国飞到成都参加比赛，雷明带来的就是目前最火的基因测试技术——第三代快速廉价高通量高精度的DNA测序仪。“每个人体内的基因都是不一样的，譬如某一种药物，有人吃了过敏，也有人吃了完全没问题。”雷明说，这就是体内基因构成不一样。这项技术，通过从血液或唾液中分析测定基因全序列，可以预测罹患多种疾病的可能性，个体的行为特征及行为合理，如癌症或白血病，运动天赋、酒量等，从而进行靶向治疗。利用这项技术，糖尿病患者不必等到发现胰岛素缺失才开始治疗，如提前预知，一开始注意饮食，多吃一些补充的药物或者食物，避免糖尿病的发生就变得不是那么遥不可及。目前，哈佛的专家正在利用基因测序仪，进行一项名为复活猛犸象的实验。通过提取猛犸象的基因，在试管里培养，植入亚洲象体内，复活猛犸象。而业界普遍认为，基因测序仪未来将和计算机一样普及，成为科研机构、医院等场所的“标配”。雷明说，基因测序用处非常广，目前主要是健康检查，很多国内富豪甚至打飞的到美国做基因检测。目前，这项检测的成本约是3000美金。如果检测的项目很多，花费最高可达到十万美金。　　国内已开始临床试点 未来市场可达千亿美金作为四川乐山夹江人，雷明的大学本科和研究生都是在四川大学度过的。1982年，原本本科学习土木工程的他，成功跨学科，研究生读了生命医学，并且一发不可收拾。“我们那个年代工作包分配，专业无法自己选择。”雷明说，自己一直喜欢生命医学，上本科的时候，就看了大量这方面的书籍。所以，这个专业一 开始招硕士，他就立马决定转专业。研究生毕业后，雷明在川大留校任教，并且参与了国内最早的人工心脏瓣膜研究。后来，他辗转到欧洲、美国，如今雷明所在的机构拥有基因测序方面顶尖的科研实力，并曾在全球率先发布了基因测序仪。但目前，这项技术在推广中还存在一定的困难。无论是中国还是美国，基因测序还主要用于健康检查，极少进入临床领域。在国内基因测序广为人知的是针对唐氏综合征筛查的无创产前基因检测。只需要孕妇5毫升血，就可以算出胎儿出现唐氏综合征的危险指数。不过一些新的变化正在发生，今年1月，国家卫计委批准109家医疗机构开展NIPT高通量测序临床试点。“这是一个好现象。”雷明说，临床应用才刚刚开始，未来市场前景有几千亿甚至上万亿美元的产值。另一个阻碍推广的原因是，价格偏贵。目前，市场上使用的第二代测试仪，价格很贵，普遍售价在75万美元至100万美元之间，而且检测的精度不够，容易导致误诊。雷明说，他研制的三代测试仪已经取得美国专利，将精度大大提高，而且可将售价降至5万至10万美金之间。未来在体检机构，普通市民花上100美元，就可像验血一样检测自己的基因情况了。“作为一个四川人，此次来参加海科会，我希望能寻找到投资者，让自己的技术在四川落地生根。”雷明说，他希望将三代基因测序仪的生产基地落在四川。

在口腔内取几滴唾液送至检测机构，不出几日就可以收到报告，祖先来源、性格、天赋、易患疾病，甚至代谢能力、皮肤管理方案都可以“一览无余”，还可以根据“天赋指导”为孩子“量身定制”成长计划，提前拿到“人生剧本”……近来，不少人被这样的宣传吸引，花费数百元到数千元不等进行基因检测。这样的商业化基因检测到底靠不靠谱？相关结果有没有科学价值？如果出现纠纷，消费者权益能不能得到保护？记者进行了调查。检测项目五花八门记者查询发现，目前市面上商业化的基因检测项目五花八门，甚至还可以检测出“恋爱人格”“酒精咖啡代谢能力”等，直戳年轻人的好奇心。更有针对青少年儿童“成长天赋”的检测，踩中家长“望子成龙”的焦虑心理。此类商业化的基因检测产品和服务，在互联网平台可以随意购买，价格从几十元到上千元不等，消费者的评价也褒贬不一。有的人表示：“流程方便，出结果快，可以通过报告关注营养和疾病。”“大部分结果比较准，和前阵子在医院检查出的疾病结果一致。”也有消费者吐槽：“我家孩子在三甲医院检测是异卵双胎，这里出报告显示两个孩子数据一模一样，商家是不是压根没有检测？”更多消费者则带着“玩玩看”的心态，“作为礼物送给朋友玩玩，自己玩得也很开心”。市面上基因检测方法也多有不同，有的是收集唾液，有的是拍下手掌和面部照片就行。南京鼓楼医院肿瘤中心主任医师李茹恬告诉记者，在医院，如何来进行基因检测是根据检查项目来确定的：查肿瘤相关基因，优先采集肿瘤组织；如果要测胚胎基因，则要采集胚胎组织，可以是羊水中的胎儿脱落细胞。查患者是何种细菌感染，可以采集人体分泌物，比如痰、脓液等。商家宣传的采集唾液，也是一种方式，口腔上皮细胞作为体细胞，同样含有完整的DNA，而看面部、手掌照片就“不靠谱”了。“从科学角度来讲，某个基因可能与人的某些特征相关，如智力、运动能力等。但这并不代表某一个基因的改变，就一定会导致疾病的发生。”南京医科大学基础医学院生物化学系主任陈园园教授表示，基因并非一切疾病发生的决定性因素，疾病发生过程中还有其他很多因素的影响。检测机构出具的报告，具体检测了哪些基因不得而知，也许有一定的科学依据，但不能作为临床参考，也不可盲目相信。李茹恬介绍，通过基因检测来测定祖先来源，有一定科学根据。例如，2022年诺贝尔生理学或医学奖获得者，斯万特佩博就是通过基因测序来探索生物和人类进化的。但这类技术大多数还处于研究阶段，且除了检测，还需要有准确、大型的数据库和大数据分析的能力，因此，目前尚没有太大的现实应用意义。临床应用审慎严格随着科技发展，基因检测技术在医疗领域发挥了越来越重要的作用，不但可以诊断疾病，还可以对疾病风险作出预测。南京市妇幼保健院遗传医学中心主任医师罗春玉，从事妇产科临床工作已有近30年，现专注遗传咨询、产前筛查及诊断。“我所在的遗传医学中心，做基因检测的情况，常常是生过遗传病患儿的夫妻准备再育、夫妻双方有遗传病或家族史准备生育、怀孕后产前筛查或胎儿超声异常提示增加遗传病风险等。”李茹恬介绍，医院内有多个科室都会涉及基因检测，目的也不尽相同。个体是否携带某些基因，可以用来判断患者适不适合使用某种药物，用药效果、副作用等，也可以帮助判断患者预后。常见的例如肺癌相关的EGFR基因突变、胃肠道间质瘤相关的C-KIT基因突变等，已经成为临床上制定治疗方案和调整用药时必须考虑的基因突变。“在医院内进行的基因检测，都是出于医疗目的，同时严格遵循循证医学的理念，即这项检查已经被临床数据证实患者可以明确获益，才有推广的价值。”商业化基因检测带来的负面效应令人忧虑，由于没有专业医疗机构和医生介入，检测结果值得怀疑，乱象丛生，侵害消费者权益的现象十分普遍。检测公司为了吸引消费者，有的甚至直接宣称检测准确率高达99%。陈园园表示，商业基因检测采集DNA的过程一般由消费者自行操作，实际上提取DNA过程十分严格，不能有任何污染，在提取和运送过程中如果受到污染，也会导致结果的不可靠。“样本保存与运送也是一环。”李茹恬说，通常采集的样本会被保存在保存液中，保存液中含有防止DNA被破坏的物质，邮寄过程中还有可能使用冷藏技术，多项手段一起来保障检测结果的准确性。基因检测技术含量高，检测机构都需要专业的资质，普通市民很难辨别，最好通过正规医疗机构或是有资质的检测机构来进行，以免“踩雷”。此外，陈园园提醒，基因信息属于个人隐私，商业基因检测属于商业行为，我国尚无法律对检测机构的保密义务进行规范，也可能会导致相关的生物安全问题。监管空白亟待填补我国对基因检测等新技术、新产品的应用给予了明确的鼓励，在《国务院办公厅关于印发中国防治慢性病中长期规划（2017—2025年）的通知》中明确写道：支持基因检测等新技术、新产品在慢性病防治领域推广应用。原国家卫计委办公厅以及原国家食药监局办公厅于2014年6月联合发布的《关于加强临床使用基因测序相关产品和技术管理的通知》明确标明了具体的准入标准，同时强调：“在出台管理规范之前，所有医疗机构不允许在临床中应用基因检测技术进行基因测序检查。”但该标准并没有对非临床应用的基因检测进行规定，也就意味着商业化基因检测缺乏明确严格的政策或法律规范。在调查中记者发现，商业基因检测目前尚缺乏权威统一的标准，各检测实验室根据本机构所积累的基因信息库资源，依据各自的算法对受测者基因样本进行分析，因此得出的结果很难有一致性。那么做“基因体检”，从基因角度预测一下是否有某些疾病的易感性，看看将来患病的概率有多少，是否有价值呢？罗春玉告诉记者，一些生育过遗传病患儿的父母经常会问，“我们夫妻都很健康，双方家里几代都没有遗传病啊，为什么孩子得病了？”其实即使“健康”或“正常”的人，平均也都会携带2.8个隐性遗传病的致病基因，而携带同一种隐性遗传病的夫妻，有四分之一概率生育遗传病患儿，为了尽量避免一些严重遗传病患儿出生，对于正常备孕的夫妻或刚怀孕的，可做单基因遗传病携带者筛查。“如果是某种疾病的高危人群或是有特殊的医疗目的，我们才会建议患者做基因检测。如果是健康人群，我们目前还不主张常规通过基因检测去做疾病的预测，意义不大，还徒增心理负担。”李茹恬表示。商业机构售卖的天赋基因检测，在医生们看来是没有明确科学依据的。“我们表现出的所有性状、功能都是由基因决定的，但不管哪一种性状或功能，都是由成千上万个基因决定，即使知道一个人的全部遗传信息，也无法预测其智力以及某个天赋。”罗春玉建议家长，一个人某方面的成功或“天赋异禀”，是多种因素决定的，遗传固然重要，但后天的环境也重要。“教育是没有捷径可言的，不管科技如何发展，这都是亘古不变的道理。”我国目前仅对医疗机构实施的部分基因检测活动进行了相应规范，对商业化基因检测的立法几乎是空白。陈园园建议，希望国家出台更加细化的规范，从检测机构资质、检测标准、生物安全等方面进行严格规范，更好地保护消费者。

