人羊膜细胞

【序号】：3【作者】：王旗杨晓双王达利【题名】：水凝胶三维培养对人羊膜间充质干细胞特性及旁分泌效应的影响【期刊】：中国组织工程研究. 【年、卷、期、起止页码】：2020,24(22)【全文链接】：https://kns.cnki.net/kcms2/article/abstract?v=3uoqIhG8C44YLTlOAiTRKibYlV5Vjs7i8oRR1PAr7RxjuAJk4dHXolTsDENRwhPKeOnmqJ5NL0dyWN9Jv0c-mr3uTFGiIOF7&uniplatform=NZKPT

【序号】：4【作者】：张玲【题名】：人羊膜间充质干细胞在短肽水凝胶中的三维培养研究【期刊】：遵义医科大学【年、卷、期、起止页码】：2018【全文链接】：https://kns.cnki.net/kcms2/article/abstract?v=3uoqIhG8C475KOm_zrgu4lQARvep2SAkWfZcByc-RON98J6vxPv10boq4HihnKPWSU_8voVzNJzXiGGM11x2ObOs18irVgbH&uniplatform=NZKPT

10月6日出版的新一期英国《自然》杂志刊登报告说，美国研究人员用人类卵细胞培养出了胚胎干细胞，虽然这项成果还存在一些缺陷，但已是“黄禹锡造假事件”后最接近培养出正常人类胚胎干细胞的成果。这一成果可能引起有关克隆问题的新一轮大争论。http://www.bioon.com/biology/UploadFiles/201110/2011100911202350.jpg（图片来自原文）将体细胞中的遗传物质植入卵细胞中，将其培育成为胚胎干细胞甚至最终培养出新的个体，就是常说的克隆技术，著名的克隆羊“多利”就是用这种技术得到的。2004年，韩国研究人员黄禹锡曾宣称用这种方法培育出了人类胚胎干细胞，引起一时轰动，但后来证明这是一起造假事件。此后，许多科研人员都进行了这方面的尝试，但一直没有成功。相关研究面临的障碍是，如果先将人类卵细胞中的遗传物质去掉，再植入另一个体细胞的遗传物质，这样得到的卵细胞分裂几次后就会停止发育。而美国纽约干细胞基金实验室等机构的研究人员报告说，如果留下一部分原有卵细胞中的遗传物质，再另外加上体细胞的部分遗传物质，这样得到的卵细胞可以发育到具有70至100个细胞的囊胚阶段，达到可以提取胚胎干细胞的阶段。胚胎干细胞具备发育成各种组织和器官的潜力，如果能够培育出人类胚胎干细胞，就意味着能够培育出属于某个人自己的组织和器官，可用于个性化的医疗。当然这也会引起有关克隆人的争议。本次研究虽然能够培育出人类胚胎干细胞，但也存在一些缺陷。最重要的是这些细胞中存在3组染色体，即卵细胞原有的1组染色体和来自体细胞的2组染色体，而正常的人类细胞只有2组染色体。因此，这种人类胚胎干细胞还不具备实用性。但是《自然》杂志同时发表的社论指出，这是自“黄禹锡造假事件”后最接近培养出可用人类胚胎干细胞的成果，在大方向上证明这仍然是一条可行的道路。社论认为，这将引起新一轮的有关克隆人的大争论，甚至提出联合国有必要开始考虑制订监管克隆的规章制度。

【序号】：1【作者】：范艳艳王娜徐文【题名】：新鲜羊膜对兔宫腔黏连的预防作用及对子宫内膜容受性的改善作用【期刊】：吉林大学学报(医学版). 【年、卷、期、起止页码】：2021,47(04)【全文链接】：https://kns.cnki.net/kcms2/article/abstract?v=PN9vNVFTqfd6Gy_nqUYC6uIlTiMvGnsFqGXv9KofFTgOFNfj4hU2NVV9vYYxDUDWCcHszEUbsLp4ulEt3g-FczAP3dA92ZgGninGD29kAkmC9nqU-z-OY0Snig8aqbvfOpCCc48rb-tB8AO3hgxWTw==&uniplatform=NZKPT&language=CHS

中国科技网讯 据物理学家组织网近日报道，美国麻省理工学院和佐治亚理工学院研究人员开发出利用机器人操纵来自动发现和记录活体大脑中神经元信息的方法，即用一种全细胞膜片钳制动一个微小的空心玻璃针，在神经细胞的膜上开孔，以记录其内部电活性。该研究成果刊登在5月6日《自然·方法》期刊上。 这种深入大脑中神经元内部运作的方式可提供大量有用的信息，如电活性模式、细胞内部状况、甚至基因在某一时刻被闭合的剖面。然而，能够实现这个入口非常困难，目前世界上只有极少数实验室在进行尝试，这种自动发现和记录活体大脑中神经元信息的最新方法有望改变该领域研究现状。研究人员证明，在一个细胞检测的计算机程序的引导下，与人工相比，该自动装置识别和记录活老鼠大脑中的神经元信息具有更好的精度和速度。 采用新型自动化装置消除了对活体细胞的活动进行数月定向和长期搜索的需要。采用这种技术，科学家可将大脑中数千个细胞划分成不同类型，还可绘制其彼此之间的连接，并从正常细胞中找出病变细胞。 研究人员称，该方法在研究大脑疾病方面将会尤其有用，如精神分裂症、帕金森氏症、自闭症和癫痫。科学家们一直难以描述这些疾病中一个细胞与其具有电活回路和性能的分子集成。描绘出疾病如何改变活体大脑内特定细胞分子，将会更好地发现药物的靶标。 如果通过人工对这种精密仪器进行操作，需花上4个月的训练时间，最终还可能不是很精准，于是研究人员将这项任务交与机器人来操作，其机械手臂由计算机程序做指导。研究人员说，在神经科学中使用机器人来研究有生命的动物还仅仅是个开始，而像这样的机器人可能被用于在大脑中有目标点地注入药物，或提供基因治疗载体，希望新方法也能激励神经学家追求各类机器人自动化，例如在光遗传学方面，利用光有针对性地干扰神经回路和确定神经元在大脑功能中发挥的因果作用。(记者 华凌) 《科技日报》（2012-05-11 二版）

大规模动物细胞培养的问题及对策动物细胞培养开始于本世纪初，到1962年规模开始扩大，发展至今已成为生物、医学研究和应用中广泛采用的技术方法，利用动物细胞培养生产具有重要医用价值的酶、生长因子、疫苗和单抗等，已成为医药生物高技术产业的重要部分。由于动物细胞体外培养的生物学特性、相关产品结构的复杂性和质量以及一致性要求，动 物细胞大规模培养技术仍难于满足具有重要医用价值生物制品的规模生产的需求，迫切需要进一步研究和发展细胞培养工艺。目前，世界众多研究领域集中在优化细胞培养环境、改变细胞特性、提高产品的产率并保证其质量和一致性上。1.细胞培养环境细 胞培养环境中抑制因素的积聚是提高细胞密度的主要限制因素。体外动物细胞培养中氨离子的积累是抑制细胞生长的主要因素之一。氨的积聚使细胞内UDP氨基己 糖(UDP-N-乙酰葡糖胺和UDP-N-乙酰半乳糖胺)增加，影响细胞的生长及蛋白的糖基化过程。氨抑制Gln代谢途径，使Asp和Glu消耗增加。细胞消耗Asp增加，可能是细胞线粒体膜上苹果酸－天冬氨酸泵转运NADH加快，使细胞维持糖酵解途径的需要。Asp消耗增加可能会从Gln代谢多经天冬氨 酸转氨酶途径而不是丙氨酸转氨酶或谷氨酸脱氢酶途径得以补偿。氨来源于两方面：一是直接来源于培养基，一是细胞代谢所产生。但两者都涉及谷氨酰胺，因此需要防止培养基中Gln自然分解，限制Gln用量，并尽量去除培养基中的氨。乳酸是细胞糖代谢的产物。高浓度乳酸会抑制乳酸脱氢酶(LDH），从而减少乳酸产生。LDH受抑制后阻止了NADH向NAD的再生及其偶联的丙酮酸/乳酸转 换，从而导致NADH[font=T

[img]http://www.instrument.com.cn/bbs/images/affix.gif[/img][url=http://www.instrument.com.cn/bbs/download.asp?ID=123451]大规模动物细胞培养[/url]动物细胞培养开始于本世纪初，到1962年规模开始扩大，发展至今已成为生物、医学研究和应用中广泛采用的技术方法，利用动物细胞培养生产具有重要医用价值的酶、生长因子、疫苗和单抗等，已成为医药生物高技术产业的重要部分。由于动物细胞体外培养的生物学特性、相关产品结构的复杂性和质量以及一致性要求，动物细胞大规模培养技术仍难于满足具有重要医用价值生物制品的规模生产的需求，迫切需要进一步研究和发展细胞培养工艺。目前，世界众多研究领域集中在优化细胞培养环境、改变细胞特性、提高产品的产率并保证其质量和一致性上。

