发酵毕赤酵母

我们平常所吃的馒头、面包，都是面经过发酵而制成的，它们蓬松有弹性，口感很好，还带有特殊的香味。而用来发酵的无论是从前的酵头，还是现在的发酵粉，其实都是添加剂酵母菌。现在酵母菌的作用已经不仅仅只停留在发酵作用上了，由于其独特的品性，酵母菌的用途也越来越广，成为一种多功能的食品添加剂。 酵母菌功用之一发酵 发酵是酵母菌最主要的功用。人类很早就开始将酵母菌应用于食品生产中，例如酒精饮料、酱油、食醋、馒头和面包的发酵等等。在面包和馒头的生产中，酵母发酵产生大量二氧化碳．使面团膨胀，形成松软的组织。 在食品工业上常见的酵母菌有啤酒酵母，用于生产啤酒、白酒和酒精，以及制做面包；葡萄酒酵母，也称酿酒酵母，用于酿造葡萄酒和果酒，也用于啤酒和白酒的酿造。其中啤酒酵母是食品工业上应用最为广泛的微生物之一，啤酒酵母菌体内维生素、蛋白质含量很高，其药用价值也很高，还可以用于做饲料，提取核酸、麦角醇、谷胱甘肽、凝血质和三磷酸腺苷等。

酵母类型和连续发酵对经典酒类酵母类型和连续发酵对经典酒类参数的影响酒精发酵结束时，所有连续的S的乙醇浓度在9.0到11.5% (v/v)之间，糖浓度低于2.0g.L-1。与不完全酒精发酵的纯培养物相比，接种P的样品完成发酵的时间最长，至少12天。对于其他NS酵母来说，7天就足以完成酒精发酵，而对于S纯培养物来说，则需要5天。与NS纯培养发酵相比，顺序发酵有助于增加乙醇浓度，但也减少了发酵时间。与S纯培养物相比，来自连续发酵的葡萄酒酒精含量的降低证实了NS酵母用于降低乙醇含量的效用。由于所有形式的葡萄汁和发酵条件都是相同的，使用代谢组学在最终葡萄酒成分和亮点中检测到的差异是由酵母的类型、酵母之间的相互作用和添加S的时间引起的。数的影响酒精发酵结束时，所有连续的S的乙醇浓度在9.0到11.5% (v/v)之间，糖浓度低于2.0g.L-1。与不完全酒精发酵的纯培养物相比，接种P的样品完成发酵的时间最长，至少12天。对于其他NS酵母来说，7天就足以完成酒精发酵，而对于S纯培养物来说，则需要5天。与NS纯培养发酵相比，顺序发酵有助于增加乙醇浓度，但也减少了发酵时间。与S纯培养物相比，来自连续发酵的葡萄酒酒精含量的降低证实了NS酵母用于降低乙醇含量的效用。由于所有形式的葡萄汁和发酵条件都是相同的，使用代谢组学在最终葡萄酒成分和亮点中检测到的差异是由酵母的类型、酵母之间的相互作用和添加S的时间引起的。

据美国物理学家组织网12月27日报道，美国伊利诺伊大学香槟分校食品科学与人类营养系、加州大学劳伦斯伯克利国家实验室和英国石油公司（BP）的科学家表示，他们对酿酒酵母进行了基因改造，新得到的酵母菌株可以发酵葡萄糖、纤维二糖（葡萄糖的前体物，由两个结合在一起的葡萄糖组成）和木糖，能更好更多地把植物发酵成替代燃料乙醇。相关研究发表在最新一期的美国《国家科学院院刊》上。酵母以糖为生，并在这个过程中能产生很多对人来说是“宝物”的废物——乙醇和二氧化碳，因此生物燃料工业也使用酵母将植物糖转变为生物乙醇。然而，大多数酵母无法将植物中的葡萄糖、纤维二糖和木糖这三种糖全部转化成有用的燃料，比如，酿酒酵母能很好地发酵葡萄糖，但对木糖却有心无力，这使得利用酵母制造生物燃料的成本居高不下。之前，科学家对酵母菌种进行基因改造，让其代谢木糖，但速度很慢，效率过低。研究小组成员之一、伊利诺伊大学食品科学和人类营养学教授金泳恕（音译）表示，经过基因改造的酵母无法发酵木糖的主要问题是，它接触木糖之前会吸收所有葡萄糖，酵母表面的葡萄糖转运蛋白更愿意同葡萄糖依附在一起。在此项新研究中，基因改造后的酿酒酵母可以同时将纤维二糖和木糖转化为乙醇。转化效率和转化得到的乙醇数量都提高了一倍，这主要归结于混合发酵的协同作用。金泳恕表示，新酵母菌种将木糖转化为乙醇的效率至少比目前已知酵母菌高20%，使其成为最好的发酵木糖的细菌。研究团队通过对酿酒酵母做出几个关键的改进而获得了这样的结果。首先，他们给予这种酵母一个纤维二糖转运蛋白，这意味着其能将纤维二糖直接带入细胞中，而只有当纤维二糖进入到细胞内部时，它才会被转化为葡萄糖。这种方法可以战胜酿酒酵母本身对葡萄糖的偏好，从而专注于将木糖吸收进酵母细胞中。接着，研究人员将从一个消耗木糖的酵母中提取的3种蛋白质插入酿酒酵母中，由此提高了新酵母菌种代谢木糖的速度和效率。他们也对一种人造的同功酶进行了基因修改，让木糖代谢的正常中间产物木糖醇积聚的数量最少。最后，该研究团队使用“进化工程”让新菌种利用木糖的能力达到最大。研究人员表示，混合发酵的成本优势也很明显，其乙醇产量也高于工业标准，这种研究很快将被商业化。

加拿大近日发出通报，加拿大卫生部收到一份申请，要求准许按（2.25g）/100g的90I.U.标准，选择添加维生素D2制作酵母发酵烘焙产品。加拿大卫生部完成了一项强化酵母发酵面包和非标准化酵母发酵烘焙产品提案的安全评估，如：比萨、面包混合材料、甜甜圈、牛角面包及百吉饼。现有数据评估证明，上述食品按产品（2.25g）/100g的90I.U.标准添加维生素D是安全的。评估还确定维生素D不限于一种酵母源。因此，加拿大卫生部建议修改法规，准许面包、强化（维生素）面包、葡萄干面包、全麦面包、黑面包及非标准化酵母发酵烘焙产品，按烘焙产品（2.25g）/100g的90I.U.标准有选择的添加维生素D。作为提高监管系统应答能力的一种手段，在履行法规协调程序的同时，特发布临时营销许可（IMA），批准烘焙产品直接添加维生素D。