走进位于北京市西城区文津街7号的国家图书馆古籍馆，转几个弯，绕到文津楼后，看到一扇单门。正值雨季，门口摞着两个防水用的沙袋。单门是通向一个半地下室的。即使是老读者，很多人也都没注意到，近几年，这里多了一个古籍保护实验室。　　不久前，国内首个成型的文献脱酸设备在这个实验室研制成功。全国上千万册正处于“酸化危机”中的典籍文献，将有机会因此延年增寿。古籍保护实验室内的文献脱酸设备。　　“酸化危机”：全球性问题　　实验室摆着一册1936年出版的《宋元明清四朝学案》，书页已经泛黄。工作人员张铭正在对它进行检测。结果不出意料，纸张的pH值仅为4.5。　　在酸碱度检测中，pH值等于7为中性，大于7为碱性，小于7为酸性。在文献保护领域，pH值如果小于5，就意味着纸张已严重酸化。而酸化，是加速文献纸张脆化变质的罪魁祸首。　　“纤维素是纸张的主要组成成分，也是纸张强度的主要来源。在酸性条件下，纤维素很容易发生水解，这就会使纸张老化。”实验室负责人、国家图书馆古籍馆文献保护组组长田周玲介绍，木材、竹子、稻草等造纸原料，有的本身就是酸性物质，有的则通过长期的氧化、水解产生酸性物质，再加上日益严重的环境污染更加速了纸张的酸化。现在，纸张酸化已经成为影响文献保存的世界性问题，全世界三分之二的历史文献和珍贵图书都受到酸化的威胁。　　十几年前，国家图书馆馆员李景仁、周崇润对馆藏各个历史时期的文献酸度进行了全面检测。他们得出的结论是：我国的善本古籍特藏文献大部分已呈现酸化迹象。由于在近现代造纸工艺中，常常会使用酸性添加剂，这使得民国文献的酸化程度比以往更为严重。　　基于这样的现状，研发针对民国文献的脱酸液和脱酸设备，成为这个实验室的当务之急。张铭手上的民国版《宋元明清四朝学案》，是旧书市场买来的样品。经过脱酸处理后，他又对这册书的纸张酸度进行检测：pH值为8，达到了预期的效果。　　“脱酸工艺能否完全中和纸张的强酸和弱酸，pH值是最直观也是最基础的评价指标。如果脱酸后的pH值不达标，其他各项指标性能再好也是妄谈。”田周玲查阅过国外的相关文献，美国国会图书馆等机构的模拟老化试验研究显示，脱酸后，文献的寿命可以延长3到5倍。　　批量处理：与时间赛跑　　试管、试剂、显微镜、电脑，乍看起来，这个实验室与其他生物、化学实验室似乎也没有太大不同。直到走进最里面的房间，才发现一个与众不同的“大家伙”，不锈钢结构，两米多高，长、宽在一米左右——这就是我国首个自主研发的批量文献脱酸设备。　　文献保护是一场与时间的赛跑。常常是还没来得及保护，文献就发生了无可挽回的残损。对海量酸化严重的文献，一页一页地脱酸甚至一本一本地脱酸，无疑都太慢了。美国、德国、法国、英国、加拿大、意大利等国家早已进入规模化脱酸阶段。　　曾有国外厂商找到国家图书馆古籍馆副馆长陈红彦，一台脱酸设备报价3000万元人民币。一旦购买了国外的脱酸设备，就要购买相应的脱酸液，每公斤折合人民币1100元，价格同样十分高昂。自主研发纸张脱酸技术，成为中国古籍保护工作迫在眉睫需要解决的课题。　　“20世纪80年代中期，南京博物院、中国人民大学先后研制成功纸张气相脱酸技术，但由于所用脱酸剂对环境存在安全隐患，推广应用受到了限制。国家档案局、上海图书馆等单位对纸张也进行过脱酸应用的研究，但只限于单页纸张脱酸处理。”田周玲说，该实验室2009年正式投入使用后，就把脱酸工艺作为重要研究方向。2015年，在民国时期文献保护计划的支持下，还承担了“民国时期文献脱酸研究与脱酸设备研制”项目。　　仅仅花费了30多万元，这个实验室就设计制造了这样一台集储液系统、脱酸系统、冷凝系统和控制系统于一体的脱酸设备，填补了国内相关领域的空白。与此同时，自主研制的脱酸液成本也下降为进口产品的十分之一。　　“这个设备有一个脱酸提篮，一次能放入20到50本书图书。不需要拆装订，随着提篮缓慢摇摆，文献的纸张就可以与脱酸液密切接触，达到比较好的脱酸效果。”田周玲说，提篮的摇摆频率还可以根据纸张的脆化程度进行调节，最大限度地避免对文献造成二次伤害。　　田周玲预计，再经过一段时间的检测，这个脱酸设备就能应用到馆藏民国文献的脱酸工作中。随着这种脱酸设备在全国推广开来，古籍特别是民国文献保护的困局将得到进一步缓解。

p style=" text-align: justify margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em " 　　 span style=" font-family: 楷体, 楷体_GB2312, SimKai " 本文作者为武汉大学医学部病毒学研究所严银芳副研究员，寻求科研成果转化合作，文末有联系方式，欢迎广大光谱仪器厂商联系洽谈。 /span /p p style=" text-align: justify margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em " 　　 /p p style=" text-align: justify margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " span style=" font-size: 18px " strong 光谱液体活检核酸市场分析 /strong /span /p p style=" text-align: justify margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em " 　　随着在现代医学精准医疗发展，液体活检在癌症、病毒核酸检测方面崭露头角，成为广受关注的热点领域。在临床应用中，液体活检在疾病的诊疗和预后都能发挥重要作用，通过采集患者唾液、尿液等体液标本中的肿瘤、病毒相关产物，可以实现非侵袭性检测，从而对肿瘤、病毒等疾病进行诊断和辅助治疗，具有广阔的临床应用前景。日本最近也批准了经唾液检测新冠病毒的产品，称“该核酸检测手段更安全、结果完全一致”。液体活检ctDNA核酸检测以及光谱液体活检ctDNA核酸检测已成为当前肿瘤领域的诊疗新热点。采用红外、紫外、荧光、拉曼光谱等方法进行肿瘤液体活检为临床提供了许多重要数据，因此发展光谱液体活检己成为肿瘤、病毒早期诊断的一个重要工具。 /p p style=" text-align: center" img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 400px height: 247px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202012/uepic/5fc57fd0-35a6-41ae-b35e-f81b133b900d.jpg" title=" 00-.jpg" alt=" 00-.jpg" width=" 400" vspace=" 0" height=" 247" border=" 0" / /p p style=" text-align: justify margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em " 　　单从仪器产品的名称上解析，紫外光谱液体活检核酸表型检测仪，即是利用紫外光谱来液体活检核酸RNA、DNA表型的检测仪器，也就是说利用光谱液体活检来补充ctDNA核酸测序或新冠病毒的核酸测序液体活检的一种二维表观质量检测的光谱仪器。当前核酸PCR测序液体活检仍存在许多假阴性、价格高等缺陷，因此完善光谱二维液体活检，补充核检缺陷乃是当前防疫之急的大事。虽然光谱液体活检ctDNA核酸检测在肿瘤病毒上初露锋芒，紫外光谱液体活检核酸表型检测仪，也从实验室逐渐发展成为了新冠病毒核酸测序之外的佼佼者。光谱液体活检补充了肿瘤，病毒核酸测序缺陷，增加了病毒二维表观信息检测技术，前景十分诱人。 /p p style=" text-align: justify margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em " 　　 span style=" font-size: 18px " strong br/ /strong /span /p p style=" text-align: justify margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " span style=" font-size: 18px " strong 病毒基因二维表观信息检测技术完善了病毒基因检测能力 /strong /span /p p style=" text-align: justify margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em " 　　病毒二维表观信息检测技术更加完善了核酸测序检测能力。病毒有遗传物质，新冠病毒的遗传物质是单链RNA，这是它最核心、最明确的标志。虽然核酸检测是新冠病毒检测金标准，但是核酸检测也不是万无一失的。假阴性是新冠肺炎核酸检测逃不开的问题。怎样提升新冠病毒的快速检测能力?这是摆放我们面前十分棘手的问题。新冠病毒基因是由单链RNA一维序列与RNA二维表观信息所组成的。光有一维病毒核酸测序检测实际上是一种片面的检测方法。在病毒核酸测序检测基础上，增加病毒基因二维表观信息检测技术，则更加完善了病毒基因检测能力。