溴苯肼辛酸盐

各位大神，请教一下药典通则里面的辛酸钠测定，要求[color=#333333]色谱条件与系统适用性试验为 用酸改性聚乙二醇（20M）毛细管柱，柱温160℃，火焰离子化检测器，检测器温度230℃，气化室温度230℃，载气（氮气）流速为每分钟35ml。辛酸峰与庚酸峰的分离度应大于1.5，辛酸峰的拖尾因子应为0.95～1.20，辛酸对照品溶液连续进样5次，所得辛酸峰与庚酸峰面积之比的相对标准偏差（RSD）应不大于5%。[/color][color=#333333]我这边色谱柱用的是J&W DB-FFAP（30×0.32×0.50）[color=#333333]柱温160℃，火焰离子化检测器，检测器温度230℃，气化室温度230℃，流速3.5ml/min，分流比10:1，出的峰分离度只有0.7~0.8左右，达不到要求的0.95，应该怎么处理？[/color][/color][color=#333333][color=#333333]ps：因为配制的时候浓度比药典规定的小4倍，所以进样量为4μl。[/color][/color][color=#333333][color=#333333][img=,690,387]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/08/201908261137379899_2144_2576605_3.jpg!w690x387.jpg[/img][/color][/color]

第一次发原创，记录一次有（cao）趣（dan）的溶残方法开发和验证过程 样品是一个申报的新药，结构就不公开了，这里说下样品一些性质。 性质1：分子量896，结构中含一个15元环； 性质2：多个酸碱中心，样品在最后一步工艺中用异辛酸钠成盐，最终成钠盐； 性质3：样品在纯的水、已经、乙醇溶解性差，甲醇中略溶，易溶与乙腈-水（1:1）； 性质4：由于带酸碱性，在不同pH下呈现不同的共轭形态，当在酸性下（pH＜7）样品溶液变黄色，并析出黄色沉淀； 性质5：在一次强降解实验中发现性质4中的沉淀可溶于甲醇。 好了，基本背景交代完毕，下面就是实验部分，因为工艺最后一步用了异辛酸钠，要对终产物里残留的异辛酸钠或者异辛酸进行监控，异辛酸的结构和性质是这样的。[align=center][img=,558,320]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709292301_01_2016359_3.png[/img][/align][align=center][/align][align=left] 而异辛酸钠就是成了钠盐，性状由油状液体变成固体（易吸水），溶解度跟酸也差不多。[/align][align=left] 一开始看到溶剂沸点228℃时，GC是有点拒绝的，一个溶残飚到两百多度，你考虑过其他溶残的感受么，于是就没有太多考虑[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]气相[/url]，而且结构里拖着一条长链（事后发现这是条拉我下坑的链！），虽然是个酸（盐），但保留应该不弱，于是毫不犹豫的设计实验方案了。[/align][align=left] 流动相哗哗哗的倒着，容量瓶发出叮叮叮的碰撞声，就像对天平打印机发起挑战，12月27日开始了第一次验证实验。称量、溶解、稀释、定容，一切都顺利的进行着，直到配制加标溶液，出现如下一幕，往供试品溶液加入异辛酸对照溶液时产生黄色沉淀。[/align][align=center][img=,389,297]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709292305_01_2016359_3.png[/img][/align][align=left] 面对突如其来的情况，我承认当时我就懵B了，更别说马上找出沉淀的原因和解决方法，试过把溶液过滤掉，但也是然并卵，放置一会又会浑浊，这样的溶液拿去进样，进样针稳稳的堵，最后只好停止配样。经过一个晚上思考，终于记起了样品的性质4（参见上文），然后就想着不产生沉淀的方法，既然遇酸就沉淀，那我就用异辛酸钠做对照吧。[/align][align=left] 流动相哗哗哗的又倒着，容量瓶又发出叮叮叮的碰撞声，12月28日开始了第二次验证实验。与第一次开始时一样，一切都顺利的进行着，当要配制加标溶液时，抖着小手往样品加入对照溶液，心率直接上120，相信薛定谔第一次遇到猫也差不多这心情，最终得到了澄清的供试品加标溶液。然后就顺理成章的把溶液配完，放进样品盘，序列运行，回家睡觉。[/align][align=left] 第二天上班，像往常一样打开结果看，嗯，进展还顺利，灵敏度溶液S/N有28，6针对照RSD是2.3%，空白没干扰，然鹅当我打开加标时，结果是这样的……[/align][align=center][img=,558,184]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709292307_01_2016359_3.png[/img][/align][align=left] 如上图，在异辛酸钠出峰处，加标溶液的峰明显小于对照溶液，而且在前面8min左右出一个胖胖的峰，而且加标溶液中红框的两个峰面积加起来与对照溶液异辛酸钠峰面积很接近。我再一次懵B了。[/align][align=center][img=,296,207]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709292308_01_2016359_3.png[/img][/align][align=left] 接连两次失利让我渐渐有一种液相不适合测这个的感觉，加上仪器不断高浓度进样（供试品浓度30mg/ml），造成针座出现严重残留。