杂交瘤细胞

[font=宋体][font=宋体]杂交瘤技术作为生产单克隆抗体的主流方法之一，其在生物医学领域的贡献不可忽视。该技术通过免疫小鼠后分离出能够产生抗体的[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]淋巴细胞，再与永生性骨髓瘤细胞系融合，形成杂交瘤细胞，进而在实验室中培养这些杂交瘤细胞，以产生针对特定抗原的单克隆抗体。杂交瘤抗体的大量生产，既可通过体内腹水制备方法，也可通过体外摇瓶培养方法。杂交瘤技术之所以在制备单克隆抗体上备受青睐，关键在于其制备的抗体具有高纯度、高灵敏度以及高特异性。[/font][/font][font=Calibri] [/font][b][font=宋体]杂交瘤技术的不同应用[/font][/b][font=Calibri] [/font][font=宋体]一旦得到稳定的杂交瘤细胞系后，[/font][font=Helvetica][color=#060607][font=宋体]该细胞系能够持续且高效地分泌出高度均一化的单克隆抗体[/font][/color][/font][font=宋体]。这种稳定的抗体生产能力不仅确保了抗体的稳定供应，而且显著降低了抗体的生产成本。由于这些抗体能高特异性和高灵敏度地识别目标抗原，因此，杂交瘤技术成为了多个研究领域的重要工具，包括毒理学、动物生物技术、医学、药理学、细胞生物学和分子生物学等。[/font][font=Calibri] [/font][font=宋体]单克隆抗体在诊断、成像和治疗等领域具有广泛的应用。[/font][font=Helvetica][color=#060607][font=宋体]在诊断领域，单克隆抗体因其高度的特异性，常用于免疫组化、酶联免疫吸附试验（[/font]ELISA[font=宋体]）和流式细胞术等方法中，以检测和识别特定的生物标志物。[/font][/color][/font][font=宋体]在治疗领域，很多抗体药如[/font][font=Helvetica][color=#060607][font=宋体]利妥昔单抗[/font][/color][/font][font=宋体][color=#060607]（[/color][/font][font=Helvetica][color=#060607]Rituximab[/color][/font][font=宋体][color=#060607][font=宋体]）、曲妥珠单抗[/font] [font=Helvetica](Trastuzumab)[/font][font=宋体]、西妥昔单抗（[/font][font=Helvetica]Cetuximab[/font][font=宋体]）是[/font][/color][/font][font=宋体]利用杂交瘤技术开发的，用于治疗[/font][font=Helvetica][color=#060607][font=宋体]非霍奇金淋巴瘤[/font][/color][/font][font=宋体][color=#060607]、[/color][/font][font=Helvetica][color=#060607][font=宋体]乳腺癌[/font][/color][/font][font=宋体][color=#060607]、[/color][/font][font=Helvetica][color=#060607][font=宋体]非小细胞肺癌和结肠癌[/font][/color][/font][font=宋体][color=#060607]等癌症。这些抗体药物的成功开发和应用，展示了杂交瘤技术在制备治疗性单克隆抗体方面的重要性，[/color][/font][font=宋体]为癌症等复杂疾病的治疗提供了新的可能性。[/font][font=Calibri] [/font][b][font=宋体]杂交瘤技术的局限性[/font][/b][font=Calibri] [/font][url=https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/hybridoma-technology][u][font=宋体][color=#0000ff]杂交瘤技术[/color][/font][/u][/url][font=宋体]目前也面临一些挑战[/font][font=Helvetica][color=#060607][font=宋体]，如融合效率低、产生抗体多样性有限以及可能的免疫排斥反应等[/font][/color][/font][font=宋体]。目前，大多数单克隆抗体都是在小鼠或大鼠中产生的，这增加了疾病从动物转移到人类的风险。虽然这些抗体在实验室条件下表现出色，但在实际应用中，特别是在人类疾病的治疗中，可能会引发免疫反应，影响治疗效果。因此，寻找更安全、更有效的抗体生产方法，是当前生物医学领域的重要课题。[/font][font=Calibri] [/font][font=宋体]未来，杂交瘤技术有望在多个方面取得新的突破。一方面，通过优化杂交瘤细胞的培养条件，可以进一步提高抗体的产量和质量。另一方面，利用基因工程技术对杂交瘤细胞进行改造，可以使其产生具有特定功能或特性的抗体，从而满足更多样化的应用需求。此外，随着人工智能和大数据技术的发展，我们有可能对杂交瘤技术的各个环节进行更精准的调控和优化，从而推动其在生物医学领域的更广泛应用。[/font][font=Calibri] [/font][font=宋体]综上所述，杂交瘤技术以其独特的优势在单克隆抗体的制备中占据了重要地位，其产生的抗体在多个领域都发挥着重要作用。然而，该技术也面临一些挑战，需要我们在未来的研究中不断探索和解决。我们有理由相信，随着科学技术的不断进步，杂交瘤技术将在生物医学领域发挥更大的作用，为人类的健康事业作出更大的贡献。[/font][font=Calibri] [/font][font=宋体]本篇文章由义翘神州编辑整理，同时义翘神州提供[/font][url=https://cn.sinobiological.com/services/hybridoma-culture-antibody-production-service][u][font=宋体][color=#0000ff]杂交瘤细胞培养及抗体生产服务[/color][/font][/u][/url][font=宋体]，点击了解详情！[/font][font=Calibri] [/font][font=Calibri] [/font][font=宋体]参考文献：[/font][font=宋体]Mitra S, Tomar PC. Hybridoma technology advancements, clinical significance, and future aspects. J Genet Eng Biotechnol. 2021 19(1):159. Published 2021 Oct 18. doi:10.1186/s43141-021-00264-6[/font]

[font=宋体][font=宋体]杂交瘤技术（[/font][font=Calibri]hybridoma technique[/font][font=宋体]）即淋巴细胞杂交瘤技术，又称单克隆抗体技术。它是在体细胞融合技术基础上发展起来的。克勒（[/font][font=Calibri]Kohler[/font][font=宋体]）和米尔斯坦（[/font][font=Calibri]Milstein[/font][font=宋体]）（[/font][font=Calibri]1975[/font][font=宋体]）证明，骨髓瘤细胞与免疫的动物脾细胞融合，形成能分泌针对该抗原的均质的高特异性的抗体——单克隆抗体，这种技术通称为杂交瘤技术。这一技术的基础是细胞融合技术。骨髓瘤细胞在体外可以连续传代，而脾细胞是终末细胞，不能在体外繁殖。如将小鼠的骨髓瘤细胞与分泌某种抗体或因子的淋巴细胞融合，则融合细胞既具有肿瘤细胞无限繁殖的特性，又具有淋巴细胞能分泌特异性抗体或因子的能力，同时也克服了免疫淋巴细胞不能在体外繁殖的缺点，融合的细胞称为淋巴细胞杂交瘤。[/font][/font][b][font=宋体] [/font][font=宋体]杂交瘤技术原理及步骤：[/font][/b][font=宋体][font=宋体]杂交瘤技术的基本原理是通过融合两种细胞而同时保持两者的主要特征。这两种细胞分别是经抗原免疫的小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞。被特异性抗原免疫的小鼠脾细胞（[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]淋巴细胞）的主要特征是它的抗体分泌功能，但不能在体外连续培养，小鼠骨髓瘤细胞则可在培养条件下无限分裂、增殖，即具有所谓永生性。在选择培养基的作用下，只有[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞与骨髓瘤细胞融合的杂交细胞才能具有持续培养的能力，形成同时具备抗体分泌功能和保持细胞永生性两种特征的细胞克隆。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]其原理从下列[/font][font=Calibri]3[/font][font=宋体]个主要步骤阐明。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]([/font][font=宋体]一[/font][font=Calibri])[/font][font=宋体]细胞的选择与融合[/font][/font][font=宋体][font=宋体]建立杂交瘤技术的目的是制备对抗原特异的单克隆抗体，所以融合细胞一方必须选择经过抗原免疫的[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞，通常来源于免疫动物的脾细胞。脾是[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞聚集的重要场所，无论以何种免疫方式刺激，脾内皆会出现明显的抗体应答反应。融合细胞的另一方则是为了保持细胞融合后细胞的不断增殖，只有肿瘤细胞才具备这种特性。选择同一体系的细胞可增加融合的成功率。多发性骨髓瘤是[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞系恶性肿瘤，所以是理想的脾细胞融合伴侣。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]使用细胞融合剂造成细胞膜一定程度的损伤，使细胞易于相互粘连而融合在一起。最佳的融合效果应是最低程度的细胞损伤而又产生最高频率的融合。聚乙二醇[/font][font=Calibri](PEG1 000[/font][font=宋体]～[/font][font=Calibri]2 000)[/font][font=宋体]是最常用的细胞融合剂，一般应用浓度为[/font][font=Calibri]40%(W/V)[/font][font=宋体]。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]([/font][font=宋体]二[/font][font=Calibri])[/font][font=宋体]选择培养基的应用[/font][/font][font=宋体][font=宋体]细胞融合是一个随机的物理学过程。在小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞混合细胞悬液中，经融合后细胞将以多种形式出现。如融合的脾细胞和瘤细胞、融合的脾细胞和脾细胞、融合的瘤细胞和瘤细胞、未融合的脾细胞、未融合的瘤细胞以及细胞的多聚体形式等。正常的脾细胞在培养基中仅存活[/font][font=Calibri]5[/font][font=宋体]～[/font][font=Calibri]7d[/font][font=宋体]，无需特别筛选；细胞的多聚体形式也容易死去；而未融合的瘤细胞则需进行特别的筛选去除。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]细胞[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]合成一般有两条途径。主要途径是由糖和氨基酸合成核苷酸，进而合成[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]，叶酸作为重要的辅酶参与这一合成过程。另一辅助途径是在次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在的情况下，经次黄嘌呤磷酸核糖转化酶[/font][font=Calibri](HGPRT)[/font][font=宋体]和胸腺嘧啶核苷激酶[/font][font=Calibri](TK)[/font][font=宋体]的催化作用合成[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]。细胞融合的选择培养基中有[/font][font=Calibri]3[/font][font=宋体]种关键成分：次黄嘌呤[/font][font=Calibri](hypoxanthine[/font][font=宋体]，[/font][font=Calibri]H)[/font][font=宋体]、甲氨蝶呤[/font][font=Calibri](aminopterin[/font][font=宋体]，[/font][font=Calibri]A)[/font][font=宋体]和胸腺嘧啶核苷[/font][font=Calibri](thymidine[/font][font=宋体]，[/font][font=Calibri]T)[/font][font=宋体]，所以取三者的字头称为[/font][font=Calibri]HAT[/font][font=宋体]培养基。甲氨蝶呤是叶酸的拮抗剂，可阻断瘤细胞利用正常途径合成[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]，而融合所用的瘤细胞是经毒性培养基选出的[/font][font=Calibri]HGPRT-[/font][font=宋体]细胞株，所以不能在该培养基中生长。只有融合细胞具有亲代双方的遗传性能，可在[/font][font=Calibri]HAT[/font][font=宋体]培养基中长期存活与繁殖。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]([/font][font=宋体]三[/font][font=Calibri])[/font][font=宋体]有限稀释与抗原特异性选择[/font][/font][font=宋体][font=宋体]在动物免疫中，应选用高纯度抗原。一种抗原往往有多个决定簇，一个动物体在受到抗原刺激后产生的体液免疫应答实质是众多[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞群的抗体分泌，而针对目标抗原表位的[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞只占极少部分。由于细胞融合是一个随机的过程，在已经融合的细胞中有相当比例的无关细胞的融合体，需经筛选去除。筛选过程一般分为两步进行：一是融合细胞的抗体筛选，二是在此基础上进行的特异性抗体筛选。将融合的细胞进行充分稀释，使分配到培养板的每一孔中的细胞数在[/font][font=Calibri]0[/font][font=宋体]至数个细胞之间[/font][font=Calibri](30%[/font][font=宋体]的孔为[/font][font=Calibri]0[/font][font=宋体]才能保证每个孔中是单个细胞[/font][font=Calibri])[/font][font=宋体]，培养后取上清液用[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]法选出抗体高分泌性的细胞；这一过程常被习惯地称作克隆化。将这些阳性细胞再进行克隆化，应用特异性抗原包被的[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]找出针对目标抗原的抗体阳性细胞株，增殖后进行冻存、体外培养或动物腹腔接种培养。[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体] [/font][font=宋体]杂交瘤技术应用：[/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1[/font][font=宋体]、单克隆抗体的重要性和价值[/font][/font][font=宋体]单克隆抗体不仅在生物学和免疫学基础研究中具有重要的价值，而且在实践中的应用范围亦极为广泛。[/font][font=宋体]单克隆抗体在医学诊断中的应用[/font][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]、在医学中，单克隆抗体已用于疾病的诊断，其优点是诊断准确，无交叉反应。[/font][/font][font=宋体]例如，单克隆抗体诊断乙型肝炎及潜伏的乙型肝炎病毒，则很少发生假阴性的漏诊。[/font][font=宋体][font=Calibri]3[/font][font=宋体]、单克隆抗体作为药物载体的应用[/font][/font][font=宋体]单克隆抗体对靶组织有专一亲和性，故在体内有特异定位分布的特点。[/font][font=宋体]把抗肿瘤药物和抗某种肿瘤的单克隆抗体结合，则可使药物在体内有选择地集中向该肿瘤细胞攻击，只杀灭靶细胞，而不损伤正常组织，大大减轻了抗癌药物的副作用。[/font][font=宋体][font=Calibri]4[/font][font=宋体]、单克隆抗体在治疗中的挑战和未来的发展方向[/font][/font][font=宋体][font=宋体]制做的单克隆抗体多为鼠[/font][font=宋体]——鼠型，对人来说属异种蛋白质，因此难于用于治疗。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]更多详情可以查看[url=https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/hybridoma-technology][b]杂交瘤技术[/b][/url]：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/hybridoma-technology[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=宋体]义翘神州：蛋白与抗体的专业引领者，欢迎通过百度搜索[/font][font=宋体]“义翘神州”与我们取得联系。[/font][/font][/b]