因此新冠病毒基因二维检测技术，是目前急需的核酸检测设备，值得引起我们的高度关注与重视。 /p p style=" text-align: justify margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em " 　　 /p p style=" text-align: justify margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " span style=" font-size: 18px " strong 紫外液体活检RNA、DNA表型检测仪产品原理 /strong /span /p p style=" text-align: justify margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em " 　　紫外液体活检RNA、DNA表型检测仪，是根据爱因斯坦“测量一个物体的质量就是测量其中的能量”原理。利用紫外光谱检测新冠病毒的复制动量就是在检测病毒基因二维的表观质量为基础理论。我们利用紫外吸收光谱测能技术(二维紫外光谱图)，利用DNA含氢基团(OH、NH、CH)基态以及激发振动吸收情况，来检测病毒具有不同的能量曲线和平衡核间距。来建立紫外普通感冒、病毒流感表型分析仪。二维紫外光谱检测病毒、肿瘤应用十分广泛。能解决一些我们用常规方法所不易观测的病毒表观现象，揭示了新冠病毒RNA一维光谱中被掩盖的信息量。如可观测新冠病毒RNA高级构象变化、分子空间结构信息及分子间的相互作用问题，这些微观层面的现象理解都可以通过病毒二维紫外的方法测得。紫外表型分析仪能进行常规病毒核酸蛋白分析，又能进行病毒、肿瘤早期诊断及其预后治疗，一机专用也能一机多用。紫外普通/病毒流感表型分析仪检测病毒核异质RNA或蛋白质定量定性质量灵敏可靠，很少出现假阳性，更适合检测病毒的表观质量生物学指标。通过简单的一滴体液，检测一滴唾液即可快速区分普通/病毒流感，来减少核酸测序液体活检目前存在的多次检测假阴性、价格高等缺陷问题。 /p p style=" text-align: justify margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em " 　　 /p p style=" text-align: justify margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " span style=" font-size: 18px " strong 紫外液体活检核酸表型检测仪应用场景 /strong /span /p p style=" text-align: justify margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em " 　　1. 病毒二维表观检测仪 配合病毒核酸咽拭子一维测序检测，能快速实施准确的核酸检测，避免了多次核检假阴性、价格高等缺陷问题。 /p p style=" text-align: justify margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em " 　　2. 配合红外测温仪，一滴唾液一分钟表观检测结果，在各交通口岸，地铁站对可疑病例突施两查，就能快速区分普通感冒与流行病毒新方法，弥补了单一红外测温仪检测防控口岸的重大缺陷 。 /p p style=" text-align: justify margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em " 　　3. 医院导医台放一部，就能轻松快速区分是普通感冒与流行病毒感染，快速解决看病难 /p p style=" text-align: justify margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em " 　　4. 疫情期间每日对超市、海鲜、肉禽市场货物、人流等快速实施病毒基因二维光谱扫描检测，以排除病毒染污食品造成传播扩散。 /p p style=" text-align: justify margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em " 　　5. 更重要的是能在学校学生云集的地方实施快速的每日一查，能轻松快速区分普通感冒与流行病毒感染，防止流行病毒感染发生，有益学校正常的学习生活。 /p p style=" text-align: justify margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em " 　　 /p p style=" text-align: justify margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " span style=" font-size: 18px " strong 新冠病毒二维表观检测分析仪是疫情防控急需产品 /strong /span /p p style=" text-align: justify margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em " 　　紫外光谱液体活检RNA表型分析仪实际上就是升级版的医用紫外可见分光光度计，例如UV-1801光谱扫描仪。经过简单的检测窗及软件系统性改造注册，就可以成为一台医用紫外光谱液体活检RNA表型分析仪。检测仪结构简单，无需投资，利润率客观；功能强大，价格便宜，实用性强；是新冠病毒疫情防控急需的产品，能够保证投资企业实现最大的利益，避开或减少了风险的额度，在当下疫情防控形势下，迎合了经济社会需求，是投资防控物资商业化应用的最佳时机。欢迎广大的光谱仪器制造商或有意向合作企业前来合作。 /p p style=" text-align: justify margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em " 　　 /p p style=" text-align: justify margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " 武大医学部病毒学研究所严银芳 /p p style=" text-align: justify margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em " 　　武汉市武昌东湖路115号 /p p style=" text-align: justify margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em " 　　联系电话15927431505 /p p style=" text-align: justify margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em " 　　相关资料：癌患者血清的紫外光谱研究 /p p style=" text-align: justify margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em " 　　 a href=" https://wenku.baidu.com/view/39346a58de80d4d8d15a4fba.html" target=" _self" https://wenku.baidu.com/view/39346a58de80d4d8d15a4fba.html /a /p

强强联手应对生物制药分析的苛刻要求 盐湖城, 犹他州 - 2010年5月24日 沃特世公司（WAT:NYSE）今天宣布已经与PREMIER Biosoft国际公司（帕洛阿尔托，加州）达成协议：双方携手推广该公司的SimGlycan® 软件以及沃特世质谱分析方案，用于多聚糖和糖肽分析。根据协议，沃特世将继续销售和支持其多聚糖质谱分析方案，而PREMIER Biosoft公司则将其软件卖给将使用沃特世SYNAPTTM和XEVOTM质谱平台进行多聚糖和糖肽分析的客户。 通过利用PREMIER Biosoft的SimGlycan数据分析软件来扩展沃特世分离科学产品、质谱仪和超高效液相（UPLC® ）色谱柱方案，可以帮助生物制药企业获取生物药物关键信息，这些信息对于了解该药物的稳定性和安全性至关重要。 糖基化的重要性引起了FDA法规的关注和监管 多聚糖是随蛋白质翻译后连接在生物药物如蛋白质、多肽或单克隆抗体上的支链多聚糖分子。细胞中多聚糖加成和成熟反应的最终结果是不均匀的生物药物修饰，而不同的糖基化形式可对生物药物的有效性和安全性产生不同的影响。因此确定生物药物的糖基化位点和多聚糖的糖型及数量对于评价药物的有效性和安全性是必须的，由于存在各种不同的复杂多糖结构，对分析技术提出了很高的要求。另一方面，糖基化的一致性与否通常被作为一个灵敏度很高的标志，以此来判断制药公司是否对生物药物生产过程进行了有效的控制。