三乙烯基环三硼烷吡啶复合物

甲基乙烯基硅橡胶简称乙烯基硅橡胶，是由二甲基硅氧烷与少量乙烯基硅氧烷共聚而成，乙烯基含量一般为0.1%~0.3% (摩尔分数)。少量不饱和乙烯基的引入使它的硫化工艺及成品性能，特别是耐热老化性和高温抗压缩变形有很大改进。甲基乙烯基硅氧烷单元的含量对硫化作用和硫化胶耐热性有很大影响，含量过少则作用不显著，含量过大【达0.5% （摩尔分数）】 会降低硫化胶的耐热性。甲基乙烯基硅橡胶具有很好的耐高、低温性，可在-50~250℃下长期工作，防潮、电绝缘性，耐电弧，电晕性。耐老化、耐臭氧性。表面不粘性和憎水性。压缩变形小，耐饱和蒸汽性。广泛应用于耐高、低温密封管、垫圈、滚筒、按键胶辊、瓷绝缘子的更新换代。按照GB/T 28610粘均分子量测定方法。粘度法是测定聚合物分子量较为简捷的方法。特性粘度[η]是高分子溶液浓度趋近于零时的粘数值或对数粘数值（ηsp/C或Inηr/C）。在甲苯溶剂中，高分子物质的分子量和特性粘度的关系用下式表示： [η]=KMα式中：K-----常数，K=9.46×10-3；M----粘均分子量； α-----特性常数值；α=0.71用此计算公式计算得到分子量。实验所需仪器：卓祥全自动粘度仪、多位溶样器、自动配液器、万分之一电子天平。实验所需试剂：甲苯、无水乙醇。（AR级）溶剂粘度的测定：卓祥全自动粘度仪设置到实验目标温度值并且稳定后，加入甲苯，软件中启动测试任务待结束。粘度管的清洗：启动卓祥全自动粘度仪清洗、干燥程序，仪器自动将粘度管清洗干燥后待用。样品制备：在万分之一天平上精准称量精确到0.0001g，通过自动配液器将溶液浓度精准配制，再将样品瓶放置到多位溶样器室温中溶解，待溶解完毕取出待用（室温静置需N小时以上）。样品粘度的测定：加入样品，启动软件中特定公式测试，待任务结束。粘度管的清洗：再次启动卓祥全自动粘度仪清洗、干燥程序，仪器自动将粘度管清洗干燥后待用。按照以下公式1-5计算：ηr=t/t0---------------------------------------------------1ηsp=ηr-1--------------------------------------------------2c=m/v---------------------------------------------------3[η]=KMα-------------------------------------------------5式中：ηr------相对粘度；t ------溶液时间值，单位为秒（s）；t0-----溶剂时间值，单位为秒（s）；ηsp-----增比粘度；c------样品的浓度，单位为克每毫升g/ml；m----样品质量，单位为g；v---溶剂体积，单位为ml；[η]------特性粘度；M----粘均分子量； K-----常数，K=9.46×10-3； α-----特性常数值，α=0.71；

p style=" text-align: center " strong 公开征集对《环氧乙烯基酯树脂》等505项行业标准 /strong /p p style=" text-align: center " strong 和53项推荐性国家标准计划项目的意见 /strong /p p br/ /p p style=" text-indent: 2em " 根据标准化工作的总体安排，现将申请立项的《环氧乙烯基酯树脂》等505项行业标准计划项目和《半导体器件 机械和气候试验方法 第7部分：内部水汽含量测试和其它残余气体分析》等53项推荐性国家标准计划项目予以公示（见附件1、2），截止日期为2018年5月28日。如对拟立项标准项目有不同意见，请在公示期间填写《标准立项反馈意见表》（见附件3）并反馈至工业和信息化部科技司，电子邮件发送至KJBZ@miit.gov.cn（邮件主题注明：标准立项公示反馈）。 br/ /p p style=" text-indent: 2em " & nbsp /p p style=" text-indent: 2em " 地址：北京市西长安街13号 工业和信息化部科技司 标准处 /p p style=" text-indent: 2em " 邮编：100846 /p p style=" text-indent: 2em " 联系电话：010-68205241 /p p style=" text-indent: 2em " & nbsp /p p style=" text-indent: 2em " 公示时间：2018年4月27日-2018年5月28日 /p p style=" text-indent: 2em " & nbsp /p p style=" text-indent: 2em " 附件： /p p style=" line-height: 16px text-indent: 2em " 1. img src=" /admincms/ueditor1/dialogs/attachment/fileTypeImages/icon_doc.gif" / a href=" http://img1.17img.cn/17img/files/201805/ueattachment/7df061fd-09ed-4c73-8b2a-4a13e8bc3dc7.docx" 《环氧乙烯基酯树脂》等505项行业标准制修订计划（征求意见稿）.docx.docx /a /p p style=" line-height: 16px text-indent: 2em " 2. img src=" /admincms/ueditor1/dialogs/attachment/fileTypeImages/icon_doc.gif" / a href=" http://img1.17img.cn/17img/files/201805/ueattachment/42cef454-a775-4eca-8729-8bd443ee71da.docx" 《半导体器件 机械和气候试验方法 第7部分：内部水汽含量测试和其它残余气体分析》等53项国家标准制修订计划.docx& nbsp /a /p p style=" line-height: 16px text-indent: 2em " 3. img src=" /admincms/ueditor1/dialogs/attachment/fileTypeImages/icon_doc.gif" / a href=" http://img1.17img.cn/17img/files/201805/ueattachment/db790b51-8e34-4048-807f-a40e0f01499b.doc" 标准立项反馈意见表.doc /a /p p br/ /p p style=" text-align: right " 工业和信息化部科技司 /p p style=" text-align: right " 2018年4月27日 /p p & nbsp /p p & nbsp /p p br/ /p

美国环保局(EPA)近日撤销了根据《有毒物质控制法案》对亚乙烯基酯(vinylidene esters)发布一项重要新用途规则的提案，该物质也是两个&ldquo 制造前通知(pre-manufacture notices)&rdquo 的目标物质。EPA指出，采取该行动是对拟议规则收到的公众评议的回应。具体来说，提交的信息表明，氰基丙烯酸酯(cyanoacrylates)比拟议规则中的亚乙烯基酯更适合作为评估水生生物潜在毒性的结构类似物，这是拟议的重要新用途规则的通知要求的依据。 　　决定一种新的化学品作为新用途使用必须考虑以下相关因素，包括(一)该化学物质的预计制造和加工量 (二)该使用方法改变人类或环境暴露于该化学物质的类型或形式的程度 (三)该使用方法增加人类或环境暴露于该化学物质的强度和持续时间的程度 (四)制造、加工、分销，以及处理该化学物质的合理预期方式和方法 和(五)任何其他相关因素。

聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone)简称PVP，是一种非离子型高分子化合物，是N-乙烯基酰胺类聚合物中最具特色，且被研究得最深、广泛的精细化学品品种。已发展成为非离子、阳离子、阴离子3大类，工业级、医药级、食品级3种规格，相对分子质量从数千至一百万以上的均聚物、共聚物和交联聚合物系列产品，并以其优异独特的性能获得广泛应用。PVP按其平均分子量大小分为四级，习惯上常以K值表示，不同的K值分别代表相应的PVP平均分子量范围。K值实际上是与PVP水溶液的相对粘度有关的特征值，而粘度又是与高聚物分子量有关的物理量，因此可以用K值来表征PVP的平均分子量。通常K值越大，其粘度越大，粘接性越强。测定K值最常用的方法是用毛细管粘度计测的PVP水溶液的相对粘度n，再根据公式计算出K值。 实验方法如下实验所需仪器：卓祥全自动粘度仪、自动配液器、万分之一电子天平。实验所需试剂1：溶剂：纯水，无水乙醇为清洗剂。溶剂粘度的测定：卓祥全自动粘度仪设置到实验目标温度值并且稳定后，加入纯水，软件中启动测试任务待结束，测的溶剂时间T0。粘度管的清洗：启动卓祥全自动粘度仪清洗、干燥程序，仪器自动将粘度管清洗干燥后待用。样品溶液的制备：在万分之一天平上精准称量精确到*g，溶解在**ml溶剂中，通过自动配液器将溶液浓度精准配制到**g/ml，溶解条件：常温搅拌。样品粘度的测定：加入**ml样品，测量样品时间**，计算粘度结果粘度管的清洗：启动卓祥全自动粘度仪清洗、干燥程序，仪器自动将粘度管清洗干燥后待用。

前言 /PROTAC表征难题重要靶点和候选药物的亲和力筛选非常具有挑战性。当您的亲和力筛选项目涉及到PROTAC二元和三元复合物，片段化合物库及固有无序蛋白时，需要进行样品固定的SPR技术和样品消耗量大的ITC技术的检测难度会大大增加，而这些应用则是Dianthus所擅长的。光谱位移技术（Spectral Shift）光谱位移技术是通过荧光发射光谱的蓝移或红移来检测分子间的结合。Dianthus可以为您解决哪些表征难题？Dianthus是一个基于微孔板的亲和力筛选平台，使您能够克服其他生物物理方法带来的挑战。避免这些常见的障碍，让您的PROTAC项目继续推进。1通过固定二元复合物的方法来进一步研究三元复合物，二元复合物的稳定性会受到影响。答Dianthus直接在溶液内进行检测，结合平衡状态可控。因此，在表征三元结合的过程中二元复合物可保持稳定。2在再生过程中，共价分析物几乎不可能从传感器芯片上完全去除。答在单独的孔中直接在溶液中检测分子间相互作用，使得您的亲和力分析更简单、无压力且更经济实惠。3其他检测方法难以测量warheads这样的小分子的亲和力。答光谱位移技术不依赖于分子量，因此您可以使用 Dianthus 对片段化合物进行初步筛选，还可以在后续亲和力优化中筛选PROTAC 候选物。4靶点和配体的样品量有限答使用Dianthus进行亲和力筛选无需耗费时间进行大量方法开发，检测时的样品消耗量很低，将极大节省所有的样品量。选择Dianthus表征PROTAC候选物Dianthus 是基于微孔板且无微流体系的亲和力筛选平台，您可通过 gRPC 框架轻松将其集成到任何自动化设置中。无需定期维护，您的项目不会因停机而延迟。Dianthus 随时准备好为您效劳 —— 7天24小时不间断。点击图片下载PROTAC电子书，了解更多技术难题

核孔复合物（nuclear pore complex, NPC）是真核细胞的核膜上负责物质双向运输的唯一通道，同时也是真核细胞中最庞大，最复杂的分子机器之一。核孔复合物在维持细胞核的微环境稳态，保护遗传物质，调控基因表达等方面起着至关重要的作用，其功能异常与包括癌症在内的多种疾病的发生联系在一起。NPC的高分辨率结构研究对理解真核细胞活动的基本过程，探究核质运输的结构机制以及探索相关疾病的致病机理都具有重要意义，也是开发相应治疗方法和药物的基础。NPC镶嵌于细胞核的双层核膜（nuclear envelope, NE）之上，在从细胞质到细胞核的方向上，主要由胞质丝（cytoplasmic filaments）、胞质环（cytoplasmic ring, CR），内环（inner ring, IR）、腔环（Luminal ring, LR）、核质环（nuclear ring, NR）和核篮（nuclear basket）组成（图1）。其中，CR、IR和NR构成NPC最稳定的支架部分，其直径可达约110 nm，高约70 nm。而附着于CR上的胞质丝、附着于NR上的核篮以及主要由IR中的FG重复（FG repeats）构成的扩散屏障（diffusion barrier）则是NPC选择性运输的主要执行者。此外，在垂直于NE的方向上，NPC还具有C8对称性。一个NPC含有约30种不同的核孔蛋白（nucleoporin），每种核孔蛋白的拷贝数一般为八的倍数，因此一个NPC含有的核孔蛋白数目非常大（500-1000个）。这也导致NPC具有非常大的分子量，在酿酒酵母中约为60 MDa，而在人中则可达约110 MDa。图1：NPC的结构示意图2022年6月10日，西湖大学施一公团队在Science上在线发表了题为 Structure of the cytoplasmic ring of the Xenopus laevis nuclear pore complex 的最新研究成果，报道了目前分辨率最高的，NPC中CR亚基的结构。该研究以非洲爪蟾（Xenopus laevis）NPC为研究对象，单颗粒冷冻电镜分析为主要研究手段。团队共收集46143张电镜照片，从中人工筛选出33747张可用照片，并进一步挑选出800825个NPC颗粒用于数据处理。经过多轮迭代计算，该团队最终将NPC中CR亚基重构至3.7-4.7 分辨率。同时，该研究还利用重组表达技术和单颗粒冷冻电镜分析手段，将脊椎动物中特有的核孔蛋白Nup358的N端结构域解析至3.0 分辨率。以这些重构结果为基础，该团队最终搭建了迄今为止最完整的CR结构模型（图2）。图2：CR亚基的单颗粒冷冻电镜结构该模型中CR亚基的主体由两个Y复合物组成，此外还包含五个Nup358、两个Nup205和两个Nup93分子。在Y复合物中，新解析的Nup160的C端片段作为组织中心，在介导三条臂汇集上起着重要作用。而Nup358、Nup205和Nup93在辅助以及稳定CR骨架的组装过程中起着重要的作用。结合施一公团队之前解析的NR和IR高分辨结构，他们搭建了NPC支架部分的结构模型。该模型包含了来自632个核孔蛋白中的约445000个氨基酸残基，是目前为止最详细，且最精确的NPC支架结构模型（图3），为领域内理解脊椎动物NPC的组成、结构、组装以及功能提供了坚实的基础。图3. NPC支架的结构模型西湖大学生命科学学院博士后朱薛辰、黄高兴宇、曾超、占谢超和三年级博士生梁珂为该文共同第一作者，黄高兴宇和施一公教授为该文共同通讯作者。原文链接：https://doi.org/10.1126/science.abl8280

大家好，本周为大家分享一篇最近发表在Analytical Chemistry上文章，High-Throughput, Quantitative Analysis of Peptide-Exchanged MHCI Complexes by Native Mass Spectrometry1。该文章的通讯作者是美国基因泰克公司的Wendy Sandoval研究员。　　癌症疫苗是通过利用肿瘤细胞相关抗原，来唤醒人体针对癌症的免疫系统。常见的策略是通过对病人的肿瘤细胞样本进行基因测序来寻找特征性抗原肽，该抗原肽会与I类主要组织相容复合体(MHCI)相结合并呈递至CD8+细胞表面，通过与CD8+细胞表面受体相结合从而诱导免疫反应。为了实现整个过程，研究人员通常会结合基因测序和计算机预测结果设计多个候选抗原肽，每个候选肽都需要通过实验测试来确认它与MHCI分子的结合能力以及相关免疫原性。此外，考虑到编码MHCI的基因具有多态性，候选抗原肽还需要与不同等位基因编码的MHCI分子进行测试。因此，本文开发了一种高通量方法，利用非变形质谱快速筛选候选抗原肽并表征形成的肽-MHCI复合物(pMHCI)。　　pMHCI复合物中抗原肽的体外载入一直以来都是难点，因为MHCI复合物(包括HLA和β2M亚基)本身并不稳定，需要长度为8~10的多肽链载入到MHCI的凹槽以保持完整。本文则通过利用紫外光裂解肽-MHCI复合物(UV-MHCI)的肽交换实现抗原肽的载入，具体步骤如图1A所示，通过紫外光照，UV-MHCI中的高亲和肽被切割转为低亲和肽段，该低亲和力肽段极易发生肽交换，通过监测新的pMHCI复合物的形成实现对候选肽的评估。目前常用的检测pMHCI形成的工具包括ELISA、TR-FRET以及2D-LC-MS。然而这些方法仅能提供有限的信息关于肽交换、pMHCI分子质量，对形成的pMHCI复合物无法进一步的表征。事实上，pMHCI复合物对后续诱导免疫反应至关重要。　　图1. 癌症疫苗的免疫监测的示意图：A) 筛选流程，B检测方法。　　为了确认非变性质谱(nMS)能否用于pMHCI复合物表征以及肽交换率的检测，作者对UV-MHCI以及6个标准肽段进行了考察(图2)。未经UV照射的UV-MHCI MS谱图(图2A)可以观察完整的UV-MHCI复合物以及丢掉紫外光裂解肽的MHCI。MHCI复合物被认为是气相解离产生的，因为没有活性肽的稳定作用，MHCI很难存在于溶液相中，溶液中没有MHCI，“空壳”的MHCI只有可能是质谱中UV-MHCI的气相裂解产生的。图2B证实了这一观点，经紫外光照射后，紫外光裂解肽由高亲和力转为低亲和力，从MHCI上脱落，MHCI解离成HLA和β2M亚基，谱图中能观察到HLA和β2M亚基信号。确认了MHCI是由peptide-bound population产生的信号，作者开始用该方法去定量标准肽的肽交换率。如图2C为UV-MHCI与标准肽孵育并过夜UV照射得到的谱图，仅观察到完整的pMHCI以及“空壳”MHCI的信号，说明实现了100%的完全肽交换。如图2D，肽交换率随孵育时间改变，2小时孵育时间足以实现最大肽交换。　　图2. nMS表征UV光照A)前B)后的UV-MHCI复合物，C)nMS测定UV-MHCI与标准肽的肽交换率，D)标准肽肽交换率随时间的变换情况。　　为了提高分析通量，减少样本消耗，作者在nMS基础上开发了SEC-nMS和CZE-nMS系统。作者用SEC-nMS系统测定了50个候选肽的交换率，说明该系统能够进行中或大规模的数据采集。相比较SEC-nMS而言，CZE-nMS系统具有更高的灵敏度和通量，样品体积消耗从微升减少至纳升，分析时间也缩短为2 min(图3A)。检测信号与进样量呈线性关系，注射体积为3 nL时，最低检测限为6 ng(图3BCD)。作者测定了67个候选肽跨越4种等位基因编码的MHCI分子的肽交换率(图3E)。此外，通过将UV-MHCI复合物同时与四种以上的候选肽进行孵育可在单个实验中同时检测它们的相对肽交换率以及与MHCI结合的亲和力(图3F)。作者还提出Vc50这个概念，即导致50%的pMHCI复合物发生解离的碰撞电压，可作为评估pMHCI复合物稳定性的重要参数。　　图3. 使用CZE-MS系统高通量分析pMHCI复合物　　除了检测pMHCI复合物的形成，测定肽交换率，nMS还可以对形成的复合物进行进一步的结构表征。如图4所示，native top-down的分析策略可获得多层次的结构信息。本文使用的Orbitrap Eclipse “Tribrid” 质谱，图4A为完整pMHCI的MS1谱图，图4B为施加源内电压(SID)促使蛋白解离为亚基，图4C是将14+ pMHC单独分离出，为后续HCD活化做准备。图4D为pMHCI复合物经HCD解离后的MS2谱图。图4E和图4F则分别为对肽段以及HLA亚基进行top-down测序的结果。这些多层次的结构信息能够帮助区分HLA亚型、阐明候选肽的序列，包括一些PTMs、二硫键信息。这些结构细节可能会影响候选肽与MHCI分子间的亲和力甚至是后续T细胞受体的识别。　　图4. Native top-down分析策略获得pMHCI复合物的多层结构信息　　总之，本文将非变性质谱(nMS)与分子排阻(SEC)或毛细管电泳(CZE)分离技术相结合用于高通量筛选pMHCI复合物中的候选肽。该方法能够直观确认pMHCI的完整性，Vc50可作为评估复合物气相稳定性的重要指标，通过native top-down分析策略可获得多层次的结构信息。以上所有确保了后续临床T-细胞实验的正常进行。　　撰稿：刘蕊洁　　编辑：李惠琳　　原文：High-Throughput, Quantitative Analysis of Peptide-Exchanged MHCI Complexes by Native Mass Spectrometry　　参考文献　　1. Schachner LF, Phung W, Han G, et al. High-Throughput, Quantitative Analysis of Peptide-Exchanged MHCI Complexes by Native Mass Spectrometry. Anal Chem. 2022 10.1021/acs.analchem.2c02423. doi:10.1021/acs.analchem.2c02423

