链霉亲和素

目前国内市场上流通的检测产品多为检测单一毒素的亲和柱和固相萃取柱，这些产品进行净化处理时存在操作繁琐、污染大、定量差、耗时长的特点，尤其是目前流行使用的免疫亲和柱净化成本高，操作繁琐，造成企业和国家质检机构的检测成本居高不下。针对这一问题，Pribolab公司的技术研发人员已经研究出了同时高效准确的处理多种毒素的多毒素免疫亲和柱，可同时检测黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素、伏马毒素和T2毒素等11种毒素(aflatoxins, ochratoxin, zearalenon, deoxynivalenol, fumonisins and T2-Toxin)，一次过柱，得到多种毒素。这样可以更加省时省力省心。

用于亲和色谱的理想载体应具有下列特性：⑴不溶性：不溶于水；⑵渗透性：疏松网状结构，容许大分子自由通过；⑶有一定硬度，最好为均一的珠状；⑷具有大量可供反应的化学基团，能与大量配基共价连接；⑸非特异性吸附能力极低；⑹能抗微生物和酶的侵蚀；⑺有较好的化学稳定性；⑻亲水性。选择配基根据对纯化大分子的特异性的全面认识。　　选择也的配基有两条标准：第一是蛋白质和配基之间必须有强的亲和力，解离常数在5mM以上不是好配基； 相反亲和力太高也是有害的，因为在解离蛋白质──配基复合物时所需的条件就要强烈，样可能使蛋白质变性。例如用抗生物素蛋白作配基纯化含生物素的羧化酶时，生物素──抗生物素蛋白复合物的解离常数达10-15M，解离时需要pH1.5，6M盐酸胍，在这种条件中。羧化酶数已经变性。选择配基的第二标准是，配基必须具有适当的化学基团，这种基团不参与配基与蛋白质之间特异结合，但可用于活化和载体相连接，同时又不影响配基与蛋白质之间的亲和力。 琼脂糖凝胶亲水性强，理化性质稳定 （商品名：Sepharose）；聚丙烯酰胺凝胶理化性质稳定，耐有机溶剂及去污剂， 抗微生物能力强，特别适应用配基与提取物亲和力比较弱的物质。葡聚糖凝胶： 有良好的化学及物理性质，孔经小。 纤维素非特易吸附严重，廉价，易得。

哪位能够提供一些信息谢谢了

目前国内市场上流通的检测产品多为检测单一毒素的亲和柱和固相萃取柱，这些产品进行净化处理时存在操作繁琐、污染大、定量差、耗时长的特点，尤其是目前流行使用的免疫亲和柱净化成本高，操作繁琐，造成企业和国家质检机构的检测成本居高不下。因此多毒素共同净化检测产品的研发迫在眉睫，可喜的是部分公司已经研究出了同时高效准确的处理多种毒素的多毒素免疫亲和柱，例如PribolabCombiAOZDFT-IAC可同时检测黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素、伏马毒素和T2毒素(aflatoxins, ochratoxin, zearalenon,deoxynivalenol, fumonisins and T2-Toxin)，这样可以更加省时省力省心。相信在不久的将来针对多毒素同时检测方式的研究会更上一层楼。

检测黄曲霉毒素M1、B1、B2、G1、G2时，样品前处理均要使用到免疫亲和柱，查了下月旭的免疫亲和柱有如下的几种：黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2：免疫亲合柱（Welchrom®Aflatoxin G1 G2 B1 B2 货号：01140-00031 ） 免疫亲和柱：Welchrom® Immunoaffinity Column (3 mL) （以下部分简写为Welchrom® IAC）（中药材） Welchrom® Aflatoxin M1乳制品中M1： 黄曲霉毒素免疫亲和柱：Welchrom® IAC (1ml，25支[/si

想检测玉米中的玉米赤霉烯酮，净化柱和免疫亲和柱差别大吗？ 另外用国标的方法，检测过程中应该注意什么问题啊？

为了方便广大产品用户使用Pribolab霉菌毒素免疫亲和柱，总结了各类柱子的使用方法1. 取样，处理样品。2. 过柱，样品经过PriboFast®霉菌毒素免疫亲和柱处理。3. 冲洗，清洗免疫亲和柱除去杂质。4. 洗脱，用纯甲醇清洗吸附的霉菌毒素（推荐分两次清洗，详见说明书）。5. 检测。各类毒素经免疫亲和柱处理结果均符合国内外的标准。

[font=宋体]链接：[/font]https://bbs.instrument.com.cn/topic/7752272问题描述：[font=宋体]亲和色谱有哪些用途？[/font]解答：a)[font=宋体]亲和色谱（[/font]affinitychromatography[font=宋体]）是将生物活性配体（如酶、抗体、激素等）键合到多孔微粒固体基质为固定相，不同[/font]pH[font=宋体]的缓冲溶液为流动相，依据生物分子与固定相配体间的特异、可逆的相互亲和作用力差异，形成可解离的配位复合物，实现分离和纯化。[/font]b)[font=宋体]亲和色谱的用途很广泛，可以用来从细胞提取物中分离纯化核酸、蛋白，还可以从血浆中分离抗体。分离重组蛋白就经常使用亲和色谱，通过基因修饰为蛋白加上一些人为的特性，这些特性使蛋白选择性地与配体结合，从而达到分离的目的。亲和色谱的另一大用途是从血浆中分离抗体。[/font]以上内容来自仪器信息网《样品前处理实战宝典》