为此，美国食品药品监督管理局FDA和其它法规机构也提出了相应的指导原则，要求对蛋白质药物糖基化进行更为严格的控制，这将使生物制药行业针对分析技术进行更大的投入，以便更好地分析和了解复杂的生物治疗药物。 关于沃特世的UPLC多聚糖分析方案 沃特世UPLC多聚糖分析方案由ACQUITY UPLC BEH多聚糖分析专用色谱柱配合带荧光检测器的ACQUITY UPLC® 系统组成，用于分析2-氨基苯甲酰胺（2-AB）或其它荧光试剂标记的生物药物经酶处理后得到的多聚糖混合物。UPLC多聚糖分析方案提供比HPLC方案更好的分析结果，具有重现性好、分离度高、灵敏度高且分析速度快的特点，能够帮助实验室分析检测多聚糖的同分异构体（质量数相同、但保留时间不同），进行不同种类多聚糖如高甘露糖、中性以及唾液酸化的多聚糖分析，并同时对相对丰度很低的多聚糖进行分析（相对于其它多聚糖来讲）。 沃特世UPLC多聚糖分析方案配合沃特世质谱仪器使用可以对多聚糖结构进行确证。作为MS/MS数据分析的工具，SimGlycan软件可预测蛋白质分子上的多聚糖结构、对其进行评分并生成一个与得到的质谱图信息最接近的可能的多聚糖列表。SimGlycan数据库是一个巨大的包含8,553种多聚糖信息的关系型数据库，并持续不断地更新其它新发表的多聚糖信息，可支持糖肽和多聚糖分析。 关于PREMIER Biosoft国际公司（www.premierbiosoft.com ） 成立于1994年，由计算机科学家和生物学家领导，专注于制造用于生命科学研究的最尖端的直观软件。该公司的目标是研究生命科学中最新的创新型技术并将其转化为软件产品以辅助研究。 关于沃特世公司（www.waters.com ） 50年来，沃特世公司（NYSE:WAT）通过提供实用且可持续的创新，实现了全球医疗保健、环境管控、食品安全、水质监测等领域的显著进步，为基于实验室的许多机构创造了商业价值。 沃特世的技术突破和实验室解决方案开创了分离科学、实验室信息管理、质谱技术和热分析的相互组合，为客户提供了一个持久成功的平台。 沃特世公司2009年的收入达15亿美元，员工人数达5,200人；公司正在帮助全球客户推进科研进程，并为其提供绝佳的操作体验。

重组人红细胞生成素（rhEPO）是全球最重要的生物制品之一，可用于治疗由慢性肾脏病、肿瘤化放疗或骨髓增生症导致的贫血。rhEPO是一种高度糖基化的糖蛋白药物，几乎rhEPO分子量的一半是由翻译后修饰的多糖组成。这些多糖包括N端链接寡糖链，其末端为唾液酸残基。唾液酸残基在控制rhEPO在体内半衰期起重要作用，并且影响其稳定性和电荷异质性。 电荷异质性（电荷变异体），即蛋白质表面电荷的改变。改变可以是由于电荷数量增减的直接改变，也可以是由于蛋白构象改变而间接引起的改变。产生电荷异质性的原因有很多，例如异构化、氧化、聚合、末端改变、脱酰胺化和糖基化等。 rhEPO电荷变异体产生最主要的原因是其高度糖基化，尤其是高度唾液酸化。电荷异质性是反应糖基化水平的重要表征之一，属于关键质量属性（Critical Quality Attributes, CQA），监管机构要求必须在整个生产和贮存中对rhEPO的电荷异质性进行检测和表征。使用CZE方法表征rhEPO存在如下难点制剂中rhEPO含量相对较低，μg级别，需要浓缩样品提高检测灵敏度；制剂中含多种辅料组分，可能会对分析结果造成干扰。例如，促红素制剂中含有mg级别的人血白蛋白（HSA），使用CZE方法会对结果造成干扰；CEZ方法需对样品进行复杂前处理，去除辅料干扰。NIFDC解决方案 2021年，中国食品药品鉴定研究院（NIFDC）依据ICH（国际人用药品注册技术协调会）指导原则，利用全柱成像毛细管等电聚焦电泳技术（iCIEF）自发荧光通道表征8种商品化rhEPO电荷异质性，并评估该方法的精密度、准确性、线性、范围和耐用性。 紫外吸收UV280nm是经典icIEF等电聚焦电泳检测通道。而自发荧光（NIF：Native Fluorescence）是指利用芳香族氨基酸（色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸）的自发荧光来实现检测，无需添加染料，提高检测灵敏度。 结果表明，对比CZE-UV（毛细管区带电泳-紫外）方法，iCIEF方法自发荧光通道检测具有更高的分辨率和灵敏度，同时具有快速检测、无需样品前处理、消除辅料干扰等优势。结果展示图1. A：紫外通道检测 B：自发荧光通道检测 图1结果显示，紫外通道检测（A）的信号很低；自发荧光通道检测（B），可以明显看到信号增强，且各个变异体分离效果较好。表1. 紫外通道检测和自发荧光通道检测对比 研究结果表明，两种通道检测下各变异体峰面积比例含量完全一致（表1）。图2. 自发荧光通道检测不同浓度样品表2. 文献报道其它方法定量限 研究人员考察了利用自发荧光通道检测1.25μg/m至20μg/ml浓度范围内样品（图2），各变异体面积比例含量和浓度线性关系良好，R方均不低于0.99。该方法定量限（LOQ）为0.1ug/ml（表2），根据文献报道显示，本方法灵敏度为最高。图3. 不同稀释度下的回收率 研究人员配制了7个不同浓度的样品对该方法准确性进行验证（图3），通过实际测定总峰面积和理论总峰面积来计算回收率，回收率在80-105%之间。图4. 耐用性评估 研究人员对方法耐用性进行评估（图4），比较不同两性电解质浓度、尿素浓度、不同毛细管以及不同样品放置时间情况下的各变异体等电点和峰面积百分比的差异。结果表明，变异体等电点差异不超过0.1，峰面积百分比RSD%不超过5%，方法耐用性良好。图5. 自发荧光检测模式表征8种商品化rhEPO电荷变异体 为了证明该方法对商品化rhEPO表征的适用性，研究人员利用所建立方法，对不同企业的8种商品化rhEPO电荷变异体进行表征（图5）。DP1-6有相似峰型，在DP3和DP6中，有一额外明显的小峰。DP7峰形独特，可能由于与其他DP相比糖基化不同所造成。结论 NIFDC利用ProteinSimple全柱成像毛细管等电聚焦电泳技术自发荧光检测通道建立并证明了用于rhEPO电荷异质性表征的方法平台。该平台有如下特点：无需样品预处理，可直接表征rhEPO；自发荧光通道检测的rhEPO峰型与紫外吸收通道检测得到的峰型相同；与CZE-UV或icIEF紫外吸收通道检测相比，自发荧光检测灵敏度更高；不受高浓度辅料干扰（如人血清白蛋白和聚山梨酯，会干扰CZE分析，CZE 分析前，须通过多步分离步骤去除这些辅料）；该平台方法快速且操作简易。扫描下方二维码，获取ProteinSimplerhEPO表征解决方案参考文献：1. Li, Xiang et al. “Capillary isoelectric focusing with UV fluorescence imaging detection enables direct charge heterogeneity characterization of erythropoietin drug products.” Journal of chromatography. A vol. 1643 (2021): 462043.关于我们ProteinSimple是美国纳斯达克上市公司Bio-Techne集团（NASDAQ:TECH）旗下行业领先的蛋白质分析品牌。我们致力于研发和生产更精准、更快速、更灵敏的创新性蛋白质分析工具，包括蛋白质电荷表征、蛋白质纯度分析、蛋白质翻译后修饰定量检测、蛋白质免疫实验如Western和ELISA定量检测蛋白质表达等技术，帮助疫苗研发、生物制药、细胞治疗、基因治疗、生物医学和生命科学等领域科学家解决蛋白质分析问题，深度解析蛋白质和疾病相互关系。联系我们地址：上海市长宁路1193号来福士广场3幢1901室 电话：021-60276091热线：4000-863-973邮箱：PS-Marketing.CN@bio-techne.com网址：www.bio-techne.com

p style=" text-align: center " img width=" 300" height=" 217" title=" e7b35254f97133b786c2d1f9589deaad.jpg" style=" width: 300px height: 217px " src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201706/noimg/feb6bdeb-673d-4a60-8f2a-d7164473cf35.jpg" border=" 0" vspace=" 0" hspace=" 0" / /p p 　　“一口唾液，就能测出孩子的天赋。家长可以有的放矢地开发孩子的天赋和潜能，不用尝试那么多的兴趣班来挖掘特长”“准确预测癌症肿瘤，准确率近100%”…… /p p 　　打开搜索引擎，键入“基因检测”，类似的广告语不时可见。基因检测成了可以预测未来发展以及旦夕福祸的利器，然而事实真的如此吗? /p p 　 strong 　天赋基因检测尚处于“忽悠”阶段 /strong /p p 　　近年来，消费级基因检测受到关注，其中儿童的天赋基因检测尤其受到追捧。 /p p 　　去年9月，著名拳击运动员邹市明的妻子冉莹颖给儿子轩轩测了天赋基因，便引发了不少“宝妈”的跟风。