大家好，本周为大家分享一篇发表在Nat. Commun.上的文章：Structure and dynamics of endogenous cardiac troponin complex in human heart tissue captured by native nanoproteomics ，文章的通讯作者是威斯康星大学麦迪逊分校的葛瑛教授。　　蛋白质大多都是通过组装成蛋白复合物来执行特定的生物功能，因而表征内源性蛋白复合物的结构和动力学将有助于生命过程的理解。蛋白复合物在其组装、翻译后修饰(Post-translational modifications，PTMs)和非共价结合等方面是高度动态的，在native状态下通常以低丰度存在，这给研究其结构和动态性的传统结构生物学技术(如X-ray和NMR)带来了巨大的挑战。非变性Top-down质谱(nTDMS)结合了非变性质谱和Top-down蛋白组学的优势，目前已发展成蛋白复合物结构表征的有力工具，可以保留蛋白质亚基-配体间的非共价作用和PTMs等重要信息。然而，由于内源性蛋白复合物自身的低丰度特性，导致对其的分离纯化和检测非常困难，所以nTDMS目前仅限用于过表达的重组或高丰度蛋白质的表征。在本研究中，作者开发了一种非变性纳米蛋白质组学(Native nanoproteomics)技术平台，通过使用表面功能化的超顺磁性纳米颗粒(Nanoparticles，NPs)直接富集组织中的蛋白复合物，然后再利用高分辨质谱表征其结构和动态性。这里选用心肌肌钙蛋白(Cardiac troponin，cTn)异源三聚体复合物(~77 kDa)作为研究对象。cTn三聚体复合物是调节横纹肌肌动蛋白收缩的Ca2+离子调节蛋白，由TnC、cTnI和cTnT这3个亚基组成。其中，TnC是Ca2+结合亚基，cTnI是抑制肌动蛋白-肌球蛋白相互作用的亚基，而cTnT细丝锚定亚基。TnC与Ca2+的结合，以及cTnI 亚基的磷酸化，会共同引起细丝上的分子级联事件，诱导心肌收缩所必需的肌动蛋白-肌球蛋白交叉桥的形成。传统结构生物学技术不能有效捕获cTn复合物高度动态的构象变化，并且先前研究用的cTn复合物是由原核细胞表达的，缺乏PTMs的信息。因此，作者开发了native纳米蛋白组学的方法，以实现对人内源性cTn复合物结构和动力学的全面表征。作者首先使用肽功能化的超顺磁性氧化铁NPs富集了人心脏的内源性cTn复合物，同时优化了非变性蛋白提取缓冲液(高离子强度LiCl溶液，生理pH)。富集到的cTn复合物中的3种亚基的含量比例为1:1:1，真实反应了肌节cTn异源三聚体复合物的组成。作者也发现含有750 mM L-Arg，750 mM咪唑和50 mM L-Glu(pH 7.5)的溶液对蛋白复合物的洗脱效果最好，并且不会破坏亚基间的相互作用。该富集方法具有很好的重现性，proteoforms信息得到很好保留，且可以直接用于化学计量分析。总的实验流程如图1所示，洗脱后的cTn复合物经体积排阻色谱(Sze-exclusion chromatography，SEC)除盐和交换至醋酸铵溶液中，随后对cTn复合物进行多种nTDMS分析：1)在线SEC监测复合物 2)超高分辨傅里叶变换离子回旋共振质谱(FTICR-MS)表征复合物的化学计量比和proteoforms 3)捕获离子淌度质谱(TIMS-MS)解析调控复合物构象变化中的非共价作用的结构动态性。　　图1. 用于表征人心脏中内源性cTn复合物的native纳米蛋白组学平台。　　为了全面表征内源性cTn复合物，作者使用FTICR-MS进行proteoforms测序和复合物表征。图2展示了native状态下检测丰度最高的cTn复合物的电荷态(19+)，其中包含了4种独特的proteoforms，这些复合物主要带有单磷酸化的cTnT、单磷酸化和双磷酸化的cTnI，以及结合了3个Ca2+的TnC。这些结果表明人cTn复合物在肌节中以结构多样化的分子组成存在，具有高度异质的共价和非共价修饰，可产生一系列不同的完整复合物。　　图2. FTICR-MS分析展示的cTn复合物状态。红色方框中是最高丰度电荷态(19+)的放大谱图，理论同位素分布(红色圆圈)可以与谱图很好叠加，说明结果具有高质量精度(质量偏差在2 ppm 以内)。　　作者接着对cTn复合物进行complex-up分析，以研究复合物的化学计量比及其组成。图3a~3b分别显示的是完整cTn三聚体复合物，以及经CAD碎裂后的蛋白亚基谱图。但这里没有检测到cTnI单体，可能是因为cTnI和TnC在native状态下的亲和力很强，且cTnI单体带的电荷不多，导致其在高m/z区域出峰，所以不易被检测到.随后，作者又对解离出的亚基进行complex-down分析。图3c展示了检测到的cTnT的多种proteoforms：未磷酸化的 cTnT、单磷酸化的cTnT(p cTnT)和 C 端 Lys 截断的磷酸化cTnT(pcTnT [aa 1-286])，CAD碎裂谱图也发现cTnT的C端较N端更易暴露在外界溶剂中。图3e则是cTn(I-C)二聚体的谱图，共检测到6种具有不同数量Ca2+结合和磷酸化的proteoforms。二级谱图可将cTnI的两个磷酸化位点准确定位在Ser22和Ser23，同时发现cTnI序列两端都较内部区域更易暴露于溶剂中。但还无法通过nTDMS准确推断Ca2+结合和磷酸化是如何影响cTn复合物的稳定性。作者在此也没有优化FTICR-MS在非常高m/z范围的离子检测，所以也会遗漏带少量电荷的cTn复合物信息。　　图3.nTDMS表征人心脏来源的cTn复合物。(a~b)完整cTn复合物和经CAD碎裂后的亚基谱图 (c~d)cTnT单体及其代表性的CAD碎裂谱图 (e~f)cTn(I-C)二聚体及其代表性的CAD碎裂谱图。　　人TnC蛋白含有3个钙结合EF-hand基序(结构域 II~IV)。结构域 II与Ca2+结合的亲和力较低，是触发心肌收缩的调控域。结构域 III 和 IV则与Ca2+具有强的亲和力，在心肌舒张和收缩时均始终保持与Ca2+充分结合，但结构域 II只有在收缩时才被Ca2+占据。这里观察到了TnC分别与0、1、2和3个Ca2+结合的情况，通过CAD碎裂也进一步定位了TnC与Ca2+结合的具体氨基酸序列(图4)。研究发现结构域 II的骨架最容易发生碎裂，而结构域 III的骨架最难碎裂。目前结构域 II~IV的序列在UniprotKb中分别对应65DEDGSGTVDFDE76、105DKNADGYIDLDE116和141DKNNDGRIDY152。这里分别将与1、2和3个Ca2+结合的TnC隔离出来进行CAD碎裂(m/z分别为2312、2316和2321)，可以更准确地将结构域 III、II和IV的序列分别定位到113DLD115、141DKNND145和73DFDE76(图4c)，表明非变性纳米蛋白组学方法在定位非共价金属结合方面具有高分辨能力。　　图4.nTDMS定位 TnC与Ca2+结合的结构域。(a)FTICR-MS隔离与不同数量Ca2+结合的TnC单体 (b~c)与两个Ca2+结合的TnC的CAD碎裂谱图，蓝色、红色和黄色方框分别对应结构域 II 、III和IV。　　Ca2+与TnC的结合会对cTn复合物的功能和构象有着很大影响。cTn复合物的核心区维持着构象的稳定，但当Ca2+与TnC发生结合时，其柔性区会经历广泛的构象变化，复合物结构会从“closed”状态转变成“opened”状态，这会促进肌动蛋白和肌球蛋白间的相互作用，最终导致心肌收缩。然而，传统结构生物学技术很难捕获cTn复合物与Ca2+结合时的构象变化。因此，作者使用离子淌度质谱来分析cTn复合物的构象变化。TnC亚基和与Ca2+结合的cTn(I-C)二聚体的淌度分离谱图如图5所示。与0~3个Ca2+结合的TnC的碰撞截面(Collision Cross-Section，CCS)值分别为1853、1849、1829和1844 Å2(图5a~5b)，TnC构象比IMPACT预测的更为紧凑，但cTn(I-C)二聚体的CCS值与预测的非常接近(图5c~5d)。作者推测TnC与两个Ca2+结合会形成更致密的构象，是因为在静息舒张时Ca2+与结构域 III 和 IV充分结合。当第三个 Ca2+与结构域II结合时，TnC转变为“opened”构象，使其N端与cTnI的C端相结合，进而引发心肌收缩(图5e)。cTn(I-C)二聚体与Ca2+结合时的构象变化也是如此(图5f)。　　图5.TnC单体(a~b)和与Ca2+结合的cTn(I-C)二聚体(c~d)的离子淌度分离谱图 (e~f)TnC和cTn(I-C)二聚体与Ca2+结合时的构象变化。　　最后，作者通过添加EGTA来剥离cTn复合物中的Ca2+，以进一步研究Ca2+在维持复合物结构稳定性上的作用。图6b~6c是没有EGTA孵育时的cTn复合物的TIMS-MS谱图。cTn复合物的CCS值与理论预测值非常符合。随着EGTA孵育浓度的增加(25、50和100mM)，Ca2+逐渐被螯合，cTn复合物的结构也越来越舒展，体现在平均电荷态逐渐增加，以及逐渐在较低m/z范围内出峰，这表明cTn复合物构象的稳定性丢失与EGTA浓度的增加相关(图6d~6f)。虽然100mM EGTA孵育也不敢保证Ca2+的完全剥离，并且cTnI的存在又会增强TnC与Ca2+的结合，但TIMS-MS为我们研究cTn复合物与Ca2+结合时的构象变化提供了一种切实可行的分析手段。　　图6.cTn复合物与EGTA孵育时的构象变化。(a)cTn复合物的构象随EGTA孵育浓度的增加发生改变 (b~c)cTn复合物的TIMS-MS谱图 (d~f)cTn复合物与不同浓度EGTA(25、50和100mM)孵育的谱图和CCS分析。　　总的来说，本研究开发了一种可用于内源性蛋白复合物富集和结构表征的非变性纳米蛋白组学方法，以获取其组装、proteoforms异质性和动态非共价结合等方面的生物信息。本文采用的功能化NPs可被灵活设计成选择性结合特定的靶蛋白，在富集和洗脱过程中可以很好保持其近似生理条件下的存在状态。更为重要的是，功能化NPs与nTDMS的整合可以作为一种强有力的结构生物学工具，可以作为传统技术的补充，用于内源性蛋白复合物的表征。　　撰稿：陈昌明 编辑：李惠琳文章引用：Structure and dynamics of endogenous cardiac troponin complex in human heart tissue captured by native nanoproteomics　　参考文献　　Chapman EA,Roberts DS, Tiambeng TN, et al. Structure and dynamics of endogenous cardiac troponin complex in human heart tissue captured by native nanoproteomics. Nat Commun. 2023 14(1):8400. Published 2023 Dec 18. doi:10.1038/s41467-023-43321-z

大家好，本周为大家分享一篇来自Angewandte Chemie - International Edition的文章：Infrared Multiphoton Dissociation Enables Top-Down Characterization of Membrane Protein Complexes and G ProteinCoupled Receptors[1]，文章的通讯作者是牛津大学化学系的Carol V. Robinson教授。　　非变性质谱(Native MS)是结构生物学中一个成熟的工具。在电喷雾电离过程中使用非变性缓冲液可以保存多组分蛋白质复合物之间的非共价相互作用，以及它们的配体、辅因子或其他结合蛋白。它可以用于探究蛋白质复合物的相互作用和功能，因为结合事件导致质量变化，可以在质谱仪中跟踪和剖析。然而，由于膜蛋白的疏水性，使得它们在传统的非变性质谱缓冲液中不溶且容易聚集，因此在非变性质谱中呈现出独特的挑战。目前采用的方法是将蛋白质复合物溶解到膜类似物中，例如：去垢剂、纳米脂质盘、两性聚合物等，再将这些膜类似物通过碰撞激活去除。其中去垢剂是应用的最广泛的一种。然而由于碰撞激活的能量在应用中受到限制，该方法并不能在质量分析前很好地去除去垢剂。此外，在非变性质谱条件下，键的断裂也受到非共价相互作用强度的影响(例如蛋白质-蛋白质、蛋白质-去垢剂剂以及去垢剂胶束内的相互作用)。　　基于光子的方法，如紫外光解离(UVPD)和红外多光子解离(IRMPD)已被证明有利于可溶性蛋白质及其复合物的Top-Down质谱分析。与此同时，基于光子的膜蛋白Top-Down模式的应用正在兴起。原理上，激光束路径中的离子被连续地驱动到振动激发态。因此，在基于光子的方法中，能量储蓄通常与前体离子的电荷状态和分子量无关。然而，电荷状态和分子量仍然会影响肽键解离需要的输入能量。先前报道的通过UVPD对79 kDa的五聚体的大电导机械敏感通道(MscL)Top-Down的断裂得到了令人印象深刻的54%的序列覆盖。然而，对于氨通道(AmtB)一个127 kDa的同源三聚体，通过碰撞激活和UVPD两种不同的方式破碎，仅实现了20%的序列覆盖率。事实上，相对较低的序列覆盖率是由于大分子量以及三聚体中增加的非共价相互作用影响的结果。尽管这些工具能够在非变性状态下实现Top-Down质谱分析，但其在膜蛋白表征中的应用仍不广泛。这就要求建立一种能使低电荷密度的高分子量蛋白质稳定地产生蛋白质序列离子的方法，而膜蛋白嵌入异质膜或膜类似物则使这一问题更加复杂。虽然IRMPD之前被用于从去垢剂中释放膜蛋白，但使用IRMPD对非变性的膜蛋白进行测序的研究相对较少。　　图1. (A)改进的Orbitrap Eclipse Tribrid的原理图，其中包括一个红外激光器直接进入四极线性离子阱(QLIT)的高压细胞。离子化的蛋白质胶束被转移到高压QLIT中，在那里整个离子群受到红外光子的照射，然后被转移到Orbitrap进行质量分析。通过调节激光输出功率(W)和照射时间(ms)，可以使膜蛋白从去垢剂胶束中完全解放出来。(B)三聚氨通道(AmtB)在3.0 W输出功率和200ms辐照时间下的非变性质谱。(C)在3.3 W输出功率和200ms辐照时间下AmtB的非变性质谱。　　因此，作者利用改进的Orbitrap Eclipse Tribrid质谱仪，与连续波远红外(IR) CO2激光器连接，使光束聚焦到双四极杆线性离子阱(QLIT)的高压池中(图1A)。红外激活可以有效地去除蛋白质复合物中的去垢剂胶束，随后通过IRMPD使得膜蛋白碎片化。在这种安排下，由纳米电喷雾电离产生的蛋白质复合物被转移到高压池中。在转移到Orbitrap进行检测或m/z分离和随后的碎片化之前，整个离子群将受到943cm-1红外光子的照射。利用红外的方法去除去垢剂胶束，红外激光有两个可调控参数:激光输出功率(高达60瓦)和照射时间(毫秒到秒)。因此，可以更好地控制从蛋白质胶束中释放膜蛋白，确保非变性复合物的保存，同时完全去除包裹复合物中的去垢剂。通过对激光输出功率和照射时间的优化，作者发现红外激活的参数是高度可调的，不同的激光功率和照射时间的组合也可以产生分辨率相当的谱图。其中例如在3.3 W下照射200 ms时，可以得到多个电荷态的三聚体峰(~6500 m/z)，也可以观察到三聚体与脂质结合的峰，而且对于图谱中的单体也能观察到与脂质结合的峰(图1C)。作者还对不同的去垢剂产生分辨率较高的图谱所需要红外参数进行了评估，从而评价了这几种去垢剂得到高分辨率图谱的难易程度(图2)。　　图2. 红外辐射去除膜蛋白离子中的去垢剂是高度可调的。增加激光输出功率对三种常用的MS兼容去垢剂(C8E4,G1和DDM) AmtB三聚体峰外观的影响。辐照时间固定为200 ms，激光输出功率分别为2.1、2.4、3.0和3.6 W。去垢剂在真空中按易去除的顺序显示，这是由完全释放膜蛋白复合物所需的激光输出功率决定的，从而在m/z光谱中产生良好分辨的电荷状态峰。为了探究IRMPD分离蛋白质和去垢剂胶束的机制，作者对三种不同的去垢剂：四聚乙二醇单辛醚(C8E4)、树突状低聚甘油(G1)和十二烷基-β-D-麦芽糖苷(DDM)的溶液相和气相红外光谱进行了表征，并利用密度泛函理论(DFT)计算得到了C8E4头部基团的红外谐波光谱，用来验证所得到的红外吸收光谱会受到振动耦合的影响，对于质子化的去垢剂离子，氢键和富氧去垢剂内的质子共享可以改变观察到的振动频率。结果表明C8E4胶束的溶液相吸收光谱包含一个与预期激光波数943cm-1重叠的显著带，这就解释了为何较低的激光能量可以将去垢剂胶束和蛋白质复合物分离。而在谐波光谱中在预期的激光波数处的确产生了峰，并推测该峰来自于O-H伸缩、C-C伸缩，C-H弯曲和C-O伸缩振动的耦合。而G1和DDM的最大吸收则偏离了943cm-1的预期波数，作者认为这是不同去垢剂氢键作用的结果。而蛋白质在真空中的红外吸收能力较弱，由此推测在IRMPD的过程中，去垢剂是主要的吸收对象。所以仅需要较低的能量就可以使蛋白质从复合物中剥离而不至于破坏蛋白质的非共价作用。完整的蛋白质离子还支持串联质谱的实验，为了得到蛋白质的序列信息，作者分离了m/z在6674处(电荷态为+19)的AmtB三聚体蛋白，并将其置于高激光输出功率(9 W)下照射5 ms，在m/z 1750~4000之间产生密集的多电荷态离子片段，并得到了26%的序列覆盖，这优于之前基于碰撞激活的方法(　　图3. 三聚体AmtB的IRMPD。(A)在m/z 6674处分离19+电荷态离子阱后，IRMPD后观察到的碎片离子MS2谱。多重带电碎片被高亮显示 来自相同地点的重复片段用虚线分组。为了清楚起见，许多指定的离子没有注释 (B)片段丰度相对于裂解原点(残基数)的条形图，其中丰度表示来自每个位点的片段归化一强度之和。条形图的颜色强度表示每个片段的加权平均电荷。将AmtB的拓扑域叠加在条形图上 α-螺旋跨膜区域用黄色方框表示，编号为1到11。跨膜区由质周环和细胞质环连接，用灰色线表示。(C)主干裂解位点覆盖在AmtB (PDB: 1U7G)的结构上。蓝色和红色阴影区域分别代表b型和y型离子。颜色强度对应于所分配片段的丰度。从气相分子动力学模拟中得到的高温(500 K)下的跨膜螺旋快照用虚线圈标出。为了验证这一个推测，作者又对另外两种GPCR蛋白：β -1-肾上腺素能受体(β1AR)和腺苷A2A受体(A2AR)用IRMPD进行了MS2图谱的测定，结果也观察到了片段离子相似的二级结构定位，在跨膜结构区域有着高丰度的片段，但是在二硫键相连的螺旋中并没有观察到丰富的离子片段。并再次利用分子动力学模拟研究了两种GPCR的结构对断裂的影响。在500 K下的最终结构中显示，两种GPCR中都保留了α-螺旋特征，并与观察到的裂解位点密切相关。此外，还对这两种蛋白进行了HCD和IRMPD的比较分析。对于β1AR, IRMPD产生的片段离子平均分子量为8866 Da，高于HCD产生的5843 Da。IRMPD产生的片段离子也保留了更高的平均电荷(4.7 + vs 3.6+ z)。最终，IRMPD的碎片化导致β1AR的序列覆盖率更高，为28%，而HCD为17%。在A2AR中也观察到类似的趋势，IRMPD的覆盖率为19%，而HCD为9%。　　总的来说，作者证明了可以在改进的Orbitrap Eclipse质谱仪的高压QLIT下，通过红外照射可以完全释放一系列去垢剂胶束中的膜蛋白。然后，通过增加激光输出功率，获得直接从膜蛋白及其复合物中释放的序列信息片段离子，证明红外光去除去垢剂是通用的和高度可控的，为保存和鉴定膜蛋白和配体之间脆弱的非共价相互作用构建了一个可靠的方法。而且还对片段离子的产生机制做了阐述，即质子可以通过沿蛋白质骨架迁移来稳定和诱导连续的肽键裂解。　　撰稿：李孟效　　编辑：李惠琳　　文章引用：Infrared Multiphoton Dissociation Enables Top-Down Characterization of Membrane Protein Complexes and G ProteinCoupled Receptors　　参考文献　　Lutomski, C.A., El-Baba, T.J., Hinkle, J.D., et al. Infrared multiphoton dissociation enables top-down characterization of membrane protein complexes and g protein-coupled receptors[J]. Angewandte Chemie-International Edition，2023.