亲和层析过程中的注意事项1.上样亲和层析纯化生物大分子通常采用柱层析的方法。亲和层析柱一般很短，通常10cm左右。上样时应注意选择适当的条件，包括上样流速、缓冲液种类、pH、离子强度、温度等，以使待分离的物质能够充分结合在亲和吸附剂上。一般生物大分子和配体之间达到平衡的速度很慢，所以样品液的浓度不易过高，上样时流速应比较慢，以保证样品和亲和吸附剂有充分的接触时间进行吸附。特别是当配体和待分离的生物大分子的亲和力比较小或样品浓度较高、杂质较多时，可以在上样后停止流动，让样品在层析柱中反应一段时间，或者将上样后流出液进行二次上样，以增加吸附量。样品缓冲液的选择也是要使待分离的生物大分子与配体有较强的亲和力。另外样品缓冲液中一般有一定的的离子强度，以减小基质、配体与样品其它组分之间的非特异性吸附。生物分子间的亲和力是受温度影响的，通常亲和力随温度的升高而下降。所以在上样时可以选择适当较低的温度，使待分离的物质与配体有较大的亲和力，能够充分的结合；而在后面的洗脱过程可以选择适当较高的温度，使待分离的物质与配体的亲和力下降，以便于将待分离的物质从配体上洗脱下来。上样后用平衡洗脱液洗去未吸附在亲和吸附剂上的杂质。平衡缓冲液的流速可以快一些，但如果待分离物质与配体结合较弱，平衡缓冲液的流速还是较慢为宜。如果存在较强的非特异性吸附，可以用适当较高离子强度的平衡缓冲液进行洗涤，但应注意平衡缓冲液不应对待非特异性洗脱。2.洗脱亲和层析的另一个重要的步骤就是要选择合适的条件使待分离物质与配体分开而被洗脱出来。亲和层析的洗脱方法可以分为两种：特异性洗脱和非特异性洗脱。（1）特异性洗脱特异性洗脱是指利用洗脱液中的物质与待分离物质或与配体的亲和特性而将待分离物质从亲和吸附剂上洗脱下来。特异性洗脱也可以分为两种：一种是选择与配体有亲和力的物质进行洗脱，另一种是选择与待分离物质有亲和力的物质进行洗脱。前者在洗脱时，选择一种和配体亲和力较强的物质加入洗脱液，这种物质与待分离物质竞争对配体的结合，在适当的条件下，如这种物质与配体的亲和力强或浓度较大，配体就会基本被这种物质占据，原来与配体结合的待分离物质被取代而脱离配体，从而被洗脱下来。例如用凝集素作为配体分离糖蛋白时，可以用适当的单糖洗脱，单糖与糖蛋白竞争对凝集素的结合，可以将糖蛋白从凝集素上置换下来。后一种方法洗脱时，选择一种与待分离物质有较强亲和力的物质加入洗脱液，这种物质与配体竞争对待分离物质的结合，在在适当的条件下，如这种物质与待分离物质的亲和力强或浓度较大，待分离物质就会基本被这种物质结合而脱离配体，从而被洗脱下来。例如用染料作为配体分离脱氢酶时，可以选择NAD+进行洗脱，NAD+是脱氢酶的辅酶，它与脱氢酶的亲和力要强于染料，所以脱氢酶就会与NAD+结合而从配体上脱离。特异性洗脱方法的优点是特异性强，可以进一步消除非特异性吸附的影响，从而得到较高的分辨率。另外对于待分离物质与配体亲和力很强的情况，使用非特异性洗脱方法需要较强烈的洗脱条件，很可能使蛋白质等生物大分子变性，有时甚至只能使待分离的生物大分子变性才能够洗脱下来，使用特异性洗脱则可以避免这种情况。由于亲和吸附达到平衡比较慢，所以特异性洗脱往往需要较常的时间和较大的洗脱条件，可以通过适当的改变其它条件，如选择亲和力强的物质洗脱、加大洗脱液浓度等等，来缩小洗脱时间和洗脱体积。（2）非特异性洗脱非特异性洗脱是指通过改变洗脱缓冲液pH、离子强度、温度等条件，降低待分离物质与配体的亲和力而将待分离物质洗脱下来。当待分离物质与配体亲和力较小时，一般通过连续大体积平衡缓冲液冲洗，就可以在杂质之后将待分离物质洗脱下来，这种洗脱方式简单、条件温和，不会影响待分离物质的活性。但洗脱体积一般比较大，得到的待分离物质浓度较低。当待分离物质和配体结合较强时，可以通过选择适当的pH、离子强度等条件降低待分离物质与配体的亲和力，具体的条件需要在实验中摸索。可以选择梯度洗脱方式，这样可能将亲和力不同的物质分开。如果希望得到较高浓度的待分离物质，可以选择酸性或碱性洗脱液，或较高的离子强度一次快速洗脱，这样在较小的洗脱体积内就能将待分离物质洗脱出来。但选择洗脱液的pH、离子强度时应注意尽量不影响待分离物质的活性，而且洗脱后应注意中和酸碱，透析去除离子，以免待分离物质丧失活性。对于待分离物质与配体结合非常牢固时，可以使用较强的酸、碱或在洗脱液中加入脲、胍等变性剂使蛋白质等待分离物质变性，而从配体上解离出来。然后再通过适当的方法使待分离物质恢复活性。分离物质与配体的结合有明显影响，以免将待分离物质同时洗下。

本产品的测定的基础是抗原抗体反应，黄曲霉毒素单克隆抗体连接在柱内凝胶上，样品中的黄曲霉毒素经过提取、过滤、稀释，然后将样品提取液缓慢的通过黄曲霉毒素免疫亲和层析柱，在免疫亲和柱内，毒素与抗体结合，之后洗涤免疫亲和柱除去没有被结合的其他物质。用甲醇洗脱黄曲霉毒素，然后注入到分析仪器中用于检测。操作程序：符合GB/T 18979-2003 国标方法----将免疫亲和柱连接于泵流操作架的10mL 注射器下。准确移取10mL 样品提取液注入注射器；1.富集:将空气压力泵与注射器连接，调节压力使提取液以约2-3mL/min(1 滴/3 秒)流速缓慢通过免疫亲和柱，直至2-3mL 空气通过柱体；2.洗涤: 用10mL PH7.0 PBS 清洗，再以10mL 水淋洗柱子2 次，弃去全部流出液，并使2-3mL 空气通过柱子3.洗脱可采取以下方式之一进行: 优选2 A.洗脱1: 准确加入1.0mL 色谱级甲醇洗脱,孵育30秒以上(孵育即甲醇在柱子中浸泡),然后以流速为1-2mL/min 过柱，收集全部洗脱液供检测用。 B.洗脱2: 为保证洗脱充分,建议以1.5mL 色谱甲醇分两步进行洗脱，流速为1-2mL/min(1 滴/秒,重力即可) 。首先，加入0.5ml 甲醇洗脱，重力过柱，当溶剂通过柱子后，等待30 秒后再加入1ml 甲醇进行洗脱，过柱前孵育30 秒以上(孵育即甲醇在柱子中浸泡)。收集全部甲醇洗脱液供检测用。注：1.如样品处理后仍然很粘稠，请加大离心力及离心时间，或选择减少加入亲和柱中的样品量，避免出现亲和柱堵塞。2.如样品本底复杂，洗涤步骤可全部采用PBST 清洗。3.亲和柱可短期内于常温保存，长期保存建议2-8℃储存(5-6℃最佳)，不可冻存;4.使用前，免疫亲和层析柱需回至室温（22-25℃）。

SN/T 1772-2006 进出口粮谷中玉米赤霉烯酮的测定 免疫亲和柱-液相色谱法2006-04-25发布，2006-11-15实施。[img]http://www.instrument.com.cn/bbs/images/affix.gif[/img][url=http://www.instrument.com.cn/bbs/download.asp?ID=98912]SN/T 1772-2006 进出口粮谷中玉米赤霉烯酮的测定 免疫亲和柱-液相色谱法[/url]

为答谢广大客户对安谱实验beacon免疫亲和柱的支持，现针对黄曲霉毒素亲和柱系列产品进行买二赠一活动，活动产品种类任意搭配，等您来组合！ 附件：[url=http://www.anpel.com.cn/UpFile/Tech/00922/%E9%BB%84%E6%9B%B2%E9%9C%89%E6%AF%92%E7%B4%A0%E5%85%8D%E7%96%AB%E4%BA%B2%E5%92%8C%E6%9F%B1%E4%BF%83%E9%94%802018.5.pdf][color=#337fe5][u]Beacon黄曲霉毒素免疫亲和柱年中大促.pdf[/u][/color][/url][align=center][img]http://www.anpel.com.cn/UpFile/Admin/image/20180516/20180516125243_1475.jpg[/img][/align]