冉莹颖晒出轩轩的天赋基因分析图，显示轩轩的天赋是在语言和数理逻辑方面，并笑称“别浪费天赋，培养他成为主持人吧”。 /p p 　　这个由国内首家上市的基因检测公司所做的基因检测价格不菲，高达6800元。据称，这一产品能通过监测约30个关联基因位点，科学分析少儿的语言智能、逻辑梳理、音乐、空间、身体动觉、自我认识、人际交往、自然观察等八大先天智能水平。“能提前看见孩子天赋，让孩子的成才不走弯路”戳中望子成龙的中国家长的心。 /p p 　　尽管市场火热，但对于天赋基因检测，不少业内人士明确持反对意见。“中国的家长极其关注小孩教育，基因的作用在小孩身上会被无限放大，家长基于这样不科学的结果去决定小孩的发展方向，干预他的兴趣和发展，真的非常不合适。”WeGene联合创始人陈钢表示，他们不提供也不支持提供天赋基因检测。 /p p 　　陈钢以目前不少机构所提供的音乐天赋基因检测为例说，绝对音高是指人们具有对声音实际不同音高的感受判断能力，可通过关联的基因位点突变与否，来判断被检测者拥有绝对音高的概率大小。但一些检测机构却将音乐天赋直接等同于绝对音高。实际上，音乐天赋的构成因素非常复杂，比如唱得好、弹得好，或者曲子写得好，这些都属于音乐天赋领域，认为有绝对音高就是有音乐天赋，显然是错误的。 /p p 　　中国科学院北京基因组研究所陈科博士更是表示，孩子是否聪明、以后适合做什么，这些事情从目前研究的水平和角度来看还不那么实际，“还处于一个粗浅的、忽悠的阶段”。 /p p strong 　　科学性受限 /strong /p p 　　不仅是天赋基因检测，对于所有与“预测”功能相关的科技手段，人们最关心的都是“科不科学”和“准不准”。 /p p 　　“TA不喜欢看恐怖片，也会很难享受在过山车上直冲云霄的感觉。感官的刺激难以带给TA快感，TA会更多体验到恐惧和危险。”北京各色科技有限公司(以下简称各色科技)提供给用户的检测报告中的部分语言，看起来颇像一些常常出现在星座运程中的表述。 /p p 　　对此，各色科技CEO郭婷婷回应说， “看起来像是星座算命，但其实每句话所对应的都有科学依据。”她们为检测者出具的10万字报告是导入数据后，由后台自动生成的。通过几百个标签分别将用户的结果标准化，“每个标签下的分析，一部分是根据研究文献得来，一部分是根据数据分析，最后该标签下可能出现的行为表现，也往往来自该特质的心理学表现研究和问卷”。 /p p 　　根据郭婷婷的解释，一个标签的解读，是结合这一人格特质所对应的权威研究文献，将研究结论运用算法，设置位点间的不同权重，最终自动生成的结果。 /p p 　　但对于文献的依赖，在一些研究者看来，恰恰表明了基因检测分析的局限性。 业界和学界的共识是，在祖源、心理、运动等这些偏娱乐应用的消费级基因检测方面，中国与美国相比，差距非常大。这个差距在研究样本数量上体现得尤其明显。美国的基因检测样本量在数百万级，中国在这些领域的检测样本量加起来仅有几万个。据了解，截至目前，各色科技的用户量约近2000人，而WeGene的用户量为近3万人。 /p p 　　陈科指出，国内非临床基因检测样本数据的匮乏，导致目前在此基础上作出的结论，并没有那么准确。陈钢认为，基因检测科学性的高低取决于累积检测人群的规模、所依据研究中的人群是否与检测人群相一致、数据质量是否经过多次独立验证等。 /p p 　　美国的基因检测公司23andMe往往在解读报告中指出，在某几个基因位点上跟被测者相同的人，有百分之多少。“比如有80%的人身体质量指数BMI大于28等，这就比较科学，因为这个结果的背后，有庞大的用户数据作支撑。”陈钢说，“相比之下，国内厂商，包括WeGene，都只能告诉你，你的体重比一般人高，却给不出像23andMe一样精确的百分比数据。” /p p 　　陈钢认为，理想状态下，所有的解读背后的关键因素都应该是数据——有多少中国人数据，和中国人的这些数据相对应的表型信息来支持解读。 /p p 　　他说，由于国内检测公司的数据积累不足，只能结合研究文献进行解读。但这其中有很多主观因素影响结果，因为论文的质量并无判断标准。哪些论文是最权威、最适合的?分析者往往是根据自身主观经验和眼光进行选择，主观因素在其中起到很大作用。同时，分析者在对论文结论进行整合时，也存在一定的主观判断，进而得出一个带有较多主观因素的解读结果。“相比于这种形式，23andMe依托大数据的分析方式显然更好、更精确”。 /p p 　　郭婷婷也表示， “现有的检测结果是根据国际上对这一问题研究的最新、最权威文献得出的。但科学的特点是变化，所以我们会去追踪这一领域的研究。如果变动的研究所涉及的基因位点影响到我们的检测结果，我们也会追踪更新。” /p p 　　陈钢和郭婷婷都强调，WeGene和各色科技所作的基因解读报告都在不断更新。“我们不提供纸质报告，而是电子版报告”。 /p p 　　在WeGene提供给51岁的科技爱好者程明(化名)的第一版检测报告中，他被检测出运动能力表现突出，比如爆发力、耐力等指标，属于前10%的范围。但第二版检测报告更新后，他的运动能力变成了前20%的范围。 /p p 　　陈钢表示，WeGene正在不断减少那些科学性不够高、主观影响较多的检测项目，尤其是一些涉及健康风险的项目，尽可能为用户提供最有用、可靠的信息。 /p p 　 strong 　亟待规范的国内市场 /strong /p p 　　事实上，对天赋基因检测的迷信与追捧，只是揭开了基因检测问题的冰山一角。目前这一领域还处于野蛮发展阶段，鱼龙混杂，乱象丛生。 /p p 　　据《中国青年报》去年8月曾刊出一篇报道《藏在基因里的野心与欺骗：基因不是“生命说明书”》，江苏一位老人投入毕生积攒的30多万元积蓄，换来的是6大本根本看不懂的基因检测报告，因此投河自尽。近300页全彩色印刷的报告，除了用他根本看不懂的表情符号标注各种癌症的易感性以外，唯一“说人话”的地方就是建议老人购买各种保健品。 /p p 　　在政策管理方面，国内目前仅有针对临床基因检测运用的政策约束。2014年，国家食品药品监督管理总局和国家卫计委联合发出禁令，要求任何医疗机构不得开展基因测序临床应用。但这种“一刀切”的做法引起较大争议，到了2015年上半年，国家卫计委又先后公布了基因测序临床应用的试点名单。 /p p 　　但在非临床领域，尤其是在天赋检测、健康风险等消费级基因检测领域，国内的监管始终处于缺位状态。 /p p 　　早在2013年11月，美国食品药品监督管理局就出于无法确定检测准确性的考虑，向23andMe发布禁令，该公司所有与健康相关的检测分析都被停止，仅提供祖源等分析和解读服务。 /p p 　　禁令持续两年后，逐渐放开。由于23andMe通过学术研究等方式证明了相应检测的准确性，美国食品药品监督管理局允许其进行部分遗传性疾病基因携带状况的分析和解读，但不允许告知具体的风险几率。如今，23andMe早已成为该领域的巨头。 /p p 　　陈钢认为，没有监管和规范的行业只会野蛮发展，鱼龙混杂。消费级基因检测行业要想长期健康的发展，真正对人们有用，就必须要有合适、明确的监管政策出台。他呼吁监管政策尽快出台，并指出，“如果时间拖太久，市场没有监管，很容易会出现劣币驱逐良币的情况”。 /p p 　　郭婷婷表示，针对消费级基因检测，消费者目前很难从一个产品的价格和包装来判断该检测是否可靠。“国内没有相关标准，也没有严格审核，所以只有业内人士才能真正判断出一个基因检测产品的可靠程度”。 /p p 　　而对如何甄别一项基因检测产品是否相对可靠和科学，郭婷婷给出了她的建议。“提供了基因原始数据的相对更靠谱，从算法的复杂程度也可以判断，如果一个复杂的问题只有一个基因位点，那显然可靠性较差，如果提供了多个位点，且每个位点都有相应的参考文献，从这些要素上，基本可以判断这个产品是否靠谱、有诚意。” /p p strong 　　人类基因的“冰山一角” /strong /p p 　　如今，做一次人类全基因组测序的花费已经从2001年的1亿美元降低到1000美元。 /p p 　　据陈科介绍，包括WeGene和各色科技等公司在内，目前国内消费级基因检测公司所应用的基本都是基因检测芯片或检测范围更小的Panel，这些芯片最多可以检测出60万到90万个基因位点，检测成本远低于全基因组测序。 /p p 　　60万到90万个基因位点，是个什么概念?大象公会创始人黄章晋曾在2013年做过两次基因检测，其中一次基因检测利用芯片检测80万个位点，他所拿到的结果是一个多达14M的TXT文档，甚至由于文件过大，打开过程中造成电脑死机。该文档中只有一个个的位点序列号，整整80万行。为了知道各个位点所代表的性状和意义，黄章晋利用朋友所提供的200个有对应意义的位点序列号，依次检索了100多个位点。“太费劲了，而且一个性状往往是由好几个位点决定的，在算法中各个位点的权重还不一样，我自己看是看不出来的”。 /p p 　　然而在专业人士看来，60万到90万个基因位点的基因检测芯片得出的信息还相当有限。“基因组测序所得到的是你的基因全貌，而芯片测出的只是一部分。即便是90万个位点，也是远远不够的，因为我们人类基因组碱基数是3.2乘以10的9次方，而90万个是5次方，只占了非常小的一部分。”陈科表示，在生物医疗领域做研究，研究层次呈现为三个同心圆，最外层的是疾病的描述，即何时发病、发病的状态等 第二圈是关联性，不是因果关系 第三圈才是研究真正的核心，即机制研究，搞清楚病因。他指出，目前很多基因检测分析都还处于关联的层面，很多公式或推断只是一种关联，却把这种关联性当成了因果关系来宣传，夸大了效果。 /p p 　　而人类基因组计划自1990年开始，至今仍未完成。2000年时，参与这项工作计划的6国科学家将“人类基因组草图”的绘制工作全部完成，而“人类基因组精图”的绘制工作仍在进行中。 /p p 　　因此，比起单纯的提供基因检测服务，郭婷婷表示，各色科技更希望通过提供有质量的数据解读内容，对用户进行市场教育，让更多的人正确认识到“基因检测是怎么回事”，“如何看待自己的基因数据”，最关键的，是积累更多中国人的数据，挖掘更大的数据科研价值。而这也正是陈钢所提出的WeGene的最终目标——建立起一个属于中国人自己的高质量基因数据库，为基因研究提供更多数据支撑。 /p p 　　陈科也指出，建立起国内这样的基因数据库很有必要，但需要打破各机构、各公司各自为战的局面，共享基因数据，让数据发挥更大的价值。 /p

