小鼠腹水瘤细胞

[b][size=15px][color=#595959]恶性腹水(MA)[/color][/size][/b][size=15px][color=#595959]是一种以腹腔内异常液体积聚为特征的病理状态，是由多种原发性腹部和腹外[/color][/size][b][size=15px][color=#595959]恶性肿瘤[/color][/size][/b][size=15px][color=#595959]引起的。MA是一个[b]不良预后指标[/b]，只有约11%的患者在[/color][/size][b][size=15px][color=#595959]诊断[/color][/size][/b][size=15px][color=#595959]后存活超过6个月。MA的治疗包括多种保守治疗方案，如[/color][/size][b][size=15px][color=#595959]利尿剂[/color][/size][/b][size=15px][color=#595959]、限钠饮食、穿刺等，这些方法疗效有限，且存在一定的风险。[/color][/size] [b][size=15px][color=#595959]甘遂半夏汤(GBD)[/color][/size][/b][size=15px][color=#595959]是治疗恶性腹水等异常积液的经典中药方剂。虽然GBD已显示出明确的排水作用，但其确切的潜在机制尚未阐明。[/color][/size] [size=15px][color=#595959]该研究旨在探讨GBD对MA大鼠的药物作用及其机制。[/color][/size] [size=15px][color=#595959][/color][/size][size=15px][color=#595959][/color][/size][size=15px][color=#595959]采用超高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]法测定GBD主要化学成分。建立[b]肿瘤细胞[/b]诱导的MA大鼠模型，评价GBD的药物作用。对症状进行分析，采集生物样本，采用酶联[b]免疫[/b]吸附法、western blot法和流式细胞术检测[b]免疫[/b]和[b]炎症[/b]相关指标。[/color][/size][size=15px][color=#595959][/color][/size][size=15px][color=#595959][/color][/size][size=15px][color=#595959][/color][/size] [align=center] [/align] [size=15px][color=#595959]GBD增加尿量，减少腹水产生，减轻恶病质。GBD治疗后，TLR4、MyD88、NF-кB的表达减少，白细胞介素(IL)-1β、IL-6、肿瘤[/color][/size][b][size=15px][color=#595959]坏死[/color][/size][/b][size=15px][color=#595959]因子(TNF)-α等促炎细胞因子的释放减少。此外，[b]GBD增加G1期阻滞，抑制骨髓细胞过度增殖；减轻G1期阻滞，增加胸腺细胞增殖[/b]。相应的，T细胞的发[/color][/size][size=15px][color=#595959][/color][/size][size=15px][color=#595959]育和成熟也发生了变化。GBD增加了成熟T细胞(CD4+CD8和CD4-CD8+单阳性(SP)T细胞)的比例，降低了未成熟细胞(CD4+CD8+双阳性(DP)T细胞和CD4-CD8-双阴性(DN)T细胞)在血液或肿瘤微环境(TME，腹水微环境)中的比例。[/color][/size] [size=15px][color=#595959]最后，进一步分析了免疫细胞亚群，GBD降低了血液中免疫抑制性T细胞(CD4+CD25+Foxp3+T细胞)和TME (CD8+CD25+Foxp3+T细胞)的比例，增加了TME中抗[/color][/size][b][size=15px][color=#595959]肿瘤免疫[/color][/size][/b][size=15px][color=#595959]细胞(CD8+CD28+T细胞和NK细胞)的比例。[/color][/size][size=15px][color=#595959][/color][/size] [size=15px][color=#595959][/color][/size][color=#3573b9]结论[/color][size=15px][color=#595959][/color][/size] [b][size=15px][color=#595959][/color][/size][size=15px][color=#595959][/color][/size][size=15px][color=#595959][/color][/size][size=15px][color=#595959][/color][/size][/b][size=15px][color=#595959][font=&][/font][/color][/size][b][size=15px][color=#595959][/color][/size][/b][size=15px][color=#595959][/color][/size][b][size=15px][color=#595959][/color][/size][size=15px][color=#595959][/color][/size][/b][size=15px][color=#595959]这些发现提示[b]GBD的药物作用可归因于调节免疫炎症稳态，从而减轻癌症细胞的破坏并减少腹水的产生[/b]，这为临床合理应用提供了理论支持，拓展了GBD“排水”的科学内涵。[/color][/size][size=15px][color=#595959] [/color][/size]

大神们，帮忙推荐台主要针对小鼠骨髓细胞数检测的仪器，再一个就是能对小鼠血细胞的种类分类，计数。要求不高。。但是这种针对性的仪器还这难找。。

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[em0808]我要做的是小鼠的卵细胞的电镜，但是我所能获得的卵细胞的数量有限的，不知道有什么技巧可以保证细胞能包埋进去，听说有人做了好几次就没有作出来呀 急哦 谢谢大家了

原文是Purton, L.E., and Scadden, D.T. (2007). Limiting Factors in Murine Hematopoietic Stem Cell Assays. Cell Stem Cell 1, 263-270.发表在2007年cell stem cell 杂志上，最近由于要进行相应的课题研究，拿来精读了一番，做了一个笔记，发上来和大家分享，由于初涉小鼠造血干细胞这个领域，肯定有很多地方理解不全和错误，请大家指正。下面是我的精读笔记：小鼠造血干细胞研究方法综述一．关于HSC 免疫表型1. Thy1.1lo,Lin-Sca-1+Cells:其缺点是Thy1.1只表达于C57BL/Ka-Thy1.1小鼠，不表达于常用的C57BL/6小鼠；2. Lin- c-Kit+ Sca-1+ Cells（LSK）：异质性，含有祖细胞，HSC含量不超过10%；结合CD34和Flt3可以分为long-term repopulating HSCs (LKS+ CD34- Flt3-) ，short-term repopulating HSCs (LKS+ CD34+ Flt3-) ，以及multipotent progenitors(LKS+ CD34+ Flt3+)；3.荧光染料标记HSC: Rhodamine 123, Hoescht 33342, 以及Side Population，Rhodamine 123为线粒体染料，Hoescht 33342为DNA染料，HSC能够更多地将这两种染料泵出细胞外，所以染色较浅；4. SLAM Family Members：SLAM antigens (CD150+ CD244-CD48- cells)，其优点是不像Thy1.1和Sca-1其表达受到品系和发育阶段等的影响，在更多的种系的小鼠中适用二．克隆形成实验：主要反映的是祖细胞的造血能力，不反映HSC，检测T系和B系需要另外特定的培养条件；三．Cobblestone Area-Forming Cells/Long-Term Culture-Initiating Cells，鹅卵石样区域形成细胞实验/长期培养-启动细胞实验：体外检测更早期造血干/祖细胞的方法，但由于feeder layers和培养条件不同，实验结果在不同实验室间稳定性较差，对于其是否真正能检测造血干细胞也比较有争议，不过在一些情况下，比如归巢（homing）或植入（engraftment）有缺陷导致体内造血重建实验无法进行时，这两个方法是较好的替代方法；四．Colony-forming unit-spleen (CFU-S)脾集落单位形成实验：属于短期（1-3周）体内重建实验，检测的干祖细胞比体外CFC早，但比HSC晚；五．long-term repopulating assays，长期重建实验，包括：1. competitive repopulation assay：竞争重建实验：属于定性或者半定量研究HSC重建能力的方法，不能区别是HSC的数量还是质量造成的结果差异，得到的结果为RU即重建单位；2. limiting dilution assay：统计的指标是造血重建失败的小鼠数目，采用泊松分布来计算HSC的频率，得到的结果为CRU即竞争重建单位；Stem Cell公司的免费软件L-Calc,可用于分析实验结果。limiting dilution assay有两种方法：1CRU assay，采用最小数的HSC作为竞争细胞，可以在单细胞水平检测HSC；2也称为CRU assay，采用标准的，足量的HSC作为竞争细胞，不能在单细胞水平检测HSC；3serial transplant assay，多代移植，最为严格的检测造血干细胞的方法；六：Limiting Dilution Assays需要考虑的几个重要因素：1.竞争细胞：1compromised bone marrow，即连续两代重建成功的骨髓细胞，比较耗时2W41/W41受体小鼠：c-kit基因发生突变，具有更加敏感的宿主微环境，能够检测更少的植入的HSC，不需要另外的HSC作为支持细胞（竞争细胞）；3全骨髓细胞（whole bone marrow cells）：经验表明2 X105 competing bone marrow cells比较适合2.受测细胞（Test Cells, Unknown HSC Potential）：有人用LKS+ CD34- cells，但作者认为全骨髓细胞最好，原因是这种方法是在功能上评价HSC，避免了HSC在基因修饰的小鼠中免疫表型发生变化导致的结果的不可靠，在作者实验室通常采用的受测全骨髓细胞数为8 X 103到2 X106；3.重建失败的标准：现在一般认为受测细胞的重建比例小于1%为重建失败；在重建比例中，红细胞是不计算在内的，因为其不表达CD45,但一般认为只要其他系重建成功，红系应该也会重建成功；4.分析重建的时间点：看长期造血重建，最少要16周，最佳是六个月；5.其他考虑因素：归巢，HSC各系分化阻滞或减弱，祖细胞增殖动力学特性的改变，造血微环境对HSC的影响等等七．区分供体，受体的遗传学标志：最常用的是CD45.1,CD45.2系统，还有可以通过性别（Y染色体）来区分。