很多朋友问这样一个问题：为什么毕赤酵母表达困难?他们自己也很纳闷，重组酵母pcr检测也证明目的基因重组了，但是诱导之后就是在表达上清中检测不到目的蛋白，仔细研究操作手册后仍然不知道原因。本人，根据自己的经验，采用倒推的方法，按实验过程从后向前分析，供大家参考：1、诱导之后表达上清中检测不到目的蛋白：分析1：检测的方法是否有问题，要考虑是不是蛋白表达量低而没有检测到? 如果是蛋白表达低，可以选择浓缩蛋白，具体的方法很多，有TCA、丙酮、浓缩柱等等方法，之前在本版已经发过帖，在此不赘述。 2、如果蛋白浓缩N倍之后仍然检测不到，那基本可以确证蛋白并不在上清中。那么蛋白到哪里去了，考虑是否没有分泌出来，而是在胞内，那就需要通过裂解酵母来检 测胞内蛋白，具体的方法很多，在此也不赘述，曾整理过相关破碎的帖子。 3、如果胞内也没有目的蛋白表达，那么基本可以确定蛋白并没有表达。 4、为什么没有表达呢?倒推回来就是诱导的过程了，诱导体系是什么?甲醇浓度是多少?培养问题是多少，转速是多少?这些都要注意。甲醇一般是0.5%-1.0%，本人用的 是0.5%，也有很多人也用1.0%，曾见过一个帖子，说超过1.5%反而会抑制表达，没有验证过，供大家参考。培养问题28-30度比较合适，转速250rpm比较合适，诱导 体系没有固定的体系，说明书上推荐的是BMGY到OD600 2~6，换到BMMY中OD600 为1左右。 5、如果诱导的过程也没有问题，那问题就复杂了，特别是重组酵母PCR检测证明目的基因确实已经发生了重组。这个时候是最郁闷的了，但是郁闷怎么办，还是要找原 因，在此我给的建议是先做RT-PCR证明mRNA水平的情况，也就是说有没有转录。如果转录了，后续的操作也没有问题(本帖的1、2、3、4项)，那么只有重新设计实 验，比如换酵母株，有文章上说：用GS115表达不出蛋白，换KM71H后，大部分克隆能表达。 6、有个帖子说的很好，在此和大家分享一下。 1、 菌株：用GS115表达不出蛋白，换KM71H后，大部分克隆能表达。 2、温度：　在28度和室温下诱导表达，表达水平可能都不低。 3、pH：手册上用6.0，pH提高到6.8，不表达的蛋白可能就表达出来。BMMY的pH7.0-7.5比较合适。国内外做的最好的rHSA，最适pH大概5-6左右。pH3的时 候yeast和peptone好像会沉淀的，可以用磷酸和磷酸二氢钾调，具体比例自己去试试。 4、偏爱密码子： codon bias一般不是主要的问题，你要表达的蛋白特性才是主要问题，酵母对分子量大(30KD以上)，结构复杂(如一些蛋白酶)，二硫键含量多的 蛋白往往不能有效表达，尤其是分泌表达。密码子改造对一些较小的而且结构简单的蛋白表达量的提高可能有一些作用。比如一位战友用Pichia酵母表达一个单链 抗体，29KD，含有2对二硫键，表达量约几毫克每升，选用酵母偏好密码子全基因合成后，表达量没有什么提高。 5、表达时间与空质粒转化对照：诱导时间长了以后，是会有很多蛋白分泌出来的，时间越长杂蛋白就越多，且分子量都比较大。最好做一个空质粒转化的对照， 这样就会比较肯定到底是不是自身的蛋白分泌的结果。 6、污染：每个样品从G418板上挑10个左右单克隆于2ml BMGY摇菌(30ml玻璃管，比LB管大一点)，纱布一般用8层，一天左右看着比较浑离心，留样1ml，余 1ml换2ml BMMY诱导表达，3,4层纱布足够了。 污染一般都是跟瓶口覆盖有关的原因造成的，只盖纱布肯定会污染。加盖报纸后，就再没遇到过污染。如果只用6层纱布，污染的可能当然很大，100ml三角瓶， 装量10ml培养液，用橡筋把8层纱布和2层报纸拴紧封口，空气浴摇床。 7、不表达：蛋白有没有表达就要看你的运气了，一般重复2-3次实验都没有表达菌株，这个蛋白就放弃表达了。 8、表达量： 30KD,10mg/L表达量已经很高，最直接的方法是发酵，一般提高5-10倍。大肠杆菌一样出现大团的超表达蛋白。 9、糖基化：酵母分泌表达的N糖基化是可以预测的，有如下序列：N X S/T就是潜在的糖基化位点，X为任意氨基酸，1个糖基化位点会加上1-3KD左右的糖基。另外可 能还有O糖基化话，但是无法预测其位点，不过很少听说表达蛋白有O糖基化的。如果胞内表达，不存在糖基化的问题。 10、表型与表达：重组SalI和BglII酶切产生单交换和双交换，结果就是产生Mut+和Muts表型的菌株;前者在甲醇诱导表达时生长快，消耗的甲醇多，后者生长慢，消耗 的甲醇少，所以诱导表达时Muts表型要求更高的菌体浓度。一般用Mut+表型的较多，但是对某些蛋白Muts菌株可能表达的更好，只有试试才知道你的蛋白用那种菌 株表达较好。 11、培养基 YPD：最基本的培养用;BMGY：诱导表达前培养用;BMMY：诱导表达用;MD：电转化后筛选his+用。 YEPD是不能代替BMGY的，因为有葡萄糖，这样残留的葡萄糖会影响下一步的诱导表达。不过有一种方法是可行的，就是用YPG培养基代替，只是把YEPD中的葡萄糖 用3%的甘油代替，也可以降低成本。摇瓶毕竟不能和发酵罐比，甘油残余会抑制甲醇利用。 BMGY、BMMY灭菌后才能加甲醇、磷酸钾、生物素。配制BMMY时也没必要用5%过滤除菌的甲醇，在灭菌后使用前加100%甲醇至你要的浓度。 YNB可以高压灭菌，没问题的，也可以0.22um过滤处理，天冬氨酸和苏氨酸要待培养基高压灭菌后加入;配YPD时可以加入YPD一起灭菌，但时间不能太长，温度不能 太高，一般121-125度12-15分钟足够了。若时间过长，温度过高，可能导致YPD焦化。glucose和含氮化合物在一起容易产生美拉德反应，这是配制培养基中的禁忌。 颜色很深的话，基本不能使用了。或者含有葡萄糖和/或YNB的培养基108度35min高压灭菌。 小量发酵其实可以把培养基成分中的YNB和生物素去除，培养基价格便宜，操作又方便，可以直接灭菌，效果也很好(效果不比含YNB的差)。 如果是用自己配置的培养基，如玉米浸提液、麦芽浸提液、麦麸浸提液等等，可以不用换液，采取添料来维持酵母对培养基的营养需要。 用无机盐进行大规模发酵，更省钱。更多有关蛋白表达纯化的相关资料，请点击：资料专区

乙醛是酵母菌酒精发酵的一种副产物，酒中的乙醛大多数由乙醇氧化而来。但在葡萄酒中，乙醛的乙醛是酵母菌酒精发酵的一种副产物，酒中的乙醛大多数由乙醇氧化而来。但在葡萄酒中，乙醛的来源通常认为还与乙酸菌合成或乙醇和一些酚类化合物的一系列氧化反应有关。来源通常认为还与乙酸菌合成或乙醇和一些酚类化合物的一系列氧化反应有关。[img]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2023/08/202308280107097861_5115_1642069_3.png[/img]

试剂1M LiCl 50% PEG3350 (氯化锂转化法只能PEG3350,不能用PEG8000,PEG3350在北京莱博生物有售,80元/100克)2mg/ml salmon sperm DNA / TE（10mM Tris-Cl, pH8.0, 1.0mM EDTA）-20℃保存注：醋酸锂对毕氏酵母无效,对酿酒酵母有效，仅氯化锂有效；PEG3350可屏蔽高浓度LiCl的毒害作用。感受态毕氏酵母的制备1. 接种Pachia pastoris到50ml YPD培养基中，30℃摇菌过夜（约24～28h）培养到OD值为0.8～1.0（约108 Cells/ml）；培养基里有流沙样的菌体在流动2. 收获细胞，用25ml无菌水洗涤一次，室温下1500g离心10min；3. 重悬细胞于1ml 100mM LiCl溶液中，将悬液转入1.5ml离心管；4. 离心机最大速度离心15秒沉淀菌体，重悬菌体于400ul 100mM LiCl溶液中；5. 按50ul/管分装，立即进行转化；注：不要将感受态酵母菌冰浴；

毕赤酵母表达操作手册（精译版）[~150514~][~150513~]

酵母菌在中国的研究与开发 从2000年开始，在国家葡萄产业从2000年开始，在国家葡萄产业技术体系、国家自然基金等项目的支持下，刘延琳教授团队二十多来坚持不懈进行本土酵母资源的收集、鉴定、挖掘、优选，建立了保藏2万余份本土葡萄酒酵母的种质资源库，开发了典型特征突出、综合性状优良、功能细分的系列本土酵母菌种30株。经过研究测试，CEC01和CECA这2株中国本土优良葡萄酒酵母菌种具有耐受力强、发酵力强、香气表达力强等特点，率先于2013-2014年进入产业化应用，现已实现对进口葡萄酒酵母30%的国产化替代。经过规模化产业应用，这2个菌种生产的葡萄酒活性干酵母已批量出口至欧洲传统葡萄酒主产国，提升了中国葡萄酒产业的国际竞争力和美誉度。技术体系、国家自然基金等项目的支持下，刘延琳教授团队二十多来坚持不懈进行本土酵母资源的收集、鉴定、挖掘、优选，建立了保藏2万余份本土葡萄酒酵母的种质资源库，开发了典型特征突出、综合性状优良、功能细分的系列本土酵母菌种30株。经过研究测试，CEC01和CECA这2株中国本土优良葡萄酒酵母菌种具有耐受力强、发酵力强、香气表达力强等特点，率先于2013-2014年进入产业化应用，现已实现对进口葡萄酒酵母30%的国产化替代。经过规模化产业应用，这2个菌种生产的葡萄酒活性干酵母已批量出口至欧洲传统葡萄酒主产国，提升了中国葡萄酒产业的国际竞争力和美誉度。

?酵母的营养需求酒精发酵过程中，可吸收氮是酵母必不可少的营养物质，?即铵盐（NH4?+?）和氨基酸（有机氮）。它们天然存在于葡萄果汁中且含量随时都在变化。往往，天然的氮源并不能满足酵母的发酵需求。

