貂肺上皮细胞

[align=center][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]上皮细胞[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]-[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]间充质转化[/color][/size][/font][/align][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]上皮细胞[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]-[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]间充质转化，是指上皮细胞转化为具有间质表型细胞的生物学过程，[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]在肿瘤的侵袭和转移等方面[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]具有[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]重要作用[/color][/size][/font][font='times new roman'][sup][size=16px][color=#000000][31][/color][/size][/sup][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]经历[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]EMT[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]过程的细胞具有类似干细胞的特性，耐药性也随之增强[/color][/size][/font][font='times new roman'][sup][size=16px][color=#000000][32][/color][/size][/sup][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]。研究发现，在乳腺癌的小鼠模型中，降低[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]snail[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]的表达，肺转移的发生显著减少[/color][/size][/font][font='times new roman'][sup][size=16px][color=#000000][33][/color][/size][/sup][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]。胰腺癌、肺腺癌细胞在[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]EMT[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]过程后表现出更强的迁移和侵袭能力[/color][/size][/font][font='times new roman'][sup][size=16px][color=#000000][34, 35][/color][/size][/sup][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]从[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]EMT[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]转录调控的角度看，[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]与非小细胞肺癌相比，人小细胞肺癌细胞系中[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]EMT[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]相关转录因子的表达量较高[/color][/size][/font][font='times new roman'][sup][size=16px][color=#000000][36][/color][/size][/sup][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]Krohn[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]等人研究发现，[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]E[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]-cadherin[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]表达下调，[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]Vimentin[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]表达上调的贴壁的小细胞肺癌亚系[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]NCIH69V[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]具有更高的侵袭性[/color][/size][/font][font='times new roman'][sup][size=16px][color=#000000][37][/color][/size][/sup][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]。在小细胞肺癌中，[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]EMT[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]与[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]PARP[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]抑制剂、顺铂、[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]Bcl-2[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]抑制剂等药物的耐药具有显著关联性。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]E[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]-cadherin[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]表达量较高的小细胞肺癌对[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]Bcl-2[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]抑制剂具有更好的应答率[/color][/size][/font][font='times new roman'][sup][size=16px][color=#000000][38][/color][/size][/sup][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]Contactin 1[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]通过诱导[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]EMT[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]过程调节小细胞肺癌聚乙二醇精氨酸酶的耐药性[/color][/size][/font][font='times new roman'][sup][size=16px][color=#000000][39][/color][/size][/sup][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]。越来越多的研究证明，小细胞肺癌[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]EMT[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]过程受到多种通路的调节，促进小细胞肺癌细胞的增殖、侵袭和转移，并促进化疗的耐药性[/color][/size][/font][font='times new roman'][sup][size=16px][color=#000000][40-44][/color][/size][/sup][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]EMT[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]指的是上皮细胞变成具备间质细胞形态和特性的细胞的[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]过程[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]在[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]EMT[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]的发生过程中[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]，[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]细胞丧失上皮表型[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]，[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]同时获得间质表型。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]E-cadherin[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]水平下降可以导致细胞的粘附力降低[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]，[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]使细胞获得易于侵袭和转移的特性[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]，这[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]已经被认为是[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]EMT[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]最显著的特征。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]在乳腺癌及宫颈癌中发现，[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]MSI1[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]促进肿瘤[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]EMT[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]过程[/color][/size][/font][font='times new roman'][sup][size=16px][color=#000000][29][/color][/size][/sup][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]。通过[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]Western blot[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]技术检测[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]MSI1[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]低表达后[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]EMT[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]相关蛋白的表达情况。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]如果[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]与对照相比，[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]H69[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]-sh[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]MSI1[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]组[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]N-cadherin[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]、[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]Vimentin[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]表达量下降，而[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]E-cadherin[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]表达量上升，表明[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]MSI1[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]低表达的[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]H69[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]细胞的[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]EMT[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]过程受到了抑制，减少了肿瘤转移的概率。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]Wnt[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]信号通路能通过抑制[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]GSK3β[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]（糖原合成酶激酶[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]3β[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]，[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]glycogen synthase kinase -3β[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]）介导的磷酸化作用以及抑制胞质中的[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]β-catenin[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]降解等作用来诱发[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]EMT[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]转换[/color][/size][/font][font='times new roman'][sup][size=16px][color=#000000][75][/color][/size][/sup][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]研究显示，抑制[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]Wnt[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]信号通路逆转非小细胞肺癌[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]EMT[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]过程[/color][/size][/font][font='times new roman'][sup][size=16px][color=#000000][76][/color][/size][/sup][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]，而肿瘤干细胞[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]LGR5[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]通过活化[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]Wnt[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]通路促进神经胶质瘤[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]EMT[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]过程[/color][/size][/font][font='times new roman'][sup][size=16px][color=#000000][77][/color][/size][/sup][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]。参与[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]EMT[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]过程的信号通路还有：[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]TGF-β[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]、[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]Notch[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]、[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]SMAD[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]、[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]PI3K-AKT-MTOR[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]信号通路[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]等，其中涉及[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]MSI1[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]调节的信号通路。在人小细胞肺癌细胞系中，[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]MSI1[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]可能通过[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]Wnt[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]通路调节[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]EMT[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]过程，也可能通过其他通路协同作用，[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]具体机制仍需进一步关注与研究。[/color][/size][/font]

胆固醇稳态对机体正常的细胞和系统功能至关重要，胆固醇平衡失调是心血管疾病、神经退行性疾病和癌症等其他疾病的基础[1]。胆固醇代谢包括内源性胆固醇合成、吸收和排泄等环节。研究表明，胆固醇在体内不能被降解，有效排泄是维持其稳态的重要环节[2]。体内积累的胆固醇最终通过肠道以粪便消除胆固醇和胆汁酸的形式达到平衡，目前已知的胆固醇排泄途径包括了胆固醇逆转运（reverse cholesterol transport，RCT）途径和经肠胆固醇排泄（transintestinal cholesterol excretion，TICE）途径；前者是肝脏将胆固醇转化为胆汁酸后经肠排出，后者是由血直接经肠道分泌和排出血浆脂蛋白来源的胆固醇，二者交汇于肠道，因此，肠道在胆固醇稳态中发挥了重要作用[3-4]。调血脂治疗是防治体内高胆固醇含量诱导的相关疾病的有效方法，目前临床常用调血脂药物他汀类的作用是通过降低低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）以限制内源性胆固醇合成，从而防治心血管等疾病的发生发展，但其相关发病率和死亡率仅降低了30%[5]。这意味着需要更多策略来解决这个严重的公共卫生事件。 雷公藤红素（celastrol，CeT）是一种从传统中药雷公藤Tripterygium wilfordii Hook. f.中提取分离出的活性成分，具有抗炎、抗癌和抗动脉粥样硬化等多种药理活性[6]，且具有良好的成药性，被《Cell》杂志列为最可能转化为现代药物的5种有潜力传统药物之一[7]。Zhang等[8]前期研究发现，体外有效成分为CeT的南蛇藤能够通过在促进RCT减少脂质蓄积方面具有积极作用，其机制主要是通过激活清除剂受体B类成员1（scavenger receptor class B member 1，SRB1）、ABC转运体和细胞色素P450家族7亚家族A成员1（cytochrome P450 family 7 subfamily A member 1，CYP7A1）途径促进胆固醇代谢。然而，有关CeT调控胆固醇代谢的作用机制探索尚不完善。此外，迄今为止，并无有关CeT通过调控肠道TICE途径介导胆固醇代谢的相关研究。因此，本研究采用网络药理学和系统生物学理论，通过构建“CeT-靶点-肠道胆固醇代谢”多层次网络，初步预测CeT调控肠上皮细胞胆固醇代谢的作用机制[9-10]，并结合实验深入探讨和验证CeT调控肠上皮细胞胆固醇代谢的作用及机制，旨在为维持体内胆固醇稳态提供新的方向和理论依据。 1 材料 1.1 细胞 大鼠小肠隐窝上皮IEC-6细胞（批号ZQ0783）由中国科学院上海细胞库提供。 1.2 药品与试剂 CeT（批号C0869）购自美国Sigma公司；肝X受体α（liver X receptor α，LXRα）抑制剂GSK2033（批号HY-108688）、Bodipy荧光染色（批号HY-W090090）购自美国MCE公司；0.25%胰蛋白酶（批号PB180229）购自美国Hyclone公司；DMEM高糖完全培养基（批号ZQ-121）、DMEM基础培养基（批号09122）购自上海中乔新舟生物科技有限公司；磷酸酶抑制剂（批号CW2383S）、蛋白酶抑制剂（批号CW2200S）、BCA试剂盒（批号CW0014S）、SDS-PAGE试剂盒（批号CW0022S）、Loading buffer（批号CW0028S）液购自康为世纪生物科技股份有限公司；CCK-8试剂盒（批号C0037）、RIPA裂解液（批号P0013B）、ECL化学发光试剂盒（批号P0018S）购自碧云天生物技术股份有限公司；油红O染色试剂盒（批号G1262-4）购自北京索莱宝科技有限公司；PVDF膜（批号ISEQ00010）购自美国Millipore公司；兔抗三磷酸腺苷结合盒转运蛋白G5（adenosine triphosphate-binding cassette transporters G5，ABCG5）抗体（批号27722-1-AP）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体（批号10494-1-AP）、山羊抗兔二抗（批号SA00001-2）购自美国Proteintech公司；兔抗ATP结合盒转运蛋白G8（ATP-binding cassette transporters G8，ABCG8）抗体（批号A01482-2）购自武汉博士德生物工程有限公司；兔抗NPC1样细胞内胆固醇转运蛋白1（NPC1 like intracellular cholesterol transporter 1，NPC1L1）抗体（批号PA5-116672）购自美国Thermo Fisher Scientific公司；兔抗LXRα抗体（批号ab41902）、DAPI染液（批号ab228549）购自英国Abcam公司。 1.3 仪器 ix 73型倒置荧光显微镜（日本Olympus公司）；FC型酶标仪、Forma 3系列CO2培养箱、EVOS fl auto全自动荧光倒置荧光学显微镜（美国Thermo Fisher Scientific公司）；ChemiDoc XRS+化学发光成像系统、Mini-PROTEAN Tetra蛋白电泳系统（美国Bio-Rad公司）。 2 方法 2.1 网络药理学研究 将PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）得到的CeT 3D结构导入PharmMapper（http://www. lilab-ecust.cn/pharmmapper/）进行药物靶点预测。通过NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）得到肠道和胆固醇代谢靶点。并与CeT靶点取交集得到共有靶点；通过STRING（https://STRING-db.org）进行蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络构建，并导入Cytoscape 3.9.1软件构建网络模型并分析；通过DAVID（https://david. ncifcrf.gov/）进行基因本体（gene ontology，GO）功能及京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析；利用PDB（https://www.rcsb.org/）筛选并下载分辨率小于0.25 nm的靶点的结晶复合式，结合上述得到的CeT 3D结构，采用Autodock进行分子对接，运用PyMol可视化处理。 2.2 实验验证 2.2.1 IEC-6细胞培养 IEC-6细胞用DMEM高糖完全培养基于37 ℃、5% CO2的恒温培养箱中常规培养。 2.2.2 CCK-8法检测细胞存活率 将对数生长期的IEC-6细胞接种于96孔板中，5×103个/孔。每孔加入100 μL含不同浓度（0.05、0.10、0.20、0.40、0.80 μmol/L）CeT的培养基，另设置加入无药物培养基的对照组，每组设置5个复孔，培养箱中培养24、48 h。每孔加入10 μL CCK-8试剂，于培养箱中孵育1～2 h后，采用酶标仪在450 nm处检测吸光度（A）值，计算细胞存活率。 细胞存活率＝A给药/A对照 2.2.3 油红O染色评估CeT对肠上皮细胞胆固醇的影响 设置对照组、模型组和CeT（0.05、0.10、0.20 μmol/L）组，除对照组外，其余各组加入DMEM基本培养基配制的胆固醇胶束（cholesterol micelles, C-M，10 mmol/L）构建肠上皮细胞高胆固醇模型[11]，给药组加入不同浓度的CeT溶液，对照组加入不含药物的培养基。干预24 h后，加入ORO Fixative固定液固定细胞；加入1 mL 60%异丙醇浸洗；加入油红O染液（ORO Stain A∶ORO Stain B＝3∶2），洗涤至孔内无红色剩余；加入Mayer苏木素染色液，洗涤；加入油红O染液缓冲液；加入蒸馏水覆盖细胞并拍照，使用Image-Pro Plus软件以脂滴与整个图像的面积比进行定量。 2.2.4 Bodipy荧光标记法 按“2.2.3”项下方法进行分组和给药，干预24 h后，PBS洗涤，室温下多聚甲醛固定30 min；每孔加入2 μmol/L Bodipy染色液，于37 ℃细胞培养箱中孵育15 min；弃去染色液，PBS洗涤；DAPI复染核5 min，PBS洗涤；观察并拍照。使用Image-Pro Plus软件以荧光强度进行统计。 2.2.5 Western blotting检测TICE相关蛋白表达 按“2.2.3”项下方法进行分组和给药，干预24 h后，收集细胞；PBS洗涤后使用蛋白裂解液提取总蛋白质，BCA定量法测定蛋白质浓度。蛋白样品经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF膜，加入5%脱脂牛奶封闭3 h，用TBST洗涤后加入一抗，4 ℃孵育过夜；洗涤后加入二抗，室温孵育2 h；洗涤后进行显影，使用Image-Pro Plus软件分析条带灰度值。 2.2.6 免疫荧光检测LXRα/ABCG8和LXRα/ NPC1L1通路相关蛋白的影响 设置对照组、模型组、CeT（0.1 μmol/L）组、GSK2033（10 μmol/L）组和CeT＋GSK2033组，除对照组外，其余各组加入DMEM基本培养基配制的胆固醇胶束（10 mmol/L）构建肠上皮细胞高胆固醇模型，各给药组加入相应药物，对照组加入不含药物的培养基。干预24 h后，PBS洗涤3次；4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗涤3次后加入Trition X-100，室温下通透10 min；PBS洗涤3次后，加入免疫染色封闭液封闭60 min，吸去多余的牛血清白蛋白；分别滴加100 μL LXRα（1∶200）、ABCG8（1∶200）、NPC1L1（1∶200）一抗，4 ℃孵育过夜；回收一抗，PBS浸洗3次，滴加100 μL二抗（1∶300），室温避光孵育60 min；PBS洗涤3次，滴加DAPI复染核15 min，PBS洗涤3次；滴加抗淬灭剂10 μL，扣片，正面朝下盖在载玻片上，荧光显微镜下观察并拍照。使用Image-Pro Plus软件分析荧光强度。 2.2.7 统计学分析 采用GraphPad Prism 9.0和SPSS 26.0软件进行统计分析，数据以表示。两组间数据分布的正态性和方差齐性分别以Kolmogo? rov-Smirnov和Levene检验确定。组间均数比较采用t检验；多组间均数比较采用单因素方差分析，组间有差异进一步采用SNK-q检验进行两两比较。 3 结果 3.1 网络药理学研究 3.1.1 CeT-肠道胆固醇代谢靶点 通过TCMSP等数据库得到94个CeT相关靶点。通过NCBI Gene等数据库得到15 415个肠道相关靶点、14 177个胆固醇代谢相关靶点。并构建韦恩图预测CeT-肠道胆固醇代谢共有靶点，见图1。 图片 3.1.2 CeT-靶点-肠道胆固醇代谢网络构建 将PPI导入Cytoscape 3.8.1软件进行可视化，发现1个关键的子网络，见图2。 图片 3.1.3 CeT-肠道胆固醇代谢的GO功能富集分析 对CeT调控肠道胆固醇代谢的作用及机制进行GO富集分析，分别得到855个生物进程、17个细胞组成、53个分子功能，根据P＜0.05，选出排名前10的条目，见图3。 图片 3.1.4 CeT-肠道胆固醇代谢的KEGG通路富集分析 CeT调控肠道胆固醇代谢的通路涉及34条，根据P＜0.05，选出排名前10的通路，见图4。其中，主要涉及脂肪的消化和吸收、过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome proliferators-activated receptor，PPAR）等信号通路。其中，肠道脂质代谢的关键通路（fat digestion and absorption）的靶点（ABCG5、ABCG8、NPC1L1）主要涉及CeT-靶点-肠道胆固醇代谢网络的关键网络之一（图5）。并且该网络主要涉及胆固醇排泄的关键途径——TICE途径。 图片 图片 3.2 分子对接分析 CeT与NR1H3（LXRα）结合能为?28.131 4 kJ/mol，可视化显示，匹配度良好，化合物与靶点结合的最优构象以氢键的方式呈现，结合活性良好，见图6。 图片 3.3 体外实验研究 3.3.1 CeT浓度筛选 不同浓度（0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 μmol/L）的CeT分别干预IEC-6细胞24、48 h后，如图7所示，干预24 h时随着CeT浓度的增加细胞存活率降低，CeT的半数抑制浓度（half inhibitory concentration，IC50）为0.2 μmol/L。本研究在探索CeT安全浓度调控IEC-6细胞胆固醇代谢活性的同时，为了更进一步研究CeT在IC50时是否较安全浓度的效果更好，因此，选择0.05、0.10、0.20 μmol/L的CeT处理细胞24 h进行后续研究。 图片 3.3.2 CeT对IEC-6细胞内脂质的影响 如图8所示，油红O染色与Bodipy荧光标记结果均显示，与对照组比较，胆固醇胶束干预显著增加脂滴染色和荧光强度（P＜0.001），表明造模成功；与模型组比较，各剂量CeT均显著抑制IEC-6细胞中脂质积累（P＜0.05、0.01、0.001）。 图片 3.3.3 CeT对TICE途径关键蛋白的影响 NPC1L1是胆固醇吸收的重要蛋白，ABCG5/G8与胆固醇流出密切相关。如图9所示，与对照组比较，模型组NPC1L1蛋白表达水平显著升高（P＜0.05），ABCG5和ABCG8蛋白表达水平显著降低（P＜0.05、0.01）；与模型组比较，CeT（0.2 μmol/L）组NPC1L1蛋白表达水平显著降低（P＜0.05），CeT（0.1、0.2 μmol/L）组ABCG5和ABCG8蛋白表达水平显著升高（P＜0.05、0.01）。因此，CeT可能通过抑制NPC1L1，促进ABCG5、ABCG8的表达，调控TICE途径介导的胆固醇摄取和流出。 图片 3.3.4 LXRα是CeT调控TICE途径的关键蛋白 如图10所示，与对照组比较，模型组LXRα、ABCG8表达显著降低（P＜0.01），NPC1L1表达显著增加（P＜0.001）；与模型组比较，CeT组LXRα、ABCG8表达显著增加（P＜0.001），NPC1L1表达显著降低（P＜0.01），LXRα抑制剂GSK2033组ABCG8表达显著降低（P＜0.01），NPC1L1表达显著增加（P＜0.05）；与CeT组比较，CeT＋GSK2033组LXRα、ABCG8表达显著降低（P＜0.01），NPC1L1表达显著增加（P＜0.01）。因此，CeT可能通过促进LXRα的表达，调控TICE途径中的关键蛋白NPC1L1、ABCG8介导的胆固醇摄取和流出。 图片 4 讨论 胆固醇广泛存在于机体中，具有广泛的生理作用，是组织细胞中不可缺少的重要物质，它不仅参与细胞膜的形成，也是合成胆汁酸、维生素D及甾体激素的重要原料，但当其过量时便会导致高胆固醇血症，研究表明，心血管疾病、胆石症和肿瘤与高胆固醇血症密切相关[12-13]。胆固醇在体内不能被降解，机体有效排泄胆固醇是维持胆固醇稳态的重要环节[2]。因此，促进体内胆固醇排泄以维持体内胆固醇的动态平衡可能是治疗胆固醇失衡相关疾病的新策略。 基于此，本研究通过网络药理学方法，探讨CeT通过调控肠上皮细胞胆固醇代谢的潜在靶点及相关机制。PPI网络发现，CeT调控肠上皮细胞胆固醇代谢涉及1个核心子网络。其中，ABCG5/8与NPC1L1为胆固醇摄取与流出相关的核心靶点。本研究通过体外构建和模拟肠上皮细胞高胆固醇环境，探索CeT调控肠上皮细胞胆固醇代谢的机制，油红O和Bodipy结果均显示，CeT能够呈浓度相关性地降低胆固醇胶束干预的肠上皮细胞内的脂质积蓄。进一步通过结合KEGG通路分析发现，该子网络中的核心靶点与肠道脂质代谢的关键通路（fat digestion and absorption）相匹配，通过深度分析该通路发现，其主要涉及肠上皮细胞摄取与流出胆固醇中的TICE途径。已有研究表明，胆固醇从体内排出的唯一途径是通过粪便直接排出或转化为胆汁酸后排出，粪便排泄可通过2种独立途径进行，第1种途径是胆汁分泌，该途径已被广泛描述和研究。第2种途径是通过TICE途径[14]。在2009年Van团队初步研究估计，TICE对野生型小鼠体内排出的粪便中性固醇总量的贡献约为30%[15]。接下来，该团队在2010年通过实验得出在小鼠中TICE途径占粪便中性甾醇排泄的70%[16]。在人体生理情况下，TICE途径排泄的胆固醇占粪便胆固醇排泄总量的35%[2,17]。TICE指由血直接经肠道分泌和排出血浆脂蛋白来源的胆固醇。包括肝源性含载脂蛋白B的脂蛋白被基底膜侧低密度脂蛋白受体（low density lipoprotein receptor，LDLR）和其他可能受体吸收、内化，最终通过ABCG5/G8以及其他可能的转运体从顶端膜流出排泄到肠腔[18]。另有研究发现，利用Ezetimibe抑制NPC1L1介导的胆固醇摄取可显著增强TICE途径[2]。而本研究表明，CeT干预处于高胆固醇环境中的肠上皮细胞后，NPC1L1被抑制，而ABCG5、ABCG8被激活。提示，CeT主要通过抑制NPC1L1减少肠上皮细胞胆固醇摄取和促进ABCG5、ABCG8增加胆固醇流出。 LXRα由于其抗动脉粥样硬化、去除胆固醇和抗炎活性，在胆固醇稳态的转录调控中发挥极其关键作用[19]。研究发现，LXRα可调控NPC1L1在肠上皮细胞中的表达，降低肠道胆固醇的吸收[20]。此外，ABCG5和ABCG8是LXRα的直接靶基因，常形成异二聚体ABCG5/G8发挥作用，负责将细胞内胆固醇泵入肠腔并最终通过粪便排出体外[21]。PPI子网络表明，NPC1L1、ABCG5以及ABCG8主要由LXRα交联。因此，在上述研究的基础上，通过分子对接模拟了CeT与LXRα的对接模式，结合活性良好。采用LXRα抑制剂GSK2033处理，结果显示，NPC1L1和ABCG5/G8主要受LXRα调控。提示，CeT可能通过LXRα/ABCG5/ABCG8和LXRα/ NPC1L1途径分别介导IEC-6细胞胆固醇摄取和流出，进而促进TICE途径介导的胆固醇排泄。 本研究通过网络药理学和相关实验发现，CeT可能通过抑制肠上皮细胞胆固醇摄取和促进胆固醇流出维持机体胆固醇稳态，这一效应与核心靶点LXRα密切相关，本研究拓展了CeT调控体内胆固醇代谢的机制，为维持体内胆固醇稳态和胆固醇失衡相关疾病的新药研发提供了新思路。