各国争相发展的重点项目　　iPS技术，即诱导性多能干细胞技术，是一种将成体成熟、分化的体细胞重编程获得类似胚胎干细胞的新兴技术。2007年11月美国和日本科学家分别独立宣布可将人类皮肤细胞转化为iPS细胞。这一发现被《自然》和《科学》杂志分别评为2007年第一和第二大科学进展。之后，iPS细胞研究迅猛发展，不同的国家和实验室纷纷报道了多种方法建立的iPS细胞系。就连世界第一只体细胞克隆动物多利羊的培育者伊恩·威尔莫特也宣布放弃人类胚胎干细胞克隆研究，转而进行 iPS 细胞研究，因为他认为这种细胞比胚胎干细胞更具潜在优势。　　我国连续多年将干细胞研究列入“863”、“973”、国家自然基金重点项目。国务院2006年发布的《国家中长期科学和技术发展规划纲要（2006-2020年）》中，干细胞作为五项生物技术之一成为未来15年我国前沿技术的重点研究领域。　　致瘤风险浮出水面　　Yamanaka研究组在《自然·生物技术》上发表的文章显示，用iPS细胞诱导的神经干细胞，即使不含c-Myc（曾被认为是导致肿瘤的主要原因），在植入NOD/SCID免疫缺陷小鼠后仍有很强的致瘤性，甚至高于胚胎干细胞。　　　他们共研究了36个iPS细胞克隆，在诱导方式上，有些诱导剂配方中含有c-Myc基因，有些没有，因此具有较好的代表性。同时他们选择了3株胚胎干细胞作为对照。在45周的观察中，移植胚胎干细胞来源神经干细胞的34只小鼠有4只长出肿瘤。在100只移植胚胎成纤维细胞来源的iPS神经干细胞小鼠中34只发现肿瘤，概率和胚胎干细胞相当。在55只移植成人成纤维细胞来源的iPS神经干细胞小鼠中46只发现肿瘤，概率远高于胚胎干细胞。在36只移植肝细胞来源的iPS神经干细胞小鼠中10只发现肿瘤，概率高于胚胎干细胞。8只移植胃上皮细胞来源的iPS神经干细胞小鼠中未发现肿瘤。病理学检查证实肿瘤均为畸胎瘤，部分为恶性畸胎瘤。　　研究还发现，以前认为致瘤性很强的c-Myc在去掉后并没有减少iPS神经干细胞的致瘤性，相反以前认为没有致瘤性的Nanog基因却可以明显增强iPS神经干细胞的致瘤性。　　这次试验的另一个意外结果是并未发现在生成的肿瘤细胞中有c-Myc或其他基因的激活。以前的观点认为，转入的癌基因是iPS致瘤性的基础，只要在iPS细胞诱导成功后通过各种方法去除已完成使命的癌基因即可使iPS细胞免于致瘤性。这次试验的结果无疑给这些想法留下了阴影，而且使iPS致瘤的机制更加扑朔迷离。

食品安全国家标准 小鼠精原细胞或精母细胞染色体畸变试验

十三.流式细胞术在血液学中的应用 淋巴瘤免疫分型 目前淋巴瘤的分类方法已从LSG的形态学分类逐渐转变为REAL分类法, REAL分类法是以肿瘤发生源为基础的分类方法,在原来的形态学基础上加上免疫学分型后再加以分类,这种分类方法不仅能够推断肿瘤的发生源,对治疗也有指导意义。因此淋巴瘤的免疫分型越来越重要。如同白血病免疫分型一样，淋巴瘤的免疫分型也是利用单克隆抗体检测淋巴瘤细胞的细胞膜和细胞浆抗原,分析其表现型,以了解被测淋巴瘤细胞所属细胞系列及其分化程度。流式细胞仪能对多数的淋巴瘤细胞的细胞膜和细胞浆抗原迅速客观地做出检测，在淋巴瘤的免疫分型中起着不可替代的作用。临床淋巴瘤的免疫分型的检测标本一般是淋巴结、脾脏、胸水、腹水等。在临床淋巴瘤的免疫分型工作中常可遇到以下四种情况：①B细胞系淋巴瘤②T/NK细胞系淋巴瘤③淋巴细胞系以外的造血细胞肿瘤④造血细胞以外的肿瘤。REAL分类淋巴瘤的免疫表型见表12.8。*：弱表达或阴性。BLBL :前B原始淋巴细胞淋巴瘤/白血病; BSLL: B-小淋巴细胞淋巴瘤; LPL:淋巴浆细胞样淋巴瘤; MCL: 斗篷细胞淋巴瘤; FCL:滤泡中心淋巴瘤; MZL: 边缘带B细胞淋巴瘤; SMZL :脾MZL ;HCL:毛细胞白血病; PC:浆细胞瘤;DLBL: B-弥漫性大细胞淋巴瘤; BL: Burkitts淋巴瘤; HBLB:高度B细胞淋巴瘤, Burkitts样; TLB L: 前T原始淋巴细胞淋巴瘤/白血病; TPLL: T幼淋细胞白血病; LGLT:大颗粒淋巴细胞白血病, T细胞型[col

[b][size=15px][color=#595959]丹参酮IIA[/color][/size][/b][size=15px][color=#595959] (TIIA)[/color][/size][size=15px][color=#595959]是中药丹参的主要脂溶性活性成分，具有延缓[/color][/size][b][size=15px][color=#595959]动脉粥样硬化[/color][/size][/b][size=15px][color=#595959](AS)[/color][/size][size=15px][color=#595959]的作用。[/color][/size][size=15px][color=#595959]TIIA还可以通过发挥抗炎和抗氧化作用来治疗帕金森病等神经系统疾病。[/color][/size][size=15px][color=#595959]然而，目前尚不清楚TIIA是否[/color][/size][size=15px][color=#595959]可以通过调节[/color][/size][b][size=15px][color=#595959]胞葬作用(e[/color][/size][size=15px][color=#595959]fferocytosis)[/color][/size][/b][size=15px][color=#595959]从而改善动脉粥样硬化。[/color][/size] [align=center] [/align] [size=15px][color=#595959][/color][/size][size=15px][color=#595959]该研究旨在[b]确定TIIA是否可以通过增强胞葬作用来减少脂质积累和治疗AS[/b]。[/color][/size] [size=15px][color=#595959]首先，对LDLR敲除(LDLR-/-)小鼠进行为期24周的体内实验，分别采用组织病理学染色、[/color][/size][size=15px][color=#595959]免疫[/color][/size][size=15px][color=#595959]荧光和Western blot实验从疗效和机制两部分进行验证；此外，利用细胞在体外再次验证。具体实验设计方案如下：在体内，以西方饮食（高脂肪饮食）喂养12周的LDLR-/-小鼠为AS模型，以正常饮食喂养的LDLR-/-小鼠为空白对照组。TIIA组和阳性对照组(阿托伐他汀，ATO)分别通过腹腔注射(15 mg/kg/d)和灌胃(1.3 mg/kg/d)干预12周。体外分别用ox-LDL (50 ug/mL)或ox-LDL (50 ug/mL) + TIIA (20 uM/L或40 uM/L)培养RAW264.7细胞。[/color][/size] [size=15px][color=#595959]采用Masson染色和油红O染色分别评价[/color][/size][size=15px][color=#595959]主动脉[/color][/size][size=15px][color=#595959]斑块和RAW264.7细胞泡沫细胞形成的病理变化。采用生化方法检测小鼠血脂水平。采用免疫荧光法检测斑块中凋亡细胞和胞葬作用相关信号的表达。采用RT-q[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]和Western blot方法观察小鼠主动脉和RAW264.7细胞中胞葬作用相关分子的变化趋势。还使用中性红法评估RAW264.7细胞的吞噬能力。[/color][/size] [align=center] [/align] [size=15px][color=#595959]与模型组比较，TIIA降低了血清TC、TG、LDL-C水平(p 0.01)，减少了小鼠主动脉富含脂质斑块的相对管腔面积(p 0.01)，增强了小鼠主动脉斑块的稳定性(p 0.01)，减少了ox-LDL诱导的RAW264.7细胞脂质堆积(p 0.01)，上调了ox-LDL诱导的RAW264.7细胞的胞葬作用相关分子表达，提高了胞葬作用率。[/color][/size] [align=center] [/align] [size=15px][color=#595959]TIIA可能[b]通过增强巨噬细胞的胞葬作用功能来减少脂质积累[/b]，从而治疗AS。继续深入研究TIIA使巨噬细胞在AS中保持[b]强吞噬和[/b][/color][/size][b][size=15px][color=#595959]消化[/color][/size][size=15px][color=#595959]吸收[/color][/size][/b][size=15px][color=#595959]的具体机制，可能会推动TIIA作为巨噬细胞胞浆作用的靶向治疗剂的进展。[/color][/size]

研究人员报告说，以能检测到皮肤中的外来入侵物而最为出名的一组免疫细胞也能通过代谢环境中的化学物质而促进肿瘤的生长。包括皮肤及那些覆盖许多身体表面的上皮组织形成了一种抵御微生物及可以引起癌症的化学毒素的关键性的屏障。（在人类中，90%的癌症起源于上皮组织。）这些组织常常充满了树突状细胞，其中包括一个叫做朗格汉斯细胞的亚组细胞，这些细胞可识别抗原并将它们“穿戴”在其表面以警示T细胞进行防御反应。这些抗原可以是微生物，或它们也可来自肿瘤。然而，令人感到惊讶的是，缺乏朗格汉斯细胞的小鼠则可不受化学性致癌作用的侵害，而Badri Modi及其同事希望能找出其原因。他们如今用一种鳞状细胞癌的小鼠模型揭示了朗格汉斯细胞可驱使健康的皮肤细胞转变成为癌性细胞。朗格汉斯细胞在对致癌物7,12二甲基苯丙蒽（DMBA）进行回应时会增加其对某种叫做CYP1B1酶的表达，这种酶会将DMBA代谢成为一种可诱导细胞内突变的化合物。文章的作者指出，DMBA是一种聚芳烃，或PAH，而这些烃类化合物一般在工业污染中非常普遍。他们说，含有PAH的颗粒物质可能是人类皮肤癌中的一种未得到正确评价的环境因素。 —————————————————————————————————————————— 令人震惊的比例（人类90%），不过PAHs尤其是苯并芘（BAP）是强致癌物倒是听说过！