[color=initial]一、菌种选育[/color] [list=1][*] 传统选育方法 [list][*]从自然界中筛选优良菌株：可以从不同的啤酒生产环境、土壤、水果等来源中采集酵母样本，通过分离、纯化和筛选，找到具有优良发酵性能和风味特征的酵母菌株。例如，从传统的啤酒酿造地区采集土壤样本，从中分离出可能适合啤酒发酵的酵母菌株。[*]诱变育种：利用物理（如紫外线、X 射线等）或化学（如亚硝基胍、硫酸二乙酯等）诱变剂对现有酵母菌株进行处理，使其发生基因突变，然后筛选出具有优良性状的突变株。例如，用紫外线照射酵母菌株，使其发生基因突变，然后通过发酵实验筛选出发酵速度快、产酒精能力强的突变株。[/list][*] 现代生物技术选育方法 [list][*]基因工程技术：通过基因克隆、表达和调控等手段，对酵母菌株进行改良。例如，可以将具有优良发酵性能的基因导入到酵母菌株中，使其获得更好的发酵能力和风味特征。或者通过基因编辑技术，对酵母菌株的特定基因进行修饰，以改善其性能。[*]高通量筛选技术：利用自动化设备和先进的检测技术，对大量的酵母菌株进行快速筛选。例如，使用微流控芯片技术，可以同时对数千个酵母菌株进行发酵实验和分析，大大提高了筛选效率。[/list][/list] [color=initial]二、优化发酵工艺[/color] [list=1][*] 控制发酵条件 [list][*]温度控制：根据不同的酵母菌株和啤酒类型，确定最佳的发酵温度。一般来说，低温发酵可以产生更多的风味物质，而高温发酵则可以加快发酵速度。例如，对于淡色啤酒，可以采用较低的发酵温度（8-12℃），以获得清爽的口感和丰富的风味；而对于深色啤酒，可以采用较高的发酵温度（15-20℃），以促进麦芽的焦香和酵母的代谢。[*]压力控制：适当的压力可以促进酵母的发酵活动，提高啤酒的质量。例如，在发酵过程中，可以通过控制发酵罐的压力，使酵母在一定的压力下进行发酵，从而提高发酵效率和啤酒的风味。[*]pH 值控制：保持适宜的 pH 值对于酵母的生长和发酵至关重要。一般来说，啤酒发酵的 pH 值在 4.0-5.5 之间。可以通过调整麦汁的 pH 值、添加缓冲剂等方法，控制发酵过程中的 pH 值。[/list][*] 优化麦汁成分 [list][*]调整麦汁浓度：根据不同的啤酒类型和酵母菌株，确定最佳的麦汁浓度。一般来说，高浓度的麦汁可以产生更多的酒精和风味物质，但也会增加酵母的代谢负担。例如，对于高浓度啤酒，可以采用较高的麦汁浓度（12-16°P），以获得浓郁的口感和香气；而对于低浓度啤酒，可以采用较低的麦汁浓度（8-10°P），以获得清爽的口感。[*]优化麦汁营养成分：确保麦汁中含有足够的碳源、氮源、维生素和矿物质等营养物质，以满足酵母的生长和发酵需求。例如，可以添加适量的麦芽提取物、酵母营养盐等，提高麦汁的营养价值。同时，要避免麦汁中含有过多的不良成分，如脂肪酸、醛类、酮类等，这些成分会影响酵母的代谢，导致酵母产生异味。[/list][*] 合理的酵母接种量和接种时间 [list][*]确定最佳的酵母接种量：酵母接种量过大或过小都会影响发酵效果和啤酒质量。一般来说，酵母接种量在 0.5-1.5×10?个细胞 / 毫升麦汁之间。可以根据酵母菌株的特性、麦汁浓度、发酵温度等因素，确定最佳的酵母接种量。例如，对于发酵速度快的酵母菌株，可以适当减少接种量；而对于发酵速度慢的酵母菌株，则可以适当增加接种量。[*]选择合适的接种时间：在麦汁冷却至适宜的接种温度后，及时接种酵母。过早或过晚接种酵母都会影响发酵效果。一般来说，在麦汁冷却至 8-12℃后，尽快接种酵母，以保证酵母的生长和发酵活动顺利进行。[/list][/list] [color=initial]三、酵母管理[/color] [list=1][*] 酵母的扩培和储存 [list][*]酵母扩培：采用科学的酵母扩培方法，确保酵母的数量和质量。一般来说，酵母扩培需要经过多个阶段，从原始菌种开始，逐步扩大培养，直到达到所需的酵母数量。在扩培过程中，要严格控制温度、pH 值、营养物质等条件，保证酵母的生长和繁殖。[*]酵母储存：正确储存酵母可以延长其使用寿命和保持其质量。酵母储存的条件包括低温、干燥、无氧等。一般来说，酵母可以储存在冰箱或冷库中，温度控制在 0-4℃之间。同时，要避免酵母与空气接触，以免酵母氧化和变质。在储存过程中，要定期检查酵母的质量，如有必要，可以进行活化和再培养。[/list][*] 酵母的回收和再利用 [list][*]酵母回收：在啤酒发酵结束后，及时回收酵母。可以采用离心、过滤等方法，将酵母从啤酒中分离出来。回收的酵母要经过清洗、消毒等处理，去除杂质和残留的啤酒成分。[*]酵母再利用：经过处理后的酵母可以再次用于啤酒发酵。但要注意控制酵母的使用次数，一般来说，酵母的使用次数不宜超过 5-7 次。随着使用次数的增加，酵母的活性和发酵性能会逐渐下降，需要及时更换新的酵母菌株。[/list][*] 酵母的检测和监控 [list][*]定期检测酵母的质量：包括酵母的活性、数量、纯度、发酵性能等指标。可以采用显微镜观察、平板计数、发酵实验等方法，对酵母进行检测。例如，通过显微镜观察酵母细胞的形态和大小，判断酵母的活性和健康状况；通过平板计数法，确定酵母的数量和纯度；通过发酵实验，检测酵母的发酵性能和产酒精能力。[*]监控发酵过程中的酵母状态：在啤酒发酵过程中，要密切关注酵母的生长和代谢情况。可以通过检测发酵液的温度、pH 值、糖度、酒精含量等指标，了解酵母的发酵活动。同时，要注意观察发酵液的外观、气味等变化，如有异常情况，要及时采取措施进行处理。[/list][/list] 通过以上方法，可以有效地提高啤酒酵母的质量，从而生产出品质优良的啤酒

啤酒酵母产生异味的原因主要有以下几个方面： [color=initial]一、酵母代谢产物[/color] [list=1][*] 高级醇 [list][*]形成原因：高级醇是酵母在发酵过程中代谢产生的副产物。当酵母在发酵过程中，尤其是在主发酵阶段，会进行糖代谢和氨基酸代谢，其中一些氨基酸会通过转氨作用和脱羧作用生成高级醇。此外，发酵温度过高、酵母接种量过大、发酵时间过长等因素也会增加高级醇的生成量。[*]异味表现：高级醇具有较高的沸点和较低的挥发性，在啤酒中含量过高时会给啤酒带来刺鼻的酒精味和杂醇油味，使啤酒口感粗糙，饮用后容易上头。[/list][*] 酯类 [list][*]形成原因：酯类是酵母在发酵过程中通过脂肪酸代谢和醇类代谢产生的。酵母在发酵过程中会合成脂肪酸，这些脂肪酸可以与醇类反应生成酯类。发酵温度、酵母菌株、麦汁成分等因素都会影响酯类的生成量。[*]异味表现：酯类具有较低的沸点和较高的挥发性，在啤酒中含量过高时会给啤酒带来水果味、花香或溶剂味。虽然适量的酯类可以为啤酒增添香气，但过多的酯类会使啤酒的风味失衡，产生异味。[/list][*] 双乙酰 [list][*]形成原因：双乙酰是酵母在发酵过程中由 α- 乙酰乳酸氧化脱羧生成的。在啤酒发酵的前期，酵母会产生 α- 乙酰乳酸，然后在酵母细胞内或发酵液中被氧化脱羧生成双乙酰。当发酵后期酵母的活性降低时，双乙酰的还原速度会变慢，导致双乙酰在啤酒中的含量升高。[*]异味表现：双乙酰具有强烈的馊饭味，在啤酒中含量过高时会使啤酒产生不愉快的异味，严重影响啤酒的口感和品质。[/list][/list] [color=initial]二、酵母自溶[/color] [list=1][*] 原因 [list][*]当酵母在发酵后期或储存过程中受到不良环境因素的影响时，如温度过高、压力过大、营养缺乏、pH 值变化等，酵母细胞会失去完整性，发生自溶现象。酵母自溶后，细胞内的物质会释放到啤酒中，包括蛋白质、核酸、多糖等。[*]例如，在发酵后期，如果温度控制不当，酵母的代谢活动会加快，导致酵母细胞衰老和自溶。此外，如果啤酒在储存过程中受到震动或温度变化的影响，也会加速酵母的自溶。[/list][*] 异味表现 [list][*]酵母自溶后释放的蛋白质和核酸会在啤酒中分解成氨基酸和核苷酸等物质，这些物质会使啤酒的口感变得粗糙，产生浑浊和异味。同时，自溶的酵母还会释放出一些脂肪酸和醛类物质，进一步加重啤酒的异味。[/list][/list] [color=initial]三、酵母污染[/color] [list=1][*] 原因 [list][*]在啤酒酿造过程中，如果卫生条件不佳、设备消毒不彻底、酵母储存不当等，就会导致酵母受到杂菌的污染。常见的污染酵母的杂菌有乳酸菌、醋酸菌、野生酵母等。[*]例如，在发酵罐或管道中残留的麦汁或啤酒如果没有及时清洗干净，就会滋生杂菌，然后在下次发酵时污染酵母。此外，如果酵母在储存过程中没有密封好，或者与空气接触时间过长，也会容易受到野生酵母的污染。[/list][*] 异味表现 [list][*]被污染的酵母会产生不同于正常酵母的代谢产物，从而给啤酒带来异味。例如，乳酸菌污染会使啤酒产生酸味；醋酸菌污染会使啤酒产生醋酸味；野生酵母污染会使啤酒产生不良的风味和香气，甚至可能导致啤酒变质。[/list][/list] [color=initial]四、麦汁成分[/color] [list=1][*] 不良成分 [list][*]如果麦汁中含有过多的不良成分，如脂肪酸、醛类、酮类等，这些成分会影响酵母的代谢，导致酵母产生异味。此外，麦汁中的重金属离子、农药残留、抗生素等物质也会对酵母的生长和代谢产生不良影响，从而影响啤酒的风味。[*]例如，如果麦汁中的脂肪酸含量过高，酵母在发酵过程中会将这些脂肪酸转化为不良的风味物质，使啤酒产生异味。此外，如果麦汁中含有抗生素，会抑制酵母的生长和代谢，导致发酵不完全，产生异味。[/list][*] 营养不平衡 [list][*]如果麦汁中的营养成分不平衡，如缺乏必要的维生素、矿物质、氨基酸等，也会影响酵母的代谢，导致酵母产生异味。例如，如果麦汁中缺乏锌离子，会影响酵母的生长和代谢，导致酵母产生不良的风味物质。[/list][/list] 综上所述，啤酒酵母产生异味的原因是多方面的，需要在啤酒酿造过程中严格控制各个环节，以确保酵母的正常生长和代谢，从而生产出品质优良的啤酒

毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒说明书，是个很不错的资料，对于做蛋白表达的版友来说很有用的。包括多酵母及表达，背景知识等的综述，实验技术路线，方案，详细的培养基及培养条件，注意事项。以及表达分析。[img]http://www.instrument.com.cn/bbs/images/affix.gif[/img][url=http://www.instrument.com.cn/bbs/download.asp?ID=158198]毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒说明书[/url]

面包制作中添加了酵母，出厂检验还是以7099的微生物标准执行或不执行，酵母属不属于7099中的未熟制的发酵配料，要是按7099执行，出厂检验菌落总数不合格，大概率就是酵母在熟制过程中未杀死了是不是

【中文名称】饲料酵母粉【英文名称】feed yeast powder【性状】 有浓香气味。【用途】 是一种蛋白质含量高，氨基酸齐全，且含有B族维生素、微量元素及各种酶，是一种营养价值高的单细胞蛋白。能促进禽畜的新陈代谢，可增强禽畜的抗病能力，提高禽畜的生长速度、繁殖能力、肉质和毛皮质量，特别适宜以气味觅食得鱼虾喂养。【制备或来源】 用酒糟液发酵而成。其工艺路线有三种：（1）酒糟经冷却、净化、增殖、浓缩、质壁分离后，再干燥、粉碎得产品；（2）将酒糟接种发酵后，经干燥，去杂质粉碎得产品；（3）将酒糟沉渣加营养盐液，以酵母为微生物源，发酵后，经分离、干燥、粉碎得产品。【生产单位】 杭州长征化工厂；河南南阳酒精总厂酵母厂；

[color=initial]一、发酵问题[/color] [list=1][*] 发酵停滞 [list][*]原因：可能是由于酵母营养不良、温度不适宜、麦汁成分不合适（如含有过多的有害物质或缺乏必要的营养物质）、酵母受到污染或老化等原因引起。[*]影响：导致发酵不完全，啤酒的酒精含量和二氧化碳含量不足，口感平淡，可能还会有未发酵的糖分残留，使啤酒容易变质。[/list][*] 发酵过快或过慢 [list][*]过快：可能是由于酵母接种量过大、温度过高、麦汁营养丰富等原因。这会使发酵过程难以控制，产生过多的热量和泡沫，可能导致啤酒风味不佳，甚至可能出现酵母自溶现象。[*]过慢：可能是酵母活力不足、温度过低、麦汁营养缺乏等原因。这会延长生产周期，增加成本，并且可能使啤酒受到杂菌污染的风险增加。[/list][/list] [color=initial]二、风味问题[/color] [list=1][*] 异味产生 [list][*]原因：酵母在发酵过程中可能会产生一些不良的风味物质，如高级醇、酯类、双乙酰等。高级醇含量过高会使啤酒有刺鼻的酒精味和杂醇油味；酯类含量过高会使啤酒有水果味或溶剂味；双乙酰含量过高会使啤酒有馊饭味。[*]影响：这些异味会严重影响啤酒的口感和品质，降低消费者的接受度。[/list][*] 风味不稳定 [list][*]原因：不同批次的啤酒酵母可能会有差异，或者在发酵过程中受到环境因素的影响，导致啤酒的风味不一致。此外，酵母的代谢产物也可能会随着时间的推移而发生变化，使啤酒的风味逐渐变差。[*]影响：使消费者对啤酒品牌的信任度降低，影响啤酒的市场竞争力。[/list][/list] [color=initial]三、酵母健康问题[/color] [list=1][*] 酵母自溶 [list][*]原因：通常是由于发酵后期温度过高、压力过大、营养缺乏、酵母老化等原因引起。酵母细胞破裂后，会释放出一些物质，如蛋白质、核酸、多糖等，这些物质会使啤酒的口感变得粗糙，产生浑浊和异味。[*]影响：严重影响啤酒的质量和稳定性，甚至可能导致啤酒变质无法饮用。[/list][*] 酵母污染 [list][*]原因：可能是由于生产过程中的卫生条件不佳、设备消毒不彻底、酵母储存不当等原因引起。污染的酵母可能会带来杂菌，如乳酸菌、醋酸菌等，这些杂菌会产生乳酸、醋酸等酸性物质，使啤酒变酸；或者产生其他不良的风味物质，影响啤酒的品质。[*]影响：降低啤酒的质量和安全性，可能导致啤酒不符合卫生标准，无法上市销售。[/list][/list] [color=initial]四、其他问题[/color] [list=1][*] 酵母沉降问题 [list][*]原因：如果酵母沉降速度过快，可能是由于酵母品种特性、麦汁成分、发酵条件等因素引起。酵母沉降过快会使啤酒在发酵后期失去酵母的活性，影响发酵的进行；同时，也会使啤酒在灌装后缺乏酵母的保鲜作用，容易氧化变质。[*]影响：影响啤酒的发酵效果和保质期。[/list][*] 酵母活性问题 [list][*]原因：酵母在储存和使用过程中可能会失去活性，如储存温度过高、时间过长、受到氧化等。此外，酵母在反复使用过程中也可能会出现活性下降的情况。[*]影响：导致发酵效果不佳，影响啤酒的产量和质量[/list][/list]

最近身边有朋友在学做馒头，关注了些有关馒头的问题。网上有人说，其实老面发的馒头不如酵母发的好，因为老面里面是一些乱七八糟的杂菌，可能对肠胃不好，而酵母就是酵母菌。第二个问题是，用老面做馒头，肯定要放碱，会不会不如不放碱的酵母馒头好呢?还有很多朋友问：自发粉到底是什么东西?它做的馒头和传统的馒头一样吗?和酵母发酵做成的馒头有什么区别?吃馒头和面包哪个更有营养?有这样类似疑问的朋友实在不少，咱们还是从头一个问题一个问题地弄清楚。

生产过程中，酵母浓度的控制是产品质量的一个关键因素，为了控制酵母浓度，最好的方式就是在线快速测定。目前国内外有哪些公司生产或代理酵母在线活性检测仪，就是那种生产发酵过程中能在线快速准确测定酵母活细胞数的仪器。在网上查了一下美国Aber公司有酵母监测仪，法国FOGALE公司有活细胞浓度在线检测议，请问各位有用过吗？哪家好用一些呢？

粗渣自然发酵酿造果酒 2022年10月9日 于江深 这里介绍粗渣发酵步聚：1、破碎果实去梗，粗渣入罐，装容量的70%左右，最好加入酵母，一百公斤粗渣加酵母三十克。（酵母用42℃的十倍酵母量的水，浸泡50~60分钟加入破碎粗渣中）。2、保持温度在15℃一25℃粗渣发酵最佳。3、气泡上升，粗渣上浮。每天搅拌两次。4、 主发酵放阳面15一25℃度下避光。每天搅拌两次。5、搅拌后沙布盖上发酵。6、发酵约7一9天皮渣不再上浮，液面平静，前发酵结束。7、可用滤布过滤去粗渣。8、装另一个罐进行后发酵，温度20度左右，共计一个月，倒罐去掉底子，上清液就是发好的水果原酒。9、发酵原酒酸涩、有涩味、不甜。10、放15度左右地方陈酿。11、一段时间，可倒果实原酒至酒液清澈。12、原酒放置室外，零下4℃~零下5℃，七~十天最粗渣自然发酵酿造果酒 2022年10月9日 于江深 这里介绍粗渣发酵步聚：1、破碎果实去梗，粗渣入罐，装容量的70%左右，最好加入酵母，一百公斤粗渣加酵母三十克。（酵母用42℃的十倍酵母量的水，浸泡50~60分钟加入破碎粗渣中）。2、保持温度在15℃一25℃粗渣发酵最佳。3、气泡上升，粗渣上浮。每天搅拌两次。4、 主发酵放阳面15一25℃度下避光。每天搅拌两次。5、搅拌后沙布盖上发酵。6、发酵约7一9天皮渣不再上浮，液面平静，前发酵结束。7、可用滤布过滤去粗渣。8、装另一个罐进行后发酵，温度20度左右，共计一个月，倒罐去掉底子，上清液就是发好的水果原酒。9、发酵原酒酸涩、有涩味、不甜。10、放15度左右地方陈酿。11、一段时间，可倒果实原酒至酒液清澈。12、原酒放置室外，零下4℃~零下5℃，七~十天最佳，冰冻最好。13、一般粗渣原酒可适量加入白砂糖、冰糖，可口饮用。粗渣原酒密封，喝时加糖化开。饮用调糖。味道最好。佳，冰冻最好。13、一般粗渣原酒可适量加入白砂糖、冰糖，可口饮用。粗渣原酒密封，喝时加糖化开。饮用调糖。味道最好。