糖尿病肾病（DN）是糖尿病（DM）最常见且严重的微血管病变之一，常伴有肾小球硬化和肾小管间质纤维化，最终可发展为终末期肾脏病（ESRD），严重危及生命。西医治疗DN主要以降糖、降压、调脂、抗感染为主，但这些手段仍难以阻止炎症反应与肾纤维化的发生，且存在一定的局限性及不良反应，因此，探寻行之有效的DN防治策略，提高治疗水平迫在眉睫［1-3］。中医药根据辨证分型对DN进行治疗已有上千年的历史，对其记载可追溯至《黄帝内经》之“消瘅”及“消渴病”继发的“虚劳、水肿、尿浊、关格、肾劳”等，可通过调节代谢、自噬、抗氧化、抗炎、抗纤维化等机制，对DN进行多靶点调控治疗。在改善DN客观指标、保护肾功能及远期疗效方面，中医药都显示出了独特的优势［4-5］。 黄芪六一汤始载于《太平惠民和剂局方》，由黄芪60 g、甘草10 g组成，具有大补肺气、滋益肾水、调和脾胃的功效［6］。课题组前期发现［7-11］，由黄芪六一汤提取、分离出来的黄芪总皂苷、黄芪总黄酮、黄芪多糖、甘草酸所组成的黄芪六一汤组分（简称“HQD”）具有防治DN、显著改善肾功能的作用。并鉴定出HQD中6个主要原型入血成分（黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素、芒柄花苷、甘草酸）。然而，HQD作为中药复杂化学成分的混合体，其在体内发挥抗DN药效的分子作用机制尚不完全明确，制约了其深层次开发利用。 网络药理学能高效整合中药、成分和靶点之间关系，构建中药-成分-靶点网络，诠释药物与疾病之间的复杂关系，为中药及其复方作用机制研究提供了行之有效的新方法［12-13］。故本实验首先采用网络药理学技术对HQD抗DN的机制进行探索，发现HQD发挥药理作用可能与细胞自噬缺陷有关。据报道［14-15］，自噬缺陷可导致肾小管上皮细胞的损伤，而激活自噬能够减轻这一损伤从而保护肾功能。根据药效学及网络药理学实验结果，推测HQD发挥抗糖尿病肾病的作用机制可能和肾小管上皮细胞自噬水平失调有关，为验证推测结果，本研究从细胞自噬角度出发，采用DN大鼠模型对筛选出的核心通路进行验证，以期为黄芪六一汤及中药复方的分子作用机制研究及深层次开发提供创新思路与借鉴。 1　材料 1.1　仪器 EnVision酶标仪（PerkinElmer）；H1-16KR台式高速冷冻离心机（湖南可成仪器设备有限公司）；Rayto全自动生化分析仪（Chemray 800）；Tissuelyser-24L多样品组织研磨仪（上海净信实业发展有限公司）；三诺血糖仪（长沙三诺生物传感技术有限公司）；Multiskan FC酶标仪（Thermo Scientific）；免染蛋白印迹系统（ChemiDooTM）、蛋白快速转印仪（Trans-Blot Turbo）、胶凝成像系统（GBOXChemiXL1.4）均购自美国Bio-rad公司；电泳仪（PowerPacBasic）、核酸蛋白紫外检测仪（Biomate 3S）、垂直电泳槽，均购自美国Thermo公司；纯水超纯水机（四川优普超纯科技有限公司）；透射电子显微镜（日本电子JEOL）生物显微镜（麦克奥迪实业集团有限公司）；台式高速微量离心机（大龙兴创实验仪器北京股份）；超薄切片机（LEICA）；组织脱水机（LEICA）。 1.2　试药 黄芪（批号220604、211104、220901，四川盛世锦荣药业有限公司）、甘草（批号201024、200306、220805，四川盛世锦荣药业有限公司），黄芪、甘草经贵州中医药大学谢军丽讲师鉴定分别为豆科植物膜荚黄芪 Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.的干燥根、豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.干燥根和根茎。细胞凋亡检测试剂盒（货号E-CK-A322，Elabscience），DAPI（货号C1002，上海碧云天生物技术有限公司），抗荧光淬灭封片剂（货号0100-01，southernbiotech），苏木素（货号H9627，Sigma）；二甲苯（货号10023418）、包埋石蜡（货号69019361）、伊红Y（水溶性，货号71014544）、中性树胶（货号10004160）均购于中国医药集团有限公司；肌酐（Scr，货号C074-d）、尿素氮（BUN，货号C010-a）、总胆固醇（TC，货号C048-a）、三酰甘油（TG，货号C019-a）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C，货号C047-a）检测试剂盒均购于长春汇力生物科技有限公司；尿蛋白测试试剂盒（货号C035-2，南京建成生物工程研究所），RIPA裂解液、PMSF、蛋白酶抑制剂、磷酸化蛋白酶抑制剂、BCA蛋白定量试剂盒、1xTBST 缓冲液、5x蛋白上样缓冲液、β-actin 兔多克隆抗体（货号AC230205001）均购于武汉塞维尔生物科技有限公司；mTOR（货号66888-1-lg）、Beclin 1（货号66665-1-lg）、p-mTOR（货号66882-1-lg）、HRP标记的羊抗鼠 IgG（货号SA00001-2）、HRP标记的羊抗兔 IgG（货号20000373）鼠单克隆抗体均购于武汉Proteintech有限公司；LC3α/β（货号R10241506）、PI3K（货号N09263380）、Akt（货号M04201652）兔多克隆抗体购于沈阳万类生物科技有限公司，链脲佐菌素（STZ，索莱宝生物有限公司，批号2230520002）。 根据本课题组前期确定的HQD制备工艺［10］，按照原处方黄芪与甘草6∶1比例，取符合药典标准的黄芪饮片12 kg和甘草饮片2 kg，制备得质量分数为72.04%的黄芪总皂苷干浸膏76.02 g（含黄芪甲苷2.69%）；质量分数为70.03 %的黄芪总黄酮干浸膏31.64 g（含毛蕊异黄酮葡萄糖苷1.72%、毛蕊异黄酮1.52%、芒柄花苷0.94%、芒柄花素0.31%）；质量分数为67.12%的黄芪总多糖干浸膏185.04 g，质量分数为80.05%的甘草酸精制品22.01 g。将上述制备所得黄芪总皂苷、黄芪总黄酮、黄芪多糖干浸膏与甘草酸精制品全部混合均匀，即得本实验所需HQD样品。 1.3　实验动物 SPF级雄性SD大鼠35只，体质量（300.00±10.82）g，购自长沙市天勤生物技术有限公司，实验动物生产许可证号SCXK（湘）2022-0011，饲养于通风良好，室温18～25 ℃，相对湿度50%～70%，按常规定期消毒的动物房。按每笼4只分装，由专人饲养管理，自由饮水及饲料，实验操作和处理严格遵循国际准则。 2　方法 2.1　HQD抗DN的药效实验 2.1.1 　DN模型大鼠的制备 大鼠适应性喂养1周后，选取8只作为对照组，对照组大鼠喂食普通饲料。其余大鼠高糖高脂饲料喂养2周，尾iv STZ（溶于pH 4.5，0.01 molL-1无菌柠檬酸钠缓冲液）33 mgkg-1，注射4周后测定空腹血糖（FBG）及24 h尿蛋白（24 h U-Alb）含量，以FBG≥11.1 mmolL-1［16-17］，肾组织出现病变为造模成功。其中，24只大鼠造模成功，3只血糖低于11.1 mmolL-1，无死亡大鼠。 2.1.2　分组及给药 将造模成功大鼠随机分为模型组，HQD高、低剂量给药组，每组8只。以黄芪六一汤临床生药用量（黄芪60 g、甘草10 g）的4倍、1倍剂量，换算本实验的HQD高剂量（0.66 gkg-1）与低剂量（0.17 gkg-1）。按照给药剂量，每日固定时间ig 1次，对照组与模型组ig等量的0.9%氯化钠溶液，连续给药8周。 2.1.3　各组大鼠相关生化指标检测 实验期间观察各组大鼠活动情况、精神状态、毛色、进食、饮水量及排泄量状况等。末次给药后，代谢笼收集24 h尿液并记录尿量（禁食不禁水），1 400 rmin-1离心5 min，收集上清。尾静脉采血测FBG，于腹主动脉取血，4 ℃下3 000 rmin-1离心15 min，收集上清。取血后断颈处死各组大鼠，取肾脏，除去被膜，部分肾组织用于病理学、细胞凋亡等检测，其余组织于-20 ℃保存备用。采用全自动生化分析仪，检测血清Scr、BUN、TG、TC、LDL-C水平。按照尿蛋白定量测试盒说明书操作测定尿总蛋白。 2.1.4　肾脏组织病理学观察 取上述部分肾脏置于4%多聚甲醛中固定，蒸馏水冲洗，将组织包裹在石蜡块中，组织脱水，浸蜡、包埋、切片、烤片、切片脱蜡，HE染色、Masson染色，封片，光镜下观察肾脏组织病理学改变。 2.1.5　TUNEL检测细胞凋亡情况 取肾组织石蜡切片进行脱蜡、水化，以蛋白酶K工作液在25℃下消化组织15 min，PBS漂洗，按照说明书对切片进行TUNEL染色，荧光显微镜下观察采集图像，计算细胞凋亡率。 2.1.6　数据统计分析 所有数据以±s表示，统计分析采用SPSS 27单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。 2.2　网络药理学研究 2.2.1　活性成分靶点预测 以HQD中6个主要原型入血成分（黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素、芒柄花苷、甘草酸）为研究对象。采用PubChem数据库 （https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下载活性成分的SDF格式，将其导入SwissTargetPrediction 数据库（http：//swisstargetprediction.ch/）进行活性成分的靶点预测。剔除重复靶点，获取与6个活性成分相关的靶点。通过UniProt数据库 （https：//www.uniprot.org/）将得到的活性成分靶点蛋白名称进行标准化。 2.2.2　DN的靶点预测 通过GeneCard（https：//www.genecards.org/）、DisGeNET（https：//www. disgenet.org/）和OMIM（https：//omim.org/）数据库以“Diabetic nephropathy”为关键词进行检索，剔除重复得到疾病靶点，并用Venny工具将6个活性成分的作用靶点与DN靶点进行交集比对，得到其共同作用的靶点作为6个活性成分治疗DN的潜在靶点。 2.2.3　蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络的构建 为了进一步明确HQD治疗DN预测靶点之间的直接或间接调控关系，将潜在靶点导入STRING数据库（https：//string-db.org/）中构建PPI网络，限定物种为“Homo sapiens”，为了具有高置信度，设置minimum required interaction score≥0.9，并隐藏游离蛋白，以TSV格式保存结果，将其导入可视化的Cytoscape 3.6.0软件进行拓扑分析，筛选得到核心靶点。 2.2.4　基因本体（GO）注释及京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析 将交集靶点导入Metascape（http：//metascape.org/gp/index.html），进行GO功能富集分析；将交集靶点导入KOBAS 3.0数据库（http：//kobas.cbi. pku.edu. cn/ kobas3/genelist/），进行KEGG通路富集分析。下载分析结果，将其分别按P值和“Count”（每条通路中含有的潜在基因靶点的数量）值的大小进行排序。 2.3　实验验证网络药理学预测结果 2.3.1　透射电镜观察肾小管上皮细胞中自噬体及自噬溶酶体的形成 取“2.1.3项”下对照组、模型组、HQD高剂量给药组大鼠部分肾组织约1 cm3，经3%戊二醛预固定24 h左右，1%四氧化锇再固定2 h；依次加入30%、50%、70%、80%、95%、100%的丙酮溶液进行逐级脱水，每次20 min；脱水后，采用丙酮和Epon812包埋剂对其进行渗透和包埋；采用超薄切片机制备60～90 nm的超薄切片；并以醋酸铀避光染色10～15 min，再用柠檬酸铅避二氧化碳染色1～10 min，超纯水清洗3次，滤纸吸干、室温干燥过夜后，采用JEM-1400FLASH透射电镜对各组肾组织中的肾小管上皮细胞外形及其中的自噬体及自噬溶酶体进行观察。 2.3.2 Western blotting检测肾脏组织中自噬相关蛋白及磷脂酰肌醇-3-激酶/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（PI3K/Akt/mTOR）信号通路关键蛋白的表达 随机从对照组、模型组、HQD高剂量给药组选取3只大鼠的肾组织，加入含蛋白酶和磷酸化酶抑制剂的RIPA裂解液，冰上匀浆，裂解1 h后，12 000 rmin-1离心10 min，收集上清液；BCA法测定总蛋白浓度。每孔以20 μg蛋白上样，100 V电泳，100 V湿转；5%的脱脂牛奶封闭2 h，加入Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ一抗（1∶1 000），4 ℃孵育过夜，加入二抗（1∶10 000）室温孵育1 h，显色曝光。扫描胶片，分析胶片灰度值。考察HQD对肾组织中Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ、PI3K、Akt、mTOR及p-mTOR蛋白表达的影响。 3　结果 3.1　HQD抗DN的药效实验 3.1.1　各组大鼠相关生化指标检测 结果见图1。对照组大鼠精神状态良好，饮食、饮水与大小便正常，皮毛有光泽，体质量逐渐增加。模型组大鼠呈明显的多饮、多尿、多食、体质量下降等糖尿病“三多一少”症状，后期出现不同程度的体毛暗淡、稀疏、精神萎靡，反应迟钝症状。与对照组比较，模型组大鼠FBG、Scr、BUN、TG、TC、LDL-C、24 h U-Alb显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，HQD高剂量组均能显著降低上述药效指标（P＜0.05、0.01）；低剂量组FBG、Scr、BUN、TG、24 h U-Alb显著降低（P＜0.05、0.01）。 3.1.2　肾脏组织病理学观察 HE染色结果显示，细胞核呈蓝色，细胞浆、肌纤维、胶原纤维和红细胞呈不同程度的红色。对照组肾小球结构清晰，肾小球系膜区未见明显改变。模型组大鼠肾小球系膜基质增宽、增多，基底膜弥漫增厚，肾小囊腔狭窄，肾小球体积增大。HQD给药组大鼠肾小球系膜轻度增生，肾组织损伤情况较模型组明显减轻，见图2。 Masson染色结果显示，胶原纤维、黏液、软骨呈蓝色，肌肉、胞浆、纤维素、红细胞呈红色，胞核呈蓝黑色。主要用于区分肌纤维和胶原纤维。与模型组相比，HQD给药组大鼠的肾纤维化程度较轻，见图3。 3.1.3　TUNEL检测细胞凋亡情况 荧光显微镜下组织切片上凋亡的细胞呈红色荧光，细胞核呈蓝色荧光。每个样品选取3个高倍视野（400倍），每个高倍视野计数各视野总细胞数，同时计数各视野的凋亡阳性细胞。结果见图4。与对照组比较，模型组细胞凋亡率明显上升（P＜0.01）；而HQD高、低剂量组细胞凋亡率显著下降（P＜0.05）。 3.2　网络药理学研究 3.2.1　潜在靶点 通过检索SwissTargetPrediction得到各个活性成分所对应的靶点基因共600个，去掉重复的244个，剩余356个靶点。通过GeneCard、DisGeNET和OMIM 数据库共获得1 480个与DN相关的靶点，通过制作韦恩图分析，得到114个药物-疾病共同靶点作为活性成分治疗DN的潜在靶点，见图5。 3.2.2　潜在靶点的PPI网络分析 为了获得有关潜在靶点交互作用的信息，将114个潜在靶点上传到STRING平台，进行PPI网络分析，结果见图6。并将结果的TSV文件导入Cytoscape 3.6.0 进行可视化和拓扑分析，PPI网络包括102个节点和451条边，选择“度”（degree）、“介数中心性”（betweenness centrality）和“接近中心性”（closeness centrality）高于中位数的靶点作为关键目标，首次筛选值为degree＞6，betweenness centrality＞0.003 836 8，closeness centrality＞0.413 800 8，筛选后，获得了一个包含41个节点和258条边的新网络；随后筛选值为degree＞10，betweenness centrality＞0.007 837 44，closeness centrality＞0.571 428 57，获得包含19个节点和107条边的中心网络；为了在PPI网络中找到最关键的目标，最后一次筛选值为degree＞11，betweenness cenTrality＞0.014 000 41，closeness centrality＞0.72，筛选获得STAT3、EGFR、VEGFA、JUN、TNF、AKT1、CASP3、mTOR及IL2作为PPI网络中的核心靶点，见图7。其中，mTOR是调节自噬的关键激酶，抑制mTOR可促进自噬。 3.2.3　GO分析和KEGG分析 将114个交集靶点导入Metascape平台进行GO富集分析，共获得 1 581条结果，包含1 388条生物过程（BP）结果，122条分子功能（MF）结果，71条细胞组成（CC）结果，分别选取显著丰富的前15个结果进行可视化处理，见图8。BP主要对激素的反应、MAPK级联调节、细胞对氮化合物的反应、细胞对有机氮化合物的反应和蛋白质磷酸化的正调控等；CC主要涉及膜筏（membrane raft）、膜微区（membrane microdomain）、细胞外基质（extracellular matrix）、膜面（side of membrane）和囊泡腔（vesicle lumen）等；MF主要涉及激酶结合（kinase binding）、蛋白激酶结合（protein kinase binding）、激酶活性（kinase activity）、内肽酶活性（endopeptidase activity）和蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性（protein serine/threonine kinase activity）等。表明HQD治疗DN的机制涉及多种生物学过程，体现多重治疗作用。 使用KOBAS3.0共检索到235条富集通路，选取P＜0.001的结果，获得147条显著富集通路，并按“Count” 值由高到低排列，选取前20条通路作为核心通路进行展示，见图9。显示6个成分治疗DN的靶点主要涉及癌症通路、癌症中的蛋白多糖、PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路和糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路等信号通路，其中PI3K-Akt信号通路、MAPK通路均与自噬调控相关。与上述“3.2.2 ”项下PPI网络分析得出的“HQD核心作用靶点”进行联合分析后，选择对自噬经典通路PI3K/Akt/mTOR进行验证。 3.3　实验验证 3.3.1　透射电镜观察肾小管上皮细胞中自噬体及自噬溶酶体的形成 结果见图10。检测自噬的金标准是电镜下可观察到结构完整的自噬体及自噬溶媒体。采用透射电镜观察对照组、模型组、HQD高剂量组大鼠肾小管上皮细胞中自噬体及自噬溶酶体的数量。结果显示，对照组肾小管上皮细胞形态结构较正常；细胞核呈椭圆形或类圆形，核仁明显；线粒体呈圆形、椭圆形或长梭形，嵴排列较紧密，胞浆中可见大量溶酶体、自噬溶酶体和空泡。模型组肾小管上皮细胞形态结构出现明显异常。细胞核呈类圆形或椭圆形，核仁明显；线粒体发生肿胀，仅可见少量残留嵴结构，基质颗粒大量丢失；胞浆中自噬溶酶体数量较对照组明显降低。HQD高剂量组肾小管上皮细胞形态结构轻度异常。细胞核呈类椭圆形或类圆形，核仁明显；部分线粒体轻度肿胀，嵴溶解断裂，基质颗粒减少；胞浆中自噬溶酶体及自噬小体数量较模型组有所增加，溶酶体与自噬小体融合较好。 3.3.2　Western blotting检测肾脏组织中自噬相关蛋白Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ及PI3K/Akt/mTOR信号通路关键蛋白的表达 结果见图11。与对照组比，模型组PI3K、Akt、mTOR、p-mTOR蛋白表达水平显著升高；Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达水平显著降低（P＜0.01）。与模型组比，HQD高剂量给药组PI3K、Akt、mTOR、p-mTOR蛋白表达水平显著降低；Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达水平显著升高（P＜0.05、0.01）。 4　讨论 自噬是真核细胞的一种自我保护机制，也是细胞内蛋白质降解的主要途径之一。自噬活性正常时，细胞能够及时降解自噬小体内包裹的受损细胞器、侵入的病原体及衰老的蛋白质等，以维持细胞稳态、能量生成及细胞器的更新［19-20］。研究表明［21-23］，DN发生时，肾脏存在显著的自噬失调。自噬缺陷可导致肾小管上皮细胞的损伤，激活自噬能够减轻这一损伤从而保护肾功能。恢复自噬活性可能成为保护肾脏免受高糖损伤的一种新的治疗选择，有望成为防治DN的新靶点。 课题组前期已鉴定出HQD中6个主要原型入血成分（黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素、芒柄花苷、甘草酸）。文献报道［24-28］，黄芪甲苷可通过激活AMPK/eNOS信号通路，改善大鼠糖尿病肾损伤；毛蕊异黄酮葡萄糖苷具有保护血管内皮细胞的作用，能延缓DN患者的血管病变；毛蕊异黄酮能通过调节NF-κB/p65/NLRP3/TXNIP炎症小体信号通路延缓DN的发展；芒柄花素可通过调节Sirt1/PGC-1α通路减轻DN大鼠的肾小管及线粒体损伤；芒柄花苷能通过降低氧化应激和炎症标志物减轻链脲佐菌素诱导的DN大鼠模型的肾损伤；甘草酸能通过调节SNARK/AMPK信号通路保护高糖诱导的肾小球足细胞损伤。然而， HQD在体内发挥抗DN药效作用的分子机制尚不完全明确，限制了其深层次研究。网络药理学能基于中药多靶点效应，从生物信息学上整体分析在HQD治疗DN上所涉及的靶点及信号通路。故本实验以HQD中6个主要原型入血成分为研究对象，采用网络药理学方法对HQD作用靶点及信号通路进行预测，并将114个潜在靶点进行了PPI分析，发现HQD可能主要作用于STAT3、EGFR、VEGFA、JUN、TNF、AKT1、CASP3、mTOR及IL2等核心靶点。其中，mTOR是调控自噬的重要因子。mTOR是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白酶，是磷脂酰肌醇3激酶的相关激酶（PIKK），mTOR复合体是调节细胞自噬的关键分子之一，可作为多条信号通路的中间环节参与细胞自噬调节过程，并影响自噬标志性蛋白LC3的表达。mTOR可与其他调控蛋白相互作用至少形成两个不同的复合物，分别是mTOR复合物1（mTORC1）和复合物2（mTORC2）。虽然这两个复合物含有相同的催化亚基——TOR，但均可磷酸化不同的下游靶点，从而显示出不同的细胞功能。抑制mTOR可促进自噬，响胰岛素抵抗和炎性反应［29-30］。因此，调控mTOR不同的上游信号通路可能是治疗DN的一个新思路。 KEGG通路功能富集分析显示，HQD可能通过作用于癌症通路、癌症中的蛋白多糖、PI3K-Akt信号通路、MAPK等信号通路发挥药理作用。其中PI3K/Akt/mTOR通路为自噬调控的经典通路，通路活化后可激活mTORC1抑制细胞自噬过程［31］。据报道［32］，Beclin-1、LC3蛋白参与自噬小体的形成与自噬溶酶体降解过程，是经典的自噬标志物。自噬小体的减少会导致Beclin-1和LC3Ⅱ/Ⅰ的表达水平降低，而激活Beclin-1和LC3Ⅱ/Ⅰ表达可诱导细胞发生自噬。故本项目选择对经典自噬调控通路PI3K/Akt/mTOR进行验证，并进一步考察HQD对自噬标志蛋白Beclin-1和LC3Ⅱ/Ⅰ的调节作用。Western blotting结果表明，HQD可以上调肾组织自噬相关蛋白Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ表达，抑制PI3K/Akt通路活化，抑制mTOR的激活；透射电镜观察显示，HQD可以增加肾小管上皮细胞自噬体及自噬溶酶体数量。研究结

