[b][size=15px][color=#595959]丹参酮IIA[/color][/size][/b][size=15px][color=#595959] (TIIA)[/color][/size][size=15px][color=#595959]是中药丹参的主要脂溶性活性成分,具有延缓[/color][/size][b][size=15px][color=#595959]动脉粥样硬化[/color][/size][/b][size=15px][color=#595959](AS)[/color][/size][size=15px][color=#595959]的作用。[/color][/size][size=15px][color=#595959]TIIA还可以通过发挥抗炎和抗氧化作用来治疗帕金森病等神经系统疾病。[/color][/size][size=15px][color=#595959]然而,目前尚不清楚TIIA是否[/color][/size][size=15px][color=#595959]可以通过调节[/color][/size][b][size=15px][color=#595959]胞葬作用(e[/color][/size][size=15px][color=#595959]fferocytosis)[/color][/size][/b][size=15px][color=#595959]从而改善动脉粥样硬化。[/color][/size] [align=center] [/align] [size=15px][color=#595959][/color][/size][size=15px][color=#595959]该研究旨在[b]确定TIIA是否可以通过增强胞葬作用来减少脂质积累和治疗AS[/b]。[/color][/size] [size=15px][color=#595959]首先,对LDLR敲除(LDLR-/-)小鼠进行为期24周的体内实验,分别采用组织病理学染色、[/color][/size][size=15px][color=#595959]免疫[/color][/size][size=15px][color=#595959]荧光和Western blot实验从疗效和机制两部分进行验证;此外,利用细胞在体外再次验证。具体实验设计方案如下:在体内,以西方饮食(高脂肪饮食)喂养12周的LDLR-/-小鼠为AS模型,以正常饮食喂养的LDLR-/-小鼠为空白对照组。TIIA组和阳性对照组(阿托伐他汀,ATO)分别通过腹腔注射(15 mg/kg/d)和灌胃(1.3 mg/kg/d)干预12周。体外分别用ox-LDL (50 ug/mL)或ox-LDL (50 ug/mL) + TIIA (20 uM/L或40 uM/L)培养RAW264.7细胞。[/color][/size] [size=15px][color=#595959]采用Masson染色和油红O染色分别评价[/color][/size][size=15px][color=#595959]主动脉[/color][/size][size=15px][color=#595959]斑块和RAW264.7细胞泡沫细胞形成的病理变化。采用生化方法检测小鼠血脂水平。采用免疫荧光法检测斑块中凋亡细胞和胞葬作用相关信号的表达。采用RT-q[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]和Western blot方法观察小鼠主动脉和RAW264.7细胞中胞葬作用相关分子的变化趋势。还使用中性红法评估RAW264.7细胞的吞噬能力。[/color][/size] [align=center] [/align] [size=15px][color=#595959]与模型组比较,TIIA降低了血清TC、TG、LDL-C水平(p 0.01),减少了小鼠主动脉富含脂质斑块的相对管腔面积(p 0.01),增强了小鼠主动脉斑块的稳定性(p 0.01),减少了ox-LDL诱导的RAW264.7细胞脂质堆积(p 0.01),上调了ox-LDL诱导的RAW264.7细胞的胞葬作用相关分子表达,提高了胞葬作用率。[/color][/size] [align=center] [/align] [size=15px][color=#595959]TIIA可能[b]通过增强巨噬细胞的胞葬作用功能来减少脂质积累[/b],从而治疗AS。继续深入研究TIIA使巨噬细胞在AS中保持[b]强吞噬和[/b][/color][/size][b][size=15px][color=#595959]消化[/color][/size][size=15px][color=#595959]吸收[/color][/size][/b][size=15px][color=#595959]的具体机制,可能会推动TIIA作为巨噬细胞胞浆作用的靶向治疗剂的进展。[/color][/size]
[size=15px][font=宋体]结直肠癌([/font][font=&]Colorectal Cancer[/font][font=宋体],[/font][font=&]CRC[/font][font=宋体])是全球常见的恶性肿瘤,术后复发转移已成为结直肠癌患者死亡的主要原因,特别是结直肠癌肝转移([/font][font=Georgia, &][color=#333333]CRLM[/color][/font][font=宋体])。因此,迫切需要深入研究[/font][font=Georgia, &][color=#333333]CRLM[/color][/font][font=宋体]的病理和分子机制。原发性肿瘤细胞与远端器官中的免疫细胞或基质细胞之间的信息传递是转移前微环境([/font][font=&]PMN[/font][font=宋体])形成的关键因素,了解这一机制对于制定有效的肿瘤转移治疗策略至关重要。[/font][font=&][/font][/size][size=15px][font=宋体]细胞外囊泡([/font][font=&]EV[/font][font=宋体])作为各种细胞分泌的功能实体,富含蛋白质、核酸、脂质和其他分子,促进肿瘤细胞和基质细胞之间的重要通讯。越来越多的报道表明,肿瘤衍生的[/font][font=&]EV[/font][font=宋体]([/font][font=&]TEV[/font][font=宋体])有助于[/font][font=&]PMN[/font][color=#333333]和[/color][font=Georgia, &][color=#333333]CRLM[/color][/font][font=宋体]的形成,为转移器官中循环肿瘤细胞的增殖提供必需肿瘤微环境([/font][font=&]TME[/font][font=宋体])。作者推测[/font][font=&]circRNA[/font][font=宋体]富集的[/font][font=&]TEVs[/font][font=宋体]介导[/font][font=&]PMN[/font][font=宋体]的形成,并且靶向[/font][font=&]circRNA[/font][font=宋体]富集的[/font][font=&]TEVs[/font][font=宋体]可能是针对[/font][font=&]PMN[/font][font=宋体]形成和[/font][font=&]CRLM [/font][font=宋体]的有效治疗策略。[/font][/size][size=15px][font=宋体]肿瘤细胞分泌的富含[/font][font=&]circ-0034880[/font][font=宋体]的细胞外囊泡通过增强[/font][font=&] SPP1[sup]high[/sup]CD206[sup] +[/sup][/font][font=宋体]促肿瘤巨噬细胞的活化来促进结直肠癌肝转移。重要的是,研究确定人参皂苷[/font][font=&]Rb1[/font][font=宋体]是一种潜在的治疗剂,通过直接靶向[/font][font=&]QKI [/font][font=宋体]蛋白,从而减少[/font][font=&]circ-0034880[/font][font=宋体]的生物合成并抑制[/font][font=&]SPP1[sup]high[/sup]CD206[sup] +[/sup][/font][font=宋体]促肿瘤巨噬细胞的活化,最终抑制结直肠癌肝转移。研究从调控[/font][font=&]TME[/font][font=宋体]的角度,特别是抑制[/font][font=&]circ-0034880[/font][font=宋体]的生物合成和细胞外囊泡的生成,首次揭示了人参皂苷[/font][font=&]Rb1[/font][font=宋体]在肿瘤防治领域的特殊作用,为今后的临床药物转化奠定了坚实的基础。 [size=15px][b]1、富含Circ-0034880的血浆EV与CRLM相关[/b][/size][font=宋体]基于细胞外囊泡在肿瘤转移中的重要作用,作[/font][font=宋体]者首先人类血液外泌体数据库、GSE159669数据集,以及临床血浆细胞外囊泡样本发现[/font][size=15px]一个环状RNA circ-0034880在结直肠癌肝转移患者中具有更高的表达水平,表明该环状RNA与结直肠癌的肝转移密切相关[/size] [size=15px][b]2、富含Circ-0034880的TEV在体内促进CRLM[/b][/size][size=15px]为了进一步研究circ-0034880富集的TEVs对CRC肝转移的体内影响,作者通过体内示踪实验发现了肿瘤细胞MC38来源的EVs在肝中高度积累。体内注射肿瘤细胞MC38来源的EVs可以促进肝转移,而缺失circ-0034880的EVs却丧失其促肝转移的作用,结果表明EVs依赖于其携带的circ-0034880发挥作用[/size] [size=15px][b]3、Circ-0034880富集的TEV激活肝脏转移前微环境中的CD206+促肿瘤巨噬细胞[/b][/size][size=15px]为了全面评估circ-0034880富集的TEV对肝脏转移前微环境的影响,研究人员对小鼠持续进行TEV注射和肿瘤细胞注射,建立了一个肝转移小鼠模型,多重免疫荧光分析显示TEV处理促进CD206 +促肿瘤巨噬细胞在转移前肝脏中的显著浸润,且circ-0034880表达水平与CD206 +促肿瘤TAM浸润之间存在正相关性 [/size][size=15px][/size][size=15px][b]4、Circ-0034880富集的TEV通过激活CD206 +促肿瘤巨噬细胞促进CRC细胞迁移[/b][/size][size=15px]由于有多项报道显示活化的巨噬细胞对CRC细胞迁移有促进作用,作者进一步研究利用示踪实验发现TEV可以携带circ-0034880被巨噬细胞所吸收。此外,功能实验表明富含circ-0034880 的TEV可以促进CD206+促肿瘤巨噬细胞的活化,并且携带circ-0034880的TEV的巨噬细胞上清会显著促进肿瘤细胞的迁移 [/size][size=15px][b]5、Circ-0034880富集的TEV促进SPP1[sup]high[/sup]CD206 +促肿瘤巨噬细胞的激活[/b][/size][size=15px]为了探究携带circ-0034880的TEV对CD206+促肿瘤巨噬细胞的激活机制,研究人员对TEV处理的巨噬细胞进行了转录组数据分析,进一步通过体外基因和蛋白检测和体内IF实验验证了巨噬细胞中SPP1是其调控的靶点,这些发现表明circ-0034880富集的TEV促进了SPP1[sup]high[/sup] CD206 +促肿瘤巨噬细胞的激活。