[font=宋体][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/hybridoma-technology][b]杂交瘤技术[/b][/url]，作为现代生物技术的瑰宝，自诞生以来便在生物医学领域产生了深远的影响。其基本原理在于利用细胞融合技术，将免疫的[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行融合，从而得到一种新型的杂交细胞——杂交瘤细胞。这种细胞既保留了[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]淋巴细胞产生特异性抗体的能力，又继承了骨髓瘤细胞无限增殖的特性。通过筛选和克隆，我们可以获得稳定产生特定抗体的杂交瘤细胞系，进而制备出高纯度、高特异性的单克隆抗体。下面是具体的关于杂交瘤技术原理及应用：[/font][/font][font=宋体][b]杂交瘤技术的基于三种关键技术。[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]一、动物免疫[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]将特定的抗原注射到哺乳动物（如小鼠）体内，在外来抗原刺激下，被免疫动物脾脏内的[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]淋巴细胞大量增殖并且分泌针对于该抗原的特异性抗体。动物免疫的作用就是用特定外来抗原对动物进行免疫，以刺激能分泌特异性抗体的[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]淋巴细胞大量增殖。 [/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]二、细胞融合[/font] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]B[/font][font=宋体]淋巴细胞受外来抗原刺激后可以分泌抗体，但[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]淋巴细胞本身是一种终末分化细胞，通常不再进行细胞分裂，存活一段时间（两周）便死亡[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]短命细胞；而骨髓瘤细胞不分泌抗体，却能在体外无限增殖存活。如果能将这两种细胞的特性结合起来，就能得到既能分泌抗体又能在体外长期存活的细胞，细胞融合杂交瘤细胞中非常关键的一个步骤。 [/font][/font][font=宋体][font=宋体]通常使用的细胞融合技术有生物方法如仙台病毒，化学方法如聚乙二醇（[/font][font=Calibri]PEG[/font][font=宋体]），物理方法如电融合。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]B[/font][font=宋体]淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合后，能产生五种细胞类型；未融合脾细胞，未融合骨髓瘤细胞，脾细胞[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]脾细胞融合体，骨髓瘤细胞[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]骨髓瘤细胞融合体，脾细胞[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]骨髓瘤细胞杂合体（杂交瘤细胞）。其中，我们需要利用另一个关键技术[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]杂交瘤细胞筛选[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]将所需的杂交瘤细胞分离出来。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]三、杂交瘤细胞筛选[/font] [/font][font=宋体][font=宋体]筛选杂交瘤细胞一般使用[/font][font=Calibri]HAT[/font][font=宋体]培养基。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]HAT[/font][font=宋体]培养基筛选方法基本原理：[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]HAT[/font][font=宋体]培养基成分：含有次黄嘌呤[/font][font=Calibri](H)[/font][font=宋体]、氨基喋呤[/font][font=Calibri](A)[/font][font=宋体]和胸腺嘧啶[/font][font=Calibri](T)[/font][font=宋体]三种成分。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]细胞[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]合成途径：主要合成和补救合成途径两种方式。主要合成就是利用糖和氨基酸在二氢叶酸还原酶的催化下来合成[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]；而补救合成途径则是通过次嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶[/font][font=Calibri](Hypoxanthine guznine phosphoribosyl transferase[/font][font=宋体]， [/font][font=Calibri]HGPRT)[/font][font=宋体]和胸腺嘧啶激酶[/font][font=Calibri](thymidine kinase[/font][font=宋体]，[/font][font=Calibri]TK)[/font][font=宋体]将核苷酸前体合成核苷酸以供[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]合成原料。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]HAT[/font][font=宋体]培养基中氯基喋呤是二氢叶酸还原酶的抑制剂，能有效地阻断[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]合成的内源性途径。融合前的骨髓瘤细胞不能产生抗体，并且缺乏次黄嘌呤 – 鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶（[/font][font=Calibri]HGPRT[/font][font=宋体]）基因，使得它们对[/font][font=Calibri]HAT[/font][font=宋体]培养基敏感，阻断了[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]补救合成途径。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]将融合的细胞在[/font][font=Calibri]HAT[/font][font=宋体]培养基中孵育大约[/font][font=Calibri]10[/font][font=宋体]至[/font][font=Calibri]14[/font][font=宋体]天，未融合的以及自身融合的骨髓瘤细胞死亡。这是因为[/font][font=Calibri]HAT[/font][font=宋体]培养基阻断了骨髓瘤细胞两大[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]合成途径。未融合的以及自身融合的[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]淋巴细胞虽然能够合成[/font][font=Calibri]HGPRT[/font][font=宋体]酶，但其是正常细胞，存活一段时间（两周）也死亡。因此，在[/font][font=Calibri]HAT[/font][font=宋体]养基中，只有[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]骨髓瘤杂合体存活，因为杂交瘤细胞继承了[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]淋巴细胞和骨髓瘤细胞的双重特性，能够合成[/font][font=Calibri]HGPRT[/font][font=宋体]酶和[/font][font=Calibri]TK[/font][font=宋体]酶。这些杂交瘤细胞能够分泌抗体（[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞特性）并且无限增殖（骨髓瘤细胞特性）。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]然后将培养基稀释到多孔板中，使得每个孔仅含有一个杂交瘤细胞。再由这些单细胞克隆生长，最终选出分泌预定特异抗体的杂交细胞株。由于孔中的抗体由相同的[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞产生，针对相同的抗原表位，所以产生的抗体又被称之为单克隆抗体。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]接下来采用体内或者体外方式对筛选的能分泌特异性抗体的杂交瘤细胞进行扩大培养，最后收集提纯获取单抗。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]杂交瘤技术应用：[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]①疾病诊断：单克隆抗体在疾病诊断中发挥着重要作用，以其准确且无交叉反应的特点，显著提高了诊断的准确性。例如，在乙型肝炎及潜伏的乙型肝炎病毒的诊断中，单克隆抗体能显著减少假阴性的漏诊。[/font][font=宋体]②治疗载体：单克隆抗体也可以作为治疗疾病的载体。通过与抗肿瘤药物结合，单克隆抗体能在体内选择性集中攻击肿瘤细胞，具有靶向性，从而减少对正常组织的损伤并减轻抗癌药物的副作用。这种载药单克隆抗体被誉为“生物导弹”。[/font][font=宋体][font=宋体]③抗体序列保护：获取抗体基因序列后，可以通过专利对[/font][font=Calibri]CDR[/font][font=宋体]区进行保护，从而保护创新性的抗体序列。[/font][/font][font=宋体]④生产方式备份：由于杂交瘤存在退化转阴的风险，抗体序列可以通过基因工程方式轻松获得抗体样品，为生产方式提供备份。[/font][font=宋体]⑤抗体工程改造：获得的抗体序列可用于抗体人源化、双特异性抗体等抗体工程改造项目，进一步拓展抗体的应用范围和效果。[/font][font=宋体]⑥癌症研究：杂交瘤技术可以制备大量的特异性抗体，用于检测肿瘤标志物、研究癌细胞的生物学特性、筛选分子靶点等。此外，该技术还可以用于检测肿瘤细胞表面的抗原，通过对来自不同患者的癌瘤细胞进行克隆化和筛选，发现不同肿瘤的抗原异质性，为临床肿瘤治疗提供新的思路和策略。[/font][font=宋体]总的来说，杂交瘤技术以其独特的优势在多个领域都有着广泛的应用，为生物医学研究和疾病治疗提供了有力的工具。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]义翘神州提供[url=https://cn.sinobiological.com/services/hybridoma-sequencing-service][b]杂交瘤细胞抗体基因测序服务[/b][/url]和[url=https://cn.sinobiological.com/services/hybridoma-culture-antibody-production-service][b]杂交瘤细胞培养及抗体生产服务[/b][/url]，有需求可以咨询。[/font][font=宋体][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/hybridoma-sequencing-service[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/hybridoma-culture-antibody-production-service[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=宋体]义翘神州：蛋白与抗体的专业引领者，欢迎通过百度搜索[/font][font=宋体]“义翘神州”与我们取得联系。[/font][/font][/b]

[font=宋体][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/hybridoma-technology][b]杂交瘤技术[/b][/url]是一种将[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合生产单克隆抗体的传统方法。该技术通过将动物脾细胞与骨髓瘤细胞融合，产生永生化杂交瘤细胞系，然后筛选其上清液中的抗原特异性克隆，并进一步循环亚克隆以产生严格的单克隆抗体。[/font][/font][font=宋体][font=宋体][b]利用杂交瘤技术制备单克隆抗体通常操作流程为[/b]：抗原制备、抗原免疫动物、杂交瘤细胞制备、融合细胞的筛选、培养杂交瘤细胞制备抗体。（详细实验流程：杂交瘤单克隆抗体制备[/font][font=Calibri]SOP[/font][font=宋体]）在单克隆抗体制备过程中，常常会遇到细胞污染，细胞融合后不生长、亚克隆后的细胞株不分泌抗体以及细胞难以克隆等问题，本文将详细分析以上常见问题的产生原因以及解决该问题的方法。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]一、微生物污染[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]①细菌、真菌污染主要是由于实验人员操作不当或者消毒不到位引起的。人身上可能携带各种孢子，如果操作不当，或者是未能及时到位的消杀，就有可能会引入污染。除此之外，还须注意平时使用的一些消毒剂，比如[/font][font=Calibri]84[/font][font=宋体]消毒液或者[/font][font=Calibri]75%[/font][font=宋体]酒精，要确认它的纯度以及质量。如果是因为这些问题导致的消毒不到位，是非常不容易发现的。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]②支原体污染则可能由血清制品、关键试剂材料或实验人员带入。正常的[/font][font=Calibri]SP2/0[/font][font=宋体]细胞圆润透亮，当被支原体污染后，短期内细胞没有明显的变化，当污染严重后，细胞生长会变得极为缓慢，生长周期变长，细胞形态多样。可通过加入商品化的清除支原体试剂，或者通过将污染的杂交瘤细胞注射进小鼠腹腔，待产生实体瘤后或产生腹水后，无菌分离重新获得杂交瘤细胞。[/font][/font][font=宋体]③原生生物污染主要是大家比较头疼的黑胶虫，污染后会陆续出现多少不等的小黑点。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]二、融合后细胞不生长[/font][font=宋体][font=宋体]①融合后细胞不生长可能是因为融合试剂有毒性，部分毒性试剂作用时间过长引起的。如[/font][font=Calibri]PEG[/font][font=宋体]在[/font][font=Calibri]10%~60%[/font][font=宋体]都可以进行融合，但浓度越高毒性越大。[/font][/font][font=宋体]②也有可能是使用血清质量比较差，推荐使用胎牛血清。[/font][font=宋体][font=宋体]③还有可能是因为添加的[/font][font=Calibri]HAT[/font][font=宋体]试剂中氨基喋呤（[/font][font=Calibri]A[/font][font=宋体]）含量过高或[/font][font=Calibri]HT[/font][font=宋体]（次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷）含量过低。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体]三、杂交瘤细胞不分泌抗体或者停止分泌抗体[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1[/font][font=宋体]、杂交瘤细胞不分泌抗体，可能的原因有以下几种：[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]a.[/font][font=宋体]抗原免疫原性弱，免疫效果不好，可以通过多方案检测血清效价进行进一步评估；[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]b.[/font][font=宋体]操作过程中脾细胞损伤较多，抗原特异性淋巴母细胞大量死亡；[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]、杂交瘤细胞前期有抗体分泌，后期在克隆化过程中抗体分泌量减少或停止分泌抗体，可能的原因有以下几种：[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]a.HAT[/font][font=宋体]试剂中氨基喋呤（[/font][font=Calibri]A[/font][font=宋体]）失效，骨髓瘤细胞增殖抑制杂交瘤细胞的生长；[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]b.[/font][font=宋体]未及时克隆，不分泌抗体的杂交瘤大量生长挤占生存空间；[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]c.[/font][font=宋体]骨髓瘤细胞返祖化，抵抗氨基喋呤（[/font][font=Calibri]A[/font][font=宋体]）的选择；[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]d.[/font][font=宋体]梁色体丢失（突变）[/font][font=Calibri] [/font][/font][font=宋体][font=Calibri]e.[/font][font=宋体]支原体污染。[/font][/font][font=宋体]解决方法有三种：第一，及时进行细胞建库；第二，高频次检查细胞状态和是否污染；第三，定期进行抗原筛选。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]四、杂交瘤细胞难以克隆化[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]一旦确认有分泌抗体的杂交瘤细胞，就应尽快进行克隆化。克隆化的目的是为了获得单一细胞系的群体，反复克隆化后可获得稳定的杂交瘤细胞株。杂交瘤细胞若难以克隆化，可以尝试以下解决方法：[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]①使用已有杂交瘤细胞株对血清进行筛选，确定最佳批次的血清和使用浓度；[/font][font=宋体][font=宋体]②融合后第一次克隆（一亚）仍需采用含[/font][font=Calibri]HT[/font][font=宋体]的条件培养；[/font][/font][font=宋体][font=宋体]③在培养体系中加入白细胞介素[/font][font=Calibri]6[/font][font=宋体]（[/font][font=Calibri]IL6[/font][font=宋体]），一般商品化的杂交瘤因子都含有[/font][font=Calibri]IL6[/font][font=宋体]。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]义翘神州提供杂交瘤测序服务和杂交瘤细胞培养及抗体生产服务，具体关于杂交瘤相关问题详情可以参看[/font][font=宋体][font=宋体]杂交瘤技术：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/hybridoma-technology[/font][/font][font=宋体][font=宋体]杂交瘤细胞培养及抗体生产服务：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/hybridoma-culture-antibody-production-service[/font][/font][font=宋体][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/services/hybridoma-sequencing-service][b]杂交瘤测序服务[/b][/url]：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/hybridoma-sequencing-service[/font][/font]

[font=宋体][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/hybridoma-technology][b]杂交瘤技术[/b][/url]是指建立杂交瘤细胞系的技术，其用于产生大量单克隆抗体，所以又称单克隆抗体技术。其是在细胞融合技术上发展起来的：将[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]淋巴细胞和骨髓细胞融合，即可形成在体外长期存活并分泌免疫蛋白的杂交瘤细胞。通过克隆化可得到来自单个杂交瘤细胞的单克隆系，即杂交瘤细胞系，它所产生的抗体是针对同一抗原结合位点的抗体，即单克隆抗体（[/font][font=Calibri]monoclonal antibody[/font][font=宋体]），简称单抗。单克隆抗体具有高度专一性，一种单克隆抗体只能识别一种特定的抗原决定簇。正是由于其特异性强，因此被广泛应用于生物学，药学，医学等领域，具有极其远大的应用前景，因此用于制备单克隆抗体的杂交瘤技术也变得越来越重要。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]杂交瘤技术原理：[/font][/font][font=宋体]杂交瘤技术基于三种关键技术。[/font][font=宋体][b]一、动物免疫[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]将特定的抗原注射到哺乳动物（如小鼠）体内，在外来抗原刺激下，被免疫动物脾脏内的[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]淋巴细胞大量增殖并且分泌针对于该抗原的特异性抗体。动物免疫的作用就是用特定外来抗原对动物进行免疫，以刺激能分泌特异性抗体的[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]淋巴细胞大量增殖。 [/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体][b]二、细胞融合[/b][/font] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]B[/font][font=宋体]淋巴细胞受外来抗原刺激后可以分泌抗体，但[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]淋巴细胞本身是一种终末分化细胞，通常不再进行细胞分裂，存活一段时间（两周）便死亡[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]短命细胞；而骨髓瘤细胞不分泌抗体，却能在体外无限增殖存活。如果能将这两种细胞的特性结合起来，就能得到既能分泌抗体又能在体外长期存活的细胞，细胞融合杂交瘤细胞中非常关键的一个步骤。 [/font][/font][font=宋体][font=宋体]通常使用的细胞融合技术有生物方法如仙台病毒，化学方法如聚乙二醇（[/font][font=Calibri]PEG[/font][font=宋体]），物理方法如电融合。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]B[/font][font=宋体]淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合后，能产生五种细胞类型；未融合脾细胞，未融合骨髓瘤细胞，脾细胞[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]脾细胞融合体，骨髓瘤细胞[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]骨髓瘤细胞融合体，脾细胞[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]骨髓瘤细胞杂合体（杂交瘤细胞）。其中，我们需要利用另一个关键技术[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]杂交瘤细胞筛选[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]将所需的杂交瘤细胞分离出来。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体][b]三、杂交瘤细胞筛选[/b][/font] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]筛选杂交瘤细胞一般使用[/font][font=Calibri]HAT[/font][font=宋体]培养基。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]HAT[/font][font=宋体]培养基筛选方法基本原理：[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]HAT[/font][font=宋体]培养基成分：含有次黄嘌呤[/font][font=Calibri](H)[/font][font=宋体]、氨基喋呤[/font][font=Calibri](A)[/font][font=宋体]和胸腺嘧啶[/font][font=Calibri](T)[/font][font=宋体]三种成分。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]细胞[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]合成途径：主要合成和补救合成途径两种方式。主要合成就是利用糖和氨基酸在二氢叶酸还原酶的催化下来合成[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]；而补救合成途径则是通过次嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶[/font][font=Calibri](Hypoxanthine guznine phosphoribosyl transferase[/font][font=宋体]， [/font][font=Calibri]HGPRT)[/font][font=宋体]和胸腺嘧啶激酶[/font][font=Calibri](thymidine kinase[/font][font=宋体]，[/font][font=Calibri]TK)[/font][font=宋体]将核苷酸前体合成核苷酸以供[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]合成原料。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]HAT[/font][font=宋体]培养基中氯基喋呤是二氢叶酸还原酶的抑制剂，能有效地阻断[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]合成的内源性途径。融合前的骨髓瘤细胞不能产生抗体，并且缺乏次黄嘌呤 – 鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶（[/font][font=Calibri]HGPRT[/font][font=宋体]）基因，使得它们对[/font][font=Calibri]HAT[/font][font=宋体]培养基敏感，阻断了[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]补救合成途径。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]将融合的细胞在[/font][font=Calibri]HAT[/font][font=宋体]培养基中孵育大约[/font][font=Calibri]10[/font][font=宋体]至[/font][font=Calibri]14[/font][font=宋体]天，未融合的以及自身融合的骨髓瘤细胞死亡。这是因为[/font][font=Calibri]HAT[/font][font=宋体]培养基阻断了骨髓瘤细胞两大[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]合成途径。未融合的以及自身融合的[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]淋巴细胞虽然能够合成[/font][font=Calibri]HGPRT[/font][font=宋体]酶，但其是正常细胞，存活一段时间（两周）也死亡。因此，在[/font][font=Calibri]HAT[/font][font=宋体]养基中，只有[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]骨髓瘤杂合体存活，因为杂交瘤细胞继承了[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]淋巴细胞和骨髓瘤细胞的双重特性，能够合成[/font][font=Calibri]HGPRT[/font][font=宋体]酶和[/font][font=Calibri]TK[/font][font=宋体]酶。这些杂交瘤细胞能够分泌抗体（[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞特性）并且无限增殖（骨髓瘤细胞特性）。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]然后将培养基稀释到多孔板中，使得每个孔仅含有一个杂交瘤细胞。再由这些单细胞克隆生长，最终选出分泌预定特异抗体的杂交细胞株。由于孔中的抗体由相同的[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞产生，针对相同的抗原表位，所以产生的抗体又被称之为单克隆抗体。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]接下来采用体内或者体外方式对筛选的能分泌特异性抗体的杂交瘤细胞进行扩大培养，最后收集提纯获取单抗。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]杂交瘤技术的优缺点介绍：[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1[/font][font=宋体]、优点：与传统的免疫动物方法制备抗体相比，利用杂交瘤技术可以制备出高纯度的单抗，并且可以进行单克隆抗体的大量生产。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]、缺点：[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]a.[/font][font=宋体]操作步骤繁琐。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]b.[/font][font=宋体]利用杂交瘤技术生产出的单克隆抗体多为鼠源性，而鼠源性抗体在应用中有诸多问题，例如被人类免疫系统所识别，产生人抗鼠抗体[/font][font=Calibri](HAMA[/font][font=宋体]）反应、在人体循环系统中很快被清除等。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]目前义翘神州提供[url=https://cn.sinobiological.com/services/hybridoma-culture-antibody-production-service][b]杂交瘤细胞培养及抗体生产服务[/b][/url]，服务内容从细胞复苏[/font][font=宋体]→细胞驯化→生产及纯化→[/font][font=Calibri]QC[/font][font=宋体]分析→交付内容 义翘神州都有严格的质量把控，更多详情可以参看：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/hybridoma-culture-antibody-production-service[/font][/font]