牛奶体细胞数的英文为somatic cell count,SCC。牛奶体细胞数是指每毫升牛奶中的细胞总数，多数是白细胞，通常由巨噬细胞、淋巴细胞、多形核嗜中性白细胞和少量乳腺组织上皮细胞等组成，约占牛体细胞数的95%，其余是乳腺组织死去脱落的上皮细胞。体细胞数反映了牛奶质量及奶牛的健康状况,在正常情况下,牛奶中体细胞数一般在20万～30万个/mL。

牛奶体细胞数的英文为somatic cell count,SCC。牛奶体细胞数是指每毫升牛奶中的细胞总数，多数是白细胞，通常由巨噬细胞、淋巴细胞、多形核嗜中性白细胞和少量乳腺组织上皮细胞等组成，约占牛体细胞数的95%，其余是乳腺组织死去脱落的上皮细胞。体细胞数反映了牛奶质量及奶牛的健康状况,在正常情况下,牛奶中体细胞数一般在20万～30万个/mL。

近日哈佛医学院和哈佛牙科学院的研究人员在培养皿中模拟一种罕见的遗传性疾病时，发现了一种新方法可以扭转成熟细胞的生物钟，使细胞返回成体干细胞状态。由此生成的新“干细胞“可在培养基及动物模型中分化为各种细胞类型。新发现发表在《自然-医学》（Nature Medicine）的网络版上。“新发现对于推动个体化用药尤其是组织工程学的发展具有重要的意义，”哈佛医学院细胞生物学系教授及哈佛牙科学院院长Bjorn Olsen说。进行性骨化性纤维发育不良（FOP）是一种罕见的遗传性疾病，目前全球的患者不到1000人。临床表现为急性炎症引起软组织转变为软骨和骨骼。在漫长的几十年病程中，患者身体的各个部分逐渐发生僵化，目前临床对此病征尚无有效的治疗策略。哈佛医学院及波士顿贝斯以色列女执事医疗中心的医学系讲师Damian Medici对来自这些患者的病变软骨细胞和骨细胞进行检测时，发现不同于正常的骨骼组织，病变细胞中包含有上皮细胞（一种排列在血管内壁的细胞）特异的生物标记物，这使得Damian Medici开始怀疑在FOP患者软组织中生成的软骨和骨是否有可能起源于内皮细胞。Medici和他的同事们将引起FOP的突变基因导入到正常上皮细胞中，意外地发现上皮细胞转化成了与间充质干细胞或成体干细胞非常相近的细胞类型，这些细胞可以分化为骨骼、软骨、肌肉、脂肪，甚至是神经细胞。研究人员在接下来的试验中证实当不使用突变基因时，用特异的蛋白TGF-β2或BMP4（功能与突变基因效应非常相似）孵育上皮细胞均可有效地诱导细胞重编程。进而Medici证实这些重编程细胞在培养皿和动物模型中均可诱导分化为一些相关的组织类型。“我们发现这些新细胞与骨髓间充质干细胞并不完全相同，两者之间存在一些非常重要的差异，”Medici说：“然而新细胞却拥有与骨髓间充质干细胞相同的潜能性和可塑性。”Olsen 说：“通过这个系统我们简单地重复和模拟了在自然界发生的过程。从这个意义上来说，它相比于当前其他的细胞重编程技术更少一些人为的影响。”“新发现必将推动组织工程学和个体化医疗领域的发展。可以想见或许在某天患者就可以通过获取自身的上皮细胞，将其培养为所需的组织类型进行移植，这样同时还避免了宿主免疫排斥等问题，”Medici和Olsen echo说。