下列哪类物质是酵母菌细胞壁主要的成分()。 A、甘露聚糖 B、脂质 C、无机盐 D、蛋白质

葡萄酒在瓶装时，必须认真考虑葡萄酒是否已经达到了除菌、灭菌的目的。为了准确达到这个目的，就要对瓶装的葡萄酒进行快速而可靠的检验。这里列举了3个检查方法，仅供同行朋友们在实际生产中，根据企业的实际条件进行参考。　　一、格森海姆(Geisenheimer)检定法　　将被检验的葡萄酒在无菌的条件下，接入与其等量的葡萄汁，便为酵母提供了良好的繁殖条件，酵母开始快速繁殖和发酵。酵母繁殖的速度和发酵的强度，是衡量被检样品染菌的程度。　　具体操作如下：　　取标准试管3支，分别注入10mL葡萄汁，并加棉塞封口，置于高压灭菌锅中灭菌；将吸管用纸包好，并在160℃下灭菌。然后小心的拔除葡萄酒瓶的软木塞，立即用火焰将瓶口附着的微生物灭除，再用无菌吸管从瓶底吸出10mL被检葡萄酒，移入已灭菌葡萄汁的试管内，每份样品做平行样3支。　　若被检的样品活酵母较多，在3—5天内即可检定其发酵度；若酵母较少，发酵需要两倍于此的时间，由此可断定生产线是否处于受控状态，断定瓶装酒出厂后是否会发生浑浊等质量事故。　　这个方法十分简便，不需要特别的仪器，对小型葡萄酒厂十分适用，这是其优点。缺点是只能检定出葡萄酒中是否存在酵母菌，无法进行定量分析。　　二、薄膜过滤法　　借助于不同孔径的过滤片(孔径一般为2微米以下)，在无菌条件下过滤被检葡萄酒，分离出酵母及其它微生物，然后对滤片上的微生物进行生长培养，计算出现的菌落数，并进行其它各项必要的检查。　　操作方法如下：　　将所有参与过滤的仪器、器皿进行彻底消毒，在无菌的条件下进行过滤等操作。在每次分析之前，将过滤器及过滤片置于高压锅内灭菌，用经火焰烧过的镊子取已灭菌的过滤片放入过滤器中。　　被检瓶酒在开启前，必须仔细用75%酒精擦拭瓶口，小心地拔除软木塞，勿使开瓶刀穿通软木塞。　　开始时先将软木塞拔出四分之三，然后用手轻轻取下软木塞，瓶口在倒酒前先用火焰烧一下，再将葡萄酒一点一点地倒入过滤漏斗中。　　过滤结束后，用火焰烧过的镊子在漏斗内取出滤片，置于培养皿中，并摆放平整，倒入适量的酵母培养基(约3mL)，然后标明日期和试样编号，置于生物培养箱内，在25℃下培养3—5天。为避免凝结水影响菌落生长，将培养皿反扣于培养箱内。若过滤片上的酵母菌是活的，酵母即进行繁殖，在培养基上会出现菌落。　　如果未发现菌落生长，说明被检的葡萄酒是稳定的，不会出现酵母菌引起的浑浊；如果每瓶样有5个以上的菌落出现，说明葡萄酒的除菌或杀菌操作不彻底，葡萄酒有不稳定的因素，应该严格检查生产过程中的每个环节，直到查出原因为止。　　这一方法能对瓶装酒内各种微生物进行定量检定，但需要选择适当孔径的滤片和培养基，并由掌握基本微生物学的熟练人员操作。　　三、快速检定法　　薄膜过滤法可以用显微镜对滤片做仔细检查，迅速检出活酵母；快速检定法则可将死的和活的微生物区别开来，但要求瓶装酒内必须不含其他悬浮物。　　在适宜的温度下，于8—14小时内，具有繁殖能力的菌体生长成为微小的菌落，用显微镜观察，可将死的、没有繁殖能力的菌落区别开来。活菌体在培养时会形成小的菌落，死菌体只有单个的存在。

【中文名称】脱核酵母【英文名称】yeast;as a by-product of RNA production【用途】 可代替鱼粉饲养水貂、鳗鱼、对虾等。【制备或来源】 将蜜糖经澄清、稀释后，成为清糖水，再加入营养盐类，经发酵，离心分离，弃去轻相，重相溶解，再离心分离，轻相用以制取核糖核酸，重相经烘干、粉碎即得成品。【其他】 含蛋白质≥50%，含赖氨酸核蛋氨酸分别≥和≥2.4%，营养价值高。【生产单位】 福建莆田糖厂

CR1酵母，酿造高酒精度葡萄酒，低温发酵启动，在不掩盖水果香气的同时，可提供高酒精度！[img]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2022/03/202203141516532630_7047_1642069_3.png[/img]