蛋白质作为生命活动的执行者,通过自身结构的动态改变,以及与其他蛋白质相互作用组装为蛋白质复合物,调控各种生物学过程。因此,如何实现蛋白质复合物的精准解析已成为当前生命科学的研究热点。化学交联结合质谱(CXMS)技术作为蛋白质复合物解析的新兴技术,利用化学交联剂将空间距离足够接近的蛋白质分子内或分子间的氨基酸残基以共价键连接起来,再利用液相色谱-质谱联用对交联肽段进行鉴定,实现蛋白质复合物的组成、界面和相互作用位点的解析。该技术具有分析通量高、灵敏度高、可提供蛋白质间相互作用的界面信息、普遍适用于不同种类和复杂程度的生物样品等优势,已成为X射线晶体衍射、低温冷冻电镜、免疫共沉淀等蛋白质复合物研究技术的重要补充。化学交联位点的鉴定覆盖度和准确度决定着该技术对于蛋白质复合物结构的解析能力。目前,为了实现蛋白质复合物的高覆盖度交联,研究人员发展了可用于共价交联赖氨酸(K)的氨基、谷氨酸(E)/天冬氨酸(N)的羧基、精氨酸(R)的胍基以及半胱氨酸(C)的巯基等多种活性基团的新型交联剂。进而,为了提高低丰度交联肽段的鉴定灵敏度,体积排阻色谱法、强阳离子交换色谱法,及亲和基团富集策略被提出用于交联肽段的高选择性富集,如可富集型化学可断裂交联剂——Leiker,与不具备富集功能的交联剂相比,通过亲和富集可以将交联位点鉴定数目提高4倍以上。胰蛋白酶镜像酶(LysargiNase)的酶切位点与胰蛋白酶互为镜像,可特异地切割赖氨酸和精氨酸的N端。由于LysargiNase的N端酶切特点,电荷主要分布在交联肽段的N端,在碰撞诱导裂解(CID)和高能诱导裂解(HCD)模式下产生以b离子为主的碎片离子,与胰蛋白酶酶切肽段以y离子为主的碎片离子互为镜像补充,为胰蛋白酶酶解肽段在质谱鉴定中b离子缺失严重的问题提供了很好的解决办法。由于具有较高的酶切特异性和酶活性,镜像酶已经成功地应用于蛋白质C末端蛋白质组鉴定、磷酸化蛋白质组研究、甲基化蛋白质组鉴定等方面,然而在CXMS中的应用仍未见报道。为进一步提高对蛋白质复合物结构及相互作用位点的解析能力,本文发展了LysargiNase与胰蛋白酶联合酶切的方法,基于镜像酶正交切割的互补特性,通过产生赖氨酸及精氨酸镜像分布的交联肽段,以增加特征碎片离子数量和肽段匹配连续性,从而提升交联肽段的谱图鉴定质量,达到提高交联位点的鉴定覆盖度和准确度的目的。通过分别对牛血清白蛋白及大肠杆菌全蛋白样品的交联位点鉴定结果的考察,评价该策略对单一蛋白样品和复杂细胞裂解液样品蛋白质复合物表征的应用潜力。蛋白质样品制备称取牛血清白蛋白粉末,以20 mmol/L 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES, pH 7.5)作为缓冲体系,配制0.1 mmol/L牛血清白蛋白溶液。大肠杆菌细胞(种属K12)在37 ℃下采用Luria-Bertani(LB)培养基培养24 h,然后于4 ℃以4000 g离心2 min,收集细胞沉淀。细胞沉淀采用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3遍后,悬浮于细胞裂解液(含20 mmol/L HEPES和1%(v/v)蛋白酶抑制剂)中,冰浴超声破碎180 s(30%能量,10 s开,10 s关)。匀浆液于4 ℃以20000 g离心40 min,收集上清,采用BCA试剂盒测定所得蛋白质含量。稀释大肠杆菌蛋白裂解液至蛋白质含量为0.5 mg/mL。化学交联样品制备以20 mmol/L HEPES(pH 7.5)为溶剂配制浓度为20 mmol/L 的BS3交联剂母液 将交联剂母液加入牛血清白蛋白的缓冲溶液及大肠杆菌蛋白裂解液中,使交联剂的终浓度为1 mmol/L,在室温条件下反应15 min 通过添加终浓度为50 mmol/L的淬灭溶液NH4HCO3进行交联反应淬灭,并在室温下孵育15 min 在冰浴条件下,将交联样品逐渐滴入8倍体积的预冷丙酮中,于-20 ℃静置过夜 在4 ℃条件下,以16000 g转速离心,去除丙酮,然后将交联蛋白用预冷丙酮清洗2次,去除上清液后,于室温挥发掉残余的丙酮 以8 mol/L尿素溶液复溶蛋白质沉淀 将牛血清白蛋白交联样品以5 mmol/LTCEP作为还原剂,于25 ℃下反应1 h进行变性和还原 将大肠杆菌样品以5 mmol/LDTT作为还原剂,于25 ℃下反应1 h进行变性和还原,避免大肠杆菌蛋白在酸性条件下发生变性 添加终浓度为10 mmol/L的碘乙酰胺(IAA),在黑暗中,于室温下反应30 min 以50 mmol/LNH4HCO3稀释样品至尿素浓度为0.8 mol/L后,将样品均分为两份,一份以蛋白样品与蛋白酶的质量比呈50:1的比例加入胰蛋白酶,于37 ℃酶解过夜,另一份加入终浓度为20 mmol/L的CaCl2,以蛋白样品与蛋白酶的质量比呈20:1的比例加入LysargiNase,并在37 ℃温度下酶解过夜。液相色谱-质谱鉴定及数据搜索上述所有样品经过除盐,使用0.1%甲酸(FA)溶液复溶,用超微量分光光度计测定肽段浓度,进行反相高效色谱分离和质谱分析。牛血清白蛋白样品采用Easy-nano LC 1000系统偶联Q-Exactive质谱仪平台进行质谱分析。流动相A: 2%(v/v)乙腈水溶液(含0.1%(v/v)FA) 流动相B: 98%(v/v)乙腈水溶液(含0.1%(v/v)FA)。梯度洗脱程序:0~10 min, 2%B~7%B 10~60 min, 7%B~23%B 60~80 min, 23%B~40%B 80~82 min, 40%B~80%B 82~95 min, 80%B。Q-Exactive质谱仪采用数据依赖性模式,Full MS扫描在Orbitrap上实现,扫描范围为m/z 300~1800,分辨率为70000(m/z=200),自动增益控制(AGC)为3×106,最大注入时间(IT)为60 ms,母离子分离窗口为m/z 2。MS/MS扫描的分辨率为17500(m/z=200),碎裂模式为HCD,归一化碰撞能量(NCE)为35%, MS2从m/z 110开始采集,MS2的AGC为5×104, IT为60 ms,仅选择电荷值为3~7且强度高于1000的母离子进行碎裂,并将动态排除时间设置为20 s。每个样品分析3遍。大肠杆菌样品采用EASY-nano LC 1200系统偶联Orbitrap Fusion Lumos三合一质谱仪平台进行质谱分析。流动相A: 0.1%(v/v)甲酸水溶液 流动相B: 80%(v/v)乙腈水溶液(含0.1%(v/v)FA)。梯度洗脱程序:0~28 min, 5%B~16%B 28~58 min, 16%B~34%B 58~77 min, 34%B~48%B 77~78 min, 48%B~95%B 78~85 min, 95%B。Orbitrap Fusion Lumos三合一质谱仪采用数据依赖性模式,Full MS扫描在Orbitrap上实现,扫描范围为m/z 350~1500,分辨率为60000(m/z=200), AGC为4×105, IT为50 ms,母离子分离窗口为m/z 1.6。MS2扫描的分辨率为15000(m/z=200),碎裂模式为HCD, NCE为30%, MS2从m/z 110开始采集,MS2的AGC为5×104, IT为60 ms。仅选择电荷值为3~7且强度高于2×104的母离子进行碎裂,并将动态排除时间设置为20 s。每个样品分析3遍。质谱数据文件(*.raw)采用pLink 2软件(2.3.9)对交联信息进行检索和鉴定。使用从UniProt于2019年4月27日下载的牛血清白蛋白序列和大肠杆菌序列,搜索参数如下:酶切方式为胰蛋白酶(酶切位置:K/R的C端)、LysargiNase(酶切位置:K/R的N端) 漏切位点个数为3 一级扫描容忍(precursor tolerance)2.00×10-5 二级扫描容忍(fragment tolerance)2.00×10-5 每条肽段的质量范围为500~1000 Da 肽段长度的范围为5~100个氨基酸 固定修饰为半胱氨酸还原烷基化(carbamidomethyl [C]) 可变修饰为甲硫氨酸氧化(oxidation [M])、蛋白质N端乙酰化(acetyl [protein N-term]) 肽段谱图匹配错误发现率(FDR)≤5%。映射胰蛋白酶与LysargiNase酶解样品的交联位点在牛血清 白蛋白晶体结构(PDB: 3V03)的映射 LysargiNase与胰蛋白酶酶解样品的交联位点对及单一交联位点的互补性LysargiNase与胰蛋白酶酶解样品共同得到的交联位点鉴定打分比较b+/++与y+/++离子碎片分别在α/β-肽段的碎片覆盖度LysargiNase与胰蛋白酶酶解的交联肽段质谱图大肠杆菌样品中LysargiNase与胰蛋白酶酶切鉴定蛋白质复合物信息互补性带点击了解原文：https://www.chrom-china.com/article/2022/1000-8713/1000-8713-40-3-224.shtml

大家好，本周为大家分享一篇最近发表在 Journal of the American Chemical Society上文章，Native Top-Down Mass Spectrometry with Collisionally Activated Dissociation Yields Higher-Order Structure Information for Protein Complexes1。该文章的通讯作者是美国加利福尼亚大学洛杉矶分校的Joseph A. Loo教授。非变性质谱(native MS，nMS)通常用于揭示蛋白及其复合物的分子量大小和化学结合计量比，但若要进一步阐明深层次的结构信息，则需要与串联质谱结合，即非变性自上而下质谱（nTDMS），通过对母离子进行二级甚至多级碎裂可获取额外的序列、翻译后修饰(PTMs)以及配体结合位点信息。此外，nTDMS能以构象敏感的方式断裂共价键，这样就可以从碎片模式推断出有关蛋白高级结构的信息。值得注意的是，使用的激活/解离方式会极大地影响得到的蛋白质高阶结构信息。电子捕获/转移解离(ECD、ETD或ExD)和紫外光解离(UVPD)等快加热的活化方式因其能够在保留蛋白整体结构的情况下先对共价键进行断裂而被广泛应用于nTDMS分析中。而慢加热的活化方式如碰撞活化解离(CAD)会在断键前进行能量重排，导致一些较弱的非共价相互作用先发生破坏，例如：亚基的释放和展开，因此对高阶结构表征没有帮助。而此次Joseph A. Loo课题组的研究结果显示使用基于orbitrap的高能C-trap解离(HCD)同样也可以从天然蛋白复合物的中直接获得序列信息，并且碎片模式可以提供有关其气相和溶液相高阶结构信息。此外，CAD还可以生成大量的内部碎片(即不包含N-/ C-端的片段)用于揭示蛋白质复合物的高阶结构。为了研究蛋白复合物HCD的碎裂化情况，作者比较了酵母来源的乙醇脱氢酶四聚体（ADH）在Complex-down MS (psedo-MS3)和nTDMS两种分析策略下的碎片模式。如图1所示，在Complex-down MS分析中，ADH经源内解离（ISD）释放出单个亚基，该亚基经HCD碎裂生成肽段b/y离子。而在nTDMS分析中，肽段离子则可以从复合物中直接获得。如图2（上）所示，在Complex-down MS分析中总共获得了24个b离子和18个y离子，能够实现11.8%的序列覆盖率。近乎相等数目的b、y离子表明Complex-down MS分析中释放的ADH亚基N-端和C-端均具有较高的表面可及性，即亚基发生去折叠。此外，碎片模式也揭示了N-端乙酰化、V58T突变体以及Zn2+结合位点等信息。相比之下，nTDMS分析则更反映ADH的高阶结构，如图2（下）所示，在nTDMS分析中主要检测到b离子，几乎没有亚基信号，说明b离子是直接由复合物中共价键断裂产生的。ADH的nTDMS分析共产生了60个N-端b离子和3个C-端y离子（17.6%序列覆盖率）。由HCD产生的大量N端碎片类似于ADH基于电子和光子解离技术产生的nTDMS产物。将这些片段映射到ADH的晶体结构上可以看出，N端区域比C端区域更容易暴露于溶剂，而C端区域主要形成复合物的亚基-亚基界面。ADH的碎片离子中来源亚基界面断裂的仅占8%，大部分碎裂都发生在溶剂可及的N-端。图1 Complex-down MS和nTDMS分析流程图1 Complex-down MS（上）和nTDMS（下）碎片模式比较ADH的nTDMS分析充分展现了CAD在蛋白复合物高阶结构表征上的潜力，为了进一步验证，作者还选择了其他的蛋白复合物进行实验，如醛缩酶同源四聚体、谷胱甘肽巯基转移酶A1二聚体、肌酸激酶二聚体等。这些蛋白复合物在n-CAD-TDMS分析中都产生了与结构对应的碎片离子，说明基于CAD的nTDMS分析是具有普适性。当然也会存在一些例外，膜蛋白水通道蛋白(AqpZ)同源四聚体在nTDMS分析过程中产生了高丰度的单体亚基、二聚体、三聚体信号，这应该归因于AqpZ四聚体亚基之间的弱疏水结合界面，导致亚基的释放发生在共价键断裂之前，因此产生的b/y离子无法反映蛋白复合物的空间结构。相较而言，以盐桥为主要稳定作用的蛋白复合物，如ADH、醛缩酶等则更容易在nTDMS分析中产生肽段碎片离子。此外，基于CAD的nTDMS分析中还发现了大量的内部碎片，ADH产生的大部分内部碎片来源于溶剂可及区。尽管内部碎片难以辨认，但可以大幅度提高序列覆盖率，提供更精细的结构信息。一个从小分子裂解衍生到大分子解离的假设是，在实验的时间尺度内，由碰撞引起的激活是完全随机化的，并以沿着最低能量途径引导碰撞诱导的解离。然而，这些假设没有考虑到熵的要求，缓慢重排可能是释放亚基所必须的，例如重新定位盐桥将一个亚基与其他亚基相连。在碰撞次数或每次碰撞能量不足以碰撞出能释放亚基的罕见构型的情况下，以释放出更小的多肽碎片(具有更少的约束) 代替重排可能具有更高的竞争性。总之，本文展示CAD在nTDMS分析中的应用，无需基于光子或电子的活化方式，CAD可直接从蛋白复合物中获得肽段离子，并且该碎裂离子能够反映蛋白复合物的空间结构。撰稿：刘蕊洁编辑：李惠琳原文：Native Top-Down Mass Spectrometry with Collisionally Activated Dissociation Yields Higher-Order Structure Information for Protein Complexes参考文献1. Lantz C, Wei B, Zhao B, et al. Native Top-Down Mass Spectrometry with Collisionally Activated Dissociation Yields Higher-Order Structure Information for Protein Complexes. J Am Chem Soc. 2022 144(48): 21826-21830.

作为生命活动的执行者，蛋白质通过相互作用形成复合物等形式行使其特定的生物学功能。近日，中国科学院大连化学物理研究所研究员张丽华、研究员赵群等研制了一种基于糖苷键的质谱可碎裂型交联剂，显著地提高了交联信息的检索通量和鉴定准确度，同时具有良好的两亲性和生物兼容性，实现了活细胞内蛋白质复合物原位交联和规模化精准解析。相关成果发表在《德国应用化学》上。大连化物所供图　　细胞内的限域效应、拥挤效应和细胞器微环境等对于维持蛋白质复合物结构和功能至关重要。而化学交联技术，尤其是原位化学交联质谱技术具有规模化分析蛋白复合物原位构象和相互作用界面的优势，已成为活细胞内蛋白质复合物解析的重要技术。但是，目前活细胞原位交联面临着细胞扰动大、交联肽段谱图复杂程度高等问题。因此，如何实现活细胞低扰动下的原位快速交联是蛋白质原位构象和相互作用精准解析的先决条件。　　本工作中，团队基于糖分子的高生物兼容性和糖苷键的质谱可碎裂特征，将糖苷键引入到功能交联剂的骨架设计中，筛选并获得了高生物兼容性的海藻糖作为骨架分子，研制了质谱可碎裂型交联剂——海藻糖二琥珀酰亚胺酯。该交联剂较目前已报道的可透膜型化学交联剂，展示了更加优异的细胞活性维持能力，可在低扰动状态下实现细胞内蛋白质复合物的高效交联。　　在此基础上，低能量的糖苷键—高能量的肽键的质谱选择性碎裂模式，可以将“工字形”的交联肽段数据分析降幂为常规交联剂片段修饰的线性肽段数据检索，极大地降低了交联肽段谱图分析的复杂性，显著地提高了交联肽段的鉴定效率与准确度。