鉴于已知circRNA可作为miRNA海绵发挥作用,作者分析了circ-0034880靶向的miRNA和SPP1结合的miRNA,发现了有2个miRNA重叠:miR-200a-3p和miR-141-3p。结合实验证明这两个miRNA可结合circ-0034880和SPP1,表明 circ-0034880和SPP1竞争结合miRNA,使SPP1不被miRNA所抑制。SPP1是巨噬细胞活化的关键蛋白,因此,研究结果表明TEV释放的circ-0034880通过保护SPP1免受miR-200a-3p和miR-141-3p介导的降解来提高巨噬细胞中SPP1的表达,促进SPP1[sup]high[/sup]巨噬细胞亚群增加 [/size][size=15px][b]6、人参皂苷Rb1给药可通过阻止富含circ-0034880的TEVs介导SPP1[sup]high[/sup]CD206+促肿瘤巨噬细胞的激活来阻止CRC细胞迁移[/b][/size][size=15px]鉴于circ-0034880的重要作用,下调其表达可以作为抑制癌症肝转移的策略,于是作者对103种天然药物进行了筛选,发现4种天然产物(人参皂苷Rb1、异鼠李素、山奈酚和槲皮素)对该circ-0034880的抑制作用最强,其中人参皂苷Rb1具有更强抑制作用。同样人参皂苷Rb1预处理的肿瘤细胞来源的TEV,其作用于巨噬细胞后下游的SPP1的蛋白表达造成下调作用,后续对结直肠癌细胞迁移能力下降,效果类似于沉默circ-0034880。总之,研究结果表明人参皂苷Rb1给药可通过抑制富含circ-0034880的TEV介导的SPP1[sup]high[/sup] CD206+促肿瘤巨噬细胞的激活来阻止CRC细胞迁移 [/size][size=15px][b]7、人参皂苷Rb1直接与QKI蛋白结合,抑制circ-0034880的生物合成[/b][/size][size=15px]为了确定影响circ-0034880表达的Rb1的直接靶点,作者进行了DARTS实验筛选出151种差异表达蛋白,其中一个蛋白QKI被报道与调控前mRNA剪接和促进circRNA生物合成。研究者接下来采用CETSA分析来验证了QKI和Rb1的结合,证实了Rb1能够显著增加QKI的热稳定性。进一步采用SPR分析验证了Rb1与QKI之间的很强的结合亲和力,通过分子对接预测了结合模式。此外,敲低QKI能够显著抑制该circRNA的表达。研究结果表明Rb1直接与QKI蛋白结合,抑制circ-0034880的生物合成[/size] [size=15px][/size][size=15px][b]8、[/b][/size][size=15px][b]人参皂苷[/b][/size][size=15px][b]Rb1给药通过阻止circ-0034880富集的TEV介导SPP1[sup]high[/sup]CD206+促肿瘤TAM的激活来抑制CRLM[/b][/size][size=15px]最后,作者验证了Rb1 给药的[i]体内[/i]效果,发现与单独使用TEV相比,使用Rb1预处理的TEV给药组的肝转移显著减少,与直接沉默circ-0034880的效果非常相似。然而,在沉默circ-0034880的情况下,使用Rb1预处理的TEV给药对肝转移的影响很小。接下来,作者探讨了Rb1对肝转移中CD206+促肿瘤TAM浸润的影响,发现在Rb1预处理的TEVs给药组中,SPP1表达显著下调,类似于直接沉默circ-0034880的效果。然而,在沉默circ-0034880的前提下,相应肝转移中的SPP1表达受到Rb1预处理的TEVs给药的影响最小。总之,体内功能实验证明Rb1预处理的肿瘤细胞来源的TEV失去了促进癌症肝转移的作用[/size][/font][/size]
大神们,帮忙推荐台主要针对小鼠骨髓细胞数检测的仪器,再一个就是能对小鼠血细胞的种类分类,计数。要求不高。。但是这种针对性的仪器还这难找。。
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[size=15px][color=#595959]中药复方是治疗[/color][/size][b][size=15px][color=#595959]急性[/color][/size][size=15px][color=#595959]胰腺炎[/color][/size][size=15px][color=#595959](AP)[/color][/size][/b][size=15px][color=#595959]患者的常见和完善的做法。[b]清下解胰方(QXJYF)[/b]是在清胰汤基础上改良而成的方剂,在我国应用多年,临床疗效满意。它可以降低[b]重型AP[/b](SAP)患者的感染率并恢复胃肠动力。然而,QXJYF颗粒的个别成分、[b]对AP的确切作用和机制[/b],以及对pSAP患者SAP发病率的影响仍有待阐明。 [size=15px]评价QXJYF颗粒剂对急性胰腺炎的影响,并探讨其分子机制。[/size] [size=15px]采用UPLC-Q-Orbitrap质谱法(UPLC-Q-Orbitrap MS)对[b]QXJYF颗粒中的主要化合物进行鉴定[/b]。阐明QXJYF颗粒对实验性AP模型体外和体内的影响,并详细阐述其作用机制。分别[b]腹腔注射雨蛙素或L-精氨酸诱导小鼠两种AP模型[/b],并用QXJYF颗粒对AP小鼠进行体内治疗。[/size] [size=15px]观察[b]胰腺和肺的组织学变化[/b]、血清淀粉酶和脂肪酶水平、血清炎症因子、炎症细胞浸润和巨噬细胞表型。体外培养骨髓源性巨噬细胞(BMDMs),并对其进行QXJYF颗粒处理。[b]测定BMDM表型和糖酵解水平[/b]。最后,[b]验证QXJYF颗粒对AP患者的临床疗效[/b]。对符合纳入条件的预测严重AP (pSAP)患者进行[b]入组评估[/b]。[/size][size=15px][/size] [/color][/size][align=center] [/align][size=15px][color=#595959][/color][/size][size=15px][color=#595959][/color][/size][size=15px][color=#595959][/color][/size] [size=15px][color=#595959]QXJYF颗粒中鉴定出[b]9种主要化合物[/b]。数据显示,QXJYFf颗粒在体内均能显著减轻雨蛙素或L-精氨酸诱导的AP模型的严重程度,胰腺损伤和炎症细胞浸润,全身炎症、肺损伤和炎症细胞浸润均得到改善。[/color][/size] [size=15px][color=#595959]QXJYF颗粒在体内和体外均能显著降低AP期间[b]M1巨噬细胞[/b];QXJYF处理后M1巨噬细胞中inos、Tnfα、Il1β、Il6等M1基因mRNA表达水平明显低于M1巨噬细胞。在机制上,发现M1巨噬细胞中HK2、PFKFB3、PKM、LDHα水平升高,但经QXJYF治疗后明显降低。临床资料显示,QXJYF颗粒能显著抑制CRP水平,缩短器官衰竭持续时间,从而[b]降低SAP的发生率,防止pSAP患者向SAP发展[/b]。[/color][/size] [size=15px][color=#595959][/color][/size][color=#3573b9]结论[/color][size=15px][color=#595959][/color][/size] [b][size=15px][color=#595959][/color][/size][size=15px][color=#595959][/color][/size][size=15px][color=#595959][/color][/size][size=15px][color=#595959][/color][/size][/b][size=15px][color=#595959][font=&][/font][/color][/size][b][size=15px][color=#595959][/color][/size][/b][size=15px][color=#595959][/color][/size][b][size=15px][color=#595959][/color][/size][size=15px][color=#595959]QXJYF颗粒通过抑制糖酵解作用,抑制M1巨噬细胞极化,减轻AP[/color][/size][/b][size=15px][color=#595959]。[/color][/size]
重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的生物质谱和毛细管电泳法
[em0808]我要做的是小鼠的卵细胞的电镜,但是我所能获得的卵细胞的数量有限的,不知道有什么技巧可以保证细胞能包埋进去,听说有人做了好几次就没有作出来呀 急哦 谢谢大家了
食品安全国家标准 小鼠精原细胞或精母细胞染色体畸变试验
[b][size=15px][color=#595959]呼吸道合胞病毒(RSV)[/color][/size][/b][size=15px][color=#595959]是导致婴幼儿和老年人[b]下呼吸道疾病的常见病原体[/b],目前尚无疫苗接种。[b]清肺口服液(QF)[/b]是一种中药配方,临床证明具有[b]抗炎作用[/b]。[/color][/size][size=15px][color=#595959][/color][/size][size=15px][color=#595959][/color][/size] [size=15px][color=#595959]该研究通过[b]脂肪酸依赖性巨噬细胞[/b]极化研究QF是否能够抑制RSV诱导的小鼠模型肺部炎症。[/color][/size] [align=center] [/align] [size=15px][color=#595959]在RSV[b]感染[/b]后,BALB/c小鼠连续4天灌胃[b]低、中、高剂量QF[/b]。使用[b]H&E染色和细胞因子分析[/b]评估肺部炎症状态。使用超高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]/串联质谱(UP[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LC-MS[/color][/url]/MS)分析[b]QF和脂肪酸代谢的活性成分[/b]。通过网络药理学和分子对接研究发现[b]脂质代谢相关途径[/b]。[/color][/size] [size=15px][color=#595959]Western印迹分析用于测定ATP柠檬酸裂解酶(ACLY)、过氧化物酶体增殖激活受体α(PPAR)、Akt蛋白激酶B及其在Akt信号中的磷酸化形式的水平。流式细胞术用于[b]定量巨噬细胞亚型(M1/M2)的数量,免疫[/b]组织化学用于检测诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和精氨酸酶-1(Arg-1)的表达。[/color][/size] [align=center] [/align] [size=15px][color=#595959]在RSV感染小鼠的肺组织中,[b]QF抑制促炎蛋白[/b]如白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素6(IL-6)的转录,同时[b]增加抗炎因子[/b]如白细胞介素-10(IL-10)的水平。[/color][/size] [size=15px][color=#595959]由Akt信号传导介导的代谢酶活性的改变与[b]QF显著减少肺脂肪酸积累[/b]有关。