组织材料若来自血液、羊水、胸水或腹水的悬液材料，最简单的方法是采用1000r/min的低速离心10分钟，若悬液量大，可适当延长离心时间，但速度不能太高，延时也不能太长，以避免挤压或机械损伤细胞，离心沉淀用无钙、镁PBS洗两次，用培养基洗一次后，调整适当细胞浓度后再分瓶培养，若选用悬液中某些细胞，常采用离心后的细胞分层液，因为，经离心后由于各种细胞的比重不同可在分层液中形成不同层，这样可根据需要收获目的细胞。不同比重的分层液的配制和具体分离方法详见淋巴细胞分离培养的章节。　　　　实体组织材料的细胞分离方法　　　　对于实体组织材料，由于细胞间结合紧密，为了使组织中的细胞充分分散，形成细胞悬液，可采用机械分散法(物理裂解)和消化分离法。　　　　(一)机械分散法　　　　所取材料若纤维成分很少，如脑组织，部分胚胎组织可采用剪刀剪切、用吸管吹打分散组织细胞或将已充分剪碎分散的组织放在注射器内(用九号针)，使细胞通过针头压出，或在不锈钢纱网内用钝物压挤(常用注射器钝端)使细胞从网孔中压挤出。此法分离细胞虽然简便、快速，但对组织机械损伤大，而且细胞分散效果差。此法仅适用于处理纤维成分少的实验室试剂软组织。　　　　(二)消化分离法　　　　组织消化法是把组织剪切成较小团块(或糊状)，应用酶的生化作用和非酶的化学作用进一步使细胞间的桥连结构松动，使团块膨松，由块状变成絮状，此时再采用机械法，用吸管吹打分散或电磁搅拌或在摇珠瓶中振荡，使细胞团块得以较充分的分散，制成少量细胞群团和大量单个细胞的细胞悬液，接种培养后，细胞容易贴壁生长。　　　　1、酶消化分离法　　　　酶消化分离法常采用胰蛋白酶和胶原酶，其分离方法如下：　　　　(1)胰蛋白酶分散技术　　　　胰蛋白酶(简称胰酶)是广泛应用的消化剂。胰蛋白酶是一种胰脏制品，对蛋白质有水介作用，主要作用于赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，使细胞间质中的蛋白质水介而使细胞分散开，在常用人血清 AB的蛋白酶中由于产品的活力和纯度不同，对细胞的消化能力也不同，胰蛋白酶对细胞的作用，取决于细胞类型、酶的活力、配制的浓度、消化的温度、无机盐离子、pH以及消化时间的长短等。　　　　①细胞类型胰蛋白酶适于消化细胞间质较少的软组织,能有效地分离肝、肾、甲状腺、羊膜、胚胎组织、上皮组织等。而对含结缔组织较丰富的组织,如乳腺、滑膜、子宫、纤维肉瘤、肿瘤组织等就无效，但若与胶原酶合用,就能增加其对组织的分离作用。　　　　②酶的活力市售的胰蛋白酶,其活力都经过测定而有效，但配制时必须新鲜，需保存在低温冰箱中，消化时的pH和温度都要适宜，否则会影响活力，细胞的分散直接与酶的活力有关，最终使用活力为1:200或1:250，56℃pH8.0时活力最强。　　　　该酶为粉剂，保藏时要防潮，室内温度不宜过高，保存时间不能太长，若粉剂结团块,说明该部分受潮或失效。　　　　③酶的浓度胰蛋白酶一般采用的浓度为0.1%-0.25%(活力1:200或1:250),但遇到难消化的组织时，浓度可适当提高，消化时间适当延长。浓度高对细胞有毒性，而较低浓度的胰蛋白酶在培养液中可促进细胞的增殖，若培养液中加入血清，其少量胰蛋白酶可被血清中抗胰蛋白酶因子所清除。　　　　④温度一般认为胰蛋白酶在56℃时活性最强，但由于对细胞有损害而不能被采用，常使用的温度为37℃，通常在37℃进行消化比室温作用快。　　　　⑤pHpH8~pH9是胰蛋白酶活力适宜范围，但随碱性的增加其活力也随之减少，活性强分散快，细胞也容易被消化下来，消化分离细胞时PH只能选用7.6～8.0之间，否则对细胞有损伤。　　　　⑥无机盐离子若用含有钙和镁的盐类溶液来配制胰蛋白酶时，可以发生抑制胰蛋白的消化作用。因此,在配制时应采用无钙镁离子的PBS配制。　　　　⑦消化时间如果细胞消化时间过长，可以损害细胞的呼吸酶，从而影响细胞的代谢，一般消化时间为20分钟为宜，冷消化时使用低浓度消化液，于4℃过夜也可。　　　　分离方法如下：　　　　①过夜冷消化将取得的组织用Hanks液洗三次，剪成碎块大小为4毫米左右，用Hanks液洗2~3次以除去血球和脂肪组织，再加入0.25%的胰蛋白酶，摇匀后放4℃过夜，次日再用Hanks液洗涤，弃去上清，共洗2~3次，然后，加入少量营养液吹打分散，细胞计数，按适当的浓度分瓶培养。　　　　②多次提取消化法多次提取消化法有以下三种：　　　　热消化多次提取将剪碎的细胞块加入0.25%胰蛋白酶37℃水浴中消化15~20分钟，然后经洗涤后用营养液分散制成细胞悬液，按合适的浓度分瓶培养，然后将留下的未彻底消化的组织按上述方法操作，再消化提取细胞。　　　　冷消化多次提取方法同上，只是消化温度为4℃。　　　　先热消化后冷消化将组织块先用胰蛋白酶于37℃下消化20分钟经洗涤后用营养液分散，制成悬液，剩余未消化的小组织块经洗涤后用胰酶于4℃下过夜，次日再提取细胞，分散成悬液，分瓶培养。　　　　(2)胶原酶(Collagenase)消化法　　　　胶原酶是一种从细菌中提取出来的酶，对胶原有很强的消化作用。适于消化纤维性组织、上皮组织以及癌组织，它对细胞间质有较好的消化作用，对细胞本身影响不大，可使细胞与胶原成分脱离而不受伤害。该酶分离效果好，即使有钙、镁离子存在仍有活性，故可用PBS和含血清的培养液配制，即操作简便又可提高细胞成活率，最终浓度200u/mL或0.1～0.3mg/mL。细胞培养此酶消化作用缓和，无需机械振荡，但胶原酶价格较高，大量使用将增加实验成本。　　　　经过胶原酶消化后的上皮组织，由于上皮细胞对酶有耐受性，可能有一些上皮细胞团块尚未被完全消化开。成小团块的上皮细胞比分散的单个上皮细胞更易生长，因此不必要再进一步消化处理。　　　　鉴于胰蛋白酶和胶原酶的生物学活性和在不同浓度下消化各种组织小块所需的时间(小时)有差异，以及两者价格不等，有人采用胶原酶与胰蛋白酶并用，同时还可加透明质酸酶(对细胞表面糖基有作用)，采用两者的联合消化作用，对分散大鼠和兔肝、癌组织非常有效。　　　　除上述两种最常用的消化酶外，还有链霉蛋白酶、粘蛋白酶、蜗牛酶、弹性蛋白酶、木瓜蛋白酶，近年来，还有一种从灰霉菌中提取的Pronase新酶分散细胞更佳。　　　　2、非酶消化法(EDTA消化法)　　　　EDTA是一种非酶消化物，又称螯合剂或Versene，全名为乙烯二胺四乙酸。常用不含钙、镁离子的PBS配成0.02%的工作液，对一些组织，尤其是上皮组织分散效果好，该化学物质能与细胞上的钙、镁离子结合形成螯合物，利用结合后的机械力使细胞变圆而分散细胞或使贴壁细胞从瓶壁上脱离，缺点是细胞易裂解或贴壁细胞从瓶壁上脱离时呈片状，有团块，常不单独使用，但可与胰蛋白酶混合使用(1:1或2:1)，不仅利于细胞脱壁又利于细胞分散，可降低胰酶的用量和毒性作用。　　　　消化分离法的操作步骤：　　　　(1)剪切把组织块剪碎，呈1~5mm3大小的组织块。　　　　(2)加液漂洗将碎组织块在平皿(或三角烧瓶)中用无钙镁PBS洗2-3次(采用倾斜，自然沉降法)。　　　　(3)消化加入消化液(胰蛋白酶或胶原酶或EDTA)于37℃水浴中作用适当时间(中间可轻摇1~2次)，若组织块膨松呈絮状可终止，若变化不大可更换一次消化液，继续消化直至膨松絮状为止。胰蛋白酶消化时间不宜过长。　　　　(4)弃去消化液采用倾斜自然沉降或低速离心法尽量弃去消化液。　　　　(5)漂洗将含有钙、镁离子的培养基沿瓶壁缓缓加入，中止消化反应，采用漂洗法洗2-3次后，加入完全培养基。　　　　(6)机械分散采用吸管吹打或振荡法，使细胞充分散开后用纱网或3~4层无菌纱布过滤后分瓶培养，若要求不高可采用倾斜自然沉降5~10分钟，吸上层细胞悬液进行分瓶培养。

如果要在液体环境下扫描细胞表面形貌，应该用哪种模式呢？对探针的参数又有哪些要求？我用的是NT-MDT的AFM和配套探针CSG10/NSG10，锥形针尖，刚度分别为0.2N/M和12N/M，细胞是贴壁的狗肾上皮细胞，但效果都不太好。接触模式下，探针把细胞推来推去，轻敲模式也差不多，感觉是不是探针没用对。如果给细胞加载的话，是不是球形探针比较好。

[font=宋体][size=15px]淫羊藿苷[/size][/font][size=15px][font=宋体]（[/font][font=&]Icariin[/font][font=宋体]，[/font][font=&]ICA[/font][font=宋体]）[/font][font=宋体]是传统中药淫羊藿的主要活性成分，在体内会被代谢为淫羊藿素（[/font][font=&]Icaritin[/font][font=宋体]，[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]）发挥作用。[/font][font=&]2022[/font][font=宋体]年，以[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]为主要成分的[/font][font=&]Icaritin[/font][font=宋体]胶囊获得[/font][font=&]NMPA[/font][font=宋体]批准用于晚期无法手术的肝细胞癌的一线治疗。[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]不仅通过诱导细胞凋亡和自噬直接作用杀死肿瘤，而且调节肿瘤免疫微环境，促进抗肿瘤免疫应答。然而，[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]调节[/font][font=&]TME[i][/i][/font][font=宋体]的具体机制，特别是在尿路上皮癌中，尚不完全清楚。[/font][font=&][/font][/size] [size=15px][font=宋体]淫羊藿素（[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]）通过减少肿瘤微环境中[/font][font=&]NET[/font][font=宋体]（中性粒细胞胞外诱捕网）的形成和中性粒细胞浸润来预防尿路上皮癌转移。[/font][b][font=宋体]机制上，在中性粒细胞中，[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]结合并抑制[/font][font=&]PADI2[/font][font=宋体]介导的组蛋白瓜氨酸化。此外，[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]抑制[/font][font=&]ROS[/font][font=宋体]的产生，抑制[/font][font=&]MAPK[/font][font=宋体]信号通路，抑制[/font][font=&]NET[/font][font=宋体]诱导的肿瘤转移。同时，在肿瘤细胞中，[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]抑制肿瘤[/font][font=&]PADI2[/font][font=宋体]诱导的组蛋白瓜氨酸化，从而降低[/font][font=&]IL-6[/font][font=宋体]转录，[/font][font=&]IL-6[/font][font=宋体]表达的下调通过[/font][font=&] JAK2/STAT3/IL-6 [/font][font=宋体]轴形成调节反馈回路并限制中性粒细胞募集。[/font][/b][font=&][/font][/size] [size=15px][b][font=&]1[/font][font=宋体]、[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]在体外抑制尿路上皮癌细胞的恶性生物学行为[/font][font=&][/font][/b][/size] [size=15px][font=宋体]为阐明[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]对肿瘤的调控机制，[/font][b][font=宋体]作者通过体外实验（[/font][font=&]CCK8[/font][font=宋体]、集落形成、流式细胞术、划痕和[/font][font=&]Transwel[/font][font=宋体]等）评估了[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]对恶性生物学特性的抑制作用[/font][/b][font=宋体]。结果显示[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]显著抑制多种尿路上皮癌细胞系的细胞活力，抑制细胞增殖，促进细胞凋亡，诱导细胞周期停滞。这些体外研究结果证明了[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]作为抗肿瘤药物的潜力[/font][/size] [align=center][img=图片,1,]data:image/svg+xml,%3C%3Fxml version='1.0' encoding='UTF-8'%3F%3E%3Csvg width='1px' height='1px' viewBox='0 0 1 1' version='1.1' xmlns='http://www.w3.org/2000/svg' xmlns:xlink='http://www.w3.org/1999/xlink'%3E%3Ctitle%3E%3C/title%3E%3Cg stroke='none' stroke-width='1' fill='none' fill-rule='evenodd' fill-opacity='0'%3E%3Cg transform='translate(-249.000000, -126.000000)' fill='%23FFFFFF'%3E%3Crect x='249' y='126' width='1' height='1'%3E%3C/rect%3E%3C/g%3E%3C/g%3E%3C/svg%3E[/img][/align][align=center] [/align] [size=15px][b][font=&]2[/font][font=宋体]、[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]抑制体内中性粒细胞浸润来抑制肿瘤转移[/font][font=&][/font][/b][/size] [size=15px][font=宋体]进一步作者研究了[/font][b][font=&]ICT[/font][font=宋体]对尿路上皮癌的体内抗肿瘤功效[/font][/b][font=宋体]。通过皮下肿瘤模型发现[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]抑制肿瘤增长，增强细胞毒性[/font][font=&]T[/font][font=宋体]细胞和[/font][font=&]M1[/font][font=宋体]型巨噬细胞的浸润，促进抗肿瘤免疫效应分子的分泌，显著抑制中性粒细胞浸润。尾静脉肺转移试验显示，[/font][b][font=&]ICT[/font][font=宋体]在体内显著抑制肿瘤转移，而在中性粒细胞耗竭后，这种对转移的抑制作用减弱。[/font][/b][font=宋体]此外，在[/font][font=&]CD4[/font][font=宋体]或[/font][font=&]CD8 T[/font][font=宋体]细胞单独耗竭后，对肿瘤转移的抑制仍然存在。结果表明[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]调节肿瘤免疫微环境中的中性粒细胞，从而通过抑制中性粒细胞浸润来增强抗肿瘤免疫。[/font][font=&][/font][/size] [align=center][img=图片,1,]data:image/svg+xml,%3C%3Fxml version='1.0' encoding='UTF-8'%3F%3E%3Csvg width='1px' height='1px' viewBox='0 0 1 1' version='1.1' xmlns='http://www.w3.org/2000/svg' xmlns:xlink='http://www.w3.org/1999/xlink'%3E%3Ctitle%3E%3C/title%3E%3Cg stroke='none' stroke-width='1' fill='none' fill-rule='evenodd' fill-opacity='0'%3E%3Cg transform='translate(-249.000000, -126.000000)' fill='%23FFFFFF'%3E%3Crect x='249' y='126' width='1' height='1'%3E%3C/rect%3E%3C/g%3E%3C/g%3E%3C/svg%3E[/img][/align] [size=15px][b][font=&]3[/font][font=宋体]、[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]逆转[/font][font=&]NET[/font][font=宋体]介导的肿瘤上皮[/font][font=&]-[/font][font=宋体]间充质转化（[/font][font=&]EMT[/font][font=宋体]）和干性以抑制转移[/font][font=&][/font][/b][/size] [size=15px][font=宋体]中性粒细胞胞外陷阱（[/font][font=&]NET[/font][font=宋体]）作为中性粒细胞中[/font][font=&]NETosis[/font][font=宋体]的产物，在介导肿瘤免疫微环境中的免疫抑制中起着关键作用。[/font][b][font=宋体]作者发现[/font][font=&]NET[/font][font=宋体]标志物组蛋白[/font][font=&]3[/font][font=宋体]瓜氨酸化（[/font][font=&]H3CIT[/font][font=宋体]）和髓过氧化物酶（[/font][font=&]MPO[i][/i][/font][font=宋体]）的表达显著降低，进一步通过体外共培养系统发现[/font][font=&]PMA[/font][font=宋体]诱导的[/font][font=&]NET[/font][font=宋体]形成增强了肿瘤的侵袭和转移，而[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]有效逆转了这一作用。[/font][/b][font=宋体]此外，[/font][font=&]DNase I[/font][font=宋体]（一种[/font][font=&]NET[/font][font=宋体]降解剂）与[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]表现出协同作用。体内实验进一步证实了[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]对[/font][font=&]NET[/font][font=宋体]形成的抑制作用。接着作者检查了共培养后肿瘤的[/font][font=&]EMT[/font][font=宋体]表型，发现[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]不仅能抑制中性粒细胞浸润，还能有效抑制[/font][font=&]NET[/font][font=宋体]形成，从而抑制[/font][font=&]NET[/font][font=宋体]介导的肿瘤[/font][font=&]EMT[/font][font=宋体]和干性。[/font][font=&][/font][/size] [align=center] [/align] [size=15px][b][font=&]4[/font][font=宋体]、[/font][font=&]ICT [/font][font=宋体]通过靶向[/font][font=&] PADI2 [/font][font=宋体]和抑制自杀性[/font][font=&] NETosis [/font][font=宋体]来抑制[/font][font=&] NET [/font][font=宋体]的形成[/font][font=&][/font][/b][/size] [size=15px][b][font=宋体]为了研究[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]抑制[/font][font=&]NET[/font][font=宋体]形成的机制，作者分离[/font][font=&]CD45CD11b[/font][font=宋体]中性粒细胞，用[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]处理，并进行[/font][font=&]RNA-seq[/font][font=宋体]分析。功能富集分析表明，[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]调节了与[/font][font=&]NET[/font][font=宋体]形成和趋化因子信号传导相关的通路，差异基因表达分析显示[/font][font=&]PADI2[/font][font=宋体]表达显著降低[/font][/b][font=宋体]，[/font][font=&]PADI2[/font][font=宋体]是一种与组蛋白瓜氨酸化和[/font][font=&] NET[/font][font=宋体]形成相关的基因。分子对接实验表明，[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]可以在六个潜在位点与[/font][font=&]PADI2[/font][font=宋体]结合。相关性分析表明[/font][font=&]PADI2[/font][font=宋体]表达与中性粒细胞浸润有关。[/font][font=&]GSVA[/font][font=宋体]分析揭示[/font][font=&]PADI2[/font][font=宋体]表达与[/font][font=&]NET[/font][font=宋体]相关基因表达之间的相关性，从而得出了[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]介导的[/font][font=&]NET[/font][font=宋体]形成调控可能与[/font][font=&]PADI2[/font][font=宋体]相关的假设，并通过一系列实验证实[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]通过抑制自杀性[/font][font=&]NETosis[/font][font=宋体]和[/font][font=&]PADI2[/font][font=宋体]介导的组蛋白瓜氨酸化来抑制[/font][font=&]NET[/font][font=宋体]的形成。[/font][font=&][/font][/size] [align=center] [/align] [size=15px][b][font=&]5[/font][font=宋体]、[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]抑制[/font][font=&]PADI2[/font][font=宋体]介导的组蛋白瓜氨酸化和[/font][font=&]IL-6/JAK2/STAT3[/font][font=宋体]信号传导的正反馈回路来抑制中性粒细胞浸润[/font][font=&][/font][/b][/size] [size=15px][font=宋体]先前的研究表明，[/font][b][font=&]ICT[/font][font=宋体]不仅可以抑制[/font][font=&]NET[/font][font=宋体]的形成，还可以抑制中性粒细胞浸润。作者进一步剖析[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]抑制中性粒细胞浸润的机制，发现[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]处理后与中性粒细胞募集相关的几种细胞因子下调，功能富集分析表明这种抑制可能与[/font][font=&]JAK/STAT[/font][font=宋体]信号通路有关。[/font][/b][font=宋体]体外中性粒细胞[/font][font=&]-[/font][font=宋体]肿瘤共培养系统发现[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]处理后招募到下腔室的中性粒细胞数量减少，[/font][font=&]IL-6[/font][font=宋体]和[/font][font=&]IL-8[/font][font=宋体]的转录在不同肿瘤细胞系中受到抑制。鉴于[/font][font=&]PADI2[/font][font=宋体]介导的组蛋白瓜氨酸化可以增强[/font][font=&]IL-6[/font][font=宋体]的转录，[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]与[/font][font=&]PADI2[/font][font=宋体]抑制剂[/font][font=&]AFM32a[/font][font=宋体]的组合用于进一步的机制探索，发现[/font][font=&]ICT [/font][font=宋体]同样抑制肿瘤内[/font][font=&]PADI2[/font][font=宋体]的表达，并且抑制[/font][font=&]PADI2[/font][font=宋体]表达导致肿瘤细胞内组蛋白瓜氨酸化减少，导致[/font][font=&] IL-6 [/font][font=宋体]转录的下游减少并阻碍中性粒细胞募集。[/font][font=&]IL-6[/font][font=宋体]水平降低可进一步抑制[/font][font=&]JAK2/STAT3[/font][font=宋体]信号通路，从而破坏[/font][font=&]IL-6[/font][font=宋体]的正转录反馈回路。[/font][font=&][/font][/size] [align=center] [/align] [size=15px][b][font=&]6[/font][font=宋体]、[/font][font=&]PADI2[/font][font=宋体]介导的[/font][font=&]NETs[i][/i][/font][font=宋体]对尿路上皮癌具有预后价值[/font][font=&][/font][/b][/size] [size=15px][b][font=宋体]为了验证[/font][font=&]PADI2[/font][font=宋体]介导的[/font][font=&]NET[/font][font=宋体]是尿路上皮癌的预后生物标志物，作者收集了尿路上皮癌患者的组织和血液样本进行相关性分析。[/font][/b][font=宋体]结果显示[/font][font=&]NET[/font][font=宋体]标志物[/font][font=&]CD66b[/font][font=宋体]和[/font][font=&]NET[/font][font=宋体]标志物[/font][font=&]H3CIT[/font][font=宋体]的联合分析显示，两种标志物高表达的患者预后最差，且中性粒细胞浸润与化疗耐药性相关。肌层浸润性膀胱癌[/font][font=宋体]患者的[/font][font=&]MPO-DNA[/font][font=宋体]水平高于非肌层浸润性膀胱癌患者[/font][font=宋体]，且手术后血浆[/font][font=&] MPO-DNA [/font][font=宋体]升高的患者往往会复发。这些结果强调了中性粒细胞[/font][font=&]NE[/font][font=宋体]相关成分在预测尿路上皮癌复发和进展方面的潜力。[/font][font=&][/font][/size] [align=center][img=图片,1,]data:image/svg+xml,%3C%3Fxml version='1.0' encoding='UTF-8'%3F%3E%3Csvg width='1px' height='1px' viewBox='0 0 1 1' version='1.1' xmlns='http://www.w3.org/2000/svg' xmlns:xlink='http://www.w3.org/1999/xlink'%3E%3Ctitle%3E%3C/title%3E%3Cg stroke='none' stroke-width='1' fill='none' fill-rule='evenodd' fill-opacity='0'%3E%3Cg transform='translate(-249.000000, -126.000000)' fill='%23FFFFFF'%3E%3Crect x='249' y='126' width='1' height='1'%3E%3C/rect%3E%3C/g%3E%3C/g%3E%3C/svg%3E[/img][/align] [size=15px][b][font=&]7[/font][font=宋体]、[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]与抗[/font][font=&]PD-1[/font][font=宋体]免疫疗法协同作用，以抵消[/font][font=&]NET[/font][font=宋体]诱导的[/font][font=&]T[/font][font=宋体]细胞耗竭[/font][font=&][/font][/b][/size] [size=15px][font=宋体]既往研究证实，[/font][b][font=宋体]中性粒细胞和[/font][font=&]NET[/font][font=宋体]可以抑制肿瘤微环境中[/font][font=&]T[/font][font=宋体]细胞的抗肿瘤功能，诱导[/font][font=&]T[/font][font=宋体]细胞耗竭，导致免疫逃逸。[/font][/b][font=宋体]因此，作者分析了肿瘤中中性粒细胞、[/font][font=&]NETs[/font][font=宋体]和[/font][font=&]T[/font][font=宋体]细胞耗竭之间的关系。相关性分析显示，肿瘤中中性粒细胞浸润和[/font][font=&]NET[/font][font=宋体]与[/font][font=&]T[/font][font=宋体]细胞浸润增加有关。然而，