大家好，本周为大家分享一篇李惠琳课题组最近发表在Mass Spectrometry Reviews上的综述，Native top‐down mass spectrometry for higher‐order structural characterization of proteins and complexes1。结构生物学的快速发展极大地促进了蛋白结构表征工具的开发。其中，基于质谱的分析方法凭借其快速、灵敏、高通量的优势从中脱颖而出。相比于原子水平的高分辨结构表征工具如X-射线晶体学、核磁共振（NMR）、冷冻电镜（Cryo-EM）等，基于质谱的分析方法能够有效地补充蛋白动力学结构变化的信息，并且不受蛋白纯度、分子量大小的限制。而相较于低分辨的蛋白表征工具如圆二色光谱、动态光散射等，基于质谱的分析方法能够提供更高的肽段或残基水平分辨率，获取额外的序列、翻译后修饰（post‐translational modifications, PTMs）、局部空间结构等信息。常见的结构质谱包括：氢氘交换质谱（hydrogen‐deuterium exchange MS, HDX-MS）、交联质谱（cross‐linking MS, CX-MS）、表面标记质谱（covalent labeling MS, CL-MS）等。已有相当多的文献对这些方法进行了详细的介绍2,3，在此不再赘述。而此篇综述将重点介绍非变性至上而下质谱（native top‐down MS, nTDMS）在蛋白及其复合物结构表征中的应用。在过去的十年，非变性质谱（native MS, nMS）特别是nTDMS发展迅速。nMS作为一个桥梁将蛋白质组学与结构生物学相连，其保留非共价相互作用的特性使其广泛用于蛋白复合物四级结构表征，如推断亚基组成、化学计量比、亚基排布等。然而，对于一些深层次的结构信息，如氨基酸序列、PTMs、配体结合位点、亚基结合界面等，仅靠单一的nMS是无法获取的。与之对应的，变性条件下的自上而下质谱（TDMS）能够在完整蛋白水平下直接获得序列以及PTMs信息，虽然有助于PTM的准确定位以及蛋白、蛋白异质体（Proteoform）的鉴别，但却丢失了涉及非共价相互作用的高级结构信息。受限于质谱仪器的发展，在早期，nMS与TDMS通常在两个独立的实验中进行，随着质量分析器以及多种活化/碎裂方式的开发，nMS与TDMS的能够有效的结合，充分发挥各自的优势，在实现多层次结构信息获取的同时，也在不断挑战更加复杂的生物体系，如核糖体、膜蛋白、内源蛋白混合物等。实验设计nTDMS已成为表征蛋白质和复合物的初级到高级结构的重要工具。随着蛋白质样品的大小和复杂性的增加，用于nTDMS的仪器不仅需要符合某些特定标准，还需要不断提高其性能以满足这些增加的需求。nTDMS分析中几个关键的步骤包括：样品前处理、ESI离子化、二级碎裂、质量检测以及数据处理。样品前处理为了维持蛋白的自然状态，通常需要在生理环境中进行nMS分析。然而，缓冲液中的非挥发性盐会产生大量盐簇并与蛋白离子形成非特异性加合物，从而抑制离子信号、降低检测的准确度和灵敏度。因此，样品前处理过程中最重要的环节就是除盐。然而适当的离子强度有助于维持蛋白的三维结构，所以通常的步骤是对蛋白进行缓冲液置换，将蛋白置换至醋酸铵或碳酸氢铵等挥发性盐溶液中。目前已开发了多种在线或离线的除盐方法，详细内容的可在综述原文中查看，此处不再赘述。除了使用非挥发性缓冲盐，减小ESI喷针孔径大小也可以提高系统耐盐能力。碎裂/活化方式二级碎裂方式是实现nMS到nTDMS的关键。常见的活化方式按照原理可分为三类：基于碰撞（CID, SID）、基于电子（ECD, ETD, EID等）以及基于光子（UVPD, IRMPD）的活化/碎裂方式。值得注意的是，CID与IRMPD都属于慢加热的活化方式，能量累积的非常慢，以至于在发生碎裂之前已经进行了能量重排，一些较弱的或者不稳定的键会优先发生断裂，最终导致非共价相互作用在活化的过程中被破坏。而SID、ExD与UVPD则属于快加热的活化方式，碎裂发生在能量重排之前，非共价相互作用得以在这一过程保留下来，碎片化程度受到非共价相互作用的限制，因此可被用于表征蛋白的空间结构。此外，将多种活化方式的结合或与离子淌度技术串联也是获取多层次结构信息的关键。质量检测与变性条件下的质谱分析相比，蛋白复合物在天然环境下通过电喷雾电离产生的电荷数相对较少，因此需要具有较大m/z 范围的质量分析仪（高达m/z = 20,000 Da甚至更高）。最初，nMS分析高度依赖基于飞行时间（time of fight, TOF）质量分析器，因为TOF具有理论上无限的m/z范围。近年来，高分辨质量分析器如轨道阱（Orbitrap）和傅里叶变换离子回旋共振（FTICR）为生物大分子的nTDMS分析带来了新的活力。在综述中，我们简要介绍了每种质量分析器的最新进展，并重点强调了FTICR和Orbitrap在nTDMS分析中的发展和应用。数据处理除了基本的硬件设施，配套的数据处理软件也十分重要。nTDMS数据处理流程通常包括以下4个步骤：同位素峰选取、去卷积、数据库搜索、验证和可视化。正文中，我们对每个步骤进行了简要描述，并重点介绍用于数据库搜索和异质体鉴别的软件。多层次结构信息的获取得益于多种活化/碎裂方式的开发，nTDMS分析可同时获得多层次的结构信息（图1）。主要有以下两种策略：第一种策略，完整蛋白复物（MS1）首先被CID或SID碎裂至亚基（MS2），亚基可进一步碎裂肽段（MS3），在MS1及MS2中可获蛋白复合物结合计量比、拓扑结构、蛋白异质性等信息，在MS3阶段则可获取蛋白序列、PTMs定位以及异质性来源等信息。第二种策略则是完整蛋白复合物（MS1）直接被UVPD或ExD碎裂成肽段（MS2），受益于UVPD以及ExD独特的碎裂方式，发生碎裂的区域主要位于蛋白复合物的表面可及区，而未发生碎裂的区域可能位于蛋白复合物的核心区域或参与亚基相互作用界面。不同的碎裂情况反映不同的空间结构，带有配体的肽段碎片可以用于配体结合位点的定位。综述中，我们详细阐述了如何利用nTDMS获得蛋白复合物的多层次结构信息以及如何将碎片信息与结构信息相关联。图1. nTDMS可提供的多维度结构信息复杂生物体系中的应用蛋白质的空间结构决定了其生物功能，而蛋白质-蛋白质/配体相互作用是大多数生物进程的基础。通过突变、翻译后修饰、或者与金属、小分子配体、蛋白质、DNA、RNA等分子发生共价或非共价的相互作用，蛋白质功能在活细胞中不断受到调节。随着MS仪器、方法的不断开发和数据处理软件的逐渐成熟，nTDMS已被广泛应用于各种生物系统，从小蛋白质、蛋白质-配体复合物到大分子组装体，如膜蛋白、蛋白酶体、核糖体、病毒衣壳，甚至是内源性蛋白混合物。它们中的许多都是极具挑战性的体系，即便是采用NMR、X-射线晶体学或Cryo-EM等生物物理方法分析也是非常困难的。因此，来自nTDMS的见解对于理解这些蛋白质和复合物至关重要。在这里，我们总结nTDMS在所有生物体系中的应用实例，旨在全面了解nTDMS在解决生物学问题方面的潜力。小蛋白的结构表征和区分最初，nTDMS主要用于50 kDa以下单体蛋白的结构表征，大部分的研究都是围绕蛋白质气相结构与溶液相结构对比展开的。根据nTDMS的碎裂情况，推断蛋白的气相空间结构，并与NRM获得的溶液结构进行对比。此外，如果在二级碎裂前增加离子预活化有助于蛋白分子的展开，以便研究蛋白气相展开路径以及获取蛋白质内部空间结构信息。得益于碎片离子对蛋白空间结构的高度敏感性，nTDMS还被用于区分不同蛋白亚型、蛋白突变体的结构差异。蛋白-小分子配体相互作用随后，nTDMS应用到了蛋白-配体复合物中，不同的配体类型适合不同的活化/碎裂方式，除了金属离子、RNA/DNA等以静电作用为主的蛋白配体能够在CID活化时存活，大部分复合物的碎裂都需要选择ECD或UVPD等方式。nTDMS可用于蛋白-配体结合计量比、亲和力、结合位点、作用机制、结构动力学/变构效应的研究。它是一种强大的结构表征工具，其在抑制剂筛选、酶催化监控、RNA-蛋白质互作机制的应用实例在正文中已有详细的介绍。蛋白-蛋白相互作用随着仪器设备的快速发展，nTDMS已应用到更大的体系如蛋白-蛋白复合物，通过组合不同的活化/碎片化技术，在一次实验中可以获得多层次的结构信息。nTDMS可以帮助区分不同的蛋白异质体，并在完整复合物、亚基、肽段三个水平上确定异质性的来源。蛋白的异质性与其生物学功能密切相关，通过调整蛋白的异质性可以实现蛋白功能的转变，具体的应用案例已在正文详细介绍。除此之外，nTDMS还可以用作蛋白-蛋白复合物结合界面、气相展开以及深层次结构探索。治疗性抗体和抗原-抗体复合物在过去的几十年中，治疗性抗体已成为最受欢迎的候选药物之一，它们的高特异性和低副作用促进了治疗性抗体的快速增长。在综述中，我们还详细地介绍了nTDMS在治疗性抗体和抗原-抗体复合物体系中的应用。nTDMS可用于抗体可变区的测序、具有不同药物计量比（DARs）的抗体耦联药物的结构表征、以及抗体-抗原复合物中互补决定区及抗原表位区的鉴别。膜蛋白无论是对于传统的结构表征工具如：X-射线晶体学、NMR还是nTDMS，膜蛋白的结构表征一直以来面临着诸多困难。膜蛋白具有低丰度以及低溶解性等特点，最常见的方法是利用与nMS兼容的膜模拟物如：去污剂胶束、纳米微盘等去溶解膜蛋白，在nTDMS分析时再将膜蛋白从胶束中释放出来，释放出的蛋白可在nTDMS中进一步碎裂获取结构信息。具体的实验流程和应用实例可在综述正文中查看。大分子组装体正文中，还介绍nTDMS在极具挑战性的大分子组装体如：核糖体、蛋白酶体、病毒衣壳中的应用实例，这些生物体系普遍存在的问题是分子量非常大（接近MDa），且具有较高的异质性。对这些大分子机器进行nTDMS分析要求仪器具有较高的质量范围以及分辨率。大分子机器的结构表征充分说明nTDMS方法无论在深度还是广度上都有极大的提升。Native top-down MS蛋白质组学值得注意的是，当质谱前端结合非变性分离技术，如native GELFrEE，尺寸排阻色谱，毛细管区带电泳，离子交换色谱等，nTDMS还可以在靶向模式或发现模式下用于复杂蛋白质组的高通量分析，如内源性蛋白混合物。nTDMS分析最大的优势在于它能区分不同的蛋白异质体，并对每种蛋白异质体进行结构表征，这是其他在肽段水平进行分析的结构质谱法如：HDX-MS, CL-MS所无法实现的。总结与展望总之，在这篇综述中我们重点介绍了nTDMS的最新进展和在不同生物体系中的应用，强调通过nMS与TDMS结合可以获得额外的多层次结构信息。新技术的出现以及仪器的进步使nTDMS能够应用于结构生物学中日益复杂的生物样本体系，包括蛋白质配体、多聚蛋白复合物、大分子组装体和内源性复合物。尽管这样，nTDMS分析仍面临着的挑战，包括但不限于前端的样品分离、离子化、去溶剂化、高质荷比分子传输、异质性样本的分析以及软件的开发。未来nTDMS将与其他的一些结构表征方法相结合以获取更加全面的结构信息。正文中对未来发展趋势进行了讨论并提到了其他一些令人兴奋的创新技术如：基于MALDI离子源的质谱成像技术用于蛋白原位分析、电荷检测质谱（CDMS）用于异质性样本分析，多重技术的结合将为蛋白质复合物的nTDMS研究开辟新的道路。我们希望这篇综述能让读者更好地理解nTDMS提供的独特结构信息，并推动该方法的广泛应用。撰稿：刘蕊洁编辑：李惠琳原文：Native top‐down mass spectrometry for higher‐order structural characterization of proteins and complexes. 参考文献1.Liu RJ, Xia SJ, Li HL. Native top‐down mass spectrometry for higher‐order structural characterization of proteins and complexes. Mass Spec Rev. 2022 e21793. https://doi.org/10.1002/mas.217932.Britt HM, Cragnolini T, Thalassinos K. Integration of mass spectrometry data for structural biology. Chem Rev. 2022 122(8):7952-7986. 3.Liu XR, Zhang MM, Gross ML. Mass spectrometry-based protein footprinting for higher-order structure analysis: fundamentals and applications. Chem Rev. 2020 120(10):4355-4454.

center /center p 　　 strong 科研进展 /strong /p p 　　2018年5月25日，生命中心PI施一公教授研究组就剪接体的组装机理与结构研究于《科学》(Science)杂志以长文形式再次发表重大研究成果。这篇题为《完全组装的酿酒酵母剪接体激活前结构》(Structures of the Fully Assembled Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Before Activation)的论文报道了酿酒酵母剪接体处于被激活前阶段的两个完全组装的关键构象——预催化剪接体前体(precursor pre-catalytic spliceosome，定义为“pre-B复合物”)和预催化剪接体(pre-catalytic spliceosome，定义为“B复合物”)。这两个整体分辨率分别为3.3-4.6埃和3.9埃的高分辨率三维结构首次展示了在剪接体组装过程中 pre-mRNA的5’剪接位点和分支点(BPS)的识别状态与动态变化，回答了剪接体激活前pre-mRNA的5’剪接位点和分支点识别机理，以及激活过程中5’剪接位点和分支点如何逐步进入活性位点、剪接体如何逐步组装并通过结构重组最终完成激活等重要问题。 /p p 　　RNA剪接是真核生物基因表达调控的重要环节之一。上世纪70年代，科学家们首次发现真核生物基因的不连续性，从而表明遗传信息从DNA转移到RNA上之后，需要经历有效遗传信息的 “剪断”与重新“拼接”，这种有效遗传信息的拼接与“无效”遗传信息的去除，被称为RNA剪接。RNA剪接普遍存在于真核生物中，随着物种的进化，含有内含子的基因数量增加，发生RNA剪接的频率也相应增高，使得一个基因编码多个蛋白质成为可能。RNA剪接的本质是两步转酯反应，这种看似简单的化学反应在细胞中难以自行发生，而负责执行这一化学反应的是细胞核内一个巨大且高度动态变化的分子机器——剪接体(spliceosome)。在剪接反应过程中，多种蛋白质-核酸复合物及剪接因子按照高度精确的顺序发生结合和解聚，依次形成预组装复合物U4/U6.U5 Tri-snRNP(U4/U6.U5三小核核糖核蛋白复合物)以及至少8个状态的剪接体pre-B、B、Bact、B*、C、C*、P以及ILS复合物。 /p p 　　由于剪接体高度的动态性和复杂性，获得不同状态的剪接体的高分辨率三维结构被公认为世界难题。在这种巨大的挑战下，施一公教授率领研究组迎难而上，经过7年的努力，终于在2015年首次报道了裂殖酵母剪接体3.6埃的高分辨率结构，首次展示了剪接体催化中心近原子分辨率的结构。这一重大研究成果对RNA剪接机理的研究产生革命性影响。自2015年第一个剪接体结构发表以后，施一公研究组相继解析了酿酒酵母剪接体复合物处于6个不同状态的高分辨率结构，分别是3.8埃的预组装复合物U4/U6.U5 Tri-snRNP、3.5埃的激活状态复合物Bact complex、3.4埃的第一步催化反应后复合物C complex、4.0埃的第二步催化激活状态下的C* complex、3.6埃的完成两步转酯反应后状态下的P complex，以及3.5埃的内含子套索剪接体ILS complex的结构。这些已解析的剪接体基本覆盖了整个RNA剪接循环，从分子层面揭示了剪接体催化RNA剪接两步反应的工作机理，同时为理解剪接体的激活和解聚等过程的发生提供依据。然而，想要清楚解释剪接体是如何逐步组装并完成激活的机制仍有困难，而最新发表的这篇文章所解析的两个关键状态的剪接体，则弥补了领域内对这一部分研究的缺陷。 /p p 　　本文报道的处于激活前的两个完全组装的剪接体结构，从复合物的提纯、样品的制备到结构的解析，每一步都十分具有挑战。预催化剪接体前体(pre-B complex)由U1 snRNP、U2 snRNP以及U4/U6.U5 tri-snRNP组成，目前被认为是组成蛋白最多、分子量最大的剪接体，该状态结构复杂，但各组分之间的相互作用并不紧密，使得该复合物在提纯过程中十分容易解聚。在最新发表的这篇《科学》文章中，施一公研究组对提纯方案多次探索，最终优化出一套可以获得稳定的、性质良好的pre-B complex样品。随后利用单颗粒冷冻电镜技术重构出了U1 snRNP、U2 snRNP以及U4/U6.U5 tri-snRNP部分分辨率高达3.3埃、3.6-4.6埃以及3.4埃的冷冻电镜结构，并搭建了原子模型(图1)。 /p center img alt=" 图1" src=" http://p3.ifengimg.com/fck/2018_21/ba9a2db2fe902a0_w550_h630.jpg" height=" 630" width=" 550" / /center p style=" text-align: center " 　　 strong 图1 酿酒酵母预催化剪接体前体和预催化剪接体的三维结构 /strong /p p 　　该文解析的pre-B complex结构是目前世界上已解析的唯一一个同时包含五种核糖核蛋白(snRNP)剪接体结构，它由68个蛋白和6条RNA组成。在该结构中，首次观察到了剪接体组装早期U1 snRNP对5’剪接位点的识别，以及五种核糖核蛋白之间的相互作用界面。与此同时，该文还报道了处于pre-B complex之后的另一个完全组装的剪接体，即预催化剪接体B complex的高分辨率三维结构。结合B complex的结构信息，通过结构对比，可以清楚的看到在组装过程中，pre-mRNA的5’剪接位点由一开始被U1 snRNP识别，而后由于构象变化被转移并与U6 snRNA配对，这一步的变化为剪接体激活提供了结构基础。除此之外，分支点的动态变化、剪接体的各组分所经历的结构重组与构象改变也都清晰的呈现出来。在文章最后，根据pre-B的结构特征，作者还大胆推测了最早期的不完全组装的预剪接体(pre-spliceosome，定义为“A 复合物”)的三维结构模型(如图2)。这两个关键状态剪接体结构的解析，为揭示剪接体组装初期如何识别5’剪接位点和分支点、如何进行结构重组以及如何完成剪接体的激活等问题的机理提供了最直接、有效的结构证据，也将为更高等真核生物可变剪接的研究提供结构基础与理论依据。 /p center img alt=" 图2" src=" http://p3.ifengimg.com/fck/2018_21/3ac0a90b5e6dd9b_w550_h672.jpg" height=" 672" width=" 550" / /center p style=" text-align: center " 　　 strong 图2 酿酒酵母预剪接体三维结构的预测与剪接体组装并激活的模型 /strong /p p 　　截至目前为止，施一公研究组在酵母中一共解析了9个不同状态的剪接体高分辨的三维结构(如图3)，从组装到被激活，从发生两步转酯反应到剪接体的解聚，这9 个状态的剪接体完整覆盖了剪接通路，首次将剪接体介导RNA剪接的过程串联起来，为理解RNA剪接的分子机理提供了最清晰、最全面的结构信息。 /p center img alt=" 图3 施一公研究组解析的酵母剪接体结构汇总（图片来源: Shi Lab）" src=" http://p3.ifengimg.com/fck/2018_21/f2e159672c130e9_w550_h388.jpg" height=" 388" width=" 550" / /center p style=" text-align: center " 　　 strong 图3 施一公研究组解析的酵母剪接体结构汇总(图片来源： Shi Lab) /strong /p p 　　生命中心PI施一公为本文的通讯作者 清华大学生命学院三年级博士研究生白蕊、医学院博士后万蕊雪以及生命学院博士后闫创业为该文的共同第一作者 清华大学冷冻电镜平台的雷建林博士为冷冻电镜数据收集提供了帮助。电镜数据采集于清华大学冷冻电镜平台，计算工作得到清华大学高性能计算平台、国家蛋白质设施实验技术中心(北京)的支持。本工作获得了北京结构生物学高精尖创新中心及国家自然科学基金委的经费支持。 /p p 　　原文链接： /p p 　　http://science.sciencemag.org/content/early/2018/05/23/science.aau0325 /p p 　　相关论文链接： /p p 　　http://science.sciencemag.org/content/early/2016/01/06/science.aad6466 /p p 　　http://science.sciencemag.org/content/early/2015/08/19/science.aac8159 /p p 　　http://science.sciencemag.org/content/early/2015/08/19/science.aac7629 /p p 　　http://science.sciencemag.org/content/early/2016/07/20/science.aag0291 /p p 　　http://science.sciencemag.org/content/early/2016/07/20/science.aag2235 /p p 　　http://science.sciencemag.org/content/early/2016/12/14/science.aak9979.full /p p 　　http://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(17)30954-6 /p p 　　http://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(17)31264-3 /p

聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone)，简称PVP，是一种非离子型高分子化合物，是N-乙烯基酰胺类聚合物中独具特色的精细化学品。已发展成为非离子、阳离子、阴离子3大类，工业级、医药级、食品级3种规格，相对分子质量从数千至一百万以上的均聚物、共聚物和交联聚合物系列产品，并以其独特的性能获得广泛应用。PVP（聚乙烯吡咯烷酮）材料作为一种合成水溶性高分子化合物，具有水溶性高分子化合物的一般性质，胶体保护作用、成膜性、粘结性、吸湿性、增溶或凝聚作用，其受到人们重视的独特性质是其优异的溶解性能及生理相容性。在合成高分子中像PVP（聚乙烯吡咯万通）材料这样既溶于水，又溶于大部分有机溶剂、毒性很低、生理相溶性好的并不多见，特别是在医药、食品、化妆品这些与人们健康密切相关的领域中，随着其原料丁内酯价格的降低，展示出发展的良好前景。PVP（聚乙烯吡咯烷酮）材料按其平均分子量大小分为四级，习惯上常以K值表示，不同的K值分别代表相应PVP（聚乙烯吡咯烷酮）材料的平均分子量范围。K值实际上是与PVP水溶液的相对粘度有关的特征值，而粘度又是与高聚物分子量有关的物理量，因此可以用K值来表征PVP的平均分子量。通常K值越大，其粘度越大，粘接性越强。在PVP（聚乙烯吡咯烷酮）材料的生产和研发中，K值通常使用乌氏毛细管法进行测量，乌氏毛细管法实验操作简单，数据重复性好，在大多数高分子材料研发及相关质量控制中都起到关键作用，尤其是ZVISCO自动乌式粘度仪因其自动化程度高，节省人力的同时进一步提高了实验数据的可靠性。以IV2000系列全自动乌式黏度计、MSB系列多位溶样块、ZPQ智能配液器一整套黏度测试设备为例： 实验流程：1. 智能配液过程使用ZPQ智能配液器进行配液，点击配液功能后，直接输入浓度和质量（可通过连接天平直接获取），可直接计算出所需要的目标体积进行移液并且精度可达0.1%。可避免因手动配液方法导致的精度差、效率低及数据误差等问题。ZPQ智能配液器还具有密度计算功能，移取液体体积后，输入质量（可与天平通讯，直接获取），即可自动计算出密度值。2. 溶样过程MSB系列多位溶样块，采用金属浴的方式进行加热溶样并具有自动搅拌功能，同时可容纳15个样品。溶样效率快、转速可调、溶样时间可调、溶样温度可调、溶样温度可达180℃。3. 测试过程IV2000系列全自动乌式黏度计可实现自动连续测量，全程无需人员看管。并且采用的智能红外光电传感器，保证测量时间的精度可到毫秒级，可有效确保实验数据的精度，避免人工实验导致误差。4. 测试结果：IV2000系列全自动乌式黏度计连接电脑端，得出结果可在计算机上直接显示，并有数据储存、多样化粘度分析报表等多种功能。

近日，北京大学未来技术学院分子医学研究所研员陈雷课题组发现了钠漏通道NALCN-FAM155A-UNC79-UNC80复合物的冷冻电镜结构及UNC79-UNC80调节NALCN-FAM155A的机制。这一研究于5月12日发表在《自然-通讯》上。　　神经细胞的静息膜电位（Resting Membrane Potential, RMP）影响着神经细胞的可兴奋性，对于维持神经细胞正常的生理功能至关重要。钠漏通道NALCN（Sodium Leak Channel, Nonselective）介导了神经细胞的钠漏电流，能使静息膜电位更加去极化，从而提高神经细胞的可兴奋性。　　NALCN在哺乳动物中高度保守，与电压门控钙离子通道（CaV）和电压门控钠离子通道（NaV）同源性较高。且参与了诸多与神经系统相关的重要的生物学过程，包括呼吸节律的调节、痛觉感知、生物钟的调节和快速动眼睡眠等。　　“在人群中，NALCN的单点突变会引起多种严重的神经发育遗传疾病，包括精神运动发育迟缓和具有特征面相的小儿肌张力低下症及四肢和面部先天性挛缩、肌张力低下和发育迟缓症等。尽管NALCN通道有着如此重要的功能，但其工作机制仍不清楚。”陈雷告诉《中国科学报》。　　在2020年，陈雷研究组曾解析NALCN-FAM155A亚复合体的高分辨率结构，阐明了NALCN的钠离子选择性、胞外钙离子阻塞和电压调节特性的结构基础，发现了在NALCN通道中独有的位于II-III linker上的CIH螺旋可以结合在其胞内结构域上。但是UNC79和UNC80的结构以及它们是如何激活NALCN的并不清楚。　　先前的研究表明，UNC79和UNC80容易与NALCN-FAM155A亚复合体发生解离。在本项研究中，作者们在NALCN的C末端融合了GFP，UNC80的N末端融合了与GFP高亲和力结合的纳米抗体以稳定UNC79/80与NALCN间的相互作用。　　经过同源蛋白筛选等步骤，研究人员确定以大鼠NALCN和小鼠FAM155A, UNC79和UNC80亚基组成的复合体为研究对象，并在克服了样品制备、数据处理等困难后，通过单颗粒冷冻电镜技术获得了整体分辨率为3.2埃的四元复合物的电子密度，并搭建了原子模型。　　结构显示，UNC79和UNC80均由富含螺旋的结构组成，这些螺旋进一步的组装成HEAT重复或ARM重复等超螺旋结构。UNC79的N端与UNC80的C端、UNC79与UNC80的中间铰链区以及UNC79的C端与UNC80的N端均存在着紧密的相互作用，形成钳子状的复合体，整体形状类似于无穷号“∞”。 进一步的研究发现，NALCN主要通过胞内loop区与UNC79-UNC80发生相互作用的：NALCN胞质侧的I-II linker中的一段β-发卡结构（UNIM-A）与UNC79发生相互作用，II-III linker中的一段loop-螺旋结构（UNIM-B）以及一段L型螺旋结构（UNIM-C）与UNC80发生相互作用。作者们将NALCN与UNC79/80发生相互作用的基序命名为UNC Interacting Motif (UNIM)。　　陈雷介绍，该项研究还发现，UNC79, UNC80和FAM155A三个附属亚基对于NALCN能够正确的转运到细胞膜上是必不可少的。“这有可能是因为这些互作使UNC79/80遮挡了NALCN胞质侧loop上的内质网滞留信号，从而促进NALCN上膜。另外，这些互作也释放了CIH对NALCN的自抑制，使其激活。这为深入理解NALCN复合体的工作机制奠定了基础。”他说。