QF处理后发现低ACLY表达和高PPAR表达,表明这两种酶是[b]Akt信号的下游靶点[/b],分别[b]控制脂肪酸合成(FAS)和脂肪酸氧化(FAO)[/b]。[/color][/size] [b][size=15px][color=#595959]脂肪酸代谢的重新编程导致巨噬细胞从M1极化为M2[/color][/size][/b][size=15px][color=#595959],iNOS表达较低,Arg-1表达较高。此外,应用[b]Akt激动剂(SC-79)通过增加FAS和减少巨噬细胞极化来降低QF的抗炎作用[/b]。[/color][/size][font=mp-quote, -apple-system-font, BlinkMacSystemFont, &][size=15px][color=#595959][/color][/size][/font][font=mp-quote, -apple-system-font, BlinkMacSystemFont, &][size=15px][color=#595959][/color][/size][/font][size=15px][color=#595959][/color][/size][color=#3573b9]结论[/color][b][size=15px][color=#595959][/color][/size][/b][font=mp-quote, -apple-system-font, BlinkMacSystemFont, &][size=15px][color=#595959][/color][/size][/font] [b][size=15px][color=#595959][/color][/size][size=15px][color=#595959][/color][/size][size=15px][color=#595959][/color][/size][size=15px][color=#595959]QF抑制Akt介导的FAS,极化M1至M2巨噬细胞,具有抗炎作用[/color][/size][/b][size=15px][color=#595959]。[/color][/size]
原文是Purton, L.E., and Scadden, D.T. (2007). Limiting Factors in Murine Hematopoietic Stem Cell Assays. Cell Stem Cell 1, 263-270.发表在2007年cell stem cell 杂志上,最近由于要进行相应的课题研究,拿来精读了一番,做了一个笔记,发上来和大家分享,由于初涉小鼠造血干细胞这个领域,肯定有很多地方理解不全和错误,请大家指正。下面是我的精读笔记:小鼠造血干细胞研究方法综述一.关于HSC 免疫表型1. Thy1.1lo,Lin-Sca-1+Cells:其缺点是Thy1.1只表达于C57BL/Ka-Thy1.1小鼠,不表达于常用的C57BL/6小鼠;2. Lin- c-Kit+ Sca-1+ Cells(LSK):异质性,含有祖细胞,HSC含量不超过10%;结合CD34和Flt3可以分为long-term repopulating HSCs (LKS+ CD34- Flt3-) ,short-term repopulating HSCs (LKS+ CD34+ Flt3-) ,以及multipotent progenitors(LKS+ CD34+ Flt3+);3.荧光染料标记HSC: Rhodamine 123, Hoescht 33342, 以及Side Population,Rhodamine 123为线粒体染料,Hoescht 33342为DNA染料,HSC能够更多地将这两种染料泵出细胞外,所以染色较浅;4. SLAM Family Members:SLAM antigens (CD150+ CD244-CD48- cells),其优点是不像Thy1.1和Sca-1其表达受到品系和发育阶段等的影响,在更多的种系的小鼠中适用二.克隆形成实验:主要反映的是祖细胞的造血能力,不反映HSC,检测T系和B系需要另外特定的培养条件;三.Cobblestone Area-Forming Cells/Long-Term Culture-Initiating Cells,鹅卵石样区域形成细胞实验/长期培养-启动细胞实验:体外检测更早期造血干/祖细胞的方法,但由于feeder layers和培养条件不同,实验结果在不同实验室间稳定性较差,对于其是否真正能检测造血干细胞也比较有争议,不过在一些情况下,比如归巢(homing)或植入(engraftment)有缺陷导致体内造血重建实验无法进行时,这两个方法是较好的替代方法;四.Colony-forming unit-spleen (CFU-S)脾集落单位形成实验:属于短期(1-3周)体内重建实验,检测的干祖细胞比体外CFC早,但比HSC晚;五.long-term repopulating assays,长期重建实验,包括:1. competitive repopulation assay:竞争重建实验:属于定性或者半定量研究HSC重建能力的方法,不能区别是HSC的数量还是质量造成的结果差异,得到的结果为RU即重建单位;2. limiting dilution assay:统计的指标是造血重建失败的小鼠数目,采用泊松分布来计算HSC的频率,得到的结果为CRU即竞争重建单位;Stem Cell公司的免费软件L-Calc,可用于分析实验结果。limiting dilution assay有两种方法:1CRU assay,采用最小数的HSC作为竞争细胞,可以在单细胞水平检测HSC;2也称为CRU assay,采用标准的,足量的HSC作为竞争细胞,不能在单细胞水平检测HSC;3serial transplant assay,多代移植,最为严格的检测造血干细胞的方法;六:Limiting Dilution Assays需要考虑的几个重要因素:1.竞争细胞:1compromised bone marrow,即连续两代重建成功的骨髓细胞,比较耗时2W41/W41受体小鼠:c-kit基因发生突变,具有更加敏感的宿主微环境,能够检测更少的植入的HSC,不需要另外的HSC作为支持细胞(竞争细胞);3全骨髓细胞(whole bone marrow cells):经验表明2 X105 competing bone marrow cells比较适合2.受测细胞(Test Cells, Unknown HSC Potential):有人用LKS+ CD34- cells,但作者认为全骨髓细胞最好,原因是这种方法是在功能上评价HSC,避免了HSC在基因修饰的小鼠中免疫表型发生变化导致的结果的不可靠,在作者实验室通常采用的受测全骨髓细胞数为8 X 103到2 X106;3.重建失败的标准:现在一般认为受测细胞的重建比例小于1%为重建失败;在重建比例中,红细胞是不计算在内的,因为其不表达CD45,但一般认为只要其他系重建成功,红系应该也会重建成功;4.分析重建的时间点:看长期造血重建,最少要16周,最佳是六个月;5.其他考虑因素:归巢,HSC各系分化阻滞或减弱,祖细胞增殖动力学特性的改变,造血微环境对HSC的影响等等七.区分供体,受体的遗传学标志:最常用的是CD45.1,CD45.2系统,还有可以通过性别(Y染色体)来区分。
牛奶体细胞数的英文为somatic cell count,SCC。牛奶体细胞数是指每毫升牛奶中的细胞总数,多数是白细胞,通常由巨噬细胞、淋巴细胞、多形核嗜中性白细胞和少量乳腺组织上皮细胞等组成,约占牛体细胞数的95%,其余是乳腺组织死去脱落的上皮细胞。体细胞数反映了牛奶质量及奶牛的健康状况,在正常情况下,牛奶中体细胞数一般在20万~30万个/mL。
【序号】:3【作者】:朱琳邹德庆范作卿【题名】:蚕蛹羧甲基壳聚糖对小鼠成纤维细胞增殖与生长的影响【期刊】:蚕业科学. 【年、卷、期、起止页码】:2017,43(03)【全文链接】:https://kns.cnki.net/kcms2/article/abstract?v=3uoqIhG8C44YLTlOAiTRKibYlV5Vjs7iAEhECQAQ9aTiC5BjCgn0RurLuDBf62EN5lCHC3tB7EA_NCYlyZxEZRugsuO02raR&uniplatform=NZKPT
【序号】:4【作者】: 张建政【题名】:创伤后线粒体DNA活化巨噬细胞NF-κB通路引起全身炎症反应综合征的研究【期刊】:中国人民解放军医学院【年、卷、期、起止页码】:2012【全文链接】:https://kns.cnki.net/kcms/detail/detail.aspx?dbcode=CDFD&dbname=CDFD1214&filename=1012432423.nh&uniplatform=NZKPT&v=EvIFTOT4Kn_pKJNSrQk2-2ah9Z8aiBJpn6nM72kMwb63g_qj3WqsFtrtL8JZ7V1Y
生鲜乳中体细胞数(SomaticCellCount,简称SCC)反应生鲜乳卫生状况和奶牛乳房健康的状态。体细胞通常由巨噬细胞、淋巴细胞、脱落上皮细胞和中性白细胞等组成。当乳腺被感染或受机械损伤后,体细胞会上升,受感染乳区的乳汁中大约99%的细胞是白细胞。 1、高体细胞数对乳制品的影响主要有:(1)牛奶味道变异;(2)牛奶贮存期缩短;(3)乳清量增加、酪蛋白收缩性降低,导致奶酪的产量下降。 2、引发高体细胞数原因有:(1)可能有隐性乳腺炎发生 发生隐性乳腺炎时,感染牛很少有临床症状,肉眼观察乳汁正常,故常常误将感染乳区的乳作正常牛奶处理,造成生鲜牛奶中体细胞的升高。(2)牛群结构偏老 一般而言,胎次越小的牛只体细胞越低。因为老龄牛只长期接触乳腺炎病原菌,免疫功能下降,有更多的被感染机会。 3、降低生鲜乳中SCC,重点应从以下方面着手:(1)减少乳房机械性损伤。牛床、运动场、挤奶厅、饲槽、水槽等奶牛活动区域无尖锐物品,机械挤奶时不可过挤,以避免引起乳房损伤。(2)减少病原菌等生物侵袭。加强环境消毒,及时杀灭环境中的有害微生物。(3)日粮营养充足、均衡,提高机体抗感染能力。(4)定期(至少每月1次)进行牛群隐性乳房炎检测,及时进行乳房炎预防。(5)隔离患有传染性乳房炎的奶牛,淘汰患有慢性乳房炎的母牛等。
牛奶体细胞数的英文为somatic cell count,SCC。牛奶体细胞数是指每毫升牛奶中的细胞总数,多数是白细胞,通常由巨噬细胞、淋巴细胞、多形核嗜中性白细胞和少量乳腺组织上皮细胞等组成,约占牛体细胞数的95%,其余是乳腺组织死去脱落的上皮细胞。体细胞数反映了牛奶质量及奶牛的健康状况,在正常情况下,牛奶中体细胞数一般在20万~30万个/mL。
