酪氨酸磷酸化抑制剂

仪器信息网讯 近日，中国科学院大连物理研究所生物分子高效分离与表征研究组(1810组)张丽华研究员和张玉奎院士团队，蛋白组组学分析最新成果发表于《自然-通讯》(Nature Communications)上。团队发展了N-磷酸化肽段高选择性富集新方法，并结合肽段的高效分离和高灵敏度鉴定，实现了N-磷酸化蛋白质组的深度覆盖分析。　　与研究相对深入的发生在丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸侧链氨基上的蛋白质O-磷酸化修饰相比，发生在蛋白质组氨酸、精氨酸和赖氨酸上的N-磷酸化修饰，由于P-N酰胺键具有较高的吉布斯自由能，且易发生水解，目前仍缺乏有效的N-磷酸化蛋白质组分析方法，制约了人们对其生物学功能的认识。　　团队研制了具有核壳结构的亚二微米硅球，并通过在硅球表面键合双二甲基吡啶胺双锌分子，在中性条件下实现了N-磷酸化肽段的高效、高选择性、快速富集 通过基于该材料的on-tip富集方法和液质联用分离鉴定的结合，不仅从HeLa细胞中鉴定到3384个N-磷酸化位点(目前最大的哺乳动物N-磷酸化数据集)，而且还发现N-磷酸化位点附近亮氨酸高度表达 建立的N-磷酸化蛋白质组分析新方法不仅为深入研究其生物学功能提供了基础数据，而且也为推动精准医学、合成生物学等领域的发展提供了技术支撑。　　上述工作得到国家自然科学基金、国家重点研发计划、中科院大连化物所创新基金等项目的资助。文章链接：《自然-通讯》(Nature Communications)。

大家好，本周为大家介绍一篇本课题组发表在ACS Chem. Biol.上的文章，Insights into Phosphorylation-Induced Protein Allostery and Conformational Dynamics of Glycogen Phosphorylase via Integrative Structural Mass Spectrometry and In Silico Modeling1。变构调节在自然界中广泛存在，可以用于调控细胞过程。糖原磷酸化酶（GP）是第一个被鉴定出的与变构调节相关的磷酸化蛋白。GP是一个分子量约196kD的同源二聚体蛋白，是糖代谢中重要的组分，也是2型糖尿病及癌症的靶点。AMP结合以及Ser14的磷酸化介导了GP的变构调节，使其构象从非活化的T-state GPb（未磷酸化状态）转变为活化的R-state GPa（磷酸化状态）。即使目前X-射线晶体学法解析出了GP的原子级蛋白结构，但受限于较大分子量，其结构动态性的检测较为困难，因此与GP变构调节相关的结构动态变化过程仍较为模糊。核磁共振（NMR）谱及分子动力学（MD）模拟等是探究蛋白质结构动态性的常用方法，但NMR分析存在分子量上限，且样品消耗量大，MD模拟的时间尺度和力场准确度有限。质谱（MS）法具有快速、灵敏的特点，是蛋白质结构、动态性以及构象变化分析中强有力的一款技术。氢氘交换质谱（HDX-MS）通过监测蛋白骨架酰胺氢原子与溶液中氘的交换来反映蛋白质构象动态性，因此适用于探究由配体、蛋白结合或共价修饰引起的蛋白质构象变化。同时，多个软件实现了由HDX-MS数据计算保护因子（PFs）和吉布斯自由能，从而提取残基水平的蛋白动态性信息。此外，在先前的工作中2, 3，我们整合了native MS和top-down方法（native top-down，nTD-MS技术），成功实现了多个蛋白复合物的一级序列到高阶结构等多方面信息的检测（包括测序、翻译后修饰、配体结合、结构稳定性、朝向等）。整合多种结构质谱法（整合结构质谱法）可以有效填补传统生物物理法中结构到动态性联系中的空缺，更好地表征变构调控现象。本文整合了HDX-MS、nTD-MS、PF分析、MD模拟以及变构信号分析检测了磷酸化介导的GP变构调控的结构和动态性基础，为GP的变构调控过程提供了见解。根据X-射线晶体学结构报道（图1a），T-state GPb转变为R-state GPa时，二聚体界面中N-末端尾部、α2、cap’（图1b）以及tower-tower helices区（图1c）发生了明显的结构重排，导致催化位点开放，从而底物磷酸吡哆醛（PLP）可以结合。尽管有晶体学报道，但与变构调控关联的构象动态性仍有待探寻。图1.（a）磷酸化介导T-state GPb（PDB：8GPB）向R-state GPa（PDB：1GPA）的构象转变；亚基相互作用界面：（b）C端区域和（c）tower-tower helices，GPb为蓝色，GPa为绿色。首先我们通过nTD-MS进行了检测。如图2a、b，谱图中观察到了GPb的单体和二聚体信号，其中二聚体为主要形式；GPa除了单体和二聚体外，谱图中还存在少量四聚体，但仍以二聚体为主要形式。当增加sampling cone（SC）电压时，GPb、GPa保留了其二聚体形式（图2c、d）。随后我们选择离子（29+）并在trap池中进行了碎裂（图2e、f、g、h），谱图低质荷比区GPa的碎片相对峰强度较GPb高，说明GP的二聚体互作界面较为稳定，且GPb亚基结构较GPa稳定。nTD-MS不仅能够探究GPb、GPa的结构差异，也能够为接下来的HDX-MS实验做好前期样品质量检查工作。图2.不同活化条件下GPb、GPa的nTD-MS谱图。（a、b）SC=40V；（c、d）SC=150V；（e、f）SC=150V、trap=100eV；（g，h）SC=150V、trap=200eV。左侧为GPb，右侧为GPa。随后我们进行了HDX-MS实验。图3a中展示了五个时间点的HDX heat map。图3b为通过PyHDX软件计算产生的PF值。其中N-端（1-22）以及tower helix前的loop区域（256-261）的氘代值较高、PF值较低，说明这些区域较为柔性或是结构较为无序。此外我们发现，tower-tower helices（262-276）区域的氘代值较低、PF值较高，表明helices的旋转可能是由前端可塑性铰链区触发的，而非helices本身的变形和重塑引起的，这些发现在晶体结构数据中均有吻合之处。除这两个区域外，GPa和GPb基本保持了稳定的整体结构。而从1μs原子级MD模拟计算得到的均方根波动（RMSF）和溶剂可及表面（SASA）中我们也发现（图3c），这两个区域数据与HDX-MS信息有所吻合，但MD模拟中部分区域未和HDX-MS相吻合的区域可能跟序列覆盖不足相关。图3. （a、d）GPb和GPa在不同标记时间下的氘代热图并映射到结构中（PDB: 1GPA）。（b、e）基于HDX-MS数据计算得到的PF值并映射到晶体结构中。（c、f）MD模拟中RMSF和SASA值并映射到结构中。从氘代差异图（图4a）中可以看出，4个区域呈氘代降低趋势（红色方框），多个区域呈氘代上升趋势（蓝色方框）（GPa-GPb）。而PF差的变化趋势与氘代变化趋势基本一致（图4b）。由数据可知，N-端和tower-tower helices的变化说明磷酸化介导的变构稳定了这两个区域，α1-cap-α2区域的动态性轻微下降。除此之外多个区域（尤其是tower-tower helices序列后的区域）均表现为PF值下降，说明相比于GPb，GPa催化位点附近的区域动态性增强了。接下来我们根据HDX kinetic plot特征将其进行了分类，并详细讨论了所属区域的变化。图4.（a）GPa-GPb HDX-MS的氘代差异图。（b）GPb到GPa PF的变化。 首先是N-端和C-端的变化（图5）。N-端残基1-22表现氘代下降，这说明N-端具有一定可塑性。受N-端区域磷酸化和结构变化影响，C-端区域也产生了一定的变化。此外，残基30-50（cap区）和残基111-117（α4back-loop）区表现氘代下降，而103-109（α4front）表现氘代上升。根据晶体结构推测，cap区和α4back-loop的氘代变化受N-末端变化影响，原有的残基相互作用被打破，形成新的残基间相互作用，同时这两个区域也经历了结构重排，因此表现出较明显的氘代变化。残基88-99（β2-α3）和残基125-141（β3-L-α6）氘代上升。总的来说，磷酸化使得cap′/α2界面互作增强了，同时磷酸化基团和精氨酸残基的静电相互作用是cap区产生变化的主要原因，而α1和α2起到锚定作用，其相对位置基本保持不变。图5.GPb（a）和GPa（b）的N-端和C-端区域的局部结构和HDX动力学曲线（c）。 此外，tower-tower helices（α7，残基262-278）区的变化同样值得关注（图6）。250s loop是表面暴露区域，未与其他区域发生接触，其氘代下降可能是因为自身结构的收缩。而肽段262-267和268-274氘代下降提示该区域可能发生了低周转率或强互作的结合反应。280s loop区氘代值上升。这些变化均说明，tower-tower helix的角度的改变不仅影响了二聚体界面结构，而且还影响了其靠近催化位点的周围区域。因此我们结合晶体结构推测，磷酸化和N-端相对位置的改变，使250s loop自身结构收缩，从而打破了Tyr262' -Pro281和Tyr262-Tyr280′之间的相互作用，导致两个亚基的tower helices发生相对滑动，倾斜角度增加。图6.GPb（a）和GPa（b）tower helix区域的局部结构和HDX动力学曲线（c）。 最后是催化位点、PLP结合位点和糖原存储位点的变化情况（图7）。催化位点周围多数区域均表现氘代上升趋势。我们推测，随着Pro281、Ile165和Asn133间的相互作用被打破，Arg569与Ile165、Pro281、Asn133间的互作也随之打破，因此催化位点和PLP结合位点周围的残基溶剂可及性上升，局部区域结构变得更为灵活，催化位点开放并转变为活化构象。糖原储存位点位于GP表面，距离催化位点30Å，除了α23（残基699−708）外，HDX-MS在糖原存储区没有观察到明显的变化。图7.GPb（a）和GPa（b）的催化位点和PLP（橙色）结合位点的局部结构和HDX动力学曲线（c）。结合以上所有数据，我们对磷酸化调节的动态机制进行了推测（流程图1）。磷酸化后，N-端尾部残基与acidic patch的互作被打破，也导致N-端尾部的有序化以及C-端尾部的无序化以及伴随的其他结构变化。通过在pSer14和Arg69和Arg43′之间形成新的盐桥，N-端残基被重定位，随之带来的是Asp838和His36′间的盐桥断裂。随着三级和四级结构的转变，250s loop收缩并发挥类似“门环”的作用，当其收缩时，Tyr262′-Pro281与Tyr262-Tyr280′之间的相互作用、276-279区与162-164区之间的氢键也被打破，导致tower helix发生相对滑动，tower-tower helices之间的作用被打破，同时将结构变化传递到催化位点。最后，280s loop和催化位点以及PLP结合位点附近的残基松动，通往催化位点和底物磷酸盐识别位点的通道打开，酶得以活化。流程图1.GP变构调节过程中，被打破（蓝色）或新形成的（红色）关键残基相互作用。 本文整合nTD-MS、HDX-MS、PF分析和MD模拟检测了GP磷酸化变构调节过程的结构和动态基础，通过该整合结构手段揭示了GP构象柔性、局部动态性以及长程变构调控构象变化中值得关注的信息。各个方法具有各自的优势，但也在一定层面存在局限，我们期待将HDX-MS信息与计算模拟信息进行更深度的整合以实现二者对蛋白质结构更精确的分析。撰稿：罗宇翔编辑：李惠琳原文：Insights into Phosphorylation-Induced Protein Allostery and Conformational Dynamics of Glycogen Phosphorylase via Integrative Structural Mass Spectrometry and In Silico Modeling李惠琳课题组网址：https://www.x-mol.com/groups/li_huilin参考文献1. Huang, J. Chu, X. Luo, Y. Wang, Y. Zhang, Y. Zhang, Y. Li, H., Insights into Phosphorylation-Induced Protein Allostery and Conformational Dynamics ofGlycogen Phosphorylase via Integrative Structural Mass Spectrometry and In Silico Modeling. ACS Chem. Biol. 2022.2. Li, H. Nguyen, H. H. Ogorzalek Loo, R. R. Campuzano, I. D. G. Loo, J. A., An integrated native mass spectrometry and top-down proteomics method that connects sequence to structure and function of macromolecular complexes. Nat. Chem. 2018, 10 (2), 139-148.3. Li, H. Wongkongkathep, P. Van Orden, S. L. Ogorzalek Loo, R. R. Loo, J. A., Revealing ligand binding sites and quantifying subunit variants of noncovalent protein complexes in a single native top-down FTICR MS experiment. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2014, 25 (12), 2060-8.

p 　　 span style=" color: rgb(255, 192, 0) " strong 2018年8月9日消息，根据国家食品药品监督管理总局药品审评中心(CDE)发布的公告，杭州艾森医药研究有限公司自主研发的马来酸艾维替尼被纳入新药上市优先审评程序。 /strong /span /p p style=" text-align: center " span style=" color: rgb(255, 192, 0) " strong img width=" 600" height=" 444" title=" 2018.8.10 1-1.jpg" style=" width: 434px height: 257px " src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201808/insimg/39d0bc55-65f5-45da-8c78-b87fe592863d.jpg" / /strong /span /p p style=" text-align: center " 　　 span style=" font-size: 14px " 马来酸艾维替尼进入优先审评，图来自CDE官方网站 /span /p p 　　艾维替尼是我国首个原创的第三代EGFR靶向抑制剂，主要用于治疗具有EGFR T790M突变阳性的非小细胞肺癌，是十二五国家“重大新药创制”科技重大专项的重要成果之一。 /p p 　　2014年9月，艾维替尼同时获中国CFDA和美国FDA临床试验批准，其新药上市申请于2018年6月22日获CDE承办。此次，艾维替尼作为十三五国家“重大新药创制”科技重大专项，被CDE纳入第三十一批优先审评程序。 /p p 　　 span style=" color: rgb(255, 192, 0) " strong 国家癌症中心今年发布的最新报告显示，我国肺癌每年新发病例约78.1万，发病率和死亡率均高居榜首。非小细胞肺癌(NSCLC)占比约80%-85%。EGFR-TKI(表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂)是一线治疗EGFR基因突变NSCLC的标准方法，已经在肺癌治疗领域广泛使用，但也因此有大量治疗后出现T790M耐药突变的病人，迫切需要新一代的临床治疗。 /strong /span /p p 　　三年来，通过对大量晚期耐药肺癌病人的疗效和安全性评估，艾维替尼对EGFR T790M耐药突变的晚期肺癌病人具有显著疗效及安全性。与此同时，艾维替尼部分临床数据已先后在中国临床肿瘤学会(CSCO)、欧洲临床肿瘤大会(ESMO)、世界肺癌大会(WCLC)上做大会报告，国际反响热烈。目前，艾维替尼在美国7家癌症中心及法国、西班牙等国开展国际临床研究。 /p p 　　作为国内首个原创的第三代EGFR抗肺癌新药，艾维替尼如能尽快获批上市，将为广大患者提供新的治疗选择，解决我国目前最大的肿瘤临床急需，缓解患者沉重的医疗负担。 /p p /p

蛋白质磷酸化是在激酶催化下将磷酸基团转移到底物蛋白质上的可逆过程，是能够调控蛋白质结构与功能且参与细胞内信号转导的重要翻译后修饰，在植物的生长、发育、环境适应以及作物的产量和品质调控中发挥着重要作用。深度解析磷酸化蛋白质组，是探讨磷酸化如何参与这些生物学过程以及筛选与作物重要农艺性状相关的关键磷酸化靶点的有效手段。然而，与动物相比，植物磷酸化蛋白质组的深度解析在技术上更具挑战性。这是由于植物细胞具有致密的细胞壁和大量的色素以及其他次生代谢物。前者增加了蛋白质提取的难度，而后者干扰了磷酸肽富集的效率和特异性。 中国科学院遗传与发育生物学研究所汪迎春研究组通过探索一系列的实验条件，研发出高效的植物磷酸化蛋白质组学新技术。该技术的主要特点是利用脱氧胆酸钠高效抽提植物蛋白，同时消除常规方法中导致样品损失和灵敏度降低的两个步骤，即在蛋白酶消化前的样品净化和在磷酸肽富集前的脱盐处理，在色素与其他干扰分子共存的情况下进行高特异性、高灵敏度地磷酸肽富集。 科研人员应用这一方法，在拟南芥、水稻、番茄和衣藻等绿色生物的组织中高效纯化磷酸化蛋白质组（单针质谱可鉴定约11,000个磷酸位点）。由于该技术主要面向高等植物及其他绿色生物（如衣藻），且操作简便，降低了实验所需的人力和试剂费用，因此命名为GreenPhos。GreenPhos可定量分析不同植物的磷酸化蛋白组，分析深度深、定量重复性高，有望成为植物磷酸化蛋白组学的通用技术。研究人员应用该技术，深度解析了拟南芥响应不同时长盐胁迫的差异磷酸化蛋白质组，发现了包括剪接体蛋白和一些激酶响应盐胁迫的磷酸化事件。 11月27日，相关研究成果在线发表在《分子植物》（Molecular Plant，DOI：10.1016/j.molp.2023.11.010）上。研究工作得到国家重点研发计划与中国科学院战略性先导科技专项的支持。中国科学院植物研究所的科研人员参与研究。GreenPhos工作流程及多种绿色生物磷酸化蛋白质组鉴定结果

在国家自然科学基金的大力支持下(项目资助号：21021004)，中国科学院大连化学物理研究所邹汉法研究员在磷酸化蛋白质组分析技术方面获得新进展，相关成果发表在最近一期的Nature Protocols上(2013，8，461-480)。(http://www.nature.com/nprot/journal/v8/n3/abs/ nprot.2013.010.html)。 　　固定化金属离子亲和色谱(IMAC) 是磷酸化蛋白质组学研究中最常用的磷酸化肽段富集技术之一，常规的IMAC使用的螯合基团有三羧甲基乙二胺、次氨基乙酸、亚氨基二乙酸等，在螯合铁、镓等金属离子后可用于磷酸肽的富集。其缺点是特异性不高，在富集磷酸肽的同时也富集了一些酸性肽。研究人员发现了磷酸酯锆或钛表面与磷酸肽之间的高特异性相互作用，并利用这一相互作用建立了以磷酸基团为螯合配体的新一代固定化金属离子亲和色谱技术。实验表明，该新型IMAC对磷酸肽富集的特异性优异，可以有效避免酸性肽段的非特异性吸附。与传统的IMAC相比较，其对磷酸肽的富集能力提高3-10倍，从而大大提高了蛋白质磷酸化分析的检测灵敏度和鉴定覆盖率。该新型IMAC方法自2006年发表首篇论文以来，已在Mol. Cell. Proteomics, J. Proteome Res., Anal. Chem.等蛋白质组学与分析化学权威期刊发表论文20余篇，其中2007年发表在Mol. Cell. Proteomics的一篇论文已经被引用110余次。采用该方法为核心技术进行了人类肝脏蛋白质磷酸化的规模化分离鉴定，建立了迄今为止国际上人类肝脏蛋白质磷酸化的最大数据集 (Mol. Cell. Proteomics，2012，11，1070-1083)。