生物技术研究者追求的两个主要目标，一是新型生物产品的开发，另一就是为传统的或新生生物产品，寻求更经济的生产方式。近十年来，利用遗传工程技术来生产一些重要的生物药物，是生物技术领域中迅速发展的一个重要方向。在这一研究领域里，如何创造更经济、更有效的方法，来提高生产过程的经济性和产品的市场竞争力，已经成为生物技术领域的科学家们所关注的焦点问题。利用重组DNA技术生产重要的生物药物，在人类文明史上具有划时代的意义。由于生产成本和生产率的高低直接影响公司的生存，重组生物药物生产过程的优化已经成为一个重要问题。它包括以下六个方面∶(1)适宜宿主的选择；(2)重组蛋白积累位点(如可溶的胞内积累、胞内聚合积累、周质积累或胞外积累)的确定；(3)重组基因最大表达的分子策略；(4)细胞生长和生产环境的优化；(5)发酵条件的优化；后处理过程的优化。只有这六个方面都以实现高生产率为目标，整个生产过程的最优化才能实现。(一)细胞生长环境的优化策略要提高细胞密度和生产率，首先需要对微生物生长的物理和化学环境进行优化，包括生长培养基的组成，培养物理参数(pH、温度和搅拌)及产物诱导条件。优化这些参数的目的在于保证细胞生长处于最适的环境条件之下，避免营养物过量或不足、防止产物降解以及减少有毒产物的形成。1．培养基组成的优化培养基中通常含有碳(能)源、氮源，以及微营养物如维生素和微量元素，这些营养物的浓度与比例，对实现生产重组微生物的高密度发酵是很重要的。例如，过量的Fe2+和CaCO3与相对低浓度的磷酸盐可促进黄曲霉生产L-苹果酸；链霉菌在60～80 mmol/L CO32-存在下，其丝氨酸蛋白酶生产能力可提高10倍之多；在重组微生物达到高细胞密度后，限制磷酸盐浓度可使抗生素和异源白介素b的产率显著提高。此外还发现，限制精氨酸的浓度虽然会抑制细胞的生长，但比起精氨酸充足时细胞生长优良的情况，其重组a-淀粉酶的产量可提高2倍。培养基中复合氮源的种类对重组大肠杆菌的高密度发酵也非常重要。一般地，当流加培养基中含有酵母膏时，重组蛋白不稳定；而当流加培养基中含有蛋白胨时，大肠杆菌不能再利用其所产生的乙酸。将酵母膏和蛋白胨都加入流加培养基中，不但所生产的重组蛋白非常稳定，细胞还能再利用代谢合成的乙酸，这是一种非常有趣的代谢机制。恒化技术可用于优化精氨酸营养缺陷型大肠杆菌X90的生长培养基。使该菌株以0.4 h-1的比生长速率在含精氨酸的基本培养基上生长，待培养达到稳定状态后，在恒化器内分别加入氨基酸、维生素和微量元素来考察这些物质对菌体生长和精氨酸合成的影响。结果表明，由于氨基酸生物合成途径的末端产物抑制作用，加入某些氨基酸后，细胞生长反而受到抑制。加入NH4Cl后细胞量则出现了戏剧性的增长。而添加维生素对菌体生长基本上没有任何影响。通过计算生物量对每种基质的产率，最终可以确定高密度发酵培养基的组成，在此优化培养基上，大肠杆菌X90细胞密度可达到92 g/L，同时形成56 mg/L的胞外重组蛋白酶。2．特殊营养物的添加在某些情况下，向培养基中添加一些营养物质能提高生产率。这些营养物的作用有可能是作为产物的前体，也有可能是阻止产物的降解，例如，在培养重组大肠杆菌生产氯霉素乙酰转移酶(一种由许多芳香族氨基酸组成的蛋白)时添加苯丙氨酸，可将酶的比活力提高大约2倍；在培养重组枯草芽孢杆菌生产b-内酰胺酶的培养基中添加60 g/L的葡萄糖和100 mmol/L的磷酸钾能使重组蛋白的稳定性显著提高。其原因可能是由于宿主细胞产生的多种胞外蛋白酶的活性被抑制，从而防止了重组蛋白的降解。在生长培养基中添加特殊物质有时还能以一种未知的机制提高生产率。例如，在摇瓶培养Micromonospora cbersina时添加碘化钠可使dynemicin A的产量提高35倍，但在小型反应器中却无法重复这一结果。3．限制代谢副产物的积累培养条件的控制对代谢副产物的形成影响甚大。在分批或流加培养中，某些营养物的浓度过高均会导致Crabtree效应的产生。在这种效应下，酿酒酵母会产生乙醇，大肠杆菌则会产生过量乙酸，一旦生成乙酸，细胞生长及重组蛋白的生产均会受到抑制。大肠杆菌形成乙酸的速度依赖于细胞的生长速度和培养基的组成。业已确证，如果在培养基中添加复合营养物(如大豆水解物)，则会增加乙酸的积累量。针对如何减轻由于乙酸积累而产生的负面影响，众多研究者进行了大量工作，如利用循环发酵技术来限制乙酸在重组大肠杆菌高密度培养中的积累。近来也有研究表明，添加某些氨基酸能减轻乙酸的抑制作用。如在培养基中添加10 mg/L的甘氨酸能显著促进大肠杆菌合成重组a-淀粉酶和b-内酰胺酶，并能刺激酶从周质向培养基中释放，但此时仍有乙酸伴随生成。(二)培养模式由于许多营养物在高浓度下对细胞有抑制作用，而为了达到高细胞密度，又必须供给大量的营养物质，因此，浓缩营养物必须以与其消耗速率成比例的速度加入反应器中。为此产生了多种形式的补料策略，它可以简单到线性补料，也可以复杂到利用数学模型计算得出的策略来控制补料速率。具体来说，培养模式的选择主要依赖于以下三个因素∶(1)所培养细胞的具体代谢行为；(2)利用抑制性底物合成目的产物的潜力；(3)诱导条件以及测量细胞培养各项参数的能力。1．大肠杆菌流加发酵策略大肠杆菌是迄今为止遗传背景最清楚的菌株，广泛用于基因工程的研究中。大肠杆菌高密度培养时最关键的问题是如何尽量减少乙酸的产生，因为高浓度葡萄糖或高比生长速率带来的高浓度乙酸会严重抑制细胞生长和重组蛋白的生产。研究发现，即使葡萄糖浓度只有0.25～0.5 g/L，大肠杆菌仍会产生乙酸。因此，高细胞密度发酵所采用的流加策略必须按照一定的算法制定，以保持反应器中底物浓度处于较低的水平。营养物最好以它们的消耗速率加入反应器中，这样不仅可以防止底物积累到毒性水平，也不会使细胞处于饥饿状态。近年来已经报道了多种控制大肠杆菌流加培养中流加速率的方法，其中大多数是将流加速率与一种物理参数间接耦合(如溶氧、pH或CO2释放速率)。有学者将溶氧控制在一个预定值上以保证较低的生长速率，结果乙酸产生很少，最终细胞干重达到110 g/L，并发现较低的比生长速率还有利于重组蛋白的高表达。在另一个控制低比生长速率的高细胞密度培养中，研究者采用先指数流加葡萄糖、铵盐和无机盐，后采用广义线性流加的培养策略，有效地防止了乙酸的积累，重组大肠杆菌的细胞密度达到66 g/L，通过温度诱导可在胞内形成19.2 g/L的活性重组蛋白。如果将葡萄糖浓度控制在一个不致于产生毒性的足够低的水平上，也可以使细胞在不存在限制性基质的情况下迅速生长到高细胞密度。这种控制策略对仪器的要求较高。Kleman等采用在线葡萄糖分析仪，以微生物对葡萄糖的需求来决定葡萄糖和其它营养物的流加速率，这一算法能够在产物诱导阶段中根据细胞生长的变化自动调整流加速率。培养携带质粒的大肠杆菌 MV1190，其质粒中带有编码1,5-二磷酸核酮糖羧化酶的基因，最终细胞干重达到39 g/L，产生1.7 g/L可溶的活性蛋白。2．重组酵母的流加发酵酵母中广泛用于遗传工程研究的菌株是酿酒酵母。但采用酿酒酵母作为重组宿主也有以下缺点∶(1)重组蛋白生产的水平较低；(2)质粒不稳定；(3)生成乙醇。其中生成乙醇是研究者最不希望出现的，因为这会抑制重组蛋白的形成。近来研究表明，其它酵母，如巴斯德毕赤氏酵母也具有作为重组宿主的潜力。Clare等比较了重组巴斯德毕赤氏酵母和酿酒酵母在高细胞密度状态下表达和分泌鼠表皮生长因子的能力。培养每基因组含有19个拷贝数的巴斯德毕赤氏酵母，最终可获得447 mg/L胞内重组蛋白；而培养酿酒酵母所获得的最高水平仅6～7 mg/L。通过先指数流加，后采用基于CO2释放和RQ值的线性流加控制方式可使重组巴斯德毕赤氏酵母的细胞干重达到80～90 g/L，并分泌高水平的重组人血清蛋白。而培养酿酒酵母，细胞干重和重组蛋白的产量仅分别为25 g/L和20 mg/L。即使将酿酒酵母的生长速率维持在0.12～0.18 h-1，也将形成10～13 g/L的乙醇，因而导致产率降低。但酿酒酵母产乙醇也并不是不可控制的。Shimizu等采用一个复杂的流加系统，将酵母的生长速率控制在0.3 h-1，可使谷胱甘肽(GSH)的生产最大而乙醇的生成最小。3．流加培养的控制一个好的流加控制系统必须避免两种倾向∶一是流加过量，补料组分在反应器中积累从而对细胞生长和产物形成产生抑制；二是流加不足，这可能会导致细胞必需营养物的缺乏。计算机技术的迅猛发展，为流加培养的控制提供了更有效的手段。近年来，应用计算机技术来监测和控制发酵过程的研究屡见报道。由于现代计算机技术的帮助，人们能够采用多种生长参数和数学模型来控制流加培养中营养物的添加，从而使复杂的控制系统得以实现。在各种人工智能技术中，模糊推理(fuzzy reasoning)是应用最广的一种。模糊逻辑控制(fuzzy logic control)部分依赖于数学生长模型，也采用“语言定义的规则系统”(linguistically defined rules system)来帮助系统响应发酵过程的非线性和动态行为。Alfafara等在流加培养酿酒酵母生产谷胱甘肽的研究中，采用一个模糊逻辑控制系统来控制葡萄糖的流加速度，对系统进行优化后谷胱甘肽的比产生速率达到6.2 h-1。目前，在流加培养中应用模糊逻辑控制技术的最大问题在于如何减少底物和产物浓度振荡所需的调整次数。自适应模糊逻辑控制算法的发展可望对此有所