一、细胞因子的概念细胞因子(cytokine)是由机体多种细胞分泌的小分子蛋白质,通过结合细胞表面的相应受体发挥以调节免疫应答为主的生物学作用。细胞因子具有 非常广泛的生物学活性,包括促进靶细胞的增殖和分化,增强抗感染和细胞杀伤效应,促进或抑制其它细胞因子和膜表面分子的表达,促进炎症过程,影响细胞代谢 等。二、细胞因子的命名细胞因子按其来源可分为:由单个核吞噬细胞产生的细胞因子称为单核因子(monokine);由淋巴细胞产生的细胞因子称为淋巴因子 (lymphokine)等。按其作用可分为干扰素、集落刺激因子、肿瘤坏死因子、生长因子和趋化因子等。部分由不同细胞分泌的细胞因子,其基因及编码蛋 白与结构清楚者,在免疫调节、造血和炎症中发挥重要作用,又称为白细胞介素(interleukin,IL)。也可以依据结构或者其受体结构分类,我们的 趋化因子目前没有受体产品。三、细胞因子的特征1、低分子量;一般为<60kD的多肽或糖蛋白。多以单体形式存在,少数为二聚体,三聚体。2、天然细胞因子由抗原、丝裂原或其他刺激物活化的细胞所分泌,通过旁分泌(paracrine)、自分泌(autocrine)或内分泌(endocrine)方式在局部发挥短暂作用。3、一种细胞因子可由多种细胞产生,同一种细胞可产生多种细胞因子。4、需通过与靶细胞表面相应受体结合后发挥其生物学效应。5、具有高效性、多效性、叠性、拮抗性、协同性和网络性。四、细胞因子的分类1、白细胞介素(interleukin,IL-s)最初是指由白细胞产生又在白细胞间发挥作用的细胞因子。2、干扰素(interferon,IFN)最早发现的细胞因子,有干扰病毒感染和复制的能力。分α、β和g三种类型。3、肿瘤坏死因子超家族(tumor necrosis factor,TNF)1975年发现的一种能使肿瘤发生出血坏死的物质。4、集落刺激因子(colony-stimulating factor,CSF)指能够刺激多能造血干细胞和不同造血祖细胞增殖分化,在半固体培养基中形成相应细胞集落的细胞因子。包括G-CSF(粒细胞)、M-CSF(巨噬细胞)、 GM-CSF(粒细胞、巨噬细胞)、Multi-CSF(多重)(IL-3)、红细胞生成素(EPO)、干细胞生长因子(SCF)、血小板生成素 (TPO)等。5、趋化因子(chemokine)主要功能是招募血液中的单核细胞、中性粒细胞、淋巴细胞等进入特定的淋巴器官和组织以及感染发生的部位。根据趋化因子近N端半胱氨酸(Cys)的位置、排列方式和数量,可分为CC、CXC、C、CX3C四个亚家族。6生长因子(growth factor,GF)生长因子(GF)是具有刺激细胞生长作用的细胞因子。五、细胞因子的生物学活性1.介导自然免疫、参与抗肿瘤和抗感染2.调节T、B细胞活化、生长和分化,介导细胞免疫和体液免疫3.刺激造血生成、刺激骨髓祖细胞生长和分化为各种成熟血细胞4.在炎症、感染和内毒素血症中的作用5.在超敏反应和自身免疫病中的作用6.细胞因子通过激活其相应受体(CKR),导致细胞的增殖与分化或分泌某种蛋白质。六、四种蛋白表达体系比较表达细胞优点缺点原核E. coli繁殖快、成本低、产量高遗传背景及基因表达调控机制清楚易于大规模培养,成本低廉蛋白常为包涵体,纯化困难无糖基化(分泌蛋白,细胞膜上蛋白不可用),生物活性不定无翻译后修饰,内毒素含量高酵母Pichia使用简单,表达量高,His-tag便于纯化,一定的翻译后加工可进行糖基化修饰,操作简单,适合大规模生产可诱导表达,也可分泌表达,产物便于纯化有时会出现蛋白切割问题糖基化不能满足要求昆虫High-5产量高 ,翻译后加工与哺乳动物相似对于部分有毒性或较难表达蛋白有优势无内毒素污染蛋白活性不如哺乳动物适合表达激酶等定位于细胞内的真核蛋白哺乳CHO HEK293完善的翻译后加工,活性接近天然蛋白周期长、技术要求高表达产量低
各国争相发展的重点项目 iPS技术,即诱导性多能干细胞技术,是一种将成体成熟、分化的体细胞重编程获得类似胚胎干细胞的新兴技术。2007年11月美国和日本科学家分别独立宣布可将人类皮肤细胞转化为iPS细胞。这一发现被《自然》和《科学》杂志分别评为2007年第一和第二大科学进展。之后,iPS细胞研究迅猛发展,不同的国家和实验室纷纷报道了多种方法建立的iPS细胞系。就连世界第一只体细胞克隆动物多利羊的培育者伊恩·威尔莫特也宣布放弃人类胚胎干细胞克隆研究,转而进行 iPS 细胞研究,因为他认为这种细胞比胚胎干细胞更具潜在优势。 我国连续多年将干细胞研究列入“863”、“973”、国家自然基金重点项目。国务院2006年发布的《国家中长期科学和技术发展规划纲要(2006-2020年)》中,干细胞作为五项生物技术之一成为未来15年我国前沿技术的重点研究领域。 致瘤风险浮出水面 Yamanaka研究组在《自然·生物技术》上发表的文章显示,用iPS细胞诱导的神经干细胞,即使不含c-Myc(曾被认为是导致肿瘤的主要原因),在植入NOD/SCID免疫缺陷小鼠后仍有很强的致瘤性,甚至高于胚胎干细胞。 他们共研究了36个iPS细胞克隆,在诱导方式上,有些诱导剂配方中含有c-Myc基因,有些没有,因此具有较好的代表性。同时他们选择了3株胚胎干细胞作为对照。在45周的观察中,移植胚胎干细胞来源神经干细胞的34只小鼠有4只长出肿瘤。在100只移植胚胎成纤维细胞来源的iPS神经干细胞小鼠中34只发现肿瘤,概率和胚胎干细胞相当。在55只移植成人成纤维细胞来源的iPS神经干细胞小鼠中46只发现肿瘤,概率远高于胚胎干细胞。在36只移植肝细胞来源的iPS神经干细胞小鼠中10只发现肿瘤,概率高于胚胎干细胞。8只移植胃上皮细胞来源的iPS神经干细胞小鼠中未发现肿瘤。病理学检查证实肿瘤均为畸胎瘤,部分为恶性畸胎瘤。 研究还发现,以前认为致瘤性很强的c-Myc在去掉后并没有减少iPS神经干细胞的致瘤性,相反以前认为没有致瘤性的Nanog基因却可以明显增强iPS神经干细胞的致瘤性。 这次试验的另一个意外结果是并未发现在生成的肿瘤细胞中有c-Myc或其他基因的激活。以前的观点认为,转入的癌基因是iPS致瘤性的基础,只要在iPS细胞诱导成功后通过各种方法去除已完成使命的癌基因即可使iPS细胞免于致瘤性。这次试验的结果无疑给这些想法留下了阴影,而且使iPS致瘤的机制更加扑朔迷离。
白细胞与红细胞在此重新定向。白细胞(WBC)和红细胞(RBC)是血液中的重要组成部分,在生命体延续发展和生物治疗中具有不同的功能。红细胞,又称红血球,含有一种蛋白质称作血红蛋白。当血红蛋白从肺部吸收氧气时,血液呈红色。随着血液流经全身,血红蛋白向人体组织释放氧气。红细胞的生命周期为4个月,其形如圆盘,中间下凹,边缘较厚,呈圆饼状。白细胞,又称白血球,具有更加复杂的功能。白细胞构成了人体抵抗感染的一种防御机制。有多种不同类型的白细胞,其生命周期和功能各不相同。白细胞还能够产生一种特殊的蛋白质,称作抗体,能够识别并吞噬入侵人体的外来异物。 红细胞白细胞物理特征红细胞呈双凹圆盘状,无核。尺寸大约为6-8 μm。白细胞呈不规则性,但有一个核和外缓冲层。生命周期120天。几天,但在健康人体中可存活数天至数年不等。类型:血液中只有一种红细胞在血液中存在许多类型的白细胞,其功能各不相同:嗜中性粒细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞(巨噬细胞)、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞。循环系统:心血管系统。心血管和淋巴系统总计红细胞700:1白细胞男性每立方毫米460-6200万个;女性每立方毫米4200-5400万个。每立方毫米4000 – 11000个功能:向身体的不同部位提供氧气,并负责运送二氧化碳和其它废物。产生抗体,对感染形成免疫力,有些具有噬菌功能。血液中含量:
【作者】 但操;【导师】 张继民; 【作者单位】 广州医学院, 外科学,【摘要】 研究背景:5’-脱氧氟尿苷(5’-deoxy-5-fluorouridine, 5’-DFUR)是临床治疗消化道恶性肿瘤的口服抗癌药物,为5-氟尿嘧啶(5-FU)的前体药物。其本身没有细胞毒作用,需要在细胞内经过胸苷磷酸化酶(thymidine phosphorylase,TP)转化为5-FU才能发挥抗肿瘤作用。已有文献报道乳腺癌和胃癌细胞可以表达TP活性,而大肠癌细胞是否表达TP则持论不同。我们在前期研究中发现大肠癌组织中TP活性主要由间质细胞中的巨噬细胞表达,而测定6株结肠癌细胞系也几乎没有TP蛋白表达。在癌细胞不表达TP的情况下5’-DFUR在结直肠癌组织中如何转化尚属疑问。我们前期体内实验对结肠癌小鼠动物模型应用化疗药物5’-DFUR进行治疗,结果发现与5-FU相比平均荷瘤生存期更长,平均瘤重轻,同期平均体重下降缓慢,提示5’-DFUR在小鼠结肠癌组织比正常组织中转化率高,抗癌选择性高。其原因可能是TP酶在癌组织中分布较正常组织多。前期体外实验把5’-DFUR加入培养基中同人血单核细胞一起培养24h,5’-DFUR对4种癌细胞的IC50明显下降,提示血液中单核细胞也可表达TP。由于尚未发现实验比较在癌组织和血液中TP含量,故两者TP的含量高低尚需要实验进一步证实。本实验应用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)测定应用5’-DFUR后癌组织和血液中5-FU的转化情况,间接推断TP酶在癌组织和血液中分布差异,为进一步研究5’-DFUR在结直肠癌组织中转化及TP酶调控机制提供资料。实验材料:1、实验动物SPF级近交系BALB/c小鼠28只,6-8周龄,雄性,体重20.00±2.34g,购自广东省医学实验动物中心。2、肿瘤细胞株BALB/c小鼠结肠腺癌细胞株(CT26),购自美国菌种保藏中心(American Type Culture Collection, ATCC)。3、实验药物5’-DFUR由Roche公司日本研究中心提供; 5-FU注射液,江苏南通精华制药有限公司生产(批号: 080607);5-FU标准品购自Sigma有限公司提供(批号: 097K1352)。4、实验仪器岛津高效液相系统;色谱柱:Diamonsil C18柱(250mm×4.6mm,5μm)实验方法:1、小鼠结肠癌CT-26细胞株的培养10%胎牛血清1640培养基,含青霉素100×103 U/L和链霉素100 mg/L,37℃,5%CO2水浴恒温培养箱中培养,隔日换液,2-3天酶消化法传代。2、细胞悬液制备制备模型当天取指数生长期的细胞,用0.25%胰蛋白酶消化,机械吹打成细胞悬液,2 000r/min离心5 min,弃上清液,加适量生理盐水调整细胞浓度至1×107个/ml,以台盼蓝测定细胞活力在95%以上。3、结肠癌模型制作方法将体外培养的CT26细胞悬液0.2ml注入小鼠(BALB/c)背部皮下,约2周后基本可以形成肉眼可见的肿瘤隆起。4、动物分组及给药荷瘤小鼠28只随机分为4组:①5’-DFUR给药15分钟组;②5’-DFUR给药30分钟组;③5-FU给药15分钟组;④5-FU给药30分钟组。根据动物体重,5-FU用量0.020mg/g ,配制浓度为1.0 mg/ml。5’-DFUR用量0.038mg/g;配置浓度为2.0mg/ml。各组分别腹腔注射给药15分钟、30分钟后处死小鼠立即取血和瘤组织。5、标本处理小鼠眼眶动静脉取血0.5 ml后放置入37℃水浴30分钟,3200rpm离心5min,取上清液4℃保存。肿瘤组织用滤纸吸干血迹后称重,然后按0.5g组织与4 ml生理盐水(1:8)加入匀浆器匀浆5min, 3200rpm离心5min,取上清液4℃保存。6、制作血液和肿瘤组织的5-FU药物标准曲线取未给药小鼠血清7份,每份90μL,分别加入由5-FU对照品和蒸馏水配制的系列标准液适量并混匀配成100μL,使血清中药物浓度分别为6.25,12.5,25.0,50.0,100.0,200.0,400.0μg·mL-1,制作血清标准曲线;取未给药小鼠肿瘤组织匀浆液7份,每份90μL,分别加入由5-FU对照品和蒸馏水配制的系列标准液适量并混匀配成100μL,使肿瘤匀浆液中药物浓度分别为1.0,2.0,4.0,8.0,16.0,32.0,64.0μg·mL-1,制作肿瘤标准曲线。7、测量各标本浓度取血清100μL,置于5mL玻璃试管中,加入乙酸乙酯2mL,漩涡振荡2min后,3200rpm离心5min,取上层析液置于另一玻璃试管中。再次加入乙酸乙酯2mL进行第二次提取,漩涡振荡2min后,3200rpm离心5min,取上层析液,然后合并两次提取的上层析液,离心浓缩挥干。加入100μL流动相定容,混匀取出,置于EP管中,10000rpm离心7min,取上层析液20μL进样。记录药物峰面积,代入相应标准曲线计算药物浓度;取肿瘤匀浆液100μL,以同样方法处理标本测量浓度。8、观测指标给药15分钟、30分钟处死组5’-DFUR组和5-FU组小鼠血液与癌组织5-FU浓度。9、统计学方法应用统计软件SPSS13.0数据包对5’-DFUR组和5-FU组小鼠血液与癌组织5-FU浓度采用配对样本t检验进行比较。当P0.05时,认为差异有统计学意义。结果:1、注射药物5’-DFUR 15、30分钟后,癌组织转化的5-FU浓度分别54.64μg/g±12.80μg/g和45.58μg/g±18.82μg/g,血清中中5-FU浓度分别为8.83μg/ml±1.68μg/ml和9.82μg/ml±2.93μg/ml,15分钟、30分钟组癌组织5-FU浓度分别为血清的6.36、4.47倍(P0.05);2、注射药物5-FU 15、30分钟后,癌组织转化的5-FU浓度分别86.13μg/g±15.42μg/g和94.68μg/g±39.89μg/g,血清中5-FU浓度分别为133.35μg/ml±20.69μg/ml和112.70μg/ml±26.27μg/ml,15分钟、30分钟组血清5-FU浓度分别为癌组织的1.59、1.62倍(P0.05)。结论:小鼠结肠癌模型体内,癌组织内5’-DFUR转化率高于血液,考虑分布在癌组织中的PyNPase酶比血液高。 【谱图】http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2012/08/201208142214_383901_1609970_3.jpg