瑞典皇家科学院10月5日宣布，将2022年诺贝尔化学奖授予科学家Carolyn R. Bertozzi、Morten Meldal和K. Barry Sharpless，以表彰他们在“点击化学和生物正交化学”方面所做出的贡献。CR. Bertozzi是第一个提出生物正交反应概念的人。生物正交反应是指在活体细胞或组织中，能够在不干扰生物自身生化反应条件下可以进行的化学反应，是化学生物学中非常重要的工具。生物正交反应必须发生在复杂的生命条件下，与点击反应一样温和且高效，且具有高选择性。那么生物正交反应和近期火热的免疫治疗有什么关系呢？CR. Bertozzi课题组就用这种反应将唾液酸酶和一种抗体药物（曲妥珠单抗）偶联物T-Sia 2形成一种新的免疫检查点抑制剂疗法，并在《Nature》子刊上发表了题为Targeted glycan degradation potentiates the anticancer immune response in vivo [1]的文章(以下用“该文”表示)。唾液酸酶的作用唾液酸残基（基本单糖结构单元之一）在肿瘤细胞中上调，与受体Siglecs结合可形成免疫抑制效果。而唾液酸酶可以除掉这些唾液酸，阻断Siglecs-唾液酸的相互作用。 唾液酸酶-抗体偶联作为免疫检查点抑制剂示意图抗体和唾液酸酶的偶联方式就是著名的生物正交反应——具有张力的环状炔与叠氮的无金属催化的点击反应。生物正交反应示意图在偶联抗体生成后仍需要面临两个问题：酶和抗体之间linker是否稳定？考虑到抗体需要有ADCC等效应来杀死肿瘤，修饰后的抗体是否还有Fc受体的结合活性？该文使用Sartorius的Incucyte® 实时活细胞分析系统 进行linker稳定性分析。用荧光基团标记不同linker（oxime或HIPS）偶联抗体，可通过荧光强弱与荧光持续性判断linker的稳定性。使用Incucyte® 进行活细胞实时成像，发现HIPS比较稳定，同时克服了抗体和酶之间先前使用的肟键的不稳定性。Incucyte®每隔2小时拍摄，动态观察细胞内抗体linker荧光的持续情况（稳定性），10倍镜(图cde)C 图 正常培养基活细胞培养；D 图 加入蛋白酶抑制剂活细胞培养；E 图 固定细胞；HIPS为红色，oxime为蓝色。分析参数：使用Top-Hat减噪算法半径为100-μm；荧光阈值:0.2 RCU；边界灵敏度 −25；中空填充：200 μm2；最大面积 2,600 μm2 ；使用积分荧光面积输出结果。抗体和Fc受体的结合活性作为抗体药物的重要表征方法，该文通过Octet® 非标记分子互作系统进行分析。发现偶联后的抗体药物（T-Sia2）与Fc受体的亲和力与未偶联的药物类似。Octet® RED 96数据用链霉亲和素传感器（SA）固化生物素化的Fc受体，与100 nM的抗体或者抗体偶联物结合20 s，解离40 s。在制备一些对照蛋白的时候，也用到了Octet® 检测其与Fc受体的亲和力（数据未列出）。T-Sia 2在移植了同系HER2+癌细胞的小鼠模型中，作者观察到肿瘤生长延迟，并且证明与肿瘤唾液酸减少有关。在动物试验中也说明了这种方法的可行性。生物正交反应在活细胞成像、药物可控靶向释放、抗体药物偶联，甚至聚合物化学、材料表面化学领域均有应用，而该文就是在抗体药物偶联中的一个案例。CR. Bertozzi课题组在多篇文章中都使用了Incucyte® 实时活细胞分析系统和Octet® 非标记分子互作系统。好马配好鞍，Octet® 和Incucyte® 不愧为2022年诺奖得主都在用的实验神器！那为什么大家都争先恐后的使用这两款神器呢？使用Incucyte® 实时活细胞分析系统的优势培养箱内可长达数周的连续观察，最短几分钟间隔拍摄，减少人力，防止过多操作对细胞的伤害；如该文每隔2个小时拍摄，共拍摄4天。6个板位，分别独立设置检测程序，可以兼容各种孔板和培养皿，通量高；如该文有各种免疫抑制剂、效靶比等实验组，Incucyte® 一次可以完成所有实验组实验。高效简便的模块化软件设置和数据分析，输出图片、视频、生长曲线等多指标多参数；该文提到了使用Incucyte®多个参数的调节，使得结果更加准确。大于100种优化过的活细胞专用荧光试剂、耗材及详尽的Protocol，文章数大于12000篇。使用Octet® 非标记分子互作系统的优势- 非标记Direct Binding是趋势，它的结果更加准确。- 快速测定亲和力，更加定量化对互作进行表征。- 无洗涤步骤，可测弱亲和力（解离快）；如该文Fc受体解离快，无法用带洗涤的传统方法建立结合活性检测。- 测试时间短，一般10分钟，更快拿到结果；如该文5分钟就可以完成实验。- 实验形式多样化：定性，两者结合，协同/竞争实验，垂钓。- 写入美国药典，文章10000篇，认可度广。- 万金油技术，可以用与检测DNA、小分子、蛋白等各种生物分子。- 使用方便，成本相对较低。再好的idea与成就，也需要用强有力的手段和工具去实现，Incucyte® 实时活细胞分析系统和Octet® 非标记分子互作系统，来自诺奖得主的制胜法宝！-参考文献-[1]Carolyn R. Bertozzi et al.Targeted glycan degradation potentiates the anticancer immune response in vivo.Nature Chemical Biology volume 16, pages1376–1384 (2020)

大家好，本周为大家介绍一篇本课题组发表在ACS Chem. Biol.上的文章，Insights into Phosphorylation-Induced Protein Allostery and Conformational Dynamics of Glycogen Phosphorylase via Integrative Structural Mass Spectrometry and In Silico Modeling1。变构调节在自然界中广泛存在，可以用于调控细胞过程。糖原磷酸化酶（GP）是第一个被鉴定出的与变构调节相关的磷酸化蛋白。GP是一个分子量约196kD的同源二聚体蛋白，是糖代谢中重要的组分，也是2型糖尿病及癌症的靶点。AMP结合以及Ser14的磷酸化介导了GP的变构调节，使其构象从非活化的T-state GPb（未磷酸化状态）转变为活化的R-state GPa（磷酸化状态）。即使目前X-射线晶体学法解析出了GP的原子级蛋白结构，但受限于较大分子量，其结构动态性的检测较为困难，因此与GP变构调节相关的结构动态变化过程仍较为模糊。核磁共振（NMR）谱及分子动力学（MD）模拟等是探究蛋白质结构动态性的常用方法，但NMR分析存在分子量上限，且样品消耗量大，MD模拟的时间尺度和力场准确度有限。质谱（MS）法具有快速、灵敏的特点，是蛋白质结构、动态性以及构象变化分析中强有力的一款技术。氢氘交换质谱（HDX-MS）通过监测蛋白骨架酰胺氢原子与溶液中氘的交换来反映蛋白质构象动态性，因此适用于探究由配体、蛋白结合或共价修饰引起的蛋白质构象变化。同时，多个软件实现了由HDX-MS数据计算保护因子（PFs）和吉布斯自由能，从而提取残基水平的蛋白动态性信息。此外，在先前的工作中2, 3，我们整合了native MS和top-down方法（native top-down，nTD-MS技术），成功实现了多个蛋白复合物的一级序列到高阶结构等多方面信息的检测（包括测序、翻译后修饰、配体结合、结构稳定性、朝向等）。整合多种结构质谱法（整合结构质谱法）可以有效填补传统生物物理法中结构到动态性联系中的空缺，更好地表征变构调控现象。本文整合了HDX-MS、nTD-MS、PF分析、MD模拟以及变构信号分析检测了磷酸化介导的GP变构调控的结构和动态性基础，为GP的变构调控过程提供了见解。根据X-射线晶体学结构报道（图1a），T-state GPb转变为R-state GPa时，二聚体界面中N-末端尾部、α2、cap’（图1b）以及tower-tower helices区（图1c）发生了明显的结构重排，导致催化位点开放，从而底物磷酸吡哆醛（PLP）可以结合。尽管有晶体学报道，但与变构调控关联的构象动态性仍有待探寻。图1.（a）磷酸化介导T-state GPb（PDB：8GPB）向R-state GPa（PDB：1GPA）的构象转变；亚基相互作用界面：（b）C端区域和（c）tower-tower helices，GPb为蓝色，GPa为绿色。首先我们通过nTD-MS进行了检测。