生鲜乳中体细胞数(SomaticCellCount，简称SCC)反应生鲜乳卫生状况和奶牛乳房健康的状态。体细胞通常由巨噬细胞、淋巴细胞、脱落上皮细胞和中性白细胞等组成。当乳腺被感染或受机械损伤后，体细胞会上升，受感染乳区的乳汁中大约99%的细胞是白细胞。　　1、高体细胞数对乳制品的影响主要有：(1)牛奶味道变异;(2)牛奶贮存期缩短;(3)乳清量增加、酪蛋白收缩性降低，导致奶酪的产量下降。　　2、引发高体细胞数原因有：(1)可能有隐性乳腺炎发生 发生隐性乳腺炎时，感染牛很少有临床症状，肉眼观察乳汁正常，故常常误将感染乳区的乳作正常牛奶处理，造成生鲜牛奶中体细胞的升高。(2)牛群结构偏老 一般而言，胎次越小的牛只体细胞越低。因为老龄牛只长期接触乳腺炎病原菌，免疫功能下降，有更多的被感染机会。　　3、降低生鲜乳中SCC，重点应从以下方面着手：(1)减少乳房机械性损伤。牛床、运动场、挤奶厅、饲槽、水槽等奶牛活动区域无尖锐物品，机械挤奶时不可过挤，以避免引起乳房损伤。(2)减少病原菌等生物侵袭。加强环境消毒，及时杀灭环境中的有害微生物。(3)日粮营养充足、均衡，提高机体抗感染能力。(4)定期(至少每月1次)进行牛群隐性乳房炎检测，及时进行乳房炎预防。(5)隔离患有传染性乳房炎的奶牛，淘汰患有慢性乳房炎的母牛等。

研究人员报告说，以能检测到皮肤中的外来入侵物而最为出名的一组免疫细胞也能通过代谢环境中的化学物质而促进肿瘤的生长。包括皮肤及那些覆盖许多身体表面的上皮组织形成了一种抵御微生物及可以引起癌症的化学毒素的关键性的屏障。（在人类中，90%的癌症起源于上皮组织。）这些组织常常充满了树突状细胞，其中包括一个叫做朗格汉斯细胞的亚组细胞，这些细胞可识别抗原并将它们“穿戴”在其表面以警示T细胞进行防御反应。这些抗原可以是微生物，或它们也可来自肿瘤。然而，令人感到惊讶的是，缺乏朗格汉斯细胞的小鼠则可不受化学性致癌作用的侵害，而Badri Modi及其同事希望能找出其原因。他们如今用一种鳞状细胞癌的小鼠模型揭示了朗格汉斯细胞可驱使健康的皮肤细胞转变成为癌性细胞。朗格汉斯细胞在对致癌物7,12二甲基苯丙蒽（DMBA）进行回应时会增加其对某种叫做CYP1B1酶的表达，这种酶会将DMBA代谢成为一种可诱导细胞内突变的化合物。文章的作者指出，DMBA是一种聚芳烃，或PAH，而这些烃类化合物一般在工业污染中非常普遍。他们说，含有PAH的颗粒物质可能是人类皮肤癌中的一种未得到正确评价的环境因素。 —————————————————————————————————————————— 令人震惊的比例（人类90%），不过PAHs尤其是苯并芘（BAP）是强致癌物倒是听说过！

非特异性的硅珠黏附细胞法检测宫颈癌美国克拉克森大学纳米工程和生物技术实验室中心Igor Sokolov课题组开发出一种新的宫颈癌检测方法——非特异性的硅珠黏附细胞法(nonspecific adhesion of silica beads to cells)。这篇研究报告发表在Small杂志上。这项研究是基于课题组之前发表在Nature Nanotechnology杂志的研究报告，他们观察到，正常的和发生癌变的宫颈上皮细胞表面存在着某些之前未发现的差异。在这项研究中，研究人员将硅珠连接到原子力显微镜(atomic force microscopy,AFM)的旋臂上，从而使硅珠黏附在细胞表面，硅珠和细胞分离所需的的黏附力的大小可以通过测量得到。黏附能力越高的细胞表面黏住的硅珠越多。根据细胞表面的荧光硅珠粒子的数目以及荧光的亮度轻易区别出癌细胞和正常细胞。试验中所使用的超亮的荧光硅珠(ultrabright fluorescent silica particles)也是Sokolov课题组开发出来的。（

各国争相发展的重点项目　　iPS技术，即诱导性多能干细胞技术，是一种将成体成熟、分化的体细胞重编程获得类似胚胎干细胞的新兴技术。2007年11月美国和日本科学家分别独立宣布可将人类皮肤细胞转化为iPS细胞。这一发现被《自然》和《科学》杂志分别评为2007年第一和第二大科学进展。之后，iPS细胞研究迅猛发展，不同的国家和实验室纷纷报道了多种方法建立的iPS细胞系。就连世界第一只体细胞克隆动物多利羊的培育者伊恩·威尔莫特也宣布放弃人类胚胎干细胞克隆研究，转而进行 iPS 细胞研究，因为他认为这种细胞比胚胎干细胞更具潜在优势。　　我国连续多年将干细胞研究列入“863”、“973”、国家自然基金重点项目。国务院2006年发布的《国家中长期科学和技术发展规划纲要（2006-2020年）》中，干细胞作为五项生物技术之一成为未来15年我国前沿技术的重点研究领域。　　致瘤风险浮出水面　　Yamanaka研究组在《自然·生物技术》上发表的文章显示，用iPS细胞诱导的神经干细胞，即使不含c-Myc（曾被认为是导致肿瘤的主要原因），在植入NOD/SCID免疫缺陷小鼠后仍有很强的致瘤性，甚至高于胚胎干细胞。　　　他们共研究了36个iPS细胞克隆，在诱导方式上，有些诱导剂配方中含有c-Myc基因，有些没有，因此具有较好的代表性。同时他们选择了3株胚胎干细胞作为对照。在45周的观察中，移植胚胎干细胞来源神经干细胞的34只小鼠有4只长出肿瘤。在100只移植胚胎成纤维细胞来源的iPS神经干细胞小鼠中34只发现肿瘤，概率和胚胎干细胞相当。在55只移植成人成纤维细胞来源的iPS神经干细胞小鼠中46只发现肿瘤，概率远高于胚胎干细胞。在36只移植肝细胞来源的iPS神经干细胞小鼠中10只发现肿瘤，概率高于胚胎干细胞。8只移植胃上皮细胞来源的iPS神经干细胞小鼠中未发现肿瘤。病理学检查证实肿瘤均为畸胎瘤，部分为恶性畸胎瘤。　　研究还发现，以前认为致瘤性很强的c-Myc在去掉后并没有减少iPS神经干细胞的致瘤性，相反以前认为没有致瘤性的Nanog基因却可以明显增强iPS神经干细胞的致瘤性。　　这次试验的另一个意外结果是并未发现在生成的肿瘤细胞中有c-Myc或其他基因的激活。以前的观点认为，转入的癌基因是iPS致瘤性的基础，只要在iPS细胞诱导成功后通过各种方法去除已完成使命的癌基因即可使iPS细胞免于致瘤性。这次试验的结果无疑给这些想法留下了阴影，而且使iPS致瘤的机制更加扑朔迷离。

众所周知,人乳汁内各种营养物质的配比是最有利于人体吸收的,对于新生儿,世界上一直提倡母乳喂养,但对于由于种种原因不能接受母乳喂养的婴幼儿及需要用奶品来补充营养的各年龄段的人群,人们不得不选择一种较为接近母乳的奶品来代替,据记载:”羊乳味甘,性温,无毒”,主治:”补寒冷虚乏,润心肺,治消渴,疗虚劳,益精气……”,由此可见,古代人民已把羊奶作为食疗.养生.美容养颜的佳品,现代医学研究更证明羊奶已是最接近人奶的奶品,并经国际营养协会一致公认,如下:1.羊奶含有与人奶相同的上皮细胞生长因子EGF,能帮助人体修复DNA.RNA.上皮细胞黏膜和皮肤,对人体生长有促进作用.因此可以有效预防感冒.气管炎.胃肠溃疡等疾病.[上皮细胞是包覆人体与外界接触的表面,例如:肠胃.气管.皮肤等黏膜上皮细胞.而EGF(上皮细胞生长因子)可促进上皮细胞的良性生长.并使其的生长更完整.羊奶的EGF可以促进呼吸系统的上皮细胞的生长,具有强力分解过敏源酵素(PAF-AH),对空气的骤变.质量不佳…等所产生的身体不适,皆有预防及保护的作用.] 2.羊奶与人奶均仅含α.β.κ型酪蛋白,不含任何过敏源(牛奶过敏源:α-ls酪蛋白.γ-酪蛋白.β-乳糖蛋白),因此饮羊奶同人奶一样不会产生任何过敏,特别适合过敏体质及胃肠不佳的人群. 3.羊奶的营养价值高,其所含的脂肪球大小与人奶基本相似,且大小均匀,易于消化. 4.羊奶与人奶一样含有丰富的NCT(中链脂肪酸),易被肠粘膜细胞吸收,直接进入人体门静脉,氧化,供能,因此不会在体内形成脂肪堆积,长期饮用身体强壮而不发胖.5.羊奶中含有的短链和中链脂肪酸中的三葵酸甘油酯和三已酸甘油酯等可抑制念珠菌的感染.6.羊奶为略碱性,PH值为7.0,长期饮用有益于维持人体酸碱平衡.7.羊奶中含有的免疫蛋白及核苷酸含量较高.