组织材料若来自血液、羊水、胸水或腹水的悬液材料，最简单的方法是采用1000r/min的低速离心10分钟，若悬液量大，可适当延长离心时间，但速度不能太高，延时也不能太长，以避免挤压或机械损伤细胞，离心沉淀用无钙、镁PBS洗两次，用培养基洗一次后，调整适当细胞浓度后再分瓶培养，若选用悬液中某些细胞，常采用离心后的细胞分层液，因为，经离心后由于各种细胞的比重不同可在分层液中形成不同层，这样可根据需要收获目的细胞。不同比重的分层液的配制和具体分离方法详见淋巴细胞分离培养的章节。　　　　实体组织材料的细胞分离方法　　　　对于实体组织材料，由于细胞间结合紧密，为了使组织中的细胞充分分散，形成细胞悬液，可采用机械分散法(物理裂解)和消化分离法。　　　　(一)机械分散法　　　　所取材料若纤维成分很少，如脑组织，部分胚胎组织可采用剪刀剪切、用吸管吹打分散组织细胞或将已充分剪碎分散的组织放在注射器内(用九号针)，使细胞通过针头压出，或在不锈钢纱网内用钝物压挤(常用注射器钝端)使细胞从网孔中压挤出。此法分离细胞虽然简便、快速，但对组织机械损伤大，而且细胞分散效果差。此法仅适用于处理纤维成分少的实验室试剂软组织。　　　　(二)消化分离法　　　　组织消化法是把组织剪切成较小团块(或糊状)，应用酶的生化作用和非酶的化学作用进一步使细胞间的桥连结构松动，使团块膨松，由块状变成絮状，此时再采用机械法，用吸管吹打分散或电磁搅拌或在摇珠瓶中振荡，使细胞团块得以较充分的分散，制成少量细胞群团和大量单个细胞的细胞悬液，接种培养后，细胞容易贴壁生长。　　　　1、酶消化分离法　　　　酶消化分离法常采用胰蛋白酶和胶原酶，其分离方法如下：　　　　(1)胰蛋白酶分散技术　　　　胰蛋白酶(简称胰酶)是广泛应用的消化剂。胰蛋白酶是一种胰脏制品，对蛋白质有水介作用，主要作用于赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，使细胞间质中的蛋白质水介而使细胞分散开，在常用人血清 AB的蛋白酶中由于产品的活力和纯度不同，对细胞的消化能力也不同，胰蛋白酶对细胞的作用，取决于细胞类型、酶的活力、配制的浓度、消化的温度、无机盐离子、pH以及消化时间的长短等。　　　　①细胞类型胰蛋白酶适于消化细胞间质较少的软组织,能有效地分离肝、肾、甲状腺、羊膜、胚胎组织、上皮组织等。而对含结缔组织较丰富的组织,如乳腺、滑膜、子宫、纤维肉瘤、肿瘤组织等就无效，但若与胶原酶合用,就能增加其对组织的分离作用。　　　　②酶的活力市售的胰蛋白酶,其活力都经过测定而有效，但配制时必须新鲜，需保存在低温冰箱中，消化时的pH和温度都要适宜，否则会影响活力，细胞的分散直接与酶的活力有关，最终使用活力为1:200或1:250，56℃pH8.0时活力最强。　　　　该酶为粉剂，保藏时要防潮，室内温度不宜过高，保存时间不能太长，若粉剂结团块,说明该部分受潮或失效。　　　　③酶的浓度胰蛋白酶一般采用的浓度为0.1%-0.25%(活力1:200或1:250),但遇到难消化的组织时，浓度可适当提高，消化时间适当延长。浓度高对细胞有毒性，而较低浓度的胰蛋白酶在培养液中可促进细胞的增殖，若培养液中加入血清，其少量胰蛋白酶可被血清中抗胰蛋白酶因子所清除。　　　　④温度一般认为胰蛋白酶在56℃时活性最强，但由于对细胞有损害而不能被采用，常使用的温度为37℃，通常在37℃进行消化比室温作用快。　　　　⑤pHpH8~pH9是胰蛋白酶活力适宜范围，但随碱性的增加其活力也随之减少，活性强分散快，细胞也容易被消化下来，消化分离细胞时PH只能选用7.6～8.0之间，否则对细胞有损伤。　　　　⑥无机盐离子若用含有钙和镁的盐类溶液来配制胰蛋白酶时，可以发生抑制胰蛋白的消化作用。因此,在配制时应采用无钙镁离子的PBS配制。　　　　⑦消化时间如果细胞消化时间过长，可以损害细胞的呼吸酶，从而影响细胞的代谢，一般消化时间为20分钟为宜，冷消化时使用低浓度消化液，于4℃过夜也可。　　　　分离方法如下：　　　　①过夜冷消化将取得的组织用Hanks液洗三次，剪成碎块大小为4毫米左右，用Hanks液洗2~3次以除去血球和脂肪组织，再加入0.25%的胰蛋白酶，摇匀后放4℃过夜，次日再用Hanks液洗涤，弃去上清，共洗2~3次，然后，加入少量营养液吹打分散，细胞计数，按适当的浓度分瓶培养。　　　　②多次提取消化法多次提取消化法有以下三种：　　　　热消化多次提取将剪碎的细胞块加入0.25%胰蛋白酶37℃水浴中消化15~20分钟，然后经洗涤后用营养液分散制成细胞悬液，按合适的浓度分瓶培养，然后将留下的未彻底消化的组织按上述方法操作，再消化提取细胞。　　　　冷消化多次提取方法同上，只是消化温度为4℃。　　　　先热消化后冷消化将组织块先用胰蛋白酶于37℃下消化20分钟经洗涤后用营养液分散，制成悬液，剩余未消化的小组织块经洗涤后用胰酶于4℃下过夜，次日再提取细胞，分散成悬液，分瓶培养。　　　　(2)胶原酶(Collagenase)消化法　　　　胶原酶是一种从细菌中提取出来的酶，对胶原有很强的消化作用。适于消化纤维性组织、上皮组织以及癌组织，它对细胞间质有较好的消化作用，对细胞本身影响不大，可使细胞与胶原成分脱离而不受伤害。该酶分离效果好，即使有钙、镁离子存在仍有活性，故可用PBS和含血清的培养液配制，即操作简便又可提高细胞成活率，最终浓度200u/mL或0.1～0.3mg/mL。细胞培养此酶消化作用缓和，无需机械振荡，但胶原酶价格较高，大量使用将增加实验成本。　　　　经过胶原酶消化后的上皮组织，由于上皮细胞对酶有耐受性，可能有一些上皮细胞团块尚未被完全消化开。成小团块的上皮细胞比分散的单个上皮细胞更易生长，因此不必要再进一步消化处理。　　　　鉴于胰蛋白酶和胶原酶的生物学活性和在不同浓度下消化各种组织小块所需的时间(小时)有差异，以及两者价格不等，有人采用胶原酶与胰蛋白酶并用，同时还可加透明质酸酶(对细胞表面糖基有作用)，采用两者的联合消化作用，对分散大鼠和兔肝、癌组织非常有效。　　　　除上述两种最常用的消化酶外，还有链霉蛋白酶、粘蛋白酶、蜗牛酶、弹性蛋白酶、木瓜蛋白酶，近年来，还有一种从灰霉菌中提取的Pronase新酶分散细胞更佳。　　　　2、非酶消化法(EDTA消化法)　　　　EDTA是一种非酶消化物，又称螯合剂或Versene，全名为乙烯二胺四乙酸。常用不含钙、镁离子的PBS配成0.02%的工作液，对一些组织，尤其是上皮组织分散效果好，该化学物质能与细胞上的钙、镁离子结合形成螯合物，利用结合后的机械力使细胞变圆而分散细胞或使贴壁细胞从瓶壁上脱离，缺点是细胞易裂解或贴壁细胞从瓶壁上脱离时呈片状，有团块，常不单独使用，但可与胰蛋白酶混合使用(1:1或2:1)，不仅利于细胞脱壁又利于细胞分散，可降低胰酶的用量和毒性作用。　　　　消化分离法的操作步骤：　　　　(1)剪切把组织块剪碎，呈1~5mm3大小的组织块。　　　　(2)加液漂洗将碎组织块在平皿(或三角烧瓶)中用无钙镁PBS洗2-3次(采用倾斜，自然沉降法)。　　　　(3)消化加入消化液(胰蛋白酶或胶原酶或EDTA)于37℃水浴中作用适当时间(中间可轻摇1~2次)，若组织块膨松呈絮状可终止，若变化不大可更换一次消化液，继续消化直至膨松絮状为止。胰蛋白酶消化时间不宜过长。　　　　(4)弃去消化液采用倾斜自然沉降或低速离心法尽量弃去消化液。　　　　(5)漂洗将含有钙、镁离子的培养基沿瓶壁缓缓加入，中止消化反应，采用漂洗法洗2-3次后，加入完全培养基。　　　　(6)机械分散采用吸管吹打或振荡法，使细胞充分散开后用纱网或3~4层无菌纱布过滤后分瓶培养，若要求不高可采用倾斜自然沉降5~10分钟，吸上层细胞悬液进行分瓶培养。

肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是发病率高、治疗困难、死亡率高的恶性肿瘤，全球每年有1000000人死于肝癌。我国肝癌的死亡率在所有恶性肿瘤中居第二位，年死于肝癌的人数占全世界肝癌年死亡总数的53%。虽然肝癌的诊断和治疗有了长足的进步，但生存率在总体水平上变化不是很明显。迄今已建立的一系列人肝癌细胞系（cell line）和人肝癌细胞系的动物模型，为肝癌的发病机理和治疗研究奠定了良好的基础。咱们坛子里是否有做这方面工作的战友，分享一下相关文献。[img]http://www.instrument.com.cn/bbs/images/affix.gif[/img][url=http://www.instrument.com.cn/bbs/download.asp?ID=122088]人肝癌细胞系研究进展[/url]

细胞在体外进行培养，失去了机体的调节和控制。因此，除满足营养的要求外，还必须使细胞生存环境尽量接近活体的环境。外环境的培养条件如温度、渗透压、酸碱度等均能影响细胞的生长。 一、温度 一般哺乳类及禽类细胞体外培养的适宜温度是37~38℃。温度过高或过低都会影响到细胞的生长。细胞耐受低温的能力比抗热的能力强，在低温下，细胞的代谢活力及核分裂降低。温度不低于0℃时，虽影响细胞代谢，但并无伤害作用；把细胞置于25～35℃时，细胞仍能生存和生长，但速度减缓；放在40℃数小时后，再置回37℃培养细胞仍能继续生长。但如果在40℃下暴露时间太长，对细胞生长不利，甚至变圆脱落于瓶壁。若温度过低，在降到冰点以下时，细胞因胞外水和胞质结冰而受损死亡。但若向培养液中加入甘油或二甲亚砜等保护剂，封入安瓿中后，置于液氮中，可起保护作用，此时细胞可耐受-70℃以下温度，能长期储存，解冻后细胞复苏，仍能继续生长增殖，细胞生物性状不受任何影响。此为保存细胞的主要手段。 高温对细胞培养不利。细胞在39～40℃培养1小时，能受到一定损伤，但仍有可能恢复，但不能忍受温度再升高2℃，持续数小时，即在41～42℃中培养1小时，细胞损伤严重，温度至43℃以上时细胞多数被杀死。高温主要引起酶的灭活、类脂质破坏，核分裂的破坏，产生凝固酶使细胞发生凝固，另外使蛋白质变性。因此，体外培养细胞时一定要避免高温。 二、渗透压 细胞在高渗溶液或低渗溶液中，可以立即发生皱缩或肿胀、破裂。所以，渗透压是体外培养细胞的重要条件之一。哺乳动物和其他动物组织细胞体外培养的渗透压的维持主要与NaCl有关，但不能忽视其他电介质渗透压的关系。渗透压与单位体积溶媒内溶质的分子数和离子数成正比。为此，按一定比例控制培养液中离子平衡，维持正常渗透压是很重要的。这不仅是为了维持细胞张力，而且是为了调节细胞的代谢。因为细胞外离子输送和离子浓度改变着其他营养物质的输送(如氨基酸、蔗糖等)，直接影响细胞基本合成系统。 理想的渗透压因细胞的类型及种族而异，人血浆渗透压为290mmol/L，被视为是体外培养人类细胞的理想渗透压。哺乳类动物细胞的渗透压一般为290～300mmol/L。人胚肺成纤维细胞为250～325mmol/L，鼠则为310mmol/L左右。在实际应用中，260～320mmol/L的渗透压可适于大多数细胞。

