绿叶假单胞菌

该资料就国家最新发布的GB 19298-2014 GB 《食品安全国家标准包装饮用水》中，对大肠菌群和铜绿假单胞菌的采样方案和微生物限量要求做了详细的图示。特别是铜绿假单胞菌滤膜法的检测，资料上演示了C6水中微生物膜过滤系统上的滤膜法正确操作过程，供检验人员参考。[img=,690,336]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/11/201811291101391320_3276_2443641_3.png!w690x336.jpg[/img][img=,690,333]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/11/201811291101383267_4896_2443641_3.png!w690x333.jpg[/img][color=#ff0000][b]详细资料请见附件。[/b][/color]

最近地摊经济引起热议，大家各种有才点子，其中榜上有名的是“去篮球场卖水”。随着夏天到来，包装饮用水市场也“火热火热”的。出门在外，运动的、逛街的、户外工作的朋友们已经习惯了去路边的小店买水，瓶装水刚需又便捷；在室内有桶装饮用水，“吨吨吨……”喝个满足，喝个痛快，就很棒。[align=center][img=,690,468]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2020/06/202006081106021719_7752_3169908_3.png!w690x468.jpg[/img][/align][align=center][i][size=10px]（图片来源：unsplash）[/size][/i][/align]但是，注意了，包装饮用水频上市场监督管理局抽查通报名单。五月至今，全国各地市场监督管理局发布的不合格食品通报中，出现多批次包装饮用水（密封于符合食品安全标准和相关规定的包装容器中，可供直接饮用的水[1]）铜绿假单胞菌项目不合格，包括福建省2批次、深圳市3批次、内蒙古2批次、江西省9批次。[b][size=18px]█ 什么是铜绿假单胞菌？[/size][/b]铜绿假单胞菌( Pseudomonas aeruginosa，PA) 别名绿脓杆菌，需氧菌属，是一种条件致病菌, 广泛分布于各种水、空气、正常人的皮肤、呼吸道和肠道等，易在潮湿的环境存活，对消毒剂、紫外线等具有较强的抵抗力。常以生物膜的形式附着在物体表面，即使在最低营养环境下，细菌总体数量仍然非常高[2]。铜绿假单胞菌最适生长温度为25-30℃，炎炎夏日，正是铜绿假单胞菌生长繁殖的高峰期。[b]对人体危害：[/b]对抵抗力较弱的人群，容易引起急性肠道炎、脑膜炎、败血症和皮肤炎症等疾病。[b]标准要求：[/b]根据GB 19298-2014《食品安全国家标准 包装饮用水》规定，铜绿假单胞菌在包装饮用水中不得检出。[size=18px][b]█ 可能造成包装饮用水铜绿假单胞菌不合格的原因？[/b][/size]1. 原料蓄水池周边环境差，水源污染严重；2. 原料水污染严重，杀菌过程未执行到位；3. 包装材料被污染，清洗消毒过程不彻底；4. 生产设备清洗消毒不彻底；5. 产品贮存、流通运输、销售环节卫生环境差；6. 产品贮存环境无通风，温度过高[b][size=18px]█ 应如何应对？[/size][/b][color=#ff0000][b]一、生产企业应对五到位，人机料法环，一步不能少。[/b][/color]1、人员管理关到位做好员工卫生管理，生产过程中避免人为带入的污染。2、机械设备洗消到位注意回收容器及设备管道等清洗消毒到位。回收容器配备自动刷洗消毒设备，保证内壁的清洗消毒彻底到位。3、原材料验收到位（1）以来自公共供水系统的水为生产用源水的，应定期监测pH值、电导率、余氯等水源水质情况；以来自非公共供水系统的地表水或地下水为生产用源水的，应监测水质波动情况（如水温等），判定水源是否受到外界影响产生异常[3]。（2）保证原材料质量达标；原材料贮存环境干净、卫生，离墙离地存放，保持通风干燥。（3）做好水源管控，水源选址远离污染源、蓄水池定时清洗消毒、水塔安装呼吸器。4、工艺、方法到位（1）严格要求每一个生产消毒工艺，不放松标准要求。（2）原料、产品检验方法依照相关国家标准执行。5、生产环境安全到位（1）清洁作业区对空气进行过滤净化处理，加装空气过滤装置并定期清洁，清洁作业区空气洁净度（悬浮粒子、沉降菌）静态时应达到10000级且灌装局部达到100级，或整体洁净度达到1000级[3]。（2）准清洁作业区及清洁作业区应相对密闭，清洁作业区应安装初效和中效空气净化设备，保证空气循环次数10次/h以上[3]。[b][color=#ff0000]二、经营企业应注意：[/color][/b]卸货注意要离地；存放注意保持干燥通风、干净卫生。贮存注意温度不宜过高。[color=#ff0000][b]三、运输过程应注意：[/b][/color]车辆保持干净卫生，温度不宜过高。[i][size=12px]参考资料[1] GB19298-2014 食品安全国家标准 包装饮用水.[2]王辉,马筱玲,钱渊,等.临床微生物学手册[M]. 第11版.北京:中华医学电子音像出版社,2017:1010-1013.[3]饮料生产许可审查细则（2017版）[/size][/i]