[/align][align=center][img=空白出现明显残留,558,191]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709292309_01_2016359_3.png[/img][/align][align=left] 由于个人原因，必须要在1月4日之前搞定这个实验。经过元旦一天的休息后，于是我开始尝试用[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]气相[/url]，首先选一根合适的柱子，结果如下。[/align][align=center][img=,558,216]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709292310_01_2016359_3.png[/img][/align][align=left] DB-1(30m×0.32mm，1.5μm)和DB-624(30m×0.32mm，1.8μm)色谱柱上异辛酸色谱峰峰形前沿；在DB-WAX(30m×0.32mm，0.5μm)色谱柱上异辛酸峰形拖尾；而在DB-FFAP(30m×0.32mm，1.0μm)色谱柱上异辛酸峰形较好，就你了FFAP。[/align][align=left] 虽然时间上很紧急，但这次我并没有急着设计实验方案和配样，先把各种溶液试水一下。既然用[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]气相[/url]，那对照溶液还是得用异辛酸配制，so还是回到最开始的怎么解决沉淀的问题。在一次偶然的冥想中，突然记起样品性质5，于是立马动起手来，往稀释剂中混入一点甲醇，沉淀如愿消失了！[/align][align=center][img=,558,280]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709292312_01_2016359_3.png[/img][/align][align=left] 正当我认为问题解决了的时候，新的问题又双叒叕出现了！[/align][align=center][img=,558,219]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709292313_01_2016359_3.png[/img][/align][align=center][/align][align=center][img=,558,218]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709292313_02_2016359_3.png[/img][/align][align=left] 加标溶液和对照溶液这对磨死我的小妖精，前者总是比后者小一截；而且多次进对照后空白很容易出现残留干扰；连续6针对照溶液异辛酸的峰面积一针比一针大，第6针是第1针的2.5倍。[/align][align=left] 6针翻2.5倍，比股票涨停还要猛啊有木有，简直惊呆了作为实验狗的我，毕竟干了7年我的工资都没涨这么快过……[/align][align=left] 对于连番爆出的问题，我表示已经麻木了，心里毫无波澜，甚至还有点上瘾。[/align][align=center][img=,370,362]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709292314_01_2016359_3.png[/img][/align][align=left] 对于残留的问题，原因也不难分析，针对[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]气相[/url]直接进样，残留基本上都是在衬管引起的，由于衬管表面玻璃材质以及玻璃棉灭活不完全，或者玻璃棉丝断裂产生内部横截面，不能保证整根衬管内部都100%惰性，很容易对一些性质较活泼的化合物引起吸附，而异辛酸有羧基，带酸性，正对衬管的胃口，这也是[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]气相[/url]做酸碱性较强的化合物时，峰形往往不完美的原因之一。[/align][align=left] 原因分析了，问题解决也不难了，我决定用一个比较粗暴的方法，就是在不影响供试品的前提下，向溶液中加入一种酸性更强的酸（比如盐酸），原理就是与异辛酸竞争陈管内的吸附点，把异辛酸顶出来，从而减少对其的吸附。后来也在百度和中国药典里看到类似的2-乙基己酸（即异辛酸）的溶残方法，所以有时候遇到问题，先在网上查一下，或者翻翻药典也是很有用的，当然这是后话了。[/align][align=left] 然后就是开始尝试往配制的溶液中加入酸溶液了，所得结果如下[/align][align=center][img=,558,199]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709292316_01_2016359_3.png[/img][/align][align=center][/align][align=center][img=,573,210]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709292316_02_2016359_3.png[/img][/align][align=left] 吸附和加标溶液的问题都消失了，终……终于可以开始设计方案做验证了。