上期，展鹏教授团队分享并阐述了冠状病毒的基本结构、冠状病毒的生命周期、抗冠状病毒药物的主要靶点等内容，本期将分享靶向冠状病毒刺突蛋白、RdRp、蛋白酶及宿主靶标的一系列冠状病毒广谱抑制剂，以及其对抗击新冠肺炎疫情、预防未来的冠状病毒传播具有的重要意义。本文讨论的冠状病毒广谱抑制剂是针对冠状 病毒与宿主的关键靶点开发的抗病毒化合物。现 阶段,根据这类化合物靶向的生理过程不同，分别靶向冠状病毒的侵入过程、RNA复制过程、多聚 蛋白裂解过程以及宿主靶标。4.1靶向冠状病毒侵入过程的抑制剂在抗病毒药物中，侵入抑制剂可以使病毒的生命周期停止在第一步，使其对宿主的危害最小化。SARS-CoV和SARS-CoV-2是通过刺突蛋白与人类呼吸道上皮细胞的ACE2结合而侵入[16]， 而MERS侵入所利用的胞外受体是CD26,也称 作二肽基肽酶(DPP4)。刺突蛋白是一种I型跨膜蛋白(图3),分子 表面高度糖基化，它组装成三聚体后，分布在病毒颗粒的最外层，形成了冠状病毒独特的外观。所有冠状病毒刺突蛋白的胞外部分都是由两个相同的结构域结合而成:氨基端的S1亚单位与受体结 合相关，含有受体结合域(receptor binding domain,RBD)；羧基端的S2亚单位含有融合肽 (fusion peptide)，与病毒融合相关。在S1完成结合后,S2被细胞表面的TMPRSS2蛋白酶裂解，该过程是病毒与宿主细胞膜融合所必需的[17]。因此，靶向S蛋白或TMPRSS2的分子可成为有效的冠状病毒侵入抑制剂。Figure 3 (A-B ) Structure of S protein trimer, from different angles of view ( PDB code ：6XM5) ； ( C) Structure of S protein monomer and location of NTD and RBD； (D) Binding mode of S protein with ACE2 ( PDB code： 7KNY)4.1.1 靶向S蛋白的侵入抑制剂在S蛋白抑制剂中，肽类具有高效、低毒的优势[18]。基于ACE2胞外序列设计的水溶性肽 作为潜在的侵入抑制剂曾受到重视，但其体内半衰期短，难以转运到肺泡[19]。为提高成药性, Lei[20]将ACE2片段与人免疫球蛋白IgGl的Fc结构域结合，提高了血浆中稳定性并增强了结合力。目前,已设计并合成了一系列模拟ACE2的N端螺旋结构域的肽类化合物，如Barh[21]通过扫 描现有的抗菌、抗病毒肽类数据库，得到了10个可能有效阻断S蛋白RBD区域与人ACE2作用 的肽类，但其体内外活性有待进一步研究。在此 基础上,Larue[22]设计了一系列针对刺突蛋白的 ACE2多肽类似物(SAP1 ~SAP6,表1),并在编码荧光素酶并负载SARS-CoV-2刺突蛋白的慢病毒侵染HEK293T-ACE2细胞体系中测定各个多 肽对病毒侵入的抑制作用,各物质活性以半数抑 制浓度(IC50)计量，活性最好为SAP6[(1.90 ± 0. 14) mmol • L-1 ]。同时，上述多肽对SARS- CoV-2刺突蛋白RBD区域的亲和力(Kd)最高为 (0.53 ±0.01) mmol-L-1(SAPl)。Table 1 Amino acid sequence of ACE2 derivatives targeting S proteinCompd.SequenceLocationSAP127-TFLDKFNHEAEDLFYQ42Helix-1SAP237-EDLFYQSSLS5Helix-1SAP379-LAQMYPL-85Helix-3SAP4352-GKGDFRYL-359Helix-11SAP524-QAKTFLDKFNHEA-36Helix-1SAP637-EDLFYQ42Helix-1Curreli等[23]基于ACE2蛋白结合区中30个 氨基酸残基长度的螺旋结构，以8 ~11碳的不饱 和炷链连接肽链上一定跨度的邻近氨基酸，设计了 4个高度螺旋化的装订肽(stapled peptide) NYBSP-1~NYBSP-4，并在 HT1080/ACE2 细胞 与人肺A549/ACE2细胞系中使用基于假病毒的 单循环方法测定了上述多肽分子的EC50值。其中3 个多肽分子显示出了潜在的抗病毒活性:HT1080/ ACE2 中的 EC50值为(1. 9 ~ 4. 1 )μmol• L-1 , A549/ACE2 中 EC50值为(2. 2 ~ 2. 8) μmol • L-1，且在最高测试剂量时，未显示出任何细胞毒性。使用SARS-CoV-2病毒侵染Vero E6细胞时， NYBSP-1显示出了最高的抑制活性，在 17.2 μmol• L-1的浓度完全阻止了细胞病理效应。NYBSP-2和NYBSP-4活性稍低,EC100值为 33 μmol • L-1,NYBSP-4在血浆中的半衰期为289 min,代谢稳定性好。Glasgow 采用“受体陷阱”，(receptor trap)策略，合成出高亲和性、高溶解性的ACE2胞外部分结构域，阻止病毒刺突蛋白与人体细胞表面的 ACE2的结合与入侵[24]。基于此策略设计的肽类分子使冠状病毒难以产生抗药性，并可以抑制几乎所有通过ACE2侵入细胞的冠状病毒[25]。在进一步研究中,Glasgow[24]利用计算机/实验组合的蛋白质工程方法，重新设计了能与SARS- CoV-2刺突蛋白结合的ACE2胞外可溶性区域 (氨基酸18-614) 。最终得到的ACE2变体对于单体刺突蛋白RBD区域的KD app ( apparent binding affinity)值已接近100 pmol• L-1。同时，最理想的 “受体陷阱”分子抑制SARS-CoV-2假病毒和真正 SARS-CoV-2 病毒的 IC50值已达到(10~100) ng-mL-1的范围。这类多肽分子有望真正实现针对利用ACE2入侵宿主细胞的冠状病毒的广谱抑制。由于S蛋白分子高度糖基化，可与多糖衍生物产生多种相互作用，引导人们去探索针对S蛋 白的多糖类抑制物。早在2013年,Milewska就证实了N-(2-羟丙基)-3-三甲氨基甲壳素氯化物 (HTCC,1,图4)及其疏水性修饰的同系物(HM- HTCC)是HCOV-NL63的潜在抑制剂[26]，并制备 了不同比例的氨基被甲壳素取代的HTCC衍生物, 各自具有对不同种类人冠状病毒的抑制作用[27]。近期，文献报道了在人呼吸道上皮细胞中，HTCC 具有抑制 SARS-CoV-2 和 MERS-CoV 的 活性。尽管HTCC中单个正电基团对于靶标的作用较弱，但冠状病毒连环化的特性和多聚物分 子中的多个位点协同作用使得HTCC可以稳定 结合S蛋白。目前，虽然HTCC仍未被批准用于 临床,但实验已经证明其在肺部局部给药的可行 性，且毒副作用极低口旳。综合考虑，上述各种甲 壳素衍生物联合使用，有望成为广谱抗人冠状病 毒感染的防治药物。Griffithsin（2,图4）是由海藻中分离得到的天 然血凝素，可利用糖基结构域结合病毒包膜糖蛋白中特定的寡糖[29]。已有研究表明,griffithsin可以与多种病毒表面的糖蛋白相互作用，包括HIV gpl20 以及 SARS-CoV 的 S 蛋白[30-31]。2016 年，Millet 等[32]报道了 griffithsin 对于 MERS-CoV 的抑制作用。在2μg • mL-1 浓度下,griffithsin抑制了 MERS 病毒对 Huh-7、MRC-5 和 Vero-81 细 胞系90%以上的感染性。针对迅速爆发的新冠 肺炎疫情，一系列针对griffithsin抗新冠病毒活性 的研究正在展开。Xia等[33]首先发现griffithsin 对SARS-CoV-2假病毒侵染呈现剂量依赖性地抑 制作用,EC50值为293 nmol• L-1 Cai等[34]网进一 步在体外试验中测定了 griffithsin对SARS-CoV- 2的抑制活性，结果表明,griffithsin对SARS-CoV- 2活病毒的EC50值达63 nmol• L-1，同时对S蛋白 介导的细胞间融合的EC50 值为323 nmol-L-1值得注意的是,该研究团队还报道了 griffithsin与肽 类冠状病毒侵入抑制剂EK1的协同作用。未来, griffithsin可以单独或与EK1联合制成鼻喷剂、吸入剂或凝胶，以预防或治疗新冠肺炎。4. 1.2 TMPRSS2 抑制剂在SARS-CoV或 MERS-CoV的刺突S蛋白 发挥作用之前，要依赖宿主细胞的跨膜蛋白酶 TMPRSS2将其裂解为S1和S2亚单位[35]。针对 这类蛋白酶的抑制剂也可用于阻断各种冠状病毒 的入侵过程。蔡莫司他（nafamostat,3,图5 ）最初用于治疗胰腺炎，后发现也是TMPRSS2抑制剂，对MERS- CoV具有拮抗活性[36]。进一步研究发现,蔡莫司 他甲磺酸盐对SARS-CoV-2的EC50值达到了纳摩尔级[37]。同时，在日本批准用于治疗胰腺炎的 药物甲磺酸卡莫司他（camostat mesilate,4,图5） 同样具有抑制TMPRSS2的活性[17]，在微摩尔浓度即可有效抑制MERS-CoV感染中合胞体的形成[38]，EC50值达到 0.11 μmol• L-1[39]:对 SARS- CoV-2的EC50值为87 nmol• L-1[37]o现阶段仍无 法确定该化合物能否在肺部达到抑制病毒的有效浓度[40]，但已有临床研究正在评估其对新冠肺炎的治疗作用。4. 1. 3 宿主细胞激酶抑制剂病毒在生命周期中利用了宿主细胞的若干信 号通路。冠状病毒以内吞方式入侵宿主细胞的过 程中，除S蛋白与ACE2的作用外,还需要Abel- son激酶（Abl）的介导。Abl是细胞中重要的管 家蛋白，参与正常细胞的多个生理过程，同时也与 病毒的入侵与复制密切联系，是开发广谱冠状病 毒抑制剂的有效靶点[41]。伊马替尼（imatinib ,5, 图5）是Abl的抑制剂，已被批准用于治疗慢性粒 细胞白血病。已有研究证实，伊马替尼通过阻断病毒颗粒与胞内体膜融合，从而抑制病毒以内吞 路径入胞，并在感染早期抑制SARS-CoV和 MERS-CoV的增殖關。据报道，伊马替尼抑制 SARS-CoV-2 增殖的 EC50值达到130 nmol-L-1 , 同时对SARS-CoV-2 S蛋白的RBD区域结合活 性高达2. 32 pimol-L-1,可通过双靶点作用有效 抑制SARS-CoV-2的侵入關。但在细胞实验中， 其毒性较为明显，用于治疗新冠肺炎或其他冠状 病毒感染前还要经过充分评估。目前，世界范围 内已有多项伊马替尼针对新冠肺炎的临床试验正 在进行(NCT04394416、EudraCT2020-001236-10、 NCT04357613)。4. 1. 4 组织蛋白酶L与Furin蛋白酶抑制剂组织蛋白酶L位于宿主细胞的胞内体，在无 TMPRSS2表达的细胞中，组织蛋白酶L发挥裂 解活性，介导病毒粒子与胞内体膜融合，从而完成侵入过程[44]。2003年,SARS-CoV疫情引起了人 们对组织蛋白酶L抑制剂研发的重视。随后的十几年内，已发现数种具有抗冠状病毒活性的组 织蛋白酶L抑制剂。其中，K11777(6,图5)是通 过筛选2 000余个人组织蛋白酶抑制剂发现的［45］，其对人体或某些寄生虫的半胱氨酸蛋白酶具 有显著抑制作用。K11777抑制SARS-CoV和 MERS-CoV感染的EC50值分别达到0.68 nmol• L-1与46 nmol• L-1，但其不可逆的共价结合机制可能导致较强的毒副作用。目前,K11777仅作为锥虫 病治疗药物进行临床试验M ,其针对SARS- CoV-2的抑制作用有待于进一步确证。SARS-CoV-2 S蛋白的裂解过程也可依赖 Furin蛋白酶进行。Cheng［47］研究了以蔡基荧光 素(naphthofluorescein, 7,图5 )为代表 的数个 Furin蛋白酶抑制剂，证实了此类分子可抑制SARS-CoV-2的感染进程及细胞病理效应。但冠状病毒侵入细胞的不同路径中的关键酶具有互补作用，因此单一种类的蛋白酶抑制剂难以起效［48］，而多种抑制剂联用的毒性可能大幅度增加。针对冠状病毒生命周期中宿主蛋白酶的药物应用尚存在一定的风险与挑战。4.2靶向冠状病毒RNA复制过程的抑制剂针对冠状病毒另一类极为重要的治疗靶标是 RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)，由非结构蛋白 nspl2、nsp7与nsp8结合构成。其活性位点高度保守，包括在一个β转角中突出的两个连续的天 冬氨酸残基样［49］,在不同的正链RNA病毒如冠状病毒和HCV中结构相似［50］。RdRp作为RNA复 制的工具，在病毒的复制中具有重要作用［51］。同 时该酶结构高度特异化,人体无同源酶，是药物开 发的优良靶点。4. 2. 1 RNA依赖的RNA聚合酶抑制剂瑞德西韦(remdesivir ,8,图6-A)是一种腺昔 酸类似物，作为RNA聚合酶的广谱抑制剂，能够抑制人与鼠冠状病毒［52］。更为重要的是，研究证明瑞德西韦在体外针对SARS-CoV-2具有抑制活性, 其抑制 SARS-CoV-2 的 EC50值为 0.77μmol• L-1， 且CC50值大于100 μmol• L-1[53]。基于“老药新用”的原则,2020年10月23日，瑞德西韦获得美 国FDA的正式使用批准，用于治疗12岁以上的新冠肺炎患者[54]。作为一种核昔类似物，瑞德西韦可以与 SARS-CoV、MERS-CoV 和 SARS-CoV-2 RdRp 的 NTP结合位点相互作用。其代谢后以核昔母体9 (GS-441524，图6-A)的形式掺入新生的子代 RNA链中，但允许子链RNA的进一步延长。瑞 德西韦在新生链中移动到-4位时,分子中1，-氰基 与RdRp侧链的Ser861残基发生空间上的碰撞，阻碍了 RdRp在RNA链上的进一步移动,进而导致RNA复制终止(图6-B)。由于终止作用是在瑞德西韦结合RdRp后发生的，该过程称为延迟链终止[54]。延迟链终止机制的RdRp抑制剂针对冠状病 毒具有一定的抗耐药性。包括SARS-CoV-2在内 的冠状病毒会编码具有核酸外切酶活性的nspl4,该酶可以在3,端切除掺入RNA链的异常 碱基,并重启正确的RNA合成[56]。在此机制下, 导致RNA合成即时终止的分子，如去除3,羟基 的核甘类似物，在插入后会被nspl4切除。相对地，在一定延迟后使RNA链合成终止的RdRp抑制剂可有效逃脱nspl4的校对。但研究证实，核酸外切酶仍会识别并切除部分含有瑞德西韦的子 链RNA,并重启RNA复制[57]。同时，病毒体外 传代实验中发现了针对瑞德西韦的耐药现象。与 SARS-CoV-2相似的鼠肝炎病毒(MHV)传代培 养至23代后，其RdRp中出现了不利于瑞德西韦 结合的氨基酸突变[58]。一系列瑞德西韦的临床试验也引起了研究人 员对其临床疗效的争议。2020年5月，原研公司 吉利德发布了适应性试验的“最终报告” (NCT04280705)[59]，称瑞德西韦在临床中可缩短住院时间，改善呼吸系统症状。但WHO在2020 年12月2日发表的“团结实验” (NCT04315948) 结果显示,瑞德西韦无法显著改善总体死亡率、通气时间与住院时间，疗效仍待改进[60]。Spin-ner[61]在为期11天的周期内研究了瑞德西韦针 对新冠肺炎轻中症患者的疗效(NCT04292730), 结果表明，在治疗期间，虽然患者的某些临床数 据出现显著改变，但并不表示任何程度的病情改善。近H,Li[62]在一系列细胞实验中比较了瑞德 西韦与核昔母体GS-441524在体外细胞中的抗病毒能力。结果显示,GS-441524在Vero E6细胞 系中对SARS-CoV-2的抑制能力略强于瑞德西韦，但在Calu-3和Caco-2细胞系中活性稍弱。GS-441524亦可显著提高感染鼠肝炎病毒 (MHV)小鼠的生存率，初步展示出广谱抗病毒作用。由于GS-441524合成方便、成本低、可口服， 同样有望成为治疗SARS-CoV-2的候选药物。法匹拉韦(favipiravir, 10,图7)最早在日本上 市,用于治疗流感，其通过与RdRp活性位点结合 发挥抑制活性[63]，对所有种类及亚型的流感病毒均有拮抗作用，具有治疗多种RNA病毒感染的 潜力。此外,法匹拉韦在抑制病毒RdRp的同时, 不对哺乳动物机体的RNA及DNA合成路径产生影响[64-65]。虽然法匹拉韦在体外试验中对 SARS-CoV-2的抗病毒活性较低(EC50 = 62μmol• L-1),但在两次临床试验中均显示出良 好的效果3项7]。利巴韦林(ribavirin, 11,图7)是已上市的广谱抗病毒药物，已被批准用于治疗丙型肝炎与呼吸道合胞病毒感染。其作用机制是通过靶向病毒 RdRp而使病毒基因组RNA中出现多位点突变， 最终导致病毒mRNA加帽终止，进而抑制病毒 RNA合成[68]。利巴韦林的疗效已经在SARS- CoV和MERS感染者中得到了证实，但严重的不 良反应限制了其临床应用[69]。且在体内外实验中，利巴韦林对SARS-CoV-2感染的疗效约为瑞德西韦的1 /100[53]。综合考虑，利巴韦林治疗 SARS-CoV-2感染的药效、安全性及潜在的毒性 作用有待在临床试验中进一步研究。Galidesivir( BCX4430,12,图 7 )也是腺昔酸 类似物，最初为病毒RNA聚合酶抑制剂，曾被用 来治疗丙型肝炎，且对多种RNA病毒如SARS- CoV,MERS-CoV, Ebola 病毒和 Marburg 病毒具 有广谱抑制活性。在生物体内,galidesivir首先被 转化成相应的三磷酸核昔,再以此形式插入病毒 新合成的RNA链中，导致RNA转录或复制的提 前终止[70]。因此，其有望成为治疗新冠肺炎的候 选药物[71]。阿兹夫定(azvudine,FNC,13,图7)是首个核 首类双靶点HIV抑制剂，针对多种HIV耐药毒株有良好的抑制活性[72]。新冠肺炎疫情爆发后，在我国进行的一项临床试验(CTR2000029853)显 示，阿兹夫定可以显著缩短新冠肺炎轻中症状患 者的核酸转阴时间，对重症患者也具有潜在的治 疗作用。同时临床上未观察到任何与药物有关的 不良反应,安全性有充分保障。目前针对阿兹μmol• L-1。特别是 S416的选择指数达到10 000以上,且无激酶抑制 活性,在治疗浓度下对宿主细胞毒性极小,基本克 服了脱靶效应，作为广谱抗冠状病毒抑制剂具有 极大的开发潜力。此外，DHODH抑制剂有望在 新冠肺炎的治疗中发挥免疫抑制作用，降低“细 胞因子风暴”产生的炎症损伤。参考文献见 中国药物化学杂志 第31卷 第9期，2021年9月总173期

大家好，本周为大家介绍一篇发表在J. Am. Chem. Soc.上的文章，Transient Structural Dynamics of Glycogen Phosphorylase from Nonequilibrium Hydrogen/Deuterium-Exchange Mass Spectrometry，文章作者是英国埃克塞特大学的Jonathan J. Phillips。　　变构调节指在蛋白质的正构位点上的变化通过蛋白质内部传递，最终影响到变构位点的结构，从而调整白质功能。理解蛋白质功能转换背后的特定结构动态变化对于分子生物学和药物发现领域至关重要。尽管变构现象自从提出以来已有广泛的研究，但是关于信号如何在蛋白质内部长距离传递的具体机制仍然不甚清楚。很大程度上是由于缺乏能够在时间和空间上高分辨率测量这些信号的生物物理方法。糖原磷酸化酶(glycogen phosphorylase，GlyP)是研究变构调节常用的标准蛋白，GlyP与II型糖尿病和转移性癌症的治疗密切相关。GlyP作为一种典型的变构酶，其活性受磷酸化修饰、多种天然配体和药物的调控。本文旨在通过开发和应用非平衡毫秒级氢/氘交换质谱(neHDX-MS)技术，来精确定位GlyP在变构激活和抑制期间的动态结构变化。这项技术能够提供蛋白质在毫秒时间尺度上的局部结构动态信息，有助于揭示变构调节过程中的瞬态结构特征，从而为理解蛋白质的动态行为和设计变构调节剂提供重要的结构信息。　　作者首先确定了能够完全激活或抑制GlyP的条件。25 mM 的AMP能实现GlyPb的最大激活(图1A)。32 mM咖啡因足以完全抑制GlyPa(图1B)。并且观察到50ms内AMP和咖啡因能够达到最佳激活/抑制状态(图1C和1D)。　　图1.糖原磷酸化酶b的变构激活和糖原磷酸化酶a的抑制。　　随后作者通过neHDX-MS捕捉由AMP引起的GlyPb变构激活过程中的局部结构扰动。通过激活过渡态与未激活和激活状态之间的HDX差异，作者将这些肽段分成了七个类群。其中重点值得关注的类群是c、d(其他类群对应区域及趋势不在此详细介绍)，因为他们的HDX行为与未激活和激活时的稳定态都有明显差异，这些局部区域的结构变化是过渡态的独特体现(图2A)。其中，c类群主要涵盖了tower helix区(图2B)，说明该区域在从未激活到激活状态的过渡态中，表现出相较于前后二者皆较高的动态性。d类群涵盖活性位点，说明活性稳点结构在因结合发生了结构稳定化现象。为了从原子水平理解这些瞬态结构变化，研究人员使用了一种基于Energy Calculation and Dynamics(ENCAD)的方法，Climber，来模拟从非活性状态到活性状态转变过程中的过渡态内部作用变化。结果显示，tower helix在激活过程中经历了氢键先断裂后形成的变化，这与观察到的HDX增加相一致(图4A)。　　图2.GlyPB中表现不同结构动力学行为的类群。　　图3.局部区域HDX动力学。　　图4.GlyP在活性和非活性状态之间的结构插值。　　随后作者探讨了咖啡因如何通过变构抑制影响GlyPa的结构动态。同样作者也比较了抑制过渡态与未抑制和抑制状态之间的HDX差异，分成了七个类群。在这几组类群中，仅有m表现出较未抑制和抑制状态都较明显的氘代上升趋势(图2C、图3C&D)。m区域涵盖了tower helix区(图2D)，说明该区域在未抑制状态到完全抑制状态的过渡阶段内，发生了局部去结构化现象。此外，在280s loop和250′ loop区域也表现出类似的瞬时去稳定化现象。结合AMP激活实验中的现象表明，尽管咖啡因和AMP作用于GlyP的不同位点，但它们都可能通过类似的变构路径(即tower helix的去稳定化)来引起GlyP的变构调节，从而实现对该蛋白功能的调控。同样在Climber分析中，可以观察到对应区域发生了氢键重排，与neHDX-MS结果呼应(图4B)。　　本文讨论了GlyP的变构调节中间态涉及的局部结构动态变化，并通过毫秒级neHDX-MS揭示了这些变化。结果表明激活和抑制过渡态都涉及到tower helix的氢键断裂和局部结构重排，这是两个途径的共同特点。本研究的亮点在于开发了一种新的neHDX-MS方法，能够在毫秒时间尺度上观察蛋白质的变构结构动态。这种方法不仅对理解GlyP的变构机制具有重要意义，而且可以广泛应用于不同蛋白质的变构研究，为理解蛋白质的变构调节提供了新的视角和工具。　　撰稿：罗宇翔　　编辑：李惠琳　　文章引用：Transient Structural Dynamics of Glycogen Phosphorylase from Nonequilibrium Hydrogen/Deuterium-Exchange Mass Spectrometry　　参考文献　　Kish, M. Ivory, D. P. Phillips, J. J., Transient Structural Dynamics of Glycogen Phosphorylase from Nonequilibrium Hydrogen/Deuterium-Exchange Mass Spectrometry. J. Am. Chem. Soc. 2023, 146 (1), 298-307.