大家还记得我吗?好久好久没有来发帖了,肯定都快被遗忘了。一直在忙着养细胞,这次过来给大家分享一些自己的心得体会。↓↓↓养了很久的细胞,有一些经验和体会总结一下,和大家分享一下。关于如何把细胞养的形态很好更漂亮。1.不同的细胞,喜欢的环境是不一样的。这个不仅仅是说培养基的不同,还有就是细胞生长的空间密度问题。有一些细胞是数量多一点比较好生长,生长状态也比较好。这种一般是属于生长速度慢的细胞。譬如内皮细胞。而有一些是细胞是数量少一点细胞状态会生长的比较好,譬如巨噬细胞和某些肿瘤细胞。尤其是巨噬细胞,生长速度非常得快,贴壁速度很快,所以传代时就应该留很少量的细胞,这样细胞状态会比较好。并且巨噬细胞比较喜欢扎堆生长,而堆与堆之间是有空间的。如果长成相连在一起的一满片的时候,细胞形态基本上就会差了,老化的会比较多,对后期实验结果是不好的。所以在养细胞的时候应该摸索该细胞喜欢的生长空间密度问题。2.对于有些人总是会遇到养的细胞形态怎么都不好的问题。这个其实是有一个方法可以改善的。对于贴壁细胞,如果细胞形态不好,(或者细胞形态不清晰,表面似有异物等)可以在传代的时候进行如下操作:首先,倒掉旧的培养基,加入3ml新的培养基(有无血清的都可)洗涤一次,用滴管吸走,然后再加入3ml的培养基,进行预吹打,控制吹打力度,轻轻地大概沿着瓶底过一遍,然后吸走。这时侯再开始正式的消化、吹打。(巨噬细胞我们只吹打,不消化的)其次,把吹打下来的细胞悬液加入到新的培养瓶内,培养瓶事先加入培养基,放入培养箱内培养,按时间点观察细胞贴壁情况。10分钟观察一次,20分钟,30分钟观察一次。选择一个时间点,已经有部分细胞贴壁的情况下,重新置于洁净台,底面朝上迅速倒出其中的培养基,加入3ml新培养基再轻轻洗一次。然后加入完全培养基培养。后续观察细胞生长情况以及形态。我称之为“二传”。呵呵。如果一次效果还不理想,可重复多次。直到找到细胞完美形态。其中要注意,结合细胞喜欢的生长情况。喜欢多一点数量长得好的细胞你就等贴壁细胞比较多点的时候再传。反之亦然。这个是我师兄发明的,谢谢他了。这个方法真的很好用!3.关于培养瓶内加入培养基的量的问题。这个是要靠自己去摸索你所养的细胞的。并不是小的玻璃方瓶12ml,大方瓶14ml的。有些细胞反而是培养基少一点相反细胞形态会长得比较好。(可能也是竞争很大,有优胜劣汰吧。呵呵。)对于生长速度快的细胞,易生长的细胞加少一点培养基细胞形态会更好。但是要注意换液掌握。4.关于选择培养瓶的问题。个人发现生长速度快的细胞在玻璃瓶内生长的状态会比一次性塑料瓶相对好一些。而对于同一种细胞,在其生长旺盛快速的时期在玻璃瓶内的生长状态也比塑料瓶内好。这可能是因为塑料瓶比玻璃瓶更容易贴壁。生长速度快的细胞在塑料瓶这种相对“更安逸”的环境里反而长得状态不如玻璃瓶好。所以对于生长速度慢的细胞如果想要更漂亮的细胞状态,塑料瓶比玻璃瓶会好,对于生长速度慢的细胞,玻璃瓶则会更好。同样,对于同一种细胞,在其生长速度慢的时候,塑料瓶会好一点,比如刚刚复苏的时候,或者原代培养的时候。而在其生长旺盛的时候,玻璃瓶则相对会好一点。今天就先分享到这里吧,等下次有时间来逛帖的时候再来分享。大家一定要注意:要想把细胞养的漂亮,一定要保持实验室干净整洁。至于怎么保持,方法很重要,更重要的是要有责任心。方法的话,可能每个人都会有自己的一套方法,不过能走捷径的还是可以走的。像我们实验室,现在很多都是利用软件来管理的。还记得之前给你们推荐的那款软件吗?我们实验室现在还在用,倒是真的蛮好用的,至少大家做实验的时候不会再乱堆乱放了(因为有领用记录)可能新朋友不知道,或者没有看过我上篇帖子的人不了解,如果相信我的推荐,可以看下我上一篇帖,谢谢,希望能帮到大家!差点忘了,那款软件更新成了iLab,不叫Mr.F了。其他不多说,省得被当成打广告的!
文章出处:Natural killer cell education and tolerance. Cell. 2010. 142:847-856综述背景与主要内容:NK细胞作为继T细胞、B细胞之后的第三大类淋巴细胞,对它的研究已经超过了30年,对其的认识也在一步一步的加深。NK细胞最主要的功能是杀伤病毒感染细胞和转化了的肿瘤细胞,从而起到免疫防御和免疫自稳的作用。从一开始,大家就提出了关于NK细胞如何识别“自我”与“非我”的问题,也就是为什么NK细胞不会杀伤正常的细胞,而专杀病毒感染细胞和肿瘤细胞呢?随着NK细胞众多活化性受体和抑制性受体的发现似乎解释了这一问题,尤其是识别自身MHC I类分子的抑制性受体的发现,认为机体有核细胞都表达MHC I类分子,NK细胞接受自身MHC I类分子的抑制性信号所以不会杀伤自身正常细胞,而病毒感染细胞和肿瘤细胞MHC I类分子下调,NK细胞抑制性信号下降,活化性信号占主导,NK细胞活化从而杀伤这些细胞。但是,随着研究的深入,发现事实并不是如此简单,有些NK细胞并不表达识别MHC I类分子的抑制性受体,或者表达的抑制性受体不识别自身的MHC I类分子。但是这些NK细胞却并不杀伤正常细胞,也不杀伤MHC I类分子缺陷的细胞。另外,无核的红细胞并不表达MHC I类分子,NK细胞也并不杀伤正常的红细胞。虽然自身免疫性疾病有很多,但是没有证据表明NK细胞是导致自身免疫性疾病的主要细胞,自身免疫性疾病一般都是由T细胞或B细胞自身耐受被打破导致的,说明NK细胞自身耐受机制比T细胞和B细胞要完善。逐着研究的深入,对NK细胞耐受的机制的研究也取得了重要突破,本文全面介绍了NK细胞耐受机制研究的重要进展。NK细胞耐受机制(本人总结):1、经典方式:NK细胞表达识别自身MHC I类分子的抑制性受体,机体正常细胞通过表达MHC I类分子抑制NK细胞对机体正常细胞的杀伤。2、NK细胞表达的识别自身配体的活化性受体长期接触机体正常细胞表达的自身配体能够诱导NK细胞耐受。证据1:NKG2D是NK细胞重要的活化性受体,其配体是Rae-1家族,该配体在机体出生前高表达,出生后不表达。所以,NK细胞可以直接杀伤表达Rae-1配体的细胞。但是转基因持续表达该配体的小鼠的NK细胞则表现为对这些配体的耐受,无法杀伤表达该配体的细胞。证据2:Ly49D识别H-2Dd,来源于H-2Dd缺陷小鼠的Ly49D阳性NK可以杀伤表达H-2Dd的细胞。证据3:Ly49H识别MCMV编码的m157,野生型Ly49H阳性NK细胞可以杀伤表达m157的细胞;但是转基因表达m157小鼠来源的Ly49H阳性NK细胞则无法杀伤表达m157的细胞。而且,将野生型Ly49H阳性NK细胞过继转移到转基因表达m157小鼠内,该NK细胞也将耐受,无法杀伤表达m157的细胞。3、正常机体内存在不表达识别自身MHC I类分子的抑制性受体的NK细胞,这些NK细胞在正常机体内表现为耐受状态。在感染或者炎症条件下,这些NK细胞将打破耐受状态,具有较强的杀伤功能,但是,此时这些NK细胞也不会杀伤自身正常的细胞,因为这些NK细胞表达识别其它自身抗原分子的抑制性受体,如识别CD48的CD244抑制性受体,识别LLT1的CD161抑制性受体等。
大家还记得我吗?好久好久没有来发帖了,肯定都快被遗忘了。一直在忙着养细胞,这次过来给大家分享一些自己的心得体会。↓↓↓养了很久的细胞,有一些经验和体会总结一下,和大家分享一下。关于如何把细胞养的形态很好更漂亮。1.不同的细胞,喜欢的环境是不一样的。这个不仅仅是说培养基的不同,还有就是细胞生长的空间密度问题。有一些细胞是数量多一点比较好生长,生长状态也比较好。这种一般是属于生长速度慢的细胞。譬如内皮细胞。而有一些是细胞是数量少一点细胞状态会生长的比较好,譬如巨噬细胞和某些肿瘤细胞。尤其是巨噬细胞,生长速度非常得快,贴壁速度很快,所以传代时就应该留很少量的细胞,这样细胞状态会比较好。并且巨噬细胞比较喜欢扎堆生长,而堆与堆之间是有空间的。如果长成相连在一起的一满片的时候,细胞形态基本上就会差了,老化的会比较多,对后期实验结果是不好的。所以在养细胞的时候应该摸索该细胞喜欢的生长空间密度问题。2.对于有些人总是会遇到养的细胞形态怎么都不好的问题。这个其实是有一个方法可以改善的。对于贴壁细胞,如果细胞形态不好,(或者细胞形态不清晰,表面似有异物等)可以在传代的时候进行如下操作:首先,倒掉旧的培养基,加入3ml新的培养基(有无血清的都可)洗涤一次,用滴管吸走,然后再加入3ml的培养基,进行预吹打,控制吹打力度,轻轻地大概沿着瓶底过一遍,然后吸走。这时侯再开始正式的消化、吹打。(巨噬细胞我们只吹打,不消化的)其次,把吹打下来的细胞悬液加入到新的培养瓶内,培养瓶事先加入培养基,放入培养箱内培养,按时间点观察细胞贴壁情况。10分钟观察一次,20分钟,30分钟观察一次。选择一个时间点,已经有部分细胞贴壁的情况下,重新置于洁净台,底面朝上迅速倒出其中的培养基,加入3ml新培养基再轻轻洗一次。然后加入完全培养基培养。后续观察细胞生长情况以及形态。我称之为“二传”。呵呵。如果一次效果还不理想,可重复多次。直到找到细胞完美形态。其中要注意,结合细胞喜欢的生长情况。喜欢多一点数量长得好的细胞你就等贴壁细胞比较多点的时候再传。反之亦然。这个是我师兄发明的,谢谢他了。这个方法真的很好用!3.关于培养瓶内加入培养基的量的问题。这个是要靠自己去摸索你所养的细胞的。并不是小的玻璃方瓶12ml,大方瓶14ml的。有些细胞反而是培养基少一点相反细胞形态会长得比较好。(可能也是竞争很大,有优胜劣汰吧。呵呵。)对于生长速度快的细胞,易生长的细胞加少一点培养基细胞形态会更好。但是要注意换液掌握。4.关于选择培养瓶的问题。个人发现生长速度快的细胞在玻璃瓶内生长的状态会比一次性塑料瓶相对好一些。而对于同一种细胞,在其生长旺盛快速的时期在玻璃瓶内的生长状态也比塑料瓶内好。这可能是因为塑料瓶比玻璃瓶更容易贴壁。生长速度快的细胞在塑料瓶这种相对“更安逸”的环境里反而长得状态不如玻璃瓶好。所以对于生长速度慢的细胞如果想要更漂亮的细胞状态,塑料瓶比玻璃瓶会好,对于生长速度慢的细胞,玻璃瓶则会更好。同样,对于同一种细胞,在其生长速度慢的时候,塑料瓶会好一点,比如刚刚复苏的时候,或者原代培养的时候。而在其生长旺盛的时候,玻璃瓶则相对会好一点。今天就先分享到这里吧,等下次有时间来逛帖的时候再来分享。大家一定要注意:要想把细胞养的漂亮,一定要保持实验室干净整洁。至于怎么保持,方法很重要,更重要的是要有责任心。方法的话,可能每个人都会有自己的一套方法,不过能走捷径的还是可以走的。像我们实验室,现在很多都是利用软件来管理的。还记得之前给你们推荐的那款软件吗?我们实验室现在还在用,倒是真的蛮好用的,至少大家做实验的时候不会再乱堆乱放了(因为有领用记录)可能新朋友不知道,或者没有看过我上篇帖子的人不了解,如果相信我的推荐,可以看下我上一篇帖,谢谢,希望能帮到大家!差点忘了,那款软件更新成了iLab,不叫Mr.F了。其他不多说,省得被当成打广告的!