[font=宋体][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/hybridoma-technology][b]杂交瘤技术[/b][/url]又称细胞融合技术，是将两个或多个细胞融合成一个。[/font] [font=宋体]融合后形成的杂交瘤细胞承袭了两亲本细胞的特征。[/font] [font=宋体]自发的细胞融合很少发生，当加入一种融合剂，如：聚乙二醇（常用）、仙台病毒或溶血卵磷脂后，两种细胞就可发生融合。[/font] [font=宋体]首先是质膜互相融合，形成具有两个或多个核的异核体，细胞进一步分裂时，核互相融合，形成了杂交细胞。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]杂交瘤技术优缺点：[/font][/b][font=宋体]优点：与传统的免疫动物方法制备抗体相比，利用杂交瘤技术可以制备出高纯度的单抗，并且可以进行单克隆抗体的大量生产。[/font][font=宋体][font=宋体]缺点：[/font][font=Calibri]a.[/font][font=宋体]操作步骤繁琐。[/font][font=Calibri]b.[/font][font=宋体]利用杂交瘤技术生产出的单克隆抗体多为鼠源性，而鼠源性抗体在应用中有诸多问题，例如被人类免疫系统所识别，产生人抗鼠抗体[/font][font=Calibri]( HAMA[/font][font=宋体]）反应、在人体循环系统中很快被清除等。[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]杂交瘤技术应用：[/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体]①诊断应用：单克隆抗体在疾病诊断中发挥了重要作用，其优点在于诊断准确且无交叉反应，例如在乙型肝炎及潜伏的乙型肝炎病毒的诊断中，单克隆抗体能显著减少假阴性的漏诊。[/font][font=宋体]②治疗载体：单克隆抗体也可作为治疗疾病的载体。通过与抗肿瘤药物结合，单克隆抗体能在体内选择性集中攻击肿瘤细胞，具有靶向性，从而减少对正常组织的损伤并减轻抗癌药物的副作用。因此，载药单克隆抗体被誉为“生物导弹”。[/font][font=宋体][font=宋体]③异种蛋白质问题：目前大多数单克隆抗体为鼠[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]鼠型，对于人体来说属于异种蛋白质，容易引起排异反应，限制了其在治疗中的应用。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]④人[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]人型单克隆抗体的研究：为了解决排异问题，研究者正在努力研发人[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]人型单克隆抗体，以利于其在治疗中的广泛应用。[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]杂交瘤技术常见问题解析：[/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]①电融合和[/font][font=Calibri]PEG[/font][font=宋体]融合的区别？[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]PEG[/font][font=宋体]化学融合是利用聚乙二醇分子能够改变细胞膜结构的特性来实现细胞融合的过程。聚乙二醇可以使两个细胞接触点质膜的脂质分子发生疏散和重组，两个细胞接触部位的质膜由于相互亲和以及彼此的表面张力作用，从而发生细胞融合。电融合则是先通过高频交流电压，使细胞成串珠状排列，实现点接触；然后施加方波脉冲，击穿两个细胞接触部位的质膜，质膜脂质分子发生重组，同时由于细胞表面张力作用，完成细胞融合。电融合法比[/font][font=Calibri]PEG[/font][font=宋体]融合法有明显的优点：细胞融合率高，有利于杂交瘤的筛选；电脉冲击穿对细胞的损伤小，有利于融合后细胞的生长增殖；可直接观察融合过程；便于有目的地控制选择融合条件。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]②为什么要推荐进行[/font][font=Calibri]2~3[/font][font=宋体]轮有限稀释获得稳定的杂交瘤细胞株？[/font][/font][font=宋体][font=宋体]阳性单克隆细胞的获得通常进行至少[/font][font=Calibri]2[/font][font=宋体]轮有限稀释，原因主要考虑两点。第一，有限稀释过程中，大多数是通过实验者在显微镜下观察细胞团状态来判定是否是单克隆，存在一定的主观经验值，至少进行两轮有限稀释可以增加判断的准确性；第二，杂交瘤细胞由两个细胞融合而成，存在基因的不稳定性，连续[/font][font=Calibri]2[/font][font=宋体]轮有限稀释，客观上增加了筛选中细胞培养时间，有利于淘汰不稳定的杂交瘤细胞株。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]③为什么要使用核酸免疫？[/font][font=宋体]重组蛋白由于免疫靶向明确、剂量可控等优势，通常作为动物免疫阶段的首选免疫原。但有些重组蛋白因为表达纯化困难，很难大量获得并用于动物免疫；另外，重组蛋白与天然样本之间存在或多少的结构差异。而核酸免疫，跳过了蛋白表达纯化的过程，成功避开了蛋白生产的难题，通过核酸体内表达的蛋白结构也更加接近天然蛋白，故而可以作为重组蛋白免疫的有效补充手段。但核酸免疫的免疫剂量很难判断，整体免疫效价也会普遍低于蛋白和多肽免疫。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]④除弗氏佐剂之外，免疫佐剂还有哪些？[/font][font=宋体][font=宋体]免疫佐剂是指那些同抗原一起或预先注入机体内能增强机体对抗原的免疫应答能力或改变免疫应答类型的辅助物质。佐剂的免疫生物学作用是增强免疫原性、增强抗体的滴度、改变抗体产生的类型、引起或增强迟发超敏反应等。除经典的弗氏佐剂外，各类不同功能的佐剂也层出不穷，比较常见的有：[/font][font=Calibri]1[/font][font=宋体]）无机佐剂，如磷酸铝佐剂、氢氧化铝佐剂；[/font][font=Calibri]2[/font][font=宋体]）生物类佐剂，如以细菌胞壁或产物为主要组成的佐剂；[/font][font=Calibri]3[/font][font=宋体]）具有佐剂活性的细胞因子类，如[/font][font=Calibri]GSF[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]IL1[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]IL2[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]IFN -[/font][font=宋体]γ等；[/font][font=Calibri]4[/font][font=宋体]）人工合成佐剂，如[/font][font=Calibri]cpG[/font][font=宋体]等。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]⑤杂交瘤融合后主克隆接种[/font][font=Calibri]96[/font][font=宋体]孔细胞培养板数量通常是多少？[/font][/font][font=宋体][font=宋体]融合后的主克隆细胞接种[/font][font=Calibri]96[/font][font=宋体]孔细胞培养板的数量与融合效率和脾细胞多少有密切关系。[/font][font=Calibri]PEG[/font][font=宋体]化学融合后的主克隆，通常一只小鼠的脾细胞可以接种[/font][font=Calibri]8-15[/font][font=宋体]块[/font][font=Calibri]96[/font][font=宋体]孔细胞培养板；电融合因为融合效率大大提高，通常一只小鼠的脾细胞可以接种[/font][font=Calibri]30~50[/font][font=宋体]块[/font][font=Calibri]96[/font][font=宋体]孔细胞培养板。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]更多[url=https://cn.sinobiological.com/services/platform/hybridoma-development][b]杂交瘤开发平台[/b][/url]详情可以关注：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/platform/hybridoma-development[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=宋体]义翘神州：蛋白与抗体的专业引领者，欢迎通过百度搜索[/font][font=宋体]“义翘神州”与我们取得联系。[/font][/font][/b]

[font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/phage-display-antibody][b]噬菌体展示技术[/b][/url]是一种筛选技术，通过基因工程技术将外源蛋白或多肽的基因序列插入到噬菌体，进行多轮筛选，最终在体外获得具有高特异性和高亲和力的重组抗体。[/font][font=宋体][font=Calibri]1985[/font][font=宋体]年，[/font][font=Calibri]Smith[/font][font=宋体]首先发现外源[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]片段可以融合到非裂解丝状噬菌体[/font][font=Calibri]pIII[/font][font=宋体]外壳蛋白的编码基因上，并以融合蛋白的形式表达在病毒表面，而不影响噬菌体的传染性。随后，[/font][font=Calibri]Winter[/font][font=宋体]颠覆了噬菌体展示的过程，他使用噬菌体展示抗体（而不是蛋白质），然后找出与分子甚至细胞结合的目标抗体。噬菌体展示技术这一发明，为单克隆抗体药物的发现带来了巨大的改变。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]杂交瘤和噬菌体展示技术都属于重要的单克隆抗体制备技术。然而，每种方法都有其局限性，以下表格是两者的优势和缺点对比。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]噬菌体展示技术优缺点介绍：[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]优点：[/font][font=宋体]? 大规模生产[/font][font=宋体]? 周期快[/font][font=宋体]? 筛选过程易于控制[/font][font=宋体]? 易于筛选大量的不同克隆[/font][font=宋体]? 可直接筛选人类文库[/font][font=宋体]? 可用于筛选有毒抗原[/font][font=宋体][font=宋体]? 无免疫原性问题（对于[/font][font=Calibri]na?ve[/font][font=宋体]文库）[/font][/font][font=宋体]? 无克隆生存能力问题[/font][font=宋体]? 直接获得序列[/font][font=宋体][font=宋体]? 无动物使用（对于[/font][font=Calibri]na?ve[/font][font=宋体]文库）[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]缺点：[/font][font=宋体]?价格昂贵[/font][font=宋体][font=宋体]? [/font][font=Calibri]binders[/font][font=宋体]可能有较低的亲和力[/font][/font][font=宋体]? 技术更难[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]杂交瘤技术优缺点介绍：[/b][/font][font=宋体]优点：[/font][font=宋体]? 大规模生产[/font][font=宋体]? 高产量[/font][font=宋体]? 高特异性[/font][font=宋体]? 高灵敏度[/font][font=宋体]? 低成本[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]缺点：[/font][font=宋体]? 周期长[/font][font=宋体]? 需要人源化[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]基于噬菌体展示平台，义翘神州可为客户提供多种噬菌体展示文库构建和筛选服务，包括鼠源单克隆抗体、兔源单克隆抗体、鸡源单克隆抗体和全人源抗体等多个种属。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州噬菌体抗体库开发技术包括噬菌体展示抗体库构建、淘洗、单克隆鉴定和阳性克隆重组表达等步骤，利用灵活的筛选策略、多种筛选方法以及上清介入检测，筛选的成功率达到[/font][font=Calibri]90%[/font][font=宋体]，可根据客户的特殊需求构建不同物种的噬菌体抗体库，并提供全面高效的抗体发现服务。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]更多噬菌体展示技术和[url=https://cn.sinobiological.com/services/platform/phage-display][b]噬菌体抗体库技术平台[/b][/url]详情可以参看：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/phage-display-antibody[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/platform/phage-display[/font][/font]