http://www.bioon.com/biology/UploadFiles/201208/2012080216013081.jpg癌症研究人员可以测定肿瘤细胞基因组的序列，扫描其异常的基因活性，剖析其突变的蛋白质和研究它们在实验室培养皿中的生长，但研究者一直无法跟踪细胞形成肿瘤的过程。现在三个独立研究小组在小鼠体内做到了这一点。他们的研究结果支持这样的观点：一小部分细胞驱动肿瘤的生长，而想要治愈癌症可能需要将这些所谓肿瘤干细胞清除。目前还无法确认，这些从脑瘤，肠癌和皮肤癌研究的结论是否适用于其他类型肿瘤，但是得克萨斯大学西南医学中心的路易斯·帕拉达认为，如果它们适用于其他肿瘤，"将深刻地改变目前的化疗疗效评价和临床疗法的制定标准"。 不仅是看某种疗法是否缩小肿瘤，研究人员将更关注是否杀死了正确的细胞。帕拉达和他的同事们想检测是否特异性标识健康成人神经干细胞的一个遗传标记，也可标识神经母细胞瘤中的癌症干细胞。他们发现，所有神经母细胞瘤样本中至少有几个标记细胞 - 大概是干细胞。未标记细胞可被标准化疗杀死，但肿瘤可迅速恢复。进一步的实验表明，未标记细胞起源于标记的细胞祖先。当研究者把化疗与抑制标记细胞的遗传手段相结合进行治疗时，帕拉达说，肿瘤显著缩小到"残留遗迹"的水平。在另一项研究中，荷兰乌得勒支Hubrecht研究所的干细胞生物学家们把注意力瞄着了肠道。利用药物驱动的荧光素标志物表达系统，他们在小鼠体内证实，多种不同类型的肿瘤细胞，其实是来源于同一干细胞的。而且，这些干细胞是肿瘤发展的驱动力。对皮肤癌的研究，Blanpain和他的小组标记单个肿瘤细胞，而不是特异地标记干细胞。他们发现，细胞表现出两种不同的分工模式：它们要么在慢慢耗尽前分裂出少数细胞，或者产生许多细胞。这再次证实，一类独特的细胞亚群是肿瘤生长的驱动力。研究者说，下一步的研究计划将是，搞清楚这些实验所跟踪的细胞如何与通过多年移植实验所确定的，假定的癌症干细胞相联系的。研究人员已经紧锣密鼓地在寻找杀死这些细胞的方法;现在他们有更多的工具来测试这样的策略是否会奏效。

【序号】：3【作者】：朱琳邹德庆范作卿【题名】：蚕蛹羧甲基壳聚糖对小鼠成纤维细胞增殖与生长的影响【期刊】：蚕业科学. 【年、卷、期、起止页码】：2017,43(03)【全文链接】：https://kns.cnki.net/kcms2/article/abstract?v=3uoqIhG8C44YLTlOAiTRKibYlV5Vjs7iAEhECQAQ9aTiC5BjCgn0RurLuDBf62EN5lCHC3tB7EA_NCYlyZxEZRugsuO02raR&uniplatform=NZKPT

肝硬化腹水（水鼓胀）冬瓜皮一两，萝卜籽3钱，煎一碗汤一次服下，一日二次，连用10~15天。忌吃油炸食物。

组织材料若来自血液、羊水、胸水或腹水的悬液材料，最简单的方法是采用1000r/min的低速离心10分钟，若悬液量大，可适当延长离心时间，但速度不能太高，延时也不能太长，以避免挤压或机械损伤细胞，离心沉淀用无钙、镁PBS洗两次，用培养基洗一次后，调整适当细胞浓度后再分瓶培养，若选用悬液中某些细胞，常采用离心后的细胞分层液，因为，经离心后由于各种细胞的比重不同可在分层液中形成不同层，这样可根据需要收获目的细胞。不同比重的分层液的配制和具体分离方法详见淋巴细胞分离培养的章节。　　　　实体组织材料的细胞分离方法　　　　对于实体组织材料，由于细胞间结合紧密，为了使组织中的细胞充分分散，形成细胞悬液，可采用机械分散法(物理裂解)和消化分离法。　　　　(一)机械分散法　　　　所取材料若纤维成分很少，如脑组织，部分胚胎组织可采用剪刀剪切、用吸管吹打分散组织细胞或将已充分剪碎分散的组织放在注射器内(用九号针)，使细胞通过针头压出，或在不锈钢纱网内用钝物压挤(常用注射器钝端)使细胞从网孔中压挤出。此法分离细胞虽然简便、快速，但对组织机械损伤大，而且细胞分散效果差。此法仅适用于处理纤维成分少的实验室试剂软组织。　　　　(二)消化分离法　　　　组织消化法是把组织剪切成较小团块(或糊状)，应用酶的生化作用和非酶的化学作用进一步使细胞间的桥连结构松动，使团块膨松，由块状变成絮状，此时再采用机械法，用吸管吹打分散或电磁搅拌或在摇珠瓶中振荡，使细胞团块得以较充分的分散，制成少量细胞群团和大量单个细胞的细胞悬液，接种培养后，细胞容易贴壁生长。　　　　1、酶消化分离法　　　　酶消化分离法常采用胰蛋白酶和胶原酶，其分离方法如下：　　　　(1)胰蛋白酶分散技术　　　　胰蛋白酶(简称胰酶)是广泛应用的消化剂。胰蛋白酶是一种胰脏制品，对蛋白质有水介作用，主要作用于赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，使细胞间质中的蛋白质水介而使细胞分散开，在常用人血清 AB的蛋白酶中由于产品的活力和纯度不同，对细胞的消化能力也不同，胰蛋白酶对细胞的作用，取决于细胞类型、酶的活力、配制的浓度、消化的温度、无机盐离子、pH以及消化时间的长短等。　　　　①细胞类型胰蛋白酶适于消化细胞间质较少的软组织,能有效地分离肝、肾、甲状腺、羊膜、胚胎组织、上皮组织等。而对含结缔组织较丰富的组织,如乳腺、滑膜、子宫、纤维肉瘤、肿瘤组织等就无效，但若与胶原酶合用,就能增加其对组织的分离作用。　　　　②酶的活力市售的胰蛋白酶,其活力都经过测定而有效，但配制时必须新鲜，需保存在低温冰箱中，消化时的pH和温度都要适宜，否则会影响活力，细胞的分散直接与酶的活力有关，最终使用活力为1:200或1:250，56℃pH8.0时活力最强。　　　　该酶为粉剂，保藏时要防潮，室内温度不宜过高，保存时间不能太长，若粉剂结团块,说明该部分受潮或失效。　　　　③酶的浓度胰蛋白酶一般采用的浓度为0.1%-0.25%(活力1:200或1:250),但遇到难消化的组织时，浓度可适当提高，消化时间适当延长。浓度高对细胞有毒性，而较低浓度的胰蛋白酶在培养液中可促进细胞的增殖，若培养液中加入血清，其少量胰蛋白酶可被血清中抗胰蛋白酶因子所清除。　　　　④温度一般认为胰蛋白酶在56℃时活性最强，但由于对细胞有损害而不能被采用，常使用的温度为37℃，通常在37℃进行消化比室温作用快。　　　　⑤pHpH8~pH9是胰蛋白酶活力适宜范围，但随碱性的增加其活力也随之减少，活性强分散快，细胞也容易被消化下来，消化分离细胞时PH只能选用7.6～8.0之间，否则对细胞有损伤。　　　　⑥无机盐离子若用含有钙和镁的盐类溶液来配制胰蛋白酶时，可以发生抑制胰蛋白的消化作用。因此,在配制时应采用无钙镁离子的PBS配制。　　　　⑦消化时间如果细胞消化时间过长，可以损害细胞的呼吸酶，从而影响细胞的代谢，一般消化时间为20分钟为宜，冷消化时使用低浓度消化液，于4℃过夜也可。　　　　分离方法如下：　　　　①过夜冷消化将取得的组织用Hanks液洗三次，剪成碎块大小为4毫米左右，用Hanks液洗2~3次以除去血球和脂肪组织，再加入0.25%的胰蛋白酶，摇匀后放4℃过夜，次日再用Hanks液洗涤，弃去上清，共洗2~3次，然后，加入少量营养液吹打分散，细胞计数，按适当的浓度分瓶培养。　　　　②多次提取消化法多次提取消化法有以下三种：　　　　热消化多次提取将剪碎的细胞块加入0.25%胰蛋白酶37℃水浴中消化15~20分钟，然后经洗涤后用营养液分散制成细胞悬液，按合适的浓度分瓶培养，然后将留下的未彻底消化的组织按上述方法操作，再消化提取细胞。　　　　冷消化多次提取方法同上，只是消化温度为4℃。　　　　先热消化后冷消化将组织块先用胰蛋白酶于37℃下消化20分钟经洗涤后用营养液分散，制成悬液，剩余未消化的小组织块经洗涤后用胰酶于4℃下过夜，次日再提取细胞，分散成悬液，分瓶培养。　　　　(2)胶原酶(Collagenase)消化法　　　　胶原酶是一种从细菌中提取出来的酶，对胶原有很强的消化作用。适于消化纤维性组织、上皮组织以及癌组织，它对细胞间质有较好的消化作用，对细胞本身影响不大，可使细胞与胶原成分脱离而不受伤害。该酶分离效果好，即使有钙、镁离子存在仍有活性，故可用PBS和含血清的培养液配制，即操作简便又可提高细胞成活率，最终浓度200u/mL或0.1～0.3mg/mL。细胞培养此酶消化作用缓和，无需机械振荡，但胶原酶价格较高，大量使用将增加实验成本。　　　　经过胶原酶消化后的上皮组织，由于上皮细胞对酶有耐受性，可能有一些上皮细胞团块尚未被完全消化开。成小团块的上皮细胞比分散的单个上皮细胞更易生长，因此不必要再进一步消化处理。　　　　鉴于胰蛋白酶和胶原酶的生物学活性和在不同浓度下消化各种组织小块所需的时间(小时)有差异，以及两者价格不等，有人采用胶原酶与胰蛋白酶并用，同时还可加透明质酸酶(对细胞表面糖基有作用)，采用两者的联合消化作用，对分散大鼠和兔肝、癌组织非常有效。　　　　除上述两种最常用的消化酶外，还有链霉蛋白酶、粘蛋白酶、蜗牛酶、弹性蛋白酶、木瓜蛋白酶，近年来，还有一种从灰霉菌中提取的Pronase新酶分散细胞更佳。　　　　2、非酶消化法(EDTA消化法)　　　　EDTA是一种非酶消化物，又称螯合剂或Versene，全名为乙烯二胺四乙酸。常用不含钙、镁离子的PBS配成0.02%的工作液，对一些组织，尤其是上皮组织分散效果好，该化学物质能与细胞上的钙、镁离子结合形成螯合物，利用结合后的机械力使细胞变圆而分散细胞或使贴壁细胞从瓶壁上脱离，缺点是细胞易裂解或贴壁细胞从瓶壁上脱离时呈片状，有团块，常不单独使用，但可与胰蛋白酶混合使用(1:1或2:1)，不仅利于细胞脱壁又利于细胞分散，可降低胰酶的用量和毒性作用。　　　　消化分离法的操作步骤：　　　　(1)剪切把组织块剪碎，呈1~5mm3大小的组织块。　　　　(2)加液漂洗将碎组织块在平皿(或三角烧瓶)中用无钙镁PBS洗2-3次(采用倾斜，自然沉降法)。　　　　(3)消化加入消化液(胰蛋白酶或胶原酶或EDTA)于37℃水浴中作用适当时间(中间可轻摇1~2次)，若组织块膨松呈絮状可终止，若变化不大可更换一次消化液，继续消化直至膨松絮状为止。胰蛋白酶消化时间不宜过长。　　　　(4)弃去消化液采用倾斜自然沉降或低速离心法尽量弃去消化液。　　　　(5)漂洗将含有钙、镁离子的培养基沿瓶壁缓缓加入，中止消化反应，采用漂洗法洗2-3次后，加入完全培养基。　　　　(6)机械分散采用吸管吹打或振荡法，使细胞充分散开后用纱网或3~4层无菌纱布过滤后分瓶培养，若要求不高可采用倾斜自然沉降5~10分钟，吸上层细胞悬液进行分瓶培养。