名 称:骨髓细胞的提取目的:分离并培养骨髓间充质干细胞原理:先分离出单核细胞然后再通过培养分离出骨髓间充质干细胞内容:步骤一:小鼠骨髓细胞的获取1. 断颈处死小鼠(7-12周,雌雄均可),投入盛有250ml左右的0.1%新洁尔灭或75%酒精中浸泡3-5分钟,拎出后将小鼠仰面翻铺于超净台上一个消毒托盘上。2. 用眼科镊小心捏起小鼠两髋关节之间的腹部皮肤,用眼科剪小心剪开皮肤,并分离两下肢的皮肤,往下在脚踝处剪断,往上在髋关节处剪断,这样可以游离出小鼠的两条下肢。将它们放入另外一个消毒托盘中,并换一套新的剪子和镊子。手术器械事先均必须消毒。3. 小心剥离肌肉,分别剪下Femurs and Tibias, 剪去两端软骨,露出红色的骨髓腔。注意尽可能少的剪走骨髓腔。4. 拿两支5ml无菌注射器,每支吸取5ml IMDM(10%FBS, 50/50u/ml Pen/Strep),换装一个4号针头(又称皮针)或1ml注射器的针头,并用无菌的针头套管将之轻轻拧弯。轻轻插入骨髓腔,对准一个无菌15ml离心管,将细胞冲出。每根骨用2.5ml IMDM培养液左右即可基本冲下骨髓腔内的细胞。5. 300C下离心,1200转/10分钟,去上清,但留1ml,以便用于在振荡器上悬浮细胞。6. 加进氯化铵溶液(NH4Cl: 8.99g/L, KHCO3: 1g/L, Na4-EDTA: 0.037g/L ,过滤灭菌, 40C储存)裂解红细胞,按1: 9比例,即1ml 细胞悬液,加进9ml氯化铵溶液,混匀,冰上10分钟。 7. 300C离心,1200转/10分钟,去上清。步骤二:淋巴细胞分离液分离小鼠骨髓细胞1. 按步骤二方法采集小鼠骨髓细胞,并破红细胞2. 细胞用4ml培养液悬浮,缓慢留置于8ml淋巴细胞分离液液面上,2000rpm for 20min.3. 小心吸取云雾状底层的基质细胞约1.5ml的体积,置于1个盛有1ml无菌细胞培养用PBS的15ml离心管中,颠倒混匀,1200rpm for 10min, 去上清4. 如果是注射用细胞,则用5ml PBS洗涤细胞2次;5. 离心沉淀下来的细胞用50-200ul PBS,计数细胞,并计算所需细胞体积数铺板培养
第四种淋巴细胞—NKT细胞 通常认为,构成机体免疫系统的淋巴细胞有三种细胞系组成,一是由胸腺产生的T细胞,二是由骨髓分化而来的产生抗体的B细胞,三是自然杀伤(NK)细胞。而新近发现存在第四种淋巴细胞—NKT细胞。1. NKT细胞的发现1986年,克隆成功了NKT细胞的特征性抗原受体基因。将其命名为Va14基因,与其他T细胞抗原受体的(TCR)基因不同,有其独特的结构特征。1987年美国国立卫生研究所的Fawlkes与瑞士的Budd分别领导的两个研究小组报告指出,胸腺细胞中的T细胞通常不能表达受体,仅有部分未成熟T细胞选择表达V-β8.2受体。随后的研究证明这种细胞不是T细胞,考虑是NK细胞的受体,这种细胞集团的数量极少,生理意义不明。1994年,这两个研究小组的研究人员发现,他们报道的细胞为同一细胞,从此NKT细胞的研究引起人们的广泛关注。T细胞识别的抗原是蛋白质,而NKT细胞是别的抗原是α-Gal-Cer即所谓的糖脂质,这是该免疫系统与通常的免疫系统重要的不同点。NKT细胞的分化与T细胞不同的是在胸腺形成前的胎生初期6.5日在胸腺外组织分化。NKT细胞与T细胞比较,机能处于不发达状态。T细胞分化为功能不同的Th1和Th2细胞群,Th1细胞产生INFγ及IL-2,引起迟发行过敏症等细胞性炎症。Th2细胞能产生IL-4和IL-10,参与变态反应及抗体产生等体液免疫反应。而NKT细胞不但能分泌Th1和Th2细胞因子,同时还具有与CD8+伤害性T细胞(cytotox-ic Tlymphocyte,CTL)相同的杀伤靶细胞作用。毫无疑问,NKT细胞在免疫调节系统中占有重要位置。NKT细胞与疾病可能有诸多关系,可能与自身免疫性疾病的发病机制、变态反应的调节、抗肿瘤作用、及抑制寄生虫感染等有关。2. NKT细胞的多样性分化NKT细胞具有T细胞和NK细胞细胞两重性质,既能表达Va14/Ja281特定的T细胞受体又能由CD1介导识别脂质抗原。NKT细胞的分化是否依赖胸腺尚有争议。根据其表达TCR等多种表面抗原的不同,提示NKT细胞存在两个以上细胞群。从CD4/8的表达看,可将其分为(1)CD4-NKT细胞,(2)CD8-NKT细胞,(3)CD4和CD8均不能表达的DN-NKT细胞。第一类的全部和第二类的半数是Va14/Ja281-T细胞。3.人类NKT细胞人末梢血中的DN-NKT细胞V区域,可高度表达Va24/JaQ(这与鼠的Va14/Ja281高度相似)及Vβ11(与鼠Vβ18高度相似)。这种TCR的组合表达可见于DN-NKT细胞和CD4+细胞。而未见于CD8+细胞。小鼠的CD1相当于人的CD1d的Va24/JaQ。此外,人末梢血中1~2%的T细胞能表达抑制性受体,即抑制型NK细胞受体(KIR),而Va24/JaQ+细胞则不能表达。它的NK相关分子是CD16、CD56或CD57,Va24/JaQ+细胞异不能表达这些分子。在小鼠中还可以看到Va24/Ja281+T细胞以外的NKT细胞。人类Va24/JaQ+细胞与KIR+T细胞能形成不同的亚群。且具有不同的功能。4. NKT细胞分化的胸腺依赖性这是目前存在争议的问题,可以肯定地说NKT细胞分化过程中胸腺是有作用的。NKT细胞多见于胸腺及脾脏以外的肝脏和骨髓种,胸腺缺损的小鼠与正常小鼠比较,NKT的分化并不少。将出生三日小鼠的胸腺摘除,虽然NKT细胞的分化显著受到抑制,但此时CD8+NKT细胞的分化未受到影响。由此认为CD8+NKT细胞在胸腺外分化的可能。5. NKT细胞产生细胞因子的意义 NKT细胞是指能够表达NKT细胞标志NKT1.1的T细胞,其机能具有T细胞和NKT细胞双重特征。NKT细胞在TCR和NKR介导下,产生大量的IL-4及INFγ,对肿瘤细胞有细胞伤害作用。 NKT细胞能表达T细胞的TCR与NK细胞的NKR-P1两种受体,特别是NKT细胞多数表达Va14TCR,识别CD1抗原,而NKR-P1识别各种糖链。 NKT细胞,特别是CD4-NKT细胞,对TCR刺激可产生大量IL-4及IFNγ,同时具有ThO型细胞因子产生能力。NKT细胞不但产生IL-4的主要细胞,而且强力产生IFNγ。IFNγ参与自身Th1诱导,具有极强的Th1诱导能力,从而是IL-2产生亢进。它同时还具有Th2细胞分化抑制功能。IL-12能诱导NKT细胞产生IFNγ。IL-12对TCR的刺激是IFNγ的产生显著亢进。综上所述,NKT细胞不但是IL-4和IFNγ的强力产生细胞,同时参与Th1/Th2分化的抑制,而这些作用都不是单纯的。 虽然NKT细胞能大量产生细胞因子,但仅在机体内保持这种功能。当初一度认为,NKT细胞只是IL-4的产生细胞,而不是Th2分化的必需细胞。并不认为在CD1缺损的小鼠中NKT细胞的分化和对TCR刺激使IL-4产生减少,且对Th2分化必需的IL-4及IgE的产生没有多大影响。但给小鼠投于α-GalCer可使NKT细胞活化,IL-4的产生诱导Th2的应答。有报告指出,同样投于α-GalCer,可使NKT细胞产生IFNγ而致IgE产生低下。由此可见,NKT细胞能产生IL-4与IFNγ两种功能相反的细胞因子。这种微妙的协调作用可能是NKT机能表达的重要特征。NKT细胞的活化通常伴有T细胞、B细胞及NK细胞的活化,这对NKT细胞活化后的免疫应答有较大影响。
1. 利用诱导性多功能干细胞构建出小鼠精子祖细胞日本京都大学研究人员通过体外诱导胚胎干细胞(ESCs)和诱导性多功能干细胞(iPSCs),形成原始生殖细胞样细胞(primordial germ cell-like cells, PGCLCs),最后进一步分化,通过体内植入不能生育的小鼠睾丸中,产生了外观正常的精子。将这些精子注射到雌性小鼠的卵细胞中,不久雌性小鼠生出了健康的小鼠后代。2. 鉴定出阿尔茨海默病Alzheimer's disease的生物标记美国研究人员利用一种一般性和无偏差的方法---组合文库筛选(Combinatorial Library Screening)来鉴定出诊断上有用的抗体,而避免进行抗原鉴定。该方法涉及利用非自然的合成分子组合文库对病人血清样品和对照样品进行比较性筛选,这样就可鉴定出病人血清样品中要比和对照样品中保留极其多IgG抗体的分子,随后利用这些分子作为捕获试剂来捕获诊断上有用的抗体。研究人员利用多发性硬化症(multiple sclerosis)小鼠模式动物和证实这种方法的实用性,并利用该方法在阿尔茨海默病小鼠模式动物中鉴定出两种候选的IgG抗体生物标记。3. 发现干细胞多能性的选择性剪接开关加拿大多伦多大学研究人员发现了进化上保守的特异的FOXP1选择性剪接开关,可调控干细胞的多能性。研究人员发现这种剪接开关产生的FOXP1胚胎干细胞特异性异构体,与典型的FOXP1异构体相比,着不同的DNA结合性质。选择性剪接事件改变了FOXP1胚胎干细胞特异性异构体的DNA结合性质,促进维持多能性所需的转录因子基因的表达,包括OCT4、NANOG、NR5A2和GDF3,同时抑制胚胎干细胞分化所需的基因。同时,研究小组还发现FOXP1胚胎干细胞特异性异构体促进体细胞高效重编程为诱导性多功能干细胞(iPSC)。4. 追踪神经胶质瘤的起源美国研究人员利用双标记嵌合分析(Mosaic Analysis with Double Markers,MADM)---该技术的精髓在于用绿色荧光蛋白明确标示突变细胞,还有一个关键特色就是无论一个突变的绿色细胞何时产生,总是同时产生一个正常的红色细胞---来分析神经胶质瘤(glioma)的起源。他们将胶质瘤病人体内发现的两种流行突变p53与NF1导入神经干细胞(neural stem cells, NSCs)中,对源自神经干细胞的所有细胞系所作的进一步分析清楚地显示了少突胶质前体细胞(Oligodendrocyte precursor cells,OPCs)是该肿瘤的来源细胞,因为任何可见的肿瘤标志可被检出之前,变异的绿色少突胶质前体细胞的数量大大超过了其正常的红色对应物数量,足足超了130倍。为了进一步证实这点,研究人员也将p53与NF1突变直接导入小鼠少突胶质前体细胞,结果发现这些小鼠产生神经胶质瘤,从而再次证实少突胶质前体细胞是神经胶质瘤的来源。5. 发现新的组蛋白修饰方式美国芝加哥大学Ben Mary癌症研究所研究人员在细胞中筛查出了67个新组蛋白修饰标记,并从中发现了一种新型组蛋白翻译后修饰方式---赖氨酸巴豆酰化(lysine crotonylation)修饰。通过进一步的结构及基因组定位分析,研究人员证实氨酸巴豆酰化修饰是一种进化高度保守,且在生物学功能上完全不同于组蛋白赖氨酸乙酰化的蛋白质修饰方式。研究人员还发现在人类体细胞和小鼠精子细胞基因组中,组蛋白赖氨酸巴豆酰化分布于基因活性转录启动区域或增强子上。在减数分裂后的精子细胞中,赖氨酸巴豆酰化高丰度集中在性染色体上,被用来标记睾丸特异性基因。