与 MSI1 相关的信号通路及凋亡相关机制研究进展Notch 信号通路Notch 信号通路在调节细胞增殖、干细胞维持、胚胎和成人发育期间的分化以及内环境稳定中起着重要作用。MSI1 可以特异性识别并结合 Numb mRNA 的 3'-UTR 区域，促进 Notch 信号通路的异常激活[33]。在肿瘤微环境中，Notch 信号通路起到了至关重要的作用，MSI1 和 Notch 信号通路是乳腺上皮细胞中干细胞不对称分裂的两个关键调节因子，而乳腺上皮干细胞被认为是乳腺癌病因的主要靶点。另有研究显示MSI1 通过激活 Notch 通路促进胶质瘤细胞的发展[35]，在髓母细胞瘤中通过沉默 MSI1下调了 Notch 通路成员 Hes1、Hey2 和 Notch2 的表达，从而抑制了肿瘤的发生发展。在弥漫型胃癌的相关研究中发现，通过 MSI1 调节 Notch 通路中的 delta-1 配体和 Jagged-2 配体的表达来激活 Notch 信号通路，促进肿瘤细胞的发生发展。综上所述，MSI1 通过调节 Notch 信号通路，影响未分化细胞的分化、细胞周期和凋亡等方向和进程，从而促进肿瘤细胞的异常增殖。 Wnt 信号通路Wnt 信号通路控制发育、体内平衡、愈合和再生等各种生物过程[38]。该信号传导缺陷导会致发育缺陷、骨骼疾病和恶性肿瘤[39，40]。在肠道上皮组织稳态平衡中 MSI1 和APC 之间的负反馈起着关键调节作用，APC 是 Wnt 通路的一个组成部分，当 MSI1 表达下调时会增加 APC 的活性，进而导致而 Wnt 信号活性降低，当这种平衡失去时， 就会增加肠道息肉和肿瘤发生[41，42]。Chen[43]等人在肝细胞癌的研究中发现，MSI1 通过直接下调 APC 和 DKK1 激活 Wnt 通路来调节细胞生长和细胞周期。髓母细胞瘤的相关研究发现，电离辐射诱导的尿激酶纤溶酶原激活物受体（uPAR）在 Wnt/β-catenin 信号传导中起作用，并介导髓母细胞瘤细胞系 UW228 和 D283 中肿瘤干细胞（CSC）样特性的诱导，从而促进癌细胞的侵袭、迁移和转移。肿瘤中 MSI1 与 Wnt 信号通路的关系仍需要我们进一步探索。其他信号通路Akt信号参与调节细胞增殖、细胞周期进程、凋亡以及肿瘤细胞与细胞外基质之间的相互作用[44，45]。MSI1可以激活肺癌和胶质母细胞瘤中的AKT信号，从而促进恶性肿瘤[3，30]。敲除 MSI1 可通过上调胶质瘤细胞中的 PTEN 来降低 PI3 激酶 AKT 信号通路的活性[。Hh 信号通路对无脊椎动物和脊椎动物的正常发育至关重要。在哺乳动物的皮肤、神经、肺中 Hh 参与维持体细胞和多能干细胞的修复，当 Hh 途径被启动后能激活靶基因的转录[。在胃癌耐药性的研究中发现，CD44（+）/MSI1（+）的共表达通过 Hh 通路增强胃癌干细胞的耐药性。TGF-β 通路参与调节细胞分化、生长和增殖，并能激活免疫反应起到抑制肿瘤的作用，该通路直接促进上皮-间充质转化，从而促进肿瘤发展进程[55-57]。哺乳动物的 TGF-β 信号通路同样存在复杂的调控网络， 促进肿瘤细胞增殖、凋亡、血管生成、细胞侵袭[。综上所述，大量研究发现了 MSI1 与 Notch、Wnt、Akt、TGF-β和 Hedgehog（Hh） 等信号通路之间相互作用，这些信号通路在正常胚胎发育中起重要调控作用，并且这些信号通路失调均在肿瘤发生发展过程中发挥着重要作用。

牛奶中的体细胞有两个来源。一是来自乳腺分泌组织中的上皮细胞（也称腺细胞）；二是来自与炎症进行搏斗时而死亡的白血细胞。腺细胞是正常的体细胞，是乳腺进行新陈代谢过程的产物，在奶中的含量相对恒定。而白细胞是一种防卫细胞，可以杀灭感染乳腺的病菌，还可以修复损伤的组织。因此白细胞在牛奶中的数量随奶牛的生理状态和健康水平有很大变化。 一、牛奶中体细胞上升的原因 1 、 由于乳腺被细菌感染出现乳房炎而使体细胞数量上升 。 牛奶中正常的体细胞为 20 万 /ml （标准）。但初产母牛和管理良好的牛群可能低于 10 万 /ml 。如果体细胞数超过 25 ～ 30 万个 /ml ，就接近不正常，说明有细菌传染，引起乳房炎。引起乳房炎的细菌有两大类：传染性的细菌和环境中的细菌，详见另文所述。 2 、 牛的年龄及泌乳状态 体细胞数随着牛的胎次（年龄）及泌乳阶段而上升。这是母牛自然免疫系统在分娩之前所表现出的一种免疫反应，其目的是为了提高乳腺的防御机能。到了分娩以后，如果乳腺未遭病菌感染，则牛奶中的体细胞数量会很快下降。 3 、应激和季节 高温和高湿条件下所引起的热应激，一般多出现在 7 、 8 月份，也可能引起牛奶中的体细胞数的上升。母牛表现发情症状时也有伴随体细胞上升的趋势，但报道不太一致。 4 、乳房创伤 在没有传染源的情况下，乳房内部创伤（如挤奶机负压过大，空吸时间过长或乳房被压伤等）也可以导致牛奶中体细胞数量增加。但当创伤愈合后，体细胞又可恢复正常。 5 、其它原因 包括挤奶设备的完好及工作状况，如脉动频率、真空负压大小及稳定性、集乳器的通透性，橡皮奶衬的完好及柔软性等都可以影响牛奶体细胞的数量。 此外，挤奶过程的卫生状况，乳头的护理及乳头的封闭影响着细菌进入乳头的机会，同时也影响着牛奶中体细胞的数量。 二、体细胞数制约着牛奶的产量及质量 1 、对牛奶产量的影响 当牛奶中的体细胞数量超过 30 万 /ml 时，日产奶量开始下降。上升幅度越大，产量下降幅度也越大（详细材料参考另文）。 2 、对牛奶质量的影响：当体细胞增加时，可以伴随乳白蛋白质的上升和酪蛋白质含量的下降，可以使奶酪的产量随之下降；在这种条件下奶牛的货架期和风味也随之受到影响。因此奶业发达国家一般均根据体细胞的数量标注奶价。对体细胞少的生产场家给予特殊奖励。

[size=3][font=宋体]基本原理[/font][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=宋体]细胞凋亡早期改变发生在细胞膜表面，目前早期识别仍有困难。这些细胞膜表面的改变之一是磷脂酰丝氨酸（[/font][font=Times New Roman]PS[/font][font=宋体]）从细胞膜内转移到细胞膜外，使[/font][font=Times New Roman]PS[/font][font=宋体]暴露在细胞膜外表面。[/font][font=Times New Roman]PS[/font][font=宋体]是一种带负电荷的磷脂，正常主要存在于细胞膜的内面，在细胞发生凋亡时细胞膜上的这种磷脂分布的不对称性被破坏而使[/font][font=Times New Roman]PS[/font][font=宋体]暴露在细胞膜外。[/font][font=Times New Roman]Annexin V[/font][font=宋体]是一种[/font][font=Times New Roman]Ca+[/font][font=宋体]依赖的磷脂结合蛋白，最初发现是一种具有很强的抗凝血特性的血管蛋白，[/font][font=Times New Roman]Annexin V[/font][font=宋体]具有易于结合到磷脂类如[/font][font=Times New Roman]PS[/font][font=宋体]的特性。对[/font][font=Times New Roman]PS[/font][font=宋体]有高度的亲和性。因此，该蛋白可充当一敏感的探针检测暴露在细胞膜表面的[/font][font=Times New Roman]PS[/font][font=宋体]。[/font][font=Times New Roman]PS[/font][font=宋体]转移到细胞膜外不是凋亡所独特的，也可发生在细胞坏死中。两种细胞死亡方式间的差别是在凋亡的初始阶段细胞膜是完好的，而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就破坏了。因此，可以建立一种用[/font][font=Times New Roman]Annexin V[/font][font=宋体]结合在细胞膜表面作为凋亡的指示并结合一种染料排除试验以检测细胞膜的完整性的检测方法。[/font][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=宋体]试剂与仪器[/font][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=Times New Roman] [/font][font=宋体]孵育缓冲液：[/font][font=Times New Roman]10mmol/L HEPES/NaOH[/font][font=宋体]，[/font][font=Times New Roman]PH 7.4[/font][font=宋体]，[/font][font=Times New Roman]140mmol/L NaCl[/font][font=宋体]，[/font][font=Times New Roman]5mmol/L CaCl2 [/font][/size][size=3][font=Times New Roman] [/font][font=宋体]标记液：将[/font][font=Times New Roman]FITC- Annexin V[/font][font=宋体]（宝灵曼公司产品）和[/font][font=Times New Roman]PI[/font][font=宋体]加入到孵育缓冲液中，终浓度均为[/font][font=Times New Roman]1ug/ml [/font][/size][size=3][font=Times New Roman] [/font][font=宋体]流式细胞仪[/font][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=宋体]实验步骤[/font][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=Times New Roman]1. [/font][font=宋体]细胞收集：悬浮细胞直接收集到[/font][font=Times New Roman]10ml[/font][font=宋体]的离心管中，每样本细胞数为（[/font][font=Times New Roman]1~5[/font][font=宋体]）×[/font][font=Times New Roman]106[/font][font=宋体]，[/font][font=Times New Roman]/mL[/font][font=宋体]　[/font][font=Times New Roman]500~1000r/min[/font][font=宋体]离心[/font][font=Times New Roman]5min[/font][font=宋体]，弃去培养液。[/font][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=Times New Roman]2. [/font][font=宋体]用孵育缓冲液洗涤[/font][font=Times New Roman]1[/font][font=宋体]次，[/font][font=Times New Roman]500~1000r/min[/font][font=宋体]离心[/font][font=Times New Roman]5min[/font][font=宋体]。[/font][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=Times New Roman]3. [/font][font=宋体]用[/font][font=Times New Roman]100ul[/font][font=宋体]的标记溶液重悬细胞，室温下避光孵育[/font][font=Times New Roman]10~15min[/font][font=宋体]。[/font][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=Times New Roman]4. 500~1000r/min[/font][font=宋体]离心[/font][font=Times New Roman]5min[/font][font=宋体]沉淀细胞孵育缓冲液洗[/font][font=Times New Roman]1[/font][font=宋体]次。[/font][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=Times New Roman]5. [/font][font=宋体]加入荧光（[/font][font=Times New Roman]SA-FLOUS[/font][font=宋体]）溶液[/font][font=Times New Roman]4[/font][font=宋体]℃下孵育[/font][font=Times New Roman]20min[/font][font=宋体]，避光并不时振动。[/font][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=Times New Roman]6. [/font][font=宋体]流式细胞仪分析：流式细胞仪激发光波长用[/font][font=Times New Roman]488nm[/font][font=宋体]，用一波长为[/font][font=Times New Roman]515nm[/font][font=宋体]的通带滤器检测[/font][font=Times New Roman]FITC[/font][font=宋体]荧光，另一波长大于[/font][font=Times New Roman]560nm[/font][font=宋体]的滤器检测[/font][font=Times New Roman]PI[/font][font=宋体]。[/font][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=Times New Roman]7. [/font][font=宋体]结果判断：凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料如[/font][font=Times New Roman]PI[/font][font=宋体]有抗染性，坏死细胞则不能。细胞膜有损伤的细胞的[/font][font=Times New Roman]DNA[/font][font=宋体]可被[/font][font=Times New Roman]PI[/font][font=宋体]着染产生红色荧光，而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。因此，在细胞凋亡的早期[/font][font=Times New Roman]PI[/font][font=宋体]不会着染而没有红色荧光信号。正常活细胞与此相似。在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为（[/font][font=Times New Roman]FITC-/PI-[/font][font=宋体]）；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为（[/font][font=Times New Roman]FITC+/PI+[/font][font=宋体]）；而右下象限为凋亡细胞，显现（[/font][font=Times New Roman]FITC+/PI-[/font][font=宋体]）。[/font][/size]

[size=4][font=宋体]乳中所含细胞成分是白血球和一些上皮细胞，也有一些红血球。[/font][/size][size=4][/size][size=4][font=宋体]牛乳中的细胞数（体细胞）是乳房健康状况的一种指标。牛乳细胞数可作为衡量牛乳卫生品质的指标之一。一般正常牛乳细胞数不超过[/font][/size][size=4][font=Times New Roman]50[/font][/size][size=4][font=宋体]万个[/font][/size][size=4][font=Times New Roman]/[/font][/size][size=4][font=宋体]毫升。[/font][/size][size=4][/size][size=4][font=宋体]乳房炎的诊断标准[/font][/size][size=4][/size][table=660][tr][td=1,2,180][align=center][size=4][font=宋体]细胞数[/font][/size][size=4][font=Times New Roman]/[/font][/size][size=4][font=宋体]万个[/font][/size][size=4][font=Times New Roman].mL[sup]-1[/sup][/font][/size][/align][/td][td=2,1,480][align=center][size=4][font=宋体]乳房中有害葡萄球菌与链球菌的检查结果[/font][/size][size=4][/size][/align][/td][/tr][tr][td=1,1,228][align=center][size=4][font=宋体]未检出[/font][/size][size=4][/size][/align][/td][td=1,1,252][align=center][size=4][font=宋体]检出[/font][/size][size=4][/size][/align][/td][/tr][tr][td=1,1,180][align=center][size=4][font=宋体]小于[/font][/size][size=4][font=Times New Roman]50[/font][/size][/align][/td][td=1,1,228][align=center][size=4][font=宋体]正常[/font][/size][size=4][/size][/align][/td][td=1,1,252][align=center][size=4][font=宋体]潜在性乳房炎[/font][/size][size=4][/size][/align][/td][/tr][tr][td=1,1,180][align=center][size=4][font=宋体]大于[/font][/size][size=4][font=Times New Roman]50[/font][/size][/align][/td][td=1,1,228][align=center][size=4][font=宋体]分泌障碍[/font][/size][size=4][/size][/align][/td][td=1,1,252][align=center][size=4][font=宋体]乳房炎[/font][/size][size=4][/size][/align][/td][/tr][/table][size=4][font=Times New Roman] [/font][/size]