三乙胺作为常规溶剂应用于不同领域，对其残留的检测也有相关规定，药典规定如下：胺类物质在检测时比较容易出现拖尾的现象，今天就给大家看一下不同极性的色谱柱中相同浓度的三乙胺的测试情况：色谱条件谱图和数据结论月旭科技胺改性柱WM 5-Amine 30m*0.32mm*1.0μm 检测三乙胺有很好的峰形和柱效。由于这一类物质在系统中也可能有残留，故仪器各部件也进行对应的清洗更换。

p & nbsp & nbsp & nbsp /p p style=" text-align:center" img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201807/insimg/859a4489-caf9-42a5-8abc-7feca5114b48.jpg" title=" 20180720.jpg" / /p p style=" text-align: center " & nbsp & nbsp & nbsp 图 & nbsp ORC通过弯曲DNA来进一步加载DNA复制解旋酶MCM2-7的过程模式图 /p p & nbsp & nbsp 在国家自然科学基金项目(项目批准号：31761163004、31725007、31630087)等资助下，北京大学生命科学学院高宁教授课题组与香港科技大学戴碧瓘教授课题组合作，解析了酿酒酵母ORC结合DNA复制起始位点3-Å 分辨率的冷冻电镜结构。研究成果以 “Structure of the Origin Recognition Complex Bound to DNA Replication Origin”(结合有复制起点DNA的起点识别复合物结构)为题，于2018年7月4日以长文(Article)形式在Nature(《自然》)上发表。北京大学高宁教授和香港科技大学戴碧瓘教授、翟元樑博士为共同通讯作者。高宁课题组博士后李宁宁、博士生程稼萱以及戴碧瓘组博士后林伟熙、翟元樑为共同第一作者。 /p p & nbsp & nbsp DNA复制起始在真核生物细胞中受到严格而精密的调控。DNA复制启动因子(ORC，Origin Recognition Complex)首先结合到DNA复制起点，以加载DNA复制解旋酶MCM2-7复合物到DNA上，随后MCM2-7被激活，DNA双链被解螺旋，从而启动DNA复制。所有真核生物都是利用由6个亚基组成的ORC来标记DNA复制起始的位点，在维持基因组稳定性过程中的重要作用，其功能缺失突变与肿瘤的发生发展也密切相关。 /p p & nbsp & nbsp 虽然在不同的真核生物中，ORC的蛋白质序列高度保守，但是ORC对DNA复制起点序列的选择性在不同物种间差别很大。酿酒酵母的ORC可以识别特异的DNA复制起点，而人源细胞ORC结合的DNA序列却没有序列特异性，主要依赖染色体结构识别复制起点。而由于一直缺少ORC结合DNA状态的高分辨结构，ORC序列识别差异背后的分子机制长期以来难以解释。 /p p & nbsp & nbsp 高宁研究员课题组解析的3-Å 分辨率ORC-ARS305 DNA复合物结构发现，ARS305包含一段ARS高度保守序列(ARS Consensus Sequence, ACS)和一段B1元件序列，长度为72 bp。在这个结构中，ORC的六个亚基通过与磷酸骨架的非特异性以及与碱基的特异性相互作用环绕DNA，并在ACS和B1位点使DNA发生弯曲。该结构的一个关键特征是Orc1的保守碱性氨基酸区域(Orc1-BP，basic patch)深深地插入ACS的小沟中进行序列特异的碱基识别。另外，酵母特有的具有物种特异性的位于Orc4 Wing Helix结构域(WHD)中的Helix Insertion(Orc4-IH)嵌入ACS的大沟中，与相应的碱基形成疏水相互作用。更重要的是，在ACS区域形成的这些碱基特异的相互作用的碱基都非常保守。此外，在B1区域中，也有类似的来自Orc2和Orc5的碱性氨基酸区域插入到大沟和小沟中，与碱基相互作用，并使DNA弯曲。因此，酿酒酵母ORC高度序列特异性主要是通过ORC亚基的大沟、小沟插入基序与ACS保守碱基之间的特异性相互作用实现的。序列比对分析显示，所有真核生物Orc1的N端都具有类似酿酒酵母的Orc1-BP 然而Orc4-IH却只在酿酒酵母中存在。这些发现，很大程度上解释了不同物种ORC识别起始DNA特异性差异背后的原因。 /p p & nbsp & nbsp 此高分辨率结构不仅为理解酵母ORC如何识别和结合序列特异性的DNA复制起点提供了分子基础，同时也从分子机制角度阐明了ORC如何通过弯曲DNA来进一步加载DNA复制解旋酶MCM2-7的过程。 /p

研究背景RAF激酶家族是 RAS-RAF-MEK-ERK 信号级联（MAPK信号）的核心组成部分，可传导细胞增殖、分化等信号。RAF在细胞质中保持自我抑制状态，并通过活化的RAS募集到质膜，被激活后进行信号传递。该信号通路异常通常会导致癌症发生。尽管对KRAS/RAF识别有比较详细的了解，但这种相互作用如何导致RAF激活仍不清楚。研究中涉及到不同激活状态的RAF复合物和RAS结合，互作体系中将含有到3个及以上的分子，传统的方法很难获得准确互作结果。这次我们带来的这篇文献讲述美国丹娜-法伯癌症研究所的工作人员使用MST技术来解析RAF蛋白激活和与RAS互作的关系。https://doi.org/10.1038/s41467-023-40299-6IF: 16.6 Q1研究内容先前对KRAS与RAF的结构研究主要集中在RAF的两个结构域：富含半胱氨酸结构域CRD和RAS结合结构域RBD。为了更好的了解二者的结合以及RAF的激活，作者分析了在MEK1和14-33二聚体的自抑制状态下，KRAS与完整BRAF结合的冷冻电镜结构，并使用MST技术检测不同状态RAF与KRAS亲和力。综合其他实验发现，KRAS结合不足以激活BRAF，说明了RAS结合和激活RAF是可分离的，并提出小分子抑制剂的新思路。研究结果为了探究RBD对KRAS结合的可及性，作者使用MST技术检测了不同结构域的RAF与KRAS亲和力。单独的RBD结构域的亲和力最强（26nM）,表明RBD结构域是RAF和KRAS结合的主要区域。此外，通过MST技术检测了RAS蛋白与自抑制（Autoinhibited）和活性状态（Active dimmer）下全长BRAF的亲和力。结果显明，二者亲和力相似（126nM/108nM），也就是RAF在自抑制状态下，RBD参与结合KRAS没有任何空间障碍。在获得自抑制或活性状态时，需将RAF蛋白与MEK或者14-3-3二聚体形成复合物，再检测与KRAS互作。MST技术无需固定样品，避免固定过程对复合物的影响，并且在溶液条件下检测，保证互作分子达到结合解离平衡状态，从而获得更加准确的Kd值。图：MST检测KRAS和BRAF片段或者复合体的亲和力技术优势MST技术是在溶液中进行的检测，无需固定操作，能够使靶标蛋白或者复合物保持稳定状态，在涉及到复合物或者多元互作时，可获得更加准确的亲和力结果。

中国科学院上海药物研究所研究员徐华强团队与山东大学教授孙金鹏团队、浙江大学教授张岩团队等首次解析了糖皮质激素与其膜受体GPR97和Go蛋白复合物的冷冻电镜结构，这也是国际上首次解析的黏附类GPCR与配体和G蛋白复合物的高分辨率结构。相关研究成果以Structures of glucocorticoid-bound adhesion receptor GPR97-Go complex为题，于2021年1月6日在线发表在Nature上。　　黏附类G蛋白偶联受体（Adhesion G protein-coupled receptors, aGPCRs）是GPCR超家族成员之一，在生物体一些重要的生理过程中发挥关键分子开关的作用，如脑的发育、水盐调节、炎症以及细胞命运决定等。与GPCR超家族其他成员相比，aGPCRs除了具有经典的7次跨膜核心（7TM）外，还具有较长的胞外区域，组成了拥有不同功能的结构域。目前普遍认为aGPCRs可被结合胞外的基质蛋白或可溶性小分子激活，然而，学界尚不清楚小分子配体是否可以直接结合7TM并激活受体。　　糖皮质激素对机体的发育、生长、代谢及免疫等功能发挥重要的调节作用，是机体应激反应最重要的调节激素和临床上使用最广泛的抗炎及免疫抑制剂之一。经典理论认为，糖皮质激素通过与糖皮质激素核受体结合，并穿过核孔，在细胞核内发挥调控相关基因表达的作用。该作用方式通常需要较长的反应时间，被称为基因组机制。徐华强课题组分别在2002年和2014年解析了糖皮质激素核受体与地塞米松（Cell, 110: 93-105）和内源性糖皮质激素——氢化可的松（Cell Research, 24: 713–726）的晶体结构，揭示了糖皮质激素识别与功能调控其核受体的机制，推动了糖皮质激素受体靶向药物的开发。此外，糖皮质激素被发现能够快速引起细胞和机体的变化，这提示生物体内可能存在糖皮质激素的膜受体，其能够介导糖皮质激素的快速反应。研究发现，糖皮质激素的快速反应与G蛋白有密切关系，Gi的抑制剂PTX能够抑制糖皮质激素的快速作用，并据此推测GPCR是糖皮质激素的潜在膜受体。孙金鹏和山东大学教授易凡团队等对GPR97进行了受体生理学和内源性配体发现等工作，发现包括糖皮质激素类的氢化可的松、可的松以及11-脱氧皮质醇等在内的内源性类固醇激素均能够激活GPR97，其中，地塞米松具有更强的GPR97激活能力，并最终确认Go是GPR97激活后偶联的G蛋白通路。　　在前期工作基础上，合作团队采用单颗粒冷冻电镜技术，分别对外源配体倍氯米松（BCM）以及内源性配体氢化可的松（cortisol）激活GPR97后形成的复合物进行了结构解析，最终分别获得了两个配体激活态的GPR97受体与Go蛋白的复合物结构，分辨率分别为3.1埃和2.9埃（图1a和1b）。　　与其他GPCR亚家族成员相比，GPR97的7TM呈现独特的空间分布，其螺旋展现出与其他受体不同的长度。根据传统理论，aGPCR特有的胞外GAIN结构域和7TM在激活GPCR的过程中作为整体发挥其核心功能，然而，研究人员在结构中首次发现糖皮质激素结合在GPR97 7TM核心中的一个椭圆形正构结合口袋（图1c）；此外，GPR97还展现出不同于其他A类GPCR成员的独特激活机制。GPR97序列中不含有保守的PIF、DRY和NPxxY等motif，其首先通过toggle switch W6.53识别配体并被激活。激活的受体借助首次发现的upper Quaternary core（UQC）将受体TM3-TM5-TM6捆绑在一起，继而通过HLY motif介导与Go蛋白的结合。受体7TM组成较大的胞内侧G蛋白结合口袋，3个胞内环均参与受体与G蛋白的相互作用，胞内环与受体的组成性激活密切相关；该研究中，研究人员还首次阐述了G蛋白的棕榈酰化修饰在其偶联GPCR中的关键作用。研究首次发现Gαo的α5螺旋C351位点被棕榈酰化修饰（图2），并进一步验证了该修饰在Go与GPR97的偶联中的独特作用。　　综上，合作团队首次发现了糖皮质激素的高亲和力膜受体，并通过单颗粒冷冻电镜技术，解析了黏附类GPCR家族中GPR97在糖皮质激素的激活作用下与Go蛋白复合物的结构，从而在近原子分辨率上揭示了糖皮质激素识别并激活膜GPR97，以及受体偶联Go蛋白的分子机制。该成果将对糖皮质激素膜受体功能研究和黏附类GPCR的激活机制理解发挥重要的示范及推动作用。　　上海药物所为该研究的第一完成单位。上海药物所与山东大学基础医学院联合培养博士生平玉奇，浙江大学基础医学院博士后毛春友，山东大学基础医学院副教授肖鹏、硕士研究生赵儒嘉，上海药物研究所研究员蒋轶为论文的共同第一作者；孙金鹏、张岩、徐华强为论文的共同通讯作者；易凡和山东大学教授于晓为论文的共同作者。研究工作得到国家基金委、科技部、上海市科委等单位的支持。　　论文链接图1.GPR97的冷冻电镜结构图2.Go棕榈酰化修饰

血红蛋白(Hb)是红细胞中的一种关键蛋白质，负责氧气的运输。它由α和β亚基组成，形成四聚体结构，通过氧合(relaxed)和脱氧(tense)状态之间的变构转变来实现氧气的运输。Hb作为一个重要的模型蛋白，广泛应用于蛋白质基础特性的研究以及包括质谱技术在内的分析化学方法的开发。研究中使用的Hb样品通常从化学公司购买(商业Hb)或从哺乳动物血液中新鲜提取(血液Hb)，尽管理论上商业Hb和血液Hb都应该反映血红蛋白的天然活性和三维构象，但先前的电喷雾离子化质谱(ESI-MS)分析显示，这两种Hb来源的性质存在差异，这可能与商业Hb在制备过程中的变性有关。迄今为止，商业Hb和血液Hb之间的结构差异仅使用Native ESI-MS进行过研究。考虑到Native MS不同纯化方法(缓冲液置换、脱盐)对样品的影响，本文尝试使用氢/氘交换质谱(HDX-MS)对血液Hb和商业Hb中的血红蛋白复合物进行比较研究。与Native ESI-MS相比，HDX-MS对不挥发性盐的耐受性要高得多，这主要是由于肽段的脱溶剂效率高于完整蛋白质。在本研究中，作者直接对商业Hb和血液Hb进行了HDX-MS分析，得到的HDX-MS结果与Native ESI-MS数据非常吻合，证实商业Hb已广泛变性形成二聚体物质。对于Native ESI-MS，作者认为缓冲液置换方法对于检测结果具有一定的影响。图1和图2分别展示了血液Hb和商业Hb样品在经过不同次数的缓冲液置换后得到的Native ESI-MS谱图。由图1可见，血液Hb在经过1-5次缓冲液置换后，其质谱图谱从主峰为单体型信号逐渐转变为由二聚体和四聚体信号峰主导，表明缓冲液置换次数对样品结构的完整性有显著影响。图2表明商业Hb在0-4次缓冲液置换后，其质谱图谱从主峰为单体型信号逐渐转变为由二聚体信号主导，最终在四次置换后显示出二聚体为基峰，表明商业Hb在多次置换后更倾向于形成二聚体结构。图1.缓冲液置换(A)1、(B) 2、(C) 4和(D)5次后获得的血液Hb的ESI质谱图。红色符号αh, βa、D、Q分别代表单体全α亚基、单体apo-β亚基、二聚体αhβh和四聚体(αhβh)2离子。标有星号(*)的信号对应电流噪声。图2.缓冲液置换(A)0、(B) 1、(C) 2和(D)4次后获得的商业Hb的ESI质谱图。红色符号αh, βaox、D、D-h，(D-h)ox，Q代表单体全α亚基、氧化单体apo-β亚基、二聚体αhβh、二聚体αhβa、 氧化二聚体αhβaox和四聚体(αhβh)2离子。B和D的插图分别对应β的扩展峰βaox和(D-h)ox。单氧化、二氧化和三氧化物质表示为βaox/(D-h)ox+O, βaox/(D-h)ox+2O 和βaox/(D-h)ox+3O。标有星号(*)的信号对应电流噪声。由于Native ESI-MS分析的可靠性在很大程度上依赖于样品处理方法，因此有必要开发一种互补方法来分析高阶蛋白质复合物的完整性。作者采用HDX-MS来查看是否可以获得血液Hb和商业Hb样品的一致结构信息。图3展示了血液Hb和商业Hb的HDX-MS速率曲线。这些曲线显示了不同时间点上肽段的氘化水平，揭示了两种样品在结构上的显著差异。血液Hb的肽段氘化水平普遍低于商业Hb，特别是在α亚基的33-46及130-141段和β亚基的33-41及130-146段，这表明新鲜血红蛋白在这些区域的溶剂可及性较低，结构更稳定。相反，商业Hb在这些区域显示出更高的氘化水平，暗示其结构可能已经发生了部分解离，增加了溶剂可及性。 图3.血液Hb(绿色曲线)和商业Hb(红色曲线)酶切片段的HDX速率曲线。每个数据点报告三次试验的平均值，误差线表示三次试验的标准偏差。为了将HDX结果与Hb的三维结构相关联，将t = 180 min时两个Hb样品之间的氘代水平差异映射到天然氧合血红蛋白晶体结构(PDB：1LFQ)中，如图4所示。在 t = 180 min时，商业 Hb 的氘水平分别α 130-141和β 130-146比血液Hb高18.9%和26.6%。更高的氘吸收量意味着在这两个区域中商业Hb的溶剂可及性更高。α 130-141和β 130-146分别属于α 1α 2(图4A)和β1β2(图4B)界面。这两个链段中溶剂可及性的增加可能是因为天然四聚体(αhβh)2解离成二聚体αhβh亚复合物，这将导致α1α2和β1β2界面相互作用的破坏。这一推论与Native ESI-MS分析结果一致，即商业Hb的质谱基峰是二聚体信号(图2D)，而血液Hb的质谱基峰是四聚体信号(图1D)，进一步验证了商业Hb样品在制备和存储过程中可能经历了结构变化。图4.人氧合血红蛋白(PDB：1LFQ)的晶体结构，包括亚基(A)α1和α2，(B)β1和β2，(C)α1和β2，以及(D)α1和β1。根据t = 180 min时商业Hb和血液Hb之间氘代的百分比差异对结构进行着色。总的来说，本文通过Native ESI-MS和HDX-MS来表征商业Hb和血液Hb之间的差异。发现血液Hb主要保持四聚体结构，而商业Hb则主要表现为二聚体，且在商业Hb中观察到更多的氧化形式。这些发现强调了在进行生物医学研究前验证蛋白质高阶结构完整性的重要性，并展示了两种质谱技术在分析蛋白质结构变化中的互补性。

p 　　金属有机复合物、自组装超分子化合物、短链双链DNA等，在食品、药物、蛋白质分析等领域都具有极其重要的作用，但是由于这些化合物“热不稳定”，一直是质谱检测的难题，进口仪器也无能为力。 /p p 　　近日，由广州禾信仪器股份有限公司独立研制开发的具有完全自主知识产权的金属有机复合物高分辨飞行时间质谱仪MOC-TOFMS悄然上市，快速打破行业的寂静。 /p p style=" text-align: center " img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201712/insimg/58303cb5-664f-4984-992b-09fbe716dd98.jpg" title=" 001.jpg" / /p p span style=" color: rgb(0, 112, 192) " strong 　　工作原理 /strong /span /p p 　　液体样品经过电喷雾离子源电离产生离子，在电场牵引下通过低压分子离子反应器MIR，随后离子在射频四极杆RFQ里进一步碰撞冷却聚焦，再经直流四极杆DCQ及离子光学透镜LENS调制后，由高分辨飞行时间质量分析器进行检测分析。 /p p 　　整套系统采用专利大气压接口，可以同时控制离子束能量分散和离子束与背景气体碰撞能量的大小，是目前全球少数的极柔和离子传输器之一。该技术与垂直引入反射式飞行时间分析器相连，整机性能完全媲美进口冷喷雾电离质谱仪器。 /p p span style=" color: rgb(0, 112, 192) " strong 　　特点与优势 /strong /span /p p 　　1) 柔性大气压接口专利技术，有效传输热不稳定分子离子 /p p 　　2) 三级差分真空系统，极大提高仪器灵敏度 /p p 　　3) 紧凑式“V”型飞行时间质量分析器，最优尺寸分辨比。 /p p span style=" color: rgb(0, 112, 192) " strong 　　应用领域 /strong /span /p p 　　药物研究、生物医学研究、环境与食品安全、功能材料研究、催化机理研究等。 /p p span style=" color: rgb(0, 112, 192) " strong 　　应用案例 /strong /span /p p 　　 span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 分析目的： /span 鉴定金属有机复合物合成产物的分子结构，为合成路线提供数据支撑。 /p p 　 span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 　待测样品1： /span /p p 　　目标化合物分子式：C sub 246 /sub H sub 276 /sub F sub 24 /sub N sub 4 /sub O sub 46 /sub P sub 12 /sub Pt sub 4 /sub /p p 　　目标化合物结构式： /p p style=" text-align: center " img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201712/insimg/fae951cf-2cd5-4de3-80c2-57b1601a2b05.jpg" title=" 002.png" / /p p style=" text-align: center " span style=" color: rgb(0, 112, 192) " & nbsp & nbsp strong 分子离子分子式最大丰度质荷比m/z /strong /span /p p style=" text-align: center " img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201712/insimg/3bf16853-b73c-47ac-85ce-bd489f0f1b31.jpg" title=" 004.png" / 　 /p p span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 　　分析结果： /span /p p style=" text-align: center " img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201712/insimg/9bcb5748-33d3-4a9a-91fa-c6d72cd30981.jpg" title=" 005.png" / /p p 　 span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 　待测样品2： /span /p p 　　目标化合物分子式：(Rh sub 8 /sub Ag sub 2 /sub C sub 120 /sub H sub 132 /sub O sub 16 /sub N sub 8 /sub C sub l8 /sub ) sup 6+ /sup (SO sub 3 /sub CF sub 3 /sub ) sub 6 /sub (C sub 6 /sub H sub 4 /sub Br sub 2 /sub ) /p p 　　目标化合物结构式： /p p style=" text-align: center " img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201712/insimg/95eef5c7-e06a-4f3c-99ec-e6d0b3aabdab.jpg" title=" 003.jpg" / /p p style=" text-align: center " span style=" color: rgb(0, 112, 192) " strong [M-4OTf] sup 4+ /sup 模拟质谱图[M-3OTf] sup 3+ /sup 模拟质谱图 /strong /span /p p style=" text-align: center " img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201712/insimg/b267942d-cacf-4bfb-9b66-8d2dd100bbc8.jpg" title=" 006.jpg" / /p p 　　 span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 分析结果 sup (1) /sup ： /span /p p style=" text-align: center " img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201712/insimg/1df41db8-cc21-4301-9d85-436bb55b0085.jpg" title=" 007.jpg" / /p p 　　注：(1) Wen-Ying Zhang, et al. Facile Separation of Regioisomeric Compounds by a Heteronuclear Organometallic Capsule [J]. J. Am. Chem. Soc., 2016, 138 (33), pp 10700–10707 /p p span style=" color: rgb(0, 112, 192) " strong 　　小结： /strong /span /p p 　　测试结果表明，用MOC-TOFMS对金属有机复合物检测有利于产生高价态准分子离子峰，适合热不稳定的金属有机复合物的精确质量检测。 /p p br/ /p