（1）细胞核的分离： 将培养的细胞制成细胞混悬液，或以胰蛋白酶消化法于培养盖上收集培养细胞。应用MgSO4染色分离方法分离细胞核（Van den Engh et al 1986, 在Traok和Van Den Engh 34章　）。细胞混悬液浓度为5×106/ml。利用RNA酶消化后，使核从细胞分离，细胞核混悬液浓度为4～5×106细胞核/ml。（2）细胞固定和酸的处理：在5 ml试管内加冷的100%酒精不断旋转以达到满意的固定。在冰上停留10 min。在4 ℃离心（×150 g）10 min。重复加三次冷的100%酒精入试管内，离心，倾去。置于冰上10 min，再离心。然后加入相当核悬液1/2量的0.1 n HCl , 0.5% Triton X-100。室温停留10 min。加入IBM-0.25%Triton X-100（IBM配方：50 mmol/l KCl, 10 mmol/L MgSO4, 5 mmol/L HEPES pH8.0）。再离心，重复IBM漂洗（这时细胞核可在不染色情况下，以荧光显微镜观察）后，以2×SSC-0.1%Tween漂洗1×3min，继之加入等量2%的多聚甲醛在1×PBS-5 mmol/l MgSO4。在室温静置站立10min。倾去上清液，加IBm -Triton X-100漂洗，离心，使细胞核混悬液最终浓度为108/ml，（可用IBM-Triton X-100稀释约50倍，在血球计数器计数），混悬液镜检应含单个，完整的细胞核。（3）细胞核混悬液杂交①配制杂交混合液：甲酰胺5份，20×SSC1份，50%硫酸葡聚糖2份，pH调至7.0。此原液（stock solution）可贮存在4 ℃冰箱内。应用时加1份10 mg/ml鲱鱼精子DNA（herring sperm DNA）。②混合1 μl的细胞核混悬液（108/ml）与18μl的杂交混合液，充分混匀。将此19 μl混合液移入1.5 ml容积的Eppendorf 管中（核含量约为105）。③加入100 ng/每管的AAF标记DNA探针（如为生物素标记DNA探针浓度为20～40 ng/每管）。④置70 ℃10min使DNA探针和核DNA变性。⑤和组织切片与DNA探针杂交方法相较，不同的是在加热变性后切勿置冰上迅速冷却以终止反应，而应迅速转入37 ℃孵育过夜。（4）杂交后漂洗在每管中加入1.25 ml 50%甲酰胺-2×SSC（pH7.0），在42 ℃静置10～15min。偶尔旋转以助混匀。冷却至室温。加100 μl经dimethylsuberimidate(DEMS)处理的血细胞（107/ml）混匀，离心，室温，10min，轻弹试管使沉淀的小块散开，加入1.25 ml 2×SSC(pH7.0)，42 ℃，继之，静置于室温10～15min，如前离心，再加1.25 ml IBM-Triton X-100,室温静置5min，离心。注：DEMS处理红细胞方法：经漂洗并离心去除白细胞和血清的红细胞在盐液如PBS中，细胞含量为108/ml，以K2CO3和DEMS溶液处理3次，第1次：K2CO3为20 mmol/L,DEMS为3 mmol/L，以后2次：K2CO3依然为20 mmol/L，而DEMS为10 mmol/L。在应用前将K2CO3和DEMS液混合加入红细胞混悬液中。在最后2次漂洗液中，应用100 mmol/l K2CO3将pH调至9～10。在25 ℃，15min后，加入50 μl，100 mmol/l 的柠檬酸（citric acid）/每ml细胞混悬液的浓度以达固定红细胞的目的。固定的红细胞离心倾去上清液后，用2×SSC稀释到108/ml，加0.1%叠氮钠可在4 ℃保存至少1年。（5）AFF标记的荧光显示：加200 μl的PBS含0.05%Tween和2%正常血清（NGS），轻轻振荡混匀，室温静置10min，加20 μl 1：100的单克隆抗AFF抗体，37 ℃孵育45min，加1.25 ml的PBS-Tween，室温静置10min，加20间歇性振荡，离心，倾去上清液，加200 μlPBS含0.05%Tween –2%NGS,振荡，室温静置10min，加20 μl的羊抗小鼠–FITC荧光标记抗血清，稀释度1：100～1：300。孵育于37 ℃ 45min，加1.25 ml PBS –Tween,室温静置10min，离心，倾去上清液。（6）生物素标记探针的荧光显示：加200 μl 4×SSC含0.1%Trion X-100 和5%BSA。室温静置10 min后，加20 μl抗生物素标记FITC抗血清15 μg/ml，孵育在37 ℃ 30min，以1.5 ml 4×SSc –0.1% Trion X-100洗1次，加入1.25 ml IBm –Triton X-100,室温静置10～15min，间歇振荡、离心。（7）荧光显微镜观察：将细胞核混悬液稀释于250 μl的IBM-Trion X-100中，轻加振荡混匀。为抗荧光褪色可加等量的抗褪色溶液至载片上的细胞核涂片上，选择适当的激发波长观察。（8）流式细胞计：将750 μl的细胞核混悬液通过流式细胞仪（Flow cytometry, FCM），DEMS处理过的红细胞作为对照（Df 530/30nm, Omega ·Optical Inc, Brattleboro, VT）。

胚胎干细胞实验虽然具有很高的医疗价值，但也由于伦理问题而饱受争议。英国《每日邮报》7月23日报道，有关英国多家实验室正在进行人兽杂交胚胎干细胞实验的新闻于近日曝光，在政界和学界引起强烈反响。制造150多个杂交胚胎根据《每日邮报》目前掌握的数字，英国多家实验室在过去3年中一直秘密进行人兽杂交胚胎的实验，并且已经制造了150多个同时包含人类和动物基因的杂交胚胎。这些实验都是在《人类受精与胚胎学法案》颁布之后实施的，目的据称是为了通过胚胎干细胞的研究为多种疾病寻找有效的疗法。这一消息曝光后立即引起了英国社会的广泛关注。在英国议会质询会上了解到这一事件的议员阿尔顿勋爵表示，胚胎干细胞实验无论是从伦理上还是科学上都无法成功，而人兽杂交的干细胞胚胎实验更是无法容忍。“科学家对这一实验唯一能给出的解释是：如果你们让我们做下去的话，我们就会向你们证明它的疗效。但我认为这完全是感情上的敲诈。毕竟到目前为止，所有80种干细胞治疗方法全部来自成年人的干细胞，而不是胚胎干细胞。”是否正当引发争议英国公益组织“生殖伦理学评论”的约瑟芬·昆塔瓦莱告诉记者：“为什么他们要躲避公众的视线呢？如果他们所做的是正大光明的事情，我们也就根本不需要通过议会问询的方式才能了解真相了。”很多科学家“为了实验而实验”，这根本不是正确的科学态度。科学界的反应略有不同。罗宾·洛威尔·巴奇教授来自英国医学研究理事会的国家医学研究院，他认为，近期披露的人兽杂交胚胎实验并不足虑，因为根据相关法律，这些胚胎必须在创造后14天内销毁；相反，更值得人们警惕的是那种将人类基因植入动物胚胎体内的实验。2008年颁布的《人类受精与胚胎学法案》使多种杂交物种合法化，并赋予伦敦国王学院、华威大学等3所研究机构进行相关实验的权利。所有实验目前均因为经费不足而终止，但科学家相信这一领域具有光明的未来。（来源：现代快报）

随着对多种重要生物的大规模基因组测序工作的完成，基因工程领域又迎来了一个新的时代---功能基因组时代。它的任务就是对基因组中包含的全部基因的功能加以认识。生物体系的运作与蛋白质之间的互相作用密不可分，例如：DNA合成、基因转录激活、蛋白质翻译、修饰和定位以及信息传导等重要的生物过程均涉及到蛋白质复合体的作用。能够发现和验证在生物体中相互作用的蛋白质与核酸、蛋白质与蛋白质是认识它们生物学功能的第一步。 　　酵母双杂交技术作为发现和研究在活细胞体内的蛋白质与蛋白质之间的相互作用的技术平台，在近几年来得到了广泛运用。酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行的，研究活细胞内蛋白质相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能够通过报告基因的表达产物敏感地检测得到，它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术。大量的研究文献表明，酵母双杂交技术既可以用来研究哺乳动物基因组编码的蛋白质之间的互作，也可以用来研究高等植物基因组编码的蛋白质之间的互作。因此，它在许多的研究领域中有着广泛的应用。本文就酵母双杂交的技术平台和应用加以介绍。　　酵母双杂交系统的建立是基于对真核生物调控转录起始过程的认识。细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。反式转录激活因子，例如酵母转录因子GAL4在结构上是组件式的（modular），往往由两个或两个以上结构上可以分开，功能上相互独立的结构域（domain）构成，其中有DNA结合功能域(DNA binding domain,DNA-BD)和转录激活结构域（activation domain，DNA-AD）。这两个结合域将它们分开时仍分别具有功能，但不能激活转录，只有当被分开的两者通过适当的途径在空间上较为接近时，才能重新呈现完整的GAL4转录因子活性，并可激活上游激活序列（upstream activating sequence, UAS）的下游启动子，使启动子下游基因得到转录。　　根据这个特性，将编码DNA-BD的基因与已知蛋白质Bait protein的基因构建在同一个表达载体上，在酵母中表达两者的融合蛋白BD-Bait protein。将编码AD的基因和cDNA文库的基因构建在AD-LIBRARY表达载体上。同时将上述两种载体转化改造后的酵母，这种改造后的酵母细胞的基因组中既不能产生GAL4，又不能合成LEU、TRP、HIS、ADE，因此，酵母在缺乏这些营养的培养基上无法正常生长。当上述两种载体所表达的融合蛋白能够相互作用时，功能重建的反式作用因子能够激活酵母基因组中的报告基因HIS、ADE、LACZ、MEL1，从而通过功能互补和显色反应筛选到阳性菌落。将阳性反应的酵母菌株中的AD-LIBRARY载体提取分离出来，从而对载体中插入的文库基因进行测序和分析工作。在酵母双杂交的基础上，又发展出了　　酵母单杂交、酵母三杂交和酵母的反向杂交技术。它们被分别用于核酸和文库蛋白之间的研究、三种不同蛋白之间的互作研究和两种蛋白相互作用的结构和位点。　　基于酵母双杂交技术平台的特点，它已经被应用在许多研究工作当中。 1、利用酵母双杂交发现新的蛋白质和蛋白质的新功能　　酵母双杂交技术已经成为发现新基因的主要途径。当我们将已知基因作为诱饵，在选定的cDNA文库中筛选与诱饵蛋白相互作用的蛋白，从筛选到的阳性酵母菌株中可以分离得到AD-LIBRARY载体，并从载体中进一步克隆得到随机插入的cDNA片段，并对该片段的编码序列在GENEBANK中进行比较，研究与已知基因在生物学功能上的联系。另外，也可作为研究已知基因的新功能或多个筛选到的已知基因之间功能相关的主要方法。例如：Engelender等人以神经末端蛋白alpha-synuclein 蛋白为诱饵蛋白，利用酵母双杂交CLONTECH MATCHMARKER SYSTEM 3为操作平台，从成人脑cDNA文库中发现了与alpha-synuclein相互作用的新蛋白Synphilin-1，并证明了Synphilin-1与alpha-synuclein 之间的相互作用与帕金森病的发病有密切相关。为了研究两个蛋白之间的相互作用的结合位点，找到影响或抑制两个蛋白相互作用的因素，Michael等人又利用酵母双杂交技术和基因修饰证明了alpha-synuclein的1-65个氨基酸残基和Synphilin-1的349-555个氨基酸残基之间是相互作用的位点。研究它们之间的相互作用位点有利于基因治疗药物的开发。　　2、利用酵母双杂交在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用　　利用酶联免疫（ELISA）、免疫共沉淀（CO-IP）技术都是利用抗原和抗体间的免疫反应，可以研究抗原和抗体之间的相互作用，但是，它们都是基于体外非细胞的环境中研究蛋白质与蛋白质的相互作用。而在细胞体内的抗原和抗体的聚积反应则可以通过酵母双杂交进行检测。例如：来源于矮牵牛的黄烷酮醇还原酶DFR与其抗体scFv的反应中，抗体的单链的三个可变区A4、G4、H3与抗原之间作用有强弱的差异。Geert等利用酵母双杂交技术，将DFR作为诱饵蛋白，编码抗体的三个可变区的基因分别被克隆在AD-LIBRARY载体上，将BD-BAIT载体和每种AD-LIBRARY载体分别转化改造后的酵母菌株中，并检测报告基因在克隆的菌落中的表达活性，从而在活细胞的水平上检测抗原和抗体的免疫反应。　　3、利用酵母双杂交筛选药物的作用位点以及药 物对蛋白质之间相互作用的影响　　酵母双杂交的报告基因能否表达在于诱饵蛋白与靶蛋白之间的相互作用。对于能够引发疾病反应的蛋白互作可以采取药物干扰的方法，阻止它们的相互作用以达到治疗疾病的目的。例如：Dengue病毒能引起黄热病、肝炎等疾病，研究发现它的病毒RNA复制与依赖于RNA的RNA聚合酶（NS5）与拓扑异构酶NS3，以及细胞核转运受体BETA-importin的相互作用有关。研究人员通过酵母双杂交技术找到了这些蛋白之间相互作用的氨基酸序列。如果能找到相应的基因药物阻断这些蛋白之间的相互作用，就可以阻止RNA病毒的复制，从而达到治疗这种疾病的目的。　　4、利用酵母双杂交建立基因组蛋白连锁图（Genome Protein Linkage Map）众多的蛋白质之间在许多重要的生命活动中都是彼此协调和控制的。基因组中的编码蛋白质的基因之间存在着功能上的联系。通过基因组的测序和序列分析发现了很多新的基因和EST序列，HUA等人利用酵母双杂交技术，将所有已知基因和EST序列为诱饵，在表达文库中筛选与诱饵相互作用的蛋白，从而找到基因之间的联系，建立基因组蛋白连锁图。对于认识一些重要的生命活动：如信号传导、代谢途径等有重要意义。