包装饮用水中铜绿假单胞菌的检测和鉴定[img=,690,513]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/10/201810111925505308_7597_2166779_3.png!w690x513.jpg[/img][img=,690,443]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/10/201810111926022842_4589_2166779_3.png!w690x443.jpg[/img][color=#404040]致病性[/color][color=#404040]• [/color][color=#404040]主要致病物质是[/color][color=red]内毒素[/color][color=#404040]，此外尚有菌毛、荚膜、胞外[/color][color=#404040]酶和外毒素等多种致病因子。可引起局部化脓性炎症[/color][color=#404040]，也可引起中耳炎、角膜炎、尿道炎、胃肠炎、心内[/color][color=#404040]膜炎 、脓胸，还可引起菌血症、败血症及引起婴儿严[/color][color=#404040]重的流行性腹泻。[/color][color=#404040][color=#404040] [/color][color=#404040]国内外污染情况[/color][color=#404040]- [/color][color=#404040]参考文献[/color][color=#404040]• [/color][color=#404040]国内污染情况：[/color][color=#404040] -[/color][color=#404040]瓶装天然矿泉水铜绿假单胞菌的检出率[/color][color=#404040]1.2[/color][color=#404040]％～[/color][color=#404040]23.6[/color][color=#404040]％；[/color][color=#404040] -[/color][color=#404040]瓶装饮用纯净水铜绿假单胞菌的检出率[/color][color=#404040]11.6[/color][color=#404040]％。[/color][color=#404040]• [/color][color=#404040]国外污染情况：[/color][color=#404040] -Richards[/color][color=#404040]等在[/color][color=#404040]104[/color][color=#404040]件检品中的[/color][color=#404040]4[/color][color=#404040]件分离到铜绿假单胞菌；[/color][color=#404040] -Rosenberg[/color][color=#404040]报告德国[/color][color=#404040]1.2[/color][color=#404040]％～[/color][color=#404040]10.2[/color][color=#404040]％的瓶装矿泉水检出铜[/color][color=#404040] 绿假单胞菌。[/color][color=#404040]• [/color][color=#404040]刚出厂的产品中铜绿假单胞菌数量较少，但有文献报[/color][color=#404040] 道[/color][color=#404040]5[/color][color=#404040]加仑桶装产品（[/color][color=#404040]15[/color][color=#404040]～[/color][color=#404040]31[/color][color=#404040]天的保存期），铜绿假单胞[/color][color=#404040] 菌可生长繁殖达到 [/color][color=#404040]10^4 CFU/ml[/color][color=#404040]。[/color][/color][color=#404040][color=#404040]• [/color][color=#404040]国内卫生标准：[/color][color=#404040]0 CFU/250ml[/color][/color][color=#404040][color=#404040][color=#262626]二、实验室检验[/color][/color][/color][color=#404040][color=#262626][color=#404040] [/color][color=red]GB 8538-2016 [/color][color=#404040]铜绿假单胞菌检测（滤膜法）[/color][/color][/color][color=#404040][color=#262626][color=#404040]原 理 将250mL水样用孔径为0.45μm的滤膜过滤，并将滤膜移至CN琼脂培养基上，于36℃士1℃恒温箱中培养48h，能够在CN琼脂上生长并产生绿脓菌素，或者能够在CN琼脂上生长并且氧化酶呈阳性、紫外光（360±20nm）照射下能发荧光、能够利用乙酰胺产氨的革兰氏阴性无芽孢杆菌，经证实为铜绿假单胞菌，则其检测结果为阳性。[/color][/color][/color][color=#404040][color=#262626][color=#404040][img=,690,513]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/10/201810111930447074_3628_2166779_3.png!w690x513.jpg[/img][img=,690,496]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/10/201810111930529842_4361_2166779_3.png!w690x496.jpg[/img][/color][/color][/color][color=#404040][color=#262626][color=#404040]操作步骤-水样过滤 在100级的洁净工作台进行过滤操作。首先用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘部分，将粗糙面向上，贴放在已灭菌的滤床上，固定好滤器，将250mL水样或稀释液通过孔径0.45μm的滤膜过滤，然后将过滤后的滤膜贴在已制备好的CN琼脂平板上，平铺并避免在滤膜和培养基之间夹留着气泡。