[size=3][font=宋体]基本原理[/font][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=宋体]细胞凋亡早期改变发生在细胞膜表面，目前早期识别仍有困难。这些细胞膜表面的改变之一是磷脂酰丝氨酸（[/font][font=Times New Roman]PS[/font][font=宋体]）从细胞膜内转移到细胞膜外，使[/font][font=Times New Roman]PS[/font][font=宋体]暴露在细胞膜外表面。[/font][font=Times New Roman]PS[/font][font=宋体]是一种带负电荷的磷脂，正常主要存在于细胞膜的内面，在细胞发生凋亡时细胞膜上的这种磷脂分布的不对称性被破坏而使[/font][font=Times New Roman]PS[/font][font=宋体]暴露在细胞膜外。[/font][font=Times New Roman]Annexin V[/font][font=宋体]是一种[/font][font=Times New Roman]Ca+[/font][font=宋体]依赖的磷脂结合蛋白，最初发现是一种具有很强的抗凝血特性的血管蛋白，[/font][font=Times New Roman]Annexin V[/font][font=宋体]具有易于结合到磷脂类如[/font][font=Times New Roman]PS[/font][font=宋体]的特性。对[/font][font=Times New Roman]PS[/font][font=宋体]有高度的亲和性。因此，该蛋白可充当一敏感的探针检测暴露在细胞膜表面的[/font][font=Times New Roman]PS[/font][font=宋体]。[/font][font=Times New Roman]PS[/font][font=宋体]转移到细胞膜外不是凋亡所独特的，也可发生在细胞坏死中。两种细胞死亡方式间的差别是在凋亡的初始阶段细胞膜是完好的，而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就破坏了。因此，可以建立一种用[/font][font=Times New Roman]Annexin V[/font][font=宋体]结合在细胞膜表面作为凋亡的指示并结合一种染料排除试验以检测细胞膜的完整性的检测方法。[/font][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=宋体]试剂与仪器[/font][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=Times New Roman] [/font][font=宋体]孵育缓冲液：[/font][font=Times New Roman]10mmol/L HEPES/NaOH[/font][font=宋体]，[/font][font=Times New Roman]PH 7.4[/font][font=宋体]，[/font][font=Times New Roman]140mmol/L NaCl[/font][font=宋体]，[/font][font=Times New Roman]5mmol/L CaCl2 [/font][/size][size=3][font=Times New Roman] [/font][font=宋体]标记液：将[/font][font=Times New Roman]FITC- Annexin V[/font][font=宋体]（宝灵曼公司产品）和[/font][font=Times New Roman]PI[/font][font=宋体]加入到孵育缓冲液中，终浓度均为[/font][font=Times New Roman]1ug/ml [/font][/size][size=3][font=Times New Roman] [/font][font=宋体]流式细胞仪[/font][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=宋体]实验步骤[/font][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=Times New Roman]1. [/font][font=宋体]细胞收集：悬浮细胞直接收集到[/font][font=Times New Roman]10ml[/font][font=宋体]的离心管中，每样本细胞数为（[/font][font=Times New Roman]1~5[/font][font=宋体]）×[/font][font=Times New Roman]106[/font][font=宋体]，[/font][font=Times New Roman]/mL[/font][font=宋体]　[/font][font=Times New Roman]500~1000r/min[/font][font=宋体]离心[/font][font=Times New Roman]5min[/font][font=宋体]，弃去培养液。[/font][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=Times New Roman]2. [/font][font=宋体]用孵育缓冲液洗涤[/font][font=Times New Roman]1[/font][font=宋体]次，[/font][font=Times New Roman]500~1000r/min[/font][font=宋体]离心[/font][font=Times New Roman]5min[/font][font=宋体]。[/font][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=Times New Roman]3. [/font][font=宋体]用[/font][font=Times New Roman]100ul[/font][font=宋体]的标记溶液重悬细胞，室温下避光孵育[/font][font=Times New Roman]10~15min[/font][font=宋体]。[/font][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=Times New Roman]4. 500~1000r/min[/font][font=宋体]离心[/font][font=Times New Roman]5min[/font][font=宋体]沉淀细胞孵育缓冲液洗[/font][font=Times New Roman]1[/font][font=宋体]次。[/font][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=Times New Roman]5. [/font][font=宋体]加入荧光（[/font][font=Times New Roman]SA-FLOUS[/font][font=宋体]）溶液[/font][font=Times New Roman]4[/font][font=宋体]℃下孵育[/font][font=Times New Roman]20min[/font][font=宋体]，避光并不时振动。[/font][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=Times New Roman]6. [/font][font=宋体]流式细胞仪分析：流式细胞仪激发光波长用[/font][font=Times New Roman]488nm[/font][font=宋体]，用一波长为[/font][font=Times New Roman]515nm[/font][font=宋体]的通带滤器检测[/font][font=Times New Roman]FITC[/font][font=宋体]荧光，另一波长大于[/font][font=Times New Roman]560nm[/font][font=宋体]的滤器检测[/font][font=Times New Roman]PI[/font][font=宋体]。[/font][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=Times New Roman]7. [/font][font=宋体]结果判断：凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料如[/font][font=Times New Roman]PI[/font][font=宋体]有抗染性，坏死细胞则不能。细胞膜有损伤的细胞的[/font][font=Times New Roman]DNA[/font][font=宋体]可被[/font][font=Times New Roman]PI[/font][font=宋体]着染产生红色荧光，而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。因此，在细胞凋亡的早期[/font][font=Times New Roman]PI[/font][font=宋体]不会着染而没有红色荧光信号。正常活细胞与此相似。在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为（[/font][font=Times New Roman]FITC-/PI-[/font][font=宋体]）；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为（[/font][font=Times New Roman]FITC+/PI+[/font][font=宋体]）；而右下象限为凋亡细胞，显现（[/font][font=Times New Roman]FITC+/PI-[/font][font=宋体]）。[/font][/size]

摘要：细胞凋亡与坏死是两种完全不同的细胞凋亡形式，根据死亡细胞在形态学、生物化学和分子生物学上的差别，可以将二者区别开来。细胞凋亡的检测方法有很多，下面介绍几种常用的测定方法。一、细胞凋亡的形态学检测根据凋亡细胞固有的形态特征，人们已经设计了许多不同的细胞凋亡形态学检测方法。1. 光学显微镜和倒置显微镜(1) 未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。(2) 染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。2. 荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。常用的DNA特异性染料有：HO 33342 (Hoechst 33342)，HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI。三种染料与 DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用时用PBS稀释成终浓度为2~5mg/ml。DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用终浓度一般为0.5 ~1mg/ml。结果评判：细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状(rippled)或呈折缝样(creased)，部分染色质出现浓缩状态;Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化;Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体(图1）。 http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2013/08/A1376376278_small.jpg3 透射电子显微镜观察结果评判：凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations）的空泡结构(图2)；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。 http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2013/08/A1376376295_small.jpg二、磷脂酰丝氨酸外翻分析(Annexin V法)磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine, PS)正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中(图3)。Annexin-V是一种分子量为35~36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素(FITC、PE)或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2013/08/A1376376296_small.jpg方法1. 悬浮细胞的染色：将正常培养和诱导凋亡的悬浮细胞(0.5~1×106)用PBS洗2次，加入100 ul Binding Buffer和FITC标记的Annexin-V(20ug/ml)10 ul，室温避光30 min，再加入PI(50 ug/ml)5 ul，避光反应5 min后，加入400 ul Binding Buffer，立即用FACScan进行流式细胞术定量检测(一般不超过1 h)， 同时以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作为阴性对照。2. 贴壁培养的细胞染色：先用0.25%的胰酶消化，洗涤、染色和分析同悬浮细胞。3. 爬片细胞染色：同上，最后用荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜进行观察。结果 http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2013/08/A1376376298_small.jpg http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2013/08/A1376376300_small.jpg

注意事项： 1.配制溶液时必须用新鲜的蒸馏水。2.安装蔡式滤器时通常使用孔径 0.45 微米 和 0.22 微米滤膜各一张，放置位置为 0.45 的位于 0.22 微米的滤膜上方，并且要特别注意滤膜光面朝上。 3.配制 RPMI1640 培养基时因为还要加入小牛血清，而小牛血清略偏酸性，为了保证培养液 PH 值最终为 7.2 ，可在配制时调 PH 至 7.4 。 细胞培养的一般过程 一、准备工作准备工作对开展细胞培养异常重要，工作量也较大，应给予足够的重视，推备工作中某一环节的疏忽可导致实验失败或无法进行。准备工作的内容包括器皿的清洗、干燥与消毒，培养基与其他试剂的配制、分装及灭菌，无菌室或超净台的清洁与消毒，培养箱及其他仪器的检查与调试，具体内容可参阅有关文献。二、取材在无菌环境下从机体取出某种组织细胞（视实验目的而定），经过一定的处理（如消化分散细胞、分离等）后接入培养器血中，这一过程称为取材。如是细胞株的扩大培养则无取材这一过程。机体取出的组织细胞的首次培养称为原代培养。R 理论上讲各种动物和人体内的所有组织都可以用于培养，实际上幼体组织（尤其是胚胎组织）比成年个体的组织容易培养，分化程度低的组织比分化高的容易培养，肿瘤组织比正常组织容易培养。取材后应立即处理，尽快培养，因故不能马上培养时，可将组织块切成黄豆般大的小块，置 4℃的培养液中保存。取组织时应严格保持无菌，同时也要避免接触其他的有害物质。取病理组织和皮肤及消化道上皮细胞时容易带菌，为减少污染可用抗菌素处理。由组织并分离分散细胞的方法可参阅有关文献。 三、培养将取得的组织细胞接入培养瓶或培养板中的过程称为培养。如系组织块培养，则直接将组织块接入培养器皿底部，几个小时后组织块可贴牢在底部，再加入培养基。如系细胞培养，一般应在接入培养器皿之前进行细胞计数，按要求以一定的量（以每毫升细胞数表示）接入培养器皿并直接加入培养基。细胞进入培养器皿后，立即放入培养箱中，使细胞尽早进入生长状态。正在培养中的细胞应每隔一定时间观察一次，观察的内容包括细胞是否生长良好，形态是否正常，有无污染，培养基的 PH是否太酸或太碱（由酚红指示剂指示），此外对培养温度和 CO2浓度也要定时检查。一般原代培养进入培养后有一段潜伏期（数小时到数十天不等），在潜伏期细胞一般不分裂，但可贴壁和游走。过了潜伏期后细胞进入旺盛的分裂生长期。细胞长满瓶底后要进行传代培养，将一瓶中的细胞消化悬浮后分至两到三瓶继续培养。每传代一次称为“一代”。二倍体细胞一般只能传几十代，而转化细胞系或细胞株则可无限地传代下去。转化细胞可能具有恶性性质，也可能仅有不死性（Immortality）而无恶性。培养正在生长中的细胞是进行各种生物医学实验的良好材料。四、冻存及复苏为了保存细胞，特别是不易获得的突变型细胞或细胞株，要将细胞冻存。冻存的温度一般用液氮的温度?－196℃，将细胞收集至冻存管中加入含保护剂（一般为二甲亚砜或甘油）的培养基，以一定的冷却速度冻存，最终保存于液氮中。在极低的温度下，细胞保存的时间几乎是无限的。复苏一般采用快融方法，即从液氮中取出冻存管后，立即放入 37℃水中，使之在一分钟内迅速融解。然后将细胞转入培养器皿中进行培养。冻存过程中保护剂的选用、细胞密度、降温速度及复苏时温度、融化速度等都对细胞活力有影响。

霍乱肠毒素：A.为耐热外毒素 B.为不耐热内毒素C.B亚单位与肠上皮细胞受体结合后，协助A亚单位进入细胞D.A2肽链活化后，使肠上皮细胞ATP转化为cAMP，促进肠粘膜细胞的分泌功能E.A1肽链与B亚单位结合，协助A亚单位进入细胞

[b]牛奶体细胞概念的提出[/b]乳汁中细胞计数或者说是白细胞计数在奶牛乳房炎监测中已运用的大概有百多年的历史。体细胞这一概念是在 1910 年由 Prescott 和 Breed首先提出，当时他们建议用“Body cells”，因为当时认为奶中细胞是从上皮细胞脱落下来的。直到1960 年左右，“Somatic cells”已逐渐被人们所普遍接受。[b]牛奶体细胞的组成[/b] 现今我们通常所说的牛奶体细胞主要指白细胞，包括巨噬细胞、淋巴细胞以及多形核白细胞（PMN）。乳中细胞类型研究表明，腺泡上皮细胞，无论是在干奶期还是泌乳期，在乳中很少，仅占细胞总数的7%以下。所以说泌乳期乳中细胞数的增加不是由于上皮细胞的脱落造成的。巨噬细胞是正常乳中的主要细胞，占细胞总数的 30％~70%。[b]牛奶体细胞出现的原因牛奶体细胞[/b]主要是白细胞对乳腺有重要的作用，它对病原微生物的入侵起监视和杀灭作用。巨噬细胞及PMN具有吞噬功能，可以杀死入侵病原微生物，乳中淋巴细胞包括T淋巴细胞和B淋巴细胞，它们在对入侵微生物的特异性免疫中起很重要的作用，病原微生物一旦通过乳头管进入乳腺并在其中增殖，就会引起一系列的炎性反应。此时乳中的细胞就同病原微生物相互斗争，并且产生一系列的炎性因子,而这些炎性因子将导致一系列的病理变化，这些炎性因子包括补体，前列腺素，白三烯、组胺、5-HT（5-羟色胺）、白介素，TNF（肿瘤坏死因子）、白细胞杀菌素以及一些其他细胞因子，典型的症状包括血管通透性增加，血管扩张，血流量增加，水肿，中性粒细胞转移，以及乳腺合成能力降低，并伴有疼痛，发热。在炎症初期乳腺最主要的防御机制就是 PMN 的迁入，正常情况下，PMN 可自由通过毛细血管，而不黏附或很少黏附在血管壁上，一旦出现炎症，黏附分子被大量表达，从而使得 PMN 黏附、迁移并通过细胞间隙而进入乳腺。乳中白细胞和被损伤的组织释放一些因子能吸引 PMN 大量涌入乳中，在炎症初期乳中细胞 90%以上的是 PMN，有报导表明大量要进入乳腺的 PMN 在腺泡外聚集，甚至在某些腺泡受损较严重的地方，PMN 可通过上皮间隙而进入腺泡，因此 PMN 在感染区的大量迁移是造成[b]牛奶体细胞[/b]SCC 大量上升的主要原因，因而有人认为，PMN 迁入的速率是消除感染乃至决定病情的关键因素。 另外，据报道 PMN 也可在乳头导管、乳头池、乳腺池等处透过基底膜而进入乳汁。因此，这些地方被认为是炎症初期机体作出反应并允许 PMN 通过的地方，乳腺以此来抵御微生物的入侵，值得注意的是，在慢性炎症反应过程中，单核细胞也可透入。因此，SCC 增加也是白细胞迁入造成的。乳中 PMN执行吞噬入侵微生物的功能，但是它也可以吞噬诸如脂滴、酪蛋白这样一些物质，而这些物质被吞入后 PMN 吞噬微生物的功能将降低。即便如此，PMN 仍是乳腺中起关键作用的因素，当然它也可以释放一些物质以增加血管通透性和吸引更多的白细胞到炎性部位。在一些顽固性感染病例中，虽然 PMN 数量会有所波动，但总体上是处在一个高水平上，而且即便是将感染的病原微生物清除后，它仍会维持在高水平上直至乳腺修复。还有报道说：微生物被清除后 PMN 在高水平上仍要维持几天、几周甚至更长一点时间。[b]影响牛奶体细胞的因素[/b]据报道，[b]牛奶体细胞[/b]变化受到很多因素的影响，如年龄、乳期、昼夜、挤奶过程，感染等。近年来报道渐趋于一致即认为，感染是引起变化的最主要因素。[color=inherit]1 ）微生物感染的影响[/color] 有研究表明，[b][color=#d92142]体细胞[/color][color=#d92142]S[/color][color=#d92142]CC的主要影响因素就是微生物感染，这不论是在乳区水平、个体还是桶奶水平上都是如此。[/color][/b]有人对感染后的奶牛同其 BTSCC（桶奶 SCC）联系加以分析后认为，BTSCC 之所以发生变化，感染是主要影响因素。感染乳腺的微生物被划分为二大类，即重要微生物及次要微生物，重要微生物一旦感染将使SCC大幅增加，这类微生物包括金黄色葡萄球菌，无乳链球菌及其他一些链球菌，大肠杆菌等；次要微生物包括牛棒状杆菌以及凝固酶阴性的一些葡萄球菌，它们感染后，通常使得感染乳区化正常乳区的 SCC 高出 2～3 倍。现今，许多研究表明，仅用SCC一项来作为衡量乳区感染与否是不可信的，因为常出现假阳性和假阴性的情况。造成这种误差的部分原因可能是感染期间 SCC 的正常波动所致；这种变化在人为用各种病原微生物感染乳腺的实验中得到证实。即在感染的早期阶段数量急剧上升，可以在几小时或几天内达到峰值，（这与感染微生物种类有关）随后由于中性粒细胞的吞噬而适度下降。而 SCC变化范围依感染微生物及转归结果以及牛个体差别而变化很大。有研究表明被感染乳区 SCC 是呈波动态势，在慢性感染乳区，微生物数量及SCC二者均随时间而上下波动，同时未感染乳区SCC也在变化，但始终处在 200,000/mL 以下。另外主要微生物感染后，SCC的变动幅度也由于牛个体不同而不同，所以仅凭 SCC 一项来判别乳区感染与否及微生物种类并不十分可靠。[color=inherit]2 ）年龄、乳期对SCC的影响[/color] 研究者普遍认为，牛奶体细胞SCC 随胎次增加及乳期向后延伸而增加，但 Harmon研究却不同，他将牛群中分成感染牛与未感染牛，结果显示：在未感染牛群中，牛奶体细胞 变化都很小，无论是年龄还是泌乳期影响都很小， Sheldrak等人也证实无论是胎次数目增加，还是不同乳期阶段，它对未感染牛群的 SCC影响都很小，有研究显示，在同一乳期中，从分娩35天到205天截止，SCC数目从35天的83,000/mL 逐渐升到285天的160,000/mL，但是相同的时间内金黄色葡萄球感染的乳区中，SCC的数量却从234,000/mL升至1,000,000/mL。当然，在娩后所有乳区SCC均有增加，但那些未感染的乳区和感染了次要微生物的乳区是SCC分娩后35天均很快的下降。Harmon研究也表明，[b][color=#d92142]在微生物未感染的牛群中，SCC受胎次、泌乳乳期的影响不大。[/color][/b][color=inherit]3 ）应激对SCC的影响[/color]Wells等报道，各种应激因素都能引起SCC上升。但据 Paape 等人报道，无论将牛只放入可以控制环境条件中的隔离室内，还是给牛注射 ACTH 或者是皮质醇类激素，未感染的牛只其SCC只有很小改变或者说是没有改变。Elvinger调查表明，经受热应激的牛只SCC有大量的上升，他们通过将牛圈在可以控温的房间内或予其他的热刺激，未感染牛与感染金黄色葡萄球的牛的SCC分别是145,000/mL和105,000/mL，分析认为造成这种差异的部分原因可能是由于热应激造成的产奶量下将所致，因热应激造成产奶量下降10%～20%也是很常见的。将牛单独圈起这种应激会不会造成SCC上升，LefcourtA M研究表明这一应激虽可使牛的行为有所变化，但对SCC影响甚微。在法国科学家们进行了一项非常有趣的试验，他们将牛组成二组，一组圈起来，另一组在每天早晨挤奶后走上9.6 km，结果显示：走路的一组中受感染的牛其SCC达185,000/mL，而未感染的牛SCC为47,000/mL，这二者SCC都多于另一组牛的SCC。同时显示运动不仅会使奶牛奶量下降，而且使饲料的摄入量也减少，研究者将已感染和由于剧烈运动损伤乳房而造成感染的牛联系起来分析，认为SCC变动与感染的关系很大，表明[color=#d92142][b]各种各样的应激对受微生物感染牛的SCC影响较未感染牛的大。[/b][/color][color=inherit]4 ）季节的影响[/color]据报道，[color=#d92142][b]夏季 SCC 较冬季高，这与夏季临床型乳房炎多是发是吻合的[/b][/color]。研究表明，夏季乳腺对环境中病原微生物易感与牛群中存在大量的大肠杆菌是相一致的。同时也表明了热应激不仅可增加乳腺的易感性而且使得环境中病原微生物的数量也大大增加，热应激本身不能单独使SCC上升，但SCC上升却是由于夏季乳头长时间处于有大量病原微生物的环境中而造成感染和引起临床症状的结果。[color=inherit]5 ）其他因素[/color]奶中SCC有一个正常的变化（如昼夜变化），正常挤奶时间所收集的奶与两次挤奶间隔期间收集的奶SCC也有所不同，一般规律是，末期乳中SCC最多，而挤奶前奶中SCC最低，对同一乳区来说，它们相差多达4~7倍，而且挤奶后，高水平的SCC可持续 4 个小时左右后才开始下降。Brolund 报道饲料改变也影响SCC，他认为个体间差别对 SCC 影响有较大的作用，但后来研究表明，这与感染相比影响很小。[color=#d92142][b]牛奶体细胞作为牛群乳腺的健康与否的一个指标，其优势是显而易见的 ，以月为基准测定牛群SCC可以很好地监控奶汁的质量和乳腺的健康程度。但值得强调的是，传染性病原微生物感染后牛奶SCC数量变化比较明显，而条件性病原微生物感染后，由于其感染恢复快，它们感染后，尤其是在管理良好的牛场即便是转归为临床型乳房炎，它们SCC也能维持在300,000/mL以下，在这样一种情况下，SCC 就不能直观地反映出乳腺的健康状况。[/b][/color]也由于这些病原感染后，高水平的SCC维持时间短，而且它们感染率也很低，无论什么时候均小于10%乳区，但以全年经济收入来说，由条件性病原微生物造成临床型乳房炎引起损失还是比较大的。SCC主要影响因素是微生物感染，而其他一些因素只要不影响到乳腺的健康，它的影响就不是很大，而SCC的上升，是乳腺防御微生物入侵而采取的相应措施，应激等可使已感染到乳腺SCC上升，而对于未感染的乳区来说除了昼夜变化对 SCC 有影响外，其他因素影响都非常小。