乳腺癌是世界范围内女性最常见的致死性恶性肿瘤，据统计，2020年女性乳腺癌已超越肺癌成为全球癌症发病率最高的癌种[1-2]。其中三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）是雌激素受体（estrogen receptor，ER）、孕激素受体（progesterone receptor，PR）和人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2，HER-2）均呈阴性表达的乳腺癌亚型，占所有乳腺癌的15%～20%[3]，具有侵袭力强、转移率高、术后复发率高、预后差的特点[4]。由于TNBC内分泌治疗的不确定性及靶向治疗的不应答性，导致临床上的治疗效果不理想[5-6]。因此，寻找有效抑制TNBC增殖转移的药物、降低患者的病死率一直是乳腺癌基础研究的一个重要方向[7-8]。 石蒜碱是石蒜Lycoris radiata (L'Hér.) Herb.、文殊兰Crinum asiaticum L. var. sinicum (Roxb. et Herb.) Baker、朱顶红Hippeastrum rutilum (Ker.-Gawl.) Herb.等石蒜属植物鳞茎中含量较高的异喹啉类生物碱，具有抗肿瘤、抗病毒、抗菌、抗炎镇痛、保肝等药理活性[9-10]，近年来石蒜碱的抗肿瘤作用受到众多研究者的关注。有文献报道石蒜碱对人乳腺癌MCF-7细胞[11]、人宫颈癌Hela细胞[12-13]、人肝癌HepG-2细胞[13-16]、人胃癌SGC-7901细胞[17]、人结肠腺癌LoVo细胞[18-19]具有显著的抑制作用，但对其作用机制的研究仍然处于初始阶段。本研究以人乳腺癌MDA-MB-231细胞为研究对象，主要通过体外实验从细胞水平和分子水平探讨石蒜碱对MDA-MB-231细胞的体外抑制活性及其通过线粒体氧化损伤诱导肿瘤细胞自噬及凋亡的机制，为今后石蒜碱抗肿瘤新药的深入研发和临床实践提供理论基础和实验参考。 1 材料 1.1 细胞株 MDA-MB-231细胞由国家教育部抗肿瘤天然药物工程技术研究中心提供。 1.2 药品与试剂 石蒜碱（批号34296，质量分数98%）购自阿拉丁试剂有限公司；胎牛血清（批号0201021）购自浙江杭天生物科技公司；RPMI 1640细胞培养基（批号AD123707271）购自美国HyClone公司；二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO，批号20200901）购自天津中和盛泰化工有限公司；Hoechst 33258染液（批号C1011）、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（批号P0015）、吉姆萨染液（批号C0131）、CCK-8试剂盒（批号C0043）、活性氧（reactive oxygen species，ROS）检测试剂盒（批号S0033S）、PMSF（批号ST505）、HRP标记的山羊抗大鼠IgG二抗（批号A0192）、Western blotting及IP细胞裂解液（批号072318180723）、30% Acr-Bis（批号093018181017）购自碧云天生物技术研究所；碘化丙啶（propidium iodide，PI）染液（批号R20285）、Rhodamine 123（批号R8004）购自美国Sigma公司；台盼蓝（批号72-52-1）购自美国默克公司；Reagent A染液（批号5000113）购自北京诺博莱德科技有限公司；聚山梨酯20（批号20190207）购自美国Biotopped公司；Tris（批号181127）购自美国Amresco公司；兔抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cystein-asparate protease-3，Caspase-3）抗体（批号WL02512）、兔抗B淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）抗体（批号WL01506）、兔抗Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）抗体（批号WL02385）、兔抗细胞色素C（cytochrome-C，Cyt-C）抗体（批号WL04963）、兔抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体（批号WL01114）购自沈阳万类生物科技有限公司；兔抗线粒体内膜转位酶（translocase of inner membrane，TIM）抗体（批号PSI-RF16109）、兔抗线粒体外膜转位酶（translocase of outer membrane，TOM）抗体（批号PSI57577）、兔抗E3泛素连接酶（E3 ubiquitin protein ligase，PARKIN）抗体（批号PSI50248）、兔抗PTEN诱导的激酶1（PTEN induced putative kinase 1，PINK1）抗体（批号PSI7859）、兔抗微管相关蛋白轻链3（microtubule-associated protein light chain 3，LC3-B）抗体（批号BS79705）、兔抗p62抗体（批号p196-269）购自艾美捷科技有限公司。 1.3 仪器 ECO-170P-230型细胞培养箱、Model 680型酶标仪（美国NBS公司）；Adventurer型万分之一电子天平（美国OHAUS公司）；EPICS-XL型流式细胞仪、AllegraTM 64R型低温高速离心机（美国Beckman-Coulter公司）；CKX-41-32型倒置显微镜（日本Olympus公司）；荧光显微镜、TCS-SP2激光共聚焦扫描显微镜（德国Leica公司）；680型全自动酶标仪（美国Bio-Rad公司）；P型微量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff]移液器[/color][/url]（芬兰百得公司）；标准型PB-10 pH计（德国Sartorius公司）；GIS-2019型Tannon凝胶成像系统（天能科技有限公司）；DYY-7C型电泳仪、M344039型垂直电泳转印槽（北京六一仪器厂）。 2 方法 2.1 细胞培养 MDA-MB-231细胞复苏后接种于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，置于5% CO2、37 ℃恒温培养箱中培养，待细胞长势良好时进行传代，取对数生长期的细胞进行实验。 2.2 CCK-8法检测细胞增殖活性 MDA-MB-231细胞以2×103个/孔接种于96孔板中，细胞培养24 h后，给药组每孔加入不同浓度（2、4、8、16、32 μmol/L）的石蒜碱100 μL，对照组加入100 μL细胞培养基，每组均设置6个平行孔，处理48 h后，每孔加入10 μL CCK-8试剂，继续培养4 h。采用酶标仪检测490 nm处的吸光度（A）值，计算各组细胞的增殖抑制率与石蒜碱对MDA-MB-231细胞的半数抑制浓度（half inhibitory concentration，IC50）。 2.3 倒置显微镜、荧光显微镜、激光共聚焦扫描显微镜观察细胞形态变化 MDA-MB-231细胞以3×103个/孔分别接种于2块6孔板中，细胞培养24 h后，根据石蒜碱对MDA-MB-231细胞的IC50设定3个给药剂量，分别以3、6、12 μmol/L的给药浓度每孔加入石蒜碱1 mL，对照组加入1 mL细胞培养基，继续处理48 h。取1块板用倒置显微镜观察并拍照后，每孔加入1 mL多聚甲醛固定1 h，冲洗后加入200 μL Hoechst 33258染液，37 ℃孵育30 min后，用荧光显微镜观察并拍照；取另1块板收集各组细胞，用预冷的PBS重悬细胞并弃去上清液，加入Annexin V-FITC于37 ℃避光孵育15 min，冲洗后加入PI染液于4 ℃避光孵育15 min后，用激光共聚焦扫描显微镜观察并拍照。 2.4 集落实验检测细胞克隆能力 MDA-MB-231细胞以1×103个/孔接种于6孔板中，细胞培养24 h后，按“2.3”项下方法对细胞进行分组和给药，连续培养7 d后弃去培养基。PBS洗涤后用甲醇固定10 min，冲洗后加入吉姆萨染液染色后，用倒置显微镜观察细胞集落形成率并拍照。 2.5 划痕实验检测细胞迁移能力 MDA-MB-231细胞以1×105个/孔接种于6孔板中，细胞培养24 h，细胞融合至70%～80%后，用200 μL[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff]移液器[/color][/url]倚靠直尺，枪头垂直于每孔底部竖直划痕。PBS冲洗后，按“2.3”项下方法对细胞进行分组和给药，培养48 h后，用倒置显微镜观察细胞的迁移情况并拍照记录，比较各组间的划痕宽度，使用Image J软件测量并计算划痕愈合率。 2.6 流式细胞仪检测细胞凋亡率 按“2.3”项下方法对细胞进行分组和给药，培养48 h后，收集各组细胞，加入70%冷乙醇2 mL于4 ℃固定24 h后离心。弃去上清液，PBS冲洗后，加入800 μL PI染液，4 ℃避光孵育30 min，经尼龙网滤过后，采用流式细胞仪进行检测，激发波长为488 nm。 2.7 流式细胞仪检测ROS水平 按“2.3”项下方法对细胞进行分组和给药，培养48 h，收集各组细胞，PBS洗涤后加入5 μmol/L DCFH-DA染液0.2 mL，37 ℃避光孵育20 min，经尼龙网滤过后，采用流式细胞仪进行检测。 2.8 流式细胞仪检测线粒体膜电位 按“2.3”项下方法对细胞进行分组和给药，培养48 h后，收集各组细胞，PBS洗涤后，避光加入Rhodamine 123染料，避光孵育30 min后离心弃去上清液，用PBS洗涤并混匀细胞，经尼龙网滤过后，采用流式细胞仪进行检测。 2.9 激光共聚焦扫描显微镜检测线粒体膜通透性转换孔（mitochondrial permeability transition pore，MPTP）活性 按“2.3”项下方法对细胞进行分组和给药，培养48 h后，收集各组细胞，加入37 ℃预热的Reagent A染液500 μL，离心后弃去上清液。37 ℃避光加入染色工作液，混匀后孵育20 min，离心去除上清液，将细胞吹打混匀后，经尼龙网滤过，采用激光扫描共聚焦显微镜检测并进行拍照。 2.10 Western blotting检测线粒体自噬相关蛋白TIM、TOM、PARKIN、PINK1、LC3-B、p62和凋亡相关蛋白Caspase-3、Bax、Bcl-2、Cyt-C表达 按“2.3”项下方法对细胞进行分组和给药，培养48 h后，收集各组细胞，加入含PMSF的细胞裂解液，冰上裂解30 min后将细胞加入EP管中，离心15 min。取上清液，煮沸使蛋白变性，采用BCA试剂盒定量蛋白浓度。采用SDS-PAGE凝胶电泳，转至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭2 h后，加入一抗，4 ℃孵育过夜。TBST洗膜后加入二抗，37 ℃孵化2 h，洗膜后加入化学发光试剂，采用凝胶成像系统拍照并进行分析。 2.11 统计学分析 用SPSS 21.0软件进行统计分析，数据以表示，多样本均数比较采用One-way ANOVA分析，通过Graphpad Prism 8软件绘图。 3 结果 3.1 石蒜碱对MDA-MB-231细胞增殖的影响 如图1所示，石蒜碱对MDA-MB-231细胞具有显著的增殖抑制作用（P＜0.01），且呈浓度相关性。石蒜碱对MDA-MB-231细胞的IC50为6.21 μmol/L，并参考IC50值设定后续石蒜碱给药浓度分别为3、6、12 μmol/L。 3.2 石蒜碱对MDA-MB-231细胞形态的影响 采用倒置显微镜、荧光显微镜、激光共聚焦显微镜观察石蒜碱对MDA-MB-231细胞形态的影响，如图2所示，与对照组比较，石蒜碱给药后，随着给药浓度增加，细胞生长逐渐变稀疏，细胞膜破裂现象更加明显，细胞间轮廓更加模糊，细胞核固缩形成凋亡小体，发出较强荧光。 3.3石蒜碱对MDA-MB-231细胞克隆、迁移的影响 集落实验结果表明，石蒜碱可以抑制MDA-MB-231细胞的克隆能力（图3-A），且随着浓度的增加细胞集落数量逐渐减少，且呈浓度相关性。划痕实验结果显示，石蒜碱可以显著抑制MDA-MB-231细胞的迁移能力（P＜0.01，图3-B、C），呈剂量相关性。 3.4 石蒜碱对MDA-MB-231细胞凋亡率、ROS水平的影响 如图4-A、B所示，经流式细胞仪PI单染法检测出现明显的凋亡峰，表明DNA的合成受到抑制，且随着给药浓度增加，凋亡峰越明显，凋亡率也呈上升趋势，与对照组比较有显著性差异（P＜0.01），且呈浓度相关性。如图4-C、D所示，随着给药浓度增加，细胞内ROS水平逐渐升高，具有显著性差异（P＜0.01），且呈浓度相关性。 3.5 石蒜碱对MDA-MB-231细胞线粒体膜电位和MPTP的影响 如图5-A、B所示，经流式细胞仪检测，随着石蒜碱给药浓度增加，细胞内线粒体膜阳性表达率逐渐降低，具有显著性差异（P＜0.01），且呈浓度相关性。如图5-C、D所示，应用激光扫描共聚焦显微镜结合AM染色技术对不同浓度的石蒜碱作用48 h后的MDA-MB-23细胞进行检测，激光扫描共聚焦显微镜扫描得到的荧光象素强度反映出细胞膜通透性的改变，随着给药浓度增加，细胞内线粒体膜通透性逐渐升高，具有显著性差异（P＜0.01），且呈浓度相关性。 3.6 石蒜碱对MDA-MB-231线粒体自噬和凋亡相关蛋白表达的影响 应用凝胶成像系统分析MDA-MB-231细胞中线粒体自噬和凋亡相关蛋白表达的情况。如图6所示，随着石蒜碱浓度增加，细胞自噬相关蛋白TIM、TOM和p62蛋白表达量逐渐降低，PARKIN、PINK1和LC3-B蛋白表达量逐渐升高，均具有显著性差异（P＜0.01）。如图7所示，随着石蒜碱浓度增加，细胞凋亡相关蛋白Bcl-2蛋白表达量逐渐降低，Bax、Caspase-3和Cyt-C蛋白表达量逐渐升高，均具有显著性差异（P＜0.01）。 4 讨论 乳腺癌已成为全球最常见的恶性肿瘤，与乳腺癌的其他分子亚型相比，TNBC最具侵袭性和高度异质性[20-22]，使其在临床上难以得到有效治疗。因此如何有效抑制TNBC侵袭、增殖和转移是目前亟待解决的问题。近年来，有研究表明中药在抗肿瘤方面具有显著的优势[23-25]。石蒜碱是异喹啉类生物碱，广泛分布于石蒜属植物鳞茎中，具有较强的抗肿瘤活性[26-27]。基于石蒜碱的抗肿瘤作用，结合课题组前期研究中TNBC细胞活性筛选，发现石蒜碱对MDA-MB-231细胞较为敏感，故选择MDA-MB-231细胞作为研究对象，本研究结果发现石蒜碱对MDA-MB-231细胞的增殖和迁移具有显著抑制作用，且呈浓度相关性。 ROS水平升高和线粒体功能障碍是诱导肿瘤细胞自噬和凋亡的重要途径[28]。研究发现，过量ROS的产生会诱发肿瘤细胞的损伤、自噬及凋亡并降低细胞的多药耐药性[29]。此外，肿瘤细胞对外源性ROS比正常细胞更敏感且ROS具有一定的细胞毒性。因此，促进ROS水平升高的药物可表现出一定的抗癌活性。有研究表明，线粒体功能障碍与多种恶性肿瘤的发生及ROS的过量产生密切相关[30]。本研究通过激光共聚焦显微镜和流式细胞仪检测结果表明，石蒜碱可以显著提高MDA-MB-231细胞凋亡率和ROS水平，并使线粒体膜电位下降，MPTP开放。这表明石蒜碱诱导细胞自噬和凋亡作用可能与线粒体的氧化损伤有关。 TOM及TIM是线粒体膜蛋白，当线粒体自噬增强时，其细胞内表达水平下降。研究表明线粒体损伤会使线粒体膜电位降低，导致PINK1在线粒体外膜上表达，从而使PINK1-PARKIN依赖性线粒体自噬反应被激活[31]。LC3-B是自噬体形成的特异性标志物，其含量与自噬泡数量成正比，因此被广泛用于监测细胞自噬。p62作为自噬降解的产物，自噬增强，p62水平会下降。p62还可与自噬体膜上的LC3-B蛋白及泛素化的蛋白形成复合物，在自噬溶酶体内完成降解[32]。ROS的过度累积，会触发MPTP开放，导致线粒体膜电位下降，引起Cyt-C从线粒体释放并进入细胞质中，进而激发Caspase的级联反应并启动细胞线粒体凋亡[33]。Bcl-2为抗凋亡蛋白，Bax为促凋亡蛋白，当接收到凋亡刺激信号后可转位至线粒体膜上，Bcl-2和Bax可形成二聚体或多聚体，从而增加细胞线粒体膜的通透性，进一步激活Caspase级联反应，Caspase-3可通过抑制凋亡抑制物，从而破坏细胞结构使蛋白丧失功能[34]。本研究通过Western blotting检测自噬相关蛋白和凋亡相关蛋白的表达，结果显示石蒜碱能够上调PARKIN、PINK1、LC3-B、Caspase-3、Bax和Cyt-C蛋白表达，下调TIM、TOM、p62和Bcl-2蛋白表达，表明石蒜碱可通过线粒体的氧化损伤介导MDA-MB-231细胞的自噬及凋亡。 综上，石蒜碱对MDA-MB-231细胞具有生长抑制作用，并可通过调控线粒体氧化损伤介导MDA-MB-231细胞的自噬及凋亡。本研究为石蒜碱抗肿瘤新药的深入研发和临床实践提供理论基础。