鉴于本人还是零蛋一个,特发此贴,虽然得分不是最主要目的,但零分确实很让人难受啊!单克隆抗体的研制一、单克隆抗体的概念抗体是机体在抗原刺激下产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白。常规的抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的方法产生的，因而抗血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分。一般的抗原分子大多含有多个不同的抗原决定簇，所以常规抗体也是针对多个不同抗原决定簇抗体的混合物。即使是针对同一抗原决定簇的常规血清抗体，仍是由不同B细胞克隆产生的异质的抗体组成。因而，常规血清抗体又称多克隆抗体（polyclonal antibody），简称多抗。由于常规抗体的多克隆性质，加之不同批次的抗体制剂质量差异很大，使它在免疫化学试验等使用中带来许多麻烦。因此，制备针对预定抗原的特异性均质的且能保证无限量供应的抗体是免疫化学家长期梦寐以求的目标。随着杂交瘤技术的诞生，这一目标得以实现。1975年，Kohler和Milstein建立了淋巴细胞杂交瘤技术，他们把用预定抗原免疫的小鼠脾细胞与能在体外培养中无限制生长的骨髓瘤细胞融合，形成B细胞杂交瘤。这种杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征，既像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能无限地快速增殖且永生不死，又能像脾淋巴细胞那样合成和分泌特异性抗体。通过克隆化可得到来自单个杂交瘤细胞的单克隆系，即杂交瘤细胞系，它所产生的抗体是针对同一抗原决定簇的高度同质的抗体，即所谓单克隆抗体（monoclonal antibody），简称单抗。与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。单抗技术的问世，不仅带来了免疫学领域里的一次革命，而且它在生物医学科学的各个领域获得极广泛的应用，促进了众多学科的发展。Kohler和Milstein两人由此杰出贡献而荣获1984年度诺贝尔生理学和医学奖。二、杂交瘤技术（一） 杂交瘤技术的诞生淋巴细胞杂交瘤技术的诞生是几十年来免疫学在理论和技术两方面发展的必然结果，抗体生成的克隆选择学说、抗体基因的研究、抗体结构与生物合成以及其多样性产生机制的揭示等，为杂交瘤技术提供了必要理论基础，同时，骨髓瘤细胞的体外培养、细胞融合与杂交细胞的筛选等提供了技术贮备。1975年8月7日，Kohler和Milstein在英国《自然》杂志上发表了题为“分泌具有预定特异性抗体的融合细胞的持续培养”（Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity）的著名论文。他们大胆地把以前不同骨髓瘤细胞之间的融合延伸为将丧失合成次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（hypoxanthine guanosine phosphoribosyl transferase，HGPRT）的骨髓瘤细胞与经绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合。融合由仙台病毒介导，杂交细胞通过在含有次黄嘌呤（hypoxanthine，H）、氨基喋呤（aminopterin，A）和胸腺嘧啶核苷（thymidine，T）的培养基（HAT）中生长进行选择。在融合后的细胞群体里，尽管未融合的正常脾细胞和相互融合的脾细胞是HGPRT+，但不能连续培养，只能在培养基中存活几天，而未融合的HGPRT-骨髓瘤细胞和相互融合的HGPRT-骨髓瘤细胞不能在HAT培养基中存活，只有骨髓瘤细胞与脾细胞形成的杂交瘤细胞因得到分别来自亲本脾细胞的HGPRT和亲本骨髓瘤细胞的连续继代特性，而在HAT培养基中存活下来。实验的结果完全像起始设计的那样，最终得到了很多分泌抗绵羊红细胞抗体的克隆化杂交瘤细胞系。用这些细胞系注射小鼠后能形成肿瘤，即所谓杂交瘤。生长杂交瘤的小鼠血清和腹水中含有大量同质的抗体，即单克隆抗体。这一技术建立后不久，在融合剂和所用的骨髓瘤细胞系等方面即得到改进。最早仙台病毒被用做融合剂，后来发现聚乙二醇（PEG）的融合效果更好，且避免了病毒的污染问题，从而得到广泛的应用。随后建立的骨髓瘤细胞系如SP2/0-Ag14，X63-Ag8.653和NSO/1都是既不合成轻链又不合成重链的变种，所以由它们产生的杂交瘤细胞系，只分泌一种针对预定的抗原的抗体分子，克服了骨髓瘤细胞MOPC-21等的不足。再后来又建立了大鼠、人和鸡等用于细胞融合的骨髓瘤细胞系，但其基本原理和方法是一样的。（二） 基本程序和方法杂交瘤技术在具体操作上，各实验室使用的程序不尽一致。本节中介绍的方法是作者所在实验室采用的、实践证明成熟的程序，该程序适合国内大多数实验室。在开展杂交瘤技术制备单抗之前，培养骨髓瘤和杂交瘤细胞必须具备下列主要仪器设备：超净工作台、CO2恒温培养箱、超低温冰箱（-70℃）、倒置显微镜、精密天平或电子天平、液氮罐、离心机（水平转子，4000r/min）、37℃水浴箱、纯水装置、滤器、真空泵等。其需要的主要器械包括：100ml、50ml、25ml细胞培养瓶，10ml、1ml刻度吸管，试管，滴管（弯头、直头），平皿，烧杯，500ml、250ml、100ml盐水瓶，青霉素小瓶，10ml、5ml、1ml注射器等，96孔、24孔细胞培养板，融合管（50ml圆底带盖玻璃或塑料离心管），眼科剪刀，眼科镊，血细胞计数板，可调微量加样器（~50ul，~200ul，~1000ul），弯头针头，200目筛网，小鼠固定装置等。此外，杂交瘤细胞的筛选与检测的仪器设备，依据检测单抗的方法不同而各异，请参阅本节有关部分。淋巴细胞杂交瘤技术的主要步骤包括：动物免疫、细胞融合、杂交瘤细胞的筛选与单抗检测、杂交瘤细胞的克隆化、冻存、单抗的鉴定等，图6-1概括了淋巴细胞杂交瘤技术研制单抗的主要过程。1、动物免疫(1) 抗原制备 制备单克隆抗体的免疫抗原，从纯度上说虽不要求很高，但高纯度的抗原使得到所需单抗的机会增加，同时可以减轻筛选的工作量。因此，免疫抗原是越纯越好，应根据所研究的抗原和实验室的条件来决定。一般来说，抗原的来源有限，或性质不稳定，提纯时易变性，或其免疫原性很强，或所需单抗是用于抗原不同组分的纯化或分析等，免疫用的抗原只需初步提纯甚至不提纯，但抗原中混杂物很多，特别是如果这些混杂物的免疫原性较强时，则必须对抗原进行纯化。检测用抗原可以是与免疫抗原纯度相同，也可是不同的纯度，这主要决定于所用筛检方法的种类及其特异性和敏感性。(2) 免疫动物的选择 根据所用的骨髓瘤细胞可选用小鼠和大鼠作为免疫动物。因为，所有的供杂交瘤技术用的小鼠骨髓瘤细胞系均来源于BALB/c小鼠，所有的大鼠骨髓瘤细胞都来源于LOU/c大鼠，所以一般的杂交瘤生产都是用这两种纯系动物作为免疫动物。但是，有时为了特殊目的而需进行种间杂交，则可免疫其他动物。种间杂交瘤一般分泌抗体的能力不稳定，因为染色体容易丢失。就小鼠而言，初次免疫时以8-12周龄为宜，雌性鼠较便于操作。(3) 免疫程序的确定 免疫是单抗制备过程中的重要环节之一，其目的在于使B淋巴细胞在特异抗原刺激下分化、增殖，以利于细胞融合形成杂交细胞，并增加获得分泌特异性抗体的杂交瘤的机会。因此在设计免疫程序时，应考虑到抗原的性质和纯度、抗原量、免疫途径、免疫次数与间隔时间、佐剂的应用及动物对该抗原的应答能力等。没有一个免疫程序能适用于各种抗原。现用的免疫程序中多数是参照制备常规多克隆抗体的方法。表6-1列举了目前常用的免疫程序。免疫途径常用体内免疫法包括皮下注射、腹腔或静脉注射，也采用足垫、皮内、滴鼻或点眼。最后一次加强免疫多采用腹腔或静脉注射，目前尤其推崇后者，因为可使抗原对脾细胞作用更迅速而充分。在最后一次加强免疫后第3天取脾融合为好，许多实验室的结果表明，初次免疫和再次免疫应答反应中，取脾细胞与骨髓瘤细胞融合，特异性杂交瘤的形成高峰分别为第4天和第22天，在初次免疫应答时获得的杂交瘤主要分泌IgM抗体，再次免疫应答时获得的杂交瘤主要分泌IgG抗体。笔者体会阳性杂交瘤出现的高峰与小鼠血清抗体的滴度并无明显的平行关系，且多在血清抗体高峰之前。因此，为达到最高的杂交瘤形成率需要有尽可能多的浆母细胞，这在最后一次加强免疫后第3天取脾进行融合较适宜。已有人报道采用脾内免疫，可提高小鼠对抗原的免疫反应性，且节省时间，一般免疫3天后即可融合。

http://www.biomart.cn//upload/userfiles/image/2012/01/1325747024.jpg美国俄勒冈健康与科学大学的科学家们从6只猕猴的胚胎中提取出细胞并将其放入一个胚胎内，随后，将该胚胎移入一只代孕母猴的体内。多次流产后，代孕母猴终于诞下了健康的雄性双胞胎罗库（Roku）和赫克丝（Hex）。这两个名字分别来源于日语和希腊语，都是“六”的意思，表明这对“猴哥”有6个父母。研究将发表在1月20日出版的《细胞》杂志在线版上。据英国《每日邮报》1月5日报道，美国科学家利用6只猴子的基因，培育出了两只“怪异”的猴子。进行此项研究的科学家们表示，最新研究将有助于他们更深入地了解试管受精（IVF）和受孕过程；开展与干细胞有关的研究等；批评人士则认为此举不合伦理。俄勒冈健康与科学大学的科学家们从6只猕猴的胚胎中提取出细胞并将其放入一个胚胎内，随后，将该胚胎移入一只代孕母猴的体内。多次流产后，代孕母猴终于诞下了健康的雄性双胞胎罗库（Roku）和赫克丝（Hex）。这两个名字分别来源于日语和希腊语，都是“六”的意思，表明这对“猴哥”有6个父母。研究将发表在1月20日出版的《细胞》杂志在线版上。该研究的领导者、俄勒冈国家灵长动物研究中心的沙乌科莱特-米塔利波夫表示，罗库和赫克丝很健康，它们的出生也将为科学界开启更多的可能性，因为猴子的智力和生理属性更接近人类。这项技术将有助于科学家们更深入地了解试管受精（IVF）和受孕过程以及制造出人类器官等。“这些源于不同动物的细胞不会交融在一起，而是齐心协力制造出猴子的组织和器官，这会给科学界带来很多可能性。”科学家们刚开始试图使用实验室培育而成的胚胎干细胞在猴子的胚胎内培育―制造“杂交”老鼠采用的就是这种方法，但他们失败了。米塔利波夫解释道，显然，灵长类动物的胚胎能够阻止实验室培育而成的胚胎干细胞同它们整合在一起。这也说明，在实验室培育而成的灵长类和人类的胚胎干细胞（有些已在实验室呆了20年）可能并不如活体胚胎中的胚胎干细胞那么“给力”。这也将有助于胚胎干细胞领域的研究。米塔利波夫指出：“我们不能总是以老鼠为模型，如果我们想在干细胞领域继续取得进步，并让其从实验室走向临床实践领域，我们需要理解灵长类动物细胞的能力。”但是，这些“怪异”猴子的出世也引发了一些伦理争议，批评人士控诉科学家们罔顾动物的尊严，而且，他们也对该研究可能导致的后果深表担忧。比如，英国禁止活体解剖联盟（BUAV）就认为，这项研究“令人非常不安”。该组织的科学顾问捷若德-贝利表示：“尽管有些经过遗传修改的动物展示出了‘我们所期望’的特性，但实验会导致很多动物的死亡。这些猴子也确实展示出了‘令人感兴趣的’特征，然而，其也会在实验中遭遇严重的伤害。这是我们不愿看到的。”

从传统 的杂交炉，杂交箱里进行的northern杂交和southern杂交。经过方法改进如今，大大缩短了实验时间。（以下将详细说明）DNA导流杂交技术将带你进入杂交次世代。

[font=宋体][font=宋体]双特异性单克隆抗体[/font][font=Calibri]6ispecific Mcr'b[/font][font=宋体]即杂交的杂交瘤[/font][font=Calibri](hybrid hybridoma)[/font][font=宋体]是将杂交瘤与其他抗原免疫的脾细胞或另一种杂交瘤融合的结果。[/font][/font][b][font=宋体] [/font][font=宋体]什么是双特异性抗体？[/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]双特异性抗体（[/font] [font=Calibri]bispecific antibody[/font][font=宋体]，[/font][font=Calibri]BsAb[/font][font=宋体]，简称双抗）是指能同时特异性结合两个抗原或抗原表位的人工抗体。形象比喻，它就像一座连接[/font][font=Calibri]2[/font][font=宋体]个抗原（表位）的桥梁。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]双特异性抗体在自然条件下并不存在，而是通过细胞融合或重组[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]技术制备实现的。由于其特异性和双功能性，现已成为抗体工程领域的研究热点，在肿瘤治疗及自身免疫病等领域中具有广阔的应用前景。除此之外，双特异性抗体还被应用于治疗骨质疏松、血友病等其他领域。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]双特异性抗体的作用机制[/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体]双特异性抗体在抗肿瘤治疗中的主要作用机制是：[/font][font=宋体][font=宋体]（[/font][font=Calibri]1[/font][font=宋体]）招募[/font][font=Calibri]T[/font][font=宋体]细胞或自然杀伤细胞，并将它们重定向至肿瘤细胞，增强其对肿瘤细胞的杀伤力；[/font][/font][font=宋体][font=宋体]（[/font][font=Calibri]2[/font][font=宋体]）同时阻断发病进程中两个不同的信号传导通路而发挥独特或重叠的功能，影响肿瘤细胞的生长增殖及存活；[/font][/font][font=宋体][font=宋体]（[/font][font=Calibri]3[/font][font=宋体]）同时靶向细胞表面不同的抗原或表位，增强其与肿瘤细胞的特异性结合并直接杀伤肿瘤细胞。[/font][/font][b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]双抗[/font][font=Calibri]VS[/font][font=宋体]单抗，有何优势[/font][/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体]与普通单克隆抗体相比，双特异性抗体具有同时结合两种特异性表位或目的蛋白的功能，因此可以发挥特殊的功能起到单抗药物难以达到的生物学功能。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]例如，将效应细胞直接靶向肿瘤细胞以增强其细胞毒性、提高抗体选择性和功能性、共刺激或抑制受体。相对单抗，双抗具备更强特异性、靶向性，可以降低脱靶毒性；相较单抗的组合疗法，也可有效降低治疗成本等。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]但双抗药物开发复杂性和技术壁垒更高，对于技术平台和靶点选择的适配性要求也有所提高。[/font][b][font=宋体] [/font][font=宋体]双特异性抗体的制备方法[/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]（[/font][font=Calibri]1[/font][font=宋体]）化学偶联法：该方法于[/font][font=Calibri]1985[/font][font=宋体]年首次被使用，其原理是通过化学偶联剂将两个完全的单抗或[/font][font=Calibri]Fab2[/font][font=宋体]片段偶联成一种双特异性抗体。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]（[/font][font=Calibri]2[/font][font=宋体]）双杂交瘤融合法：将两种杂交瘤细胞通过细胞融合的方法，合成双杂交瘤细胞株，筛选出具有两种抗体功能的稳定靶细胞株。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]（[/font][font=Calibri]3[/font][font=宋体]）基因工程法：利用基因工程技术对抗体进行改造，从而形成多种形式的双特异性抗体。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州在重组抗体生产方面具有扎实的专业知识和经验，利用优化的成熟哺乳动物细胞表达平台，为您提供快速高效的[url=https://cn.sinobiological.com/services/bispecific-antibody-service][b]双特异性抗体表达服务[/b][/url]。从抗体序列开始，我们可以表达多种双特异性抗体形式，如[/font][font=Calibri]BiTE[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]Diabody[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]CrossMab[/font][font=宋体]和[/font][font=Calibri]DVD-IgG[/font][font=宋体]。更多详情可以关注：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/bispecific-antibody-service[/font][/font]

[font='calibri'][size=13px]单克隆抗体的制备过程及原理是什么？[/size][/font][font='宋体'][size=13px]义翘神州是一家抗体试剂和定制抗体的领先供应商，目前已成功交付了数以万计的抗体项目，客户涵盖科研院校、生物制药公司、诊断公司和其他生物技术公司等。[/size][/font][font='宋体'][size=13px]针对定制单克隆抗体，义翘神州提供了一套全面的解决方案。我们将与您通力合作，完成从抗原设计、纯化和抗体验证的完整过程。义翘神州拥有包括杂交瘤、噬菌体抗体库和单B细胞在内的抗体发现平台， 我们可根据您感兴趣的靶点、抗体应用和时间表等，来选择最合适的技术平台。 此外，义翘神州还提供ELISA、WB、流式细胞术、IHC、基于细胞的筛选、亲和力检测等多种表征和筛选技术，确保最终鉴定到最佳的抗体，以满足研究、诊断和治疗领域等应用。[/size][/font][font='宋体'][size=13px]单克隆抗体的制备原理：[/size][/font][font='宋体'][size=13px]单克隆抗体(MAb)是针专一的抗原决定簇产生的抗体，单克隆技术又名杂交瘤技术起源于1975年，由G.K?hler和Milstein创立。主要原理是利用产生抗体的B细胞与肿瘤细胞杂交融合成杂交瘤细胞，生产抗体。[/size][/font][font='宋体'][size=13px]单克隆抗体的制备过程：[/size][/font][font='宋体'][size=13px]1、免疫动物 免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞的 过程。[/size][/font][font='宋体'][size=13px]2、细胞融合 采用眼球摘除放血法处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液。[/size][/font][font='宋体'][size=13px]3、选择性培养 选择性培养的目的是筛选融合的杂交瘤细胞，一般采用HAT选择性培养基。[/size][/font][font='宋体'][size=13px]4、杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化 在HAT培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞，因此，必须进行筛选和克隆化。[/size][/font][font='宋体'][size=13px]5、单克隆抗体的大量制备 单克隆抗体的大量制备重要采用动物体内诱生法和体外培养法。[/size][/font][font='宋体'][size=13px][url=https://cn.sinobiological.com/services/monoclonal-antibody-production-services][b]单克隆抗体定制服务[/b][/url]推荐：https://cn.sinobiological.com/services/monoclonal-antibody-production-services[/size][/font]