展鹏教授团队分享了聚焦冠状病毒生命周期中的药物靶点，综述了现有广谱冠状病毒抑制剂的研究进展，以期为研发抗冠状病毒药物提供参考，更好地应对当下及未来的冠状病毒疫情。人冠状病毒广谱抑制剂的研究进展（一）（点击查看）人冠状病毒广谱抑制剂的研究进展（二）（点击查看）4.3靶向冠状病毒多聚蛋白裂解过程的抑制剂SARS-CoV-2进入细胞后完成生命周期并制 造出子代病毒的关键步骤是多聚蛋白的裂解，这个过程依赖的是病毒自身产生的蛋白酶Mpro和 PLpro[84]。测序结果表明，编码SARS-CoV-2和 SARS-CoV蛋白酶的RNA序列显示出高度的一 致性[85]。因此针对上述蛋白酶的抑制剂是阻断各种冠状病毒在宿主细胞内增殖的有效手段。在抗病毒药物治疗中已经有多种蛋白酶抑制剂在临床上用于治疗HIV等病毒感染。随着对 NT。活性催化位点及其周边结构的认识不断深入（图10）,基于靶标的合理药物设计也促进了此类 药物的发现与发展。在针对SARS-CoV-2的治疗 中，大多数蛋白酶抑制剂仅处于计算机模拟（in silico）研究阶段，急需进一步的体外与临床研究数据。4.3. 1 主蛋白酶(Mpro)抑制剂洛匹那韦(lopinavir,20,图11)是已经上市的 拟肽类HIV蛋白酶抑制剂[86]。利托那韦 (ritronavir,21,图11)可抑制药物代谢酶,常与洛匹那韦联合应用以起到增效作用[87]，二者组成的复方制剂Kaletra相对于单一的洛匹那韦作用时 间更长[88]。2004年一项非盲临床试验显示，在 SARS-CoV感染者中，服用洛匹那韦-利托那韦 (400 mg：100 mg)的试验组产生负面临床结果的风险以及病毒载量明显降低[89]。洛匹那韦针对 MERS-CoV也有抑制作用師如，但仍需进一步的 临床试验确认。洛匹那韦在体外细胞中抑制 SARS-CoV-2 的 EC50值为 26.1μmol• L-1,但单 一的利托那韦无抗病毒活性。洛匹那韦-利托那 韦复方疗法在新冠治疗中受到普遍关注[92-94]。N3(22,图12)是含有迈克尔加成受体的拟 肽类冠状病毒抑制剂[95]。作为共价抑制剂，N3 分子的乙烯基与SARS-CoV-2的Mpro催化中心的 Cysl45共价结合,并通过3个侧链分别结合于催化中心周边的各个口袋，形成额外的作用力。此外，α-酮酰胺片段被看作高效的共价结合基团，可增强分子柔性、提高稳定性和透膜性，常用于病毒蛋白酶抑制剂的设计[96]。基于此,Zhang等[97]设计了一系列以α-酮酰胺为“共价弹头”的广谱主 蛋白酶抑制剂，针对α属、β属冠状病毒与肠病毒Mpro 均有良好的抑制活性。其中代表化合物为 23(图12)，其抑制 SARS-CoV 与 HCoV-NL63 主 蛋白酶的IC50值分别为0.71μmol• L-1和12.27μmol• L-1,在 Huh-7 细胞系中针对MERS- CoV的EC50值达到0. 0004 μmol• L-1。为进一步提高酮酰胺类抑制剂针对SARS-CoV-2的抑制作 用,Zhang等[98]对化合物23的结构进行修饰，将疏水性过强的肉桂酰基替换为具有一定亲水性的基团从而得到一系列化合物，其中化合物24(图 12)抑制 SARS-CoV-2、SARS-CoV与MERS-CoV 主蛋白酶的IC50值分别为(0.67±0.18)、(0.90 ±0.29)、(0.58 ±0.22) μmol• L-1。Rupintrivir ( AG7088,25,图12)对肠道病毒 EV71与鼻病毒有突出的抑制作用，但对冠状病毒活性不佳[99]。Dai等[100]通过解析AG7088与EV71 3Cpro的共晶结构，以醛基共价弹头取代了易水解失活的α,伊不饱和酯基，并结合数个蛋白 酶抑制剂的优势结构,设计了 一类靶向肠道病毒 EV71 3C蛋白酶的共价抑制剂。高亲电性的醛 基作为共价弹头，与主蛋白酶Cysl45的疏基结合稳定，广泛用于设计高活性的蛋白酶抑制剂。其中代表化合物26（图12）对各种肠道病毒、鼻病毒有广谱抑制作用。与先导化合物及同时合成的其他修饰物相比，化合物26具有更好的药代动力学特性与广谱抗冠状病毒作用，对SARS-CoV-2 Mpro。及病毒复制均有较好的抑制作用（IC50 = 0.034μmol• L-1 ,EC50 =0. 29 μmol• L-1）。四川大学杨胜勇团队基于SARS-CoV-2的 Mpro催化中心周边结构，结合已上市蛋白酶抑制剂的优势片段，设计了以双环脯氨酸为核心骨架的拟肽分子，部分化合物为27~32（图13）[101]门， 并首次在动物模型中测定了所合成化合物对Mpro 的抑制作用。该类化合物以环状γ-丁内酰胺基团（P1）靶向S1区域,脂肪稠环结构（P2）靶向S2 区域，并以结构多样的取代芳环（P3）靶向S4区域（图14）。在P2提高分子刚性与疏水性、增强 靶标结合力的同时,P3大小合适的疏水芳基有助 于进一步增强分子的活性与代谢稳定性。抑酶活性结果显示，化合物29、30、31的IC50值分别为7.6 ,7.6,9. 2 nmol• L-1。在 Vero E6 细胞中，化合物28,31,32抑制SARS-CoV-2复制的 EC50值分别为 0. 53,0.67,0.54μmol• L-1（表 2）。在体内活性测试中，化合物32的药代动力学性质较好,在鼠体内有效抑制了SARS-CoV-2的增殖，显著降低了病理损伤，经治疗的感染小鼠 未出现任何体重损失与异常状况。4.3.2 PLpro抑制剂PLpro在不同的冠状病毒中具有类似的氨基 酸序列与空间构象，显示出高度相似性（图15）。因此，针对特定冠状病毒PLpro抑制剂也具有开发 为广谱PLpro抑制剂的潜力。Figure 15 The conformation and amnio acid sequence of SARS-CoV PLpro ( PDB：2FE8 ) and SARS-CoV-2 PLpro(PDB：7CMD)Ratia等[102]建立了基于荧光的高通量筛选方法，在包含上万种类药分子的化合物库中发现了先导化合物33（图16）,其R型异构体抑制SARS- CoV PLpro的 IC50值为（8.7±0.7）μmol• L-1 此类分子结构按药效团可分为“头部-链接基团-尾 部”三部分，其中，“头部基团”一般是1-萘基或2-萘基，而“链接基团”中的亚氨基作为氢键供体对分子活性至关重要,N-甲基化修饰的化合物34（图 16）活性则明显减弱（IC50=22.6μmol• L-1）。为进一步提高药效,Bdez-Santos[103]结合此 类分子中的先导化合物35（图17-A）与SARS- CoV PL。，。的共晶结构以及构效关系，设计了尾部 含有不同取代苯基的新一代SARS-CoV PL。”抑 制剂36 -39（图17-A）。共晶结构显示，此类分 子结合于Tyr269与活性中心围绕而成的狭长空 腔内（图17-B、C），活性与代谢稳定性均有提高， 活性数据如表3所示。双硫仑(disulfiram, 40,图18)是乙醛脱氢酶抑制剂，用于辅助矫正酒精成瘾[104]。2018年， Lin等[105]发现双硫仑针对SARS-CoV主蛋白酶 具有竞争性抑制作用，针对MERS-CoV PLpro。则具 有变构抑制作用。证据表明，双硫仑通过分子中 的硫原子与金属离子配位,或与蛋白质疏基相互作用,因此可以靶向PLpro和NT。中具有催化作用 的半胱氨酸[106]。在以往的临床实践中，双硫仑 表现出毒副作用小、作用机理明确、成本低的独特优势。但其针对包括SARS-CoV-2在内的多种冠 状病毒的体外实验及临床试验尚待完成。疏瞟吟即6-疏基瞟吟(6-MP,41,图18)早已 广泛用于治疗急性淋巴细胞白血病和急性髓细胞白血病。2008年，Chou[107]等首先报道了疏嚓吟作为SARS-CoV PLpro小分子可逆抑制剂的活性。 在MERS-CoV与SARS-CoV的蛋白酶的相似性 被确证之后，Cheng等[109]质旳又发现了疏瞟吟针对 MERS-CoV PLpro的竞争性抑制作用。但不可忽视的是,PLpro抑制剂的设计与研发 相对存在一定难度。候选分子中的游离疏基可能 与人体内各种蛋白质的半胱氨酸残基发生作用，导致专一性较差以及毒副作用增强[108]。此外， 宿主细胞的去泛素酶与PLpro 的相似性还会带来 抑制剂脱靶的风险。Figure 18 The structures of disiilfiram (40) and6-MP(41)5 结语与展望本文作者总结了靶向冠状病毒刺突蛋白、RdRp、蛋白酶及宿主靶标的一系列冠状病毒广谱抑制剂，对抗击新冠肺炎疫情、预防未来的冠状病 毒传播具有重要意义。针对冠状病毒的高效广谱抑制剂，是疫情爆发初期迅速响应危机、并在第一时间治疗患者的法宝[109]。对冠状病毒广谱抑制剂的发现、评估和修饰，是人类对抗未来的公共卫生危机的重要 战略举措。对于具有“老药新用”潜力的已上市药物,要尽快开展科学严谨的大规模双盲临床实 验,为大范围推广提供最真实可靠的依据,最大程 度保护患者的生命健康。长远看来，从头研发出一款针对新型冠状病 毒的“魔弹”药物需要进行漫长的设计、开发及疗效验证。一方面，不同的冠状病毒生命周期中发 挥关键作用的生物大分子有明显的种间同源性，为基于靶标结构寻找广谱抑制剂提供了重要信息；另一方面,从治疗新型冠状病毒的中药方剂中寻找天然来源的先导化合物，也是开发抗冠状病 毒药物的重要源泉。参考文献见 中国药物化学杂志 第31卷 第9期，2021年9月总173期

肺癌是最具侵略性的肿瘤类型之一，根据致癌因素对病人进行分层的靶向治疗会显著改善非小细胞肺癌（Non-small-cell lung cancer，NSCLC）患者的治疗效果【1】。然而在NSCLC中最常见的肺腺癌中有25-40%的病例中找不到具体的致癌驱动因素【2】。为了对非小细胞肺癌的致癌驱动因素进行进一步地探究，2021年11月24日，日本国家癌症中心东医院Koichi Goto研究组与Susumu S. Kobayashi研究组合作发文题为The CLIP1-LTK fusion is an oncogenic driver in non-small-cell lung cancer，揭开了非小细胞癌肺癌新驱动因素CLIP1-LTK融合蛋白，并发现了可以作为临床治疗的药物参考。致癌驱动因素的发现会揭示非小细胞肺癌的发病机制，比如在76%的肺腺癌样本中受体酪氨酸激酶-RAS-RAF通路会出现体细胞致癌驱动突变【3】。而基于转录组测序的方法可以帮助发现非小细胞肺癌中其他的致癌驱动因素，比如CD74-NRG1蛋白融合【4】。而基于这些研究响应开发出来的激酶抑制剂会对病人的治疗策略进行进一步的优化，从而提高患者的生存率。2013年，作者们构建了多机构联合的肺癌基因组筛查平台LC-SCRUM-Asia，该平台可以识别肺癌的致癌驱动因素，并在临床开发分子靶向治疗。作者们希望利用该平台寻找目前无法治疗的NSCLC患者中的致癌驱动因素。为了对新的致癌驱动融合基因进行鉴定，作者们对目前LC-SCRUM-Asia平台中目前成因未知的病人样本进行了全转录组测序分析（Whole-transcriptome sequencing，WTS），从中鉴定发现了一个符合阅读框的转录本：位于染色体12q24的CLIP1以及位于15q15位置的LTK融合转录本（图1）。LTK和ALK构成受体酪氨酸激酶的ALK/LTK亚家族，而CLIP1是微管末端跟踪蛋白家族的成员之一。图1 CLIP1-LTK融合蛋白结构域示意图随后，作者们想知道该融合蛋白与肺癌之间的关系，所以对LC-SCRUM-Asia平台中所有572个肺癌样本都进行了检测，发现其中有两个病人表现出CLIP1-LTK融合转录本阳性的特征，占NSCLC病人比例的0.4%，并且这两个病人体内没有其他已知的致癌驱动因素。该结果说明CLIP1-LTK融合转录本的出现可能是NSCLC的特征性致癌原因。CLIP1-LTK融合蛋白中具有coiled-coil结构域，该结构域会协助蛋白质的二聚化，因此作者们想知道该融合蛋白是否会形成二聚体从而组成性地激活LTK的激酶活性。通过CLIP1、LTK以及CLIP1-LTK分别在细胞中进行瞬时转染，作者们对LTK的磷酸化水平进行检测，发现与其他组别相比CLIP1-LTK的转染显著增加LTK的磷酸化水平， 也就是说在融合蛋白存在的情况下LTK具有更高的激酶活性。随后，作者们找到了CLIP1-LTK融合蛋白中的激酶活性缺失突变位点，该结果进一步地确认了CLIP1-LTK是组成性激活的。另外，作者们也对CLIP1-LTK融合蛋白的定位进行检测，发现CLIP1-LTK融合蛋白与LTK本身在细胞表面的表达模式不同，由于该融合蛋白缺乏LTK的跨膜结构域，所以CLIP1-LTK融合蛋白主要定位在胞质之中。进一步地，通过对细胞进行表型分析，作者们发现瞬时转染CLIP1-LTK融合蛋白的细胞会表现出圆形的细胞形态，同时细胞之间也会缺乏接触抑制，这些结果说明CLIP1-LTK融合蛋白使得细胞具有转移特征。为了证实CLIP1-LTK融合蛋白在体内的转移活性，作者们将体外培养的细胞移植到裸鼠的体侧（图2），发现只有CLIP1-LTK融合蛋白会导致肿瘤产生因因而是致癌驱动因素，并且该融合蛋白发挥作用依赖于其激酶活性。图2 CLIP1-LTK融合蛋白会导致肿瘤产生以上的结果表明，CLIP1-LTK融合蛋白可能会是NSCLC病人体内的潜在治疗靶标。所以作者们首先对CLIP1-LTK融合蛋白转染的细胞中施用了一些美国食品和药物管理局批准的或正在研究酪氨酸受体激酶抑制剂，发现其中Lorlatinib的处理会显著降低肿瘤细胞的生长。进一步地，作者们对病人进行Lorlatinib 100mg每天的常规剂量进行临床治疗，发现CLIP1-LTK融合蛋白激酶活性受到抑制，同时肿瘤的生长也会受到抑制（图3）。图3 CLIP1-LTK融合蛋白分型的NSCLC病人施用Lorlatinib会抑制肿瘤生长总的来说，该工作发现CLIP1-LTK融合蛋白是非小细胞肺癌新的致癌驱动因子，并表明激酶抑制剂Lorlatinib可以靶向该融合蛋白。未来将需要对CLIP1-LTK融合蛋白进行分子靶向抑制剂的临床开发，以及对该致癌驱动因素进行临床筛查和验证。原文链接：https://doi.org/10.1038/s41586-021-04135-5

p 　　 span style=" font-family: 楷体,楷体_GB2312, SimKai " 回顾2017年，基于质谱的临床研究有一项突破性发现。普渡大学陶纬国教授团队在2017年3月20日的《美国国家科学院院刊》(PNAS)杂志上发表文章称，他们从人体血液中发现2400多种磷酸化蛋白。该发现首次证明了磷酸化蛋白可以作为基于液体活检的疾病标志物，能用于对癌症等重大疾病更早、更精准的非侵入性诊断，为 “液体活检”提供了全新的检测维度。近日，仪器信息网专访了陶纬国。 /span /p p style=" text-align: center " img title=" 1.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201801/insimg/a21a903c-0479-4776-9e2a-5b5c719f76fc.jpg" / /p p style=" text-align: center " strong 普渡大学 陶纬国教授 /strong /p p 　　 span style=" color: rgb(255, 0, 0) " strong 磷酸化蛋白突破性发现 /strong /span /p p 　　通过液体活检来诊断肿瘤和癌症等疾病一直是临床科学家关注的焦点，研究对象多集中在循环肿瘤细胞(CTC)和循环肿瘤DNA(ctDNA)，但是二者都有局限性：由于CTC在血清中的浓度非常低，取少量血液对其检测难度很大 癌症有很多基因突变，而这些突变不一定会显现出来，因此基于ctDNA进行的液体活检的诊断结果只能预测患病的概率，并不能确诊。 /p p 　　蛋白质磷酸化是调节和控制蛋白质活力和功能的最基本，最普遍，也是最重要的机制，同时，与许多疾病的发生密切相关。在众多肿瘤致病机理中，当前学术界对蛋白质磷酸化机理的研究最为清楚，80%-90%的癌症都跟蛋白质磷酸化有关。因此，许多抗肿瘤药物的研制都着眼于磷酸化蛋白。理论上，磷酸化蛋白作为相关基因突变的表达，在临床上能够帮助医生做出更明确的诊断。但是，有关基于液体活检的磷酸化蛋白研究还很少。此前，有个别报道在血液中发现几十种磷酸化蛋白，均是高丰度蛋白，生物学意义不大。“原因就是磷酸化蛋白一旦从细胞进入血液中就被肝脏分泌的磷酸酶水解了。”陶纬国解释说，“所以虽然磷酸化蛋白跟癌症关系非常密切，但人们无法对其进行检测。” /p p 　　陶纬国团队是如何从人体血液中检测到大量磷酸化蛋白的呢?这要从三年前的一篇文献报道说起，当时陶纬国从这篇文章中了解到外泌体和微囊的结构，“当我看到类似于纳米微粒的外泌体、微囊结构时，我认为可能会有磷酸化蛋白被包裹在外泌体中，然后进入血液。如果真是这样，被外泌体包裹的磷酸化蛋白可能会避免被血液中的磷酸酶水解。”于是陶纬国团队对血液中的外泌体、微囊进行了超速离心分离、提取，然后用质谱进行检测。一周以后，实验结果让所有人都惊呆了，他们从中发现了几千个磷酸化蛋白。这个突破性的发现使得临床科学家们今后可以在1毫升血浆里找到几千个磷酸化的位点，并从中筛选出不同疾病的生物标志物。之后，陶纬国团队对乳腺癌病人血清中的磷酸化蛋白做了研究，发现乳腺癌病人体内的磷酸化蛋白与其病症密切相关。 /p p 　　那么，磷酸化蛋白液体活检何时能够应用临床呢?陶纬国回答说：“虽然现在还不好断言，但我认为3-5年内都有可能。”他进一步解释，随着质谱技术的显著提升，一些原来检测不到的生物标志物现在能够检测了，后面的工作主要是考察重复性有多好，假阳性有多低。 /p p 　　谈及未来的工作，陶纬国表示，一方面会继续做乳腺癌的磷酸化蛋白生物标志物确认的工作 另一方面也会做其他疾病磷酸化蛋白生物标志物找筛的工作，“还有很多其它疾病，比如阿尔茨海默病、帕金森综合征等，也都是蛋白磷酸化有关。” /p p 　　 span style=" color: rgb(255, 0, 0) " strong 质谱用于生物大分子检测的思考 /strong /span /p p 　　陶纬国教授做蛋白组学研究至今已有十几年，用到的研究工具主要是质谱。在攻读博士期间，陶纬国师从普渡大学著名质谱专家Graham Cooks教授。博士毕业后，陶纬国加入了西雅图系统生物研究所，在Leroy Hood教授(自动DNA测序仪发明人)和Ruedi Aebersold教授(著名蛋白质组学专家)课题组继续博士后研究。从那时起，陶纬国就开始了他的磷酸化蛋白质组学检测的研究，“重回普渡教书以后，我的工作基本上是围绕着怎么去提高磷酸化蛋白分析手段来开展的。质谱在我的工作扮演着中心角色，包括方法开发，蛋白生物标志物早筛，全靠质谱来做。”首先是早筛，用质谱(Orbitrap)筛选出相关的生物标志物(磷酸化蛋白) 然后对病人的样本进行检测，用统计学的方法对检测结果进行分类 最后，分析统计学上有意义的、跟病人相关的磷酸化蛋白。 /p p 　　在过去二三十年里，质谱在生物大分子检测方面有几个重要的技术突破。首先，80年代末90年代初， ESI和MALDI的出现，使质谱能够用于分析生物样品 第二，近十几年来，高分辨质谱的飞跃发展，大大提升生物大分子的分析效率。“我读博士后时(2002年)，很多仪器还是低分辨的，生物样品还是挺难做的，做完一个磷酸化的蛋白，单是数据库检索就要三天，而且，相对来说，得到的数据假阳性高。现在的高分辨质谱解谱很容易，差不多半个小时就够了，假阳性也降低很多。”此外，陶纬国还说到，“UPLC与质谱的结合在技术上是很大的进步，使色谱的分离效率赶上了质谱的速度，现在一个小时能检测到几千个蛋白，非常快。” /p p 　　同时，陶纬国也指出了目前利用质谱来检测生物大分子的难点。第一，生物样品基体复杂。“像我们实验室做磷酸化蛋白，它本身丰度就很低，假如样本不经过任何分离的话，谱图上将会只能看到高丰度蛋白。”第二，质谱检测假阳性比较高。“其实还是需要统计学算法方面的开发，来解决假阳性率高的问题，这也是现在很多质谱开发者在做的工作。” /p p 　　现如今质谱产品更新迭代非常快，对于质谱工作者来说，是好，也是坏。“新产品的确扫描速度更快了，精度更高。但是，也给质谱工作者带来了不小的压力。特别是像我们这种使用高分辨大仪器的，没有那么多钱换来换去。可是如果你想要紧跟前沿，这些新仪器又十分必要。”陶纬国说，这是目前质谱工作者普遍面临的两难境地。 /p p 　　 span style=" color: rgb(255, 0, 0) " strong 整合临床大数据 /strong /span /p p 　　2017年，陶纬国作为海外高层次人才被东南大学引进回国。谈及回国的初衷，陶纬国表示，国内拥有更多、更丰富的病人样本，这是他选择回国的原因之一。此外，国内对于高分辨质谱等大型仪器的投入力度也更大，有助于前沿研究的开展。谈到选择东南大学的原因，陶纬国说到：“东南大学的生物医学工程学院有转化医学，有生物，然后又有工程，包括产业化，比较适合我。” /p p 　　现在国内，整合医学大数据来服务大健康的概念很热，“在全国，包括南京，都已经有相关工作在开展”。从临床检测这个角度来说，陶纬国希望找到办法来整合DNA检测，microRNA检测，磷酸化蛋白检测几个维度的数据，从而获得更为精准的临床诊断结果。“比如检测一个肿瘤，通过对DNA、mRNA、磷酸化蛋白、糖基检测多维度数据的不断积累，数据会越来越多，结合人工智能、计算机算法，检测结果会越来越精准。 我回来能赶上这个机会也是不容易。”陶纬国如是说到。 /p p 　　目前，医学大数据的采集方式主要为第二代、第三代测序。“但是，质谱也是很重要的一块儿。”陶纬国指出，“比如乳腺癌，基因突变仅仅代表一种患病的可能性，但是到底有没有癌症还是要通过蛋白检测来确定，所以用质谱来检测蛋白的存在、活性、功能，比基因层面更可靠。所以，质谱检测肯定会慢慢跟上来。” /p p 　　陶纬国在东南大学生物医学工程学院的新实验室是电子生物国家重点实验室。对于自己的工作重心，陶纬国表示，现在是过渡时期，未来会逐步将重心转至国内。“国内实验室刚刚开始，看起来前途光明。” /p p 　 span style=" color: rgb(255, 0, 0) " strong 　热衷学界公益事务 出任CASMS主席 /strong /span /p p 　　作为质谱生物大分子检测方面的专家，陶纬国于2017年6月份当选北美华人质谱学会(CASMS)主席。该学会汇聚了众多顶尖的华人质谱学者，已经成为质谱学界重要的华人力量。在一年一度的“美国质谱年会(ASMS)”期间举行“北美华人质谱学术会议”已经成为CASMS的传统。据陶纬国介绍，CASMS已有二三十年的历史，目前注册人数在800人左右，覆盖了北美地区绝大部分优秀的华人质谱学者。ASMS每年参会人数6000-7000人，相当一部分是华人，中国面孔越来越多。“在美国，有很多华人学者做了非常出色的工作，但他们并没有获得相匹配的影响力和威望。” 陶纬国说，“我们学会的宗旨就是提升华人质谱学者在世界质谱领域的影响力。当然， 中国本身的国际地位的重要性是显而易见的。” /p p 　　CASMS的另一个宗旨是促进世界华人质谱界的互相交流。每两年召开一次的“世界华人质谱学术研讨会”是全世界华人的质谱盛会，汇聚了中国内地、台湾、香港、新加坡和北美地区的质谱学者，CASMS是该会议4个主办方之一。2016年，CASMS主办了第六届“世界华人质谱学术研讨会”，这是该会议首次在美国召开，恰逢该会议召开十周年。“我认为非常有意义，促进了两岸三地华人质谱学者的交流合作。我的亲身体会是通过这个会议结识了很多优秀学者，而在此前很多同仁相互间是不认识的。” /p p 　　未来，除了重要的线下会议组织工作，陶纬国希望通过加强线上日常交流，来使学会内部联系更为紧密。 /p p 　　 span style=" font-family: 楷体,楷体_GB2312, SimKai " strong 后记： /strong 临床质谱技术被认为是医学诊断的下一个“基因测序”，应用前景被普遍看好。质谱用于临床检验具有灵敏度高、特异性高、重现性好的优点，可在临床多个领域对传统诊断方法学进行替代。陶纬国教授团队的磷酸化蛋白研究进一步提升了临床质谱应用的含金量。基于该研究，临床科学家们将会找到更多可靠的疾病标志物，从而实现癌症等重大疾病的早期发现和精准诊断。 /span /p p style=" text-align: right " 采访编辑：李博 /p