【综述】 亲和膜色谱法研究进展（作业都贴上来啦） 膜亲和色谱是人们将亲和色谱和膜技术结合起来研制的，以膜为基质的亲和色谱，其基本原理是将微滤膜或超滤膜经表面改性活化处理后，偶联上合适的配基，使固定在膜载体上的配基特异性地与待分离的生物大分子结合成复合物，再经洗脱是生物大分子得以分离纯化。因此亲和膜色谱技术即具有膜技术分离快，处理量大的特点，又具有亲和色谱特异性高的优点。目前亲和膜色谱法已成为分离纯化生物大分子的重要手段之一。链接到膜基质上的配体分为两大类：生物特异性配体和基团特异性配体，后者又称为通用性配体。以此为依据，可以对膜亲和色谱法进行分类，常见的有生物亲和色谱，免疫亲和色谱，金属螯合亲和色谱等。 生物亲和色谱中连接到基质上的配体是存在特异性相互作用的生物大分子，如酶与底物，酶与抑制剂，激素与受体等，因而具有高度的选择性。但是这类生物大分子通常价格昂贵且不易连接到基质上，限制了它们在大规模工业生产中的应用。 免疫亲和色谱是将抗原抗体中的一方连接到基质上来吸附纯化另一方的色谱分离技术。随着可利用的单克隆抗体技术的发展，免疫亲和色谱的应用日益广泛，期工业化应用前景广阔。 金属螯合亲和色谱又称固定化金属螯合亲和色谱，是Porath等首先提出来的。在上世纪70年代他们将铜离子、锌离子通过螯合剂亚氨基二乙酸交联到Agatose上，利用金属离子与蛋白质表面组氨酸等的配位作用选择性的分离对金属离子有亲和里的蛋白质。期理论基础是不同条件下配位键的形成和解离，即过渡金属离子（铜，铁，锌，镍等）与蛋白质表面的组氨酸，色氨酸，半胱氨酸等电子供体形成配位复合物，因而连接上这些金属离子的载体就能选择性的吸附含有咪唑基或巯基的肽类或蛋白质。吸附力的大小在很大程度上取决于蛋白分子表面咪唑基或巯基的稠密程度。此外，不同的金属离子对亲和力大小也有影响。80年代，人们又提出用微孔的膜作支撑基质，充分发挥了膜过程设备简单，易放大，成本低，分离速度快，可连续操作等优点，是生物工程产品的工业化大规模分离纯化得以实现。 近年来，利用固定化金属螯合亲和膜分离纯化蛋白质的研究取得了很大进展。美国cuno公司曾报道用以木纤维为原料的复合纤维素离子交换机金属螯合膜色谱分离纯化人尿激酶；鲍时翔等人采用ProteinA中空纤维膜成功的 从人血清中分离出免疫球蛋白。另据报道，Iwata等在聚丙烯膜上接枝甲基丙烯酸缩水甘油酯，制得铜离子亲和膜用于吸附含有组氨酸-亮氨酸的多肽以及牛血清蛋白。Klaus等则以化学改性的聚砜作为膜材料，制得金属离子螯合亲和膜，用于组氨酸，苯丙氨酸，苏氨酸和丙氨酸等小分子氨基酸混合物的分离；Ruckenstein等开展了用聚乙酰氨基葡萄糖亲和膜分离溶菌酶的研究。 随着研究的深入，科学家又提出通过遗传学的重组技术，在待分离的蛋白质表面连接上对金属离子有亲和性的氨基酸残基（如组氨酸，半胱氨酸，色氨酸等），以促进蛋白质的分离和纯化，使固定化金属螯合亲和膜分离纯化蛋白质的应用前景更加广阔。【参考文献】魏琪，姚汝华，鲍时翔。固定化金属螯合亲和膜制备及性能研究柴红，陈欢林，刘茉娥。固定化金属离子亲和膜分离技术方法和原理Porath，J,Carlsson J,Olsson I et al。Nature【J】1975,258：598-599张亚辉，杨严俊。纤维素金属螯合亲和膜用于蛋清中功能性蛋白的分离纯化。鲍时翔，石国君，姜炜。蛋白中空纤维膜吸附分离单克隆抗体大连工学院无机化学教研室编。无机化学：下册。北京高等教育出版社，1985,182-186陶慰孙编著，蛋白质分子基础。北京，人民教育出版社，1982.252-260seraficaGC，pimbley J，BelfortG.Protein Fractionation using fast flow immobilized metal chelate affinity membranes。Biotech and Bioeng，1994，43:21-36

感觉坛子里做黄曲霉毒素检测的很少啊，做过的都是用什么检测方法？试剂盒免疫亲和柱-HPLC-荧光检测器免疫亲和柱-荧光光度计，等等方法各有优劣，大家来讨论讨论，用过什么方法，哪种方法比较好？

[font=宋体]根据体内抗体亲和力成熟原理，在体外抗体亲和力成熟过程中，选择突变区域以及如何引入突变是一个关键问题，目前的突变策略主要分为三大类，随机突变、置换和定向突变。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][font=宋体]①易错[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][/b][/font][font=宋体][font=宋体]易错[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]是目前最常用的抗体突变技术，可以在抗体基因的全长或部分区域随机引入突变。在聚合酶对目的[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]基因扩增[/color][/url]时，通过应用错配率高的聚合酶或调整反应条件等，以一定的频率向目的基因中随机引入突变，并通过多轮[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]反复进行随机诱变，累计突变效应，最终获得目的蛋白的随机突变体。[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]②链置换[/font][/b][font=宋体]链置换是保留某个特定抗体的重链或轻链，另一条链与一个随机化的互补链进行组合，从中筛选更高活性的突变株。通过固定抗体两条链中的一条链，对另一条链构建具有足够多样性的置换文库，随机组合有可能产生最佳链组合，经过噬菌体抗体库筛选可获得高亲和力的新抗体。链置换策略常采用轻链替换。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]③定点突变[/b][/font][font=宋体][font=宋体]由于天然抗体在亲和力成熟过程中，体细胞高频突变发生区域并非均匀分布，而是主要集中在与抗原直接接触的[/font][font=Calibri]CDR[/font][font=宋体]区。在抗体的亲和力体外成熟过程中，[/font][font=Calibri]CDR[/font][font=宋体]区是最常选用的定点突变区域，这样既可以获得足够的序列多样性，又不会破坏蛋白质结构。对[/font][font=Calibri]CDR[/font][font=宋体]进行定点突变时，可以对多个[/font][font=Calibri]CDR[/font][font=宋体]进行平行突变或进行逐步优化。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][font=宋体]④[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]改组[/font][/b][/font][font=宋体][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]改组技术是对同源的抗体基因，采用脱氧核糖核酸酶Ⅰ将其切割成不超过[/font][font=Calibri]50bp[/font][font=宋体]的片段，再随机组合后进行[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]扩增成完成的抗体基因的技术。它包含了抗体片段随机化切割、重组和筛选的过程，一定程度上模拟了天然抗体的亲和力成熟过程，并加快了体外定向进化速度。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]Tips:[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]1[/font][font=宋体]、在链置换中为什么通常替换的都是轻链？[/font][/font][font=宋体]答：因为抗体重链在抗结合活性和结构方面比较重要，所以链置换策略常采用轻链替换，以尽量避免链替换后抗体结合特异性发生变化。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]、抗体库技术与单、多抗技术相比，有何优劣？[/font][/font][font=宋体][font=宋体]答：优势：抗体库技术筛选范围大、实验周期短、操作简单、不许进行免疫操作、可应用于大规模生产劣势：亲和力弱，不易激发人体的抗原[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]抗体反应。临床应用受限较大。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州提供[url=https://cn.sinobiological.com/services/antibody-affinity-maturation-service][b]抗体亲和力成熟服务[/b][/url]，服务内容及流程可以查看：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/antibody-affinity-maturation-service[/font][/font]