流动相哗哗…啊不对，[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]气相[/url]不用倒流动相，1月3日开始了第3次验证实验，这一次顺利完成了！最终方法如下：[/align][align=center][img=,558,295]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709292317_01_2016359_3.png[/img][/align][align=left] 这是最终溶液配制方案：[/align][align=center][img=,558,411]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709292318_01_2016359_3.png[/img][/align][align=left] 最终的验证结果（更具体的峰面积和称样数据就不列出了）[/align][align=left] 1.系统适用性[/align][align=left] 空白溶液对异辛酸的测定无背景干扰；灵敏度溶液中异辛酸的信噪比为47.0(≥10)；对照溶液连续6针的异辛酸峰面积的RSD为2.52%(≤10.0%)。系统适用性符合检测要求。[/align][align=left] 2.专属性[/align][align=left] 空白溶液与供试品溶液及100%供试品加标溶液比较，空白溶液在对照溶液和供试品溶液的异辛酸峰保留时间处无干扰；供试品溶液及供试品加标溶液与对照溶液中异辛酸溶剂峰的保留时间一致；与供试品溶液相比，供试品加标溶液色谱图中异辛酸保留时间处峰面积明显增强。方法专属性良好。[/align][align=left] 3.精密度[/align][align=left] （1）分析重复性 由分析人员甲配制的6份分析重复性试验溶液中，异辛酸含量的RSD值为2.43%（≤10.0%）。[/align][align=left] （2）中间精密度[/align][align=left] 由分析人员乙配制的6份分析重复性试验溶液中，异辛酸含量的RSD值为2.06%、（≤10.0%）；分析人员甲与乙分别配制的12份分析重复性试验溶液中，异辛酸含量的RSD为2.15%（≤10.0%）。方法精密度良好。[/align][align=left] 4. 定量限和检测限[/align][align=left] 异辛酸定量限溶液浓度水平为250ppm（≤500ppm）；该浓度水平异辛酸溶剂峰的信噪比大于10，连续3次进样峰面积的RSD值小于10.0%。方法定量限满足检测要求。[/align][align=left] 异辛酸检测限浓度水平为100ppm；该浓度水平异辛酸溶剂峰的信噪比大于3。[/align][align=left] 5. 线性及范围[/align][align=left] 异辛酸从定量限至限度水平的200%呈线性关系，线性相关系数r分别为0.9998（≥0.990），Y轴截距与100%限度浓度峰面积比值的绝对值分别为1.8%（≤10.0%）。线性及范围符合异辛酸定量检测的要求。[/align][align=left] 6. 准确度[/align][align=left] 50%，100%和150%三个加标浓度水平共9份回收率试验溶液中，异辛酸的回收率单值均在80.0%~120.0%范围内，回收率单值的RSD不超过10.0%；平均回收率为98.1%。方法准确度良好。[/align][align=left] 7. 耐用性[/align][align=left] 在变化的各色谱条件下，灵敏度溶液的信噪比均大于10，对照溶液3次测定异辛酸峰峰面积RSD均小于10.0%。[/align][align=left] 实验结果表明初始柱温在168℃~172℃内变化，流速在1.8ml/min~2.2ml/min范围内变化，同一规格型号的不同色谱柱，方法耐受性良好。[/align][align=left] 好了，实验和文章到此都终于结束，对于上文，我总结一下实验过程的几点感想：[/align][align=left] （1）对于研发人员来说，样品性质都是未知的，要善于发现和联想，说不定几个月前出现的一个小现象就是解决紧急问题的关键；[/align][align=left] （2）由于时间相当紧迫，实验中很多细节未进行进一步研究和优化；[/align][align=left] （3）第1次验证中，假如在稀释液中也混入甲醇，沉淀问题就能解决，只是当时完全没想起样品的性质5；[/align][align=left] （4）第2次验证中，发现加标溶液中异辛酸前面出一个胖胖的峰，其实可以接出来送MS，进而分析原因；[/align][align=left] （5）最终的方法中，甲醇的比例，加入盐酸的比例以及盐酸溶液的浓度都未摸索过（时间紧迫）；[/align][align=left] （6）最终的方法中，异辛酸峰形还是有点拖尾，如果把色谱柱DB-FFAP(30m×0.32mm，1.0μm)换成0.5μm膜厚，也许能得到峰形更好，耗时更短的方法（时间紧迫，拿起一根觉得可以就用）；[/align][align=left] （7）对于新药研发分析人员，查阅文献的能力固然重要，但偶尔翻翻药典的正文，也许会有新的发现，如果我在之前看到药典的方法，也许就能少一半工作量，以及码少一半字；[/align][align=left] （8）第一次发原创，重在参与，写的好的，能给大家提供点思路或者什么的固然是好，写的不好的，也烦请尽管提出来；[/align][align=left] （9）最后的最后，吐槽一下仪器论坛这个话题发表编辑界面，虽然这里主要是发科技文章，但和微信公众平台的编辑界面比较，真是难看兼不好用[img]http://simg.instrument.com.cn/bbs/images/default/em09501.gif[/img][/align]