胎盘亚全能干细胞定义： 　　亚全能干细胞自胚胎形成的第5到7天开始出现，能分化形成200 多种人体组织器官细胞，但不能形成一个完整的人体。胎盘亚全能干细胞是来源于新生儿胎盘组织的一族亚全能干细胞，其在发育阶段与胚胎干细胞接近，具备分化形成三个胚层的组织细胞的能力，但不会形成畸胎瘤。 　　胎盘亚全能干细胞的主要特性与功能： 　　胎盘亚全能干细胞是取自胎盘组织的一类亚全能干细胞，胎盘亚全能干细胞具有以下特性： 　　1. 具有强大的增殖能力和多向分化潜能，在适宜的体内或体外环境下具有分化为间充质干细胞，上皮干细胞、神经干细胞、肝干细胞，肌细胞、成骨细胞、软骨细胞、基质细胞等多种细胞的能力。可以用来修复受损或病变的组织器官，治疗心、脑血管疾病、神经系统疾病、肝脏疾病、骨组织病、角膜损伤、烧伤烫伤、肌病等多种疾病。 　　2.具有免疫调节作用，通过负性免疫调节功能，抑制机体亢进的免疫反应，使机体免疫功能恢复平衡，从而可以用来治疗造血干细胞移植之后的免疫排斥反应以及克隆氏病、红斑狼疮，硬皮病等自身免疫系统疾病。 　　3.胎盘亚全能干细胞定向培养的间充质干细胞是人体微环境的重要组成部分，移植间充质干细胞可以改变造血微环境，重建免疫系统，促进造血功能恢复，与造血干细胞共移植能显著提高白血病和难治性贫血等的治疗效果。 　　4.具有来源方便，细胞数量充足，易于分离、培养、扩增和纯化，传代扩增30多代后仍具有干细胞特性。 　　胎盘亚全能干细胞的用途： 　　胎盘作为理想的亚全能干细胞来源，在抗衰老及疾病治疗领域显示了其独特的功能，治疗疾病种类如下： 　　心脑血管系统疾病 　　糖尿病 　　肝肾损伤 　　脑及脊髓神经损伤 　　自身免疫性疾病 　　移植物抗宿主病 　　与造血干细胞共移植治疗血液病 　　缺血性血管病 　　肺及其它组织器官纤维化 　　抗衰老，恢复健康体态 　　胎盘亚全能干细胞的储存流程： 　　在新生儿娩出、胎盘剥离子宫排出后，由接生的医生尽快按照干细胞库胎盘标准采集规程进行胎盘的采集，然后放置在干细胞库特定的装置工具中，在限定时限内运送到干细胞库，由专业的技术人员进行亚全能干细胞的分离、提取、培养、检测等技术流程，直到根据最终检测结果来确认所获得的干细胞是否具有长期保存的价值。 　　保存和期限 　　目前国际上通用的干细胞保存技术是将获得的干细胞储存在-196℃深低温状态，医学研究与临床实践证明保存一百多年的细胞仍然具有活性。干细胞保存已有几十年的历史，胎盘干细胞库在与客户签订的合同期限内对干细胞库中所保管的胎盘亚全能干细胞活性负责。 　　安全性 　　胎盘的采集简便易行，不会引起母亲和新生儿任何不适的感觉或产生任何不良的影响。过去胎盘通常作为废物丢弃，而从胎盘中提取亚全能干细胞进行保存，是宝贵的生命资源再生。 　　而干细胞行业数据显示，胎盘亚全能干细胞基因稳定、不易突变，动物实验证明无致瘤性，使用安全可靠，对适应症范围疾病治疗效果好，优于传统医疗手段。 　　胎盘亚全能干细胞的优势 　　1.取材方便，原料来源充足，是生命资源的再生。 　　2.分化能力强可以定向诱导分化为间充质干细胞、血管干细胞、上皮干细胞、神经干细胞和肝干细胞等多种干细胞。 　　3.数量充足，使用方便，增殖能力强，培养后数目可达10亿，可以供多人多次使用。 　　4.在人群中使用不需要配型，不会产生免疫排斥反应，同时，血缘关系越亲近，生物利用度会越高，使用的效果越好。 　　5.治疗疾病范围广，抗衰老，恢复健康体态，心脑血管系统疾病，糖尿病，肝肾损伤，脑及脊髓神经损伤，自身免疫性疾病，移植物抗宿主病等多种疾病。

[b]奶牛体细胞测定与牧场管理[/b]是DHI（Dairy　Herd　Improvement）的必修课题。DHI即奶牛生产性能测定也称牛群改良，是一套完整的奶牛生产性能记录和管理体系，是一个实实在在通过度量和分析解决奶牛生产实际问题的方法，其目的是提高牛群的整体素质和生产水平，使用方法是从群体着眼，针对个体解决存在的问题。DHI检测的项目：一是牛群的产奶性能，包括每头牛的产奶量、乳脂率、乳蛋白率等；二是收集牛群饲养管理与经营方面的资料，如系谱资料、产犊日期、干奶日期、淘汰日期和牛群的年龄结构等，并将这些资料信息进行系统加工处理，所得结果再返回牛场指导牛场的经营管理，帮助提高牛场经济效益。DHI的用途具体体现为追踪个体牛表现、观察牛群表现、开发新目标、乳房炎管理、选种等方面的。　 针对于[b]奶牛体细胞测定与牧场管理[/b]课题，最关键是乳脂率、乳蛋白率、体细胞数，其中体细胞直接影响产奶量、乳脂率、乳蛋白率和其它乳成分。通过体细胞数的变化，可反映牧场管理水平及牧场经营状况。DHI检测设备推荐本特利NexGen系列新一代牛奶成分+体细胞检测，检测速度400-600/小时，可以根据牧场需要进行配置，同时检测模块有丙酮和乳铁蛋白，对于预防奶牛酮病和乳房炎有提前预警作用。 [b]体细胞数（SCC）[/b]是指每毫升牛奶中所含的体细胞量，它反映牛场奶牛乳房健康状况，几乎参加DHI项目的每头泌乳牛都进行体细胞检测。它包括多种类型的细胞如白细胞和脱落的上皮细胞等，高SCC记录预示着大量的白细胞的存在和乳房感染几率较大。DHI报告可提供全群奶牛各胎次每月体细胞数值，可按照不同胎次统计出不同SCC水平的牛头数及所占百分比。　　个体[b]奶牛体细胞数（SCC）[/b]直接反映了奶牛乳房健康状况，并能反映防治措施是否有效，需要说明一点，SCC的高低反映了乳房受感染的程度，而并非超过某一特定值就表示该牛一定有乳房炎而需要治疗。 牛群[b]体细胞数（SCC）[/b]是整个牛群乳房健康程度的标志。体细胞数、体细胞评分反映了该牛群的健康状况。对于体细胞高的牛群，应从挤奶设备的消毒效果，挤奶设备真空度及真空稳定性，奶衬性能及使用时间，牛床、运动场等卫生环境等方面找问题。 在DHI报告中提供了因[b]奶牛体细胞数（SCC）[/b]太高而造成奶牛产奶量的损失，应用该数据可以计算出奶牛场全年产奶量损失及直接经济损失。[b]奶牛体细胞数（SCC）[/b]与奶量损失的关系　　DHI报告分析：脂肪蛋白比。一个牛群正常的脂肪和蛋白比例在1.1-1.2的范围内，或蛋脂比在0.8—0.85如果变化范围超过上限或下限，说明奶牛饲养管理方面有问题。　　当脂蛋比低于1.1时表明　　A、奶牛粗饲料在瘤胃中的发酵率降低　　B、粗饲料的质量差　　C、精料比例过大　　D、瘤胃亚临床或临床型酸中毒　　E、奶牛反刍减少，日粮中缺乏缓冲物质　　当脂蛋比高于1.2时表明：　　A、奶牛日粮中蛋白质不平衡，品质差，缺乏必需氨基酸，如蛋氨酸和赖氨酸。　　B、日粮中能量不足，瘤胃微生物蛋白合成不足　　C、奶牛干物质采食量不足　　D、夏天热应激　　E、饲料中添加了大量的油脂类脂肪　　F、可发酵碳水化合物含量不足DHI报告中奶牛繁殖状况分析：平均泌乳天数。如果一个牛群具有正常的牛群结构，且常年均衡配种，那么该牛群的平均泌乳天数应改为150-170天。如果超过上限则表明：　　A、所提供的产犊日的准确性　　B、奶牛产后繁殖问题严重　　C、配种技术员水平不高 D、存在严重的饲养管理问题　　DHI报告在生产实践中的重要意义：DHI分析报告是奶牛场改进饲养方法、提高管理水平的基础。如根据奶牛泌乳曲线的变化、乳成分和奶牛体细胞和尿素氮测定结果，分析各类营养的平衡关系，以调整饲料配方和优化饲喂程序，保证牛群的正常管理，而使牛群发挥最大的生产潜力，提高生产水平。

一、实验目的1、掌屋凋亡细胞的形态特征 　　2、学会用荧光探针对细胞进行双标记来检测正常活细胞、凋亡细胞和坏死细胞的方法二、实验原理 细胞死亡根据其性质、起源及生物学意义区分为凋亡和坏死两种不同类型。凋亡普遍存在于生命界，在生物个体和生存中起着非常重要的作用。它是细胞在一定生理条件下一系列顺序发生事件的组合，是细胞遵循一定规律自己结束生命的自主控制过程。细胞凋亡具有可鉴别的形态学和生物化学特征。在形态上可见凋亡细胞与周围细胞脱离接触，细胞变园，细胞膜向内皱缩、胞浆浓缩、内质网扩张、细胞核固缩破裂呈团块状或新月状分布、内质网和细胞膜进一步融合将细胞分成多个完整包裹的凋亡小体，凋亡小体最后被吞噬细胞吞噬消化。在凋亡过程中细胞内容物并不释放到细胞外，不会影响其它细胞，因而不引起炎症反应。在生物化学上，多数细胞凋亡的过程中，内源性核酸内切酶活化，活性增加。核DNA随机地在核小体的连接部位被酶切断，降解为180-200bp或它的整倍数的各种片断。如果对核DNA进行琼脂糖电泳，可显示以180-200bp为基数的DNA ladder（梯状带纹）的特征。相比之下，坏死是细胞处于剧烈损伤条件下发生的细胞死亡。细胞在坏死早期即丧失质膜完整性，各种细胞器膨胀，进而质膜崩解释放出其中的内容物，引起炎症反应，坏死过程中细胞核DNA虽也降解，但由于存在各种长度不等的DNA片断，不能形成梯状带纹，而呈弥散状。一些温和的损伤刺激及一些抗肿瘤药物可诱导细胞凋亡，通常这些因素在诱导凋亡的同时，也可产生细胞坏死，这取决于损伤的剧烈程度和细胞本身对刺激的敏感程度。三尖杉酯碱（HT）是我国自行研制的一种对急性粒细胞白血病，急性单核白血病等有良好疗效的抗肿瘤药物。研究表明HT在0.02~5μg/ml范围内作用2小时，即可诱导HL-60细胞凋亡，并表现出典型的凋亡特征。本实验用1μg/ml HT在体外诱导培养的HL-60细胞发生凋亡，同时也有少数细胞发生坏死。用Hoechst33342和碘化丙啶（propidium iodide，PI）对细胞进行双重染色，可以区别凋亡、坏死及正常细胞。细胞膜是一选择性的生物膜，一般的生物染料如PI等不能穿过质膜。当细胞坏死时，质膜不完整，PI就进入细胞内部，它可嵌入到DNA或RNA中，使坏死细胞着色，凋亡细胞和活细胞不着色。而一些活细胞染料由于为亲脂性物质，可跨膜进入活细胞，因而可进行活细胞染色。Hoechst33342是一种活性荧光染料且毒性较弱，它是双苯并咪唑的一种衍生物。与DNA特异结合（主要结合于A-T）碱基区），显示凋亡细胞和活细胞。凡是看到有凋亡小体的细胞都是凋亡细胞。三、实验用品1、试剂：三尖杉酯碱（HT），300μg/ml，100mmol/L Tris-HCl（pH7.5），5mol/L EDTA缓冲液、碱性裂解液：0.2mol/L NaOH, 1%SDS、醋酸钠：3mol/L KAc（pH4.8）；异丙醇；70%乙醇；溴酚蓝，蔗糖指示剂。TBE电泳缓冲液，1%琼脂糖，溴乙锭。PI母液：500μg/ml；Ho33342母液：2mmol/L。 　　2、仪器设备：荧光显微镜，电泳仪，电泳槽，微量加样器（1ml，100μl）0.5、1.5ml离心管，载玻片，盖玻片。四、实验材料人早幼粒白血病HL-60细胞，用含10%小牛血清的RPMI1640培养基在37℃，5%CO2条件下培养。五、方法步骤 1、三尖杉酯碱诱发HL-60细胞凋亡 　　（1）实验前约24小时，接种两瓶HL-60细胞，标记①、②，每瓶含约6ml培养液，置37℃，5%CO2培养箱培养。 　　（2）实验前约2.5小时，当细胞密度达到70%，①号瓶加入三尖杉酯碱200μl，使终浓度为1μg/ml，②号瓶中加入同等量PBS（pH7.4）作对照。共同放入培养箱中继续培养2.5小时。2、Ho33342和PI双重染色鉴别三种细胞 　　（1）染色：将瓶中的细胞摇匀取200μl于1.5ml的离心管中，加入Ho33342母液2μl，PI 20μl，染色15分钟。 　　（2）滴片：取一载玻片用双面胶围成一小室，从离心管中各取以上染色后的细胞悬液10μl，加入小室内盖上盖玻片，荧光镜下用紫外激发光，高倍镜下观察，区别三种细胞，并注意三者比例。六、注意事项1、诱导培养HL-60细胞时间要准确；　　2、荧光显微镜下观察细胞时，由于荧光易碎灭，观察时要尽量快。