人冠状病毒广谱抑制剂的研究进展（一）宋乐天，程玉森，高升华，姜向毅，展鹏＊，刘新泳＊（山东大学药学院药物化学研究所化学生物学教育重点实验室，山东济南250012）摘要：冠状病毒在全球范围内的三次流行对人类生命健康造成了极大威胁，特别是目前针对新冠疫情仍然缺乏有效的抗病毒药物。冠状病毒广谱抑制剂通过作用于病毒生命周期中的关键靶标或宿主关键因子来抑制病毒感染。本文作者聚焦冠状病毒生命周期中的药物靶点，综述了现有广谱冠状病毒抑制剂的研究进展，以期为研发抗冠状病毒药物提供参考，更好地应对当下及未来的冠状病毒疫情。关键词:冠状病毒 广谱抑制剂 老药新用 药物发现冠状病毒(coronaviruses, CoVs)在自然界中 广泛分布,1947年首次由啮齿类动物体内分离得到，其常在多个宿主间传播，对多种家畜、野生动 物及人类具有潜在威胁[1]。冠状病毒在动物间传播至人类，即形成人冠状病毒HCoV。至今已出现7种对人类具有传染性的冠状病毒，分别为HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-OC43、HCoV-HKU1、MERS-CoV、SARS-CoV和SARS-CoV-2[2]。常见的人冠状病毒如HCoV-229E和 HCoV-OC43可导致上呼吸道感染、消化道及神经系统症状，不严重且能自愈[3-4]，因此在较长时间内未受到重视。2003年暴发的重症急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome, SARS)疫情造成全球范围内8000多人感染，死亡率为10%左右 2012年暴发的中东呼吸综合征(middle east respiratory syndrome, MERS)死亡率高达39%；而2019年底暴发的新型冠状病毒肺炎(coronavirus disease- 2019, COVID-19)疫情已经导致全球超过1.6亿人感染，350多万人死亡[5]，造成了全球公共卫生危机，这促使人类加快对冠状病毒抑制剂的研究，但至今仍缺乏特异性药物或疗法。相比较，广谱抗病毒药物可作用于某一类病毒或某种病毒不同的变异株，具有独特的优势。本文作者聚焦冠状病毒生命周期中的关键靶标，探讨了开发广谱抗冠状病毒药物的思路。1.冠状病毒的基本结构冠状病毒的遗传物质为单正链RNA,可以作为病毒增殖时的遗传物质及复制模板，也能以mRNA的形式参与合成相应的蛋白质，或直接组装入子代病毒颗粒。冠状病毒基因组从5,端开始，前三分之二序列由两个重合的开放阅读框组 成,编码多聚蛋白pplab,其最终转化为16种非 结构蛋白(non-structural protein, nsp)，与病毒基 因组转录与复制有关。3,端附近的序列编码冠状 病毒所共有的4种结构蛋白，包括核衣壳蛋白 (nucleocapsid protein, N 蛋白)、刺突糖蛋白 (spike glycoprotein, S 蛋白)、膜蛋白(membrane protein,M蛋白)和高度疏水的包膜蛋白(envelope protein, E 蛋白)(图1)[6] 。2.冠状病毒的生命周期冠状病毒的生命周期包括侵入宿主细胞、基因组复制和结构蛋白合成、子代病毒组装和释放 等基本步骤(图2)。S蛋白介导病毒入侵时，由宿主半胱氨酸组织蛋白酶和跨膜丝氨酸蛋白酶 (transmembrane protease serines 2, TMPRSS2)催化，裂解为S1、S2两个亚单位[7]。S1和S2分别负责病毒与细胞受体结合以及与细胞膜融合，二者协同介导病毒与细胞表面血管紧张素转化酶2 (ACE2)结合，引起S蛋白进一步的空间结构改变,使病毒以脱壳或膜融合方式纳入细胞[8]。相比于SARS-CoV, SARS-CoV-2和宿主细胞膜融合也可有成对碱性氨基酸蛋白酶(PACE,也称 Furin蛋白酶)的参与。其通过选择性水解刺突蛋 白中的氨基酸片段,预活化刺突蛋白以增强其与ACE2的结合力，提高对宿主细胞的侵染能力[9]。病毒侵入后,RNA复制产生子代RNA,并以之为模板合成多聚蛋白，后者在胞浆中受到主蛋白酶(main protease, Mpro或3CLpro)与木瓜样蛋白酶(papain-like protease, PLpro)协同作用，裂解生成功能性蛋白[10]。PLpro除此之外还具有去泛素活性,能在宿主细胞内将蛋白质脱除泛素和类泛素蛋白ISG15 ,以抑制宿主的抗病毒免疫反应[11]。最终,在功能性蛋白的作用下合成子代病毒颗粒的各个组分，装配并释放出胞。Figure 1 The structure of coronaviruses, represented by SARS-CoV-2Figure 2 The life cycle of coronaviruses, represented by SARS-CoV-23.抗冠状病毒药物的主要靶点通过将SARS-CoV-2的基因测序结果与不同的人冠状病毒基因序列对照，可以辨识出一系列 高度保守的序列。这些序列编码各种关键酶或蛋白质,包括S蛋白、主蛋白酶、木瓜样蛋白酶及依 赖RNA的RNA聚合酶(RdRp)等[12]。进一步研究表明，以上酶的活性位点在SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV乃至其他冠状病毒中保持高度相似[13],因此这些酶都是广谱抗病毒药物研发的重要靶点。同时，病毒增殖的过程中高度依赖宿主细胞的物质、能量与酶，因此靶向宿主细胞中与病毒生命周期密切相关的靶点，也是广谱抗病毒药物开发的重要策略[14]。靶向宿主的广谱冠状病毒抑制剂可充分克服病毒耐药性、突变性与种间差异性,具有较大的发展空间[15]。4.广谱冠状病毒抑制剂本文讨论的冠状病毒广谱抑制剂是针对冠状病毒与宿主的关键靶点开发的抗病毒化合物。现阶段，根据这类化合物靶向的生理过程不同，分别靶向冠状病毒的侵入过程、RNA复制过程、多聚蛋白裂解过程以及宿主靶标… … 下一期将分享靶向冠状病毒刺突蛋白、RdRp、蛋白酶及宿主靶标的一系列冠状病毒广谱抑制剂，以及其对抗击新冠肺炎疫情、预防未来的冠状病毒传播具有的重要意义。 参考文献：[1] BAILEY O T.PAPPENHEIMER A M.CHEEVER F S ,et al. A murine virus (JHM) causing disseminated encephalomyeliti s with extensive destruction of myelin: L Isolation and biological properties of the vinis[J]. J Exp Med, 1949,90(3) ：195 -212.[2] YEZ W, YUAN S, YUEN K S, et al. Zoonotic origins of human coronaviruses [ J ]. Int J Biol Sci, 2020,16(10) ： 1896 -1897.[3] WEISS S R, NAVAS-MARTIN S. Coronavirus pathogenesis and the emerging pathogen severe acute respiratory syndrome coronavirus[ J]. Microbiol Mol Biol Rev,2005,69(4) ：635 -664.[4] DE WIT E, VAN DOREMALEN N,FALZARANO D, et al. SARS and MERS: recent insights into emerging coronaviruses [ J ]. Nat Rev Microbiol, 2016,14(Suppl. 1) ：523 -524.[5] World Health Organization WHO Coronavirus Disease (COVID-19) Dashboard[EB/OLJ. [2021 -08 -23]. https://covid!9. who. int/.[6] YANG D, LEIBOWITZ J L. The structure and functions of coronavirus genomic 3' and 5' ends[ J]. Virus Res,2015,206：120 -133. [7] LAN J,GE J, YU J, et al. 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p 　　今日，业内传来重磅新药上市消息，江苏恒瑞医药宣布，其自主研发的1.1类新药吡咯替尼(商品名：艾瑞妮& reg )凭借2期临床研究获国家药品监督管理局(下称“SDA”)优先审批上市，目前状态为审批完成，待制证。吡咯替尼是一种泛-ErbB受体酪氨酸激酶抑制剂，用于人表皮生长因子受体 2(HER2)阳性晚期乳腺癌的靶向治疗。值得注意的是，该药物凭借1期研究结果登上全球顶级期刊《JCO》，又凭借2期临床获得SDA的优先审评上市，回顾整个过程可谓是中国自主研发创新药物优先审批的典范之一。 /p p style=" text-align: center " img width=" 276" height=" 184" title=" 2018.8.14 2-1.jpg" style=" width: 329px height: 152px " src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201808/insimg/e6cc6de8-0bf7-44f9-a99f-9a447161c25c.jpg" / /p p 　　吡咯替尼是获得国家“重大新药创制科技重大专项”资助，作为泛-ErbB受体酪氨酸激酶抑制剂，可同时靶向作用于人表皮生长因子受体2(HER2)、表皮生长因子受体(EGFR)和人表皮生长因子受体4(HER4)，其疗效显著优于多个小分子抗HER2药物。 /p p 　　· 2017年5月，《JCO》杂志首次全文发表了吡咯替尼的1期研究结果，中国自主研发抗肿瘤药物仅凭1期研究就登上全球知名期刊十分难得。 /p p 　　· 2017年8月，吡咯替尼凭借2期研究结果中极为出色的疗效被国家食品药品监督管理局药品审评中心(下称：CDE)列为优先审评创新药物。同年12月，2期临床研究结果在美国圣安东尼奥乳腺癌大会上报道，并被列入2017年乳腺癌重大事件年度回顾。 /p p 　　· 2018年8月， SDA正式批准吡咯替尼用于HER2阳性晚期乳腺癌治疗。吡咯替尼凭借2期临床研究的结果即获得优先审批，且从递交临床数据报告及上市申请到正式获得上市批准仅历时10个月。 /p p 　　吡咯替尼是一款不可逆的泛-ErbB受体酪氨酸激酶抑制剂，靶点包括HER2、EGFR和HER4。吡咯替尼与EGFR、HER2和HER4的胞内激酶区ATP结合位点共价结合，阻止同/异源二聚体形成，不可逆的抑制自身磷酸化，阻断下游信号通路的激活，抑制肿瘤细胞生长。 /p p 　　据了解，吡咯替尼单药治疗晚期乳腺癌1b期临床研究旨在确定最大耐受剂量，评估药代动力学和初步疗效。研究结果显示出其极为出色的抗肿瘤疗效及较好的安全性。值得一提的是，1b期研究结果全文发表在全球顶级期刊《JCO》，中国自主研发抗肿瘤药物仅仅凭借I期研究就登上全球知名期刊十分难得。同期，另一肿瘤领域顶级期刊《Lancet Oncology》杂志也对吡咯替尼的1b期研究发表点评，对该新药出色疗效和较好的安全性做出了高度评价。 /p p 　　基于1b期研究的疗效和安全性，恒瑞迅速开展了2期临床研究，评估吡咯替尼联合卡培他滨方案对比拉帕替尼联合卡培他滨方案治疗HER2阳性转移性乳腺癌的有效性和安全性。研究结果表明，其临床获益，且较现有治疗手段具有明显优势，这一结果首次在2017年美国圣安东尼奥乳腺癌大会上报告。 /p p 　　由于研究结果与现有治疗相比存在重大突破，吡咯替尼仅凭2期临床研究结果即被CDE列入优先审评。由于其临床获益且较现有治疗手段具有明显优势，符合国家对临床急需药品(指对用于治疗严重危及生命且尚无有效治疗手段的疾病的创新药)有条件批准上市的相关要求。 /p p style=" text-align: center " img width=" 600" height=" 416" title=" 2018.8.14 2-2.jpg" style=" width: 445px height: 238px " src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201808/insimg/074fb1a4-8553-4941-950d-0fd1e9f386aa.jpg" / /p p style=" text-align: center " 　 span style=" font-size: 14px " 　恒瑞吡咯替尼获批状态 /span /p p 　　2018年8月，吡咯替尼已经进入审批完毕，待制证状态。这是自1998年抗HER2治疗开始以来，中国首个自主研发的抗HER2靶向药物。 /p p & nbsp /p

近日，The Lancet Rheumatology发表一项研究预测到2050年全球骨关节炎的患病率情况，研究显示，截止到2020年，全球骨关节炎患者增加到5.95亿，约占全球人口的7.6%，增幅高达132%。由此可见，开发针对骨相关疾病的精准无创诊疗技术迫在眉睫，因为它不仅可以连续监测骨代谢、生长、转移、给药和指导手术，而且可以实现骨疾病的高效治疗。然而，设计精准无创的骨疾病诊疗探针是极具挑战的工作。应 用 报 道今年9月，青岛科技大学袁勋教授团队在《Aggregate WILEY》报道了一种新型的金团簇基骨靶向诊疗探针[1]，实现了高时空分辨的体内骨靶向近红外二区（NIR-II）荧光成像和增强的类风湿性关节炎治疗。图1. Au44MBA26-P团簇的体内特异性骨靶向和高分辨率成像该探针的设计关键在于将原子级精确的NIR-II发射Au44团簇的表面进行磷酸化。一方面，Au44团簇的表面磷酸化大大增强了探针的骨靶向能力，使骨主要成分羟基磷灰石对磷酸化前后的Au44团簇探针的理论max吸附量提高了1.36倍，使该团簇探针实现了高对比度和高分辨率的体内骨靶向NIR-II荧光成像（信噪比提升1.4倍，见图1）。图2. Au44MBA26-P团簇对胶原免疫诱导大鼠类风湿性关节炎(CIA)模型的治疗作用另一方面，该团簇探针作为一种新型纳米药物，具有直接的生物效应，可显著抑制脂多糖诱导的小鼠巨噬细胞促炎因子的产生。在II型胶原诱导的大鼠类风湿性关节炎治疗中，该团簇探针表现出优异的抗炎和免疫调节作用，可将破坏的软骨恢复到接近正常状态，比临床治疗药物甲氨蝶呤效果更为显著（图2），且具有良好的肾脏清除率和优良的生物相容性。本研究提出了一种金属纳米团簇基诊疗探针的设计范例，为高分辨率骨靶向荧光成像和类风湿性关节炎治疗提供了新思路。图3.睿光NirVivo-Pro 近红外二区小动物活体荧光成像系统助力科研研究[1]: Phosphorylation of NIR-II emitting Au nanoclusters for targeted bone imaging and improved rheumatoid arthritis therapyhttps://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0142961223001382产 品 推 荐近红外二区小动物活体荧光成像系统NirVivo-Pro 活体荧光成像系统是北京睿光科技自主研发的一款专门用于近红外二区的光学成像系统。该系统可实现高质量荧光图像的采集及图像处理，实时地观察基因在活体动物体内的表达、肿瘤的发生、生长、转移及药物的治疗效果，对同一个动物进行时间、环境、发展和治疗影响跟踪，可用于生命科学、医学研究及药物开发等应用领域。产品特点

天然产物具有资源丰富、安全有效、环境友好和毒副作用小等特点，是天然酶抑制剂的重要来源之一。从天然产物中筛选有效、低毒、价廉的酶抑制剂具有重要意义。低共熔溶剂（Deep eutectic solvents, DES）作为一类新型离子液体，具有制备简单、蒸气压低、可生物降解、成本低和设计性强等特点。近年来，中国科学院兰州化学物理研究所中科院西北特色植物资源化学重点实验室手性分离与微纳分析课题组在新型碱性DES的设计合成及用于纳米酶分析方面取得了系列成果。最近，研究人员以L-脯氨酸为氢键供体、六水合硝酸铈为氢键受体，结合理论计算合成了新型DES（图1）。图1. L-脯氨酸与六水合硝酸铈以不同的摩尔比形成的混合物的玻璃化转变温度及三维结合模式图研究人员以摩尔比为1：1的L-脯氨酸和六水合硝酸铈组成的DES为溶剂、反应物和模板，制备出CeO2-Co(OH)2复合材料。结果表明，与水溶液中制备的CeO2、Co(OH)2和CeO2-Co(OH)2材料相比，在该DES中制备的CeO2-Co(OH)2复合材料具有更显著的类氧化酶活性，这主要是由于DES中制得的CeO2-Co(OH)2具有丰富的氧空位。基于CeO2-Co(OH)2纳米材料优异的类氧化酶活性，构建了可视化检测乙酰胆碱酯酶活性和不可逆抑制剂筛选的新方法。在此基础上，研究人员将其成功应用于生物碱类天然产物（盐酸小檗碱、咖啡因、喜树碱、苦参碱和吴茱萸碱）中乙酰胆碱酯酶可逆抑制剂的筛选，并通过分子对接和动力学模拟实验探讨了其作用机理（图2）。该研究不仅拓展了DES在纳米酶中的应用，而且为从天然产物中筛选阿尔茨海默病等神经退行性疾病的治疗药物提供了一种新策略。图2. CeO2-Co(OH)2复合材料用于乙酰胆碱酯酶活性检测及抑制剂筛选该研究发表在Analytical Chemistry上，硕士研究生刘芸为该论文第一作者，兰州化物所陈佳副研究员、邱洪灯研究员和东北大学于永亮教授为共同通讯作者。前期相关研究成果发表在Chinese Chemical Letters（2020, 31, 1584）、Analytical and Bioanlytical Chemistry（2020, 412, 4629）、Microchimica Acta（2020, 187, 314）、ACS Applied Nano Materials（2021, 4, 2820）、Talanta（2021, 222, 121680）和ACS Sustainable Chemistry & Engineering（2021, 9, 15147）上。以上工作得到了国家自然科学基金、中科院青年创新促进会和甘肃省自然科学基金项目的支持。