干细胞使与衰老有关的肌无力的速度放缓 在小鼠中的一则新的研究报告指出,用干细胞来增加年轻的肌肉可减缓与年龄老化相关的肌无力的进程。 这些发现可能会导致再生性肌肉疗法的出现,这种疗法也许会对罹患肌营养不良症的病人或是那些虚弱的老年人有帮助。 文章的作者提出,如果科学家们能够发现可刺激肌肉中干细胞的小分子或分子组合(这可能会比将干细胞移植到人体内要更容易些),那么这些分子可被用于增进肌肉修复或减少肌肉丧失。 在成年期,损伤后或疾病后肌肉再生主要是靠卫星细胞,这是一种会分裂并参与修复、重新恢复活力和控制骨骼肌组织的干细胞,它可通过发育成为肌肉细胞而令肌肉生长。 Bradley Olwin及其同事在这里利用了干细胞的能力并防止了在幼小的小鼠中某一单一肌肉的与年龄老化有关的消瘦。 在该研究中,研究人员将少数的干细胞移植到肌肉受伤的幼小小鼠体内。 该研究小组在两年后对这些小鼠进行检查时发现,这种手术永久性地改变了移植的细胞,使得它们能够抵抗肌肉中的老化过程。 明确地说,这些移植的细胞能够控制它们所在的肌肉并与肌肉融合以形成新的肌肉纤维。 尽管人们对这一过程的机制还不了解,但这些发现提示,通过模仿这些移植的干细胞的功效,科学家们也许能够防止肌肉功能和重量的丧失,而这些通常是在人类老化时出现的情况。
中国科技网讯 (记者何屹)据每日科学网站2月20日(北京时间)报道,斯坦福大学的科学家开发出一种系统,可以实时观察活鼠大脑活动情况,对研究诸如阿尔茨海默氏症等神经退行性疾病的新治疗手段具有十分重要的作用。该研究发表在近期出版的《自然·神经科学》杂志上。 研究人员首先利用基因疗法令老鼠神经细胞表达绿色荧光蛋白,该蛋白对钙离子敏感。当神经元受到刺激时,细胞内充满钙离子,荧光蛋白被激活,整个细胞会发出明亮的绿色荧光,就像一朵灿烂的绿色小烟花在黑色背景下绽放。随后,研究人员在老鼠大脑负责空间和情景记忆的海马体上方植入一个微型显微镜,显微镜与相机芯片相连,并可将数字图片传送到电脑,在电脑屏幕上显示老鼠大脑活动的实时视频。 海马体对环境非常敏感,在不同的环境下会有不同的细胞响应。当老鼠在实验环境的某个特定区域挠墙时,刺激特定的神经元闪烁绿色荧光。当小鼠流窜到别的区域时,绿色荧光会从某个神经元褪色,转而刺激新的神经元细胞发光。科学家在掌握了小鼠行为和神经元之间的关联后,仅仅通过小鼠脑部荧光闪烁的混乱图景,就能够清楚地了解老鼠究竟位于何处。 该研究小组发现,小鼠神经元的刺激模式十分稳定,实验间隔时间长达一月之后,仍可保持不变。而观察相同的细胞对于了解脑部疾病非常重要。如果某一个特定的神经元在测试时发生功能障碍,表明正常神经元已经死亡或出现神经退化疾病。研究人员就可以利用某些实验性的治疗试剂进行治疗,然后在相同刺激条件下,确定神经元能否恢复功能。 目前这项技术尚不能应用于人类,但小鼠模型是研究人类神经退行性疾病新疗法的一个重要起点,该系统将成为临床前研究评估的一种非常有用的工具。目前研究人员已经成立了一个公司,生产和销售该设备。 总编辑圈点 一般所说的“读脑仪”,通常指对脑意识进行探测和显现的电子设备,譬如测谎仪就算一种读脑设备。但在本文的研究中,“读脑”是为了找出实验对象的行为和神经元之间的关联,再进行医学药理学的分析。与意识探测相同的是,关乎“脑”研究,人类都还只是接触到皮毛,不过,随着近几年新进展的不断出炉,无论是“倾听大脑的思想”,还是将小鼠模型应用于研究人类神经退行性疾病新疗法,相信只是时间问题。 《科技日报》(2013-02-21 一版)
自去年10月开始,分子生物学家Katsuhiko Hayashi就陆陆续续收到了许多夫妻的邮件,这些夫妻大多人到中年,仍然在为了一件事情焦急:要一个孩子。其中有一位英国的更年期妇女,希望到他位于日本京都大学的实验室,在他的帮助下怀上孩子,她写道:“这是我唯一的愿望。”这些请求开始于Hayashi一篇文章的发表——他原以为只有发育生物学家才会对他的实验结果感兴趣。在体外条件下,利用小鼠的皮肤细胞创造可以发育成精子和卵子的原始生殖细胞(PGCs)。为了证明这些实验室培养的原始生殖细胞与自然发育而成的原始生殖细胞类似,他利用它们生成了卵子,进而创造小鼠生命。他表示,这个创造出来的小鼠生命仅仅是他研究的一个“副产品”,他的研究将意味着更多——利用不孕妇女的皮肤细胞为她们提供可受精的卵细胞。与此同时他还提出,男性的皮肤细胞也可以用来创造卵子,同样,女性的皮肤细胞也可以生成精子。(事实上,研究结果发表后,许多同性恋发邮件给Hayashi ,索要更多的信息。)尽管这是一项创新研究,但是公众的广泛关注还是令Hayashi和他的教授Mitinori Saitou感到非常惊讶。他们花了十多年不断挖掘哺乳动物配子产生的微妙细节,然后在体外条件下重新创建该过程——一切都是为了科研,而非医疗。现在他们的方法使研究人员能够创建无限的原始生殖细胞,这种在以前很难获得的珍贵细胞的正常供应有助于推动哺乳动物生殖研究。但是,当他们将这个科学挑战自小鼠到猴子,再到人类推进时,这一过程被公众定义为治疗不孕不育的过程,于是相关的道德争议随之出现。“毫无疑问,他们在小鼠身上给这一领域带来了重大的改变,” 洛杉矶加州大学的生育专家Amander Clark说,“但是,在这项技术展示它的实用性之前,我们必须讨论一下使用这种方式创造配子的伦理问题。”回到最初在小鼠体内,胚胎发育一周后,便出现约40个左右的原始生殖细胞。这个小小的细胞团进而在雌性小鼠体内形成成千上万的卵细胞,在雄性小鼠体内每天都能生成几百万个精细胞,并能够遗传小鼠的全套遗传信息。Saitou想要了解在这些细胞发育过程中受到了那些信号的控制。在过去的十年中,Saitou已经通过辛苦研究确定了几个基因——包括Stella, Blimp1 和Prdm14 ——这些基因的某种组合在某些时候对于PGCs的发育起到了至关重要的作用。利用这些基因作为标记,可以从其他细胞中筛选原始生殖细胞以观察这些细胞的变化。2009年,在日本神户的RIKEN发育生物学中心,他发现,当培养条件适当时,在精确的时间加入骨形态发生蛋白4(BMP4),可以胚胎干细胞转化为原始生殖细胞的。为了验证这一发现,他向胚胎干细胞提供高浓度的BMP4,结果显示,几乎所有的胚胎干细胞都变成了PGCs。他和科学家们都预计这一过程非常复杂。http://www.ibioo.com/data/attachment/portal/201308/25/095620gaqefeejnqejxuu3.jpg人造小鼠生殖细胞产生小鼠胚胎的过程(点击图片查看大图)Saitou的方法严格遵循了自然过程,这与其他从事类似研究的人形成了鲜明的对比,以色列魏茨曼科学研究所的干细胞专家Jacob Hanna说。许多科学家尝试通过信号分子轰击干细胞在体外创造特定类型的细胞,然后筛选细胞混合物得到他们想要的细胞。但是他们忽略了这些细胞的自然形成过程和这些人造细胞与自然形成细胞的相似程度。Saitou找出了形成生殖细胞所需的条件,去除多余的信号干扰并将每个过程的时间精确控制,给他的同事们留下了深刻的印象。英国谢菲尔德大学的干细胞生物学家Harry Moore将这种生殖细胞发育的精确重现视为一场“胜利”。到了2009年, Saitou在小鼠生殖细胞出现之前从外胚层取了一些细胞,这成了研究的起点。但是想要真正掌握这个过程中,Saitou希望从细胞培养开始。当时正值Hayashi从英国剑桥大学回到日本,和Saitou一样,Hayashi在该领域先驱Azim Surani英国的实验室里完成了4年的研究。Surani盛赞这两位科学家说,他们的“气质、风格和解决问题的方法能够相互补充”。 Saitou “处理事情时很有系统性、完成目标一心一意”,而Hayashi“工作时更有直觉、视角更广阔、处理问题方法相对更加宽松”,他说。“他们确实形成了一个非常强大的团队。”Hayashi加入了Saitou京都大学的团队,他很快就发现,那里不同于剑桥。在京都大学,Hayashi用在理论讨论上的时间比曾经少得多,而更多的时间都花在实验上。他说“在日本,我们只管‘做’,这有时是非常低效的,但有时又酝酿着巨大的成功”。Hayashi同样以外胚层细胞作为起点,但与Saitou不同的是,他试图培养一个能够产生原始生殖细胞的稳定细胞系。