在一项最新研究中，来自美国印第安纳大学医学院的研究人员比较了来自人胎盘和来自人脐带血的内皮集落形成细胞(endothelial colony-forming cells, ECFCs)哪个拥有更强的增殖能力和更好地形成新的血管，结果发现来自人胎盘的ECFCs更好地产生新血管。相关研究结果发表在Cell Medicine期刊上。研究通信作者Michael P. Murphy博士说，“从人脐带血分离出的循环流通ECFCs(circulating ECFCs)和从人胎盘中分离出的常驻ECFCs(resident ECFCs)在表型上是一样，而且拥有同样的增殖潜力。在移植之后，胎盘来源的常驻ECFCs要比来自脐带血中的循环流通ECFCs产生明显更加多的血管，这就表明常驻ECFCs和循环流通ECFCs之间存在内在性的功能差别，源自胎盘的ECFCs产生更加多的新血管。”研究人员说，脐带血和胎盘胚外膜都是祖细胞的理想来源。然而，从胎盘中能够获得的细胞量要比从脐带血中获得的数量大得多，这就使得胎盘成为细胞量更为充足的来源。他们作出结论，胎盘代表着一种ECFCs数量充足的来源，能够提供大量用于治疗的细胞

注意事项： 1.配制溶液时必须用新鲜的蒸馏水。2.安装蔡式滤器时通常使用孔径 0.45 微米 和 0.22 微米滤膜各一张，放置位置为 0.45 的位于 0.22 微米的滤膜上方，并且要特别注意滤膜光面朝上。 3.配制 RPMI1640 培养基时因为还要加入小牛血清，而小牛血清略偏酸性，为了保证培养液 PH 值最终为 7.2 ，可在配制时调 PH 至 7.4 。 细胞培养的一般过程 一、准备工作准备工作对开展细胞培养异常重要，工作量也较大，应给予足够的重视，推备工作中某一环节的疏忽可导致实验失败或无法进行。准备工作的内容包括器皿的清洗、干燥与消毒，培养基与其他试剂的配制、分装及灭菌，无菌室或超净台的清洁与消毒，培养箱及其他仪器的检查与调试，具体内容可参阅有关文献。二、取材在无菌环境下从机体取出某种组织细胞（视实验目的而定），经过一定的处理（如消化分散细胞、分离等）后接入培养器血中，这一过程称为取材。如是细胞株的扩大培养则无取材这一过程。机体取出的组织细胞的首次培养称为原代培养。R 理论上讲各种动物和人体内的所有组织都可以用于培养，实际上幼体组织（尤其是胚胎组织）比成年个体的组织容易培养，分化程度低的组织比分化高的容易培养，肿瘤组织比正常组织容易培养。取材后应立即处理，尽快培养，因故不能马上培养时，可将组织块切成黄豆般大的小块，置 4℃的培养液中保存。取组织时应严格保持无菌，同时也要避免接触其他的有害物质。取病理组织和皮肤及消化道上皮细胞时容易带菌，为减少污染可用抗菌素处理。由组织并分离分散细胞的方法可参阅有关文献。 三、培养将取得的组织细胞接入培养瓶或培养板中的过程称为培养。如系组织块培养，则直接将组织块接入培养器皿底部，几个小时后组织块可贴牢在底部，再加入培养基。如系细胞培养，一般应在接入培养器皿之前进行细胞计数，按要求以一定的量（以每毫升细胞数表示）接入培养器皿并直接加入培养基。细胞进入培养器皿后，立即放入培养箱中，使细胞尽早进入生长状态。正在培养中的细胞应每隔一定时间观察一次，观察的内容包括细胞是否生长良好，形态是否正常，有无污染，培养基的 PH是否太酸或太碱（由酚红指示剂指示），此外对培养温度和 CO2浓度也要定时检查。一般原代培养进入培养后有一段潜伏期（数小时到数十天不等），在潜伏期细胞一般不分裂，但可贴壁和游走。过了潜伏期后细胞进入旺盛的分裂生长期。细胞长满瓶底后要进行传代培养，将一瓶中的细胞消化悬浮后分至两到三瓶继续培养。每传代一次称为“一代”。二倍体细胞一般只能传几十代，而转化细胞系或细胞株则可无限地传代下去。转化细胞可能具有恶性性质，也可能仅有不死性（Immortality）而无恶性。培养正在生长中的细胞是进行各种生物医学实验的良好材料。四、冻存及复苏为了保存细胞，特别是不易获得的突变型细胞或细胞株，要将细胞冻存。冻存的温度一般用液氮的温度?－196℃，将细胞收集至冻存管中加入含保护剂（一般为二甲亚砜或甘油）的培养基，以一定的冷却速度冻存，最终保存于液氮中。在极低的温度下，细胞保存的时间几乎是无限的。复苏一般采用快融方法，即从液氮中取出冻存管后，立即放入 37℃水中，使之在一分钟内迅速融解。然后将细胞转入培养器皿中进行培养。冻存过程中保护剂的选用、细胞密度、降温速度及复苏时温度、融化速度等都对细胞活力有影响。

如何用普通生物显微镜拍清楚非小细胞肺癌细胞的细胞膜呢

细胞培养是细胞和分子生物学中最重要的一项技术。广泛应用于现代医学、农业科学、生物科学、材料科学和环境科学等领域，培养的细胞为上述领域提供研究的模型和实验材料。目前细胞间可以供从事蛋白质表达工作的昆虫细胞培养实验及如HEK293T细胞系,Hela细胞系，CHO细胞系等常用细胞系的培养、传代及其他分子实验的操作条件。

名称：细胞培养操作规程关键词：细胞培养目的：建立一套适用的培养操作规程，进行无污染条件下体外细胞扩大培养。主体内容：操作步骤：1、紫外灯照射超净台30分钟（根据实际情况，可适当延长或缩短照射时间，但时间长一点总比时间短一点安全。）2、将培养液、PBS、胰酶放在37℃水浴中温育（每次用多少，温育多少，这样既可节约温育的时间，又可延长药品的使用期限。）3、超净台照射30分钟后，关闭紫外，打开照明，打开排风10分钟后再次进入细胞培养室。（注意：要打开排风10分钟后再进行操作，这样才能保证循环的风是无菌的。同时还会避免有菌的风直接吹到人的呼吸道中，对人体也有一定的保护作用）4、戴上口罩及手套（有条件的最好戴上帽子，不过也没关系，我们实验室就没戴）5、用70-75%的酒精擦试实验物品，然后拿入超净台中。6、操作时注意以下几点：尽量在酒精灯火焰附近操作，但如果管子里有细胞就要离火焰有一定距离了，否则细胞要烫死了；不要重复使用移液管（即吸一次后，就换新的管）；不要在敞开的容器上方操作；手上的酒精不要擦太多，否则靠近酒精灯时容易把手烧到（我想很多人都有过被烧的经历吧）；其实操作是很简单的，但一定要仔细。尤其是第2步许多人都不注意，细胞平时放在37℃培养，如果加入的PBS或胰酶温度太低，会对细胞有操伤的，虽然这种损伤短期内察觉不到，但时间长了，就会显现出来。