随着对多种重要生物的大规模基因组测序工作的完成，基因工程领域又迎来了一个新的时代---功能基因组时代。它的任务就是对基因组中包含的全部基因的功能加以认识。生物体系的运作与蛋白质之间的互相作用密不可分，例如：DNA合成、基因转录激活、蛋白质翻译、修饰和定位以及信息传导等重要的生物过程均涉及到蛋白质复合体的作用。能够发现和验证在生物体中相互作用的蛋白质与核酸、蛋白质与蛋白质是认识它们生物学功能的第一步。 　　酵母双杂交技术作为发现和研究在活细胞体内的蛋白质与蛋白质之间的相互作用的技术平台，在近几年来得到了广泛运用。酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行的，研究活细胞内蛋白质相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能够通过报告基因的表达产物敏感地检测得到，它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术。大量的研究文献表明，酵母双杂交技术既可以用来研究哺乳动物基因组编码的蛋白质之间的互作，也可以用来研究高等植物基因组编码的蛋白质之间的互作。因此，它在许多的研究领域中有着广泛的应用。本文就酵母双杂交的技术平台和应用加以介绍。　　酵母双杂交系统的建立是基于对真核生物调控转录起始过程的认识。细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。反式转录激活因子，例如酵母转录因子GAL4在结构上是组件式的（modular），往往由两个或两个以上结构上可以分开，功能上相互独立的结构域（domain）构成，其中有DNA结合功能域(DNA binding domain,DNA-BD)和转录激活结构域（activation domain，DNA-AD）。这两个结合域将它们分开时仍分别具有功能，但不能激活转录，只有当被分开的两者通过适当的途径在空间上较为接近时，才能重新呈现完整的GAL4转录因子活性，并可激活上游激活序列（upstream activating sequence, UAS）的下游启动子，使启动子下游基因得到转录。　　根据这个特性，将编码DNA-BD的基因与已知蛋白质Bait protein的基因构建在同一个表达载体上，在酵母中表达两者的融合蛋白BD-Bait protein。将编码AD的基因和cDNA文库的基因构建在AD-LIBRARY表达载体上。同时将上述两种载体转化改造后的酵母，这种改造后的酵母细胞的基因组中既不能产生GAL4，又不能合成LEU、TRP、HIS、ADE，因此，酵母在缺乏这些营养的培养基上无法正常生长。当上述两种载体所表达的融合蛋白能够相互作用时，功能重建的反式作用因子能够激活酵母基因组中的报告基因HIS、ADE、LACZ、MEL1，从而通过功能互补和显色反应筛选到阳性菌落。将阳性反应的酵母菌株中的AD-LIBRARY载体提取分离出来，从而对载体中插入的文库基因进行测序和分析工作。在酵母双杂交的基础上，又发展出了　　酵母单杂交、酵母三杂交和酵母的反向杂交技术。它们被分别用于核酸和文库蛋白之间的研究、三种不同蛋白之间的互作研究和两种蛋白相互作用的结构和位点。　　基于酵母双杂交技术平台的特点，它已经被应用在许多研究工作当中。 1、利用酵母双杂交发现新的蛋白质和蛋白质的新功能　　酵母双杂交技术已经成为发现新基因的主要途径。当我们将已知基因作为诱饵，在选定的cDNA文库中筛选与诱饵蛋白相互作用的蛋白，从筛选到的阳性酵母菌株中可以分离得到AD-LIBRARY载体，并从载体中进一步克隆得到随机插入的cDNA片段，并对该片段的编码序列在GENEBANK中进行比较，研究与已知基因在生物学功能上的联系。另外，也可作为研究已知基因的新功能或多个筛选到的已知基因之间功能相关的主要方法。例如：Engelender等人以神经末端蛋白alpha-synuclein 蛋白为诱饵蛋白，利用酵母双杂交CLONTECH MATCHMARKER SYSTEM 3为操作平台，从成人脑cDNA文库中发现了与alpha-synuclein相互作用的新蛋白Synphilin-1，并证明了Synphilin-1与alpha-synuclein 之间的相互作用与帕金森病的发病有密切相关。为了研究两个蛋白之间的相互作用的结合位点，找到影响或抑制两个蛋白相互作用的因素，Michael等人又利用酵母双杂交技术和基因修饰证明了alpha-synuclein的1-65个氨基酸残基和Synphilin-1的349-555个氨基酸残基之间是相互作用的位点。研究它们之间的相互作用位点有利于基因治疗药物的开发。　　2、利用酵母双杂交在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用　　利用酶联免疫（ELISA）、免疫共沉淀（CO-IP）技术都是利用抗原和抗体间的免疫反应，可以研究抗原和抗体之间的相互作用，但是，它们都是基于体外非细胞的环境中研究蛋白质与蛋白质的相互作用。而在细胞体内的抗原和抗体的聚积反应则可以通过酵母双杂交进行检测。例如：来源于矮牵牛的黄烷酮醇还原酶DFR与其抗体scFv的反应中，抗体的单链的三个可变区A4、G4、H3与抗原之间作用有强弱的差异。Geert等利用酵母双杂交技术，将DFR作为诱饵蛋白，编码抗体的三个可变区的基因分别被克隆在AD-LIBRARY载体上，将BD-BAIT载体和每种AD-LIBRARY载体分别转化改造后的酵母菌株中，并检测报告基因在克隆的菌落中的表达活性，从而在活细胞的水平上检测抗原和抗体的免疫反应。　　3、利用酵母双杂交筛选药物的作用位点以及药 物对蛋白质之间相互作用的影响　　酵母双杂交的报告基因能否表达在于诱饵蛋白与靶蛋白之间的相互作用。对于能够引发疾病反应的蛋白互作可以采取药物干扰的方法，阻止它们的相互作用以达到治疗疾病的目的。例如：Dengue病毒能引起黄热病、肝炎等疾病，研究发现它的病毒RNA复制与依赖于RNA的RNA聚合酶（NS5）与拓扑异构酶NS3，以及细胞核转运受体BETA-importin的相互作用有关。研究人员通过酵母双杂交技术找到了这些蛋白之间相互作用的氨基酸序列。如果能找到相应的基因药物阻断这些蛋白之间的相互作用，就可以阻止RNA病毒的复制，从而达到治疗这种疾病的目的。　　4、利用酵母双杂交建立基因组蛋白连锁图（Genome Protein Linkage Map）众多的蛋白质之间在许多重要的生命活动中都是彼此协调和控制的。基因组中的编码蛋白质的基因之间存在着功能上的联系。通过基因组的测序和序列分析发现了很多新的基因和EST序列，HUA等人利用酵母双杂交技术，将所有已知基因和EST序列为诱饵，在表达文库中筛选与诱饵相互作用的蛋白，从而找到基因之间的联系，建立基因组蛋白连锁图。对于认识一些重要的生命活动：如信号传导、代谢途径等有重要意义。

1．果汁前期处理：可选择低温浸渍，8-10℃，加入果胶酶CL，30-50ppm，快速水解分解果胶，作用时间不超过48小时。2．待发酵原汁回温到22℃左右，活化酵母F33或VL1都可（推荐VL1专用白兰地酵母），添加量200ppm，推荐使用发酵助剂SuperstartBlanc200ppm吨,同时跟酵母活化，20倍纯净水恒定38℃，酵母投入搅拌均匀，静置25分钟后接种，注意温差不要超过10摄氏度.3．酒精发酵启动后注意温度变化，如果设备允许，可以控制温度在26-28左右即可，注意前期每天循环通氧1-2次。4．若要发酵结束后酒体快速澄清，可在酒精发酵启动24小时后添加植物蛋白VEGEfine，150ppm，使酒体更加干净清爽、增加出酒率，快速下胶。5．酒精发酵启动48小时后开始第一次补充营养剂Thiazote，100ppm即可。6．酒精发酵中期，以目标11°为例，酒精度大概在7-8°左右再次添加营养剂150ppm左右。7．酒精发酵末期观察发酵速率，可根据实际情况适当添加营养剂。8．酒精发酵结束后，可以进行皂土下胶，酒体澄清度较好对于后期蒸馏的指标、香气、口感等大有帮助。9．蒸馏后原酒需要进行陈化、降度调整，终端产品要根据市场需要调配，我司提供专业白兰地天然香精、焦糖色、橡木制品、橡木桶等，针对不同终端市场，我们可以提供不同的成本方案。

引用氮氮的欢乐 的 谈工业发酵各阶段培养基的要求工业发酵中利用生产菌发酵得出最终产物是一个逐级放大的过程，各个不同的阶段对于营养成分的要求也各有特点，根据发酵不同阶段的要求，培养基可分为孢子培养基、种子培养基和发酵培养基三种。 孢子培养基孢子培养基是供菌种繁殖孢子的一种常用固体培养基，对这种培养基的要求是能使菌体迅速生长，产生较多优质的孢子，并要求这种培养基不易引起菌种发生变异。所以对孢子培养基的基本配制要求是：第一，营养不要太丰富（特别是有机氮源），否则不易产孢子。如灰色链霉在葡萄糖－硝酸盐－其它盐类的培养基上都能很好地生长和产孢子，但若加入0.5%酵母膏或酪蛋白后，就只长菌丝而不长孢子。第二，所用无机盐的浓度要适量，不然也会影响孢子量和孢子颜色。第三，要注意孢子培养基的pH和湿度。生产上常用的孢子培养基有：麸皮培养基、小米培养基、大米培养基、玉米碎屑培养基和用葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏和食盐等配制成的琼脂斜面培养基。大米和小米常用作霉菌孢子培养基，因为它们含氮量少，疏松、表面积大，所以是较好孢子培养基。大米培养基的水分需控制在21%－50%，而曲房空气湿度需控制在90%－100%。 种子培养基种子培养基是供孢子发芽、生长和大量繁殖菌丝体，并使菌体长得粗壮，成为活力强的“种子”。所以种子培养基的营养成分要求比较丰富和完全，氮源和维生素的含量也要高些，但总浓度以略稀薄为好，这样可达到较高的溶解氧，供大量菌体生长繁殖。种子培养基的成分要考虑在微生物代谢过程中能维持稳定的pH，其组成还要根据不同菌种的生理特征而定。一般种子培养基都用营养丰富而完全的天然有机氮源，因为有些氨基酸能刺激孢子发芽。但无机氮源容易利用，有利于菌体迅速生长，所以在种子培养基中常包括有机及无机氮源。最后一级的种子培养基的成分最好能较接近发酵培养基，这样可使种子进入发酵培养基后能迅速适应，快速生长。 发酵培养基发酵培养基是供菌种生长、繁殖和合成产物之用。它既要使种子接种后能迅速生长，达到一定的菌丝浓度，又要使长好的菌体能迅速合成需产物。因此，发酵培养基的组成除有菌体生长所必需的元素和化合物外，还要有产物所需的特定元素、前体和促进剂等。但若因生长和生物合成产物需要的总的碳源、氮源、磷源等的浓度太高，或生长和合成两阶段各需的最佳条件要求不同时，则可考虑培养基用分批补料来加以满足。 根据发酵生产各阶段菌体对营养的需求可以大概看出，孢子阶段培养基要求营养简单少量；种子阶段培养基要求丰富完全，特别是氮与维生素含量要高；发酵阶段培养基要求在足够维持适当生长之余与产物相关联，能提供部分前体、特定成分。安琪酵母公司生产的安琪酵母浸出物采用纯化培养的高蛋白面包酵母，经过自溶酶解、分离、真空浓缩、喷雾干燥等工序精制而成。有安全性好，适用面广；稳定性高，重复性好；营养全面，量化控制；澄清度高，利于提取；颜色浅，营养损失少等诸多优点。富含蛋白质、多肽、氨基酸、核苷酸、维生素、微量元素等营养成分，比例协调，同时采用生物酶解技术，使营养物质高效定向降解，可为菌体生长培养提供全面均衡的营养。除了作为优质的种子阶段培养基氮源外，在发酵阶段同样能为维持菌体茁壮稳定提供充足的营养，尤其是以初体产谢产物为终产物的发酵，安琪酵母浸出物所含的种类齐全的氨基酸，核苷酸，各种维生素与矿质元素更是作为前体、促进剂发挥着重要的作用；而且其澄清度高，发酵残留少的特点，又大大减少了产品的提取纯化的难度与消耗，协助企业向清洁化，高效化，环保化生产发展。 安琪酵母浸出物以其优异的品质，在发酵工业飞速发展的今天，定会得到更广泛的应用，为生物产业的腾飞作出更大的贡献[/