目前，国内外最好的原位杂交仪，是什么品牌阿 ，大概价位是多少，原位杂交仪是杂交炉吗？

[font=宋体][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/monoclonal-antibody-technology][b]单克隆抗体技术[/b][/url]的基本原理是利用单一的[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞克隆培养出具有高度一致性的抗体组织。通过将能产生特定抗体的单一[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]淋巴细胞与骨髓肿瘤细胞进行融合，生成一种既能产生所需抗体，又能无限增殖的杂交瘤细胞。这种技术所得到的抗体仅来自一种类型的细胞，这与多克隆抗体或由多种类型细胞产生的多株抗体形成了鲜明对比。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]当前常见的单克隆抗体制备技术主要有杂交瘤、噬菌体抗体库和单个[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞技术。其中，杂交瘤技术是将免疫小鼠的[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞与骨髓瘤细胞融合，筛选具有特异性抗体分泌功能的杂交瘤细胞，进而生产纯化获得单克隆抗体。噬菌体抗体库技术是利用基因工程技术将抗体的基因连接到噬菌体中，并以融合蛋白的形式展示在噬菌体的表面，通过与靶蛋白的结合，完成噬菌体展示抗体的筛选。单个[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞技术是根据每个[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞只含有一对功能性的重链和轻链，每个[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞只产生一种特异性抗体的特性，可以直接从单个[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞中扩增抗体基因获得单克隆抗体。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]单克隆抗体技术流程[/b][/font][font=宋体]①杂交瘤技术制备单克隆抗体[/font][font=宋体]杂交瘤技术是经典的单克隆抗体制备技术，具体流程为：[/font][font=宋体][font=Calibri]1) [/font][font=宋体]抗原制备；[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]）动物免疫；[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]3[/font][font=宋体]）免疫动物的脾细胞与骨髓瘤细胞融合获得杂交瘤细胞；[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]4[/font][font=宋体]）筛选杂交瘤细胞获得分泌目标抗体的阳性单克隆杂交瘤细胞；[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]5[/font][font=宋体]）扩大培养阳性单克隆杂交瘤细胞；[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]6[/font][font=宋体]）单克隆抗体大量制备。（点击了解杂交瘤技术的操作步骤）[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州建立了杂交瘤开发技术平台，已成功开发了[/font][font=Calibri]19000[/font][font=宋体]株以上杂交瘤阳性克隆，可以根据客户的最终应用需求，制定个性化的抗原设计、动物免疫、克隆筛选及抗体鉴定方案，生产高质量的单克隆抗体，满足客户的不同需求。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]②噬菌体抗体库技术制备单克隆抗体[/b][/font][font=宋体][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/phage-display-antibody][b]噬菌体抗体库技术[/b][/url]也是一种制备单克隆抗体的方法。通常首先是从外周血或脾、淋巴结等组织中分离[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]淋巴细胞，提取[/font][font=Calibri]mRNA[/font][font=宋体]并反转录为[/font][font=Calibri]cDNA[/font][font=宋体]，以扩增所有的[/font][font=Calibri]VH[/font][font=宋体]和[/font][font=Calibri]VL[/font][font=宋体]片段。然后构建[/font][font=Calibri]Fab[/font][font=宋体]或[/font][font=Calibri]scFv[/font][font=宋体]等形式的抗体组合文库，使外源抗体基因表达的多肽以融合蛋白的形式展示在噬菌体外壳蛋白[/font][font=Calibri]pIII[/font][font=宋体]或[/font][font=Calibri]pVIII[/font][font=宋体]的[/font][font=Calibri]N[/font][font=宋体]端。 最后，经过“吸附[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]洗涤[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]扩增”过程筛选并富集特异性抗体。（点击了解噬菌体抗体库技术的操作步骤）[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]噬菌体抗体库开发平台包括噬菌体展示抗体库构建、淘洗、单克隆鉴定和阳性克隆重组表达等步骤，义翘神州能为客户提供个性化的抗体定制服务，包括鼠源单克隆抗体、兔源单克隆抗体、鸡源单克隆抗体和全人源抗体等多个种属的抗体发现服务。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][font=宋体]③单[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞抗体技术制备单克隆抗体[/font][/b][/font][font=宋体][font=宋体]单个[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞抗体技术是独立于杂交瘤技术和噬菌体展示技术的、新一代的单克隆抗体开发技术。其技术流程是从免疫动物组织或外周血中分离抗原特异性[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞，通过单细胞[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]技术从单个抗体分泌[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞中扩增[/font][font=Calibri]IgG[/font][font=宋体]重链和轻链可变区基因，然后在哺乳动物细胞内表达获得具有生物活性的单克隆抗体。该技术保留了轻重链可变区天然配对，具有基因多样性好、效率高和所需细胞数量少的优点。（点击了解单[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞技术的操作步骤）[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州拥有流式单[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞和[/font][font=Calibri]Beacon[/font][font=宋体]单[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞两大技术平台，可提供一站式的单[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞抗体制备服务，包括从免疫原制备到单个[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞分选、鉴定、及抗体生产等步骤。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]详情可以关注[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/monoclonal-antibody-technology[/font][/font][font=Calibri] [/font]

分子杂交仪又称“分子杂交炉”或“分子杂交箱”根据不同实验的需要可以选择不同的规格型号的杂交仪。是现代实验室采用杂交技术的理想设备，可替代塑料杂交袋和水浴摇床，并避免杂交袋破损带来污染危险。杂交炉采用微机控温精确，炉内空气循环装置设计独特，升温速度快等特点。　　广泛地使用于克隆基因的筛选、酶切图谱的制作、基因组中特定基因序列的定性、定量检测和疾病的诊断等方面。因而它不仅在分子生物学领域中具有广泛地应用,而且在临床诊断上的应用也日趋增多。file:///c:/DOCUME~1/ADMINI~1/APPLIC~1/360se6/USERDA~1/Temp/T0129F~1.JPG感觉就以烘箱有木有？

[font=宋体][b]单克隆抗体技术的基本原理[/b][/font][font=宋体][font=宋体]单克隆抗体（[/font][font=Calibri]monoclonal antibody, mAb[/font][font=宋体]）是由单一[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体。单克隆抗体在生物医学研究、疾病诊断和某些疾病治疗（如传染病和癌症）中是十分重要的工具。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]当前常见的[b][url=https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/monoclonal-antibody-technology]单克隆抗体制备技术[/url][/b]主要有杂交瘤、噬菌体抗体库和单个[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞技术。其中，杂交瘤技术是将免疫小鼠的[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞与骨髓瘤细胞融合，筛选具有特异性抗体分泌功能的杂交瘤细胞，进而生产纯化获得单克隆抗体。噬菌体抗体库技术是利用基因工程技术将抗体的基因连接到噬菌体中，并以融合蛋白的形式展示在噬菌体的表面，通过与靶蛋白的结合，完成噬菌体展示抗体的筛选。单个[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞技术是根据每个[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞只含有一对功能性的重链和轻链，每个[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞只产生一种特异性抗体的特性，可以直接从单个[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞中扩增抗体基因获得单克隆抗体。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]义翘神州拥有四大单克隆抗体开发平台，为客户提供多样化的抗体制备服务套餐，覆盖从抗原设计与制备、动物免疫到获得纯化抗体的完整流程，满足您的研究需求。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]一、杂交瘤技术制备单克隆抗体[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]杂交瘤技术是经典的单克隆抗体制备技术，具体流程为：[/font][font=宋体][font=Calibri]1) [/font][font=宋体]抗原制备；[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]）动物免疫；[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]3[/font][font=宋体]）免疫动物的脾细胞与骨髓瘤细胞融合获得杂交瘤细胞；[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]4[/font][font=宋体]）筛选杂交瘤细胞获得分泌目标抗体的阳性单克隆杂交瘤细胞；[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]5[/font][font=宋体]）扩大培养阳性单克隆杂交瘤细胞；[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]6[/font][font=宋体]）单克隆抗体大量制备。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州建立了杂交瘤开发技术平台，已成功开发了[/font][font=Calibri]19000[/font][font=宋体]株以上杂交瘤阳性克隆，可以根据客户的最终应用需求，制定个性化的抗原设计、动物免疫、克隆筛选及抗体鉴定方案，生产高质量的单克隆抗体，满足客户的不同需求。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]二、噬菌体抗体库技术制备单克隆抗体[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]噬菌体抗体库技术也是一种制备单克隆抗体的方法。通常首先是从外周血或脾、淋巴结等组织中分离[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]淋巴细胞，提取[/font][font=Calibri]mRNA[/font][font=宋体]并反转录为[/font][font=Calibri]cDNA[/font][font=宋体]，以扩增所有的[/font][font=Calibri]VH[/font][font=宋体]和[/font][font=Calibri]VL[/font][font=宋体]片段。然后构建[/font][font=Calibri]Fab[/font][font=宋体]或[/font][font=Calibri]scFv[/font][font=宋体]等形式的抗体组合文库，使外源抗体基因表达的多肽以融合蛋白的形式展示在噬菌体外壳蛋白[/font][font=Calibri]pIII[/font][font=宋体]或[/font][font=Calibri]pVIII[/font][font=宋体]的[/font][font=Calibri]N[/font][font=宋体]端。 最后，经过“吸附[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]洗涤[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]扩增”过程筛选并富集特异性抗体。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]噬菌体抗体库开发平台包括噬菌体展示抗体库构建、淘洗、单克隆鉴定和阳性克隆重组表达等步骤，义翘神州能为客户提供个性化的抗体定制服务，包括鼠源单克隆抗体、兔源单克隆抗体、鸡源单克隆抗体和全人源抗体等多个种属的抗体发现服务。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][font=宋体]三、单[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞抗体技术制备单克隆抗体[/font][/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]单个[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞抗体技术是独立于杂交瘤技术和噬菌体展示技术的、新一代的单克隆抗体开发技术。其技术流程是从免疫动物组织或外周血中分离抗原特异性[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞，通过单细胞[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]技术从单个抗体分泌[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞中扩增[/font][font=Calibri]IgG[/font][font=宋体]重链和轻链可变区基因，然后在哺乳动物细胞内表达获得具有生物活性的单克隆抗体。该技术保留了轻重链可变区天然配对，具有基因多样性好、效率高和所需细胞数量少的优点。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州拥有流式单[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞和[/font][font=Calibri]Beacon[/font][font=宋体]单[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞两大技术平台，可提供一站式的单[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞抗体制备服务，包括从免疫原制备到单个[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞分选、鉴定、及抗体生产等步骤。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]文章来源：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/monoclonal-antibody-technology[/font][/font]

[url=http://www.f-lab.cn/hybridization/traymix-s4.html][b]自动分子杂交仪[/b]traymix-s4[/url]是一种进口[b]分子杂交站[/b]和[b]分子杂交微混合器[/b]，采用主动混合中的混沌平流技术 Chaotic Advection technolog实现先进的[b]分子混合杂交仪[/b]。[b]自动分子杂交仪[/b]能够在整个杂交区域（21×60毫米）实现分子的均匀分散，从而得到最好的杂交效果。我们的专利技术-主动混合混沌平流专利技术能够使用 更少样本数量（5皮摩尔），并显著减少杂交时间 大大提高杂交效率，并且可以显著降低背景噪声，提高荧光信号强度，达到最佳杂交效果。我们主动混合混沌平 流专利消除了人为现象，如通常与其他系统一起观察到的死角或气泡，这样可以让使用者一开始就注意到问题，很快在杂交和清洗实验中取得成功，避免浪费时间。[img=自动分子杂交仪]http://www.f-lab.cn/Upload/traymix_s4_5_.jpg[/img][b]自动分子杂交仪[/b]是全自动化分子杂交站，可避免任何错误，能够确保用户获得可重复的结果。自动杂交站具有直观的和方便操作的软件WinTrayMix™ ，非常方便 用户使用，即使是非专业人员经过阅读手册后也可操作。生物学家可以使用一个简单明了的图形用户界面，输入各种的参数和杂交后的步骤：预杂交，杂交和多次清 洗。自动杂交清洗工作站为用户提供了两种操作模式，专家模式和常规模式。其中专家模式允许用户定制自己的方案，具有制定复杂实验进行多级杂交的可能性。这种模式 可用于实验室研究。常规模式可由医院和诊断实验室使用，在他们的诊断检测中的使用可靠的治疗方案。自动化杂交站TrayMix™ S4也可以用于变性操作。[b]自动分子杂交仪[/b]具有显著技术进步 :[list][*]减少微流体混合循环：250μL，以前系统中是513μL。这种减小允许使用更少的试剂和浓度增加的样品，与主动混合技术相结合，提高了杂交精确性（降低背景噪声和更高的斑点强度）。[*]温度调节改进（+/-0.1°C）[*]变性步骤具有可能性[*]与几个温度阶段杂交可在一个简单的方法（专家模式）进行设置。[/list]使用[b][b]自动分子杂交仪[/b][/b]用户可以提高应用的分析结果，如基因表达分析，基因分型，SNP基因分型，染色体异常和遗传性疾病的检测分析 结果，比较基因组杂交（CGH），荧光原位杂交（FISH）蛋白质芯片实验（如DNA /蛋白质相互作用，蛋白质/蛋白质相互作用）。[b][b]自动分子杂交仪[/b]特色[/b]自动化和主动混合 可获得一致和可重复结果减少每次分析的时间和成本[b]自动分子杂交仪[/b]参数外形尺寸：52.6x46.5x21cm重量：19kg处理能力：可单独处理或同时处理4个玻片杂交面积：21x60mm杂交容量： 杂交室60uL 微流体循环：250uL微流体系统： manifold +chamber+caplillaries, 兼容所有常用试剂并具有抗化学腐蚀功能采样量：5uL ~60uL温度范围：25~75°C (+/-0,1°C)编程控制软件：Windows XP， vista, windows7自动分子杂交仪：[url]http://www.f-lab.cn/hybridization/traymix-s4.html[/url]