幹細胞可以說是人體的主要細胞，可以在所有組織中存在。這些細胞十分罕有，它們主要是每天取替已死或將死的細胞組織，這是正常細胞自我更新及在病後和受破壞後組織修復的重要環節。幹細胞的特點除了可以自己進行複製外，更可以轉化成不同的細胞種類（多向細胞）。研究中採用的多功能幹細胞包括誘導多功能幹細胞。在特定生長環境及外在因素下，這種細胞可以轉化成身體任何種類的細胞。雖然這些細胞用途可能很令人興奮，但是現在利用幹細胞治療仍然很少，主要是因為有演變成腫瘤的風險。另一方面，胎盤中的新生幹細胞是現成的幹細胞，而且是多效性及多功能的，但卻不會產生畸胎瘤。 http://www.prostemcell.com/zh/images/stemcell_whatarestemcell_11.jpg http://www.prostemcell.com/zh/images/stemcell_whatarestemcell_14.jpg嬰兒出生時的胎盤組織是新生幹細胞的豐富來源。當中包括用以修復血液及免疫系統的臍帶血造血幹細胞，以及用作修復骨骼、肌肉、軟骨及其潛在治療免疫抑制特性的臍帶間葉幹細胞。至於胎盤羊膜幹細胞，其潛能可用於修復一系列上皮和非上皮組織，包括皮膚（傷口）、呼吸系統及免疫系統。因此，新生幹細胞整體可以代表人體修復工具，它不單有潛力可以治療一系列的疾病外，還可治療神經系統、呼吸系統、心血管、胃腸道及泌尿生殖系統等疾病。此外，新生幹細胞在治療炎症、敏感、哮喘、風濕、燒傷、物理創傷、運動損傷及老化所帶來的磨損亦具潛效。新生幹細胞是人生最健康的幹細胞，因為它們從未經歷過疾病、環境或基因等因素侵入，所以能保存細胞最年輕時的形態http://www.prostemcell.com/zh/images/stemcell_whatarestemcell_17.jpg有關幹細胞研究的正不斷益增長。直至目前已有超過170,000篇關於幹細胞研究的刊物已載錄於PubMed1 ，這是美國國立醫學圖書館提供的搜尋引擎。PubMed有超過二千萬篇有關生物醫學方面的引文。不少國際醫學權威協會均建議在於嬰兒出生後即時從臍帶血中提取幹細胞是最好的。這些協會包括美國血液和骨髓移植協會、美國婦產科學院、美國醫學協會、美國兒科學會2、皇家婦產科學院3、新英格蘭醫學雜誌4，以及歐洲倫理學集團5等。 1 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2 Nietfeld et al. 20083 RCOG Scientific Advisory Committee Opinion Paper 24 Perspective Steinbrook, R. NEJM 2004; 351(22):2255"The Cord-Blood-Bank Controversies"5 Opinion no.19 of the European Group on Ethics (EGE), released 16 March 2004

iPSC神经细胞培养试剂【胜创生物】成功取得GlobalStem中国区总代理：人ES细胞mRNA高效转染试剂，GlobalStem公司2006年在美国成立，其团队核心技术骨干为原Lifetech部门，负责研发生产细胞转染试剂Lipofectamine 2000、Lipofectamine 3000及细胞培养试剂等。　　GlobalStem专注于iPSC（诱导性多功能干细胞神经分化）神经细胞转染、干细胞转染试剂，iPSC神经细胞培养、干细胞培养、原代细胞培养试剂。　　【胜创生物】http://www.shengchuangbio.com/-人ES细胞mRNA高效转染试剂　　DNA-In-Neuro：在神经细胞中的转染效率约高于Lipofectamine 2000的 3倍。　　DNA-In-Neuro：*转染效率高*低毒性*数据重复性高*操作简单。　　日前，【胜创生物】公司已成功取得GlobalStem的中国总代理权，电话咨询400-6400-850　　胜创生物以“品质第一，客户第一“为公司价值观，以引进”新产品、新技术“为己任，更多资讯关注胜创生物微信【sc-bios】获取详情！

体外神经细胞的培养已成为神经生物学研究中十分有用的技术手段。神经细胞培养的主要优点是:(1)分散培养的神经细胞在体外生长成熟后,能保持结构和功能上的某些特点, 而且长期培养能形成髓鞘和建立突触联系,这就提供了体内生长过程在体外重现的机会。(2)能在较长时间内直接观察活细胞的生长、分化、形态和功能变化,便于使用各种不同的技术方法如相差显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、激光共聚焦显微镜、同位素标记、原位杂交、免疫组化和电生理等手段进行研究。(3)易于施行物理（如缺血、缺氧）、化学和生物因子（如神经营养因子）等实验条件, 观察条件变更对神经细胞的直接或间接作用。(4)便于从细胞和分子水平探讨某些神经疾病的发病机制，药物或各种因素对胚胎或新生动物神经细胞在生长、发育和分化等各方面的影响。 我们实验室从80年代始开展了神经细胞的体外培养工作，取得了一些经验，现将培养细胞分类及方法简要介绍如下:一.鸡胚背根神经节组织块培养 主要用于神经生长因子（NGF）等神经营养因子的生物活性测定。在差倒置显微镜下观察以神经突起的生长长度和密度为指标半定量评估NGF的活性。1． 材料和方法 （1）选正常受精的鸡蛋，置于37℃生化培养箱内孵化，每日翻动鸡蛋一次。 （2）取孵化8-12 d 的鸡蛋, 用70% 酒精消毒蛋壳，从气室端敲开蛋壳，用消毒镊剥除气室部蛋壳。（3）用弯镊钩住鸡胚颈部，无菌条件下取出鸡胚置小平皿内，除去头部后，腹侧向上置 灭菌毛玻璃片上,用眼科弯镊子打开胸腹腔，除去内脏器官。（4）在解剖显微镜下，小心除去腹膜，暴露脊柱及其两侧，在椎间孔旁可见到沿脊柱两侧 排列的背根节（图1），用一对5号微解剖镊小心取出。（5）置背根节于解剖溶液内，用微解剖镊去除附带组织，接种于涂有鼠尾胶的玻璃或塑料 培养瓶中，在DMEM无血清培养液中培养。2． 结果鸡胚背根神经节在含神经生长因子(NGF, 2.5S，20ng/ml)的无血清培养液中培养24 h,神经节长出密集的神经突起。而未加NGF的神经节培养24 h, 未见神经突起生长。二．新生大鼠、新生小鼠及鸡胚背根神经节分散细胞培养背根神经节（DRG）细胞起源于神经嵴，NGF研究先驱Levi-Montalcini的实验表明，外原性NGF能刺激DRG细胞生长发育并形成广泛的神经网络。在体外，分离培养的神经节在NGF存在的情况下，神经突起的生长在一天之内可长达数毫米，因此，利用培养的DRG细胞，进行轴突生长发育的研究，是最为经典而常用的方法之一。

每天对待细胞比孝敬爹妈还用心，那真是捧在手里怕碎了，含在嘴里怕化了，看在眼里怕丢了 ，培养细胞时有哪些惨痛经验教训可以分享呢?早走早脱身，从此专注黑生物1. 严格无菌操作，多喷喷酒精，要是对灭菌的东西不放心，自己包自己送自己烘干。　　2. 不要和别人共用试剂耗材，自己准备一套。　　3. 有可能的话在拿到新细胞的时候做好支原体衣原体检测。　　4. 水浴锅很脏，生化培养箱要是得手动加湿的话盘里的水也会很脏，勤换 (灭菌水加进去)。　　5. 晚上离开的时候最好给细胞房照紫外，超净台是用完就开。　　6. 最好的是同一时间就你一个人在用细胞房在养细胞。　非科班出身经验分享　　1. 别怕浪费。枪头什么的只要有可能污染就换，如果用酒精灯就什么都稍微烤一下，别直接放到火上，离一段距离。　　2. 动作要既轻柔又有力。动作太重会有一堆一堆的气泡，动作太轻就吹不下来... 刚开始的时候吹细胞太痛苦了，稍微一下就起泡。后来就是吹的时候枪里的培养基不要一次全都压出来，留一点，枪的最头部尽量深的在液面以下。　　3. 离开过操作台的东西再进操作台之前一定要用酒精喷一遍，包括一切实验耗材、仪器、以及你带着手套的手。　　4. 实验结束后对实验台的消毒。紫外什么的，用前用后都照个 30 分钟。　　5. 身体的各个部分尽量的少接触不需要接触的地方的地方。比如实验台，又比如培养箱内部。　　6. 细胞的密度根据细胞的性质、传代的时间以及自己的心情来定。培养基的话最多最多不要超过 2 天就要换一次。细胞可以不传代，但是培养基是一定要换的。　　大概就是，不该碰的地方不碰，有影响的地方少碰; 该使劲的时候绝对不含糊，不该使劲的地方一定忍住。如果是比较简陋的操作台就一定要摆个酒精灯，所有操作紧密围绕在酒精灯周围进行。如果是高级台子就多用酒精喷喷。感觉生物的实验，心疼钱就还是不要做了。　　最后一点点绝对非科班的经验。癌细胞真是坚挺。有一次实在是不想传了，放了 5 天吧，感觉都长了几层出来，培养基都黄了。抱着试一试的心情传了一次，又坚强的活过来了。当然，状态肯定也差的很了。　换种心情，好好生活!　　养了三年细胞，各种肿瘤细胞，说一点自己的看法：　　1. 培养细胞前，可以看看细胞特点说明书，包括细胞正常生长的状态图、传代、培养基的类型等。　　2. 不同细胞生长周期不同，有的生长很快，比如说 MDA-MB-231，传代的时候取离心悬液的十分之一就已经足够了，有的又是特别慢，等的人心焦，BT474 就是，传代是一分二，复苏起始的时候两周多才能长满，所以就要在培养细胞的过程中多多摸索了。　　3. 对于娇弱的细胞，就得细心呵护了，胰酶消化不能过久，吹得时候要轻柔，离心时候也要注意转速和时间，每天都要去看一下细胞，肉眼观察培养基状况、显微镜下观察细胞生长状况。　　4. 冻存细胞复苏后第二天最好更换一次培养基。　　5. 培养箱隔一段时间彻底用酒精棉擦洗一次。　　6. 养细胞最大的教训：不能偷懒!　细胞虐我千百遍，我待细胞如初恋。　　1. 不管买的细胞、惠赠的细胞，刚拿到手赶紧做两件事：检测是否有支原体污染; 迅速扩增冻存。　　2. 发现有污染迅速处理掉，特别是当你养了很多种细胞时; 细菌污染，真菌污染很容易发现，支原体污染的话，细胞会长的慢，买个支原体检测的 kit 定期检测一下。　　3. 细胞房日常的值日清洁是必须的，此外还要定期熏蒸。　　4. 细胞的传代一定要规律，保持相同的 confluency 和传代时间间隔，不要随心所欲或者拖延。　　5. 注意个人卫生。　靠内心感动细胞　　1. 自己的细胞自己养，血的教训。　　2. 在生物安全柜 (或者超净台)，枪头，血清管，血清，培养基，瓶子都足够好，并且细胞房有良好的卫生措施 (比如隔离服，手套，口罩，清洁，HEPA 等等) 且不违法操作原则的情况下，你其实很难污染。　　3. 上述条件不完备的情况下，就要多注意无菌操作了：比如要用的东西提前拿到台子里照啊 (不过这个其实也不大好，因为会挡住紫外线)，使用前 SDS+酒精擦台子，进出超净台一定要酒精擦手。　　4. 少对细胞说话，多靠内心来感动它们 (是的! 心不诚是不可以的!) 至少 1 天看 1 次。　养细胞很容易　　养细胞真的不难，最关键几点：　　1. 所有的东西使用最好的，如果你用的血清、培养皿、培养基、胰酶什么的都是进口的，真的很难相信你会把细胞养坏。　　2. 动作要快，胰酶消化，换液什么，细胞暴露在空气中的时间越少越好。另外，要掌握好胰酶消化时间，所谓的细胞状态差，很多时候是传代的原因。　　3. 有时间的话，需要细胞计数，传相应数目的细胞到培养皿中，可以大致清楚细胞的生长曲线，不会临时要处理，手足无措。　　4. 要做什么心里要非常清楚，合理安排时间，细胞房的实验穿插进行，可以节省很多时间，也不会耽误别人的实验。　　5. 个人的实验器具自己收一套，不要和别人混用，最近换了什么新的东西稍微记一下，试剂一旦怀疑污染，马上丢。　　6. 细胞房不能进去太多人，避免相互干扰。　细胞养不好，自挂东南枝　　现在一大型药企养细胞做检测，工作量很大，很多地方都没办法非常仔细的做。但是两年下来只出现过一次污染，总结一下心得：　　1. 好的洁净室，空调系统跟得上。　　2. 好的生物安全柜，硬件跟的上。　　3. 瓶子移液器吸头大都是进口，耗材跟的上。除了这些就是自己的操作习惯了。　　4. 任何东西不要从敞开的瓶口上面经过。　　5. 虽然酒精灯会干扰安全柜气流但是还是需要一盏用来勤烧瓶口。　　6. 实验时所用材料的位置摆放要顺手，污染源和已灭菌物品要分开放置。　养细胞就像打仗　　细胞饲养涵盖的内容太广了，而且不同种类细胞的饲养难度以及技术要求不同，肿瘤细胞，成纤维细胞，上皮细胞... 甚至各类干细胞... 每一种都有自己的生长要求。如果只是单纯的一般性操作，大同小异，个人觉得练好技术的情况下注意几点就好:　　1. 各种无菌，从培养基到操作过程再到培养箱，时刻注意无菌。本人曾经所在的实验室出现过大规模污染并最终导致所有细胞集体毁灭... 教训惨痛。　　2. 培养基的配制一定要做好梯度摸索并详细记录，否则细胞死都不知道怎么死的。　　3. 尽量提高操作熟练度，减少培养皿在培养箱外的滞留时间，细胞很脆弱，经不起折腾，不像人，热了有空调，冷了能烤火。　　4. 把握好培养基更换的时间，不同细胞类型时间不同，早了浪费试剂，晚了可能全军覆没。　　5. 经验很重要，养细胞的很多经验你是无法在公开的书籍和资料上找到的。多向实验室前辈学习，他们会让你少走很多弯路，真的。　　养细胞就像打仗，知彼知己，百战不殆。只有了解你养的对象，才能把他养好。　细胞就是矫情　　养细胞细胞这个东西呢有的时候真说不清。养过一段时间的巨噬细胞，一开始操作各种谨慎小心，随时默念各种无菌原则，培养基什么的都用的进口的，其实国产货真的不差，有钱就是任性! 但细胞还是萎靡不振，两个多星期过后实在懒得管，换液等操作也很随意的草草进行，酒精也懒得喷，结果这货却开始疯长，过了几天居然达到一天要传一次代，而且数量甚至可以一传三， 所以说，有的细胞就是矫情。