我们现在在使用的肝素免疫亲和柱是用注射器推样子的那种，想找找有没有能直接插在固相萃取装置上的小柱，不用注射器一个一个推，这样样品才可以成批处理。。。。各位大神请赐教！！！谢谢大伙！

[font=宋体][font=宋体]抗体亲和力成熟[/font][font=Calibri](antibodyaffinitymaturation)[/font][font=宋体]是指机体正常存在的一种免疫功能状态。在体液免疫中，再次应答所产生抗体的平均亲和力高于初次免疫应答。这种现象称为抗体亲和力成熟。机体的这种功能状态是长期进化和对外界环境不断适应的结果，对机体防御和维持自身免疫监控有着十分重要的意义。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]体内亲和力成熟[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]抗体亲和力成熟形成的原因，是抗体形成细胞本身的基因突变和抗原对[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞克隆的选择性激活。机体在接受抗原刺激后，体细胞发生高频突变，突变产生的各种亲和力不同的[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞克隆，经过滤泡树突细胞捕获，使得后代[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞及其产生的抗体对抗原的平均亲和力得到了提升，从而实现了亲和力的体内成熟。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]在机体体液免疫系统中，[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]淋巴细胞应对抗原刺激诱导，产生抗体。在反复暴露于抗原的过程中，产生高亲和力的抗体。这涉及两个相互关联的过程：首先在骨髓抗体轻重链的胚系基因片段经[/font][font=Calibri]V-(D)-J[/font][font=宋体]随机重排产生超过[/font][font=Calibri]106[/font][font=宋体]的组合，这是抗体特异性免疫反应的分子基础；其次，机体接受抗原刺激后，在二级淋巴器官的生发中心，抗体基因尤其是互补决定区（[/font][font=Calibri]complementaritydeterminingregion[/font][font=宋体]，[/font][font=Calibri]CDR[/font][font=宋体]）发生高频突变，突变导致抗体结合特性改变。经过滤泡树突状细胞提呈抗原，只有抗原亲和力最高的[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞将选择生存进一步分化为浆细胞和记忆细胞。对于高频突变，近期研究表明：活化的胞嘧啶核苷脱氨酶（[/font][font=Calibri]activation-inducedcytidinedeaminase[/font][font=宋体]，[/font][font=Calibri]AID[/font][font=宋体]）将胞嘧啶脱氨基转化为尿嘧啶，突变后的尿嘧啶引发错配和碱基剪切并引发[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]修复，而不正确修复进一步加剧突变产生，导致抗体基因高频突变诱发高亲和力抗体产生。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]体外抗体亲和力成熟[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]抗体制备技术的发展，经历了多克隆技术、单克隆技术和抗体库技术[/font][font=Calibri]3[/font][font=宋体]个发展阶段。与单、多克隆技术相比，抗体库技术在基因水平上的操作非常灵活，可对基因序列进行分析、修饰和加工以改进抗体特性或赋予抗体新特性，突破了以往仅局限于抗抗原分子设计的限制。然而，抗体库来源的抗体与传统的单、多克隆抗体相比，实际应用非常少见，主要是因为库来源抗体与天然抗体相比，亲和力偏低，难以满足多种实际需求。特别是来自于未经免疫的天然抗体库中的抗体，抗体的亲和力通常在微摩尔水平，这仅与动物在初次免疫应答后获得的抗体亲和力水平相当。因此人们依据体内抗体亲和力成熟原理，模拟体内亲和力成熟过程、采取各种策略对抗体基因进行相应突变，进行体外亲和力成熟研究。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]常用的抗体体外亲和力成熟技术[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]根据体内抗体亲和力成熟原理，在体外抗体亲和力成熟过程中，选择突变区域以及如何引入突变是一个关键问题，目前的突变策略主要分为三大类，随机突变、置换和定向突变。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]①易错[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]易错[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]是目前最常用的抗体突变技术，可以在抗体基因的全长或部分区域随机引入突变。在聚合酶对目的[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]基因扩增[/color][/url]时，通过应用错配率高的聚合酶或调整反应条件等，以一定的频率向目的基因中随机引入突变，并通过多轮[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]反复进行随机诱变，累计突变效应，最终获得目的蛋白的随机突变体。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]②链置换[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]链置换是保留某个特定抗体的重链或轻链，另一条链与一个随机化的互补链进行组合，从中筛选更高活性的突变株。通过固定抗体两条链中的一条链，对另一条链构建具有足够多样性的置换文库，随机组合有可能产生最佳链组合，经过噬菌体抗体库筛选可获得高亲和力的新抗体。链置换策略常采用轻链替换。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]③定点突变[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]由于天然抗体在亲和力成熟过程中，体细胞高频突变发生区域并非均匀分布，而是主要集中在与抗原直接接触的[/font][font=Calibri]CDR[/font][font=宋体]区。在抗体的亲和力体外成熟过程中，[/font][font=Calibri]CDR[/font][font=宋体]区是最常选用的定点突变区域，这样既可以获得足够的序列多样性，又不会破坏蛋白质结构。对[/font][font=Calibri]CDR[/font][font=宋体]进行定点突变时，可以对多个[/font][font=Calibri]CDR[/font][font=宋体]进行平行突变或进行逐步优化。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]④[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]改组[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]改组技术是对同源的抗体基因，采用脱氧核糖核酸酶Ⅰ将其切割成不超过[/font][font=Calibri]50bp[/font][font=宋体]的片段，再随机组合后进行[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]扩增成完成的抗体基因的技术。它包含了抗体片段随机化切割、重组和筛选的过程，一定程度上模拟了天然抗体的亲和力成熟过程，并加快了体外定向进化速度。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]Tips:[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]1[/font][font=宋体]、在链置换中为什么通常替换的都是轻链？[/font][/font][font=宋体]答：因为抗体重链在抗结合活性和结构方面比较重要，所以链置换策略常采用轻链替换，以尽量避免链替换后抗体结合特异性发生变化。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]、抗体库技术与单、多抗技术相比，有何优劣？[/font][/font][font=宋体][font=宋体]答：优势：抗体库技术筛选范围大、实验周期短、操作简单、不许进行免疫操作、可应用于大规模生产劣势：亲和力弱，不易激发人体的抗原[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]抗体反应。临床应用受限较大。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]义翘神州会为大家提供抗体亲和力成熟服务，同时义翘神州优势：[/font][font=宋体]①丰富的经验及多例成功案例[/font][font=宋体]②专业的抗体数据库分析系统[/font][font=宋体]③计算机建模结构模拟优化[/font][font=宋体]④随机突变、定点突变技术[/font][font=宋体]⑤快速、高通量哺乳动物细胞抗体表达与筛选技术平台[/font][font=宋体][font=宋体]⑥[/font][font=Calibri]OCTET Affinity, Kinetics, off-rate, ranking[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]同时[url=https://cn.sinobiological.com/services/antibody-affinity-maturation-service][b]抗体亲和力成熟服务[/b][/url]内容及流程详解可以参看抗体亲和力成熟[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/antibody-affinity-maturation-service[/font][/font][font=宋体] [/font][font=Calibri] [/font]