[font=宋体][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/monoclonal-antibody-production][b]单克隆抗体[/b][/url]（[/font][font=Calibri]mAb[/font][font=宋体]）源于单一[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞克隆，具有高度的均一性和特异性，仅针对某一特定抗原表位。在生物医学研究、疾病诊断以及某些疾病治疗（如传染病和癌症）中单克隆抗体发挥着至关重要的作用。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]目前，制备单克隆抗体的主流技术包括[url=https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/hybridoma-technology][b]杂交瘤技术[/b][/url]、[url=https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/phage-display-antibody][b]噬菌体抗体库技术[/b][/url]和[url=https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/single-b-cell-technology][b]单个[/b][/url][/font][font=Calibri][url=https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/single-b-cell-technology][b]B[/b][/url][/font][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/single-b-cell-technology][b]细胞技术[/b][/url]。杂交瘤技术通过融合免疫小鼠的[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞与骨髓瘤细胞，筛选出能够特异性分泌抗体的杂交瘤细胞，进而生产并纯化得到单克隆抗体。噬菌体抗体库技术则利用基因工程技术，将抗体基因与噬菌体基因相连接，使抗体以融合蛋白的形式呈现在噬菌体表面，通过与靶蛋白的结合，筛选出具有特定亲和力的噬菌体展示抗体。而单个[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞技术则基于每个[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞仅含有一对功能性的重链和轻链，每个[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞仅产生一种特异性抗体的特性，直接从单个[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞中扩增抗体基因，从而获得单克隆抗体。[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]制备单克隆抗体的基本流程：[/font][/b][font=宋体][font=Calibri]1[/font][font=宋体]）抗原制备[/font][/font][font=宋体][font=宋体]一般来说，抗原可以是蛋白（天然蛋白或重组蛋白）、多肽、小分子等。依据需求选择和制备合适的免疫原对于抗体开发至关重要。义翘神州在蛋白抗原、多肽抗原制备积累了丰富的经验，可提供专业的抗原制备服务。另外，义翘神州还成功制备出[/font][font=Calibri]6000[/font][font=宋体]多种重组蛋白产品，可作为抗原用于动物免疫和抗体筛选，欢迎订购。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]）动物免疫[/font][/font][font=宋体][font=宋体]通常选用[/font][font=Calibri]Balb/c[/font][font=宋体]小鼠作为免疫动物，根据抗原的特性制定免疫方案，包括免疫抗原纯度、抗原量、免疫方法和途径等。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]免疫方法一般有常规免疫法、脾内一次性免疫法、短程免疫法和体外免疫法等，免疫途径主要有皮下注射、腹腔注射和静脉注射。脾内一次性免疫法具有用量少、免疫程序短、不加佐剂且所得单克隆抗体的特异性较高等特点。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]常规免疫周期如下：第一次免疫（抗原[/font][font=Calibri]+[/font][font=宋体]弗氏完全佐剂，皮下注射）、第二次免疫（抗原[/font][font=Calibri]+[/font][font=宋体]弗氏不完全佐剂，皮下注射）、第三次免疫（抗原[/font][font=Calibri]+[/font][font=宋体]不加佐剂，皮下或静脉注射）、第四次免疫（抗原[/font][font=Calibri]+[/font][font=宋体]不加佐剂，静脉注射）。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]3[/font][font=宋体]）细胞融合[/font][/font][font=宋体]细胞融合前准备：[/font][font=宋体][font=宋体]脾淋巴细胞制备：取已经免疫的[/font][font=Calibri]Balb/c[/font][font=宋体]小鼠的脾脏，制备淋巴细胞，通常每只小鼠可得[/font][font=Calibri]1x10^8-2.5x10^8[/font][font=宋体]个脾细胞；同时摘除眼球采血，并分离血清作为抗体检测时的阳性对照血清。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]骨髓瘤细胞制备：骨髓瘤细胞应该和免疫动物属于同一品系，便于细胞融合以及产生大量[/font][font=Calibri]Ab[/font][font=宋体]。融合前骨髓瘤细胞维持的方式，对成功得到杂交瘤非常重要。目的是使骨髓瘤细胞处于对数生长的时间尽可能长，融合前不能少于[/font][font=Calibri]1[/font][font=宋体]周；冻存的细胞在复苏后要生长[/font][font=Calibri]2[/font][font=宋体]周才能处于适合于融合的状态。[/font][/font][font=宋体]饲养细胞：常用的饲养细胞有胸腺细胞、正常脾细胞和腹腔巨噬细胞。饲养细胞促进杂交瘤细胞增殖的机制可能是释放非种属特异性的生长刺激因子，为杂交瘤细胞提供必要的生长条件；也可能是满足新生杂交瘤细胞对细胞密度的依赖性。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]细胞融合：细胞融合方法有病毒介导的细胞融合、聚乙二醇（[/font][font=Calibri]PEG[/font][font=宋体]）介导细胞融合、电融合。[/font][font=Calibri]PEG[/font][font=宋体]融合相邻骨髓瘤和[/font][font=Calibri]/[/font][font=宋体]或抗体分泌细胞的质膜，形成具有两个或更多核的单细胞。异核体保留这些核，直到核膜在有丝分裂前溶解。电融合通过施加脉冲电场连接相邻细胞的膜。电融合比[/font][font=Calibri]PEG[/font][font=宋体]更加有效，结果具有重现性。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]4[/font][font=宋体]）杂交瘤筛选以及单克隆鉴定[/font][/font][font=宋体][font=宋体]骨髓瘤细胞和脾细胞融合之后，由于细胞融合是随机的，因此要利用[/font][font=Calibri]HAT[/font][font=宋体]培养基筛选杂交瘤细胞。骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤－鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶（[/font][font=Calibri]HGPRT[/font][font=宋体]），对氨蝶呤钠敏感，在[/font][font=Calibri]HAT[/font][font=宋体]选择培养液中不能生长；免疫脾细胞虽然有[/font][font=Calibri]HGPRT[/font][font=宋体]，但不能在体外无限繁殖。因此只有融合的杂交瘤细胞，才能在[/font][font=Calibri]HAT[/font][font=宋体]选择培养液中无限繁殖。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]得到融合的杂交瘤细胞后，需要进一步筛选特异性抗体。将融合的细胞进行充分有限稀释，使分配到培养板的每一孔中的细胞数在[/font][font=Calibri]0[/font][font=宋体]至数个细胞之间（[/font][font=Calibri]30%[/font][font=宋体]的孔为[/font][font=Calibri]0[/font][font=宋体]才能保证每个孔中是单个细胞），培养后取上清液用[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]法选出抗体高分泌性的细胞，这一过程常被称作克隆化。将这些阳性细胞再进行克隆化，应用特异性抗原包被的[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]找出针对目标抗原的抗体阳性细胞株，增殖后进行冻存、体外培养或动物腹水培养。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]5[/font][font=宋体]）单克隆抗体大量制备[/font][/font][font=宋体]利用杂交瘤细胞大规模制备单克隆抗体主要有两种方式：体外培养法和腹水制备法。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]体外培养可以采用单层细胞培养的形式，也可以采用悬浮培养的形式。单层细胞培养法是各个实验室最常用的，是将杂交瘤细胞加入培养瓶中，用完全培养基培养，细胞浓度以[/font][font=Calibri]1.0X10^6~2.0X10^6[/font][font=宋体]个[/font][font=Calibri]/mL[/font][font=宋体]为宜，然后收集培养上清液。如果想在体外高效率地大量制备单克隆抗体，就必须高密度培养杂交瘤细胞，充分利用培养基的立体空间。单位体积内细胞数量越多，产生的单克隆抗体就越多，浓度就越高，产量就越大。义翘神州提供杂交瘤体外培养抗体生产服务，成功率[/font][font=Calibri]99%[/font][font=宋体]，可采用低血清或无血清培养基进行高密度悬浮培养，生产规模从毫克级到克级不等，满足客户的不同需求。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]腹水制备法是通过将杂交瘤细胞接种于小鼠腹腔内，并产生腹水，可得到大量的腹水单抗。这种方式能够在相对短的时间内获得大量高浓度的抗体，而且成本低、操作相对简单以及不需要复杂的培养条件。然而，这种方法也有一些限制，比如腹水中常混有小鼠的各种杂蛋白（包括[/font][font=Calibri]Ig[/font][font=宋体]），因此在很多情况下要提纯后才能使用，而且还有污染动物病毒的危险。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]单克隆抗体技术：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/monoclonal-antibody-technology[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]杂交瘤技术：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/hybridoma-technology[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=宋体]义翘神州：蛋白与抗体的专业引领者，欢迎通过百度搜索[/font][font=宋体]“义翘神州”与我们取得联系。[/font][/font][/b]

激光扫描共聚焦显微镜是近十年发展起来的医学图像分析仪器，与传统的光学显微镜相比，大大地提高了分辨率，能得到真正具有三维清晰度的原色图像。并可探测某些低对比度或弱荧光样品，通过目镜直接观察各种生物样品的弱自发荧光。能动态测量Ca2+ 、pH值，Na+、Mg2+等影响细胞代谢的各种生理指标，对细胞动力学研究有着重要的意义。同时激光扫描共聚显微镜可以处理活的标本，不会对标本造成物理化学特性的破坏，更接近细胞生活状态参数测定。可见激光扫描共聚焦显微镜是普遍显微镜上的质的飞跃，是电子显微镜的一个补充，现已广泛用于荧光定量测量，共焦图像分析，三维图像重建、活细胞动力学参数分析和胞间通讯研究等方面，在整个细胞生物学研究领域有着广阔的应用前景。1. 定量荧光测量ACAS可进行重复性极佳的低光探测及活细胞荧光定量分析。利用这一功能既可对单个细胞或细胞群的溶酶体，线粒体、DNA、RNA和受体分子含量、成份及分布进行定性及定量测定，还可测定诸如膜电位和配体结合等生化反应程度。此外，还适用于高灵敏度快速的免疫荧光测定，这种定量可以准确监测抗原表达，细胞结合和杀伤及定量的形态学特性，以揭示诸如肿瘤相关抗原表达的准确定位及定量信息。2. 定量共聚焦图像分析借助于ACAS激光共焦系统，可以获得生物样品高反差、高分辨率、高灵敏度的二维图像。可得到完整活的或固定的细胞及组织的系列及光切片，从而得到各层面的信息，三维重建后可以揭示亚细胞结构的空间关系。能测定细胞光学切片的物理、生物化学特性的变化，如DNA含量、RNA含量、分子扩散、胞内离子等，亦可以对这些动态变化进行准确的定性、定量、定时及定位分析。3. 三维重组分析生物结构ACAS使用SFP进行三维图像重组，SFP将各光学切片的数据组合成一个真实的三维图像，并可从任意角度观察，也可以借助改变照明角度来突出其特征，产生更生动逼真的三维效果。4. 动态荧光测定Ca2+、pH 及其它细胞内离子测定，利用ACAS能迅速对样品的点，线或二维图像扫描，测量单次、多次单色、双发射和三发射光比率，使用诸如Indo-1、BCECF 、Fluo-3等多种荧光探针对各种离子作定量分析。可以直接得到大分子的扩散速率，能定量测定细胞溶液中Ca2+对肿瘤启动因子、生长因子及各种激素等刺激的反应，以及使用双荧光探针Fluo-3和CNARF进行Ca2+和pH的同时测定。5. 荧光光漂白恢复（FRAP）——活细胞的动力学参数荧光光漂白恢复技术借助高强度脉冲式激光照射细胞某一区域，从而造成该区域荧光分子的光淬灭，该区域周围的非淬灭荧光分子将以一定速率向受照区域扩散，可通过低强度激光扫描探测此扩散速率。通过ACAS可直接测量分子扩散率、恢复速度，并由此而揭示细胞结构及相关的机制。6. 胞间通讯研究动物细胞中由缝隙连接介导的胞间通讯被认为在细胞增殖和分化中起非常重要的作用。ACAS可用于测定相邻植物和动物细胞之间细胞间通讯，测量由细胞缝隙连接介导的分子转移，研究肿瘤启动因子和生长因子对缝隙连接介导的胞间通讯的抑制作用，以及胞内Ca2+、PH和cAMP水平对缝隙连接的调节作用。7. 细胞膜流动性测定ACAS设计了专用的软件用于对细胞膜流动性进行定量和定性分析。荧光膜探针受到极化光线激发后，其发射光极性依赖于荧光分子的旋转，而这种有序的运动自由度依赖于荧光分子周围的膜流动性，因此极性测量间接反映细胞膜流动性。这种膜流动性测定在膜的磷脂酸组成分析、药物效应和作用位点，温度反应测定和物种比较等方面有重要作用。8. 笼锁-解笼锁测定许多重要的生活物质都有其笼锁化合物，在处于笼锁状态时，其功能被封闭，而一旦被特异波长的瞬间光照射后，光活化解笼锁，使其恢复原有活性和功能，在细胞的增值、分化等生物代谢过程中发挥功能。利用ACAS可以人为控制这种瞬间光的照射波长和时间，从而达到人为控制多种生物活性产物和其它化合物在生物代谢中发挥功能的时间和空间作用。9. 粘附细胞分选ACAS是目前唯一能对粘附细胞进行分离筛选的分析细胞学仪器，它对培养皿底的粘附细胞有两种分选方法： ① Coolie-CutterTM法，它是Meidian公司专利技术，首先将细胞贴壁培养在特制培养皿上，然后用高能量激光的欲选细胞四周切割成八角形几何形状，而非选择细胞则因在八角形之外而被去除，该分选方式特别适用于选择数量较少诸如突变细胞、转移细胞和杂交瘤细胞，即使百万分之一机率的也非常理想。 ② 激光消除法，该方法亦基于细胞形态及荧光特性，用高能量激光自动杀灭不需要的细胞，留下完整活细胞亚群继续培养，此方法特别适于对数量较多细胞的选择。10. 细胞激光显微外科及光陷阱技术借助ACAS可将激光当作“光子刀”使用，借此来完成诸如细胞膜瞬间穿孔、切除线粒体、溶酶体等细胞器、染色体切割、神经元突起切除等一系列细胞外科手术。通过ACAS光陷阱操作来移动细胞的微小颗粒和结构，该新技术广泛用于染色体、细胞器及细胞骨架的移动。

1891年10月，抗体（antibody）一词首次出现在保罗·埃尔利希公布的《免疫力的试验性研究》这篇文章中，德语的抗体"Antikörper"出现在该文章的结论部分。从此，科学家们开始了对抗体的探索和研究。二十世纪三四十年代，人们已经认识到抗体是一种蛋白质，并且可以识别抗原的空间结构。六十年代，罗德尼·罗伯特·波特和杰拉尔德·埃德尔曼揭示了抗体的化学结构，并因此获得1972年的诺贝尔生理学或医学奖。同一时期，人们发现了IgA, IgD, IgE等亚型的抗体。1975年，分子生物学家G.J.F.克勒和C.米尔斯坦建立杂交瘤技术，这是第一代单克隆抗体技术。他们把可在体外培养和大量增殖的小鼠骨髓瘤细胞与经抗原免疫后的纯系小鼠脾细胞融合，成为杂交细胞系，既具有瘤细胞易于在体外无限增殖的特性，又具有抗体形成细胞的合成和分泌特异性抗体的特点。基于杂交瘤的单克隆抗体技术一经问世，迅速被应用于疾病诊断，治疗等用途中，使用中人们发现，鼠源的单克隆抗体很容易在人体内产生免疫反应，随后，1988年，Greg Winter等人率先提出了人源化抗体的方法，解决了这一问题。这是第二代单克隆抗体技术。而近来流行的兔单克隆抗体，是一种新型的技术，它基于杂交瘤或者噬菌体展示技术，这种方法产生的抗体在保持特异性的同时，具有更高的亲和力和灵敏度，实际使用时，工作浓度更低，背景更低，用作免疫组化等用途时，有时甚至可以免去抗原修复的步骤。时至今日，抗体的生产技术已经非常成熟。单克隆抗体已经应用于临床诊断，肿瘤治疗，自身免疫病治疗等诸多方面，日渐成为治疗各种顽疾的终极武器。

题目：虎龙杂交斑良种培育及养殖技术(下)作者：张海发 杨宇晴 吴锦辉 刘苏 黄培卫 甘松永 黄锦雄期刊：科学养鱼链接：http://www.cqvip.com/QK/92435X/202402/7111671752.html