p style=" text-align: center " strong span style=" color: rgb(153, 153, 153) " img alt=" " src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201709/uepic/82c9aaba-ed82-497a-975e-02a6c6f477b0.jpg" / br/ /span /strong /p p 　　TGF-β超家族信号通路参与了广泛的生物学过程，对调控早期胚胎发育、细胞的生长、干细胞的自我更新、肿瘤的发生发展等具有十分重要的调控作用。作为TGF-β超家族信号通路中抑制性的SMADs(Inhibitory SMADs， I-SMADs)，Smad7过去一直被认为是TGF-β信号通路重要的负反馈调节因子，然而对于Smad7是否有不依赖于TGF-β信号通路的重要功能并不十分清楚。 /p p 　　9月5日，浙江大学生命科学研究员冯新华教授课题组在PNAS杂志在线发表了题为“Smad7 enables STAT3 activation and promotes pluripotency independent of TGF-β signaling”的研究论文，揭示了Smad7能够通过TGF-β非依赖的方式与STAT3信号相互作用来调控干细胞的自我更新与分化，有力的拓展了Smad7全新的功能，并且暗示了这一全新的分子机制极有可能在炎症反应以及肿瘤中有更为广泛的影响。 /p p strong span style=" color: rgb(204, 0, 0) " /span /strong /p p 　　 strong 论文解读： /strong /p p 　　人基因组编码了33个转化生长因子-β(TGF-β)超家族成员，包括TGF-β/Activin/Nodal以及BMP，它们对于维持干细胞的全能性以及在发育过程中决定细胞命运都至关重要【1，2】。TGF-β超家族需要依靠细胞内的R-Smads蛋白传递信号，比如TGF-β/Activin/Nodal能够激活Smad2和Smad3，BMP能够激活Smad1、Smad5和Smad8( SMAD 家族蛋白共有 8 个，细分为三类：受体激活型 SMAD，R-SMADs 通用伴侣型 SMAD，Co-SMAD) 抑制型 SMAD， I-SMADs)。Smad7能够被TGF-β超家族的所有成员诱导表达，并且在多个水平上抑制TGF-β信号通路，所以它被认为是TGF-β信号通路重要的负反馈调节因子【3】(图1)。 /p p style=" text-align: center " span style=" color: rgb(153, 153, 153) " img width=" 464" height=" 400" title=" " style=" width: 464px height: 400px " alt=" " src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201709/uepic/c753e3d5-d435-40c6-9623-3900456424f0.jpg" border=" 0" vspace=" 0" hspace=" 0" / br/ /span /p p style=" text-align: center " span style=" color: rgb(153, 153, 153) " 图1 & nbsp Smad7反馈抑制TGF-β信号通路& nbsp & nbsp /span /p p 　　Smad7最主要的作用机制是通过招募E3连接酶Smurf1/2或者Nedd4-2到 TGF-β受体，导致受体的泛素化降解。另外，Smad7可以被其它细胞因子(如EGF、IFN-γ、IL-1以及TNF-α)诱导表达，从而抑制TGF-β/BMP信号，它也可以调控TNF-α/NF-κB、JNK/p38以及Wnt等其他重要的信号通路【4】。不过Smad7对其他信号通路的调控基本都是通过抑制TGF-β/BMP信号间接实现的。另外，有关Smad7在胚胎干细胞(ESC)中的功能也有报道。比如，Smad7可以控制人ESC向端脑方向分化【5】，促进小鼠造血干细胞的自我更新【6】。但是，Smad7是否能够通过TGF-β非依赖的方式来调控干细胞的自我更新与分化，这个问题目前并不清楚。 /p p 　　早前的研究表明，白血病抑制因子(LIF)对于维持小鼠ESC的全能性至关重要。LIF属于IL-6细胞因子家族，能够通过共同受体gp130以及STAT3传递信号【7】。当LIF与异源二聚受体复合物(gp130和LIFR)结合后，偶联在受体胞内段的酪氨酸激酶JAK被激活，并且磷酸化gp130胞内段的酪氨酸残基，从而为STAT3蛋白的SH2结构域提供了锚定位点。当STAT3结合到受体之后，被JAK磷酸化从而二聚化，进而转运入核，激活靶基因的转录。磷酸酶SHP2可以通过去磷酸化gp130【8】，E3连接酶SOCS3可以通过负反馈机制抑制 STAT3激活【9】，从而终止 STAT3信号通路。LIF激活的STAT3可以和转录因子Oct4、Sox2、Nanog以及Smad1/5/8协同作用，共同维持小鼠ESC的全能性【10】。另外，STAT3可以促进TGF-β1【11】以及Smad7【12】的表达，并且与Smad3相互作用抑制TGF-β信号通路。虽然STAT3和TGF-β都可以诱导Smad7的表达，但是Smad7是否与STAT3信号通路存在直接的crosstalk，从而影响ESC的全能性，还有待阐明。 /p p 　　在冯新华课题组的这项研究中，研究人员首先发现Smad7在未分化的小鼠ESC中高表达，随着细胞的分化，其表达水平逐渐下降。在拟胚体(EB)分化实验中，过表达Smad7能够有效遏制干性基因的下降，从而维持细胞的全能性。而敲减Smad7会显著抑制小鼠ESC的自我更新，并且促进ESC向外胚层和中胚层分化。更重要的是，Smad7还会影响小鼠体细胞向iPSC重编程的过程。研究人员发现，在重编程的过程中，伴随着全能性基因的表达，Smad7的表达水平也会上升。如果敲减掉Smad7会明显减少iPSC克隆的形成。所以，不管是维持小鼠ESC的自我更新，还是提高体细胞的重编程效率，Smad7都起到了关键的调控作用。 /p p 　　考虑到Smad7最经典的功能就是TGF-β/BMP信号的抑制因子，所以一开始研究人员很自然地想到，Smad7很有可能是通过抑制TGF-β信号从而促进ESC的自我更新的。然而实验结果却很意外。通过使用TGF-β/BMP特异性的抑制剂，以及Smad7丧失其抑制TGF-β/BMP能力的点突变，都证明Smad7对ESC全能性的调控是不依赖于TGF-β/BMP信号通路的，这表明很有可能存在着一种全新的分子机制。 /p p 　　研究人员通过质谱方法分析了Smad7在小鼠ESC中潜在的相互作用蛋白，发现Smad7可能和gp130-STAT3信号通路存在直接的crosstalk。实验发现，Smad7果然能够在ESC中增强LIF激活的STAT3信号，并且同样也不依赖于TGF-β/BMP。那么，Smad7究竟是通过什么机制促进LIF-STAT3的呢?研究人员接下来又利用免疫共沉淀(Co-IP)的方法对gp130-STAT3信号通路中重要的蛋白进行了筛选，确认Smad7与共受体gp130存在直接相互作用。并且，Smad7在gp130上的结合区域恰好与gp130-STAT3的负调控因子SHP2/SOCS3的结合位点(Y759)重合。进一步的体外体内实验也都表明Smad7确实能够抑制SHP2/SOCS3与gp130的结合。最后还通过一系列实验证明了Smad7通过拮抗SHP2/SOCS3对LIF-STAT3信号通路的抑制作用，从而增强STAT3信号，维持ESC的自我更新(图2)。 /p p style=" text-align: center " span style=" color: rgb(153, 153, 153) " img alt=" " src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201709/uepic/788a24ab-41dd-434d-a720-fd0f26c21ef1.jpg" / br/ /span /p p style=" text-align: center " span style=" color: rgb(153, 153, 153) " 图2 & nbsp Smad7增强gp130-STAT3信号的分子机制 /span /p p 　　综上所述，该研究揭示了Smad7与STAT3信号的相互作用对于维持小鼠胚胎干细胞全能性的关键作用。我们知道，除了影响干细胞的全能性，TGF-β-Smad与gp130-STAT3信号通路的相互作用还存在于许多重要的生理病理过程。所以我们相信，这一全新的分子机制极有可能在炎症反应以及肿瘤中有更为广泛的影响。 /p p strong 冯新华教授简介 /strong /p p style=" text-align: center " strong img alt=" " src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201709/uepic/554e2711-ac5f-4eae-b779-3648256593f2.jpg" / br/ /strong /p p 　　冯新华，博士，国家特聘专家，现任浙江大学生命科学研究院教授 、首席研究员、院长 。1983年毕业于武汉大学生物系，1986年在中国科学院遗传研究所获得遗传学硕士学位，1992年在美国马里兰大学(University of Maryland-College Park)获得植物学博士学位。1993至1999年在美国加州大学旧金山分校(UCSF)先后从事博士后训练和担任研究助理教授，1999年底起在美国贝勒医学院(BCM)外科学系、分子与细胞生物学系担任助理教授 ，2003年获任为副教授(tenured)，2007年升为教授(tenured)，并兼任Duncan 癌症中心、STaR干细胞与再生医学中心、炎症生物学中心研究员。2009年底起回到浙江大学组建生命科学研究院，同年入选中组部“千人计划”。冯新华长期从事信号转导网络和蛋白质翻译后修饰在正常组织器官发育、干细胞维持和分化以及癌症发生和转移中的功能与机制研究，在国际上享有极高的学术声誉，尤其在TGF-β信号领域的研究处于国际领先地位。先后获得过Keck Distinguished Young Scholar、American Cancer Society Research Scholar、Leukemia & amp Lymphoma Society Scholar、Michael E. DeBakey Excellence in Research、AAAS Fellow、长江学者讲座教授以及浙江省有突出贡献中青年专家等重要学术奖项。先后担任国际主流学术杂志JBC 等6个学术杂志编委或副主编。回国后受到国家自然科学基金重大项目和科技部重大研究计划等资助。 /p

KRAS突变是最常见的致癌性突变，常见于包括肺癌、结直肠癌、胰腺癌等多种高发和高致死率的癌症。在所有KRAS突变中，KRAS（G12C）突变在肺癌中最高发，同时这种突变也常发生在结直肠癌和胰腺癌中。长期以来，由于 KRAS蛋白表面光滑、缺乏有效、稳定的药物结合位点，研发直接靶向KRAS突变蛋白的抑制剂一直未能实现。直到2013年，Shokat实验室首次报道了能够直接靶向KRAS（G12C）突变蛋白的抑制剂【1】：此类抑制剂与突变的半胱氨酸进行共价结合，通过结合非活性状态的KRAS（结合GDP）从而阻断KRAS（GDP）进一步通过“核苷酸循环”被激活 （GTP结合）【2】。经过一系列的发展，现在已有两种抑制剂（分别由Amgen和Mirati公司研制）进入临床试验，并且Amgen公司研发的抑制剂（Sotorasib）目前已通过美国FDA批准上市，用于非小细胞肺癌的治疗。 目前针对这类抑制剂的临床实验的结果表明，此类抑制剂虽然能够对30-40% 相关癌症患者起作用，但对于接受治疗的肺癌患者平均无病存活期只有6个月【3】，表明很大一部分患者在接受抑制剂治疗后会产生耐药。因此研究耐药机制能够有助于更有效的应用这类抑制剂。在2020年，美国斯隆凯特琳癌症研究中心（MSKCC）的Piro Lito 实验室首次报道了癌细胞能够在此类抑制剂作用后通过合成新的KRAS蛋白，后者在EGFR， SHP2及AURKA信号的作用下激活，使细胞无法继续被抑制进而导致细胞对该抑制剂快速耐受（详见BioArt报道：Nature | 癌细胞对KRASG12C抑制剂存在快速耐受性）【4】。然而对于此类抑制剂治疗产生耐药的基因层面的变化尚不清楚。 为了研究与该抑制剂耐药相关的基因变化，2021年11月10日，Piro Lito实验室与MSKCC的临床药物试验研究组以及AMGEN制药公司合作（第一作者为赵玉磊 和Yonina R. Murciano-Goroff, Jenny Y. Xue, Agnes Ang）在Nature上发表了文章Diverse alterations associated with resistance to KRAS(G12C) inhibition，获取了相关临床样本并结合临床前模型及相关基础实验，研究报道了针对Sotorasib耐药性相关的基因改变并提出了相应治疗方案。 该研究收集了共43例进行临床Sotorasib药物试验病人的治疗前、后的组织和/或游离DNA样本。通过对收集的病人样本进行高通量靶向基因测序，发现27位病人在经过该药物治疗产生耐药后的样本中含有包括KRAS，NRAS， BRAF, EGFR, FGFR2, MYC等不同的基因改变。其中～16%的病人样本中检测到RAS基因的改变（KRAS突变，NRAS突变及KRAS拷贝数增多）；另有3位病人存在BRAF突变。此外其他检测到的基因改变还包括：EGFR扩增及突变， FGFR扩增及突变，MET扩增，MYC扩增和IDH1/2突变等。然而从病人样本中检测出的与耐药相关的基因的等位基因突变频率（variant allele frequency，VAF）都非常低，因此并不能确定这些基因的改变是否能够导致耐药。为进一步确定，研究人员获取了8位临床病人样本并用其构建了人源小鼠荷瘤模型(PDX)，通过在这些模型上进行G12C抑制剂的治疗，然后获取分离耐药和对照组肿瘤，进行基因测序。在其中两个模型中检测到了KRAS 、BRAF突变；同时在另外3个对药物不敏感的模型中检测到了高基础拷贝数的KRAS基因，进一步提示BRAF，RAS突变与耐药性密切相关。与此同时，研究人员在体外构建了三株对此类抑制剂耐药的细胞系，并对其进行了单细胞基因测序。结果在三株细胞系中同样发现了RAS及BRAF致癌性基因突变。并且其中一株细胞中含有MRAS突变，MRAS与RAS蛋白家族同源，但MRAS突变在肿瘤中非常少见。通过单细胞测序分析发现，这些突变基因能够与KRAS（G12C）突变同时存在于同一个细胞中。这一发现不同于目前广泛认为的“RAS致癌突变互斥理论”。进一步研究人员对MSKCC临床样本库中8750例含有KRAS突变的未进行抑制剂治疗的肿瘤样本进行分析，结果发现～3%的肿瘤样本中同时含有多种RAS突变；而RAS突变的比例在治疗前、后的临床样本以及耐药模型中明显增高，分别为16% 和 22%。提示G12C抑制剂能够使RAS突变比例增高，同时RAS突变可能参与G12C抑制剂的耐药。 由于通过三种方式发现的治疗后的基因突变都是多克隆性的，为进一步证明所检测到的基因变化能够驱动对KRAS突变蛋白抑制剂耐药，科研人员将这些突变的基因克隆到通过dox诱导表达的载体中并导入对抑制剂敏感的细胞系中。在这些细胞中诱导表达这些突变基因同时进行不同浓度抑制剂作用，发现抑制剂作用下的细胞中KRAS（G12C）仍然处于抑制状态，但下游ERK的抑制状态却减弱，表明突变基因能够激活KRAS下游信号通路从而达到抑制细胞对药物的敏感性；同时发现，即便用很低的dox进行诱导RAS突变基因的表达，也能够降低细胞原本对抑制剂的敏感度，提示即便表达量低或者多克隆状态，这些突变基因也可能达到使肿瘤耐药的状态。为进一步证实这个推测，研究者用不同的荧光蛋白分别标记抑制剂敏感细胞（亲本细胞）和可诱导表达NRAS（Q61K）的细胞，然后将两种细胞按不同的比例进行混合，来模拟肿瘤中可能存在的低等位基因突变率的基因改变。通过进行对抑制剂浓度滴定测试，发现细胞的耐药性随着NRAS突变在混合细胞中所占比例的增高而增强。同时即便NRAS 突变细胞只占混合细胞的7%，也足以使50%的混合细胞丧失对抑制剂的敏感性，提示NRAS突变细胞能够使周围原本对药物敏感的细胞敏感度降低。为进一步证实这一假设，研究人员利用流式细胞仪对不同比例混合的并且经过抑制剂作用后的细胞进行分析，发现敏感细胞存活的比例随着NRAS突变细胞的比例增高而增高。综上证明，RAS及BRAF突变能够通过激活KRAS下游信号通路（细胞内调节）或者影响提高周围敏感细胞的耐药性（细胞间调节）从而引起肿瘤的耐药 。 既然继发性RAS突变能够引起癌细胞对于KRAS（G12C）抑制剂耐药，那么如何能够抑制这类基因改变所引发的耐药呢？为解决这一问题，研究人员利用CRISPR全基因组筛选技术对耐药细胞株（含有NRAS（Q61K）突变）和其相应敏感细胞株在有无抑制剂作用的条件下进行筛选，来寻找能够用来作为抑制此类耐药性的治疗标靶。筛选结果表明，NRAS， SHOC2， 及MAPK信号通路相关基因是引起耐药的主要原因。利用sgRNA 特定敲除SHOC2能够明显提高耐药细胞株对于KRAS（G12C）抑制剂的反应；同样地，siRNA靶向NRAS也能够有效提高耐药细胞株对抑制剂的敏感度。但由于目前尚无有效药物能够靶向上述两个基因，而同时筛选结果表明MAPK信号通路是主要引起耐药的原因，因此，研究人员进一步利用现有针对MAPK 信号通路的抑制剂（RAF 抑制剂，MEK抑制剂和ERK抑制剂）联合G12C抑制剂进行用于检测其对于耐药细胞株以及过表达不同RAS/BRAF突变的细胞系的治疗效果。结果表明，同时联合MAPK信号通路抑制剂能够有效抑制RAS/BRAF突变引起的耐药性细胞的增殖。进一步在小鼠皮下异种移植耐药细胞株或者人源肿瘤构建的模型中也发现联合应用MEK和KRAS（G12C）抑制剂相比单一抑制剂的治疗能够更有效地抑制肿瘤的生长。综上，本研究通过结合临床样本、人源肿瘤异种移植小鼠模型、以及耐药细胞株三种不同体系研究与G12C抑制剂耐药相关的基因变化，发现与耐药相关的基因变化呈现出异质性，多克隆性和低等位基因突变率（VAF）的情况，可能与临床样本取样以及缺乏持续性的药物筛选相关。进一步RAS、BRAF的突变经过验证证明在多克隆的情况下也能引起耐药，并且可能存在细胞间相互作用的调节方式能够驱动耐药。针对此类基因改变引发的耐药情况，研究结果提示联合使用MAPK信号通路抑制剂能够对此类突变引起的耐药性起到改善并且延长KRAS突变蛋白抑制剂的有效作用时间。原文链接：https://doi.org/10.1038/s41586-021-04065-2

三阴性乳腺癌 (TNBC) 是一种高度异质性的，复发率和远端转移率最高的乳腺癌亚型，目前很少有特异性疗法能够对 TNBC 患者实现持久性缓解。即使是免疫疗法，患者的缓解率也只有10-20%左右。尤其是对于中晚期三阴性乳腺癌患者的临床治疗方案仍然以化疗为主要手段。大约有15%的三阴性乳腺癌患者肿瘤存在成纤维细胞生长因子受体 (FGFR) 基因的拷贝扩增(amplification), 突变(mutation)，以及融合（fusion），这意味着FGF信号通路在肿瘤中的过度激活导致肿瘤生长，并且与肿瘤转移和生存率降低直接相关 。因此， FGFR也被认为是一个潜在的乳腺癌治疗靶点 。除乳腺癌外，FGFR基因异常广泛存在于多种实体瘤中，FGFR抑制剂也成为了近年来炙手可热的小分子药物之一，并且先后被FDA授予临床治疗胆管癌，膀胱癌以及胃癌。如果三阴性乳腺癌患者也能够受益于FGFR抑制剂，患者的生存率将会极大的改善。然而，乳腺癌患者对FGFR抑制剂治疗产生的耐药性是目前影响临床获批的最大阻碍 。因此，系统的研究FGFR抑制剂的耐药性机制，发现有效的联合用药靶点，并设计更为精准有效的组合疗法无疑将会为携带FGFR基因异常的肿瘤患者带来更多的希望。2021年11月4日，哈佛大学医学院，丹娜-法伯癌症研究所的李一豪和邱新涛博士（共同第一作者），以及刘小乐，Alex Toker 和Myles Brown 教授（通讯作者） 研究组在Nature Cell Biology上发表了文章FGFR-inhibitor-mediated dismissal of SWI/SNF complexes from YAP-dependent enhancers induces adaptive therapeutic resistance，发现了FGFR抑制剂治疗可导致SWI/SNF染色质重塑复合物从染色质上解离，这一过程促进了YAP/TEAD转录因子依赖型增强子的激活，并上调氨基酸诱导的 mTORC1信号途径从而对靶向治疗产生适应性耐药性。Infigratinib 是一种目前正在临床开发和应用于乳腺癌和其他实体瘤的FGFR抑制剂。为了系统的鉴定infigratinib的潜在联合用药靶点，作者选用了对于infigratinib 适中敏感的三阴性乳腺癌细胞系进行全基因组 CRISPR 基因敲除筛选，鉴定了调控细胞生长的关键因子mTOR 和 YAP的敲除可增加药物敏感性，而参与染色质重塑的SWI/SNF 复合物成员 ARID1A 与BRG1 的失活会导致细胞出现耐药性。与CRISPR 基因敲除筛选结果一致的是，长时间infigratinib处理会同样导致肿瘤细胞中mTORC1复合体的激活。有趣的是，YAP信号的靶基因以及多种氨基酸转运蛋白如SLC1A5，SLC7A5，SLC3A2等是在耐药过程中最显著上调的转录物和蛋白质。TNBC细胞内几种氨基酸，包括谷氨酰胺、精氨酸和亮氨酸，均在FGFR 抑制过程中大量积累。这些发现说明对 FGFR 抑制剂的适应性耐药性是由增加的氨基酸转运介导的，并导致 mTORC1 复合体的激活。这些结果表明，氨基酸转运蛋白在耐药过程中的高度表达很有可能与表观遗传变化有关。作者接下来发现FGFR抑制剂的长期处理导致了增强子在染色质开放区域高度激活，并且这些染色质区域含有大量的YAP/TEAD DNA 结合基序（motif）。几种氨基酸转运蛋白的增强子均在耐药过程中被激活并且可与YAP转录因子结合。而且，SWI/SNF 复合体及其核心蛋白BRG1的染色质结合谱也与YAP/TEAD 结合位点高度重合，但是对FGFR的抑制导致了BRG1从染色质上解离。与耐药过程相似的是，在TNBC细胞中敲除BRG1极大的促进了YAP依赖性增强子的激活以及YAP靶基因的转录。为了开发了精准性组合疗法用于潜在的临床转化，作者在FGFR基因异常的TNBC病人来源肿瘤异种模型（PDX）中测试了infigratinib与 mTOR抑制剂依维莫司或 YAP 抑制剂CA3联用的治疗效果。在大多数情况下，两种药物组合都可将肿瘤生长降低到基线以下，并显著抑制了肿瘤生长。鉴于infigratinib 和依维莫司在一些国家已经用于临床肿瘤治疗，靶向FGFR和mTORC1的联合用药方案可以快速的转化为临床试验，在其它FGFR异常表达的肿瘤中也具有潜在的临床应用前景。原文链接：https://doi.org/10.1038/s41556-021-00781-z

“世界心脏日今天9月29日是世界心脏日(World Heart Day)，是由世界心脏联盟确定，旨在世界范围内宣传有关心脏健康的知识，并让公众认识到生命需要健康的心脏。在全世界范围内，心血管疾病是威胁人类健康的高危病种，其危害无年龄、身份、地域之分。在中国，每年大约有260万人死于心脑血管疾病，死亡人数位列世界第二。《中国心血管健康与疾病报告2021》指出，每5例死亡中就有2例死于心血管病。急性心肌梗死(MI)是一种常见的由突发冠状动脉血栓形成和闭塞引起的心脏急症。急性心肌梗死期间持续的缺血组织损伤导致疤痕形成，进而可能心力衰竭。心肌梗死后形成的新血管可减轻疤痕和心功能恶化。然而心肌梗塞后形成血管生成和功能适应的细胞间的相互作用仍不完全清楚。下面跟随小编来看一下德国汉诺威医学院的研究人员今年发表在《Science》上的“心脏知识”。德国汉诺威医学院Kai C. Wollert研究团队发表题为Meteorin-like promotes heart repair through endothelial KIT receptor tyrosine kinase的研究。通过对急性心肌梗死的小鼠进行生物信息学分泌组分析，发现细胞因子METRNL(Meteorin-like) 在梗死边界区内皮细胞高度表达，促进心肌梗死后的血管生成、组织修复和功能适应。使用化学交联质谱法发现，KIT（受体酪氨酸激酶）是内皮细胞中METRNL细胞表面受体。为了评估METRNL是否与KIT的细胞外结构域结合，通过微量热泳动（MST）技术，检测到KIT-ECD-Fc可结合METRNL和SCF（KIT已知配体），并且亲和力很高（Kd分别是87nM和175nM）,而不与血管内皮生长因子A(VEGFA)结合。Pull Down实验获得相同的结果。图注：MST技术和Pull Down检测KIT的胞外结构域与METRNL，SCF和VEGFA结合随后，作者检测时发现METRNL的治疗会增强心肌梗死区域边缘的毛细血管化，限制瘢痕的形成并对心脏功能具有持续有益的影响。研究结果: 作者定义了一种基于METRNL的髓系细胞和内皮细胞之间的交叉信号，METRNL通过KIT依赖的信号通路介导内皮细胞的血管生成作用促进心肌梗死后组织修复，为急性心肌梗死的治疗提供了新的药物靶点。心脏是人体最重要的器官之一，无论工作或者科研再忙碌，一定要注意休息。马上就要国庆节了，让我们一起为劳苦功高的心脏放个假吧！文献参考：Reboll, Marc R., et al. "Meteorin-like promotes heart repair through endothelial KIT receptor tyrosine kinase." Science 376.6599 (2022): 1343-1347.*文内部分图片来源自百度，侵则删。