帕金森疾病（Parkinson’s disease, PD）是第二常见的神经退行性疾病，患者所表现出的运动功能障碍主要由黑质（substantia nigra, SN）中多巴胺能神经元丧失引起。尽管PD致病因素多样，但多项证据表明线粒体功能缺陷在其中的重要性，例如编码维持线粒体质量控制蛋白的PARK7、PARK6和PARK2基因突变能引起早发型PD【1】。多巴胺能神经元对线粒体功能障碍的易感性可部分归因于其高代谢需求，从而引起线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）的持续刺激，然而这种巨大能量的提供是以线粒体氧化损伤增加为代价的。尸检研究表明，PD患者SN中mtDNA完整性的丧失与功能性线粒体复合物I（MCI）的丧失存在相关性。然而，这种MCI获得性损伤究竟是PD疾病进程中的一种副产品还是疾病的驱动因素还不得而知。2021年11月3日，来自美国西北大学Feinberg医学院的D. James Surmeier团队在Nature杂志上发表了一篇题为 Disruption of mitochondrial complex I induces progressive parkinsonism 的文章，这项研究通过选择性破坏小鼠多巴胺能神经元中MCI功能，发现MCI功能障碍足以导致进行性的帕金森病相关运动缺陷，且不同类型的运动功能损伤（精细动作和粗大运动）与不同部位（纹状体和黑质）多巴胺释放的相关性，挑战了长期以来存在的关于该疾病运动症状的观点。为了证明MCI功能障碍是否作为PD的驱动因素，该团队从小鼠多巴胺能神经元中特异性地敲除编码MCI催化核心亚基的Ndufs2基因。cNdufs2-/-小鼠在出生后20天（P20）仍表现出正常的粗大运动行为。但在随后10天中，SN多巴胺能神经元中的线粒体成为ATP的净消费者而非生产者，且线粒体嵴结构发生了明显改变。利用RiboTag方法分离多巴胺能神经元中的mRNA并进行测序发现，cNdufs2-/-小鼠中存在一种类似Warburg效应的代谢重编程，即编码促进糖酵解蛋白的基因上调，而与OXPHOS以及编码糖酵解抑制剂的基因下调。除了触发代谢重编程外，该团队还发现Ndufs2的缺失会导致与轴突生长和运输、突触传导、多巴胺（DA）合成和储存等相关的基因表达发生显着变化。对纹状体组织的液相色谱和质谱分析进一步验证cNdufs2-/-小鼠纹状体DA合成明显下降，此外，有助于驱动起搏的环核苷酸门控阳离子通道电流也明显减少。到P60，与多巴胺能信号相关的轴突蛋白的丢失由背侧纹状体扩大到腹侧纹状体，且cNdufs2-/-小鼠SN多巴胺能神经元胞体树突区域中的酪氨酸羟化酶表达降低至对照组一半左右，且DA释放量下降约75%。与在整个基底神经节中DA迅速耗尽的传统PD模型相比，cNdufs2-/-小鼠的病理分期能够评估DA释放的区域缺陷如何与行为相关联。随着背侧纹状体DA释放在P30左右下降到接近检测阈值，cNdufs2-/-小鼠失去了执行联想学习任务的能力，有趣的是，该任务可以通过P30时的左旋多巴治疗恢复，而P60的治疗则不能恢复。在通过小鼠从前爪去除粘合剂所花费的时间来评估精细运动技能的实验中，cNdufs2-/-小鼠完成任务时间明显延长，同时也表现出较差的旷场探索行为表现。此外，P60的cNdufs2-/-小鼠仅表现出轻微的步态障碍，到了P100才会表现出后肢张开、爪子位置异常和步幅改变等特征。而在P120-150期间，大约有40%的SN多巴胺能神经元丢失。需要注意的是，cNdufs2-/-小鼠在后期才出现粗大运动行为缺陷，这与SN DA而非背侧纹状体 DA释放变化平行。尽管有明确的临床证据表明纹状体DA耗竭对于PD患者的运动迟缓和僵硬是必要的【2】，但其充分性从未得到充分测试，因为传统的PD模型往往会导致整个基底神经节DA的快速耗竭。在此处通过对cNdufs2-/-小鼠的观察表明，背侧纹状体DA释放的丧失足以产生运动学习和精细运动缺陷，但并未达到类似于临床PD的运动症状水平。该团队通过分别向小鼠背侧纹状体或SN中立体定位注射携带AADC（可将左旋多巴转化为DA）的AAV，以及随后对小鼠旷场步态的分析，证明黑质多巴胺释放丧失对于粗大运动缺陷而言是必要因素。总的来说，这项研究不仅证明多巴胺能神经元中MCI功能丧失足以引发进行性的、轴突先行的功能丧失和左旋多巴反应性帕金森病，还证明背侧纹状体的DA耗竭对于联想运动学习和精细动作而言是必要的，但黑质的DA释放缺陷才会引起类似于临床PD患者表现出的粗大运动损伤特征。针对这项研究，来自美国格莱斯顿研究所的Zak Doric和Ken Nakamura在同期杂志上发表观点文章 Principles of Parkinson’s disease disputed by model 。他们指出González-Rodríguez等构建的基于线粒体功能障碍的帕金森疾病小鼠模型代表了目前可用的散发性PD最佳模型之一，它不仅可以研究复合物 I 缺陷在疾病中的作用，还可以提供一个模型来评估治疗策略的潜力。此外，该模型一个显著特征是多巴胺神经元在几个月中进行性退化，且轴突和胞体退化存在延迟，这种延迟便于详细研究两个不同部位多巴胺损伤所带来的影响。另一个相当大的进步是该模型证实纹状体多巴胺释放减少对于运动缺陷来说是必要而不充分的，也就是说，黑质多巴胺在维持粗大运动方面起着至关重要的作用。原文链接：https://doi.org/10.1038/s41586-021-04059-0https://doi.org/10.1038/d41586-021-02955-z

01前言Thermal shift assay（TSA），也被称为差示扫描荧光法（DSF）是表征蛋白热稳定性的常用方法之一，广泛应用于蛋白配体互作表征，突变体、缓冲液、去垢剂筛选等领域。但DSF的实验操作较繁琐，需要根据蛋白的特性及去垢剂兼容性选择合适的染料，优化蛋白和染料的比例，在配制样品时还要考虑染料自带的有机溶剂对蛋白的影响。替代性技术：nanoDSF技术时下被行业深度认可的无标记的TSA验证方法-也称nanoDSF技术，可解决DSF技术的局限性，样品无需加染料就可以直接上机检测了。下面我们一起通过用户的文献案例来进一步了解。02NanoTemper用户应用案例解读检测样品：Cas9，gRNA使用仪器：PR系列蛋白稳定性分析仪涉及技术：nanoDSF技术https://doi.org/10.1016/j.isci.2023.106399CRISPER - Cas9介导的基因编辑能够帮助人们在动物和细胞模型中实现广泛的靶向敲除(KO)或敲入(KI)，例如单点或多点KO、点突变、报告基因KO或KI等。然而，CRISPR-Cas9的切割效果和准确性仍是基因编辑面临的主要挑战，它们特别受到核糖核蛋白复合物 (RNP)的组装配比的影响。2023年3月，法国南特大学的研究人员近期发表了研究成果：Excess of guide RNA reduces knockin efficiency and drastically increases on-target large deletions，作者借助PR系列蛋白稳定性分析仪搭载的nanoDSF技术，一种无需标记和固定化的方法，证明了Cas9和gRNA的等摩尔比是形成RNP复合物的最佳条件。研究结果作者通过CRISPR/Cas9 KI将双等位纯合子GFP hiPSCs转化为BFP表达细胞，通过细胞表型分析证明在Cas9的最佳浓度为0.4 mM时，增加ssODN浓度有助于降低KO率，提高KI率，而增加dgRNA对KO和KI没有影响。0.4 mM的Cas9、等摩尔Cas9/gRNA比例和2 mM的ssODN是在hiPSC中实现高效GFP到BFP转换的最佳选择。 在此之前，有一些研究曾表明过量的gRNA对于靶向切割有帮助，而本文作者的实验结果则与之产生了矛盾。于是作者使用NanoTemper公司的nanoDSF技术建立了一套体外实验方法学，用来评估RNP复合物的形成效率，从而佐证他们的结论。通过nanoDSF这种无标记技术，可在升温过程中检测蛋白中的色氨酸和酪氨酸的自发荧光。随着升温，仪器同步采集在350 nm和330 nm处的最大发射光位移，并自动拟合出蛋白的热展开曲线。NanoDSF能够检测蛋白的构象变化导致的热稳定性差异，并由熔解温度(Tm)来表征蛋白的热稳定性。由于Cas9是一种含有色氨酸和酪氨酸残基的变构酶， 因此利用nanoDSF技术可以简单、直观地检测导致Cas9重排的RNP复合物的形成。 为了确定hiPSC中使用的dgRNA靶向GFP位点(dgRNA GFP)形成RNP复合物的有效性，作者使用恒定浓度的Cas9 (0.75 mM)与一定浓度范围内的dgRNA, 通过nanoDSF检测，作出升温诱导的蛋白变性曲线检测 (图1A)。根据一阶导数，可以确定Cas9单独的Tm(TmCas9 = 43.2C)，以及Cas9/dgRNA摩尔比为1/1至1/5 的Tm：1/1 时TmRNP = 49.6 C、1/2 时TmRNP = 50.0 C、1/3时 TmRNP = 49.9C、1/5 时TmRNP = 49.8 C (图1B)。相比只有Cas9时， Cas9/dgRNA摩尔比为1/1至1/5 时的Tm都有明显增加，但Cas9/dgRNA不同摩尔比之间的Tm并没有显著差异（图1C）。这反映了RNP复合物的形成情况。另外，当Cas9/dgRNA为等摩尔比时，是检测不到游离Cas9的。因此，可以认为Cas9/dgRNA等摩尔比是形成RNP复合物的最优条件。图1作者在大鼠胚胎上使用点突变模型来验证等摩尔Cas9/dgRNA是否能得到最佳的KI率，以及过量的dgRNA是否会影响KI效率。 他们先使用nanoDSF检测大鼠胚胎中Cas9过量、等摩尔Cas9/dgRNA或dgRNA过量这几种情况下，RNP复合物的形成情况(图2A)。在所有条件下，添加dgRNA靶向的环氧化物水解酶2基因(dgRNA rEphx2)，与单独Cas9相比，Tm都显著增加，表明RNP复合物的形成 (图2B)。 在Cas9/dgRNA摩尔比为 5/1和2/1时，可以看到变性曲线中包含了两个热变性峰，分别可表示为TmCas9和TmRNP。与单独Cas9相比(TmCas9 = 43.2℃)， TmCas9对这两种RNP的比例差异不显著(TmCas9 RNP 5/1 = 43.0℃ TmCas9 RNP 2/1 = 43.3℃, p分别= 0.4809和0.9353)，而TmRNP为(TmRNP RNP 5/1 = 48.0℃ TmRNP RNP 2/1 = 48.9℃, p 都= 0.029)。这些结果表明，在两个条件下，RNP复合物已经形成，而游离Cas9仍然存在。当等摩尔比(RNP 1/1)或dgRNA rEphx2过量(RNP 1/2, 1/3和1/5)时，只观察到一个热变性峰(TmRNP RNP 1/1 = 49.7℃ TmRNP RNP 1/2 = 49.9℃ TmRNP RNP 1/3 = 49.8℃ TmRNP RNP 1/5 = 49.7℃)，这些Tm之间差异不显著。此外，与dgRNA rEphx2相比，RNP 1/1比例的TmRNP与RNP 2/1比例的TmRNP显著不同(TmRNP RNP 2/1 = 48.9℃ TmRNP RNP 1/1 = 49.7℃, p = 0.0206)，与单独Cas9也显著不同 (TmCas9 Cas9 = 43.2℃ TmRNP RNP 1/1 = 49.7C, p03关于PR系列蛋白稳定性分析仪德国NanoTemper公司自2014年推出PR系列蛋白稳定性分析仪，以nanoDSF技术为核心，通过检测蛋白内源荧光，无需标记即可检测蛋白Tm值，快速精确评估蛋白在不同条件下的热稳定性变化。2020年NanoTemper推出新一代PR Panta仪器，并于2022年整合四大技术模块nanoDSF/Backreflection/DLS/SLS，可实时同步评估蛋白热稳定性，胶体稳定性，聚集体与粒径等信息，为科研人员在蛋白质量控制、复合物分析、化合物筛选、制剂优化等方面提供强大助力。今年年初，公司凭借自身不断创新的科学技术，推出新品型号：PR Panta + 机械臂自动上样器，这款新品拥有独立且包罗万象的系统，包含机械臂、外框架、计算机和监视器。可装载多达4个384微孔板，用于检测所有蛋白质候选分子热变性、胶体稳定性和化学变性的全自动操作。可针对高通量或配方筛选实验场景，无需手动即可完成多达1536个样品的检测。PR系列产品

p 　　日前，上海市环境保护局和上海市质量技术监督局联合发布《DB31/199-2018 污水综合排放标准》。 /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201812/uepic/9af60654-9254-4d87-b33f-9ade95f712b8.jpg" title=" 上海标准.png" alt=" 上海标准.png" / /p p 　　与2009年上海地标相比，此次标准调整了污染物控制项目 增加了总锑、总铊、总铁、二氯甲烷、硝基酚、硫氰酸盐、多氯联苯、滴滴涕、六六六、壬基酚、六氯代-1,3-环戊二烯、苯胺和多环芳烃、苯系物总量共14项污染物控制项目 取消元素磷污染物控制项目 将现行标准的可溶性钡、五氯酚及五氯酚钠(以五氯酚计)、硝基苯类(以硝基苯计)、总大肠菌群(仅针对涉及生物安全性的废水)等4项指标分别调整为总钡、五氯酚及五氯酚盐(以五氯酚计)、硝基苯类、粪大肠菌群 将现行标准的二甲苯总量调整为1,2-二甲苯、1,3-二甲苯、和1,4-二甲苯3个项目 /p p 　　与现行国家标准《GB 8978-1996 污水综合排放标准》相比，第一类污染物增加了总钒、总钴和总锡 第二类污染物增加了溶解性总固体、总磷、总氮、硫化物、总铁、总钡、总锑、总铊、总硼、甲醇、二氯甲烷、1，2-二氯乙烷、苯系物总量、异丙苯、苯乙烯、三氯苯、苯胺、硝基酚、壬基酚、多环芳烃、乙腈、肼、水合肼、一甲基肼、偏二甲基肼、吡啶、二硫化碳、丁基黄原酸、丙烯醛、氯化物、二氧化氯、氯乙烯、三乙胺、二乙烯三胺、硫氰酸盐、鱼类急性毒性、多氯联苯、滴滴涕、六六六、六氯代-1，3-环戊二烯。 /p p 　　其中，值得注意的是，壬基酚和六氯代-1，3-环戊二烯两个污染物还没有相应的监测标准，未来是工作重点。 /p p 　　壬基酚是一种重要的精细化工原料和中间体，主要用于生产非离子表面活性剂，润滑油添加剂等，但进入环境中后，是一种内分泌干扰物，有“精子杀手”之称。 /p p 标准全文： img src=" /admincms/ueditor1/dialogs/attachment/fileTypeImages/icon_pdf.gif" style=" vertical-align: middle margin-right: 2px " / a href=" https://img1.17img.cn/17img/files/201812/attachment/ebefe05b-3d39-402d-8411-88d586c0d4c0.pdf" title=" 上海市地方排放标准.pdf" style=" font-size: 12px color: rgb(0, 102, 204) " DB31/199-2018 污水综合排放标准.pdf /a /p