名 称：骨髓细胞的提取目的：分离并培养骨髓间充质干细胞原理：先分离出单核细胞然后再通过培养分离出骨髓间充质干细胞内容：步骤一：小鼠骨髓细胞的获取1． 断颈处死小鼠（7-12周，雌雄均可），投入盛有250ml左右的0.1%新洁尔灭或75%酒精中浸泡3-5分钟，拎出后将小鼠仰面翻铺于超净台上一个消毒托盘上。2． 用眼科镊小心捏起小鼠两髋关节之间的腹部皮肤，用眼科剪小心剪开皮肤，并分离两下肢的皮肤，往下在脚踝处剪断，往上在髋关节处剪断，这样可以游离出小鼠的两条下肢。将它们放入另外一个消毒托盘中，并换一套新的剪子和镊子。手术器械事先均必须消毒。3． 小心剥离肌肉，分别剪下Femurs and Tibias, 剪去两端软骨，露出红色的骨髓腔。注意尽可能少的剪走骨髓腔。4． 拿两支5ml无菌注射器，每支吸取5ml IMDM(10%FBS, 50/50u/ml Pen/Strep)，换装一个4号针头（又称皮针）或1ml注射器的针头，并用无菌的针头套管将之轻轻拧弯。轻轻插入骨髓腔，对准一个无菌15ml离心管，将细胞冲出。每根骨用2.5ml IMDM培养液左右即可基本冲下骨髓腔内的细胞。5． 300C下离心，1200转/10分钟，去上清，但留1ml，以便用于在振荡器上悬浮细胞。6． 加进氯化铵溶液（NH4Cl: 8.99g/L, KHCO3: 1g/L, Na4-EDTA: 0.037g/L ，过滤灭菌, 40C储存）裂解红细胞，按1: 9比例，即1ml 细胞悬液，加进9ml氯化铵溶液，混匀，冰上10分钟。 7． 300C离心，1200转/10分钟，去上清。步骤二：淋巴细胞分离液分离小鼠骨髓细胞1． 按步骤二方法采集小鼠骨髓细胞，并破红细胞2． 细胞用4ml培养液悬浮，缓慢留置于8ml淋巴细胞分离液液面上，2000rpm for 20min.3． 小心吸取云雾状底层的基质细胞约1.5ml的体积，置于1个盛有1ml无菌细胞培养用PBS的15ml离心管中，颠倒混匀，1200rpm for 10min, 去上清4． 如果是注射用细胞，则用5ml PBS洗涤细胞2次；5． 离心沉淀下来的细胞用50-200ul PBS，计数细胞，并计算所需细胞体积数铺板培养

文章出处：Natural killer cell education and tolerance. Cell. 2010. 142:847-856综述背景与主要内容：NK细胞作为继T细胞、B细胞之后的第三大类淋巴细胞，对它的研究已经超过了30年，对其的认识也在一步一步的加深。NK细胞最主要的功能是杀伤病毒感染细胞和转化了的肿瘤细胞，从而起到免疫防御和免疫自稳的作用。从一开始，大家就提出了关于NK细胞如何识别“自我”与“非我”的问题，也就是为什么NK细胞不会杀伤正常的细胞，而专杀病毒感染细胞和肿瘤细胞呢？随着NK细胞众多活化性受体和抑制性受体的发现似乎解释了这一问题，尤其是识别自身MHC I类分子的抑制性受体的发现，认为机体有核细胞都表达MHC I类分子，NK细胞接受自身MHC I类分子的抑制性信号所以不会杀伤自身正常细胞，而病毒感染细胞和肿瘤细胞MHC I类分子下调，NK细胞抑制性信号下降，活化性信号占主导，NK细胞活化从而杀伤这些细胞。但是，随着研究的深入，发现事实并不是如此简单，有些NK细胞并不表达识别MHC I类分子的抑制性受体，或者表达的抑制性受体不识别自身的MHC I类分子。但是这些NK细胞却并不杀伤正常细胞，也不杀伤MHC I类分子缺陷的细胞。另外，无核的红细胞并不表达MHC I类分子，NK细胞也并不杀伤正常的红细胞。虽然自身免疫性疾病有很多，但是没有证据表明NK细胞是导致自身免疫性疾病的主要细胞，自身免疫性疾病一般都是由T细胞或B细胞自身耐受被打破导致的，说明NK细胞自身耐受机制比T细胞和B细胞要完善。逐着研究的深入，对NK细胞耐受的机制的研究也取得了重要突破，本文全面介绍了NK细胞耐受机制研究的重要进展。NK细胞耐受机制（本人总结）：1、经典方式：NK细胞表达识别自身MHC I类分子的抑制性受体，机体正常细胞通过表达MHC I类分子抑制NK细胞对机体正常细胞的杀伤。2、NK细胞表达的识别自身配体的活化性受体长期接触机体正常细胞表达的自身配体能够诱导NK细胞耐受。证据1：NKG2D是NK细胞重要的活化性受体，其配体是Rae-1家族，该配体在机体出生前高表达，出生后不表达。所以，NK细胞可以直接杀伤表达Rae-1配体的细胞。但是转基因持续表达该配体的小鼠的NK细胞则表现为对这些配体的耐受，无法杀伤表达该配体的细胞。证据2：Ly49D识别H-2Dd，来源于H-2Dd缺陷小鼠的Ly49D阳性NK可以杀伤表达H-2Dd的细胞。证据3：Ly49H识别MCMV编码的m157，野生型Ly49H阳性NK细胞可以杀伤表达m157的细胞；但是转基因表达m157小鼠来源的Ly49H阳性NK细胞则无法杀伤表达m157的细胞。而且，将野生型Ly49H阳性NK细胞过继转移到转基因表达m157小鼠内，该NK细胞也将耐受，无法杀伤表达m157的细胞。3、正常机体内存在不表达识别自身MHC I类分子的抑制性受体的NK细胞，这些NK细胞在正常机体内表现为耐受状态。在感染或者炎症条件下，这些NK细胞将打破耐受状态，具有较强的杀伤功能，但是，此时这些NK细胞也不会杀伤自身正常的细胞，因为这些NK细胞表达识别其它自身抗原分子的抑制性受体，如识别CD48的CD244抑制性受体，识别LLT1的CD161抑制性受体等。

95%。目前细胞分选主要用于研究，临床应用较少。血液学应用最多的是造血干细胞的研究，最近随着造血理论的深入研究关于造血干细胞究竟是否都是CD34+细胞出现一些争论,实验研究证明, CD34-造血干细胞较CD34+造血干细胞更具造血潜能,这些实验研究所用的CD34- 和CD34+细胞就是通过细胞分选获得的。小鼠造血干细胞分选一般按lin-c-Kit+CD34+/ lin-c-Kit+CD34-分选,人造血干细胞分选一般按lin-CD34+/ lin-CD34-分选。 为避免某些遗传性血液病如海洋性贫血、异常血红蛋白病的纯合子出生，产前诊断非常重要，这些疾病的主要靶细胞是红细胞，而孕妇血循环中存在着胎儿有核红细胞，只是数量非常少，利用流式细胞仪可从孕妇血液中分选出胎儿有核红细胞（分选条件：CD45-GPA+）进行基因分析，作出产前诊断。利用流式细胞仪分选免疫担当细胞进行细胞免疫学研究也是目前的热门课题。总之，流式细胞仪能够分选出你想得到的任何一亚群细胞，只要你想得到的某一亚群细胞有合适的单克隆抗体标记，流式细胞仪的分选功能将得到越来越多的科学研究和临床应用。二十二. 流式细胞术在血液学中的应用 其他流式细胞仪可能在两方面对骨髓增生异常综合症（MDS）有用，一是测定CD34阳性细胞数，以监测病情，二是测定核蛋白增殖因子（PCNA）,有报告PCNA再在生障碍性贫血、骨髓增生异常综合症、白血病三种疾病中表达有明显差异，可辅助鉴别诊断。 此外流式细胞仪也可检耐药蛋白,如肺耐药相关蛋白（LRP）、多药耐药蛋白（MRP）、 P170等。 流式细胞仪也可检测细胞因子，细胞内细胞因子如白介素系列（IL-1—IL-14）,肿瘤坏死因子(TNF),干扰素(IFN)等,[/color