近日，来自奥地利维也纳医科大学的研究人员发现，通常在癌症中发挥癌基因作用的IL-6和STAT3信号途径在前列腺癌中发挥着不同的作用。相关研究结果发表在国际学术期刊nature communication上。 IL-6是一种重要的细胞因子，它在调控细胞存活和肿瘤生长方面发挥着重要作用。高活性的IL-6会促进肿瘤生长，而STAT3是其下游一个重要的效应因子，在许多类型的癌症中扮演着癌基因的作用。目前已经有许多靶向抑制IL-6和STAT3的治疗方法用于癌症治疗。 但根据这项研究的结果来看，IL-6和STAT3在前列腺癌中发挥的作用与人们以往的认识有些不同，研究人员发现，在前列腺癌细胞中，激活的STAT3能够激活ARF基因，阻断细胞分裂进而抑制细胞生长。 在这项研究中，研究人员在Pten缺失的前列腺癌小鼠模型中，在基因水平抑制了STAT3或IL-6信号途径，结果发现该信号途径失活可以加速癌症进展并导致癌转移。他们发现p19ARF是STAT3的一个直接靶向目标，STAT3信号途径缺失会扰乱ARF-Mdm2-p53这条肿瘤抑制因子轴，但不会影响细胞衰老。除此之外，研究人员还在人类前列腺癌细胞中发现了STAT3和CDKN2A突变，并且STAT3和CDKN2A缺失突变在转移性前列腺癌细胞中共发生频率非常高。 研究人员还发现，STAT3和p14ARF在病人前列腺肿瘤中缺失与前列腺癌复发和转移风险增加存在显著相关性。因此STAT3和ARF表达水平或可用作区分前列腺癌发生风险高低的诊断标记。 总的来说，这项研究发现在其它类型的癌症中发挥癌基因作用的STAT3在前列腺癌中发挥抑癌作用，并且这种抑癌作用是通过调节ARF的表达影响ARF-Mdm2-p53肿瘤抑制因子轴的作用实现的。STAT3以及ARF的表达水平或可用于预测前列腺癌风险，可以得到进一步开发应用yb-7640R XKR1膜转运蛋白XK抗体yb-5590R phospho-YWHAE(Thr232)磷酸化14-3-3E蛋白抗体yb-2340R 14-3-3 epsilon14-3-3E蛋白抗体yb-12358R CHI3L2软骨细胞蛋白39抗体yb-6754R YY1AP1肝癌相关蛋白2抗体（转录因子YY1结合蛋白1抗体）yb-5921R YBX-1核酸敏感元件结合蛋白1yb-1943R YB1y-盒结合蛋白1抗体yb-3605R YAP1原癌基因Yes相关蛋白1抗体yb-3477R Phospho-YB1(Ser102)磷酸化DNA结合蛋白B抗体yb-3476R Phospho-YAP1(Tyr407)磷酸化原癌基因Yes相关蛋白1抗体yb-1415R YY1核转录调节因子YY1抗体yb-3475R Phospho-YAP1(Ser127)磷酸化原癌基因Yes相关蛋白1抗体yb-4166R YES1原癌基因酪氨酸蛋白激酶Yes1抗体yb-5591R phospho-YES1 (Tyr426)磷酸化原癌基因酪氨酸蛋白激酶Yes1抗体yb-5592R phospho-YES1(Tyr537)磷酸化原癌基因酪氨酸蛋白激酶Yes1抗体yb-3478R Phospho-ZAP70 (Tyr315 + Tyr319)磷酸化zeta相关蛋白70抗体yb-3479R Phospho-ZAP70 (Tyr493)磷酸化zeta相关蛋白70抗体yb-3620R Phospho-Zyxin (Ser142+Ser143)磷酸化斑联蛋白抗体yb-13576R ZBTB41锌指蛋白924抗体yb-11608R ZIC3内脏异位相关蛋白/锌指蛋白203抗体yb-13564R zbtb11锌指蛋白913抗体yb-13557R ZBT24锌指蛋白450抗体yb-13560R ZA20D3锌指蛋白20D3抗体yb-13553R ZBED3锌指蛋白BED3抗体yb-13572R ZBTB38锌指蛋白ZBTB38抗体yb-13562R ZADH2锌结合乙醇脱氢酶结构域蛋白2抗体yb-13567R ZBTB3锌指蛋白ZBTB3抗体yb-13551R ZBBX锌指蛋白ZBBX抗体yb-12253R ZFP219锌指蛋白219抗体yb-12254R ZFP36L1EGF应答因子1抗体抗体yb-12255R phospho-ZFP36L1(Ser334)磷酸化锌指蛋白36抗体yb-12240R ZNF347锌指蛋白347抗体yb-13555R ZBED5锌指蛋白BED5抗体yb-12241R ZNF704锌指蛋白704抗体yb-13586R ZNF434宫颈癌抑癌蛋白5/锌指蛋白434抗体yb-0354R ZCWCC1ZCWCC1抗体yb-0628R ZNF300锌指蛋白300抗体yb-13573R ZBTB39锌指蛋白ZBTB39抗体yb-11609R Zic1锌指蛋白201抗体yb-11610R Zic2锌指蛋白Zic2抗体yb-8641R ZDHHC-18锌指蛋白Zdhhc18抗体yb-6958R ZDHHC-12锌指蛋白Zdhhc12抗体yb-7852R ZWINT着丝粒ZW10相互作用蛋白1抗体yb-9139R ZNRF1锌指/环指蛋白1抗体yb-9140R ZNRF2锌指/环指蛋白2抗体

Extracellular signal-regulated kinase（ERK）是胚胎发生，细胞分化，细胞增殖和细胞死亡调控的关键组成部分。ERK途径起源于质膜中的活化受体，并通过Ras/Raf/MEK至ERK（图1）。图1. Ras/Raf/MEK/ERK信号级联将信号从细胞表面受体如EGF受体（EGFR）传播到细胞内蛋白质。ERK是该途径的最终组分，并且在被生长因子（例如EGF（表皮生长因子））激活后，触发下游效应，如激酶或转录因子的激活。该途径被不同类型的受体激活，包括受体酪氨酸激酶 （例如EGF受体）以及G蛋白偶联受体。作为信号传导途径的最终组分，ERK磷酸化不同的细胞内蛋白质，包括大量其他激酶和转录因子。ERK信号传导途径存在于各种癌症类型中，因此正在研究作为治疗干预的靶标。在这里，我们描述了如何在Operetta CLS高内涵分析系统上自动化研究ERK信号传导的活细胞FRET测定。该测定可以用于药物发现。基于FRET的ERK生物传感器FRET是从供体分子到受体分子的非辐射能量转移。能量转移需要供体和受体间隔小于10nm，因此提供了研究分子接近度变化的敏感工具，例如蛋白质 - 蛋白质相互作用（分子间FRET）或蛋白质的构象变化（分子内FRET）。在这项研究中，我们专注于分子内FRET，使用称为EKAREV的CFP-YFP生物传感器（图2）。稳定表达EKAREV的细胞由Somponnat Sampattavanich博士友情提供（图3）。在该生物传感器中，供体和受体荧光团以单一融合蛋白编码。EKAREV生物传感器经过优化，可以减少随机触发的基础FRET信号，并使其可靠地与距离相关。ERK对EKAREV的磷酸化触发构象变化，使CFP和YFP靠近诱导FRET。图2.细胞外信号调节激酶活性报告基因（EKAREV）的示意图。在该生物传感器中，两种荧光蛋白通过ERK底物结构域，接头和结合结构域分开。一旦ERK底物结构域经过ERK的磷酸化，就会触发构象变化，使CFP和YFP紧密接近并允许FRET发生。EKAREV生物传感器是分子内FRET的实例，其中供体和受体以1：1的固定化学计量存在。因此，进行双通道比率实验就足够了，通道1检测受体发射光(IAcceptor)，通道2检测供体发射(IDonor)，将得到的两个荧光信号强度进行背景校正，并计算它们的比率以给出相对FRET效率EFRET:测定方法将1.2×104EKAREV细胞/孔接种到CellCarrier-96Ultra微量培养板（PerkinElmer＃6055300），150μl培养基（表1）中。孵育2天后（37℃，5％CO2），150μl饥饿培养基洗涤两次并在饥饿培养基中孵育5小时以降低基础ERK活性。另外，在孵育开始时向细胞中加入各种浓度的抑制剂或DMSO。4.5小时后，将细胞核用4μM DRAQ5在37℃，5％CO2下染色30分钟。然后用饥饿培养基洗涤细胞一次，并加入含有8μl 20x浓缩抑制剂或DMSO对照的150μl新鲜饥饿培养基。作为对照，在某一时间点，向细胞中加入8μl20x浓缩诱导物（PMA或EGF）。为了抑制FRET信号，应用PD184352，SCH772984和Ulixertinib。含有或不含有所测试化合物的最高DMSO浓度的培养基用作对照。试剂，化合物和介质列表成像在宽场模式下使用20x高NA物镜（NA 0.8）在Operetta CLS系统上建立长时间实验，获取图像总共97分钟。将FRET诱导化合物添加到血清饥饿细胞后，开始时间序列，测量间隔为每8分钟一次，在此设置中获得了四个渠道：DRAQ5 （ex 615-645，em655-760），CFP（ex 435-460，em 470-515），YFP（ex490-515，em 525-580）和FRET（ex 435-460，em 515-580）（图3）。图3.稳定表达EKAREV生物传感器的人乳腺上皮细胞。细胞核用DRAQ5染色。随后，在Operetta CLS系统上使用宽场模式的20x高NA物镜对细胞成像。分析策略使用Harmony® 高内涵成像和分析软件进行自动图像分析。简言之，将图像分割成细胞和背景。计算细胞质和背景中的供体和FRET强度，然后计算背景校正的FRET比率作为最终结果（图4）。图4.使用Harmony软件进行比率FRET定量的图像分析工作流程：细胞和背景的细胞质被分段，低表达细胞被强度阈值排除。量化供体和FRET通道的强度及其适当的背景，并计算背景校正的FRET强度比。减去背景强度在活细胞应用中尤其有利，其中具有自发荧光组分的培养基通常导致更高的背景并因此导致更小的测定窗口。结果为了探索是否可以使用基于FRET的生物传感器在Operetta CLS上研究ERK信号传导的调节，用不同的ERK和MEK激活剂和抑制剂处理EKAREV细胞。（图5）。图5.外源添加的活化剂（绿色）和抑制剂（红色）示意图及其对ERK信号通路的影响。表达EKAREV的细胞用EGF或PMA处理以诱导ERK活化，另外，用三种MEK和ERK特异性抑制剂（PD184352，SCH772984，Ulixertinib），在途径的不同位置中断信号转导。PMA和EGF充当Ras/Raf/MEK/ERK信号级联的特异性激活剂。EGF特异性结合细胞表面上的EGF受体，而PMA作为亲脂性，膜可渗透的分子通过直接激活RAF激活该途径。PD184352可以通过选择性抑制MEK1/2来抑制ERK途径，而Ulixertinib和SCH772984都是ERK1/2的有效和选择性抑制剂。首先，为了更多地了解FRET诱导和抑制的动态性质，记录了97分钟的长时实验。正如所料，与未处理的对照相比，单独用EGF或PMA处理细胞导致FRET比率的强烈增加（图6）。大约30分钟后信号处于高位。对照显示较低水平的ERK活化，并且观察到随时间稳定增加。由于ERK1/2可以通过多种生长因子和有丝分裂来调节，这可能是由活细胞成像过程中的自分泌或旁分泌信号引起的。用不同浓度的ERK抑制剂（SCH772984）共同处理细胞导致ERK反应的剂量依赖性降低。在5μMSCH772984中，通过EGF的ERK活化几乎可以忽略不计，表明在该浓度下ERK被完全抑制。请注意，0.5％DMSO是实验中使用的最高浓度，确实对FRET比率有影响，因此需要包括此对照。用第二种ERK1/2特异性抑制剂Ulixertinib获得了类似的结果（数据未显示）。图6.在Operetta CLS系统上使用基于EKAREV FRET的生物传感器的ERK信号传导的时间进程。通过EGF或PMA刺激ERK诱导快速FRET信号增加，在约30分钟后平稳。高浓度的SCH772984（5μM）导致几乎完全抑制ERK活化（1μg/ ml EGF），没有可测量的FRET信号增加。较高稀释度的SCH772984仅部分抑制EGF诱导的ERK活化。control显示没有任何处理的样品有中间轻微上升的FRET信号。0.5％DMSO略微抑制FRET信号，这是实验中使用的DMSO的最高浓度。测定统计：Z' = 0.87（在时间点32分钟计算，DMSO为阴性，EGF为阳性对照）当FRET信号在32分钟后达到恒定水平时，选择该时间点以确定SCH772984的IC50值。用1μg/ mL EGF和系列稀释的SCH772984处理EKAREV细胞，稀释范围为10pM至3μM。计算的IC50值为272nM的剂量反应曲线如图7所示。图7.ERK抑制剂SCH772984导致基于FRET的EKAREV信号的剂量依赖性降低。在1μg/ ml EGF存在下，用递增浓度的SCH772984处理EKAREV细胞。在孵育32分钟后，在Operetta CLS系统上测定FRET比率，因为信号在此时间点稳定。高Z' 值（Z' = 0.89）显示出优异的分析性能。为了研究EKAREV FRET成像测定是否可用于研究直接作用于MEK1/2的途径调节，测试了MEK1/2抑制剂PD184352对PMA化细胞的作用（图8）。如图所示，PD184352抑制PMA诱导的ERK活化。图8.在Operetta CLS系统上测量的PD184352对PMA活化的Ras/Raf/MEK/ERK信号级联的抑制。EKAREV细胞用另一组活化剂和抑制剂（PMA+PD184352）处理，其作用在RAF/MEK的上游（与图5比较）。用200或2000nM PMA处理的EKAREV细胞显示出高FRET反应（诱导后32分钟）。通过将细胞与MEK1/2特异性抑制剂PD184352以10μM的浓度共孵育来抑制活化。结论EKAREV FRET生物传感器可用于Operetta CLS系统的活细胞成像测定，以研究ERK的激活和抑制。级联内不同靶标的调节很容易测量，因此这种方法可以有助于鉴定干扰Ras/Raf/MEK/ERK信号级联的新化合物。该测定在活细胞中进行，因此它可用于分析ERK信号传导动力学，而定量ERK磷酸化的常规生物化学技术通常是终点测定。尽管细胞群中生物传感器表达水平相对不均匀（图3），但FRET比率的计算提供了特别好的化验数据和统计数据，Z' 值高于0.87。EKAREV生物传感器的优化设计，Operetta CLS系统的高质量成像以及Harmony内图像分析的出色工具都有助于提高这里提供的高含量FRET分析的稳定性。Harmony软件的构建模块概念允许创建易于设置和理解的图像分析序列，并且不需要专业的图像分析知识。该测定还提供了Opera Phenix™ 高含量筛选系统的可比较结果和测定统计数据。由于Operetta CLS和Opera Phenix系统比传统显微镜具有更高的通量，基于FRET的生物传感器的高含量成像为药物发现和细胞信号传导中的基础研究开辟了新的可能性。参考文献1. Pearson, G., Robinson, F., Beers Gibson, T., Xu, B-E.,Karandikar, M., Berman, K. & Cobb, M. H. (2001).Mitogen-Activated Protein (MAP) Kinase Pathways: Regulation and Physiological Functions. Endocrine Reviews, 22(2), 153-183. doi/10.1210/edrv.22.2.04282. Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Morgan, D., Raff, M.,Roberts, K. & Walter, P. (2007) Molecular Biology of the Cell,Garland Science., 5th revised edition, ISBN-10: 08153410593. McCubrey, J. A, Steelman, L. S., Chappell, W. H., Abrams,S. L., Wong, E. W. T., Chang, F., Lehmann, B., Terrian, D.M., Milella, M., Tafuri, A., Stivala, F., Libra, M., Basecke, J.,Evangelisti, C., Martelli, A. M., and Franklin, R. A. (2007):Roles of the Raf/ MEK/ERK pathway in cell growth, malignant transformation and drug resistance. Biochimica et Biophysica Acta, 1773,1263–84. doi:10.1016/j.bbamcr.2006.10.0014. F?rster, T. (1948). Zwischenmolekulare Energiewanderung und Fluoreszenz. Annalen der Physik 437 (1-2), 55-75.5. 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近日，中科院大连化学物理研究所研究员王方军团队与南方科技大学教授田瑞军、副教授李鹏飞等人合作，利用193nm紫外激光解离—质谱装置，实现了免疫共受体CD28磷酸化胞质端与激酶PKCθ的C2结构域识别结合机制解析。相关研究成果发表在Cell Chemical Biology上。与常规毫秒级碰撞诱导质谱解离（CID）相比，5ns单脉冲193nm紫外激光解离（UVPD）可直接激发非变性蛋白质骨架共价键至高能态引发高效解离，激发解离速率提升6个数量级，位点解离效率和碎片离子产率与其局部非共价作用和微观结构密切相关，通过碎片离子和解离产率分析可同时获得蛋白质序列和结构信息。目前，193nm紫外激光解离质谱尚未商品化设备，仅在少数实验室有自主搭建设备。免疫共受体CD28是癌症免疫治疗的重要靶点，其胞质端酪氨酸磷酸化激活引起的下游蛋白识别结合机制尚不清楚。本工作中，研究人员采用光亲和质谱法发现CD28磷酸化胞质端与激酶PKCθ的C2结构域特异性结合；利用193nm紫外激光解离质谱对C2结合前后进行了全序列覆盖位点光解离效率的差异分析，发现了光解离效率显著下降的三个关键结合区域和核心识别位点K49、H63、R68；证明了高能紫外激光解离策略在蛋白质动态识别结构变化分析中的高灵敏度和单位点分辨高精度优势。团队通过交叉学科联合攻关，在大连相干光源搭建了193nm紫外激光解离-高分辨质谱装置，在前期工作中通过高能光子对多肽分子的高效激发解离实现了多磷酸化肽修饰位点精确定位和蛋白质组学规模化序列鉴定。相关论文信息：https://doi.org/10.1016/j.chembiol.2022.01.005

p style=" line-height: 1.5em text-align: justify text-indent: 2em " span style=" text-align: justify " 日前，黄超兰课题组及合作者的最新成果，利用新型绝对定量质谱法解析T细胞受体(TCR)磷酸化修饰动态全过程，揭示了CD3ε 的新型信号转导及其在CAR-T细胞治疗中的应用。相关成果近日发表在《Cell》。 /span br/ /p p style=" text-align: center" img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 600px height: 193px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202007/uepic/c9be87de-7748-4400-ab38-28fab92a68ad.jpg" title=" 黄超兰.png" alt=" 黄超兰.png" width=" 600" height=" 193" border=" 0" vspace=" 0" / /p p style=" text-align: justify " strong span style=" text-align: justify " 　　2020年7月29日，北京大学医学部精准医疗多组学研究中心黄超兰团队，中科院上海生化与细胞所许琛琦团队、美国加州大学圣地亚哥分校惠恩夫团队，联手在Cell上发表了题为“Multiple signaling roles of CD3ε and its application in CAR-T cell therapy”的论文，该研究通过开发基于质谱的绝对定量蛋白质组新方法，揭示了T细胞受体-共受体(TCR-CD3)复合物酪氨酸在不同抗原刺激下的动态磷酸化修饰全貌，解析了不同CD3链ITAM结构域磷酸化特征的奥秘，从中发现了其中一条亚基CD3ε的单磷酸化新功能，有望助力于设计全新的CAR-T疗法。 /span /strong /p p style=" text-align: justify " strong span style=" text-align: justify " /span /strong /p p style=" text-align: center" img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 600px height: 245px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202007/uepic/b6abe943-5c1a-4258-8d80-ee14ae449013.jpg" title=" high light.png" alt=" high light.png" width=" 600" height=" 245" border=" 0" vspace=" 0" / /p p style=" line-height: 1.5em text-align: justify " 　　TCR-CD3复合物在T细胞的发育、激活及对病原的免疫反应中起着决定性作用。这一重要作用来自于CD3链胞内端的免疫受体酪氨酸激活基序(Immunoreceptor tyrosine-based activation motif-ITAM)。而ITAM的多样性功能主要取决于其结构域的酪氨酸(Tyrosine)磷酸化，比如招募SYK激酶家族蛋白ZAP70进而激活下游的信号传导。另外，ITAM的功能也被广泛应用在对嵌合抗原受体(CAR)的研究中。其中CD3ζ亚链便常用于构建CAR-T细胞疗法抗肿瘤活性，但其他CD3链的功能和对于CAR的设计也还有很多未知。 /p p style=" line-height: 1.5em text-align: justify " 　　 strong 深入探索 CD3 ITAM的酪氨酸动态磷酸化模式可为全面理解不同CD3链的功能提供核心信息。 /strong TCR-CD3受体复合物有10个ITAM结构域分布着20个磷酸化位点，在时间分辨率下实现对全部磷酸化位点的同时定量分析在技术上极具挑战性。为了直观比较不同TCR刺激下的磷酸化模式，精确绘制出TCR所有酪氨酸磷酸化的动态过程，黄超兰团队开发了一种新颖的绝对定量方法Targeted-IP-Multiplex-Light-Absolute-Quantitative Mass Spectrometry(TIMLAQ-MS)。区别于目前报道的蛋白组绝对定量手段，不需要加入同位素重标的合成肽段，而是巧妙地利用串联质量标签(TMT)，设计将6个标准样品和4个分析样品混合起来作为内标。标准样品为不同浓度梯度的合成非重标磷酸化/非磷酸化CD3肽(A)和从未经抗原刺激的T细胞中通过IgG抗体免疫沉淀下来的背景蛋白(B)的混合物 用数据依赖采集(Data-dependent acquisition, DDA)结合平行反应监测(Parallel reaction monitoring, PRM)的方式获得抗原刺激下，TCR-CD3免疫沉淀(IP)复合物中不同酪氨酸位点的磷酸化/非磷酸化在不同时间点的定量结果。 strong TIMLAQ 成功绕过了以前的定量方法中通常使用的同位素重标记肽，既节约了成本，又有效降低了方法的复杂性和数据采集误差，进一步提高了定量准确性，最终可完全实现在一次测量中对不同时间点全部ITAM磷酸化修饰的绝对定量，描绘TCR-CD3复合物的酪氨酸动态磷酸化修饰全貌。 /strong /p p style=" text-align: center" img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 600px height: 492px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202007/uepic/17408230-fe19-4e90-a93b-06bbeea1254b.jpg" title=" 111.png" alt=" 111.png" width=" 600" height=" 492" border=" 0" vspace=" 0" / /p p style=" line-height: 1.5em text-align: center " 基于TIMLAQ-MS法的CD3 ITAM磷酸化修饰鉴定 /p p style=" line-height: 1.5em text-align: justify " 　　 strong 利用这一方法鉴定到在不同的TCR刺激条件下，CD3各亚基主要表现为双磷酸化修饰模式，而唯独CD3ε呈现出单磷酸化修饰模式。 /strong 前研究表明，双磷酸化的ITAM与激酶家族蛋白ZAP70有很强的结合而激活下游信号传导，而单磷酸化的ITAM则表现出很低的结合性。 strong 本文中这一特殊的新发现驱使作者进一步深入探索CD3ε在TCR通路中的新潜在功能。 /strong 结果显示，单磷酸化的CD3ε可通过专门募集抑制性Csk激酶减弱TCR信号传导， strong 说明TCR中既有激活基元又有抑制基元，总体呈现为一种自制的信号传导机制。 /strong 作者团队进一步深入研究，发现一旦将CD3ε细胞质结构域整合到第二代CAR中，CD3ε的ITAM结构域可以通过募集Csk减少CAR-T细胞因子的产生，而CD3ε的BRS结构域则可以通过募集p85促进CAR-T细胞的持久性。总体而言，将CD3ε应用于CAR的设计可显著提高CAR-T细胞的抗肿瘤活性。 /p p style=" line-height: 1.5em text-align: justify " 　 strong 　从一个重要的基础生物学问题开始，为解决问题而开发一个新颖方法，得到新发现，再深入探索生物学功能，最后有望贡献在治疗方法上。黄超兰教授，许琛琦教授和惠恩夫教授作为本文的共同通讯作者，完美地演绎了不同交叉领域共同合作而产生的精彩结果。 /strong /p p strong /strong /p p style=" text-align: center" img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 600px height: 338px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202007/uepic/e5f4a9aa-d6b8-4604-a6a5-28e0177de6e9.jpg" title=" 222.png" alt=" 222.png" width=" 600" height=" 338" border=" 0" vspace=" 0" / /p p style=" text-align: justify " span style=" text-align: justify " 　　黄超兰教授是北京大学医学部精准医疗多组学研究中心主任，北京大学医学部基础医学院长聘副教授，北京大学生命科学联合中心研究员，曼彻斯特大学荣誉教授。近年来，黄超兰教授带领团队积极开发基于质谱的蛋白质组学新方法，实验室拥有国际领先的仪器、技术和方法，致力于为生物学和临床研究中遇到的难题提供最有质量保证的全面蛋白质组和质谱技术手段。 仅从2015年至今，黄教授在高影响因子的杂志上就发表了近50篇文章 (目前已累计发表SCI论文80余篇)，不但自己开发最前沿的质谱技术(迄今为止，课题组研发的单细胞蛋白质组技术，在单一体细胞中鉴定的蛋白数量是全球领域最高水平)，更发挥了强大的合作力量，以她高超的质谱技术助力了众多科学家的科研发展。曾协助美国普林斯顿大学教授，美国科学院外籍院士颜宁课题组，利用质谱技术有效分析了ACAT1蛋白周围游离的脂质，为ACAT1作用底物的鉴定提供了最为直接有效的证据，相关工作发表在Nature上 sup 1 /sup 。最重量级的是协助中科院院士，西湖大学校长施一公教授利用高分辨交联质谱技术对剪接体复合物的成分和相互作用进行准确鉴定，促进了剪接体复合物在冷冻电镜上的超高分辨率结构鉴定，相关工作发表在两篇Science上 sup 2，3 /sup 。 /span /p p style=" text-align: justify line-height: 1.5em text-indent: 2em " strong span style=" text-align: justify " 北京大学医学部精准医疗多组学研究中心 /span /strong span style=" text-align: justify " ，在“双一流”的支持下，正式成立于2018年6月，为北京大学医学部直属二级单位。黄超兰教授担任中心主任。中心主要基于临床医学热点和难点问题，通过临床医学，创新技术和基础学科的交叉，开展协同创新研究和研发，攻克医学重大难题。 /span span style=" text-indent: 2em " 以重要的临床问题为根，利用前沿的高通量多组学技术（基因、转录、蛋白、翻译后修饰、代谢、微生物）和人工智能分析手段，结合临床信息，打造成规模化专业化的临床生物标志物（包括疾病预防，诊断，机制，疗效和药物靶点）开发、验证和标准化的创新平台。 /span /p p style=" text-align: justify " span style=" text-align: justify " br/ /span /p p style=" line-height: 1.5em text-align: justify " 　　原文链接： a href=" https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.07.018" target=" _blank" https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.07.018 /a /p p style=" line-height: 1.5em text-align: justify " br/ /p p style=" line-height: 1.5em text-align: justify " 　　参考文献： /p p style=" line-height: 1.5em text-align: justify " 　 span style=" font-size: 14px " 　 sup 1 /sup Qian et al., Nature, 2020 581(7808):333-338 /span /p p style=" line-height: 1.5em text-align: justify " span style=" font-size: 14px " 　　 sup 2 /sup Yan et al., Science, 2015 349(6253):1182-1191 /span /p p style=" line-height: 1.5em text-align: justify " span style=" font-size: 14px " 　　 sup 3 /sup Wan et al., Science, 2016 351(6272):466-475 /span /p p br/ /p