[font=宋体][font=宋体]抗体亲和力成熟[/font][font=Calibri](antibody affinity maturation)[/font][font=宋体]是指机体正常存在的一种免疫功能状态。在体液免疫中，再次应答所产生抗体的平均亲和力高于初次免疫应答。这种现象称为抗体亲和力成熟。机体的这种功能状态是长期进化和对外界环境不断适应的结果，对机体防御和维持自身免疫监控有着十分重要的意义。[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]体内亲和力成熟[/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]抗体亲和力成熟形成的原因，是抗体形成细胞本身的基因突变和抗原对[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞克隆的选择性激活。机体在接受抗原刺激后，体细胞发生高频突变，突变产生的各种亲和力不同的[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞克隆，经过滤泡树突细胞捕获，使得后代[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞及其产生的抗体对抗原的平均亲和力得到了提升，从而实现了亲和力的体内成熟。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]在机体体液免疫系统中，[/font][font=Calibri]B [/font][font=宋体]淋巴细胞应对抗原刺激诱导，产生抗体。在反复暴露于抗原的过程中，产生高亲和力的抗体。这涉及两个相互关联的过程：首先在骨髓抗体轻重链的胚系基因片段经[/font][font=Calibri]V-(D)-J [/font][font=宋体]随机重排产生超过[/font][font=Calibri]106[/font][font=宋体]的组合，这是抗体特异性免疫反应的分子基础；其次，机体接受抗原刺激后，在二级淋巴器官的生发中心，抗体基因尤其是互补决定区（[/font][font=Calibri]complementarity determining region[/font][font=宋体]，[/font][font=Calibri]CDR[/font][font=宋体]）发生高频突变，突变导致抗体结合特性改变。经过滤泡树突状细胞提呈抗原，只有抗原亲和力最高的[/font][font=Calibri]B [/font][font=宋体]细胞将选择生存进一步分化为浆细胞和记忆细胞。对于高频突变，近期研究表明：活化的胞嘧啶核苷脱氨酶（[/font][font=Calibri]activation-induced cytidine deaminase[/font][font=宋体]，[/font][font=Calibri]AID[/font][font=宋体]）将胞嘧啶脱氨基转化为尿嘧啶，突变后的尿嘧啶引发错配和碱基剪切并引发[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]修复，而不正确修复进一步加剧突变产生，导致抗体基因高频突变诱发高亲和力抗体产生。[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]体外抗体亲和力成熟[/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]抗体制备技术的发展，经历了多克隆技术、单克隆技术和抗体库技术[/font][font=Calibri]3[/font][font=宋体]个发展阶段。与单、多克隆技术相比，抗体库技术在基因水平上的操作非常灵活，可对基因序列进行分析、修饰和加工以改进抗体特性或赋予抗体新特性，突破了以往仅局限于抗抗原分子设计的限制。然而，抗体库来源的抗体与传统的单、多克隆抗体相比，实际应用非常少见，主要是因为库来源抗体与天然抗体相比，亲和力偏低，难以满足多种实际需求。特别是来自于未经免疫的天然抗体库中的抗体，抗体的亲和力通常在微摩尔水平，这仅与动物在初次免疫应答后获得的抗体亲和力水平相当。因此人们依据体内抗体亲和力成熟原理，模拟体内亲和力成熟过程、采取各种策略对抗体基因进行相应突变，进行体外亲和力成熟研究。[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]常用的抗体体外亲和力成熟技术[/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体]根据体内抗体亲和力成熟原理，在体外抗体亲和力成熟过程中，选择突变区域以及如何引入突变是一个关键问题，目前的突变策略主要分为三大类，随机突变、置换和定向突变。[/font][font=宋体][font=宋体]易错[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]易错[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]是目前最常用的抗体突变技术，可以在抗体基因的全长或部分区域随机引入突变。在聚合酶对目的[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]基因扩增[/color][/url]时，通过应用错配率高的聚合酶或调整反应条件等，以一定的频率向目的基因中随机引入突变，并通过多轮[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]反复进行随机诱变，累计突变效应，最终获得目的蛋白的随机突变体。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]①[/font][font=宋体]链置换[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]链置换是保留某个特定抗体的重链或轻链，另一条链与一个随机化的互补链进行组合，从中筛选更高活性的突变株。通过固定抗体两条链中的一条链，对另一条链构建具有足够多样性的置换文库，随机组合有可能产生最佳链组合，经过噬菌体抗体库筛选可获得高亲和力的新抗体。链置换策略常采用轻链替换。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]②[/font][font=宋体]定点突变[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]由于天然抗体在亲和力成熟过程中，体细胞高频突变发生区域并非均匀分布，而是主要集中在与抗原直接接触的[/font][font=Calibri]CDR[/font][font=宋体]区。在抗体的亲和力体外成熟过程中，[/font][font=Calibri]CDR[/font][font=宋体]区是最常选用的定点突变区域，这样既可以获得足够的序列多样性，又不会破坏蛋白质结构。对[/font][font=Calibri]CDR[/font][font=宋体]进行定点突变时，可以对多个[/font][font=Calibri]CDR[/font][font=宋体]进行平行突变或进行逐步优化。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]③[/font][font=宋体][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]改组[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]改组技术是对同源的抗体基因，采用脱氧核糖核酸酶Ⅰ将其切割成不超过[/font][font=Calibri]50bp[/font][font=宋体]的片段，再随机组合后进行[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]扩增成完成的抗体基因的技术。它包含了抗体片段随机化切割、重组和筛选的过程，一定程度上模拟了天然抗体的亲和力成熟过程，并加快了体外定向进化速度。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州提供[url=https://cn.sinobiological.com/services/antibody-affinity-maturation-service][b]抗体亲和力成熟服务[/b][/url]，有需求可以参看：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/antibody-affinity-maturation-service[/font][/font]

Pribolab霉菌毒素免疫亲和柱使用方法 1.取样，处理样品。 2.过柱，样品经过PriboFast®霉菌毒素免疫亲和柱处理。 3.冲洗，清洗免疫亲和柱除去杂质。 4.洗脱，用纯甲醇清洗吸附的霉菌毒素（推荐分两次清洗，详见说明书）。 5.检测。各类毒素经免疫亲和柱处理结果均符合国内外的标准。