[font=宋体]单克隆抗体第一次筛选是制备过程中的关键步骤，涉及抗原特异性、抗体分泌量和细胞生长特性等多方面评估。通过精细操作和科学流程，确保筛选出特性优良的杂交瘤细胞株，为后续研究与应用奠定坚实基础。下面一起来看下[b]单克隆抗体第一次筛选的方法[/b]：[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]第一次筛选[/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]首先，在已免疫过的[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]淋巴细胞（即效应[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞）和骨髓瘤细胞进行杂交时，可能出现的情况应该先弄清楚。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]如果只考虑两两融合，可能的情况有：（效应）[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]淋巴细胞和（效应）[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]淋巴细胞的融合；（效应）[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]淋巴细胞和骨髓瘤细胞的融合（即杂交瘤细胞）；骨髓瘤细胞和骨髓瘤细胞的融合（即瘤瘤细胞）。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]第一类细胞在体外培养的条件下，因为无法无限增殖，最终死亡，因此，筛选的关键是限制第二类细胞的增殖。科学家在设计实验时，已经考虑到这方面问题，所以他们选择的瘤细胞是有遗传缺陷的，即胸腺嘧啶核苷激酶缺陷（[/font][font=Calibri]TK[/font][font=宋体]－）或者次黄嘌呤磷酸核苷转移酶（[/font][font=Calibri]HGPRT[/font][font=宋体]－）缺陷。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]筛选的目的：获得杂交瘤细胞。[/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=宋体]筛选的方法：[/font] [font=宋体]用选择性培养基来完成，即[/font][font=Calibri]HAT[/font][font=宋体]培养基。[/font][/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]加入次黄嘌呤（[/font][font=Calibri]H[/font][font=宋体]）、氨基喋呤（[/font][font=Calibri]A[/font][font=宋体]）及胸腺嘧啶核苷（[/font][font=Calibri]T[/font][font=宋体]）的培养基称[/font][font=Calibri]HAT[/font][font=宋体]培养基。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]其中，氨基喋呤可阻断[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]合成的主要途径。主要途径阻断后，依靠应急途径即在[/font][font=Calibri]HGPRT[/font][font=宋体]（次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶）和[/font][font=Calibri]TK[/font][font=宋体]（胸苷激酶）作用下，利用胸腺嘧啶和次黄嘌呤合成[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]，缺少其中一种，[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]合成不能发生。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]用于杂交的骨髓瘤细胞系均由经有毒药物诱导而成选择产生的代谢缺陷型细胞，细胞内均无[/font][font=Calibri]TK[/font][font=宋体]或[/font][font=Calibri]HGPRT[/font][font=宋体]，所以单个或融合骨髓瘤细胞在[/font][font=Calibri]HAT[/font][font=宋体]培养液中将死亡。[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞虽然有[/font][font=Calibri]HGPRT[/font][font=宋体]和[/font][font=Calibri]TK[/font][font=宋体]，但在体外通常培养条件下，尤其是在单个细胞环境下难于长期存活和增殖传代。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]因此，只有杂交瘤细胞才能在[/font][font=Calibri]HAT[/font][font=宋体]培养液中生长繁殖。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]即[/font][font=Calibri]:[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]①淋巴细胞：不能生长，[/font][font=Calibri]5[/font][font=宋体]到[/font][font=Calibri]7[/font][font=宋体]天死亡；[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]的主要合成途径被[/font][font=Calibri]A[/font][font=宋体]阻断。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]②骨髓瘤细胞：不能生长，[/font][font=Calibri]5[/font][font=宋体]到[/font][font=Calibri]7[/font][font=宋体]天死亡；[/font][font=Calibri]HGPRT[/font][font=宋体]缺乏，[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]合成的旁路途经受阻。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]③骨髓瘤细胞和脾细胞融合形成杂交瘤细胞，可长期生长繁殖。利用淋巴细胞的[/font][font=Calibri]HGRT[/font][font=宋体]将[/font][font=Calibri]H[/font][font=宋体]合成为嘌呤碱并最终与[/font][font=Calibri]T[/font][font=宋体]一起合成[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]从淋巴细胞获得产生某种抗体的遗传信息，从骨髓瘤细胞获得不断繁殖的能力。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]由于通过以上方法选择出杂交瘤细胞，虽然都是杂交瘤细胞，但可能是同一抗原的不同抗原决定簇刺激产生的。所以产生抗体是不纯的。如果不进一步提纯，这样得到的是多克隆抗体，所以，需要第二次筛选。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州提供[url=https://cn.sinobiological.com/services/hybridoma-culture-antibody-production-service][b]杂交瘤细胞培养及抗体生产服务[/b][/url]，可采用低血清或无血清培养基进行高密度体外培养，降低牛[/font][font=Calibri]IgG[/font][font=宋体]污染，是国内外客户优选的杂交瘤细胞生产抗体方案。详情可以关注：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/hybridoma-culture-antibody-production-service[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=宋体]义翘神州：蛋白与抗体的专业引领者，欢迎通过百度搜索[/font][font=宋体]“义翘神州”与我们取得联系。[/font][/font][/b]

[font=宋体][font=宋体]单克隆抗体（[/font][font=Calibri]Monoclonal antibodies[/font][font=宋体]，[/font][font=Calibri]mAb[/font][font=宋体]）是由[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞产生，并能特异性靶向抗原的免疫球蛋白。单克隆抗体不仅是生物化学、分子生物学和医学研究中必不可少的工具，其在临床治疗上的应用也以革命性的速度改进了多种疑难杂症的治疗方法。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1975[/font][font=宋体]年[/font][font=Calibri]Khler[/font][font=宋体]和[/font][font=Calibri]Milstein[/font][font=宋体]提出的杂交瘤技术（[/font][font=Calibri]Hybridoma technology[/font][font=宋体]），使得大量获得单克隆抗体成为可能，为基础研究及其临床应用提供了无限潜力。其他科学和技术进步也促进了单克隆抗体的发展、丰富了单克隆抗体的制备方法。 经过近[/font][font=Calibri]50[/font][font=宋体]年的发展，单克隆抗体制备方法不再局限于免疫小鼠的淋巴细胞术，噬菌体展示技术（[/font][font=Calibri]Phage display[/font][font=宋体]）、人源抗体转基因小鼠（[/font][font=Calibri]Human antibody-producing mice[/font][font=宋体]）和单[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞抗体技术（[/font][font=Calibri]Single B cell antibody technology[/font][font=宋体]）也都陆续登上舞台。这些方法虽然有各自的局限性，但都已广泛应用于单克隆抗体筛选。同时，这些技术都不完全是独立存在的，如果能充分利用各技术的优点，采用灵活的方法将各技术优化组合就能更加高效、快速地进行抗体开发。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体]一、杂交瘤技术[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]杂交瘤技术是一种将[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞与骨髓瘤细胞融合生产小鼠单克隆抗体的传统方法，是目前应用最广泛的单克隆生产技术。在这种技术中，首先收集免疫小鼠的[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]淋巴细胞，并将其与[/font][font=Calibri]BALB/c[/font][font=宋体]小鼠骨髓瘤细胞融合，从而形成永生化的杂交瘤细胞。然后筛选杂交瘤细胞，鉴定出能生产特异性抗体的单克隆细胞株。十几年后，[/font][font=Calibri]1988[/font][font=宋体]年，兔单克隆抗体制备方法首次被《[/font][font=Calibri]Science[/font][font=宋体]》杂志报道 [/font][font=Calibri][1][/font][font=宋体]。该研究使用小鼠[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]兔异种杂交瘤方法生产兔单克隆抗体，但鼠[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]兔异种杂交瘤细胞分泌抗体的效率较低、不稳定，且无法长时间分泌抗体。时间进展到[/font][font=Calibri]90[/font][font=宋体]年代中期，[/font][font=Calibri]1995[/font][font=宋体]年，《[/font][font=Calibri]PNAS[/font][font=宋体]》报道了能稳定生产兔单抗的兔[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]兔杂交瘤细胞。但兔杂交瘤细胞也被证明不如常规鼠杂交瘤细胞稳定，这大大阻碍了其实验室水平的广泛使用。并且，由于融合和转化效率低下，使用兔杂交瘤细胞生产单克隆抗体在应用推广中受到了极大的限制。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]经过多年发展及应用，杂交瘤技术作为一种成熟的产生鼠单克隆抗体的方法已被广泛应用于多种抗体的生产。然而，由于缺乏合适的骨髓瘤融合伴侣，杂交瘤技术一直局限于免疫啮齿动物。[/font][font=Calibri]20[/font][font=宋体]世纪[/font][font=Calibri]80[/font][font=宋体]年代，《[/font][font=Calibri]PNAS[/font][font=宋体]》报道了一种应用人杂交瘤技术生产治疗用抗体的文章 [/font][font=Calibri][3][/font][font=宋体]。利用该方法可以在无额外修饰的情况下产生天然的人源抗体，并用于临床治疗。随着融合伴侣和电融合技术的发展，人杂交瘤细胞融合成功率逐步增加，这将在未来促进治疗性抗体的开发。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体]二、噬菌体展示技术[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1990[/font][font=宋体]年开始，噬菌体展示技术被视为一种新的产生单克隆抗体的方法。这种方法是从淋巴细胞中收获抗体可变区基因（[/font][font=Calibri]V gene[/font][font=宋体]）全集，克隆[/font][font=Calibri]VHs[/font][font=宋体]和[/font][font=Calibri]VLs[/font][font=宋体]的组合并与外壳蛋白融合后表达于丝状噬菌体表面，然后筛选表达特异性抗体的噬菌体。与受限于啮齿动物的杂交瘤技术相比，噬菌体展示技术已经成功用于任何已知免疫球蛋白基因的物种中筛选和分离单克隆抗体。[/font][font=Calibri]2000[/font][font=宋体]年，[/font][font=Calibri]Rader[/font][font=宋体]等人首次介绍了应用噬菌体展示技术生产兔单克隆抗体的全过程。在这篇文章中，[/font][font=Calibri]Rader[/font][font=宋体]等人用噬菌体展示技术筛选和人源化的人[/font][font=Calibri]A33[/font][font=宋体]兔抗体，不仅对人[/font][font=Calibri]A33[/font][font=宋体]抗原有高特异性，且保留高亲和力。目前，噬菌体展示技术因为其高效、简便及体外控制在原核或真核系统中原则参数的能力正逐步成为生产治疗用抗体的重要技术平台。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]随着我们对抗体结构、功能和序列多样性研究的不断深入，除了原有的抗体库外，一种新的合成抗体库技术也在不断发展。例如，[/font][font=Calibri]HuCAL&Ylanthia[/font][font=宋体]文库中，为了使筛选出的人源抗体能更好的进行分子识别，将精确设计的序列插入抗原结合位点，并优化设计多种可变重链、轻链框架区域 [/font][font=Calibri][7-10][/font][font=宋体]。随着文库设计和筛选方法的不断进步，合成抗体文库将成为快速生产具有高特异性和高亲和力单克隆抗体不可或缺的工具。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体]三、人源抗体转基因小鼠[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1985[/font][font=宋体]年，[/font][font=Calibri]Alt[/font][font=宋体]等人首次提出将人抗体基因引入小鼠种系并使用转基因小鼠中产生人抗体的想法 [/font][font=Calibri][11,12][/font][font=宋体]。随着基因编辑技术的进步，使用人源抗体转基因小鼠生产人源化抗体已不再是天方夜谭。与其他技术相比，使用人源抗体转基因小鼠有许多优势，如无需人源化、具有更多的生物多样性，且由于体内成熟具有天然的亲和力。但是，人免疫球蛋白体量庞大对转基因小鼠抗体生产是一个巨大的挑战。为了克服这些困难，研究人员们通过使用不同策略已成功地获得转基因动物表达的人源抗体库，如全人源抗体小鼠和嵌合人源抗体小鼠等。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]四、单[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞抗体技术[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]虽然杂交瘤技术和噬菌体展示技术已经在单克隆抗体生产中广泛应用，但它们依然存在较难克服的缺点制约着抗体生产过程。近些年，为了克服杂交瘤技术细胞融合效率低，噬菌体展示技术导致重链、轻链的天然同源配对丢失等问题，单[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞抗体技术正被逐步开发和应用。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]简单来说，单[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞抗体技术包含以下几个步骤：[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]a.[/font][font=宋体]从外周血或免疫器官中初步提取淋巴细胞；[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]b.[/font][font=宋体]使用磁性活化细胞分选（[/font][font=Calibri]MACS[/font][font=宋体]）或荧光活化细胞分选（[/font][font=Calibri]FACS[/font][font=宋体]）技术鉴定和分离出特定的[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞；[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]c.[/font][font=宋体]将分离出的[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞进行单细胞培养；[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]d.[/font][font=宋体]使用逆转录聚合酶链式反应（[/font][font=Calibri]RT-[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]）和抗体特异性引物鉴定单[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞分泌抗体的特异性；[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]e.[/font][font=宋体]扩增特异抗体基因；[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]f.[/font][font=宋体]将抗体基因克隆到表达载体中，并在细菌或细胞系统中表达；[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]g.[/font][font=宋体]纯化表达产生的抗体，并用[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]等方法进行评估。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]单[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞抗体技术现在已广泛用于人和小鼠单克隆抗体生产，如一些治疗性中和单抗，可用于治疗多种疾病，包括癌症、自身免疫性疾病和传染性疾病亡[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]总结[/font][font=Calibri]4[/font][font=宋体]种方式制备单克隆抗体的优缺点[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/hybridoma-technology][b]杂交瘤技术[/b][/url]：[/font][font=宋体]优势：技术成熟、研发成本低[/font][font=宋体]劣势：周期长、融合率低、需要进行人源化[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]人源抗体转基因小鼠：[/font][font=宋体]优势：[/font][font=宋体]①可用杂交瘤技术获得人源抗体[/font][font=宋体]②良好的免疫原性[/font][font=宋体]③亲和力高[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]劣势：[/font][font=宋体]①存在免疫耐受[/font][font=宋体]②依然有鼠抗产生[/font][font=宋体]③难以免疫毒性抗原[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/phage-display-antibody][b]噬菌体展示技术[/b][/url]：[/font][font=宋体]优势：[/font][font=宋体]①基因来源灵活[/font][font=宋体]②随机库可以避免免疫耐受[/font][font=宋体]③可以灵活，特异得调整设计方案[/font][font=宋体]④可长时间保存[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]劣势：[/font][font=宋体]①重链轻链非天然配对[/font][font=宋体]②展示效率具有偏好性[/font][font=宋体]③需要再次进行功能验证[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]单[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞抗体技术：[/font][/font][font=宋体]优势：[/font][font=宋体]①无需杂交瘤融合[/font][font=宋体]②制备周期短[/font][font=宋体]③重链、轻链天然配对[/font][font=宋体]④无需合成基因[/font][font=宋体]⑤可直接获得各物种抗体[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]劣势：[/font][font=宋体]①需要新鲜样本[/font][font=宋体]②抗原特异性细胞比例低[/font][font=宋体]③操作环境要求严格[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]目前义翘神州提供[url=https://cn.sinobiological.com/services/monoclonal-antibody-production-services][b]单克隆抗体制备服务[/b][/url]，同时拥有流式单[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞分选平台、噬菌体抗体库技术平台、杂交瘤开发平台…… 可供大家选择，有需求或者了解具体详情可以查看[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/monoclonal-antibody-production-services[/font][/font][font=Calibri] [/font]

杂交试验中用于降低背景的封闭剂试剂用途Denhardt试剂Northern杂交使用RNA探针的杂交单拷贝序列的Southern杂交将DNA固定于尼龙膜上的杂交Denhardt试剂通常配制50×贮存液，过滤后保存于-20℃。可将该贮存液10倍稀释于预杂交液（常为含有0.5%SDS和100μg/ml经变性被打断的鲑精DNA的6×SSC或6×SSPE）中。50×Denhardt液中含5g聚蔗糖（Ficoll,400型，Pharmacia）、5g聚乙烯吡咯烷酮和5g牛血清白蛋白（组分V”Sigmal），加水至终体积为500ml。BLOTTOGrunstein-Hogness杂交Benton-Davis杂交除单拷贝序列Southern杂交以外的所有Southern杂交斑点印迹1×BLOTT（牛乳转移技术优化液，Bovine Lacto Transfer Technique Optimizer）,是含5%胶脂奶粉和0.02%叠氮钠的水溶液，应保存于4℃。使用前可用预杂交液稀释25倍。BLOTTO不应与高浓度的SDS并用，因为后者会导致牛奶中蛋白质析出。如果杂交背景不合要求，可在杂交液中加入NP-40至终浓度为1%。BLOTTO不能用作Northern杂交的封闭剂，因为这一封闭剂中可能含有RNA酶，其活性之高使人无法接受。注意：叠氮钠有毒性，取用时需戴手套小心操作。含叠氮钠的溶液应予明确标记。肝素Southern杂交

杂交水稻和许多优选粮食产品，从广义上来看，是不是也是“转基因”产品？现在说的“转基因”工程和杂交过程的产物究竟有哪些本质的不同？

1mg/ml的质粒（氯化钠制剂）稀释2倍后，做探针杂交，印记反而弥散开来，求大神指点（膜左边是样品原液和稀释2倍后的样品，右边是标准品）[img]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/08/201808010916534804_4574_3452368_3.jpeg[/img]

急购一台国产原位杂交仪，需要提供资料，价钱和试用期限联系bbfsun@126.com电话02137601298[em0805]