[/color][/color][/color][color=#404040][color=#262626][color=#404040][img=,690,518]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/10/201810111939198094_2367_2166779_3.jpg!w690x518.jpg[/img][/color][/color][/color][color=#404040][color=#262626][color=#404040][img=,690,504]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/10/201810111941176488_2216_2166779_3.png!w690x504.jpg[/img][/color][/color][/color][color=#262626][color=#404040][color=#404040]可疑菌落计数情况[/color][color=#404040]• [/color][color=#404040]计数所有显[/color][color=red]蓝色或绿色（绿脓色素）[/color][color=#404040]的菌落，初步判定为铜绿假单胞菌。（需要做绿脓菌素的测定）[/color][color=#404040]• [/color][color=#404040]计数滤膜上所有[/color][color=red]发荧光不产绿脓色素[/color][color=#404040]疑似铜绿假单胞菌菌落，并进行乙酰胺肉汤确定试验。[/color][color=#404040]（在紫外线下检查滤膜时，应避免长时间在紫外光下照射，否则可能会将平板上的菌落杀灭，而导致无法在证实培养基上生长。）[/color][color=#404040]• [/color][color=#404040]将其它所有[/color][color=red]红褐色不发荧光[/color][color=#404040]的菌落进行氧化酶试验、乙酰胺肉汤、金氏[/color][color=#404040]B[/color][color=#404040]培养基确证实验。[/color][/color][/color][color=#262626][color=#404040][color=#404040][img=,690,520]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/10/201810111942538578_905_2166779_3.png!w690x520.jpg[/img][/color][/color][/color][color=#262626][color=#404040][color=#404040][img=,690,518]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/10/201810111945093378_4789_2166779_3.png!w690x518.jpg[/img][/color][/color][/color][color=#262626][color=#404040][color=#404040]纯 化• 营养琼脂：将需验证的可疑菌落划线接种营养琼脂培养基，于36℃±1℃培养 20h～24h，对可疑菌进行纯化[/color][/color][/color][color=#404040][color=#404040][color=#404040] 将最初显红褐色的菌落进行[/color][color=red]氧化酶试验[/color][color=#404040]• [/color][color=#404040]氧化酶试验 ：[/color][color=#404040]• [/color][color=#404040]原理：氧化酶（细胞色素氧化酶）是细胞色素呼吸酶系统的最终呼吸酶。具有氧化酶的细菌，首先使细胞色素[/color][color=#404040]C[/color][color=#404040]氧化，再由氧化型细胞色素[/color][color=#404040]C[/color][color=#404040]使对苯二胺氧化，生成有色的醌类化合物。[/color][color=#404040]• [/color][color=#404040]操作：取[/color][color=#404040]2[/color][color=#404040]～[/color][color=#404040]3[/color][color=#404040]滴新鲜配制的氧化酶试剂滴到放于平皿里的洁净滤纸上。用铂金丝接种环或玻璃棒，将适量的纯种培养物涂布在预备好的滤纸上。在[/color][color=#404040]10[/color][color=#404040]秒内显深蓝紫色的视为阳性反应。也可以按照商品化氧化酶测试产品的说明书进行该项测试。[/color][/color][/color][color=#404040][color=#404040][color=#404040]产氨实验（[/color][color=red]乙酰胺肉汤[/color][color=#404040]）[/color][color=#404040]• [/color][color=#404040]原理：铜绿假单胞菌产生一种脱酰胺酶，可使乙酰胺经脱酰胺作用释放氨，滴加[/color][color=#404040]钠氏试剂（碘化汞钾），氨在碱性条件下与碘化汞钾作用，生成红色的络合物。[/color][color=#404040]• 操作：将纯培养物接种到装有乙酰胺肉汤的试管中，在36℃±1℃下培养20h～24h。然后向每支试管培养物加入1～2滴钠氏试剂，检查各试管的产氨情况，如表现出从[/color][color=red]深黄色到砖红色[/color][color=#404040]的颜色变化，则为阳性结果，否则为阴性。