黄曲霉毒素免疫亲和柱和净化柱有什么差别啊，看到了北京泰乐祺科技有限公司提供MycoSep226 多功能净化柱，还有MycoSep228 多功能净化柱，还有MycoSep227多功能净化柱，还有MycoSep112多功能净化柱，请问他们有什么区别啊，是填料不同还是有什么具体说法？还是根据什么分的，那个效果更好啊

现在在用的肝素免疫亲和柱，是用注射器推样子的那种，没办法大批处理，大家有没有好用的免疫亲和柱，比如有没有那种能插在固相萃取装置上的小柱，求个厂家。。。或者有没有其他的好方法

[font=宋体][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/affinity-tag][b]亲和标签[/b][/url]是指在重组蛋白的[/font][font=Calibri]N[/font][font=宋体]端或[/font][font=Calibri]C[/font][font=宋体]端添加的一段短肽，可以促进表达蛋白的纯化，亲和标签序列通常包含几个到几百个氨基酸。许多标签还可以提供与纯化无关的附加功能，例如促进目标蛋白的检测或改善目标重组蛋白的溶解性。[/font][/font][b][font=宋体]那么常见的亲和标签有哪些？[/font][/b][font=宋体][font=宋体]①[/font][font=Calibri]Flag-tag[/font][/font][font=宋体][font=Calibri][url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/flag-tag-protein-expression][b]Flag[/b][/url][/font][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/flag-tag-protein-expression][b]标签[/b][/url]是由八个亲水氨基酸（[/font][font=Calibri]DYKDDDDK[/font][font=宋体]）组成的一个短肽，分子量很小，因此不会遮盖融合蛋白中其他蛋白表位与结构域。该标签具有天然的亲水特性，可位于蛋白质的[/font][font=Calibri]C[/font][font=宋体]端或[/font][font=Calibri]N[/font][font=宋体]端，利于抗体检测，同时含有一个肠激酶切割位点，可通过肠激酶切除标签。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]②[/font][font=Calibri]His-tag[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]His-tag[/font][font=宋体]由人工合成的组氨酸首尾相连构成，通常由[/font][font=Calibri]6[/font][font=宋体]个氨基酸（[/font][font=Calibri]HHHHHH[/font][font=宋体]）组成，也有[/font][font=Calibri]3[/font][font=宋体]个和[/font][font=Calibri]8[/font][font=宋体]个的情况。[/font][font=Calibri]His[/font][font=宋体]融合标签与其他标签相比有很多明显优势，是目前用于纯化的融合标签中使用最为广泛的一种。[/font][font=Calibri]His[/font][font=宋体]标签融合蛋白一般采用固定化金属离子亲和层析进行分离纯化，操作较为简便。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]③[/font][font=Calibri]Strep[/font][font=宋体]Ⅱ[/font][font=Calibri]-tag[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]Strep[/font][font=宋体]Ⅱ即链霉亲和素结合肽，是一个小分子的短肽标签，由[/font][font=Calibri]8[/font][font=宋体]个氨基酸（[/font][font=Calibri]WSHPQFEK[/font][font=宋体]）组成，可位于融合蛋白的任一位置。广泛应用于多种目标蛋白在原核表达系统、哺乳动物表达系统等的纯化。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]④[/font][font=Calibri]GST-tag[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]GST[/font][font=宋体]即谷胱甘肽[/font][font=Calibri]-S-[/font][font=宋体]转移酶，具有解毒作用，可将谷胱甘肽中的硫基转移至含硝基或卤化物的复合物中。其天然大小为[/font][font=Calibri]26KD[/font][font=宋体]。近年来，商品化的[/font][font=Calibri]GST[/font][font=宋体]融合蛋白表达体系以及[/font][font=Calibri]GST[/font][font=宋体]标签抗体系统至今仍被广泛应用。近年来在原核表达体系中，谷胱甘肽[/font][font=Calibri]S[/font][font=宋体]转移酶[/font][font=Calibri]GST[/font][font=宋体]表达纯化系统的应用更为普遍。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]⑤[/font][font=Calibri]HA-tag[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]HA[/font][font=宋体]标签蛋白，标签序列[/font][font=Calibri]YPYDVPDYA[/font][font=宋体]，源于流感病毒的红细胞凝集素表面抗原决定簇，[/font][font=Calibri]9[/font][font=宋体]个氨基酸，对外源靶蛋白的空间结构影响小，容易构建成标签蛋白融合到[/font][font=Calibri]N[/font][font=宋体]端或者[/font][font=Calibri]C[/font][font=宋体]端。易于用[/font][font=Calibri]Anti-HA[/font][font=宋体]抗体检测和[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]检测。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]⑥[/font][font=Calibri]C-myc-tag[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]c-myc [/font][font=宋体]标签蛋白，是含[/font][font=Calibri]11[/font][font=宋体]个氨基酸的小标签，标签序列[/font][font=Calibri]Glu- Gln-Lys-Leu-lle-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu[/font][font=宋体]，这[/font][font=Calibri]11[/font][font=宋体]个氨基酸作为抗原表位，表达在不同的蛋白质框架中仍可识别其相应抗体。 [/font][font=Calibri]C-Myc tag[/font][font=宋体]已成功应用在 [/font][font=Calibri]Western-blot[/font][font=宋体]杂交技术、免疫沉淀和流式细胞计量术中，可用于检测重组蛋白质在靶细胞中的表达。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]⑦[/font][font=Calibri]MBP-tag[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]MBP-tag[/font][font=宋体]（麦芽糖结合蛋白）是由大肠杆菌[/font][font=Calibri]K12[/font][font=宋体]的[/font][font=Calibri]maLE[/font][font=宋体]基因编码的[/font][font=Calibri]396[/font][font=宋体]个氨基酸组成，大小为[/font][font=Calibri]40KDa[/font][font=宋体]，同[/font][font=Calibri]GST[/font][font=宋体]标签一样，[/font][font=Calibri]MBP[/font][font=宋体]标签能增大融合蛋白可溶性，提高其表达产量。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]⑧[/font][font=Calibri]eGFP-tag[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]eGFP[/font][font=宋体]标签蛋白，是增强型绿色荧光蛋白。[/font][font=Calibri]eGFP[/font][font=宋体]激发波长为[/font][font=Calibri]488m[/font][font=宋体]，发射波长为[/font][font=Calibri]507nm[/font][font=宋体]，是由野生型绿色荧光蛋白[/font][font=Calibri]GFP[/font][font=宋体]通过氨基酸突变和密码子优化而来的。相对于[/font][font=Calibri]GFP[/font][font=宋体]，[/font][font=Calibri]eGFP[/font][font=宋体]荧光强度更强、荧光性质更稳定。同时载体中构建的[/font][font=Calibri]KOza K[/font][font=宋体]序列使得含有[/font][font=Calibri]eGFP[/font][font=宋体]的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]⑨[/font][font=Calibri]Avi-tag[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]Avi-tag[/font][font=宋体]是由[/font][font=Calibri]15[/font][font=宋体]个氨基酸组成的短肽，具有一个单生物素化赖氨酸位点，与已知天然可生物素化序列完全不同。[/font][font=Calibri]Avi-tag[/font][font=宋体]加在目标蛋白的[/font][font=Calibri]N[/font][font=宋体]端和[/font][font=Calibri]C[/font][font=宋体]端融合表达后，可被生物素连接酶生物素化，可用于蛋白质分离纯化及蛋白质相互作用研究。义翘神州提供生物素标记蛋白：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/category/biotinylated-protein-elite[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]⑩[/font][font=Calibri]Profinity eXact tag[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]Profinity eXact[/font][font=宋体]标签是由野生型枯草芽孢杆菌蛋白酶[/font][font=Calibri]BPN[/font][font=宋体]’的功能前域，经基因改造而得到的大小约为[/font][font=Calibri]8.2kDa[/font][font=宋体]的一段多肽。利用基因工程的方法对该功能域进行改造，提高其稳定性，使其含有一段枯草杆菌蛋白酶突变体[/font][font=Calibri]S189[/font][font=宋体]的剪切识别序列（[/font][font=Calibri]EEDKLFKAL[/font][font=宋体]）。由此发展的[/font][font=Calibri]Profinity eXact[/font][font=宋体]亲和纯化技术越来越多的应用于重组蛋白的分离纯化实验中。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]详情可以关注亲和标签汇总页面：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/affinity-tag[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=Calibri] [/font]