第四种淋巴细胞—NKT细胞 通常认为，构成机体免疫系统的淋巴细胞有三种细胞系组成，一是由胸腺产生的T细胞，二是由骨髓分化而来的产生抗体的B细胞，三是自然杀伤（NK）细胞。而新近发现存在第四种淋巴细胞—NKT细胞。1. NKT细胞的发现1986年，克隆成功了NKT细胞的特征性抗原受体基因。将其命名为Va14基因，与其他T细胞抗原受体的（TCR）基因不同，有其独特的结构特征。1987年美国国立卫生研究所的Fawlkes与瑞士的Budd分别领导的两个研究小组报告指出，胸腺细胞中的T细胞通常不能表达受体，仅有部分未成熟T细胞选择表达V-β8.2受体。随后的研究证明这种细胞不是T细胞，考虑是NK细胞的受体，这种细胞集团的数量极少，生理意义不明。1994年，这两个研究小组的研究人员发现，他们报道的细胞为同一细胞，从此NKT细胞的研究引起人们的广泛关注。T细胞识别的抗原是蛋白质，而NKT细胞是别的抗原是α-Gal-Cer即所谓的糖脂质，这是该免疫系统与通常的免疫系统重要的不同点。NKT细胞的分化与T细胞不同的是在胸腺形成前的胎生初期6.5日在胸腺外组织分化。NKT细胞与T细胞比较，机能处于不发达状态。T细胞分化为功能不同的Th1和Th2细胞群，Th1细胞产生INFγ及IL-2，引起迟发行过敏症等细胞性炎症。Th2细胞能产生IL-4和IL-10，参与变态反应及抗体产生等体液免疫反应。而NKT细胞不但能分泌Th1和Th2细胞因子，同时还具有与CD8+伤害性T细胞（cytotox-ic Tlymphocyte,CTL）相同的杀伤靶细胞作用。毫无疑问，NKT细胞在免疫调节系统中占有重要位置。NKT细胞与疾病可能有诸多关系，可能与自身免疫性疾病的发病机制、变态反应的调节、抗肿瘤作用、及抑制寄生虫感染等有关。2. NKT细胞的多样性分化NKT细胞具有T细胞和NK细胞细胞两重性质，既能表达Va14/Ja281特定的T细胞受体又能由CD1介导识别脂质抗原。NKT细胞的分化是否依赖胸腺尚有争议。根据其表达TCR等多种表面抗原的不同，提示NKT细胞存在两个以上细胞群。从CD4/8的表达看，可将其分为（1）CD4-NKT细胞，（2）CD8-NKT细胞，（3）CD4和CD8均不能表达的DN-NKT细胞。第一类的全部和第二类的半数是Va14/Ja281-T细胞。3.人类NKT细胞人末梢血中的DN-NKT细胞V区域，可高度表达Va24/JaQ（这与鼠的Va14/Ja281高度相似）及Vβ11(与鼠Vβ18高度相似)。这种TCR的组合表达可见于DN-NKT细胞和CD4+细胞。而未见于CD8+细胞。小鼠的CD1相当于人的CD1d的Va24/JaQ。此外，人末梢血中1～2%的T细胞能表达抑制性受体，即抑制型NK细胞受体（KIR），而Va24/JaQ+细胞则不能表达。它的NK相关分子是CD16、CD56或CD57，Va24/JaQ+细胞异不能表达这些分子。在小鼠中还可以看到Va24/Ja281+T细胞以外的NKT细胞。人类Va24/JaQ+细胞与KIR+T细胞能形成不同的亚群。且具有不同的功能。4. NKT细胞分化的胸腺依赖性这是目前存在争议的问题，可以肯定地说NKT细胞分化过程中胸腺是有作用的。NKT细胞多见于胸腺及脾脏以外的肝脏和骨髓种，胸腺缺损的小鼠与正常小鼠比较，NKT的分化并不少。将出生三日小鼠的胸腺摘除，虽然NKT细胞的分化显著受到抑制，但此时CD8+NKT细胞的分化未受到影响。由此认为CD8+NKT细胞在胸腺外分化的可能。5. NKT细胞产生细胞因子的意义 NKT细胞是指能够表达NKT细胞标志NKT1.1的T细胞,其机能具有T细胞和NKT细胞双重特征。NKT细胞在TCR和NKR介导下，产生大量的IL-4及INFγ,对肿瘤细胞有细胞伤害作用。 NKT细胞能表达T细胞的TCR与NK细胞的NKR-P1两种受体，特别是NKT细胞多数表达Va14TCR，识别CD1抗原，而NKR-P1识别各种糖链。 NKT细胞，特别是CD4-NKT细胞，对TCR刺激可产生大量IL-4及IFNγ,同时具有ThO型细胞因子产生能力。NKT细胞不但产生IL-4的主要细胞，而且强力产生IFNγ。IFNγ参与自身Th1诱导，具有极强的Th1诱导能力，从而是IL-2产生亢进。它同时还具有Th2细胞分化抑制功能。IL-12能诱导NKT细胞产生IFNγ。IL-12对TCR的刺激是IFNγ的产生显著亢进。综上所述，NKT细胞不但是IL-4和IFNγ的强力产生细胞，同时参与Th1/Th2分化的抑制，而这些作用都不是单纯的。 虽然NKT细胞能大量产生细胞因子，但仅在机体内保持这种功能。当初一度认为，NKT细胞只是IL-4的产生细胞，而不是Th2分化的必需细胞。并不认为在CD1缺损的小鼠中NKT细胞的分化和对TCR刺激使IL-4产生减少，且对Th2分化必需的IL-4及IgE的产生没有多大影响。但给小鼠投于α-GalCer可使NKT细胞活化，IL-4的产生诱导Th2的应答。有报告指出，同样投于α-GalCer，可使NKT细胞产生IFNγ而致IgE产生低下。由此可见，NKT细胞能产生IL-4与IFNγ两种功能相反的细胞因子。这种微妙的协调作用可能是NKT机能表达的重要特征。NKT细胞的活化通常伴有T细胞、B细胞及NK细胞的活化，这对NKT细胞活化后的免疫应答有较大影响。

1. 利用诱导性多功能干细胞构建出小鼠精子祖细胞日本京都大学研究人员通过体外诱导胚胎干细胞(ESCs)和诱导性多功能干细胞(iPSCs)，形成原始生殖细胞样细胞(primordial germ cell-like cells, PGCLCs)，最后进一步分化，通过体内植入不能生育的小鼠睾丸中，产生了外观正常的精子。将这些精子注射到雌性小鼠的卵细胞中，不久雌性小鼠生出了健康的小鼠后代。2. 鉴定出阿尔茨海默病Alzheimer's disease的生物标记美国研究人员利用一种一般性和无偏差的方法---组合文库筛选(Combinatorial Library Screening)来鉴定出诊断上有用的抗体，而避免进行抗原鉴定。该方法涉及利用非自然的合成分子组合文库对病人血清样品和对照样品进行比较性筛选，这样就可鉴定出病人血清样品中要比和对照样品中保留极其多IgG抗体的分子，随后利用这些分子作为捕获试剂来捕获诊断上有用的抗体。研究人员利用多发性硬化症(multiple sclerosis)小鼠模式动物和证实这种方法的实用性，并利用该方法在阿尔茨海默病小鼠模式动物中鉴定出两种候选的IgG抗体生物标记。3. 发现干细胞多能性的选择性剪接开关加拿大多伦多大学研究人员发现了进化上保守的特异的FOXP1选择性剪接开关,可调控干细胞的多能性。研究人员发现这种剪接开关产生的FOXP1胚胎干细胞特异性异构体，与典型的FOXP1异构体相比，着不同的DNA结合性质。选择性剪接事件改变了FOXP1胚胎干细胞特异性异构体的DNA结合性质，促进维持多能性所需的转录因子基因的表达，包括OCT4、NANOG、NR5A2和GDF3，同时抑制胚胎干细胞分化所需的基因。同时，研究小组还发现FOXP1胚胎干细胞特异性异构体促进体细胞高效重编程为诱导性多功能干细胞(iPSC)。4. 追踪神经胶质瘤的起源美国研究人员利用双标记嵌合分析(Mosaic Analysis with Double Markers，MADM)---该技术的精髓在于用绿色荧光蛋白明确标示突变细胞，还有一个关键特色就是无论一个突变的绿色细胞何时产生，总是同时产生一个正常的红色细胞---来分析神经胶质瘤(glioma)的起源。他们将胶质瘤病人体内发现的两种流行突变p53与NF1导入神经干细胞(neural stem cells, NSCs)中，对源自神经干细胞的所有细胞系所作的进一步分析清楚地显示了少突胶质前体细胞(Oligodendrocyte precursor cells,OPCs)是该肿瘤的来源细胞，因为任何可见的肿瘤标志可被检出之前，变异的绿色少突胶质前体细胞的数量大大超过了其正常的红色对应物数量，足足超了130倍。为了进一步证实这点，研究人员也将p53与NF1突变直接导入小鼠少突胶质前体细胞，结果发现这些小鼠产生神经胶质瘤，从而再次证实少突胶质前体细胞是神经胶质瘤的来源。5. 发现新的组蛋白修饰方式美国芝加哥大学Ben Mary癌症研究所研究人员在细胞中筛查出了67个新组蛋白修饰标记，并从中发现了一种新型组蛋白翻译后修饰方式---赖氨酸巴豆酰化(lysine crotonylation)修饰。通过进一步的结构及基因组定位分析，研究人员证实氨酸巴豆酰化修饰是一种进化高度保守，且在生物学功能上完全不同于组蛋白赖氨酸乙酰化的蛋白质修饰方式。研究人员还发现在人类体细胞和小鼠精子细胞基因组中，组蛋白赖氨酸巴豆酰化分布于基因活性转录启动区域或增强子上。在减数分裂后的精子细胞中，赖氨酸巴豆酰化高丰度集中在性染色体上，被用来标记睾丸特异性基因。