如图2a、b，谱图中观察到了GPb的单体和二聚体信号，其中二聚体为主要形式；GPa除了单体和二聚体外，谱图中还存在少量四聚体，但仍以二聚体为主要形式。当增加sampling cone（SC）电压时，GPb、GPa保留了其二聚体形式（图2c、d）。随后我们选择离子（29+）并在trap池中进行了碎裂（图2e、f、g、h），谱图低质荷比区GPa的碎片相对峰强度较GPb高，说明GP的二聚体互作界面较为稳定，且GPb亚基结构较GPa稳定。nTD-MS不仅能够探究GPb、GPa的结构差异，也能够为接下来的HDX-MS实验做好前期样品质量检查工作。图2.不同活化条件下GPb、GPa的nTD-MS谱图。（a、b）SC=40V；（c、d）SC=150V；（e、f）SC=150V、trap=100eV；（g，h）SC=150V、trap=200eV。左侧为GPb，右侧为GPa。随后我们进行了HDX-MS实验。图3a中展示了五个时间点的HDX heat map。图3b为通过PyHDX软件计算产生的PF值。其中N-端（1-22）以及tower helix前的loop区域（256-261）的氘代值较高、PF值较低，说明这些区域较为柔性或是结构较为无序。此外我们发现，tower-tower helices（262-276）区域的氘代值较低、PF值较高，表明helices的旋转可能是由前端可塑性铰链区触发的，而非helices本身的变形和重塑引起的，这些发现在晶体结构数据中均有吻合之处。除这两个区域外，GPa和GPb基本保持了稳定的整体结构。而从1μs原子级MD模拟计算得到的均方根波动（RMSF）和溶剂可及表面（SASA）中我们也发现（图3c），这两个区域数据与HDX-MS信息有所吻合，但MD模拟中部分区域未和HDX-MS相吻合的区域可能跟序列覆盖不足相关。图3. （a、d）GPb和GPa在不同标记时间下的氘代热图并映射到结构中（PDB: 1GPA）。（b、e）基于HDX-MS数据计算得到的PF值并映射到晶体结构中。（c、f）MD模拟中RMSF和SASA值并映射到结构中。从氘代差异图（图4a）中可以看出，4个区域呈氘代降低趋势（红色方框），多个区域呈氘代上升趋势（蓝色方框）（GPa-GPb）。而PF差的变化趋势与氘代变化趋势基本一致（图4b）。由数据可知，N-端和tower-tower helices的变化说明磷酸化介导的变构稳定了这两个区域，α1-cap-α2区域的动态性轻微下降。除此之外多个区域（尤其是tower-tower helices序列后的区域）均表现为PF值下降，说明相比于GPb，GPa催化位点附近的区域动态性增强了。接下来我们根据HDX kinetic plot特征将其进行了分类，并详细讨论了所属区域的变化。图4.（a）GPa-GPb HDX-MS的氘代差异图。（b）GPb到GPa PF的变化。 首先是N-端和C-端的变化（图5）。N-端残基1-22表现氘代下降，这说明N-端具有一定可塑性。受N-端区域磷酸化和结构变化影响，C-端区域也产生了一定的变化。此外，残基30-50（cap区）和残基111-117（α4back-loop）区表现氘代下降，而103-109（α4front）表现氘代上升。根据晶体结构推测，cap区和α4back-loop的氘代变化受N-末端变化影响，原有的残基相互作用被打破，形成新的残基间相互作用，同时这两个区域也经历了结构重排，因此表现出较明显的氘代变化。残基88-99（β2-α3）和残基125-141（β3-L-α6）氘代上升。总的来说，磷酸化使得cap′/α2界面互作增强了，同时磷酸化基团和精氨酸残基的静电相互作用是cap区产生变化的主要原因，而α1和α2起到锚定作用，其相对位置基本保持不变。图5.GPb（a）和GPa（b）的N-端和C-端区域的局部结构和HDX动力学曲线（c）。 此外，tower-tower helices（α7，残基262-278）区的变化同样值得关注（图6）。250s loop是表面暴露区域，未与其他区域发生接触，其氘代下降可能是因为自身结构的收缩。而肽段262-267和268-274氘代下降提示该区域可能发生了低周转率或强互作的结合反应。280s loop区氘代值上升。这些变化均说明，tower-tower helix的角度的改变不仅影响了二聚体界面结构，而且还影响了其靠近催化位点的周围区域。因此我们结合晶体结构推测，磷酸化和N-端相对位置的改变，使250s loop自身结构收缩，从而打破了Tyr262' -Pro281和Tyr262-Tyr280′之间的相互作用，导致两个亚基的tower helices发生相对滑动，倾斜角度增加。图6.GPb（a）和GPa（b）tower helix区域的局部结构和HDX动力学曲线（c）。 最后是催化位点、PLP结合位点和糖原存储位点的变化情况（图7）。催化位点周围多数区域均表现氘代上升趋势。我们推测，随着Pro281、Ile165和Asn133间的相互作用被打破，Arg569与Ile165、Pro281、Asn133间的互作也随之打破，因此催化位点和PLP结合位点周围的残基溶剂可及性上升，局部区域结构变得更为灵活，催化位点开放并转变为活化构象。糖原储存位点位于GP表面，距离催化位点30Å，除了α23（残基699−708）外，HDX-MS在糖原存储区没有观察到明显的变化。图7.GPb（a）和GPa（b）的催化位点和PLP（橙色）结合位点的局部结构和HDX动力学曲线（c）。结合以上所有数据，我们对磷酸化调节的动态机制进行了推测（流程图1）。磷酸化后，N-端尾部残基与acidic patch的互作被打破，也导致N-端尾部的有序化以及C-端尾部的无序化以及伴随的其他结构变化。通过在pSer14和Arg69和Arg43′之间形成新的盐桥，N-端残基被重定位，随之带来的是Asp838和His36′间的盐桥断裂。随着三级和四级结构的转变，250s loop收缩并发挥类似“门环”的作用，当其收缩时，Tyr262′-Pro281与Tyr262-Tyr280′之间的相互作用、276-279区与162-164区之间的氢键也被打破，导致tower helix发生相对滑动，tower-tower helices之间的作用被打破，同时将结构变化传递到催化位点。最后，280s loop和催化位点以及PLP结合位点附近的残基松动，通往催化位点和底物磷酸盐识别位点的通道打开，酶得以活化。流程图1.GP变构调节过程中，被打破（蓝色）或新形成的（红色）关键残基相互作用。 本文整合nTD-MS、HDX-MS、PF分析和MD模拟检测了GP磷酸化变构调节过程的结构和动态基础，通过该整合结构手段揭示了GP构象柔性、局部动态性以及长程变构调控构象变化中值得关注的信息。各个方法具有各自的优势，但也在一定层面存在局限，我们期待将HDX-MS信息与计算模拟信息进行更深度的整合以实现二者对蛋白质结构更精确的分析。撰稿：罗宇翔编辑：李惠琳原文：Insights into Phosphorylation-Induced Protein Allostery and Conformational Dynamics of Glycogen Phosphorylase via Integrative Structural Mass Spectrometry and In Silico Modeling李惠琳课题组网址：https://www.x-mol.com/groups/li_huilin参考文献1. Huang, J. Chu, X. Luo, Y. Wang, Y. Zhang, Y. Zhang, Y. Li, H., Insights into Phosphorylation-Induced Protein Allostery and Conformational Dynamics ofGlycogen Phosphorylase via Integrative Structural Mass Spectrometry and In Silico Modeling. ACS Chem. Biol. 2022.2. Li, H. Nguyen, H. H. Ogorzalek Loo, R. R. Campuzano, I. D. G. Loo, J. A., An integrated native mass spectrometry and top-down proteomics method that connects sequence to structure and function of macromolecular complexes. Nat. Chem. 2018, 10 (2), 139-148.3. Li, H. Wongkongkathep, P. Van Orden, S. L. Ogorzalek Loo, R. R. Loo, J. A., Revealing ligand binding sites and quantifying subunit variants of noncovalent protein complexes in a single native top-down FTICR MS experiment. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2014, 25 (12), 2060-8.