黄曲霉毒素M1、M2检测所用免疫亲和柱(GB 5009.24～2016)要求对其柱容量进行验证应该怎么做？

论坛的各位大拿，在使用免疫亲和柱检测赭曲霉毒素时，不同厂家的IAC柱处理有那么一些差异，各位在实际应用时遇到过类似的情况吗？1笔者用的是凯斯科的小柱，它们家最明显的一点是样品中一定要加氯化钠，不加氯化钠柱效降低，我查了食品的国标和饲料的国标，食品中对于油脂、蛋白含量比较高的（如食用植物油、大豆、油菜籽等）都标明了要加氯化钠，而饲料默认都加氯化钠。氯化钠作用是降低蛋白脂类等大分子的溶解，从而降低对目标物的干扰。应用时加了氯化钠之后回收确实比不加要好很多。在使用过程中，[b][size=12px][color=#ff0000]通常对于基质复杂的样品，稀释液和淋洗液都用PBS代替水，对于降低杂质影响、减少杂峰干扰效果显著，不管哪家的产品都是这样！[/color][/size][/b]2网上查资料发现2019年CNW出过一篇免疫亲和柱条件优化的报告，主要从稀释液和淋洗液（水、PBS）进行了验证：A稀释时用纯水，淋洗分三种①20ml水（回收率24.41%）②10ml水+10mlPBS（回收率21.13%）③20mlPBS（回收率65.16%）B稀释时用PBS，淋洗分四种①20ml水（回收率70.71%）②10mlPSB+10ml水（回收率55.90%）③[color=#ff6666]20mlPBS（回收率99.34%）[/color]④[color=#ff6666]10ml水+10mlPBS（回收率82.91%）[/color]并未提到前处理时需不需要加盐。可见安谱着重点在于稀释液和淋洗液。3跟同行聊天，他们用的是美正小柱，据说厂家的技术反馈，他们家的小柱着重点在于洗脱，洗脱时在洗脱液中要需要加入乙酸（即酸化甲醇），对于目标物的解离效果最佳。公司条件有限，成本控制比较严格，无法对几个品牌进行验证，大家在应用过程中有遇到类似的问题或者困惑吗？欢迎来交流~

大家在用免疫亲和柱-高效液相色谱法测定黄曲霉毒素和呕吐毒素等真菌毒素时，有没有一些技术要点可以一起分析下，比如前处理过程、净化过程等。新人刚接触这块，希望大家能多指导，十分感谢！