试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用 目的：本试剂盒用于测定人血清，血浆及相关液体样本中肝细胞生长因子受体（HGFR/ c-MET）的含量。实验原理： 本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人肝细胞生长因子受体（HGFR/ c-MET）水平。用纯化的人肝细胞生长因子受体（HGFR/ c-MET）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入肝细胞生长因子受体（HGFR/ c-MET），再与HRP标记的羊抗人抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的肝细胞生长因子受体（HGFR/ c-MET）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人肝细胞生长因子受体（HGFR/ c-MET）浓度。试剂盒组成：试剂盒组成48孔配置96孔配置保存说明书1份1份封板膜2片（48）2片（96）密封袋1个1个酶标包被板1×481×962-8℃保存标准品：1350ng/L0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存标准品稀释液1.5ml×1瓶1.5ml×1瓶2-8℃保存酶标试剂3 ml×1瓶6 ml×1瓶2-8℃保存样品稀释液3 ml×1瓶6 ml×1瓶2-8℃保存显色剂A液3 ml×1瓶6 ml×1瓶2-8℃保存显色剂B液3 ml×1瓶6 ml×1瓶2-8℃保存终止液[align=cente

[b][b][font=&][size=18px]会议咨询：[font=inherit]顾成刚13621995193（微信同号）[/font][/size][/font][/b][font=&][size=18px][color=#404040]2022深圳细胞产业大会[/color][/size][size=18px][color=#404040]第九届（深圳）细胞与肿瘤精准医疗高峰论坛[/color][/size][size=18px][color=#404040]2022年8月深圳 11月 武汉[/color][/size][/font][font=&][size=18px]深圳会议时间：2022年8月21-22日[size=16px][/size][/size][/font][font=&][size=18px][size=16px]深圳会议地点：深圳湾万丽酒店（深圳市南山区科技南路18号）[/size][/size][/font][font=&][size=18px][size=16px][/size][/size][size=18px][color=#404040][/color][/size][size=18px][color=#404040]同期举办：[/color][/size][size=18px][color=#404040]细胞与基因治疗前沿技术应用峰会 外泌体技术转化与疾病研讨会[/color][/size][size=18px][color=#404040]单细胞多组学研究与临床应用峰会 3D细胞培养与类器官临床应用峰会[/color][/size][/font][color=#404040]细胞外囊泡前沿与转化峰会[/color][color=#404040][img]https://img-user-qn.hudongba.com/upload/_oss/userarticleimg/202207/28/31658988346866_article3_1579.png?image/auto-orient,1/quality,q_80[/img][/color][color=#404040]招展联系人：顾先生13621995193（微信Wechat）[/color][size=14px][color=#404040]大会概况：[/color][color=#404040]2022细胞产业大会 2022第九届（深圳）细胞与肿瘤精准医疗高峰论坛将于8月在深圳举办，本次峰会紧密围绕政策规范、监管、工艺与产业化进展、细胞与基因治疗、外泌体临床研究与疾病治疗、外泌体临床检验与肿瘤免疫治疗、细胞外囊泡领域的机制研究、体外诊断及疾病治疗、单细胞多组学、单细胞测序、3D细胞培养与类器官、溶瘤病毒药物的开发与产业转化、干细胞临床前研究与临床应用转化、干细胞存储与治疗、肿瘤免疫治疗、通用型CAR-T细胞治疗、基因治疗及溶瘤病毒、实体瘤治疗及药物开发、临床研究与治疗进展等话题，特邀来自国家药品审评监管机构、科研院所、医疗机构、创新药企、生物治疗、生物技术和服务企业、产业链上下游企业、产业园区、投资机构、行业协会等多位权威专家与产业先锋进行分享交流及产品展示。组委会竭诚搭建优质对话合作平台，诚邀您八月深圳相聚，共襄盛会！[/color][color=#404040]近年来，现代生命科学与生物技术取得了一系列重要进展和重大突破，尤其是以干细胞、免疫细胞为核心的细胞治疗技术更是迅猛发展，在多种难治性疾病的临床研究上获得了许多成绩，在未来展现出了巨大的应用前景细胞治疗受到前所未有的重视，国家和地方层面也密集出台相关政策，支持干细胞、免疫细胞研究的发展。[/color][color=#404040]2009年单细胞测序技术强势问世，发展至今，单细胞测序技术已经在肿瘤、临床诊断、免疫学、微生物学、神经科学等领域占有重要的应用地位，是目前研究和应用的点。研究范围也不再只是基因组、转录组学，而扩展到了表观基因组、空间转录组学、代谢组、免疫组、蛋白组谱系。这些“多组学”技术允许研究人员更仔细地观察细胞之间的异质性，更清楚地识别特定细胞及其功能。[/color][color=#404040]细胞与基因治疗改变了人类治疗遗传疾病和疑难杂症的方式，并正在撬动整个制药生态圈。在各种适应症需求的推动下，细胞与基因治疗快速发展，多种细胞免疫疗法、干细胞疗法、基于腺相关病毒及慢病毒载体的基因疗法相继问世，为复发难治性肿瘤及严重的基因遗传缺陷类疾病提供了重要的治疗选择。随着CAR-T免疫细胞疗法在国际以及国内获批上市，细胞和基因疗法进入了全新的赛道，整个行业进入了技术突破和产业化的快速演进。[/color][color=#404040]2022细胞产业大会 2022第九届（深圳）细胞与肿瘤精准医疗高峰论坛将于8月在深圳举办，本次峰会紧密围绕政策规范、监管、工艺与产业化进展、干细胞临床前研究与临床应用转化、干细胞存储与治疗、肿瘤免疫治疗、细胞与基因治疗、通用型CAR-T细胞治疗、单细胞多组学、单细胞测序、细胞外囊泡分离及检测、3D细胞培养与类器官、基因治疗及溶瘤病毒、实体瘤治疗及药物开发、临床研究与治疗进展等话题，特邀来自国家药品审评监管机构、科研院所、医疗机构、创新药企、生物治疗、生物技术和服务企业、产业链上下游企业、产业园区、投资机构、行业协会等多位权威专家与产业先锋进行分享交流及产品展示。组委会竭诚搭建优质对话合作平台，诚邀您八月深圳相聚，共襄盛会！[/color][color=#404040]专题会议[/color][color=#404040]1、干细胞临床研究与转化应用峰会[/color][color=#404040]干细胞临床前研究与转化应用[/color][color=#404040]干细胞临床前研究与临床应用转化[/color][color=#404040]干细胞治疗技术与临床研究[/color][color=#404040]干细胞与免疫细胞临床研究的制剂质量评价[/color][color=#404040]干细胞治疗质量控制管理的现状与未来[/color][color=#404040]干细胞与类器官研究[/color][color=#404040]干细胞外泌体的应用[/color][color=#404040]干细胞与再生医学[/color][color=#404040]间充质干细胞外囊泡治疗难治性疾病[/color][color=#404040]新型干细胞治疗新冠肺炎[/color][color=#404040]2、肿瘤免疫治疗产业转化领袖峰会[/color][color=#404040]细胞免疫治疗研发突破与商业化进程[/color][color=#404040]通用型CAR-T细胞免疫治疗[/color][color=#404040]细胞免疫治疗质量控制&产业化[/color][color=#404040]细胞治疗药物研发与商业化生产[/color][color=#404040]细胞治疗产品开发与工艺优化[/color][color=#404040]TIL细胞在实体瘤治疗中的技术挑战与发展趋势[/color][color=#404040]iPSC来源的CAR先天性免疫细胞及其在肿瘤免疫细胞治疗中的应用[/color][color=#404040]细胞外囊泡的多组学研究[/color][color=#404040]细胞外囊泡RNA组分解析及其应用[/color][color=#404040]外泌体技术的开发与临床转化[/color][color=#404040]3、单细胞多组学研究与临床应用峰会[/color][color=#404040]单细胞多组学研究与临床应用[/color][color=#404040]单细胞转录组技术致力于大脑发育及神经干细胞调控的研究[/color][color=#404040]单细胞多组学科学创新前沿及最新技术[/color][color=#404040]单细胞空间组学的开发与应用进展[/color][color=#404040]单细胞技术助力精准医学研究[/color][color=#404040]单细胞组学研究技术在肿瘤免疫与个性化治疗中的应用[/color][color=#404040]单细胞技术在肿瘤微环境及肿瘤细胞异质性探究中的应用[/color][color=#404040]单细胞测序结合多组学技术的应用[/color][color=#404040]4、细胞与基因治疗前沿技术应用峰会[/color][color=#404040]细胞及基因治疗的临床研究与产业转化[/color][color=#404040]细胞与基因治疗的国内外最新研究进展[/color][color=#404040]细胞与基因治疗CDMO[/color][color=#404040]基因治疗及溶瘤病毒产品的开发[/color][color=#404040]AAV基因治疗药物大规模生产工艺研究及成本控制[/color][color=#404040]基因治疗GMP病毒载体规模化生产[/color][color=#404040]基因工程化外泌体用于肿瘤靶向治疗的研究[/color][color=#404040]溶瘤病毒及RNA疗法[/color][color=#404040]5、3D细胞培养与类器官临床应用峰会[/color][color=#404040]3D细胞培养与类器官前沿进展[/color][color=#404040]3D类器官培养技术发展及其应用[/color][color=#404040]类器官基础研究与技术开发[/color][color=#404040]类器官临床医学研究与应用[/color][color=#404040]类器官药物筛选与生物制造[/color][color=#404040]类器官技术的科研应用和临床转化[/color][color=#404040]类器官在肿瘤精准医学研究中的应用[/color][color=#404040]类器官在伴随诊断和新药研发中的应用和进展[/color][color=#404040]微流控器官芯片在精准医疗及药物研发中的应用[/color][color=#404040]* 最终议程以现场为准，发言企业可自行命题[/color][color=#404040]更多嘉宾邀约中，欢迎各单位推荐自荐！[/color][color=#404040]* 最终以现场为准[/color][color=#404040]谁将参与[/color][color=#404040]全国各大医院的院长、医院管理者、肿瘤内科、肿瘤外科、生物治疗科、血液科、病理科、辅助生殖科、检验科等各科室主任医师、副主任医师、主治医生及从相关领域研究的专家、科研人员、医药企业等；[/color][color=#404040]科研院所、生物医药企业、技术服务代理商及投资机构、临床医生等；[/color][color=#404040]知名高校的教授、研究员、副研究员及生命科学专业、药学专业、医学专业、免疫学专业等；[/color][color=#404040]细胞及肿瘤抗体免疫治疗上游供应商、诊断试剂及设备服务商、技术与设备仪器提供商、IT大数据解决方案提供商等；[/color][color=#404040]基因治疗、基因编辑、基因测序、基因检测公司、生物技术公司研发人员等技术人员、研发总监等；[/color][color=#404040]精准医疗方面的机构、企业、细胞存储与治疗上、中、下游产业链的企业以及CRO、CMO等；[/color][color=#404040]CEO及药厂研发负责人：抗体免疫治疗药物研发、免疫细胞治疗及制品开发、溶瘤病毒、治疗性疫苗、小分子免疫治疗药物、细胞治疗与再生医学领域的专家、临床研究人员、从业医师、研究生以及细胞治疗与再生医学领域的医疗用品科研人员与厂商等；[/color][color=#404040]政府机构与代表、产业园区、招商局、投资孵化机构、咨询与培训机构、银行、律师、知识产权、证券公司等。[/color][/size][size=14px][color=#404040][img=2021.9嘉宾集竖版.jpg,1047,1177]https://img-user-qn.hudongba.com/upload/_oss/uePasteUpload/202206/2315/1655968748942_2757.jpg?image/auto-orient,1/quality,q_80[/img][/color][/size][size=14px][color=#404040]2021细胞产业大会 2021第六届（上海）细胞与肿瘤精准医疗高峰论坛伴随着为期两天的会议和三天的展览于4月25日在上海展览中心（上海市静安区延安中路1000号）落下帷幕！本次大会集聚60+行业大咖到场分享精彩演讲，现场参观参会人数高达1800多人，共有100多家优质展商和60多家行业媒体列席，呈现出一场学术与产业紧密交融的盛宴。细胞产业大会成熟的“会议+展览”的模式得到了参会嘉宾、参展企业及参会代表的一致好评！[/color][/size][size=14px][color=#404040][img=2021.4嘉宾集竖版.jpg,1047,1266]https://img-user-qn.hudongba.com/upload/_oss/uePasteUpload/202206/2315/1655968747557_2756.jpg?image/auto-orient,1/quality,q_80[/img][/color][/size][size=14px][color=#404040]2021细胞产业大会 2021第七届（深圳）细胞与肿瘤精准医疗高峰论坛/2021基因与精准诊疗（深圳）高峰论坛/2021肿瘤精准诊疗（深圳）论坛伴随着为期两天的会议和展览于10月27日在深圳会展中心落下帷幕！疫情特殊时期，本次大会采用了“线上（约12万人观看）+线下（600多人参加）”相结合的方式同步进行的，专家们以专业的视角分享行业动态，以战略的眼光探讨产业发展，共商细胞治疗、基因治疗及肿瘤精准诊疗的未来发展之路！[/color][color=#404040]活动预告[/color][color=#404040]2022细胞产业大会[/color][color=#404040]2022第九届（深圳）细胞与肿瘤精准医疗高峰论坛[/color][color=#404040]时间：2022年8月[/color][color=#404040]地点：深圳[/color][color=#404040]2022细胞产业大会[/color][color=#404040]2022第十届（武汉）细胞与肿瘤精准医疗高峰论坛[/color][color=#404040]时间：2022年11月[/color][color=#404040]地点：武汉[/color][color=#404040]展位及论坛赞助[/color][color=#404040]赞助商及演讲收费标准：[/color][color=#404040]套餐一：2个开放式展位+40分钟演讲+大会电子版会刊封三+资料入袋 RMB 100,000[/color][color=#404040]套餐二：1个开放式展位+30分钟演讲+大会电子版会刊彩页1P RMB 50,000[/color][color=#404040]套餐三：1个开放式展位+20分钟演讲+大会电子版会刊彩页1P RMB 40,000[/color][color=#404040]套餐四：20分钟演讲 RMB 20,000[/color][color=#404040]套餐六：1个开放式展位 RMB 22,800[/color][color=#404040]套餐七：光地展位每平方米 RMB 2,000[/color][color=#404040]听众参会代表收费标准：[/color][color=#404040]2022年8月1日前注册RMB 1,000/人，8月1日后注册RMB 1,200/人（深圳） [/color][color=#404040]2022年11月1日前注册RMB 1,000/人；11月1日后注册RMB 1,200/人（武汉） [/color][color=#404040]团体注册：3人以上可享受9折优惠（深圳、武汉两地均享此政策）[/color][color=#404040]费用包含：会议资料、大会入场资格、授权老师的PPT、午餐、茶歇等。[/color][color=#404040]上海顺展展览服务有限公司[/color][color=#404040]联系人：顾先生13621995193（微信Wechat）[/color][color=#404040]邮箱：[/color][/size][size=14px][color=#404040][email]2498299886@qq.com[/email][/color][/size][size=14px][color=#404040]地址：上海市松江区沪松公路1221号星晨大厦801室[/color][/size][size=14px][color=#404040][img]https://img-user-qn.hudongba.com/upload/_oss/userarticleimg/202207/28/11658988287538_article1_1574.png?image/auto-orient,1/quality,q_80[/img][/color][/size][/b]