可惜这种方法没有奏效。Hayashi借鉴其他研究结果——一个关键调控分子(activin A)和生长因子(bFGF)可以将培养的早期胚胎干细胞转化成类似于外胚层细胞的细胞类型。这引发了Hayashi将这两个因素结合起来的想法,诱导胚胎干细胞分化为外胚层,然后采用Saitou之前的方法把这些细胞成为的PGCs。通过这种新的方法,他最终获得了成功。为了证明这些人造的原始生殖细胞是真实的拷贝,他们必须证明这些细胞可以进一步发育成精子和卵子。这一进程是非常复杂和难以理解的。所以研究小组将这一工作留给了自然——Hayashi将PGCs植入无法产生精子的小鼠的睾丸,观察这些细胞是否会发育。Saitou认为,这是可行的,但还是感到有些担忧。当实验进行到第3或4只小鼠时,他们发现小鼠的输精管里充满了精子。“这一切都发生得恰如其分,我知道他们会产生幼仔,”Hayashi说。研究小组将这些精子注入卵细胞中并植入雌性小鼠的胚胎,结果产生了大量的雌性和雄性后代。他们利用诱导多能干细胞(iPS)进行反复的实验,成熟的细胞被重新编程为胚胎状态。此外,精子被用于生产幼仔,证明它们具有基本功能——这是干细胞分化领域的罕见成就。Clark说:“这是整个多能性干细胞研究领域里在培养皿中生成全功能细胞类型少有的成功案例之一。”他们预计形成卵细胞更复杂,但是在去年,Hayashi在体外条件下制作有正常着色的原始生殖细胞并转入白化小鼠的卵巢,将产生的卵细胞体外受精后植入代孕。当透过幼崽半透明的眼睑看到黑色的眼睛时,他知道这一切又成功了。生殖细胞的回馈目前,许多研究人员已经能够复制验室培养原始生殖细胞的过程。人造原始生殖细胞特定用于表观遗传学研究:通过修饰DNA确定哪些基因表达。最常见的修饰就是为DNA碱基加上甲基,这些修饰在有些情况下,能够反映生物所经历的历史过程。与其它类型的细胞类似,表观遗传标记改变了原始生殖细胞在胚胎发育过程中的命运,但原始生殖细胞有个与众不同的特点,就是当它们发育成精子和卵子后,表观遗传标记被擦除。这就允许细胞创建能够形成任何类型细胞的受精卵。表观遗传微妙变化中出现错误将会导致不孕不育并出现器官故障,如如睾丸癌。Surani和Hanna的团队已经利用人造原始生殖细胞研究不同酶在表观遗传调控中的作用,也许有一天,能够解答表观遗传网络如何参与疾病调控。事实上,体外产生的原始生殖细胞可以为研究提供数百万个细胞,而不是供科学家研究了40个左右,这些细胞可以通过解剖早期胚胎获得。Hanna说:“这是一个大问题,因为我们这里有这些稀有的原始生殖细胞正在经历我们尚不了解的全基因组表观遗传变化。”“体外模型为科学家们提供了前所未有的方便,” Clark表示认同。临床意义但是Hayashi和Saitou没有办法向乞求帮助的不孕夫妻提供帮助。在这种方法被运用在临床之前,还有许多问题需要梳理。Saitou和Hayashi发现,虽然运用他们的技术所产生的后代通常似乎是健康和大量的,但这些后代产生的原始生殖细胞并生不完全“正常”。 第二代原始生殖细胞产生的卵细胞往往是脆弱、畸形的,并且从支持它们生长的组织上脱离。当受精时,卵细胞内部会分为三组染色体,而不是正常的两组,体外受精的成功率也只有正常原始生殖细胞的三分之一。哈佛医学院从事表观遗传学研究的Yi Zhang,使用Saitou的方法在研究中发现,体外受精过程中,人造的原始生殖细胞不能像自然状态下产生的原始生殖细胞一样,抹去它们的表观遗传标记。“我们必须要知道,这些都是PGCs的类似细胞,而不是真正的原始生殖细胞,”他说。此外,这项技术还存在两个大的挑战。首先是在不将PGCs放回睾丸或卵巢的前提下买入和使它们变成成熟的精子和卵子,Hayashi目前正在试图破解PGCs生成卵子或精子的生物信号,使人工培育条件下完成这一阶段成为可能。但最可怕的挑战是在人体重复上述所有的工作。该小组已经在利用Saitou找到的关键调控基因来调整人类的iPS细胞,但是Saitou 和Hayashi都知道,人类的信息调控网络不同于小鼠。此外,Saitou有无数的小鼠胚胎进行解剖,但无法在人类胚胎进行
日本理化学研究所(REKIN)的小保方晴子等人 2014 年年初在《自然》上发表了两篇干细胞研究领域的重磅论文,但很快被质疑其研究存在学术不端。日本理化学研究所和《自然》(Nature)随后分别展开调查。日本理化学研究所在 4 月 1 日认定小保方晴子篡改及捏造实验数据。但目前对于该研究的争议还有一个关键性的问题尚未解决:小保方晴子等人在研究中观察到的现象究竟存在吗?或者说 STAP 真的存在吗?日本媒体 6 月 3 日发表的报道称,在对 STAP 实验中用到的细胞进行了基因检测后,结果显示,不存在。根据小保方晴子等人的研究结果,对体细胞进行简单的酸浴刺激,或者施加物理应激,就可以得到 STAP 细胞。这些细胞具有和胚胎干细胞相同的特性。对这些细胞进行进一步操作后,它们也可以形成可自我更新的干细胞系,这就是 STAP 干细胞,它们具有和胚胎干细胞系几乎相同的特性。之前《自然》上发表的论文中报告称,小保方晴子所在的实验室共创建了 8 个 STAP 干细胞系。今年3月,论文合作者之一、山梨大学的若山照彦曾要求文章的第一作者向其提供用某一品系的小鼠细胞制备的 STAP 细胞,但当若山照彦对细胞进行了简单的遗传分析后发现,文章的第一作者小保方晴子给他的干细胞,是由其他品系的小鼠细胞制备的。这表明这些细胞可能受到了污染。但是若山照彦并没有发现《自然》发表的论文中提到的 STAP 干细胞系存在问题。为了验证他的结论,若山照彦将 20 个干细胞系(包括论文中提到的 8 个),寄送给了一家匿名的独立遗传分析小组进行检测。根据日媒援引多方信源的报道,这次检测的结果已经送回理研。检测结果显示,所有 STAP 干细胞系都与论文声称的小鼠品系不符,这一结果对 STAP 现象是否存在提出了质疑。若山照彦表示,他将尽快召开媒体发布会公布相关检测细节。另据报道,日本理化所将有可能支持小保方晴子继续研究工作,设法重演STAP结果。
10多年来,干细胞疗法一直被认为能够给那些遭受遗传和退行性疾病折磨的人带来希望。而就在几天前,随着两个研究团队在于日本横滨召开的国际干细胞研究学会(ISSCR)年会上宣告了他们在人类临床研究中取得的成果——一项聚焦于罕见的遗传神经病,另一项则着眼于老年人的视力丧失,这一希望又朝着现实迈出了一步。 美国加利福尼亚州纽瓦克市干细胞公司报告了用人体神经干细胞治疗梅氏病(PMD)所取得的鼓舞人心的研究成果。PMD是一种渐进式的致命疾病,该病通过基因突变抑制了髓鞘的正常生长,后者是大脑中包裹神经纤维的一种保护物质。缺乏髓鞘,神经信号便会流失;病人,通常是婴儿,便会经历运动协调能力退化以及其他神经病症状。据干细胞公司负责研究的副总裁Ann Tsukamoto介绍,该公司之所以选择PMD来测试其神经干细胞技术,缘于目前尚没有这种疾病的治疗方法,且通过基因检测和磁共振成像能够确诊这种疾病。她说:“这便为最有效的早期介入创造了一个机会。” 该公司建立了一个从成熟神经组织中分离出的高度纯化的神经干细胞库。研究人员将这些神经干细胞注入啮齿动物体内后,它们并没有形成肿瘤,事实上,这些细胞在小鼠的大脑中游走,并分化成不同类型的神经细胞,其中就包括分泌能够保护神经纤维的髓鞘的细胞。Tsukamoto介绍说,当神经干细胞被注入小鼠后,它们表现出了“强大的移植和迁移能力,并形成新的髓鞘”。 该公司如今正赞助对4名PMD婴幼儿患者进行该技术的初期安全试验。加利福尼亚大学旧金山分校的研究人员,向每位患者大脑中的4个区域中的每一个区域移植了7500万个神经干细胞,并随之进行了免疫抑制治疗,这样受体才不会排斥外来的细胞。Tsukamoto报告说,在试验过程中并没有出现安全隐患。此外,在18个月后进行的磁共振成像显示,在轴突周围形成了新的髓鞘,并且对患者进行的临床观察表明,他们的运动机能保持稳定或出现了小幅提升。干细胞公司如今正计划进行更大规模的试验。Tsukamoto表示,一旦这种疗法被证明是有效的,它将带来多发性硬化、大脑性麻痹和阿尔茨海默氏症的神经干细胞新疗法。 在这次会议上,神户市日本理化研究所(RIKEN)发育生物学中心的干细胞研究人员Masayo Takahashi,报告了她的研究小组在针对与年龄相关的黄斑变性(AMD)的临床前研究所取得的进展。在AMD中,视网膜色素上皮(RPE)细胞的生长出现了问题,并且位于视网膜下部的血管出现了渗漏。这些情况导致眼睛中心部位的视力下降。Takahashi的研究小组研制出一种方法,即用外科手术摘除有问题的血管,同时用源自病人自身细胞的新RPE细胞替代受损的RPE细胞。利用被称为细胞再编程的一项技术,研究人员采集了病人的皮肤细胞,并将其转化为所谓的诱导多能干(iPS)细胞,这种细胞能够分化成人体中的所有细胞。研究人员随后将iPS细胞转化为RPE细胞。由于iPS方法使用的是病人自身的细胞,因此避免了对免疫抑制药物的需求。 由Takahashi小组生成的RPE细胞表现出了真正人体RPE细胞的特征结构和基因表达模式。她报告说,将它们注入小鼠并没有引发肿瘤,并且这些细胞在移植到猴子体内后存活了6个多月。Takahashi希望在得到必要的批准后,能够在1年内开展人体试验。 英国剑桥研究学院癌症中心的干细胞研究人员Fiona Watt指出,在ISSCR上发表的这些研究结果将帮助该领域“积攒力量”。而美国哈佛医学院的干细胞科学家George Daley则更为乐观。他说,记住这次年会上报告的这些进展;并表示对明年在波士顿召开的2013年ISSCR年会充满期待。