在阿尔茨海默病（AD）进展中，存在beta淀粉样蛋白（β-Amyloid，Aβ）的积累。Aβ在受影响的脑组织区域形成病理性聚集，被认为与AD的发生、进展和表型密切相关。多种翻译后修饰（如磷酸化、硝基化、糖基化等）对Aβ的病理性聚集及体内生物活性具有重要且不同的调控作用。在AD患者脑内，多种病理相关蛋白的糖基化位点、数量和水平都发生了显著性改变，表明了糖基化修饰在AD发生和发展中的重要意义。2011年，科学家对AD病人脑脊液中的Aβ片段进行鉴定，检测到之前未在哺乳动物中发现的酪氨酸O-糖基化修饰，然而由于天然来源的翻译后修饰蛋白丰度低、微观不均一等困难，Aβ糖基化修饰的生物学功能及在疾病中的作用尚未能得以阐释。　　近日，中国科学院上海有机化学研究所生物与化学交叉研究中心刘聪课题组与北京大学药学院董甦伟课题组合作，在J. Am. Chem. Soc.上发表题为O-Glycosylation Induces Amyloid-β to Form New Fibril Polymorphs Vulnerable for Degradation的研究论文，利用化学合成策略构建了一系列含不同O-糖基化修饰的均一结构Aβ，并系统研究了糖基化修饰对Aβ病理性聚集的调控作用及其构效关系。　　该研究中，研究人员首先合成了三种O-糖修饰的酪氨酸砌块，糖基分别是α-GalNAc, Galβ1-3GalNAc和Neuα2,3Galβ1-3GalNAc。然后，通过固相多肽合成策略将上述三种酪氨酸砌块制备相应的Aβ糖肽。然而，Aβ含有较多大位阻氨基酸，且自身疏水性强、容易聚集，再加上糖基的引入，给Aβ糖肽的合成带来了不少困难。为了克服这些合成难题，研究人员利用微波辅助的合成策略以及多赖氨酸亲水标签等方法，以较高效率获得了结构均一、含有不同O-糖修饰的Aβ糖肽。他们进一步对三种Aβ糖肽和不含糖链的Aβ多肽进行性质表征，发现糖基化修饰能够显著抑制Aβ的聚集，并且抑制效果与糖链结构相关。通过对Aβ聚集/解聚动力学的进一步研究，表明糖基修饰可以降低纤维结构的稳定性。在酶解实验中，糖基修饰的Aβ纤维表现出了更差的酶解稳定性。　　为进一步阐述糖基化修饰降低Aβ纤维稳定性的分子机理，研究人员通过冷冻电镜技术（Cryo-EM），获得了Galβ1-3GalNAc糖型Aβ纤维的3.1埃近原子级分辨率结构。糖基修饰的Aβ组装形成了一种全新的淀粉样纤维结构，其纤维核心由6-42位氨基酸残基组成，并且在Tyr10残基侧链附近可以观察到修饰糖基的电子密度。通过与未修饰的Aβ纤维核心结构进行比较，研究发现Tyr10的糖基化会增大其与相邻氨基酸残基的空间位阻，从而导致整个Aβ纤维核心结构的重排。相较而言，糖基化Aβ纤维的结构具有更小的原纤维间交互界面，且仅由两对盐桥（Asp23和相邻原纤维的Lys28）所维持。这为糖基化修饰降低Aβ纤维稳定性提供了分子层面的解释。　　该工作首次发现糖基化修饰在动态调控Aβ病理性聚集方面的重要功能，为后续研究不同糖基修饰对神经退行性疾病病理蛋白聚集的生物活性及病理毒性的调控作用，提供了有利的研究工具及新的研究思路。该工作得到了国家自然科学基金委、北京市自然科学基金委和中科院稳定支持基础研究领域青年团队计划的资助。　　论文链接

近日，中国科学院上海药物研究所药物发现与设计中心罗成研究员团队与大连化物所生物技术研究部生物分子结构表征新方法研究组王方军研究员团队合作，通过整合赖氨酸反应性分析质谱（LRP-MS）和非变性质谱（nMS）的结构质谱策略，发现了小分子抑制剂SR-4835诱导细胞周期蛋白依赖性激酶12/13-细胞周期蛋白K复合物（CDK12/CDK13-Cyclin K）变构激活解离的抑制新机制，为CDK12/CDK13小分子抑制剂的理性设计开拓了新思路。2023年5月19日，该工作以“Structural Mass Spectrometry Probes the Inhibitor-Induced Allosteric Activation of CDK12/CDK13-Cyclin K Dissociation”为题，发表在《美国化学会志》（Journal of the American Chemical Society）上。CDK12和CDK13在转录和mRNA加工中发挥重要的调节作用，靶向抑制CDK12和CDK13已在体外模型中被证明是多种癌症治疗的有效手段。但是还没有CDK12/CDK13的小分子抑制剂被批准在临床使用。目前仍然缺乏对小分子抑制动态相互作用分子机制进行高通量表征的方法，极大限制了CDK12/CDK13抑制剂的理性设计和相关药物研发。在本工作中，合作团队发展了整合LRP-MS和nMS的结构质谱策略，系统研究了多种小分子抑制剂调控下CDK12/CDK13-Cyclin K复合物的动态构象变化和整体蛋白组装。研究团队通过前期发展的LRP-MS策略获得了包括抑制剂结合口袋、结合强度、界面分子细节和动态构象变化在内的分子作用结构信息；发现SR-4835能够使CDK12/CDK13-Cyclin K相互作用界面赖氨酸标记反应性（溶剂可及性）显著增大，推测其诱导了CDK12/CDK13-Cyclin K复合物的解离。进一步，利用自主研发的高灵敏度静态电喷雾离子源和nMS分析证明了SR-4835能够有效减弱CDK12/CDK13-Cyclin K的相互作用，并通过免疫共沉淀试验在活体细胞水平进行了验证。相关研究结果展示了LRP-MS整合nMS在分子水平评估和理性设计激酶抑制剂的巨大潜力。 图1.赖氨酸反应性分析质谱研究CDK12/CDK13-Cyclin K变构机制王方军团队致力于发展生物大分子质谱新仪器和新方法，在大连相干光源搭建了高能紫外激光解离—串联质谱仪器，已在蛋白质及其复合物动态结构和相互作用的质谱分析中取得了系列研究进展（J.Am.Chem.Soc.，2023；Cell Chem.Biol.，2022；CCS Chem.，2022；Chem.Sci.，2021）。罗成团队基于药物设计和化学生物学技术，在蛋白质动态调控与创新药物早期发现取得系列研究进展(Nature,2021 Cancer Cell,2023 Nature Communi,2022等)。该工作的共同第一作者为大连化物所1822组联合培养硕士研究生白玉、刘哲益副研究员以及南京中医药大学/上海药物研究所联合培养博士研究生李元卿。该工作的通讯作者为王方军研究员与罗成研究员。项目获得科技部前沿生物重点专项、基金委、中科院和临港实验室等项目的资助。

中药资源丰富，历史悠久，在预防与治疗疾病中扮演着重要的角色。然而，中药的化学成分多种多样，作用机制更是复杂多样，如何从中药中筛选疾病相关药效物质是当前亟待解决的关键问题。大量研究表明，人体许多疾病过程都与体内生物酶调节作用相关，如痛风[1]、阿尔茨海默症[2]、糖尿病[3-5]等。而且，中药在治疗各种疾病中也扮演着重要角色，如白芷提取物能促进新生血管形成与成熟，从而提高自发2型糖尿病小鼠创面愈合速率和质量[6]；绞股蓝叶水提物能够降低链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠的血糖，其作用机制可能与增加骨骼肌肌膜葡萄糖转运体4蛋白表达和抑制骨骼肌炎症有关[7]。因此，基于酶在疾病发生发展的重要性，以酶为靶点从中药中筛选新药是一有力途径，而且开发一种快速、高效的酶抑制剂筛选方法是当前首要任务。固定化酶技术是20世纪60年代发展起来的，该技术利用物理或化学方法将游离酶固定在相应的载体上用于筛选酶抑制剂。固定化酶技术可以有效提高酶的催化性能和操作稳定性，并降低成本，是目前广泛使用的技术[8]。此外，相比于游离酶，固定酶更有利于酶-配合物的分离纯化，在pH耐受性，底物选择性，热稳定性和可回收性等方面表现出优越的性能[9-10]。不同的酶发挥催化作用的活性部位不同，将酶进行固定时，要使载体材料与酶的非活性部位结合，才可以保留酶的活性，因此载体材料的选择是固定化酶技术发挥作用的关键。本文以固定载体材料（表1）为分类综述了近10年固定化酶技术在中药酶抑制剂[α-葡萄糖苷酶（α-glucosidase，α-Glu）、脂肪酶等] 筛选中的研究现状，希望可以为后续的相关研究提供一定的参考依据。1 磁性载体磁性载体材料是利用铁、锰、钴及其氧化物等化合物制备的一类具有磁性的材料[11]，通过改变磁力大小和外部磁场的方向来改变粒子的运动轨迹，从而使酶与载体的结合与分离可以在可控条件下完成，便于固定化酶的分离和收集，并用于酶抑制剂的筛选[12]。以磁性载体为材料的固定化酶技术的最大优点在于利用磁力吸引可使固定化酶快速从反应体系中分离，且固定化方法简单，能有效减少筛选时间及实验试剂的消耗。因此，通过不同方法对磁性载体材料进行功能化修饰，在充分发挥磁性材料优势的基础上改善其表面性质，提高对不同类型目标物的特异性，从而在各类复杂样品的前处理过程中有着良好的应用潜力[13]。目前，磁珠是近年来发展起来的一种常用的磁性载体材料，也叫做磁性纳米粒子，包括氧化铁（Fe3O4和γFe2O3）、合金（CoPt3和FePt）等。其中，Fe3O4纳米粒子具有生物相容性和无毒性等优点，被广泛应用于酶的固定化。中药酶抑制剂筛选中的常用磁珠其磁核以Fe3O4纳米粒子为主，壳层为二氧化硅、琼脂糖、葡聚糖等，是具有超顺磁性的小球形磁性粒子[14-15]，可借助外部磁场从生物催化体系中分离酶抑制剂。该方法机械稳定性高、孔隙率低，利于降低反应中的传质阻力，提高了固定化酶的重复使用性。由于其具有操作稳定性高、磁响应强、磁分离速度快等优点，在生物和药物研究中得到了广泛的应用[16]。在进行酶抑制剂筛选时，磁珠的修饰位置不同，所固定的位点也不同。因此，在实验中，往往要根据靶蛋白的分子结构选择合适的磁珠或将某一磁珠进行修饰后作为固定载体。将酶固定在合适的磁珠上会增强酶与待筛选酶抑制剂的亲和力，利用磁力将固定化酶及其抑制剂从提取液中分离，然后洗去与酶不相互作用的化合物，随后可得到酶固定化磁珠配体配合物，最后通过洗脱溶剂使配体释放进而通过质谱表征[17]。在这种方法中，潜在的配体与酶相互作用，生成酶配体配合物，这有利于利用磁性[18-23]从复杂混合物中分离活性化合物。在酶抑制剂的筛选中，磁性载体材料是最常用的固定化载体材料[24-30]。1.1 无机载体材料二氧化硅是磁性纳米粒子表面修饰最常用的无机材料[23,31-34]，此外还有二氧化钛[35]、介孔二氧化硅[16]等。Li等[23]首先将Fe3O4分散在水中加入聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，PVP）室温搅拌得到产物。然后在超声作用下将产物分散在含有异丙醇和氨水的混合溶剂中，室温搅拌下缓慢加入正硅酸乙酯（tetraethylorthosilicate，TEOS）溶液得到SiO2@Fe3O4磁性微球，并加入3-氨丙基三甲氧基硅烷（3-aminopropyltrimethoxysilane，ATPES）对其表面进行改性。最后将α-淀粉酶固定在表面改性的SiO2@Fe3O4磁性微球上。将制得的酶固定化磁性微球用于黄花草中α-淀粉酶抑制剂的筛选，最终得到3种黄酮类化合物对α-淀粉酶具有较好抑制作用。Liu等[35]采用溶剂热法（也称水热法或水热合成法）制备了Fe3O4@TiO2纳米粒子，并通过静电相互作用固定脂肪酶。采用透射电镜、傅里叶变换红外光谱和X射线衍射等方法对磁性纳米粒子进行表征，以确定脂肪酶是否已经被固定。研究中应用脂肪酶固定化Fe3O4@TiO2纳米粒子从6种具有脂肪酶抑制活性的藏药中筛选出脂肪酶抑制剂，获得5种具有与临床常用减肥药物奥利司他活性类似的化合物，其中1种化合物（山柰酚）的抑制活性优于奥利司他。Yi等[16]将谷胱甘肽S-转移酶固定在介孔二氧化硅磁性微球表面筛选紫苏中的酶抑制剂，利用高效液相色谱和四极飞行时间质谱法进行鉴定，筛选出6种具有谷胱甘肽S-转移酶抑制作用的物质，其中，迷迭香酸、(−)表没食子儿茶素-3-没食子酸酯和 (−)-表儿茶素-3-没食子酸酯具有较好的抑制活性。最后利用分子对接技术确定潜在抑制剂与谷胱甘肽S-转移酶的结合方式。首先，用FeCl3与柠檬酸三钠和乙酸钠合成Fe3O4，然后将其分散在含有乙醇、去离子水和氨水的混合溶液中，搅拌均匀后加入TEOS制得SiO2@Fe3O4磁性微球。为进一步合成介孔二氧化硅磁性微球（mSiO2@SiO2@Fe3O4），将SiO2@Fe3O4磁性微球分散在十六烷基三甲基氯化铵、去离子水和三乙醇胺中并滴加TEOS，产物用磁铁分离并清洗除杂后得mSiO2@SiO2@Fe3O4磁性微球。最后用PDA对mSiO2@SiO2@Fe3O4磁性微球进行表面改性并将谷胱甘肽S-转移酶固定在其表面。1.2 有机载体材料在酶抑制剂的筛选中，有机载体材料相比于无机载体材料应用较少。目前，用于磁性纳米粒子表面修饰的有机载体材料有聚酰胺（polyamidoamine，PAMAM）[36]、共轭-有机骨架[37]和金属-有机骨架[38]等。Jiang等[36]以PAMAM包覆磁性微球为基础，建立了一种筛选和鉴定赤芍提取物中α-Glu抑制剂的方法。首先，采用微修饰法合成了Fe3O4-COOH微球。然后，通过Fe3O4-COOH微球表面羧基与PAMAM氨基的偶联反应，制备了Fe3O4@PAMAM微球。最后，通过GA的交联，成功地将α-Glu连接到其表面。结果表明，没食子酸和(+)-儿茶素对α-Glu均具有较好抑制作用。Zhao等[37]将乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase,AchE）固定在适配体功能化磁性纳米颗粒共轭有机骨架上构建固定化酶反应器，并将该方法用于酒石酸、(−)-石杉碱A、多奈哌齐和小檗碱4种AchE抑制剂抑制活性的测定，发现酒石酸的IC50与已报道的结果相当，证明了该固定化酶反应器的可行性。Wu等[38]将α-Glu固定在磁性纳米材料Fe3O4@ZIF-67上，构建了快速筛选α-Glu抑制剂的生物微反应器。然后，将酶生物微反应器通过外加磁场固定在连接高效液相色谱仪（high performance liquid chromatography，HPLC）和微注射泵2端的管中，形成一个磁性在线筛选系统。以信阳毛尖粗茶提取物为实验对象，对该在线筛选方法进行验证，利用该在线筛选系统筛选出3种抑制剂（儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯和表没食子酸酯）。与传统方法相比，该方法可将筛选、洗脱和分析结合起来，可以简单、高效、直接地从天然来源筛选和鉴定潜在的α-Glu抑制剂。磁珠分散性好，磁分离速度快，酶结合量大，酶活性高，是固定化酶的理想载体，现已广泛应用于酶抑制剂的筛选中。将酶固定在特定的磁珠上，可实现酶抑制剂的分离。此方法操作较稳定，非特异性结合率低。因此，酶固定化磁珠技术因其快速的生物分析、导向性分离和从复杂混合物中直接捕获配体而受到越来越多的关注。2 非磁性载体2.1 无机载体材料2.1.1 石英毛细管 毛细管电泳（capillary electrophoresis

近日，大连化物所生物分子结构表征新方法研究组（1822组）王方军研究员团队与南方科技大学田瑞军教授、李鹏飞副教授等人合作，利用193nm紫外激光解离—质谱装置，实现了免疫共受体CD28磷酸化胞质端与激酶PKCθ的C2结构域识别结合机制解析。 与常规毫秒级碰撞诱导质谱解离（CID）相比，5ns单脉冲193nm紫外激光解离（UVPD）可直接激发非变性蛋白质骨架共价键至高能态引发高效解离，激发解离速率提升6个数量级，位点解离效率和碎片离子产率与其局部非共价作用和微观结构密切相关，通过碎片离子和解离产率分析可同时获得蛋白质序列和结构信息。目前，193nm紫外激光解离质谱尚未商品化设备，仅在少数实验室有自主搭建设备。　　免疫共受体CD28是癌症免疫治疗的重要靶点，其胞质端酪氨酸磷酸化激活引起的下游蛋白识别结合机制尚不清楚。本工作中，研究人员采用光亲和质谱法发现CD28磷酸化胞质端与激酶PKCθ的C2结构域特异性结合；利用193nm紫外激光解离质谱对C2结合前后进行了全序列覆盖位点光解离效率的差异分析，发现了光解离效率显著下降的三个关键结合区域和核心识别位点K49、H63、R68；证明了高能紫外激光解离策略在蛋白质动态识别结构变化分析中的高灵敏度和单位点分辨高精度优势。　　大连化物所王方军和肖春雷研究员通过交叉学科联合攻关，在大连相干光源搭建了193nm紫外激光解离-高分辨质谱装置，在前期工作中通过高能光子对多肽分子的高效激发解离实现了多磷酸化肽修饰位点精确定位（Chin. Chem. Lett.，2018）和蛋白质组学规模化序列鉴定（Anal. Chim. Acta.，2021）。　　相关研究结果以“Motif-dependent Immune Co-receptor Interactome Profiling by Photoaffinity Chemical Proteomics”为题，于近日发表于Cell Chemical Biology上。