[/color][/color][/color][color=#404040][color=#404040][color=#404040][img=,690,504]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/10/201810111959063912_4540_2166779_3.png!w690x504.jpg[/img][/color][/color][/color][color=#404040][color=#404040][color=#404040]产荧光素实验（[/color][color=red]金氏[/color][color=red]B[/color][color=#404040]培养基）[/color][color=#404040]• [/color][color=#404040]原理：蛋白胨提供氮源，磷酸盐促进荧光素的产生并抑制绿脓色素的产生，硫酸镁为荧光素的产生提供必须的阳离子，琼脂是培养基的凝固。[/color][color=#404040]• [/color][color=#404040]操作：将上述呈红褐色的且氧化酶反应呈阳性的培养物接种于金氏[/color][color=#404040]B[/color][color=#404040]培养基上，于[/color][color=#404040]36℃±1℃[/color][color=#404040]恒温箱培养[/color][color=#404040]24h[/color][color=#404040]～[/color][color=#404040]5d[/color][color=#404040]。 每天需取出在紫外灯下检查其是否产生荧光性，将[/color][color=#404040]5d[/color][color=#404040]内产生荧光的菌落记录为阳性。[/color][/color][/color][color=#404040][color=#404040][color=#404040][img=,690,515]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/10/201810112001313728_3277_2166779_3.png!w690x515.jpg[/img][/color][/color][/color][color=#404040][color=#404040][color=#404040]计数结果说明[/color][color=#404040]• [/color][color=#404040]菌落计数公式：[/color][/color][/color][color=#404040]N[/color][color=#404040]＝[/color][color=#404040]P[/color][color=#404040]＋[/color][color=#404040]F([/color][color=#404040]cF/nF[/color][color=#404040])[/color][color=#404040]＋[/color][color=#404040]R([/color][color=#404040]cR/nR[/color][color=#404040])[/color][color=#404040][color=#404040][color=#404040][/color][color=#404040]- P[/color][color=#404040]是呈蓝[/color][color=#404040]/[/color][color=#404040]绿色的菌落数（所有证实为铜绿假单胞菌的菌落）。[/color][color=#404040]- F[/color][color=#404040]是没有绿脓色素但显荧光的菌落数。[/color][color=#404040]- R[/color][color=#404040]是呈红褐色的菌落数。[/color][color=#404040]- [/color][color=#404040]nF[/color][color=#404040]是进行产氨测试的显荧光菌落数。[/color][color=#404040]- [/color][color=#404040]cF[/color][color=#404040]是产氨阳性的显荧光菌落数。[/color][color=#404040]- [/color][color=#404040]nR[/color][color=#404040]是进行产氨、氧化酶、金氏[/color][color=#404040]B[/color][color=#404040]培养基上显荧光测试的红褐色菌落数。[/color][color=#404040]- [/color][color=#404040]cR[/color][color=#404040]是产氨、氧化酶、金氏[/color][color=#404040]B[/color][color=#404040]培养基上显荧光测试均呈阳性的红褐色菌落数。[/color][/color][/color][color=#262626][color=#404040][color=#A53010]′[/color][color=#404040]样品稀释：[/color][color=#404040] [/color][color=#404040]若样品污染严重，建议对样品进行稀[/color][color=#404040] 释，如[/color][color=#404040]10[/color][color=#404040]倍递增稀释：取[/color][color=#404040]30ml[/color][color=#404040]样液加入[/color][color=#404040] 至[/color][color=#404040]270ml[/color][color=#404040]无菌生理盐水中，混匀，以此类[/color][color=#404040] 推，进行系列稀释。[/color][color=#A53010]′[/color][color=#404040]报 告：[/color][color=#404040] 结果以 [/color][color=red]CFU/250ml[/color][color=#404040]计。[/color][/color][/color]