[font=宋体][font=宋体]单克隆抗体是由单一[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体，称为单克隆抗体。通常采用杂交瘤技术来制备，杂交瘤[/font][font=Calibri](hybridoma)[/font][font=宋体]抗体技术是在细胞融合技术的基础上，将具有分泌特异性抗体能力的致敏[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞杂交瘤。[b]下面为大家讲解[url=https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/monoclonal-antibody-production]制备单克隆抗体[/url]药物的工艺流程步骤[/b]：[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1[/font][font=宋体]、抗原提纯与动物免疫[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]对抗原的要求是纯度越高越好，尤其是初次免疫所用的抗原。如为细胞抗原，可取[/font][font=Calibri]1[/font][font=宋体]×[/font][font=Calibri]107[/font][font=宋体]个细胞作腹腔免疫。可溶性抗原需加完全福氏佐剂并经充分乳化，如为聚丙烯酰胺电泳纯化的抗原，可将抗原所在的电泳条带切下，研磨后直接用以动物免疫。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]选择与所用骨髓瘤细胞同源的[/font][font=Calibri]BALB/c[/font][font=宋体]健康小鼠，鼠龄在[/font][font=Calibri]8[/font][font=宋体]～[/font][font=Calibri]12[/font][font=宋体]周，雌雄不限。为避免小鼠反应而不佳或免疫过程中死亡，可同时免疫[/font][font=Calibri]3[/font][font=宋体]～[/font][font=Calibri]4[/font][font=宋体]只小鼠。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]免疫过程和方法与多克隆抗血清制备基本相同，因动物、抗原形式、免疫途径不同而异，以获得高效价抗体为最终目的。免疫间隔一般[/font][font=Calibri]2[/font][font=宋体]～[/font][font=Calibri]3[/font][font=宋体]周。一般被免疫动物的血清抗体效价越高，融合后细胞产生高效价特异抗体的可能性越大，而且单克隆抗体的质量（如抗体的浓度和亲和力）也与免疫过程中小鼠血清抗体的效价和亲和力密切相关。末次免疫后[/font][font=Calibri]3[/font][font=宋体]～[/font][font=Calibri]4[/font][font=宋体]天，分离脾细胞融合。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]、骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]选择瘤细胞株的最重要的一点是与待融合的[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞同源。如待融合的是脾细胞，各种骨髓瘤细胞株均可应用，但应用最多的是[/font][font=Calibri]Sp2/0[/font][font=宋体]细胞株。该细胞株生长及融合效率均佳，此外，该细胞株本身不分泌任何免疫球蛋白重链或轻链。细胞的最高生长刻度为[/font][font=Calibri]9[/font][font=宋体]×[/font][font=Calibri]105/ml[/font][font=宋体]，倍增时间通常为[/font][font=Calibri]10[/font][font=宋体]～[/font][font=Calibri]15h[/font][font=宋体]。融合细胞应选择处于对数生长期、细胞形态和活性佳的细胞（活性应大于[/font][font=Calibri]95[/font][font=宋体]％）。骨髓瘤细胞株在融合前应先用含[/font][font=Calibri]8-[/font][font=宋体]氮鸟嘌呤的培养基作适应培养，在细胞融合的前一天用新鲜培养基调细胞浓度为[/font][font=Calibri]2 [/font][font=宋体]×[/font][font=Calibri]105/ml[/font][font=宋体]，次日一般即为对数生长期细胞。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]在体外培养条件下，细胞的生长依赖适当的细胞密度，因而，在培养融合细胞或细胞克隆化培养时，还需加入其他饲养细胞（[/font][font=Calibri]feeder cell[/font][font=宋体]）。常用的饲养细胞为小鼠的腹腔细胞，制备方法为用冷冻果糖液注入小鼠腹腔，轻揉腹部数次，吸出后的液体中即含小鼠腹腔细胞，其中在巨噬细胞和其他细胞。亦有用小鼠的脾细胞、大鼠或豚鼠的腹腔细胞作为饲养细胞的。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]在制备饲养细胞时，切忌针头刺破动物的消化器官，否则所获细胞会有严重污染。饲养细胞调至[/font][font=Calibri]1[/font][font=宋体]×[/font][font=Calibri]105/ml[/font][font=宋体]，提前一天或当天置板孔中培养。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]3[/font][font=宋体]、细胞融合[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]细胞融合是杂交瘤技术的中心环节，基本步骤是将两种细胞混合后加入[/font][font=Calibri]PEG[/font][font=宋体]使细胞彼此融合。其后吧培养液稀释[/font][font=Calibri]PEG[/font][font=宋体]，消除[/font][font=Calibri]PEG[/font][font=宋体]的作用。将融合后的细胞适当稀释，分置培养板孔中培养。融合过程中有几个问题应特别注意。①细胞比例：骨髓瘤细胞与脾细胞的比值可从[/font][font=Calibri]1:2[/font][font=宋体]到[/font][font=Calibri]1:10[/font][font=宋体]不等，常用[/font][font=Calibri]1:4[/font][font=宋体]的比例。应保证两种细胞在融合前都具有较高活性。②反应时间：在两种细胞的混合细胞悬液中，第[/font][font=Calibri]1min[/font][font=宋体]滴加[/font][font=Calibri]4.5ml[/font][font=宋体]培养液；间隔[/font][font=Calibri]2min[/font][font=宋体]滴加[/font][font=Calibri]5ml[/font][font=宋体]培养液，尔后加培养液[/font][font=Calibri]50ml[/font][font=宋体]。③培养液的成分：对融合细胞，良好的培养液尤其重要，其中的小牛血清、各种离子和营养成分均需严格配制。如融合效率降低，应随时核查培养基情况。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]4[/font][font=宋体]、有限稀释法[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]筛选阳性株一般选用的骨髓瘤细胞为[/font][font=Calibri]HAT[/font][font=宋体]敏感细胞株，所以只有融合的细胞才能待续存活一周以上。融合细胞呈克隆生长，经有限稀释后（一般稀释至[/font][font=Calibri]0.8[/font][font=宋体]个细胞[/font][font=Calibri]/[/font][font=宋体]孔），按[/font][font=Calibri]Poisson[/font][font=宋体]法计算，应有[/font][font=Calibri]36[/font][font=宋体]％的孔为[/font][font=Calibri]1[/font][font=宋体]个细胞[/font][font=Calibri]/[/font][font=宋体]孔。细胞培养至覆盖[/font][font=Calibri]0[/font][font=宋体]％～[/font][font=Calibri]20[/font][font=宋体]％孔底时，吸取培养上清用[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]检测抗体含量。首先依抗体的分泌情况筛选出高抗体分泌孔，将孔中细胞再行克隆化，尔后进行抗原特异的[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]测定，选高分泌特异性细胞株扩大培养或冻存。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]5[/font][font=宋体]、单克隆抗体的制备和冻存[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]筛选出的阳性细胞株应及早进行抗体制备，因为融合细胞随培养时间延长，发生污染、染包体丢失和细胞死亡的机率增加。抗体制备有两种方法。一是增量培养法，即将杂交瘤细胞在体外培养，在培养液中分离单克隆抗体。该法需用特殊的仪器设备，一般应用无血清培养基，以利于单克隆抗体的浓缩和纯化。最普遍采用的是小鼠腹腔接种法。选用[/font][font=Calibri]BALB/c[/font][font=宋体]小鼠或其亲代小鼠，先用降植烷或液体石蜡行小鼠腹腔注射，一周后将杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中去。通常在接种一周后即有明显的腹水产生，每只小鼠可收集[/font][font=Calibri]5[/font][font=宋体]～[/font][font=Calibri]10ml[/font][font=宋体]的腹水，有时甚至超过[/font][font=Calibri]40ml[/font][font=宋体]。该法制备的腹水抗体含量高，每毫升可达数毫克甚至数十毫克水平。此外，腹水中的杂蛋白也较少，便于抗体的纯化。接种细胞的数量应适当，一般为[/font][font=Calibri]5[/font][font=宋体]×[/font][font=Calibri]105/[/font][font=宋体]鼠，可根据腹水生长情况适当增减。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]选出的阳性细胞株应及早冻存。冻存的温度越低越好，冻存于液氮的细胞株活性仅有轻微的降低，而冻存在－[/font][font=Calibri]70[/font][font=宋体]℃冰箱则活性改变较快。细胞不同于菌种，冻存过程中需格外小心。二甲亚砜（[/font][font=Calibri]DMSO[/font][font=宋体]）是普遍应用的冻存保护剂。冻存细胞复苏后的活性多在[/font][font=Calibri]50[/font][font=宋体]％～[/font][font=Calibri]95[/font][font=宋体]％之间。如果低于[/font][font=Calibri]50[/font][font=宋体]％，则说明冻存复苏过程有问题[/font][font=Calibri].[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]6[/font][font=宋体]、单克隆抗体的纯化[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]单克隆抗体的纯化方法同多克隆抗体的纯化，腹水特异性抗体的浓度较抗血清中的多克隆抗体高，纯化效果好。按所要求的纯度不同采用相应的纯化方法。一般采用盐析、凝胶过滤和离子交换层析等步骤达到纯化目的，也有采用较简单的酸沉淀方法。目前最有效的单克隆抗体纯化方法为亲和纯化法，多用葡萄球菌[/font][font=Calibri]A[/font][font=宋体]蛋白或抗小鼠球蛋白抗体与载体（最常用[/font][font=Calibri]Sepharose[/font][font=宋体]）交联，制备亲和层析柱将抗体结合后洗脱，回收率可达[/font][font=Calibri]90[/font][font=宋体]％以上。蛋白可与[/font][font=Calibri]IgG1[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]IgG2a[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]IgG2b[/font][font=宋体]和[/font][font=Calibri]IgG3[/font][font=宋体]结合，同时还结合少量的[/font][font=Calibri]IgM[/font][font=宋体]。洗脱液中的抗体浓度可用紫外光吸收法粗测，小鼠[/font][font=Calibri]IgG[/font][font=宋体]单克隆抗体溶液在[/font][font=Calibri]A280nm[/font][font=宋体]时，[/font][font=Calibri]1.44[/font][font=宋体]（吸光单位）相当于[/font][font=Calibri]1mg/ml[/font][font=宋体]。经低[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]洗脱后在收集管内预置中和液或速加中和液对保持纯化抗体的活性至关重要。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]详情可以关注：[url=https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/mab-purification][b]单克隆抗体纯化[/b][/url][/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/mab-purification[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font]