研究背景RAF激酶家族是 RAS-RAF-MEK-ERK 信号级联（MAPK信号）的核心组成部分，可传导细胞增殖、分化等信号。RAF在细胞质中保持自我抑制状态，并通过活化的RAS募集到质膜，被激活后进行信号传递。该信号通路异常通常会导致癌症发生。尽管对KRAS/RAF识别有比较详细的了解，但这种相互作用如何导致RAF激活仍不清楚。研究中涉及到不同激活状态的RAF复合物和RAS结合，互作体系中将含有到3个及以上的分子，传统的方法很难获得准确互作结果。这次我们带来的这篇文献讲述美国丹娜-法伯癌症研究所的工作人员使用MST技术来解析RAF蛋白激活和与RAS互作的关系。https://doi.org/10.1038/s41467-023-40299-6IF: 16.6 Q1研究内容先前对KRAS与RAF的结构研究主要集中在RAF的两个结构域：富含半胱氨酸结构域CRD和RAS结合结构域RBD。为了更好的了解二者的结合以及RAF的激活，作者分析了在MEK1和14-33二聚体的自抑制状态下，KRAS与完整BRAF结合的冷冻电镜结构，并使用MST技术检测不同状态RAF与KRAS亲和力。综合其他实验发现，KRAS结合不足以激活BRAF，说明了RAS结合和激活RAF是可分离的，并提出小分子抑制剂的新思路。研究结果为了探究RBD对KRAS结合的可及性，作者使用MST技术检测了不同结构域的RAF与KRAS亲和力。单独的RBD结构域的亲和力最强（26nM）,表明RBD结构域是RAF和KRAS结合的主要区域。此外，通过MST技术检测了RAS蛋白与自抑制（Autoinhibited）和活性状态（Active dimmer）下全长BRAF的亲和力。结果显明，二者亲和力相似（126nM/108nM），也就是RAF在自抑制状态下，RBD参与结合KRAS没有任何空间障碍。在获得自抑制或活性状态时，需将RAF蛋白与MEK或者14-3-3二聚体形成复合物，再检测与KRAS互作。MST技术无需固定样品，避免固定过程对复合物的影响，并且在溶液条件下检测，保证互作分子达到结合解离平衡状态，从而获得更加准确的Kd值。图：MST检测KRAS和BRAF片段或者复合体的亲和力技术优势MST技术是在溶液中进行的检测，无需固定操作，能够使靶标蛋白或者复合物保持稳定状态，在涉及到复合物或者多元互作时，可获得更加准确的亲和力结果。

糖苷酶抑制剂标准品哪里找？------上海甄准生物 糖苷酶抑制剂是一类含氮的拟糖类结构能抑制糖苷键形成的化合物。从结构上可分为两组：第一组氮原子在环上有野尻霉素(nojirimycin)、半乳糖苷酶抑素(galactostatin)、寡糖酶抑素(oligostatin)等。第二组氮原子在环外，如阿卡糖(acarbose)，validoxylamine A、B，有效霉素A、B(海藻糖苷酶抑制剂)等，从抑制酶范围上看，它包括了部分&alpha -葡萄糖苷酶抑制剂、半乳糖酶抑制剂、唾液酸抑制剂、淀粉酶抑制剂。 上海甄准生物提供糖苷酶抑制剂标准品，为您检测分析提供强有力支持！ 产品信息： 货号 品名 CAS No. B691000 N-Butyldeoxynojirimycin Hydrochloride 210110-90-0 C10H22ClNO4 10/100mg a-葡糖苷酶1和 HIV cytopathicity抑制剂 E915000 N-Ethyldeoxynojirimycin Hydrochloride 210241-65-9 C8H18ClNO4 10/100mg HIV cytopathicity抑制剂 C181150 N-5-Carboxypentyl-deoxymannojirimycin 104154-10-1 C12H23NO6 5/50mg 制备亲和树脂的配体，用于纯化Man9 甘露糖苷酶 A187545 2,3-O-Acetyloxy-2&rsquo ,3&rsquo ,4&rsquo ,6,6&rsquo -penta-O-benzyl-4-O-D-glucopyranosyl N-Benzyloxycarbonylmoranoline (&alpha /&beta mixture) 　 C56H63NO13 10/100mg 4-O-&alpha -D-Glucopyranosylmoranoline 制备中间体 B690500 N-(n-Butyl)deoxygalactonojirimycin 141206-42-0 C10H21NO45/50mg a-D-半乳糖苷酶抑制剂 B690750 N-Butyldeoxymannojirimycin, Hydrochloride 355012-88-3 C10H22ClNO4 5/50mg a-D-甘露糖苷酶抑制剂 D236000 Deoxyfuconojirimycin, Hydrochloride 210174-73-5 C6H14ClNO3 10/100mg alpha-L-岩藻糖苷酶抑制剂 M166000 D-Manno-&gamma -lactam 62362-63-4 C6H11NO5 5/50mgalpha-甘露糖苷酶 ß - 葡糖苷酶抑制剂和 M165150 D-Mannojirimycin Bisulfite 　 C6H13NO7S 1/10mg alpha-甘露糖苷酶抑制剂 D455000 6,7-Dihydroxyswainsonine 144367-16-8 C8H15NO5 1/10mg a-甘露糖苷酶抑制剂 C665000 Conduritol B 25348-64-5 C6H10O4 25/250mg b-葡糖苷酶抑制剂 C666000 Conduritol B Epoxide 6090-95-5 C6H10O5 25/250mg b-葡糖苷酶抑制剂 A155250 2-Acetamido-2-deoxy-D-gluconhydroximo-1,5-lactone 1,3,4,6-tetraacetate 132152-77-3 C16H22N2O10 25/250mg glucosamidase抑制剂 D240000 Deoxymannojirimycin Hydrochloride 73465-43-7 C6H14ClNO4 10/100mg mammalian Golgi alpha- mannosidase 1 抑制剂 M297000 N-Methyldeoxynojirimycin69567-10-8 C7H15NO4 10/100mg N-连接糖蛋白高斯过程干扰剂 A158400 2-Acetamido-1,2-dideoxynojirimycin 105265-96-1 C8H16N2O4 1/10mg N-乙酰葡糖胺糖苷酶抑制剂 A157250 O-(2-Acetamido-2-deoxy-D-glucopyranosylidene)amino N-Phenylcarbamate 132489-69-1 C15H19N3O7 5/10/100mg O-糖苷酶，己糖胺酶A和己糖胺酶B抑制剂 A157252 (Z)-O-(2-Acetamido-2-deoxy-D-glucopyranosylidene)amino N-Phenyl-d5-carbamate 1331383-16-4 C15H14D5N3O7 1/10mg O-糖苷酶，己糖胺酶A和己糖胺酶B抑制剂 M334515 4-Methylumbelliferyl &alpha -D-Glucopyranoside 4&rsquo -O-C6-N-Hydroxysuccinimide Ester 　 C26H31NO12 25mg T2DM糖苷酶抑制剂 G450000 4-O-&alpha -D-Glucopyranosylmoranoline 80312-32-9 C12H23NO9 1/10mg &alpha -葡萄糖苷酶抑制剂 D231750 1-Deoxy-L-altronojirimycin Hydrochloride 355138-93-1 C6H14ClNO4 5/50mg &alpha -糖苷酶抑制剂 H942000 N-(2-Hydroxyethyl)-1-deoxy-L-altronojirimycin Hydrochloride Salt 　 C8H18ClNO5 0.5/5mg &alpha -糖苷酶抑制剂 H942015 N-(2-Hydroxyethyl)-1-deoxygalactonojirimycin Hydrochloride 　 C8H18ClNO5 1/10mg &alpha -糖苷酶抑制剂 H942030 N-(2-Hydroxyethyl)-1-deoxy-L-idonojirimycin Hydrochloride 　 C8H18ClNO55/50mg &alpha -糖苷酶抑制剂 T795200 3&rsquo ,4&rsquo ,7-Trihydroxyisoflavone 485-63-2 C15H10O5 200mg/2g &beta -半乳糖苷酶抑制剂 A158380 O-(2-Acetamido-2-deoxy-3,4,6-tri-o-acetyl-D-glucopyranosylidene)amino N-(4-nitrophenyl)carbamate 351421-19-7 C21H24N4O12 10/100mg 氨基葡萄糖苷酶抑制剂 M166505 Mannostatin A, 3,4-Carbamate 1,2-Cyclohexyl Ketal 　 C13H19NO4S 2.5/25mg 保护的Mannostatin A B682500 Bromoconduritol (Mixture of Isomers) 42014-74-4 C6H9O3Br 200mg 哺乳类 alpha-葡萄糖苷酶 2 抑制剂 K450000 Kifunensine 109944-15-2 C8H12N2O6 1/10mg 芳基甘露糖苷酶抑制剂 D239750 1-Deoxy-L-idonojirimycin Hydrochloride 210223-32-8 C6H14ClNO4 10/100mg 酵母葡糖a-苷酶类抑制剂S885000 Swainsonine 72741-87-8 C8H15NO3 1/10mg 可逆,活性部位直接抑制甘露糖苷酶抑制剂；Golgi a-甘露糖苷酶 II抑制剂 T295810 [1S-(1&alpha ,2&alpha ,8&beta ,8a&beta )]-2,3,8,8a-Tetrahydro-1,2,8-trihydroxy-5(1H)-indolizinone 149952-74-9 C8H11NO4 10/100mg 苦马豆素和衍生物合成中间体 N635000 Nojirimycin-1-Sulfonic Acid 114417-84-4 C6H13NO7S 10/100mg 葡糖苷酶类抑制剂 V094000(+)-Valienamine Hydrochloride 38231-86-6 C7H14ClNO4 1/10mg 葡糖苷酶抑制剂 D440000 2,5-Dideoxy-2,5-imino-D-mannitol 59920-31-9 C6H13NO4 1/10mg 葡糖苷酶抑制剂 D494550 N-Dodecyldeoxynojirimycin 79206-22-7 C18H37NO4 10/100mg 葡糖苷酶整理剂 D479955 2,4-Dinitrophenyl 2-Deoxy-2-fluoro-&beta -D-glucopyranoside 111495-86-4 C12H13FN2O9 5/50mg 葡糖基氟化物,可以作为特定的机制为基础的糖苷酶抑制剂,未来可应用于合成和降解的低聚糖和多糖 A653270 2,5-Anhydro D-Mannose Oxime, Technical grade 127676-61-3 C6H11NO5 10/100mg 潜在的葡苷糖酶抑制剂C-(D-吡葡亚硝脲)乙胺和C-(D-glycofuranosyl)甲胺 D236500 1-Deoxygalactonojirimycin Hydrochloride 75172-81-5 C6H14ClNO4 10/100mg 强效的和有选择性的d半乳糖苷酶抑制剂 D236502 Deoxygalactonojirimycin-15N Hydrochloride 　 C6H14Cl15NO4 5/25mg 强效的和有选择性的d半乳糖苷酶抑制剂 B445000 (2S,5S)-Bishydroxymethyl-(3R,4R)-bishydroxypyrrolidine 105015-44-9 C6H13NO4 10/100mg 强有力的和特定的糖苷酶抑制剂 M166500 Mannostatin A, Hydrochloride 134235-13-5 C6H14ClNO3S 1/10mg 强有力的糖苷酶抑制剂，甘露糖苷酶抑制剂 A858000 N-(4-Azidosalicyl)-6-amido-6-deoxy-glucopyranose 86979-66-0 C13H16N4O7 1/10mg 人类红细胞单糖运输标签抑制剂 C185000 Castanospermine 79831-76-8 C8H15NO4 10/100mg 溶酶体 a-或者beta-葡糖苷酶. 葡糖苷酶1抑制剂和 beta-甘露糖苷酶抑制剂 D439980 1,4-Dideoxy-1,4-imino-D-mannitol, Hydrochloride 114976-76-0 C6H14ClNO4 5/50mg 糖蛋白甘露糖苷酶抑制剂 A608080 N-(12-Aminododecyl)deoxynojirimycin 885484-41-3 C12H26N2O4 5/50mg 糖苷酶亚氨基糖醇制备用试剂 I866350 1,2-O-Isopropylidene-alpha-D-xylo-pentodialdo-1,4-furanose 53167-11-6 C8H12O5 100mg/1g 糖苷酶抑制剂制备试剂 A648300 2,5-Anhydro-2,5-imino-D-glucitol 132295-44-4 C6H13NO4 10/100mg 糖水解酶类抑制剂 A648350 2,5-Anhydro-2,5-imino-D-mannitol 59920-31-9 C6H13NO4 1/10mg 糖水解酶类抑制剂 M257000 3-Mercaptopicolinic Acid Hydrochloride 320386-54-7 C6H6ClNO2S 500mg/5g 糖质新生抑制剂 B286255 N-Benzyloxycarbonyl-4,6-O-phenylmethylene Deoxynojirimycin 138381-83-6 C21H23NO6 5/50mg 脱氧野尻霉素衍生物 B286260 N-Benzyloxycarbonyl-4,6-O-phenylmethylene Deoxynojirimycin Diacetate 153373-52-5 C25H27NO8 2.5/25mg 脱氧野尻霉素衍生物 D245000 Deoxynojirimycin 19130-96-2 C6H13NO4 10/100mg 脱氧野尻霉素抑制哺乳类葡糖苷酶1 A172200 N-Acetyl-2,3-dehydro-2-deoxyneuraminic Acid Sodium Salt 209977-53-7 C11H16NNaO8 10/100mg 细菌、动物和病毒抑制剂 C181200 N-5-Carboxypentyl-1-deoxynojirimycin 79206-51-2 C12H23NO6 5/50mg 制备亲和树脂的配体，用于纯化葡糖苷酶I C181205 N-5-Carboxypentyl-1-deoxygalactonojirimycin 1240479-07-5 C12H23NO6 5/50mg 制备亲和树脂的配体，用于纯化葡糖苷酶I C645000 Conduritol A 牛奶菜醇A 526-87-4 C6H10O4 1/10mg 　 C667000 Conduritol D牛奶菜醇D 4782-75-6 C6H10O4 10mg 　 I868875 1,2-Isopropylidene Swainsonine 85624-09-5 C11H19NO31/10mg 　 更多产品，更多优惠！请联系我们！ 上海甄准生物科技有限公司 免费热线：400-002-3832

STING抑制剂片段筛选案例干扰素基因刺激因子(Stimulator of interferon genes, STING)在天然免疫中发挥重要作用，当细胞被病原体(如病毒)感染时，STING可以诱导I型干扰素和促炎性细胞因子的产生，是靶向治疗自身免疫疾病和癌症的潜在靶标蛋白。近年STING相关研究火爆，管线数量激增。目前全球范围内在研的STING靶向药物超过50种。今天给大家介绍的STING抑制剂片段筛选案例是由NanoTemper和药明康德旗下的Crelux公司合作完成的。研究人员生产纯化了带有His-tag的STING蛋白，随后使用Prometheus蛋白稳定性分析仪进行缓冲液优化并使用环二核苷酸cGAMP作为阳性对照进行Thermal shift assay，快速验证了蛋白的结合活性。案例回顾：差示扫描荧光法表征蛋白配体互作，不加染料的那种接下来研究人员使用Dianthus完成了片段化合物库单点筛选及亲和力排序。在使用Dianthus进行筛选时，其中一个分子需要带有荧光。本实验中, 研究人员使用His-tag荧光标记试剂盒对STING蛋白进行了特异性标记，片段终浓度为500μM，结合缓冲液为50 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl, 3 mM DTT, 0.005% TWEEN® 20, 4% DMSO。 STING片段筛选流程下图为单点筛选结果，2213个片段加上阳性及DMSO对照（均重复一次）总共采集了5376个数据点，即14块384孔板。消耗590μg STING蛋白,上机检测时间约8h（Dianthus 33分钟即可完成一块384孔板检测，↓ 文末查看Dianthus上机演示）。紫色线框中的黄色数据点为阳性对照cGAMP，213个阳性化合物响应值CV仅0.25%，检测重复性非常好。最后将单点筛选结果中的162个hits（上图蓝色数据点）进行12个浓度点的梯度稀释检测亲和力。消耗STING蛋白190μg，上机检测时间约3小时。苗头化合物验证基于片段的药物发现 (FBDD) 是药物研发的主流方法之一。但片段分子量低，且与蛋白靶标亲和力低，通常在μM-mM范围，因此对筛选技术的灵敏度有较高的要求。Dianthus基于光谱位移技术（Spectral shift）检测，不依赖于分子量，可检测pM-mM的亲和力。此外，Dianthus检测一个kd仅需1min，单孔上样体积20μl，是您亲和力筛选项目的强大工具！Dianthus产品介绍：全新Dianthus携光谱位移技术横空出世，1分钟击破亲和力筛选难点！wx搜索NanoTemper视频号，查看Dianthus上机操作演示吧！

p style=" text-indent: 2em " span style=" text-align: justify text-indent: 2em " PARP抑制剂能够影响癌细胞的自我复制方式，用于存在有害或疑似有害的生殖系BRCA突变(gBRCAm)、HER2阴性局部晚期或转移性乳腺癌(MBC)患者的治疗药物，除了乳腺癌外，这一类药物还可以治疗卵巢癌、前列腺癌以及胰腺癌等拥有相同基因的遗传性癌症。 /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 数据显示，2017年全球PARP抑制剂的总销售额为4.62亿美元，其中阿斯利康的奥拉帕利(Olaparib，Lynparza)占据了64%的市场份额，美国克洛维斯(Clovis Oncology)肿瘤公司的芦卡帕利和Tesaro公司的尼拉帕利占据了36%的市场份额。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " span style=" color: rgb(0, 112, 192) " strong 多韦替利横空出世，PARP抑制剂四分天下 /strong /span /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201811/uepic/ab97540c-327c-4a46-b76e-be376152bcad.jpg" title=" 9213b07eca8065386ef694f696dda144ad348232.jpg" alt=" 9213b07eca8065386ef694f696dda144ad348232.jpg" / /p p style=" text-align: center text-indent: 2em " span style=" color: rgb(0, 112, 192) font-size: 14px " strong 辉瑞公司 /strong /span span style=" color: rgb(0, 112, 192) " strong /strong /span br/ /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " PARP抑制剂通过抑制肿瘤细胞DNA损伤修复、促进肿瘤细胞发生凋亡，从而可增强放疗以及烷化剂和铂类药物化疗的疗效。PARP抑制剂利用遗传性乳腺癌的“致命弱点”展开攻击，这一弱点由被称之为“BRCA1”的基因缺陷所致，限制了癌细胞修复受损DNA的能力。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 在研究中，接受PARP抑制剂治疗的动物，可成功的收缩实体肿瘤细胞，这一研究结果给难治性肿瘤的治疗带来了希望。迄今为止，美国FDA批准了四款PARP抑制剂，另外三个药物是奥拉帕利、芦卡帕利和尼拉帕利，从而构成竞争的新格局。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 2018年10月16日，美国FDA批准辉瑞的PARP抑制剂药物多韦替利(Talazoparib)，商品名Talzenna，用于存在有害或疑似有害的生殖系BRCA突变(gBRCAm)、HER2阴性局部晚期或转移性乳腺癌(MBC)患者的治疗。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 多韦替利是一种聚ADP-核糖聚合酶(PARP)抑制剂，研究表明多韦替利高度有效，具有双重作用机制，可以通过阻断PARP酶活性以及将PARP捕获在DNA损伤位点上来诱导肿瘤细胞死亡。目前，多韦替利正在被评估用于gBRCAm乳腺癌及早期TNBC以及DNA损伤修复(DDR)缺陷的其他类型癌症。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " strong span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 奥拉帕利首吃螃蟹 /span /strong /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 2018年8月22日，国家药品监督管理局批准了阿斯利康的奥拉帕利(Olaparib)片剂，商品名为利普卓(Lynparza)。此前，在2018年1月，阿斯利康的奥拉帕利片以& quot 与现有治疗手段相比具有明显治疗优势& quot 被纳入了CDE第二十六批优先审评程序，正式进入了上市审批的绿色通道，该产品也是目前国内唯一的小分子靶向PARP抑制剂。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 奥拉帕利是阿斯利康开发的药物，是美国FDA批准上市的第一个PARP抑制剂，2014年12月19日获FDA批准口服胶囊剂上市，商品名Lynparza，临床用于铂敏感复发性BRCA突变卵巢癌成人患者的维持治疗，该药也成为用于BRCA突变铂敏感复发性卵巢癌的首个PARP抑制剂。同年，欧盟委员会也批准奥拉帕尼作为一种单药疗法，用于卵巢癌成人患者的维持治疗。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 2015年阿斯利康的奥拉帕利正式上市，第一年的全球销售额高达0.94亿美元，2016年销售额为2.18亿美元，增长率高达131.91%。2017年8月阿斯利康宣布，美国FDA已经批准奥拉帕利用于复发性上皮卵巢癌、输卵管癌、或原发性腹膜癌成人患者的维持治疗。2017年全球Lynparza销售额达2.97亿美元，同比增长率36.24%。阿斯利康对奥拉帕利寄予了厚望，其年销售额峰值可突破20亿美元。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " span style=" color: rgb(0, 112, 192) " strong 芦卡帕利绝处逢生 /strong /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 2016年12月19日，FDA 批准了美国克洛维斯(Clovis Oncology)肿瘤公司的芦卡帕利(Rucaparib)，这是全球第2个上市的PARP抑制剂，用于单药治疗既往接受过两种以上化疗的BRCA突变晚期卵巢癌，商品名Rubraca。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 实际上，芦卡帕利是辉瑞制药公司研发的药物，在赛诺菲的首个PARP抑制剂Ⅲ期研究失败后，导致了PARP抑制剂的研发跌入低谷，辉瑞将芦卡帕利转让给美国克洛维斯公司，默沙东也把尼拉帕利授权给了Tesaro。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 2015年4月，美国FDA授予治疗卵巢癌突破性疗法资格，美国FDA于2016年12月19日加速审批芦卡帕利上市，商品名为Rubraca。芦卡帕利的上市也拯救了摇摆不定的克洛维斯生物医药公司。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " span style=" color: rgb(0, 112, 192) " strong 尼拉帕利新生复活 /strong /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 在奥拉帕利和芦卡帕利上市后，PARP抑制剂类药物取得实质性进展。2017年3月27日，美国FDA批准了Tesaro公司的尼拉帕利(Niraparib)，用于复发性上皮性卵巢，输卵管或原发性腹膜癌的成年患者的维持治疗，商品名Zejula。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 截至目前，全球已获批的PARP抑制剂共有四种，仅阿斯利康的奥拉帕利在国内获准上市外；在新品研发方面，艾伯维的Veliparib处于Ⅲ期临床试验中。据悉，国内药企中，百济神州、再鼎医药、江苏豪森、青峰医药、人福医药、恒瑞医药、上海创诺医药以及中科院上海药物所等8家公司已涉及PARP抑制剂产品的开发。 /p