编者注：傅若农教授生于1930年，1953年毕业于北京大学化学系，而后一直在北京理工大学(原北京工业学院)从事教学与科研工作。1958年，傅若农教授开始带领学生初步进入吸附柱色谱和气相色谱的探索 1966到1976年文化大革命的后期，傅若农教授在干校劳动的间隙，系统地阅读并翻译了两本气相色谱启蒙书，从此进入其后半生一直从事的事业&mdash &mdash 色谱研究。傅若农教授是我国老一辈色谱研究专家，见证了我国气相色谱研究的发展，为我国培养了众多色谱研究人才。此次仪器信息网特邀傅若农教授亲述气相色谱技术发展历史及趋势，以飨读者。 　　第一讲：傅若农讲述气相色谱技术发展历史及趋势 　　第二讲：傅若农：从三家公司GC产品更迭看气相技术发展 　　第三讲：傅若农：从国产气相产品看国内气相发展脉络及现状 　　气相色谱(GC)技术至今已有52年的历史了，其现在已经是相当成熟的技术。今天气相色谱仪已经相当普及，就像分析天平一样，在许多实验室都可以见到。而对于分析人员而言，气相色谱仪的操作也很简单，样品处理完以后装到进样瓶中，之后往自动进样器上一放就自动进行分析了。而这一切的实现其实是50年来无数分析人员及厂家设计制造人员的研究，借助现代科学技术集成起来的成就。但是气相色谱仪和气相色谱方法具有相当的科学内涵，值得从事气相色谱分析人员深入地去学习和领会，才能使你在长期气相色谱分析当中应付自如、游刃有余。这里我们先从气相色谱的核心气相色谱固定液谈起，本章所谈只限于液体固定相，即在工作温度下固定相以液态存在。 　　首先，我讲一个我自己经历的故事。1974年我们买了一台北京分析仪器厂的SP-2305 E型气相色谱仪，为了测试仪器的性能，我们就用仪器附带的、厂家事先配制好的固定液 DNP(邻苯二甲酸二壬酯)做测试，但是厂家没有在固定液的包装上注明它的最高使用温度(低于130 ℃)，我们在设定温度时设定为130 ℃，结果由于固定液流失把热导池污染了，不能正常使用，没有办法只好到北京分析仪器厂又更换了热丝。后来查了文献才知道这种固定液在130 ℃就会流失。因此我意识到做气相色谱必须要了解、熟悉气相色谱固定液的性能，当然了解气相色谱固定液的性能的重要性还远不止于此，因为气相色谱固定液的性能是影响色谱分离的主要因素。 　　一.早期使用的气相色谱固定液 　　气相色谱发明人马丁(Martin)1950 年使用硅藻土(Celite)做载体，用硅油(DC 550)做固定液，用气体做流动相, 分离氨、脂肪胺和吡啶同系物。 DC 550(含25%苯基的甲基聚硅氧烷)原为工业用的耐高温硅油。 　　马丁使用硅油(聚硅氧烷)作气相色谱固定液以后，开辟了聚硅氧烷作气相色谱固定液的先河。但是聚硅氧烷类固定液在当时还没有占主导地位,人们更多地使用各种低分子化合物。如1956年有人提出了&ldquo 标准&rdquo 固定液：正十六烷、角鲨烷、苄基联苯、邻苯二甲酸二壬酯、二甲基甲酰胺、二缩甘油。(J.Chromatogr.Sci. 1973,11(4):216)。 　　后来也使用了一些高聚物用作气相色谱固定液,如聚乙二醇类，各种聚酯类，以及各类从石油提炼出来的润滑脂阿皮松-L 、阿皮松-M等。当时使用的一些聚硅氧类固定液也都是工业品,如 DC-550 、DC-710 、QF -1、 DC-11 、SE-30(聚二甲基硅氧烷)，聚二甲基硅氧烷之后成为非常广泛使用的GC固定液 。 　　1964年又有人提出 58 个常用固定液，使用频率最高的十个固定液是阿皮松-L、SE-30、邻苯二甲酸二壬酯、角鲨烷、PEG 20M、己二酸乙二醇聚酯、PEG 400、DC 550、磷酸三甲酚酯、PEG 1500。 　　为了适应各种各样混合物的分离，固定液如雨后春笋地增长，在1972年出版的 &ldquo Gas Chromatographic Data Compilation DS 25 A S-1&rdquo 中收集了700多种气相色谱固定液。 　　在气相色谱以填充柱为主的时代,由于填充柱的柱效有限,为了能分离各类混合物,人们研究发展了上千种固定液,但是固定液量太多了又带来新的麻烦。为此,许多人致力于固定液的分类和精选最常用的固定液,最有影响的是Rohrschneider和McReynolds的固定液表，下表1是McReynolds固定液表的一部分，它发表于1970年的色谱科学杂志上(J chromatogr Sci 1970,8:685-691)。 表1 McReynolds 固定液表 　　说明:X' , Y' ,Z' ,U' ,S' 分别代表苯、正丁醇、2-戊酮、1-硝基丙烷、吡啶 　　McReynolds用10种典型化合物，苯、正丁醇、2-戊酮、1-硝基丙烷、吡啶、2-甲基2-戊醇、碘丁烷、2-辛炔、二氧六环和顺八氢化茚，在120℃柱温下测定了226种固定液上的保留指数差(△I)，以前五种化合物△I之和的大小来表示固定液的极性。 　　McReynolds 工作的目的是为了解各种固定液的性能，选择时可以寻找性能类似的品种，减少测试比较固定液的数量。 　　后来Hawkes推荐的较常用的气液色谱固定液有下列一些： 　　(1) 聚二甲基硅氧烷 (OV-101, OV-1, SE-30 ) 　　(2) SE-54 ( 含5%苯基和1%乙烯基的聚甲基硅氧烷) 　　(3) OV-7 ( 含20%苯基的聚甲基硅氧烷) 　　(4) OV-1701 ( 含7%苯基和7% 氰丙基的聚甲基硅氧烷) 　　(5) OV-17 [ 含50% 苯基的聚甲基硅氧烷(油) ] 　　(6) OV-17(gum)[ 含50%苯基, 2%乙烯基的聚甲基硅硅氧烷(橡胶) ] 　　(7) OV-25 [ 含75%苯基的聚甲基硅氧烷(油)] 　　(8) OV-210 [( 含50% 三氟丙基的甲基硅氧烷(油)) 　　(9) OV-215 [含50%苯基, 2%乙烯基的聚甲基硅氧烷(橡胶)] 　　(10) UCON HB 5100 ( 约50/50的聚乙/丙基醚 ) 　　(11) OV-225 ( 含25% 氰丙基﹑25% 苯基的聚甲基硅油或硅橡胶 ) 　　(12) Superox-4 ( 高分子量的聚乙二醇, 使用温度可到300℃ ) 　　(13) Superox-0.1 ( 聚乙二醇,使用温度可到 280℃ ) 　　(14) Superox 20M ( 聚乙二醇, 使用温度可到 300℃) 　　(15) PEG-20M ( 聚乙二醇, 使用温度可到 300℃) 　　(16) Silar 5CP ( 含 50% 氰丙基﹑50% 苯基的聚甲基硅油 ) 　　(17) SP-2340 (含75% 氰丙基的聚甲基硅油 ) 　　(18) Silar 10 CP ( 含100% 氰丙基的硅油 ) 　　(19) OV-275 ( 含 100% 氰乙基的硅油 )。 　　他还推荐了最常用的 6 种气相色谱固定液如下表2。 表2 最常用的6种气相色谱固定液 　　自从1979年弹性石英毛细管柱问世之后，毛细管气相色谱得到了迅速的发展。以毛细管柱代替填充柱的趋势日益明显，特别是1983年大内径厚液膜毛细管柱的发展和应用。而优秀的气-固色谱毛细管柱&mdash &mdash PLOT柱的出现把填充柱仅剩余的一点优势也给抵消了。 　　有人认为毛细管柱具有非凡的高柱效，对固定液的选择性就降低了要求，只要有三支毛细管柱(聚二甲基硅氧烷、聚乙二醇20M、氰基聚二甲基硅氧烷)就可以应付80%的分析任务。但是要解决高沸点复杂混合物、各种沸点相近的异构体，性质极为相近的光学异构体，必须要有新的、热稳定性极好的、重复性好的、有不同选择性的固定液，为此多年来研究人员合成了许名适用于毛细管柱的固定液。 　　二、硅氧烷是现时气相色谱固定液的主体 　　尽管使用和研究过的气相色谱固定液有千余种，以适应填充柱低柱效和高选择性的要求。但是对现代毛细管色谱柱而言，这些固定液合用者很少。其中尚可在毛细管色谱柱中使用的除去聚乙二醇外几乎都是聚硅氧烷类，因而在新的固定液合成中也还限于以聚硅氧烷作为骨架，同时引入不同的选择性基团。这是因为聚硅氧烷类固定液具有以下的优点：(1)热稳定性好 (2)成膜性能好 (3)玻璃化温度低，使用温度范围宽 ( 4)如在分子中有一定量的乙烯基则易于交联 (5)扩散性能好，传质阻力小，易获高柱效 (6)可在聚硅氧烷侧链上引入各种有机分子片段，调节选择性。从上世纪70年代至今，以聚硅氧烷类固定液为基础发展了一系列优秀的气相色谱固定液。 　　(一)热稳定性好的固定液 　　目前有许多高沸点复杂混合物的分离要使用耐高温的毛细管色谱柱，如石油中碳数高达100的烃类，食品中的甘油三酸酯，环境污染物中六、七环多环芳烃等，均需要热稳定性极好的固定液。过去用的固定液几乎没有能经受370℃高温的。为此近年来出现了一些可在400℃左右使用的毛细管柱固定液。 　　(1)耐高温聚二甲基硅氧烷 　　有人利用涂有聚二甲基硅氧烷的毛细管柱，在390℃下分离碳数高达90的烃类。用程序升温到430℃ ，可使100-110个碳原子的烃类流出色谱柱。 　　前几年VIBI公司使用窄分布的聚二甲基硅氧烷(Unimolecular Low Bleed VB-1),它的特点是纯化预聚体除去低聚物，聚硅氧烷链上有支链,减少交联剂量，使用全部交联原理把端基也纳入,使其交联行成一个网络整体，没有低分子化合物。 　　(2)使用交联的聚硅氧烷固定液提高其热稳定性 　　在毛细管柱进行原位交联(固相化)是提高液膜稳定性的重要途径，也是制备抗溶剂冲洗的必要手段。但是一些苯基含量高的聚甲基硅氧烷，如OV-17、OV-25、以及OV-225难以用引发剂使之交联，但如引入一定量的乙烯基后它们可以交联，所以在研究毛细管色谱用固定液时，往固定液分子中引入乙烯基或使用端羟基聚硅氧烷固定液。 　　(a)引入乙烯基 　　早在80年代初，M.L.Lee研究组和Blomberg研究组就研究把乙烯基引入含苯基和氰丙基的聚硅氧烷的分子中使之易于交联。因为很早人们就知道含有乙烯基的聚硅氧烷很容易被过氧化物或其它引发剂使之交联的。例如在含50%苯基的聚硅氧烷中引入1%的乙烯基，在含70%苯基的聚硅氧烷中引入4%的乙烯基，就可以在加入过氧化物引发剂的情况下较为容易地进行交联。对含有苯基和氰丙基的聚硅氧烷，Markeides等人采用先制备含有乙烯基的预聚体，然后再在柱中进行原位交联。对这类固定液可采用过氧化物、偶氮化合物，甚至臭氧都可以使之引发交联。 　　(b)用端羟基聚硅氧烷固定液交联并和毛细管壁进行键合 　　1983年Verzele提出用端羟基的聚硅氧烷固定液。1985年Blum又进一步研究了非极性和中等极性的聚硅氧烷(以羟基为端基)的固定液，以及毛细管柱的制备工艺问题。1986年Lipsky等人首次把端羟基聚二甲基硅氧烷涂渍在弹性石英毛细管柱上，石英柱的外涂层不用聚酰亚胺，而使用金属铝，端羟基聚二甲基硅氧烷在高温下加热(375-400℃)，形成交联并键合的液膜。这一色谱柱在8-12h内逐渐从350℃升温到425℃。利用这种色谱柱分离原油组分，程序升温可达425&mdash 440℃。 　　(3)利用硅氧烷/硅亚芳基共聚物提高热稳定性 　　在聚硅氧烷中如把主链中的氧原子用亚苯基取代，它的热稳定性就会提高，这类化合物用作气相色谱固定液可以耐高温，其结构如下图1： 图1 硅氧烷/硅亚芳基共聚物结构 　　其热稳定性当R及R为苯基时提高，见下表中的数据。据Buijten等的研究结果，用这类化合物可涂渍出高效毛细管柱，涂渍效率达102%。这种色谱柱可在370 ℃下分离多环芳烃. 下表是硅氧烷/硅亚芳基共聚物在氮中热重分析数据。目前在GC/MS中使用最多的含5%苯基的硅氧烷/硅亚芳基共聚物，硅氧烷/硅亚芳基共聚物的热性能见表3。如DB-5MS色谱柱就是使用这类固定液。 表3 硅氧烷/硅亚芳基共聚物在氮中的热重分析数据 　　(4) 在聚硅氧烷链中引入硼烷提高热稳定性 　　在硅氧烷链中引入十硼烷，可以提高固定液的耐热性，现在网上有信息显示，北京绿百草科技提供信和固定相Dexsil 300 GC，该固定相主要用于药物、三酸甘油酯和醚、高沸点脂肪烃、高沸点烃、甾族化合物、杀虫剂和糖类。 　　Dexsil有三个品种及其结构和极性如下表4： 表4 三个品种Dexsil的结构及极性 　　HT-5 高温固定液就是Dexsil 400 GC 固定液制备的色谱柱，用以进行模拟蒸馏的色谱图2： 图2 DB-HT Sim Dis 色谱柱的模拟蒸馏色谱图 　　色谱柱：DB-HT Sim Dis 5 m x 0.53 mm I.D., 0.15 &mu m 　　载气：氦，18 mL/min, 在 35下测定 　　拄温：30-430 ℃,程序升温，10℃/min 　　检测器温度：FID 450 ℃ 　　三、极性固定液 　　小分子的极性固定液极性最强的是b，b-氧二丙氰，但是它的耐温性很差，于是人们就研究各种极性高的高聚物，聚乙二醇20M (即分子量为20000的聚乙二醇)是使用最多中等极性的固定液。多年来人们知道往聚硅氧烷分子中引入苯基可以提高极性，所以上世纪七八十年代OV公司就合成了含不同数量苯基的甲基苯基聚硅氧烷固定液，OV-7是较早使用的含20% 苯基的甲基聚硅氧烷固定液，又如 SE-54 (含5% 苯基)，OV-17 (含 50% 苯基)，OV-25 (含 75% 苯基，含5% 苯基的聚二甲基硅氧烷)是各个公司制备毛细管柱的主要气相色谱固定液，如安捷伦公司的 HP-5、DB-5. Restke公司的Rtx-5 SGE公司的BP-5 Supelco公司的SPB-5 PerkinElmer公司的PE-2等。OV-17在农残分析中多有使用，相当于安捷伦公司的DB-17, Restke 公司的 Rtx-50，SGE公司的 BPX-50, Supelco公司的 SP-2250,使用DB-17ms(用于GC/MS的色谱柱)分析22种杀虫剂的色谱如图 3(安捷伦公司的图谱)。 图3 使用DB-17ms分析22种杀虫剂的色谱图 　　另外往聚硅氧烷分子中引入氰乙基、氰丙基、三氟丙基等可提高其极性。如 OV-275，Silar10C ，OV-1701 ,OV-210 。OV-275，Silar10C是含100% 氰乙基或氰丙基的聚甲基硅氧烷，OV-1701是含7% 氰丙基和7% 苯基的聚甲基硅氧烷 ，OV-210含三氟丙基的聚甲基硅氧烷。但是这类种固定液不易涂渍，也不易交联，所以多年来人们研究易于涂渍、易于交联的含高氰丙基的聚硅氧烷固定液，本世纪多个公司有所突破，制备成功各种各样的极性固定液和毛细管色谱柱。用OV-1701涂渍的毛细管色谱柱DB-1701分离22种杀虫剂的色谱见图4(安捷伦公司的图谱) 图4 DB-1701 分离22种杀虫剂的色谱图 　　各种固定液使用频率有很大的差别，国外有人统计各类固定液在色谱柱中使用的百分比见表5。 表5 五类典型气相色谱固定液的使用情况 　　四、选择性固定液 　　选择性固定液是近年来研究最多的气相色谱固定液，而且主要是针对手性异构体的分离。因为化合物的手性特征十分普遍，它在医药，农药应用中具有重要意义,所以对分析手性化合物提出迫切要求。而分离对映异构体的核心是寻找合适的手性固定相。气相色谱中手性固定相一般讲有三大类：第1类是手性氨基酸的衍生物 第2类是手性金属配合物 第3类是环糊精衍生物和其他主客体相互作用固定液，如冠醚类、杯芳烃类固定液。 　　第1类和第2类手性固定相有不少好的固定相，例如1978年有人把手性氨基酸的衍生物接枝到聚硅氧烷上，并有商品色谱柱上市，即把L-缬氨酸-特丁酰胺接枝到聚硅氧烷上，商品名&ldquo Chirasil-Val&rdquo 。这一固定液可以使用到220℃。特别适用于氨基酸手性异构体的分离，以及对手性胺类、氨基醇类、&alpha -羟基基酸酰胺类的分离。但是近年来大量研究的手性固定液的、能成为商品毛细管的只有环糊精(CD衍生物固定液。基于美国密苏里-罗拉大学的环糊精研究者Armstrong的研究结果,1990年美国的ASTEK公司推出一套CD毛细管色谱柱，典型的有下列9种,见表6。 表6 ASTEK公司的9种环糊精衍生物毛细管商品柱 　　五、近年商品柱所使用的新固定液 　　近几年在气相色谱的进展中只有气相色谱固定相的发展有所突破，即室温离子液体的研究和用它们制备的商品化气相色谱柱 金属有机框架化合物用于气相色谱固定相的研究有很大进展 碳纳米管作气相色谱固定相的研究也所发展，但是后二者应属于气-固色谱固定相，而且还没有商品化色谱柱的出现，所以本章暂不讨论。 　　室温离子液体是在常温下呈液态的离子型化合物，常由较大的有机阳离子( 如烷基咪唑盐、烷基吡啶盐、烷基季铵盐、烷基季膦盐) 和相对较小的无机或有机阴离子( 如六氟磷酸根、四氟硼酸根、硝酸根)构成。室温离子液体所以能在许多领域获得广泛的应用，是因为它的热稳定性好、粘度高而且随温度变化的波动小、表面张力小、蒸汽压力低、物理性能可变换幅度大、有成千上万的品种可供选择。而这些性能正好符合气相色谱固定相的要求，所以选择它作气相色谱固定相是很自然的事。下表7是Supelco公司的商品离子液体固定相的牌号和极性(J Chromatogr A, 2012,1255:130-144)。 表7 几种商品离子液体固定相的极性(Supelco公司) 　　*相对极性数=(Px x 100)/ PSLB-IL 100= McRynolds 极性乘以100再除以SLB-IL 100的McRynolds 极性 　　小结： 　　气相色谱固定液是气相色谱仪的核心和灵魂，也是迄今为止气相色谱不断研究的课题之一。现在聚硅硅氧烷类固定液是气相色谱固定液的主体，其中含5%苯基的聚甲基硅氧烷占有半壁江山，而极性固定相使用较多的是聚乙二醇固定液和含氰丙基、三氟丙基聚甲基硅氧烷的固定液。选择性固定液目前有商品柱的主要是环糊精衍生物固定液，近年发展和研究最多并成为商品柱的新型固定液主要是室温离子液体固定液。下一章，我将为大家讲述气相色谱固体固定相的今夕。（未完待续） 　　（作者：北京理工大学傅若农教授)

2005年11月17日华盛顿 DC消息 ——通用电气医疗集团（GE Healthcare）今天在华盛顿 D.C.的IBC生命科学高内涵分析（IBC Life Sciences’High Content Analysis）会议上推出了Micronucleus Formation Module。这种应用于In Cell 1000和In Cell 3000活细胞图像分析测定系统的新软件，可供在药物开发前期节省时间和资源地筛查药物的基因毒性。 通用电气医疗集团 Discovery Systems的产品开发副总裁 John Burczak 说道：“这种软件的推广将对药物及其开发过程有很大帮助。该技术能让一些公司在开发工作的前期识别复合物所具有的损害DNA的活力，而不是在药物研发过程结束时再检测这些复合物，从而即节省时间又省钱。” 这种微核分析（micronuclei assay）能识别由基因毒性复合物所引起的DNA损伤，并且是美国食品药品管理局（FDA）新药批准过程种最决定性的分析。用这种由FDA所强制规定的手工方法，每种化合物要花费多达两周才能得到分析结果，因此它仅仅用在药物开发较后期的步骤中。当与In Cell 3000活细胞图像分析测定系统一起使用时，该软件能在10 分钟以内完成对一块96孔板微核检测的成像和分析工作。因而让这种关键的基因毒性检测能在复合物的前期步骤中完成，以消除这些具有基因毒性的潜在复合物。 Burczak 说道：“Micronucleus 软件使In Cell活细胞图像分析测定系统成为研究工作者准确和高效进行大规模基因毒性筛查最理想的工具。通用电气医疗集团致力于为基于细胞的高内涵药物的筛选和研究工作提高软件分析能力。”