本文引用自发酵《在发酵工艺角度看蛋白表达》引用发酵 的 在发酵工艺角度看蛋白表达在分子生物学角度讲，找到或合成外源蛋白基因，构建质粒，并导入细胞以表达具有生物活性的折叠正确的蛋白，是一种成熟的常规技术。目前，包括酶，抗原，抗体，激素，其他小分子调节蛋白在内的很多蛋白，都已经用这种技术实现了工业化生产。在具体的工艺选择上，历史沿袭习惯和表达体系的选择，对工艺稳定性，成本，有巨大的影响。 目前，常用的蛋白表达系，有3个类别：1，大肠杆菌表达系。大肠杆菌的遗传背景十分清楚，代谢相对简单，发酵副产物少，在不是很严格的情况下，是表达蛋白的首选。通过按经验选择合适的菌株及合适的质粒，既可以以包涵体的形式得到大量的目标蛋白，又可以在细胞外得到可溶性蛋白，是常见的一种表达系。2，酵母菌表达系。用酵母做表达系，理由之一，也是遗传背景清楚，而且，当蛋白分子量过小，不能形成包涵体时，或蛋白的二硫键过多，不易体外复性时，酵母菌就成了合适的选择。另外，酵母对蛋白也会有一个简单的修饰，近似于高等动物的蛋白糖基化过程。这样，在合成在体液中发挥作用的蛋白，而且，又不能（技术水平限制）用动物细胞时，就可以退而求其次的选用酵母菌表达。一般是用信号肽把蛋白导出细胞，在发酵液中以可溶性蛋白的形式存在。这也是一个常见的表达系。3，动物（或说，人的）细胞表达系。这种情况，在纯度或毒性方面有较高要求的产品应用。一般国外产品应用较多，国内还没有用动物细胞表达蛋白实现商业化生产的报道。由于技术限制，国内工业化生产用这个方法目前还有较大难度。这3种表达系，各自有自己的优缺点。首先，在潜在的毒性影像方面讲，由于和真核生物亲缘关系太远，大肠杆菌就最不合适。其次是酵母菌。而在表达量和代谢控制成本上来讲，酵母菌和动物细胞又是差强人意的。现在，很多蛋白习惯性的选用酵母菌做表达系，就是因为早期提取蛋白技术低下，而动物细胞培养技术又不过关的原因所致。目前，虽然提取工艺提高了，但作为蛋白这种高附加值产品，运作成本集中在销售而不是生产，所以，降低生产成本的诉求很低。站在降低开发难度的角度讲，一方面，质粒构建和质粒与菌株的匹配方面依赖大量经验，另一方面，发酵工艺策略选择与发酵工艺优化又需要很大的投入，所以，技术开发部门沿用自己熟悉的，已经积累了大量经验的表达系，是合理的。不过，随着分子技术进一步的发展，分子技术进入低附加值的产品领域又是必然的，降低生产成本就变的越来越必要了。 大肠杆菌表达系有两种得到外源蛋白的方法：1，缓慢的表达，得到可溶性蛋白，这种方法产量和酵母菌表达类似，与酵母菌比，不具有明显的优势，一般是有做大肠杆菌传统的研究机构生产小分子蛋白的一种沿袭性做法。2，使用T7启动子表达蛋白，这样，高速的蛋白表达速率使蛋白来不及折叠，在细胞内形成非水溶性的包涵体。最后目标蛋白可以达到总细胞质量的15%-25%，这样，就为降低成本提供了一种可能。不过，在使用T7启动子表达时，也存在两个难点：1，蛋白的复性技术，如果形成可溶性蛋白，那利用（使用分子技术加载在目标蛋白上）信号肽，只要过一遍柱子就能分离得到纯度非常高的，具有生物活性的产品，而形成包涵体，对提取，复性就有较高的要求，特别是二硫键的存在，会对复性产生很大的影响。在目前国内和国际流行技术看，并不是所有的蛋白都能在预定成本下复性的。2，任何情况下，高产都是代谢网络互相依赖与作用的结果。在如此高的表达量下，甚至细胞的形态都已经发生很大变化，正常代谢受到严重干扰，以至于放大时，摇瓶工艺对发酵工艺几乎没有任何参考价值。发酵工艺策略的选择将直接依赖于工程人员在生化，生理水平对菌株的理解，而匮乏可资参考的数据资料。发酵工艺的优化要离开摇瓶经验在发酵罐上逐步进行，这样，整个发酵工艺的确立就需要比想象中要大得多的人员与时间的投入。另外，再说一下糖基化的问题。在动物细胞内合成的折叠正确的蛋白，在分泌入体液前会有一个糖基化的过程，加上一个糖链就不会很快被蛋白酶当做折叠错误的蛋白水解掉。但是以微生物为表达系表达的蛋白，不具有动物细胞的修饰过程，用大肠杆菌表达的目标蛋白，很快会在血液中被降解。解决或回避这个问题，有两种方法：1，用动物细胞表达，一般，是用癌化的人类细胞。由于动物细胞培养技术要求过高，在国外比较昂贵的医药中有应用，国内不常见。2，由于酵母菌也有一个对蛋白的粗略的修饰过程，可以用酵母菌表达目标蛋白。这个技术，国内国外都在用，可以是一个权宜之计。主要难点集中在对合适菌株的分子水平的改造，以达到尽可能接近满意的修饰效果。这样，就可以在不同目标蛋白上表达系和发酵工艺上做出选择。如果是小分子，无糖基化修饰或不在体液中发挥作用的蛋白，可以选择大肠杆菌和酵母菌表达系，得到可溶性蛋白，然后提取。如果分子量合适，并对生产成本有诉求，而且可以比较方便的复性，则选用大肠杆菌表达系，得到包涵体，然后复性。如果是需要在体液中发挥活性并有糖基化要求的 蛋白，则选用经过分子生物学改造的酵母菌表达系。当然，并不是任何一个实验室都同时拥有或擅长所有的方向的。而难点，往往集中在以下3个方面：1，大肠杆菌蛋白包涵体复性。2，糖基化修饰。3，发酵工艺（工程菌株的工业水平）的确定。做工程一般是理科实验室的弱项，而工科实验室做基础又很少，在把工科和理科结合方面，我们实验室还是有经验和成功先例的。下面，以溶菌酶为例，阐述一下蛋白表达系的选择和工艺的确定。溶菌酶是一类具有种属差异的非特异性免疫物质，在动物界中普遍存在，种类繁多，其实，在植物和微生物中也有发现。但研究最多的还是动物。开发兽用溶菌酶，主要是想作为抗生素的替代物，作为添加剂使用。因此是一个低附加值的产品。下面一切的工作，都会围绕“兽用”和“低附加值”展开。首先，比较几种常见和认为有效的溶菌酶，杀菌效果最好的是人的溶菌酶，但考虑到潜在的危险（具有对人溶菌酶产生抗性，并使抗性基因扩散），舍尔求其次，用了鸟类蛋清溶菌酶，作为表达对象。然后，在得到溶菌酶蛋白的一级结构后，对此进行了分析。此蛋白不会用于体液内，故没有糖链修饰的问题。分子量不是很大，但也不太小，130左右的氨基酸构成，足以形成包涵体，这就为用大肠杆菌表达系高效表达提供了可能。讨厌的是有4个二硫键，其中有两个在结构复杂区域，折叠正确有一定的困难。但是，如果用酵母菌做，可能没法解决成本问题，即便优化工艺现在过去了，也不会是最终版本----肯定会有人用大肠杆菌做。所以，结论就是必须知难而进，拿下复性工艺。另外，由于是低附加值产品，发酵吨位就不能太小。以往分子生物学流行的50升，100升小罐发酵，肯定是不行的。发酵罐的放大，除了溶氧，剪切力发生变化，更重要的是搅拌线速度改变了胞外酶以及包括细胞本身的代谢方式和速度。在胞内体现就是氧化还原电势的改变，这在工艺上会带来很多麻烦。虽然说，一般是放大后产量往往提高，但放大过程中，小罐的经验就不能照搬了。同时，也因为是低附加值产品，发酵过程中诸如质粒丢失等稳定性要求，就很高了，应为只有稳定，才能控制成本。这样，工艺就成了第二个难点。明白这些之后，按照大肠杆菌的喜好，合成了溶菌酶的基因。然后构建质粒，导入细胞。在摇瓶水平表达溶菌酶。在筛选复性条件的同时，就同时在发酵罐水平对工艺稳定性进行了优化。首先，为了进一步提高质粒稳定性，对初始培养基进行了重新设计。并改动发酵工艺策略，由于是胞内产物，我们应用高细胞密度发酵控制法延长限制性生长时间（不能用经典发酵的延长对数期生长时间的办法，对工程菌不适合，会造成质粒丢失，代谢紊乱等一系列问题），提高细胞量，并改变了诱导时机，得到了稳定的高产，具体数据比较枯燥，就不在此展开了。提取方面，经过不懈的努力，我们也掌握了比较成功的复性条件（具体由另外人员负责，也不做详细介绍了）。这样，工艺才基本拼凑好。进一步优化，在试生产多次重复时在进行。以上，是外源蛋白表达的粗略的技术和工艺的过程。

酵母膏和酵母粉的营养成分差不多，可否认为可以用酵母粉替换酵母膏,你尝试过没，说说体会吧。