10多年来，干细胞疗法一直被认为能够给那些遭受遗传和退行性疾病折磨的人带来希望。而就在几天前，随着两个研究团队在于日本横滨召开的国际干细胞研究学会（ISSCR）年会上宣告了他们在人类临床研究中取得的成果——一项聚焦于罕见的遗传神经病，另一项则着眼于老年人的视力丧失，这一希望又朝着现实迈出了一步。　　美国加利福尼亚州纽瓦克市干细胞公司报告了用人体神经干细胞治疗梅氏病（PMD）所取得的鼓舞人心的研究成果。PMD是一种渐进式的致命疾病，该病通过基因突变抑制了髓鞘的正常生长，后者是大脑中包裹神经纤维的一种保护物质。缺乏髓鞘，神经信号便会流失；病人，通常是婴儿，便会经历运动协调能力退化以及其他神经病症状。据干细胞公司负责研究的副总裁Ann Tsukamoto介绍，该公司之所以选择PMD来测试其神经干细胞技术，缘于目前尚没有这种疾病的治疗方法，且通过基因检测和磁共振成像能够确诊这种疾病。她说：“这便为最有效的早期介入创造了一个机会。”　　该公司建立了一个从成熟神经组织中分离出的高度纯化的神经干细胞库。研究人员将这些神经干细胞注入啮齿动物体内后，它们并没有形成肿瘤，事实上，这些细胞在小鼠的大脑中游走，并分化成不同类型的神经细胞，其中就包括分泌能够保护神经纤维的髓鞘的细胞。Tsukamoto介绍说，当神经干细胞被注入小鼠后，它们表现出了“强大的移植和迁移能力，并形成新的髓鞘”。　　该公司如今正赞助对4名PMD婴幼儿患者进行该技术的初期安全试验。加利福尼亚大学旧金山分校的研究人员，向每位患者大脑中的4个区域中的每一个区域移植了7500万个神经干细胞，并随之进行了免疫抑制治疗，这样受体才不会排斥外来的细胞。Tsukamoto报告说，在试验过程中并没有出现安全隐患。此外，在18个月后进行的磁共振成像显示，在轴突周围形成了新的髓鞘，并且对患者进行的临床观察表明，他们的运动机能保持稳定或出现了小幅提升。干细胞公司如今正计划进行更大规模的试验。Tsukamoto表示，一旦这种疗法被证明是有效的，它将带来多发性硬化、大脑性麻痹和阿尔茨海默氏症的神经干细胞新疗法。　　在这次会议上，神户市日本理化研究所（RIKEN）发育生物学中心的干细胞研究人员Masayo Takahashi，报告了她的研究小组在针对与年龄相关的黄斑变性（AMD）的临床前研究所取得的进展。在AMD中，视网膜色素上皮（RPE）细胞的生长出现了问题，并且位于视网膜下部的血管出现了渗漏。这些情况导致眼睛中心部位的视力下降。Takahashi的研究小组研制出一种方法，即用外科手术摘除有问题的血管，同时用源自病人自身细胞的新RPE细胞替代受损的RPE细胞。利用被称为细胞再编程的一项技术，研究人员采集了病人的皮肤细胞，并将其转化为所谓的诱导多能干（iPS）细胞，这种细胞能够分化成人体中的所有细胞。研究人员随后将iPS细胞转化为RPE细胞。由于iPS方法使用的是病人自身的细胞，因此避免了对免疫抑制药物的需求。　　由Takahashi小组生成的RPE细胞表现出了真正人体RPE细胞的特征结构和基因表达模式。她报告说，将它们注入小鼠并没有引发肿瘤，并且这些细胞在移植到猴子体内后存活了6个多月。Takahashi希望在得到必要的批准后，能够在1年内开展人体试验。　　英国剑桥研究学院癌症中心的干细胞研究人员Fiona Watt指出，在ISSCR上发表的这些研究结果将帮助该领域“积攒力量”。而美国哈佛医学院的干细胞科学家George Daley则更为乐观。他说，记住这次年会上报告的这些进展；并表示对明年在波士顿召开的2013年ISSCR年会充满期待。

1、 选取7~8周龄雌性小鼠，阴道口封闭，作为供体，下午3:00左右，每只小鼠腹腔注射PMSG（10 IU）。2、 47~48小时后，每只小鼠腹腔注射HCG（0.8 IU），并与正常公鼠合笼；另取数只适龄母鼠（2月龄以上）作为受体，阴道口潮红，与结扎公鼠合笼。3、第二天上午9:00前观察供体、受体，有精栓者拿出备用。受体笼拿出作好隔离措施。4、10:30左右，断颈处死供体，手术取出整个输卵管，放入透明质酸酶~0.3mg/M2液中。显微镜下，用镊子撕开输卵管壶腹部，受精卵随同颗粒细胞即一同流出。5、仔细观察放在透明质酸酶M2液中的受精卵，当受精卵周围的颗粒细胞脱离时，将受精卵吸出，放入M2液中洗涤，最后放在M16液中放入5% CO2，37C0培养箱培养。6、在显微镜下观察，挑选细胞饱满，透明带清晰，雄原核清晰可见的受精卵待用。7、安装持卵针和注射针，使其末端平行于载物台，在凹玻片的中央滴入一滴M2液，覆盖石蜡油，移入待注射的受精卵。DNA在注射针中的气泡应在先前全部弹走。8、在高倍镜下，将注射针轻触持卵管，使DNA缓慢流出并控制其流量；反复吹吸受精卵，使其处于最佳位置，将注射针刺入受精卵的雄原核，直至看到原核膨大即退出。将注射过的和未注射过的受精卵上下分开放置，不致于混搅，注射完毕后，放入5% CO2，37C0培养箱培养。9、将受体麻醉，注射计量为1%戊巴比妥钠0.01ml/g，腹腔注射。手术取出卵巢连接输卵管，用脂肪镊固定，在显微镜下找到输卵管开口。吸取注射后经培养成活的受精卵，吸取方法是先吸一段较长的M2，吸一个气泡，然后吸取受精卵，尽量紧密排列，再吸一段液体，吸一个气泡，再吸一段液体，共四段液体三个气泡。除较长的那段液体，其余的液体大致1cm左右，气泡0.2cm左右。将移植管口插入输卵管口，轻轻将移植管内的液体吹入，看到输卵管壶腹部膨大并清晰地看到三个气泡，即移植成功。将卵巢连同输卵管放回腹腔，缝合肌肉和皮肤。10、受体每隔一个星期称体重一次，当第二次比第一次称重增加时，即可初步判断怀孕。手术后19~21天仔鼠分娩，待仔鼠3周后，剪耳、编号，剪尾，交分子组检测。(一般选取4-5周龄的雌鼠作为供体，此时的小鼠卵数较多，状态较好。用pms诱导卵细胞成熟，用hcg超排。)

新华社华盛顿7月6日电（记者任海军）据美国新一期《细胞－干细胞》杂志报道，加拿大研究人员对小鼠进行的研究显示，常用Ⅱ型糖尿病药物二甲双胍能促进脑细胞分裂及新细胞形成。这项研究表明，二甲双胍将来有望用于治疗阿尔茨海默氏症等疾病。 二甲双胍的主要靶点是糖尿病患者肝细胞内的一个特殊通道。加拿大分子遗传学家弗雷达·米勒等研究人员发现，二甲双胍也能激活实验鼠脑细胞中的同样通道，促进新的脑细胞生长。 对在实验室培养皿中培养的人类脑细胞而言，这一结论同样成立。米勒表示，新生的脑细胞能修复阿尔茨海默氏症等神经退行性疾病给大脑带来的不利影响。 2008年曾有研究显示，同时患糖尿病和阿尔茨海默氏症的人如果服用二甲双胍，其阿尔茨海默氏症的症状有所改善。当时科学家认为，其机制可能在于二甲双胍治疗糖尿病时改善了患者的身体状况，这有助于改善阿尔茨海默氏症症状。 米勒认为，他们的新研究表明，二甲双胍本身就有改善脑功能的作用。目前，加拿大研究人员已着手开展二甲双胍治疗神经退行性疾病的临床试验。 二甲双胍是一种具有长期用药安全记录的药品。此前曾有研究显示，二甲双胍可抑制肺部和乳腺肿瘤的生长，降低糖尿病患者患乳腺癌的风险。