HPLC肽图分析是蛋白质一级结构研究中极为重要的手段之一，不但可以比较重组与天然蛋白质结果之间的同一性，确认基因工程上游和下游处理过程中是否发生差错、重组产物中是否存在翻译后修饰及未预期氨基酸的变异等，而且不同批次产品的肽谱比较可验证工艺过程的稳定性。因此，肽图分析在生物技术药物质控中尤为重要。 目前肽图分析常用方法主要是胰蛋白酶切RP-HPLC方法。蛋白样品经酶解后进入HPLC，进行色谱分离，保留时间不同的肽段依次进入紫外检测器进行检测。 岛津的相关液相产品，例如Nexera-i系列、LC-40以及生物惰性兼容液相Nexera Bio均可实现蛋白类药物的HPLC肽图分析。 蛋白类药物肽图分析电荷异构体的存在将会影响到蛋白质药物的活性、结合能力、药代动力学、免疫原性及结构稳定性，从而影响药物有效性、安全性及保质期。同时，电荷异质性的控制程度也反映了重组蛋白类药物生产工艺的一致性。因此，在生物类似药的研发及与原研药的一致性评价研究中，电荷异质性是工艺质量控制的重要因素。 为了最大限度地降低蛋白质与固定相填料的离子相互作用及二者之间可能存在的吸附作用，电荷异质性分析通常使用高离子强度的流动相，并且采用碱性或酸性分析条件。但是，高离子强度流动相和碱性/酸性分析条件给液相色谱仪的耐腐蚀性和系统稳定性带来严峻的挑战。 ATP分析 糖基化是蛋白质的一种重要翻译后修饰，糖基分析主要包含唾液酸含量测定、单糖组成分析、糖基化位点测定、糖链结构测定等。 唾液酸含量的测定是先将唾液酸从糖链上解离成游离状态，再进行化学反应实现衍生化，通过测定衍生化产物从而测定唾液酸含量，常用的方法有间苯二酚显色法和HPLC法。间苯二酚显色法是利用间苯二酚将游离的唾液酸进行衍生生成有色化合物，再用紫外分光光度法测定其含量；HPLC法是利用邻苯二胺（OPD）对唾液酸进行衍生，然后用带紫外检测器的HPLC或者LC-MS/MS进行定量。 蛋白类生物药糖型分析 蛋白质药物在其生产、贮藏、运输、销售以及用药过程中由于外力因素的作用可能会产生聚集。蛋白质聚集现象会导致蛋白药活性和其在药品中的浓度降低，并可能产生有害的毒理学作用和免疫应答，甚至发生危及生命的药物反应。FDA关于聚集体的指导原则中就指出蛋白聚集体在人体内极易产生免疫原性。 对于常见的蛋白质低聚体（二聚~四聚体），非还原型聚丙烯酰胺凝胶电泳（ SDS-PAGE ）需要在变性条件下进行，一般会影响多聚体的检测。而体积排阻色谱法（SEC）条件温和，不会对蛋白的形态产生较大的影响。因此，SEC法能较准确地检测蛋白质中的低聚体，是蛋白质药物开发、质量控制和稳定性研究中常用的聚集体分析方法。 大小变异体，聚体分析 应用案例：单抗药物聚集体分析，推荐生物惰性液相 作为细胞生长的环境和营养来源，培养基的性能很大程度上决定了细胞密度和表达产物的产量和质量，因此培养基是工艺开发最重要的环节之一。其中，在生产工艺优化和确认过程中，以及QC过程中，细胞上清液中氨基酸含量的监测对细胞培养有着重大的意义。但是，离线衍生后使用HPLC分析，以及HPLC柱后衍生法检测氨基酸等方法，不仅耗时耗力，并且对结果准确度影响较大。因此，开发操作简单、高效稳定的分析方法，对氨基酸组成分析非常有意义。 24种氨基酸标准溶液色谱图（双波长同时检测）

沃特世与爱尔兰国家生物工艺研究培训所（NIBRT）的合作 将使生物制药生产过程更加可控和可预测 企业与学术界的合作将创建全球首个UPLC多聚糖数据库，可更准确方便地进行蛋白质糖基化分析 米尔福德, 马萨诸塞州 - 2010年5月6日沃特世（WAT:NYSE）公司和爱尔兰国家生物工艺研究和培训学院（NIBRT）今天宣布一项合作，将创建全球首个超高效液相色谱（UPLC® ）多聚糖分析数据库。预计这个数据库将于2011年启用，由NIBRT开发、维持和授权，沃特世与NIBRT将共同在全球进行推广。 生物药物的生产可能很困难，正确的糖基化对于得到正确结构的蛋白质并维持其治疗效果至关重要。蛋白质糖基化在细胞培养过程中会显著受到各种因素的影响，如溶解氧、pH、碳源和温度。这些参数在工艺中的发生任何一点变化都有可能给产品带来质量风险，因此糖基化是否一致被作为生物制药生产工艺是否进行良好控制的重要标志。 由于蛋白质所结合的多聚糖结构复杂、数目庞大，因此生命科学实验室要想对这些结构进行鉴别和定量分析是极为困难和耗时的。 由NIBRT Pauline Rudd教授课题组开发的新数据库，将成为首个与一系列生物治疗有关的聚糖结构的色谱保留时间数据库。其目的在于为生物制药企业提供及时和有效的方法，以确认各种糖基化蛋白质的结构。在生产工艺的各个阶段，有了更快更准确的有关糖基化信息，生物制药企业就能根据法规指南对其生产工艺进行更好的控制，以保证安全有效的生物制药制剂。 &ldquo 通过将我们在分离和多聚糖分析方面的专有技术与NIBRT在糖生物学方面的专长相结合，我们可以将快速准确的糖基化分析作为生物治疗药物的标志，&rdquo 沃特世公司生物制药商业运营部总监Jeff Mazzeo博士说，&ldquo 我们的目标是提供简单且更加准确的多聚糖分析方案，以便生产出优质的生物分子药物。&rdquo &ldquo NIBRT在糖生物学方面的专长，加上沃特世在分离科学方面的专长，将确保这次合作能开发出更快更好的技术用于糖蛋白分析，同时符合相关法规的要求。&rdquo NIBRT的CEO Maurice Treacy博士说道。 许多基于蛋白质的生物药物是糖基化蛋白质。糖基化是一种共翻译和翻译后修饰的形式，将多聚糖与蛋白质、脂类和有机分子结合。多聚糖直接影响糖蛋白生物药物的有效性和安全性。 最近色谱技术上的新进展提供了更高的分离度、灵敏度和分析速度，为蛋白质糖基化的定性和定量分析提供了更高的可靠性。UPLC经众多用户的实践检验被证明是理想的选择，可用于分析生物分子及其结合的多聚糖结构，并确定每种多聚糖结构的相对比例。 沃特世UPLC多聚糖分析方案由ACQUITY UPLC BEH多聚糖分析专用色谱柱配合带荧光检测器的ACQUITY UPLC® 系统组成，用于分析2-氨基苯甲酰胺（2-AB）或其它荧光试剂标记的生物药物经酶处理后得到的多聚糖混合物。UPLC多聚糖分析方案提供比HPLC方案更好的分析结果，具有重现性好、分离度高、灵敏度高且分析速度快的特点。 一旦NIBRT数据库开始投入使用，将沃特世UPLC多聚糖分析方案结合此数据库可以非常容易的根据每个UPLC色谱峰的保留时间来确定多聚糖结构，无论是复杂多聚糖，高甘露糖，中性和唾液酸化多聚糖均可，以便确认样品中存在的已知结构或测定Glu值并确定未知或未预料到的多聚糖。 在一份讨论UPLC Glycan分析解决方案的应用报告中，沃特世详细描述了UPLC用于多聚糖分析的方法。 关于NIBRT（www.nibrt.ie） NIBRT&mdash &mdash 爱尔兰国家生物工艺研究培训所是一家优秀的机构，它为特定目的创建了灵活的现代生物工艺设备，有助于爱尔兰生物制药行业的扩大，以这些设备为生物制造提供研究平台解决方案，为学生提供量身定制的认证产业培训和学术教育计划，来支持生物制药行业。更多信息请参阅www.nibrt.ie。 ### 关于沃特世公司（www.waters.com） 50年来，沃特世公司（NYSE:WAT）通过提供实用且可持续的创新，实现了全球医疗保健、环境管控、食品安全、水质监测等领域的显著进步，为基于实验室的许多机构创造了商业价值。 沃特世的技术突破和实验室解决方案开创了分离科学、实验室信息管理、质谱技术和热分析的相互组合，为客户提供了一个持久成功的平台。 沃特世公司2009年的总收入达15亿美元拥有5,200名员工；公司正在帮助全球客户推进科研进程，并为其提供绝佳的操作体验。