【序号】：7【作者】： 程丹1龚月宾1,2陈娇1【题名】：羊膜移植在宫腔镜下宫腔黏连分离术后预防宫腔黏连复发中的有效性和安全性【期刊】：中华妇幼临床医学杂志(电子版). 【年、卷、期、起止页码】：2019,15(04)【全文链接】：https://kns.cnki.net/kcms/detail/detail.aspx?dbcode=CJFD&dbname=CJFDLAST2019&filename=ZHFY201904014&uniplatform=NZKPT&v=fks_CoOoYcmtdCBIVINcW4AcAmUORtEJmYEyyF1kpfyqcVloGO0g1nkBAbnFmRHS

从大小来讲，细胞培养瓶约可分为约600ml，250ml，50ml和25ml的，一般都经过表面改性处理，适合细胞贴壁和生长。600ml 、300ml的多用于大规模培养时用（如单克隆细胞的培养等），50ml的多用于一般性细胞实验用（一般性的传代，保存细胞，为实验提供细胞等），25ml一般是用来复苏细胞或细胞较少时的培养，还有做原代细胞时也可以做多瓶而避免交叉污染。当然还有其他如圆形的等，都可根据个人爱好和实验需要自己选择。 根据细胞培养瓶制作材料的不同，也有玻璃和塑料之分，这里谈一点自己的浅见（欢迎不同意见的战友拍砖）。不同的细胞对胰酶的敏感度不一样，所以在实验中我们常常会遇到一些细胞消化半天也没有起色，导致细胞状态不断下滑，直至最后的死亡以至于实验进展的不顺利。当然，有时候是可以通过加一些EDTA等来增强胰酶的能力，或者提高胰酶的浓度来实现，在培养一些细胞过程中，我发现，一些细胞对玻璃和塑料制品粘附能力不同，如RAW264.7，平滑肌细胞等，在转换培养瓶之后，可以发现好消化了很多，并且在回到原制品的培养瓶时不会改变它的贴壁能力。这里希望有经验的战友可以分享你们的经验。 关于培养板的购买其实我也没有什么经验，想说的就是要尽量避免购买国产的培养板，国产的一些培养瓶还可以，但是培养板我们买过很多国产的，确实效果不是很好，细胞在里面基本上长的非常非常磕碜。所以经费富余的情况下，这些东西能买进口的就买吧。大公司的基本都可以买，BD，Corning等等。这些东西原则上是一次性的，但是我们大部分实验室根本不可能做到，其实泡酸，洗干净再用也没问题，毕竟我们没有老外那么富足的经费，所以我们就累点吧，多做点体力活锻炼一下身体吧。滴管其实也没什么好说的，国产的就足够了。要说的是图中我比较喜欢用C类的滴管，原因就是塞上棉花后吹打细胞不会怕棉花湿掉而引起污染，而且用完棉花也方便取出，便于下次再用。

1、搅拌式动物细胞培养罐　　搅拌式培养罐靠搅拌桨提供液相搅拌的动力，它有较大的操作范围、良好的混合性和浓度均匀性，因此在生物反应中被广泛使用。但由于动物细胞没有细胞壁的保护，因此对剪切作用十分敏感，直接的机械搅拌很容易对其造成损害，传统的用于微生物的搅拌培养罐用作动物细胞的培养显然是不合适的。所以，动物细胞培养中的搅拌式培养罐都是经过改进的，包括改进供氧方式、搅拌桨的形式及在培养罐内加装辅件等。　　(1)供氧方式的改进　　一般情况下搅拌式培养罐还常伴有鼓泡，为细胞生长提供所需氧分。由于动物细胞对鼓泡的剪胞生长提供所需氧分。由于动物细胞对鼓泡的剪切也很敏感，所以人们在供氧方式的改进上做了许多工作。笼式供氧是搅拌式动物细胞培养罐供氧方式的一种，即气泡用丝网隔开，不与细胞直接接触。培养罐既能保证混合效果又有尽可能小的剪切力，以满足细胞生长的要求。北野昭一报道了一个经过改进的搅拌式动物细胞培养罐，整体呈梨形，搅拌置于培养罐底部，在搅拌轴外装了一个锥形不锈钢丝网与搅拌轴一起转动。轴心处的鼓泡管在丝网内侧鼓泡，丝网外侧的细胞不与气泡直接接触。　　(2)搅拌桨的改进　　搅拌桨的形式对细胞生长的影响非常大，这方面的改进主要考虑如何减小细胞所受的剪切力。有人对搅拌桨的形式作了改进，并在反应器内加装了辅件，实验证明改进后的反应器适用于对剪切力敏感的细胞进行高密度培养。反应器采用了一个双螺旋带状搅拌桨，顶部的法兰盖上安装了3块表面挡板。每块挡板相对于径向的夹角为30°，垂直插入液面。挡板的存在减小了液面上的旋涡。这个反应器维持了较小的剪切力，实验中用于昆虫细胞的培养，最终的培养密度达到6×106个/mL，成活率在98%以上。　　2、非搅拌式动物细胞培养罐　　搅拌式细胞培养罐用于动物细胞培养存在的最大缺点是剪切力大，容易损伤细胞，虽然经过各种改进，这个问题仍很难避免。相比之下，非搅拌式培养罐产生的剪切力较小，在动物细胞培养中表现出了较强的优势。　　(1)填充床反应器填充是在反应器中填充一定材质的填充物，供细胞贴壁生长。营养液通过循环灌流的方式提供，并可在循环过程中不断补充。细胞生长所需的氧分也可以在反应器外通过循环的营养液携带，因而不会有气泡伤及细胞。这类反应器剪切力小，适合细胞高密度生长。　　(2)中空纤维反应器中空纤维培养罐由于剪切力小而广泛用于动物细胞的培养。这类培养罐由中空纤维管组成，每根中空纤维管的内径约为200μm，壁厚为50～70μm。管壁是多孔膜，O2和CO2等小分子可以自由透过膜扩散，动物细胞贴附在中空纤维管外壁生长，可以很方便地获取氧分。　　(3)气升式细胞培养罐气升式生物反应器(airliftbioreactor)也是实现动物细胞高密度培养的常用设备之一，其特点是结构简单，操作方便。有人在气升式反应器中利用微载体培养技术，研究了Vero细胞高密度培养的工艺条件。证明气升式反应器中悬浮微载体培养Vero细胞，在加入适量保护剂、营养供应充足的情况下，细胞可以正常生长至长满微载体表面，终密度可达1.13×106个/mL。