p style=" text-align: justify " 　　近日俄亥俄州立大学化学和生物化学系的 span style=" font-family: times new roman " VickiH. Wysocki /span 教授课题组在AC上发表了一篇文章，题目为 span style=" font-family: times new roman " Surface-InducedDissociation of Noncovalent Protein Complexes in an Extended Mass RangeOrbitrap Mass Spectrometer /span 。 /p p style=" text-align: justify " 　　获取蛋白质复合物的四级结构信息，对于理解其生物功能来说至关重要。与传统的CID/HCD通过多次碰撞沉积能量以实现解离相比， strong 表面诱导解离 /strong ( span style=" font-family: times new roman " Surface induceddissociation，SID /span )是通过使复合物离子撞击一个具有化学惰性、刚性的表面，经过单次高能撞击后，产生相比于CID和HCD技术电荷更均匀分布的蛋白亚基(如图1)，从而提供化学计量比和互作网络等信息。此外，相比于CID常常导致小分子配体丢失，SID可以产生保留小分子配体的复合物亚基。 /p p style=" text-align: justify " 　　& nbsp /p p style=" text-align: center " img width=" 600" height=" 253" title=" SID.webp.jpg" style=" width: 600px height: 253px " alt=" SID.webp.jpg" src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201903/uepic/671db102-c3a5-4bc3-ad7d-5e07248fc1a3.jpg" border=" 0" vspace=" 0" / /p p style=" text-align: center " 　　图1. SID示意图 /p p style=" text-align: justify " 　　目前，SID技术在蛋白复合物方面的工作主要是在飞行时间质谱( span style=" font-family: times new roman " TOF MS /span )上完成，但随着蛋白复合物的分子量越来越大，结构解析深度越来越深入，对质谱仪器的分辨率也提出了更高的要求。每一种类型的质量分析器( span style=" font-family: times new roman " TOF、FTICR或者Orbitrap /span )都有它们的优劣势，而仪器的选择主要依赖于待解决的问题本质。为此，Vicki H. Wysocki课题组与赛默飞公司Alexander A. Makarov博士合作， strong 首次将SID解离源装配到Exactive Plus Extended Mass Range(EMR)Orbitrap仪器上 /strong (如图2)。这套SID即可用来传输离子又可用来进行SID。值得一提的是，SID装置并未影响离子进入HCD池和一级质谱分析。 /p p style=" text-align: center " img title=" EMR-orbitrap.jpg" alt=" EMR-orbitrap.jpg" src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201903/uepic/97acf2a9-f158-474e-bef1-ca2f3c2deea8.jpg" / /p p style=" text-align: center " img width=" 600" height=" 498" title=" 2.webp.jpg" style=" width: 600px height: 498px " alt=" 2.webp.jpg" src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201903/uepic/7c134afb-82fa-472e-8848-062123d511f0.jpg" border=" 0" vspace=" 0" / /p p style=" text-align: justify " 　　图2. a)SID装置3D设计图，b)SID模式下离子轨迹图，c)SID改造后EMR Orbitrap仪器图。 /p p style=" text-align: justify " 　　随后，作者 strong 利用该仪器对Streptavidin和L-GlutamateDehydrogenase蛋白复合物进行了质谱分析 /strong 。其中，前者是具有D2对称性的同源四聚体，后者是具有D3对称性的同源六聚体。图3为Streptavidin的一级谱及其SID谱图。先前的文献表明，通过CID主要产生的是streptavidin复合物的去折叠单聚体和三聚体，但这一结果显然不能支持streptavidin是由同源二聚体组成的结构。而11+的母体streptavidin复合物经过SID会解离成两个二聚体，分别为5+和6+，证明SID更能反映他们真实的拓扑结构(图3a-c)。值得一提的是，之前对于谱图中出现的3+单聚体和6+同源二聚体，由于TOF MS分辨率不高所以要依靠IMS才能进行分辨3，但现在EMR Orbitrap在高分辨率模式(R=140,000 at m/z 200)下就可直接对它们二者进行分辨(图3d)，甚至盐加和离子或者N末端Met修饰与否都可以在高分辨谱图中完全获得(图3e)。 /p p style=" text-align: center " img width=" 600" height=" 466" title=" 3.webp.jpg" style=" width: 600px height: 466px " alt=" 3.webp.jpg" src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201903/uepic/335862ab-316e-4d66-8193-777c95b0aa48.jpg" border=" 0" vspace=" 0" / /p p style=" text-align: justify " 　　图3. a)Streptavidin四聚体拓扑结构(PDB ID：1SWB)，b)Streptavidin四聚体一级质谱图，c)11+价态Streptavidin四聚体的SID谱图( span style=" font-family: times new roman " 45 V，495 eV /span )，d)高分辨率模式下3+价态Streptavidin单聚体和6+价态的二聚体，e)3+价态单聚体和6+价态二聚体的N末端蛋氨酸修饰和Na离子加和谱图。 /p p style=" text-align: justify " 　　此外，作者还考察了 span style=" font-family: times new roman " L-Glutamate Dehydrogenase /span 同源六聚体的拓扑结构。HCD结果表明，该六聚体很难在气相中发生解离，需要较高HCD能量和高电荷态，常常导致先失去一个去折叠单体，无法真实反映亚基组成。而通过SID可以获得比较稳定的三聚体信号，反映出 span style=" font-family: times new roman " L-GlutamateDehydrogenase /span 同源六聚体的拓扑结构主要为三聚体-三聚体界面，在低能量下主要断裂较弱的三聚体界面(图4a)，当能量逐渐升高单体会从三聚体亚基中解离出来(图4b)。 /p p style=" text-align: center " img width=" 600" height=" 461" title=" 4.webp.jpg" style=" width: 600px height: 461px " alt=" 4.webp.jpg" src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201903/uepic/f1e97f6c-ca94-485b-825b-e918eeceb873.jpg" border=" 0" vspace=" 0" / /p p style=" text-align: justify " 　　图4. 28+价态L-Glutamate Dehydrogenase同源六聚体在a)175 eV和b)235 eV能量下的SID谱图。 /p p style=" text-align: justify " 　　综上所述，相比于SID-TOF MS仪器，具有更高质谱分辨率的SID–EMR Orbitrap仪器后续将为大蛋白复合物提供更丰富的四级结构信息。此外，Vicki H. Wysocki课题组先前还报道了将SID装载到FTICR-MS仪器，在SID谱图中可对霍乱毒素(Cholera toxin B，CTB)多种亚基进行同位素分辨(R=210,000 at m/z 5803.7)，例如8+四聚体、6+三聚体、4+二聚体和2+单聚体4，感兴趣的学者们可进一步了解。得益于Orbitrap和FTICR的超高质量分辨率，相信SID源将在蛋白-蛋白、蛋白-金属离子、蛋白-小分子配体复合物体系中发挥越来越重要的作用。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 参考文献： /p p style=" text-align: justify " 　　 span style=" font-family: times new roman " [1] VanAernum, Z. Gilbert, J. Belov, M. Makarov, A. A. Horning, S. Wysocki, V. Anal. Chem., 2019, DOI: 10.1021/acs.analchem.8b05605. /span /p p style=" text-align: justify " span style=" font-family: times new roman " 　　[2] Zhou, M. Wysocki, V. H. Acc. Chem. Res., 2014, 47, 1010-1018. /span /p p style=" text-align: justify " span style=" font-family: times new roman " 　　[3] Quintyn,Royston S. Yan, J. Wysocki, Vicki H. Chem. Biol., 2015, 22, 583-592. /span /p p style=" text-align: justify " span style=" font-family: times new roman " 　　[4] Yan, J. Zhou, M. Gilbert, J. D. Wolff, J. J. Somogyi, Á . Pedder, R. E. Quintyn, R.S. Morrison, L. J. Easterling, M. L. Pa?a-Toli?, L. Wysocki, V. H. Anal. Chem., 2017, 89,895-901. /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " strong 文献链接： /strong /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " a style=" color: rgb(0, 32, 96) text-decoration: underline " href=" https://pubs.acs.org.ccindex.cn/doi/10.1021/acs.analchem.8b05605" target=" _blank" span style=" color: rgb(0, 32, 96) " https://pubs.acs.org.ccindex.cn/doi/10.1021/acs.analchem.8b05605 /span /a /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " （文献原文可联系仪器信息网编辑部提供，联系电话：010-5165-4077-8223） /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 文中提及的赛默飞 span style=" font-family: times new roman " ExactivePlus(EMR)Orbitrap /span 相关信息可点击链接：& nbsp /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " a style=" color: rgb(0, 32, 96) text-decoration: underline " href=" https://www.instrument.com.cn/netshow/sh100244/C152611.htm" target=" _blank" span style=" color: rgb(0, 32, 96) " https://www.instrument.com.cn/netshow/sh100244/C152611.htm /span /a /p

北京北分三谱仪器助力国家环保部门共同保护我们的家园2019年是新中国成立七十周年，同时也是全面建成小康社会的关键一年。在这一年里，我国各地区、各部门积极贯彻落实全国生态环境保护要求，坚持以改善生态环境质量为核心目标，在多个领域取得了重大的治理成效。 　　5月7日，生态环境部面向全社会公开了2019年全国生态环境质量简况(以下简称“简况”)。总体来看，2019年全国生态环境质量总体改善，环境空气质量改善成果进一步巩固，水环境质量持续改善，海洋环境状况稳中向好，土壤环境风险得到基本管控，生态系统格局整体稳定，核与辐射安全有效保障，环境风险态势保持稳定。　　水是地球生命之源，无论是站在食物链顶端的人类，亦或是为全球生物提供氧气和食物来源的植物，乃至于我们肉眼无法察觉的微观世界中的微生物们都离不开水的滋养。然而，随着人类工业生产的快速发展以及全球人口的急剧增长，大量工业废水、生活污水排入江河湖海，导致水体大面积污染，水体富营养化、水质重金属超标等问题层出不穷。可以说，水体污染的治理已经刻不容缓了。　　根据简况可知，在湖泊水质监测方面，监测的主要污染指标为总磷、化学需氧量和高锰酸盐指数；在湖泊营养状态监测方面，监测的主要污染指标为总磷、化学需氧量；地表水水源监测的主要超标指标为总磷、硫酸盐和高锰酸盐指数；地下水水源监测的主要超标指标为锰、铁和硫酸盐。针对这些污染物和超标指标的检测，可以采用水质在线自动监测系统、水质重金属检测仪器、高锰酸盐指数测定仪、总磷测定仪、硫化物测定仪、水质分析仪等专门的环境监测仪器和设备。北分三谱仪器简介：水质检测专用气相色谱（饮用水及工业废水中的）挥发性有机物（顶空色谱法）摘要生活饮用水及饮水水源往往受到工业废水、农药和日用化学品等各种有机物的污染，水质污染，除了生活废水外，工厂企业排放的污水是主要原因，通过完善的水质检测技术，将是遏制水质污染，保护人类生命之源的重要手段。其中苯、甲苯、乙苯、间二甲苯、对二甲苯、邻二甲苯及有机磷浓药、有机氯农药、多环芳烃、多氯联苯以及邻苯二甲酸酯类等半挥发性有机物严重危害人体健康。测定这些化合物常用的方法是将它们分类，液液萃取浓缩后，选用不同气相色谱的检测器分别测定，不仅费时费力，而且存在有机溶剂用量大、样品处理复杂等问题。为此北京北分三谱仪器有限责任公司对生活饮用水及饮水水源中挥发性有机物的分析方法进行了研究，并将顶空进样技术与气相色谱仪联用，从而缩短了分析时间。水质（饮用水及工业废水）中的挥发性有机物检测专用气相色谱（顶空色谱法）方法引用标准及适用范围GB3838-2002生活饮用水及饮水水源工业废水《饮用天然矿泉水》(GB8537-2008)《生活饮用水卫生标准》（GB 5749-2006）强制性国家标准和13项生活饮用水卫生检验国家标准，本方法适用于各行各业的各种废水，如车间有害空气工业废水、锅炉废水农药和日用化学品等各种有机物有机磷农药、有机氯农药、多环芳烃、多氯联苯以及邻苯二甲酸酯类等半挥发性有机物在印染、农药等行业作为中间体, 工厂企业排放的污水中含有硝基苯类化合物属有毒污染物是染料合成、油漆涂料、塑料、医药及农药制造等的中间体,其中硝基苯属持久毒性有机污染物。酚类化合物, 氯苯, 硝基苯类, 邻苯二甲酸酯类, 甲醛, 有机磷农药, 氯乙烯, 氯丁二烯, 三乙胺,吡啶, 2、4-滴, 六氯丁二烯,三氯乙烷, 甲草胺, ,乐果、苯、甲苯、二甲苯、乙苯、二氯甲烷、二氯甲烷, 氯仿、四氯化碳、四氯乙烯、三氯乙烯、二氯甲烷、、三录甲烷、四氯化碳、石油类苯、甲苯、二甲苯、乐果、丙烯腈、乙腈,、环氧氯丙烷、甲胺磷等农药残留都可采用色谱法进行分离。在生产过程中往往因转化不彻底而残留, 石油化工、炼焦化工生产的排放废水都可以应用。方法原理本方法利用有机物易挥发的特性,结合顶空进样器的进样技术,采用顶空-气相色谱法,氢火焰检测器进行检测，得到了较满意的分析结果。该方法具有简便、快速、灵敏度高、重现性好、能实现半自动化的特点。顶空气相色谱法分析（饮用水及工业废水中的）挥发性有机物（顶空色谱法）北分三谱AHS-20A plus全自动顶空进样器介绍顶空进样技术是气相色谱法中一种方便快捷的样品前处理方法，其原理是将待测样品置入一密闭的容器中，通过加热升温使挥发性组分从样品基体中挥发出来,在气液(或气固)两相中达到平衡,直接抽取顶部气体进行色谱分析,从而检验样品中挥发性组分的成分和含量。使用顶空进样技术可以免除繁琐的样品前处理过程,避免有机溶剂对分析造成的干扰、减少对包谱柱及进样口的污染。该仪器可以和国内外各种型号的气相色谱仪相连接。北分三谱GC9860-5C气相色谱仪器介绍应用范围： GC-9860系列网络化气相色谱仪可广泛的应用于石油化工、环境检测、生物医药、食品加工、有机化学、卫生检疫等的微量、痕量分析。仪器特点：★ 显示窗口采用5.7寸工业彩色液晶屏设计，显示信息更全，界面操作更合理；★ 具有中、英文2套操作系统，满足不同的用户需求；★ 摒弃了易破、低档的PVC贴皮按键，采用塑料模具按键，手感好，经久耐用；★ 采用了的10/100M自适应以太网通信接口、内置IP协议栈，便于企业通过内部局域网、互联网实现远距离的数据传输；方便实验室架设、简化实验室的配置及数据的管理；★ 内部设计3个独立的连接线程，可以连接到本地处理、单位主管（如总工、技术厂长等）、以及上级主管部门（如环保局、技术监督局等），方便单位主管和上级主管单位实时监控仪器的运行以及分析数据结果；★ 配备的NETChrom® 工作站，可以支持多台色谱仪（253台）同时工作，实现数据处理以及反控，达到了业界领先的水平；★ NETChrom® 工作站内建的Modbus/TCP服务器，可以方便地使分析结果接入DCS（集散控制系统；★ 采用模块化的结构设计，设计明了，便于更换升级，保护了投资的有效性，可满足复杂样品分析，可选配多种高性能检测器，如FID、TCD、ECD、FPD和NPD等；★ 彻底摒弃了传统指针式压力表，并可加载EPC技术进行气路控制，自动化水平和整体性能接近国际一线品牌；★ 实现了气路故障自我保护、自动点火、熄火重点、自动开启气路，达到了一键启动；★ 设计定时自启动程序，可以轻松的完成气体、液体样品的在线分析（需配备进样部件）；★ 系统设计自动进样器接口，内置多款驱动程序，可随时加装自动进样器；水质检测专用气相色谱（饮用水及工业废水中的）挥发性有机物（顶空色谱法）仪器配置产品名称主要配置（规格）数量气相色谱仪GC9860毛细管进样系统、八阶程序升温、智能后开门。FID检测器1套顶空进样器 AHS-20A plus1台毛细管色谱柱SE-54 30*0.32*0.51根色谱工作站3000（电脑自备1台）1套顶空瓶20ml100只氢氮空一体发生器或钢瓶气BF-300N1台顶空压盖机 20m' m1台待测水中所用标准试剂分析纯各一瓶 北分三谱主营业务：销售本公司制造的色谱仪，顶空进样器，氢气发生器、空气发生器、氮气发生器、热解吸仪、电子皂膜流量计以及进口和国产的各类色谱仪、色谱仪配件、各种色谱柱、色谱标样及色谱试剂；兼营其他各种分析仪器、相关配件和试剂。顶空气相色谱法分析（饮用水及工业废水中的）挥发性有机物（顶空色谱法）

使用沃特世公司SYNAPT High Definition质谱系统， 利兹大学就所获得的结果发表文章 沃特世（Waters® ）公司(股票代码NYSE: WAT) 2007年12月3日宣布利兹大学爱斯布理Astbury结构分子生物学中心使用最近购买的沃特世公司SYNAPT High Definition MS™ (HDMS) 质谱系统，在Journal of the American Society of Mass Spectrometry (JASMS) 美国质谱协会杂志上发表了蛋白研究的成果。 Ashcroft实验室正在使用SYNAPT® HDMS质谱系统研究生物分子功能。在2007年12月刊的一篇文章中，利兹的研究人员描述了对几种蛋白，如细胞色素C和贝塔-2-微球蛋白，的成功分离和分析，Ashcroft希望该成就可以通向对某些生物过程的完全了解，如淀粉纤维形成，细菌纤毛集结以及病毒衣壳的装配，这些过程都与衰老症有关。 蛋白质被人体小心地折叠，经三维长链分子装配而成。当正确地被折叠时，蛋白调节正常身体功能。当某些蛋白被折叠成特殊形状而变成错误折叠时，引起一系列反应，可导致自身聚集和淀粉纤维形成，因此一些高发疾病可能发生，包括老年痴呆症，疯牛病和帕金森氏综合症。在利兹大学，Alison Ashcroft艾利森艾斯克劳福特博士和她的同事Sheena Radford诗娜拉德福德教授就是研究这样一种蛋白，贝塔-2-微球蛋白，试图探索它是如何形成纤维，在透析病人的关节聚集，并与透析相关的淀粉样变性病有关。对这些过程在分子水平的完全了解将有助于治疗方法的设计。 新型质谱为生物学研究带来新领域 作为工具，常规质谱是区分不同质量蛋白质的优秀方法。然而，一个特定蛋白的不同构象或不同的折叠形式具有同一质量数，使用常规的方法是无法区分开来的。这就是沃特世公司SYNAPT HDMS质谱系统和镶嵌其中的离子淌度技术帮助利兹大学的方式。 “一个蛋白可以折叠成紧密的三维结构，或者在某些条件下，蛋白可以打开成伸展的结构。即使这些三维结构拥有相同的质量和质荷比(m/z)，SYNAPT HDMS的离子淌度功能可以分离这些蛋白，并告诉您多少蛋白在折叠的形式而多少在非折叠的形式。而且，由于两种蛋白构象的横截面积不同，因为能够基于形状分离，SYNAPT HDMS质谱系统使我们能够区分各种不同的蛋白形状。 ”结果确实令人惊奇。”Alison Ashcroft艾利森艾斯克劳福特博士说，她是生物分子质谱研究员，质谱室主任。 来自沃特世公司的SYNAPT 质谱系统为实验室带来研究聚集过程的新的洞察力。“它为我们的研究提供新一维的空间。我们现在可以对原始状态的蛋白质定量，也可对非折叠或部分折叠的蛋白进行定量。我们也可以监测某种特定的蛋白构象在聚集过程被消耗。这为生物分子在分子水平如何工作提供了重要的新层面。”艾斯克劳福特博士补充道。 沃特世公司于2006年6月在美国西雅图美国质谱年会上推出SYNAPT HDMS质谱系统。它是第一台商业化的，在质量之外，基于尺寸，形状和电荷数分析离子的质谱。 一个管理万亿字节科学数据的决策 在生物技术和生物科学院(BBSRC) 和维尔康姆信托的资助下，艾斯克劳福特实验室拥有五台不同形式的质谱仪器，而管理其产生的数据是一个巨大的挑战。为了更有效地管理数据文件，该实验室选择沃特世公司NuGenesis Scientific Data Management System (SDMS)科学数据管理系统。 “每天在DVD上备份数据已经不需要了。科学数据管理系统SDMS 每天一次从五台质谱仪上将数据自动备份，我们的研究生和博士后可以直接从他们办公室的计算机上看到数据。存档文件对我们很重要，因为政府资助部门要求我们自建成之日起存储五或十年的数据。研究生花四年的时间拿到博士学位，所以他们需要四年或更长时间查看数据，特别是如果在拿到博士学位后要写文章” 艾斯克劳福特博士评论道。 “非分析化学背景的人们认为一台质谱就是一个复杂的称重机器。通常他们没有意识到使用这台仪器可以看到蛋白功能和行为。但是当他们发现了之后，会感到无比惊奇。”艾斯克劳福特博士说。 艾斯克劳福特博士在美国质谱协会杂志的文章全文参考: Monitoring co-populated conformational states during protein folding events using ESI-IMS-MS, D. P. Smith, K. Giles, R. H. Bateman, S. E. Radford,A. E Ashcroft, J. Am. Soc. Mass Spectrom., 2007 Dec 18 (12): 2180 – 90, DOI:10.1016/j.jasms.2007.09.017 文章再版要求请寄至A. E. Ashcroft 博士, Astbury Centre for Structural Molecular Biology, Astbury Building, Faculty of Biological Sciences, University of Leeds, Leeds LS2 9JT UK，或发电子邮件email: a.e.ashcroft@leeds.ac.uk 关于利兹大学生物科学系，请浏览(http://www.fbs.leeds.ac.uk/) 利兹大学的生物科学系是英国最大的生命科学研究团体之一，拥有将近一百五十名学者和四百多名博士后和研究生。该系目前活跃的研究基金约六千万英镑，资助者包括慈善，研究院，欧盟和企业。该系拥有杰出的研究成果，在上一期政府研究评价检查(HEFCE)中，所有主要评估项目均获得第五级。 关于利兹大学爱斯布理Astbury中心， 请浏览(http://www.astbury.leeds.ac.uk/) 爱斯布理Astbury结构分子生物学中心是利兹大学一个跨学科研究中心。成立该中心的目的是在结构分子生物学的各个领域从事国际水平的研究课题。Astbury中心汇集了五十多位来自利兹大学各学科的学者，拥有共同的学术兴趣。该中心以 W.T.Astbury 的名字命名，他是生物物理学家，在利兹大学长期从事科学研究(1928-1961)，工作期间在该领域成立了多个基金会。 艾利森艾斯克劳福特博士，(http://www.astbury.leeds.ac.uk/facil/mass.htm) 是生物分子质谱研究员，利兹大学，生物科学系，爱斯布理Astbury结构分子生物学中心质谱室主任。她的研究着重于开发和使用质谱方法探索生物分子功能。 诗娜拉德福德教授，(http://bmbsgi10.leeds.ac.uk/)，是利兹大学，生物科学系，爱斯布理Astbury结构分子生物学中心结构分子生物学教授。她的研究着重于蛋白质折叠，非折叠和聚集机理。 生物技术和生物科学研究院(BBSRC) (www.bbsrc.ac.uk)是英国生命科学资助机构。 政府投资的生物技术和生物科学研究院BBSRC 每年在很大范围的研究领域投资三亿八千万英镑，为英国国民的生活质量做出突出贡献。 维尔康姆信托(www.wellcome.ac.uk)是英国最大的慈善机构。它资助英国国内和国际创新生物医学研究，每年投资额在五亿英镑左右。 (Waters, SYNAPT, High Definition MS, High Definition Mass Spectrometry, NuGenesis 和 HDMS 是沃特世公司商标。)