之所以说这个项目倍感辛酸，是因为在显色过程中加的乙酸铵缓冲溶液真的很酸，酸的刺鼻。每次做这铁就像掉进醋缸一样……http://simg.instrument.com.cn/bbs/images/default/em09509.gif而且这个项目还不能上原吸，直接用火焰法喷出来会省事点，但是火焰法的检出限太高，直接0.3mg/L，0.3mg/L是生活饮用水的国标限值好吧？！我们的水样里边一般都在检出限上下晃悠，偶尔会有地下水在0.3mg/L左右，所以省事儿的方法根本不适用，苦命的我还得用化学法做。还好我做铁的准确度还行，质控、加标、曲线相关系数啥的还比较让我满意，在我接手做的这段时间里，我觉得做铁最关键的是要控制好显色温度，所以我一般在加完所有试剂后都放在电热套上，利用余热增加显色温度，冬天的时候就放在实验室的暖气上加温，效果还不错呢~~以下为操作规程：1.方法标准：《生活饮用水标准检验方法》GB/T5750.6中 2.2 二氮杂菲分光光度法本法最低检测质量为2.5μg（以Fe计），若取50mL水样，则最低检测质量浓度为0.05mg/L。钴、铜超过5mg/L,镍超过2mg/L，锌超过铁的10倍有干扰。铋、镉、汞、钼和银可与二氮杂菲试剂产生浑浊。2.试剂及仪器2.1盐酸溶液（1+1）。2.2 乙酸铵缓冲溶液：称取250g乙酸铵（NH4C2H3O2），溶于150mL纯水中，加入700mL冰乙酸，混匀。2.3 盐酸羟胺溶液（100g/L）：称取10g盐酸羟胺（NH2OH?HCL），溶于纯水中并稀释至100mL。2.4 二氮杂菲溶液(1.0g/L）：称取0.1g二氮杂菲（C12H8N2·H2O又名1，10一二氮杂菲，邻二氮菲或邻菲绕啉，有水合物及盐酸盐两种，均可用。）溶解于加有2滴盐酸ρ20=1.19g/mL)的纯水中，并稀至100mL。此溶液1mL可测定100ug以下的低铁。2.5 铁标准溶液：购于国家标物中心。 注：用火焰法做需要在标准中加入1%硝酸，但是用化学法做时是不能够加入酸，否则做不出曲线来，只用纯水配储备液和使用液就可以！！2.6 可见分光光度计。2.7 50mL比色管。（要用硝酸泡）2.8 100mL锥形瓶。3.分析步骤3.1 吸取50.0 mL混匀的水样（含铁量超过50ug时，可取适量水样加纯水稀释至50 mL）于150 mL 锥形瓶中。3.2 另取100 mL锥形瓶6个，分别加入铁标准使用溶液后，各加纯水至50 mL，加入量如下：标准点123456体积（mL）00.250.501.001.502.00浓度（mg/L）00.0500.1000.2000.3000.400标准系列显色过程如下（所有试剂已加完）：http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2013/08/201308181657_458423_2397801_3.jpghttp://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2013/08/201308181657_458424_2397801_3.jpg3.3 向水样及标准系列锥形瓶中各加4 mL盐酸溶液和1 mL盐酸羟胺溶液，小火煮沸至约剩30 mL，冷却至室温后移入50 mL比色管。给大家见识一下我的秘密武器，在煮沸过程中为了防止暴沸，一般会加入沸石，我们实验室里买的是玻璃球，但是特别滑，煮完了往比色管倒的时候经常会跑进比色管里，所以我砸了一个坩埚，处理过之后，用纯水洗净，用来做沸石，从不会在移液的时候跑出来，效果很好的呢~~http://simg.instrument.com.cn/bbs/images/default/em09502.gifhttp://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2013/08/201308181713_458426_2397801_3.jpg http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2013/08/201308181713_458425_2397801_3.jpg 需要解释下这个煮沸过程的一些知识：水样先经加酸煮费溶解铁的难溶化合物，同时消除氰化物，亚硝酸盐，多磷酸盐的干扰。加入盐酸羟胺将高铁还原为低铁，还可消除氧化剂的干扰。水样过滤后，不加盐酸羟胺，可测定溶解性低铁含量。水样过滤后，加盐酸溶液和盐酸羟胺，测定结果为溶解性总铁含量。水样先经加酸煮费，使难溶性铁 的化合物溶解，经盐酸羟胺处理后，测定结果为总铁含量。3.4 向水样及标准系列比色管各加2.0mL二氮杂菲，混匀后再加10.0mL乙酸铵缓冲溶液，各加纯水至50mL，混匀，放置10-15分钟（视情况可延长，比如低温情况下）。3.5 于510nm波长，用2cm比色皿，以纯水为参比，测定吸光度。以下是标准曲线和部分水样的检测结果：http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2013/08/201308301745_461016_2397801_3.jpg4.检测结果 铁的生活饮用水国家