骨髓间充质干细胞总结 2003年8月，为给大家提供一个网上交流干细胞研究经验的平台，我们干细胞版设立了骨髓间充质干细胞培养讨论区，经过近三个月的讨论学习，我们既学习丰富了自己的知识体系，也对间充质干细胞尤其是分离培养方面有了更为详实的认识，为了大家阅读的方便，我们决定把本版中的相关内容，同时参考部分书目和文献，做一总结。一、骨髓间充质干细胞的分离 目前常用的分离MSC的方法有全骨髓法和密度梯度离心法，全骨髓法即根据干细胞贴壁特性，定期换液除去不贴壁细胞，从而达到纯化MSC的目的。密度梯度离心法即根据骨髓中细胞成分比重的不同，提取单核细胞进行贴壁培养。随着对MSC表面抗原认识的深入，有人利用免疫方法如流式细胞仪法、免疫磁珠法等对其进行分离纯化，但经过流式或磁珠分选后的细胞出现了增殖缓慢等一些问题，加之耗费较大和技术的难度，在某种程度上限制了这些方法的广泛应用。1. 直接培养法（全骨髓培养法） 1987年，Friedenstein等发现在塑料培养皿中培养的贴壁的骨髓单个核细胞在一定条件下可分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞和成肌细胞，而且这些细胞扩增20－30代后仍能保持其多向分化潜能，这类细胞即为骨髓间充质干细胞（BMSC），其工作对今后MSC的研究具有重要意义，不仅证实了骨髓MSC的存在，而且创建了一种体外分离和培养MSC的简便可行的方法，得到了广泛的应用。culture-spirit采用直接贴壁法，24-36小时首次换液，换液时用PBS洗两次，7-10天传第一代，以后2-3天传代。培养基采用Hyclone的DMEM/F-12（1：1），血清是天津TBD的FBS（顶级），得到了较好的培养结果。布兰卡根据自己培养大鼠MSC的经验，详细介绍了实验步骤：（1）接种后60-80分钟,换液去除悬浮细胞（2）原代培养24 h,48 h各换液一次（3）观察细胞情况，在原代培养7天左右时，如观察到成片的典型形态的细胞，在瓶底用Marker笔标记，0.25%胰酶消化，镜下观察控制，约5-10分钟（室温太低时应放置到孵箱中），加入全培养基终止消化，瓶体朝上，吸管轻轻吹打4-8分钟，尤其是标记部位。不要用力吹打，以免把贴壁较牢的成纤维细胞，上皮样细胞吹打下来。（4）传代到新瓶中，加入少量培养基，孵箱静置20-30分钟后，MSC大多牢固贴壁。瓶底朝上，轻轻吹打，丢弃悬浮以及贴壁不牢的细胞（大多是上皮样细胞），加入全培养基开始传代培养，如观察仍有较多杂细胞，可重复上述步骤。（5）经上述处理后，原代的那瓶细胞仍有一些MSC生长，可继续按原代培养，如观察到MSC的克隆，仍可按上述步骤纯化处理。（6）原代或传代的细胞如观察的少量成片的杂细胞，可直接镜下瓶底标记后，超净台里用长吸管尖端机械刮除，吸出去掉。菊花与刀用的是全骨髓培养法，直接用含10%的FBS培养基冲洗大鼠的股骨和胫骨，为了避免冲起许多气泡应缓慢冲，冲的次数不应太多。冲洗后不用离心直接接种在培养瓶里，48 h~72 h后首次换液，一般7~10天可传代。天之饺子介绍的小鼠MSC的分离方法：取6 w小鼠的股骨和胫骨，直接用含培养基冲出骨髓，一定要尽量把干垢端的骨髓冲干净。冲洗后不离心直接接种在培养瓶里，24－48 h后去悬浮，再接下来的每3－4天换液一次，直到需要传代。2. 密度梯度离心法 裴雪涛等用比重为1.073 g/ml的percoll分离（400 g×20 min）人骨髓MSCs，取界面处细胞层，离心后洗涤以2×105/cm2的密度接种，72 h后更换培养液，弃掉未贴壁细胞，以后每3 d换液一次。细胞长到80％汇合时1：1传代。菊花与刀利用PERCOLL密度1.073分离大鼠MSC 时，用2400 rpm×20 mins后可见中间有一层约1～2 mm厚的白色层，仔细用吸管吸取这一层再用PBS离心2遍即可加培养基和胎牛血清培养即rMSCs。周进明等利用密度为1.082的percoll分离小鼠MSCs，500g×30min离心后，取中间的单个核细胞层，PBS洗两次，接种于IMDM培养基，1 d后换液，去掉非贴壁细胞，以后每3-4天换液。jetter用过FICOLL,FERCOLL,上海二分厂的淋巴细胞分离液分离MSC细胞效果都不错，当然所获细胞群的纯度不一，Percoll最纯，而上海二分厂的淋巴细胞分离液所获细胞群的传代能力优秀（35 PASSAGE）。本版的部分园友认为MSC贴壁培养得到的细胞不均一，但是多能分化能力和增殖力好，percoll分离得到的细胞较为均一，多能分化性和增殖力不如贴壁培养的，尤其是增殖力相差很远，有人添加bFGF或/和表皮生长因子发现可以增强增殖能力。二、骨髓间充质干细胞的培养 天之饺子认为，间质干细胞的培养一定要用塑料培养瓶，不能用玻璃的。因为象间质干这类的基质细胞不易贴玻璃，而且现在买的进口好品牌的培养瓶都涂有一层促细胞贴壁的物质，多数园友培养时都添加10－15％胎牛血清。分离培养结果的差异可能是由于各个研究小组标本来源、采用的分离方法不同从而所获得的细胞不同，或者用来检测的细胞代数不同，或者培养过程中用的胎牛血清不同，导致MSCs获得或失去这些表面标记物的表达。三、骨髓间充质干细胞的特性 体外培养的MSC体积小，成梭形，核浆比大。不表达分化相关的细胞标志，如I、II、III型胶原、碱性磷酸酶或Osteopontin；也不表达SH2、SH3、CD29、CD44、CD71、CD90、CD106、CD120a、CD124、CD166和多种表面蛋白，这群细胞特性稳定，扩增一代和两代后的细胞同质性分别达到95％和98％。MSC联系传代培养和冷冻保存后仍能具有多向分化潜能，而且保持正常的核型核端粒酶活性，但不易自发分化，在体外特定的诱导条件下，MSC可以分化为骨、软骨、脂肪、肌腱、肌肉、神经等多种细胞。四、其他相关内容 Jiang将从成人以及成年大鼠和小鼠骨髓分离的间充质干细胞（CD45－TER119－）命名为多潜能成年祖细胞，他们证明，MAPC高表达端粒酶，而且随着细胞的扩增，端粒的长度不变，单个MAPC来源的细胞群不仅能在体外向3个胚层的细胞分化，而且能在体内能够向各种组织细胞分化，相比较而言，形态与MSC相似的体外培养的皮肤成纤维细胞则不具有类似的分化潜能。参考文献 生理学报2003.55（2）：153－159 人骨髓间充质干细胞在成年大鼠脑内的迁移及分化中华放射医学与防护杂志.2002,22(3).-167-169 培养小鼠骨髓间充质干细胞及其移植后在体内的定位分布Exp Biol Med Vol. 226:507 520, 2001 Mesenchymal Stem CellsNATURE |VOL 418 | 4 JULY 2002 Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow干细胞生物学 裴雪涛 主编

【序号】：2【作者】：郜坤洁【题名】：人脐带脱细胞细胞外基质水凝胶的制备及相关性能研究【期刊】：南方医科大学【年、卷、期、起止页码】：2022【全文链接】：https://kns.cnki.net/kcms2/article/abstract?v=3uoqIhG8C447WN1SO36whLpCgh0R0Z-i16_wNaYct1rCckkTLVqOrRrxFeU2NGsFOH53JjrctrPrUUGId2crPEl-rpQXKB0w&uniplatform=NZKPT

简单介绍一下细胞培养技术，本人这段时间主要做细胞工作，和大家共勉吧！细胞培养技术一、细胞培养的条件和要求 二、细胞分离 三.体外培养细胞龄的计算四.细胞鉴别试验 五、细胞计数六、细胞传代 七、细胞的冻存和复苏 八、细胞培养用水处理 九、选择小牛血清的微量细胞培养检查法 十、葡萄糖测定法 十一、乳酸测定法十二、细胞培养方式

鸡蛋，在如今的社会里，更多时候是作为一种营养丰富的食品出现在我们的餐桌上。现代化大型养殖场如生产产品般输出鸡蛋的方式颠覆了人们对鸡蛋的认识，或许已经很少有人能够联想到从蛋黄蛋白到一个小生命的奇迹升华。但在人类漫长的历史中，农业是文明的核心。就在不太遥远的过去，大多数人还可以在家中目睹鸡生蛋、蛋生鸡的奇迹。这种神秘的现象让古时的人们感到好奇、困惑，甚至产生莫名的崇拜。我们华夏文明由雏鸡的诞生联想到世界的起源，“天地混沌如鸡子，盘古生其中”，看来在我们祖先的眼中，鸡蛋的孵化犹如天地诞生般神秘。这种“卵生崇拜”在史籍中屡见不鲜，如《史记·殷本纪》记述商朝人先祖契的来历时提到有娀氏的女儿简狄“见玄鸟坠其卵，简狄取吞之，因孕生契”，同样，在《史记·秦本纪》中，文章伊始就记载了颛顼的孙女女修织布时“玄鸟陨卵，女修吞之，生子大业”，而这位大业就是秦人的先祖。不得不佩服古人的想象，这玄鸟蛋孵化出了两个重要朝代。在漫长的历史中，这种对蛋朦胧而浪漫的崇拜逐渐融入了我们的文化中，直到如今，染红壳的鸡蛋依旧是新婚、生子、满月时，人们表达祝福的重要载体。随着科技的进步，人们对蛋的理解逐渐清晰，现在很多人都知道蛋和卵细胞有千丝万缕的关系。可是鸡蛋到底是否就是一个细胞？答案可谓五花八门，有人说整个鸡蛋就是一个放大的卵细胞，蛋壳内的那层膜是细胞膜，蛋清是细胞质，蛋黄是细胞核；也有人说蛋黄是卵细胞，卵黄膜就是细胞膜，蛋黄就是细胞质，而蛋黄上面的小白点是细胞核；还有人认为鸡蛋本就是由很多细胞构成的。