今天做了黄曲霉毒素B1的检测，用的是免疫亲和柱，回收率只有50%，加标是在称完样品之后加的之后加70%甲醇水提取

[b][font=宋体]前言[/font][/b][font=宋体][color=#060607][font=宋体]随着基因组学、蛋白质组学和生物信息学的发展，重组[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]技术的使用已经可以不需要预先了解蛋白质的细胞位置或功能，就能评估任何感兴趣的蛋白质。同时使用亲和标签和重组[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]技术可以简便地修改蛋白质，从而高效地识别、生产和从宿主系统中分离出来。[/font][/color][/font][font=Calibri][color=#060607][font=Helvetica]为提高表达效率和纯化产量，研究者们开发了多种[/font][/color][/font][font=宋体][color=#060607]亲和[/color][/font][font=Calibri][color=#060607][font=Helvetica]标签，这些标签可以增加[/font][/color][/font][font=宋体][color=#060607]蛋白[/color][/font][font=Calibri][color=#060607][font=Helvetica]表达产量、影响溶解度和天然折叠，并通过结合亲和技术提高纯化产量。[/font][/color][/font][b][font=Calibri] [/font][font=Calibri][font=宋体]亲和标签的选择与应用[/font][/font][/b][font=宋体][color=#060607][font=宋体]亲和标签是指在重组蛋白的[/font][font=Calibri]N[/font][font=宋体]端或[/font][font=Calibri]C[/font][font=宋体]端添加的一段短肽，可以促进[/font][/color][/font][font=Calibri][color=#060607][font=Helvetica]蛋白质检测、表征和纯化。例如，[/font]c-myc[font=Helvetica]、[/font][/color][/font][url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/ha-tag-protein-production][u][font=Calibri][color=#0000ff]HA[/color][/font][/u][/url][font=Calibri][color=#060607][font=Helvetica]和[/font][/color][/font][url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/flag-tag-protein-expression][u][font=Calibri][color=#0000ff]FLAG[/color][/font][/u][/url][font=Calibri][color=#060607][font=Helvetica]等标签主要用于蛋白质检测，而[/font]polyArg[font=Helvetica]和[/font][font=Calibri]polyHis[/font][font=Helvetica]等亲和标签则主要用于蛋白质的纯化。亲和层析技术（如[/font][font=Calibri]IMAC[/font][font=Helvetica]）和[/font][font=Calibri]Strep-tag[/font][font=Helvetica]系统等，都是基于亲和标签的纯化技术，它们能够从宿主系统中[/font][/color][/font][font=宋体][color=#060607]高效地[/color][/font][font=Calibri][color=#060607][font=Helvetica]纯化目标蛋白。[/font][/color][/font][b][font=Calibri] [/font][font=宋体]亲和[/font][font=Calibri][font=宋体]标签的创新与优化[/font][/font][/b][font=Calibri][color=#060607][font=Helvetica]为了克服单一亲和标签的局限性，研究者们开发了串联亲和纯化（[/font]TAP[font=Helvetica]）和双标签方法。这些方法通过结合不同的亲和标签，提供了多种纯化策略，从而增加了标签的多功能性和下游应用的灵活性。[/font][/color][/font][font=宋体][color=#060607]如[/color][/font][font=宋体][color=#060607]双标签构建体[/color][/font][font=Helvetica][color=#060607][font=Calibri]GFP-His[/font][/color][/font][sub][font=Helvetica][color=#060607][font=Calibri]6[/font][/color][/font][/sub][font=宋体][color=#060607]，提供了使用体内荧光显微镜或体外技术的额外检测方法。除了使用[/color][/font][font=Helvetica][color=#060607] [font=Calibri]GFP [/font][/color][/font][font=宋体][color=#060607]荧光标准品和既定方案允许估计重组体外，[/color][/font][font=Helvetica][color=#060607][font=Calibri]GFP[/font][/color][/font][font=宋体][color=#060607]及其变体的内在荧光已被用于通过凝胶内荧光技术快速评估阳性克隆。[/color][/font][b][font=Calibri] [/font][font=宋体]亲和标签的去除[/font][/b][font=宋体][color=#060607]亲和标签的存在可能影响蛋白质的结构或生物功能，因此[/color][/font][font=Calibri][color=#060607][font=Helvetica]为了保持蛋白质的天然结构，需要去除[/font][/color][/font][font=宋体][color=#060607]亲和[/color][/font][font=Calibri][color=#060607][font=Helvetica]标签。特定的蛋白酶如肠激酶、[/font]SUMO[font=Helvetica]蛋白酶、烟草蚀纹病毒（[/font][font=Calibri]TEV[/font][font=Helvetica]）蛋白酶和凝血酶等，可以用于在特定序列处切割并去除[/font][/color][/font][font=宋体][color=#060607]亲和[/color][/font][font=Calibri][color=#060607][font=Helvetica]标签。[/font][/color][/font][b][font=Calibri] [/font][font=Calibri][font=宋体]结论[/font][/font][/b][font=Calibri][font=宋体]除了[/font][/font][font=宋体]对[/font][url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/affinity-tag][u][font=Calibri][color=#0000ff][font=宋体]亲和标签[/font][/color][/font][/u][/url][font=宋体]自身进行优化[/font][font=Calibri][font=宋体]以外，标签组合使用、简化纯化步骤、降低纯化成本、扩大纯化规模等，都[/font][/font][font=宋体]需要再[/font][font=Calibri][font=宋体]使用亲和标签融合技术时不断[/font][/font][font=宋体]的[/font][font=Calibri][font=宋体]改进与优化[/font][/font][font=宋体][font=宋体]。亲和标签和亲和纯化技术的发展不仅加速了高产量优质蛋白的获取，而且促进了新药物靶点和治疗方法的发现，方便我们更深入地了解蛋白质结构[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]功能关系。[/font][/font][font=宋体][color=#060607] [/color][/font][font=Calibri][color=#060607] [/color][/font][font=Calibri][color=#060607][font=宋体]参考文献：[/font][/color][/font][font=Calibri][color=#212121]Young CL, Britton ZT, Robinson AS. Recombinant protein expression and purification: a comprehensive review of affinity tags and microbial applications. [/color][/font][i][font=Calibri][color=#212121]Biotechnol J[/color][/font][/i][font=Calibri][color=#212121]. 2012 7(5):620-634. doi:10.1002/biot.201100155[/color][/font][font=Calibri] [/font]

是进入这个领域的新人.上学的时候学的不只这个专业,现在工作开始做这方面的事情.具体的是手上有种抗体,想把它偶联到合适基质上,做成针对抗原的亲和柱.第一步是要筛选合适的基质.我想请教的是,常用的亲和柱的基质有哪些,它们的理化性质怎么样,提供什么基团,对应结合什么基团,如何激活,如何偶联,适用的操作环境(如PH值等),价格,厂家等等这些问题.不知道有没有这方面的工具书,或者想查阅一些科技期刊的话,哪些比较好,常用的检索关键字词是些什么,既有针对性,有比较全面的找到需要的资料.谢谢.

目的要求（1）了解克隆基因表达的方法和意义。（2）了解重组蛋白亲和层析分离纯化的方法。实验原理克隆基因在细胞中表达对理论研究和实验应用都具有重要的意义。通过表达能探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理，同时克隆基因表达出所编码的蛋白质可供作结构与功能的研究。大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统，其表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统，表达的目的蛋白量甚至能超过细菌总蛋白量的80%。本实验中，携带有目标蛋白基因的质粒在大肠杆菌BL21中，在 37℃，IPTG诱导下，超量表达携带有6个连续组氨酸残基的重组氯霉素酰基转移酶蛋白，该蛋白可用一种通过共价偶连的次氨基三乙酸（NTA）使镍离子（Ni2+）固相化的层析介质加以提纯，实为金属熬合亲和层析（MCAC）。蛋白质的纯化程度可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。试剂和器材一、试剂 LB液体培养基：Trytone 10g, yeast extract 5g, NaCl 10g, 用蒸馏水配至1000mL. 氨苄青霉素：100mg/mL 上样缓冲液：100 mM NaH2PO4, 10 mMTris, 8M Urea, 10 mM2-ME, pH8.0 Washing Buffer：100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris, 8 M Urea, pH6.3 Elution Buffer:100 mM NaH2PO4, 10 mMTris, 8M Urea, 500 mM Imidazole, pH8.0 IPTG二、器材摇床，离心机，层析柱（1′10 cm）操作方法一、氯霉素酰基转移酶重组蛋白的诱导1. 接种含有重组氯霉素酰基转移酶蛋白的大肠杆菌BL21菌株于5mL LB液体培养基中（含100ug/mL 氨苄青霉素），37℃震荡培养过夜。2. 转接1mL过夜培养物于100mL（含100ug/mL 氨苄青霉素）LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD600 = 0.6 - 0.8。取10ul 样品用于SDS-PAGE 分析。3. 加入IPTG至终浓度0.5 mmol/l, 37℃继续培养1-3h.4. 12，000rpm 离心10 min, 弃上清，菌体沉淀保存于-20℃或-70℃冰箱中。二、氯霉素酰基转移酶重组蛋白的分离、纯化1. NTA层析柱的准备：在层析柱中加入1mL NTA介质，并分别用8mL 去离子水，8mL上样缓冲液洗涤。2. 重组蛋白的变性裂解：在冰浴中冻融菌体沉淀，加入5mL上样缓冲液, 用吸管抽吸重悬，超声波破裂菌体，用振荡器等轻柔的混匀样品60min, 4℃ 12000rpm 离心 30 min, 将上清吸至一个干净的容器中，并弃沉淀。取10ul 上清样品用于SDS-PAGE 分析。3. 上清样品以10-15mL/h 流速上Ni2+-NTA柱，收集流出液，取10ul样品用于SDS-PAGE 分析。4. 洗脱杂蛋白：用Washing Buffer以10-15mL/h流速洗柱，直至OD280 = 0.01.分步收集洗脱液，约3-4h,取10ul洗脱开始时的样品用于SDS-PAGE 分析。5. 洗脱目标蛋白：用Elution Buffer洗柱，收集每1 mL 级分，分别取10ul样品用于SDS-PAGE 分析。