自去年10月开始，分子生物学家Katsuhiko Hayashi就陆陆续续收到了许多夫妻的邮件，这些夫妻大多人到中年，仍然在为了一件事情焦急：要一个孩子。其中有一位英国的更年期妇女，希望到他位于日本京都大学的实验室，在他的帮助下怀上孩子，她写道：“这是我唯一的愿望。”这些请求开始于Hayashi一篇文章的发表——他原以为只有发育生物学家才会对他的实验结果感兴趣。在体外条件下，利用小鼠的皮肤细胞创造可以发育成精子和卵子的原始生殖细胞（PGCs）。为了证明这些实验室培养的原始生殖细胞与自然发育而成的原始生殖细胞类似，他利用它们生成了卵子，进而创造小鼠生命。他表示，这个创造出来的小鼠生命仅仅是他研究的一个“副产品”，他的研究将意味着更多——利用不孕妇女的皮肤细胞为她们提供可受精的卵细胞。与此同时他还提出，男性的皮肤细胞也可以用来创造卵子，同样，女性的皮肤细胞也可以生成精子。（事实上，研究结果发表后，许多同性恋发邮件给Hayashi ，索要更多的信息。）尽管这是一项创新研究，但是公众的广泛关注还是令Hayashi和他的教授Mitinori Saitou感到非常惊讶。他们花了十多年不断挖掘哺乳动物配子产生的微妙细节，然后在体外条件下重新创建该过程——一切都是为了科研，而非医疗。现在他们的方法使研究人员能够创建无限的原始生殖细胞，这种在以前很难获得的珍贵细胞的正常供应有助于推动哺乳动物生殖研究。但是，当他们将这个科学挑战自小鼠到猴子，再到人类推进时，这一过程被公众定义为治疗不孕不育的过程，于是相关的道德争议随之出现。“毫无疑问，他们在小鼠身上给这一领域带来了重大的改变，” 洛杉矶加州大学的生育专家Amander Clark说，“但是，在这项技术展示它的实用性之前，我们必须讨论一下使用这种方式创造配子的伦理问题。”回到最初在小鼠体内，胚胎发育一周后，便出现约40个左右的原始生殖细胞。这个小小的细胞团进而在雌性小鼠体内形成成千上万的卵细胞，在雄性小鼠体内每天都能生成几百万个精细胞，并能够遗传小鼠的全套遗传信息。Saitou想要了解在这些细胞发育过程中受到了那些信号的控制。在过去的十年中，Saitou已经通过辛苦研究确定了几个基因——包括Stella, Blimp1 和Prdm14 ——这些基因的某种组合在某些时候对于PGCs的发育起到了至关重要的作用。利用这些基因作为标记，可以从其他细胞中筛选原始生殖细胞以观察这些细胞的变化。2009年，在日本神户的RIKEN发育生物学中心，他发现，当培养条件适当时，在精确的时间加入骨形态发生蛋白4（BMP4），可以胚胎干细胞转化为原始生殖细胞的。为了验证这一发现，他向胚胎干细胞提供高浓度的BMP4，结果显示，几乎所有的胚胎干细胞都变成了PGCs。他和科学家们都预计这一过程非常复杂。http://www.ibioo.com/data/attachment/portal/201308/25/095620gaqefeejnqejxuu3.jpg人造小鼠生殖细胞产生小鼠胚胎的过程（点击图片查看大图）Saitou的方法严格遵循了自然过程，这与其他从事类似研究的人形成了鲜明的对比，以色列魏茨曼科学研究所的干细胞专家Jacob Hanna说。许多科学家尝试通过信号分子轰击干细胞在体外创造特定类型的细胞，然后筛选细胞混合物得到他们想要的细胞。但是他们忽略了这些细胞的自然形成过程和这些人造细胞与自然形成细胞的相似程度。Saitou找出了形成生殖细胞所需的条件，去除多余的信号干扰并将每个过程的时间精确控制，给他的同事们留下了深刻的印象。英国谢菲尔德大学的干细胞生物学家Harry Moore将这种生殖细胞发育的精确重现视为一场“胜利”。到了2009年， Saitou在小鼠生殖细胞出现之前从外胚层取了一些细胞，这成了研究的起点。但是想要真正掌握这个过程中，Saitou希望从细胞培养开始。当时正值Hayashi从英国剑桥大学回到日本，和Saitou一样，Hayashi在该领域先驱Azim Surani英国的实验室里完成了4年的研究。Surani盛赞这两位科学家说，他们的“气质、风格和解决问题的方法能够相互补充”。 Saitou “处理事情时很有系统性、完成目标一心一意”，而Hayashi“工作时更有直觉、视角更广阔、处理问题方法相对更加宽松”，他说。“他们确实形成了一个非常强大的团队。”Hayashi加入了Saitou京都大学的团队，他很快就发现，那里不同于剑桥。在京都大学，Hayashi用在理论讨论上的时间比曾经少得多，而更多的时间都花在实验上。他说“在日本，我们只管‘做’，这有时是非常低效的，但有时又酝酿着巨大的成功”。Hayashi同样以外胚层细胞作为起点，但与Saitou不同的是，他试图培养一个能够产生原始生殖细胞的稳定细胞系。可惜这种方法没有奏效。Hayashi借鉴其他研究结果——一个关键调控分子(activin A)和生长因子（bFGF）可以将培养的早期胚胎干细胞转化成类似于外胚层细胞的细胞类型。这引发了Hayashi将这两个因素结合起来的想法，诱导胚胎干细胞分化为外胚层，然后采用Saitou之前的方法把这些细胞成为的PGCs。通过这种新的方法，他最终获得了成功。为了证明这些人造的原始生殖细胞是真实的拷贝，他们必须证明这些细胞可以进一步发育成精子和卵子。这一进程是非常复杂和难以理解的。所以研究小组将这一工作留给了自然——Hayashi将PGCs植入无法产生精子的小鼠的睾丸，观察这些细胞是否会发育。Saitou认为，这是可行的，但还是感到有些担忧。当实验进行到第3或4只小鼠时，他们发现小鼠的输精管里充满了精子。“这一切都发生得恰如其分，我知道他们会产生幼仔，”Hayashi说。研究小组将这些精子注入卵细胞中并植入雌性小鼠的胚胎，结果产生了大量的雌性和雄性后代。他们利用诱导多能干细胞（iPS）进行反复的实验，成熟的细胞被重新编程为胚胎状态。此外，精子被用于生产幼仔，证明它们具有基本功能——这是干细胞分化领域的罕见成就。Clark说：“这是整个多能性干细胞研究领域里在培养皿中生成全功能细胞类型少有的成功案例之一。”他们预计形成卵细胞更复杂，但是在去年，Hayashi在体外条件下制作有正常着色的原始生殖细胞并转入白化小鼠的卵巢，将产生的卵细胞体外受精后植入代孕。当透过幼崽半透明的眼睑看到黑色的眼睛时，他知道这一切又成功了。生殖细胞的回馈目前，许多研究人员已经能够复制验室培养原始生殖细胞的过程。人造原始生殖细胞特定用于表观遗传学研究：通过修饰DNA确定哪些基因表达。最常见的修饰就是为DNA碱基加上甲基，这些修饰在有些情况下，能够反映生物所经历的历史过程。与其它类型的细胞类似，表观遗传标记改变了原始生殖细胞在胚胎发育过程中的命运，但原始生殖细胞有个与众不同的特点，就是当它们发育成精子和卵子后，表观遗传标记被擦除。这就允许细胞创建能够形成任何类型细胞的受精卵。表观遗传微妙变化中出现错误将会导致不孕不育并出现器官故障，如如睾丸癌。Surani和Hanna的团队已经利用人造原始生殖细胞研究不同酶在表观遗传调控中的作用，也许有一天，能够解答表观遗传网络如何参与疾病调控。事实上，体外产生的原始生殖细胞可以为研究提供数百万个细胞，而不是供科学家研究了40个左右，这些细胞可以通过解剖早期胚胎获得。Hanna说：“这是一个大问题，因为我们这里有这些稀有的原始生殖细胞正在经历我们尚不了解的全基因组表观遗传变化。”“体外模型为科学家们提供了前所未有的方便，” Clark表示认同。临床意义但是Hayashi和Saitou没有办法向乞求帮助的不孕夫妻提供帮助。在这种方法被运用在临床之前，还有许多问题需要梳理。Saitou和Hayashi发现，虽然运用他们的技术所产生的后代通常似乎是健康和大量的，但这些后代产生的原始生殖细胞并生不完全“正常”。 第二代原始生殖细胞产生的卵细胞往往是脆弱、畸形的，并且从支持它们生长的组织上脱离。当受精时，卵细胞内部会分为三组染色体，而不是正常的两组，体外受精的成功率也只有正常原始生殖细胞的三分之一。哈佛医学院从事表观遗传学研究的Yi Zhang，使用Saitou的方法在研究中发现，体外受精过程中，人造的原始生殖细胞不能像自然状态下产生的原始生殖细胞一样，抹去它们的表观遗传标记。“我们必须要知道，这些都是PGCs的类似细胞，而不是真正的原始生殖细胞，”他说。此外，这项技术还存在两个大的挑战。首先是在不将PGCs放回睾丸或卵巢的前提下买入和使它们变成成熟的精子和卵子，Hayashi目前正在试图破解PGCs生成卵子或精子的生物信号，使人工培育条件下完成这一阶段成为可能。但最可怕的挑战是在人体重复上述所有的工作。该小组已经在利用Saitou找到的关键调控基因来调整人类的iPS细胞，但是Saitou 和Hayashi都知道，人类的信息调控网络不同于小鼠。此外，Saitou有无数的小鼠胚胎进行解剖，但无法在人类胚胎进行

日本理化学研究所（REKIN）的小保方晴子等人 2014 年年初在《自然》上发表了两篇干细胞研究领域的重磅论文，但很快被质疑其研究存在学术不端。日本理化学研究所和《自然》（Nature）随后分别展开调查。日本理化学研究所在 4 月 1 日认定小保方晴子篡改及捏造实验数据。但目前对于该研究的争议还有一个关键性的问题尚未解决：小保方晴子等人在研究中观察到的现象究竟存在吗？或者说 STAP 真的存在吗？日本媒体 6 月 3 日发表的报道称，在对 STAP 实验中用到的细胞进行了基因检测后，结果显示，不存在。根据小保方晴子等人的研究结果，对体细胞进行简单的酸浴刺激，或者施加物理应激，就可以得到 STAP 细胞。这些细胞具有和胚胎干细胞相同的特性。对这些细胞进行进一步操作后，它们也可以形成可自我更新的干细胞系，这就是 STAP 干细胞，它们具有和胚胎干细胞系几乎相同的特性。之前《自然》上发表的论文中报告称，小保方晴子所在的实验室共创建了 8 个 STAP 干细胞系。今年3月，论文合作者之一、山梨大学的若山照彦曾要求文章的第一作者向其提供用某一品系的小鼠细胞制备的 STAP 细胞，但当若山照彦对细胞进行了简单的遗传分析后发现，文章的第一作者小保方晴子给他的干细胞，是由其他品系的小鼠细胞制备的。这表明这些细胞可能受到了污染。但是若山照彦并没有发现《自然》发表的论文中提到的 STAP 干细胞系存在问题。为了验证他的结论，若山照彦将 20 个干细胞系（包括论文中提到的 8 个），寄送给了一家匿名的独立遗传分析小组进行检测。根据日媒援引多方信源的报道，这次检测的结果已经送回理研。检测结果显示，所有 STAP 干细胞系都与论文声称的小鼠品系不符，这一结果对 STAP 现象是否存在提出了质疑。若山照彦表示，他将尽快召开媒体发布会公布相关检测细节。另据报道，日本理化所将有可能支持小保方晴子继续研究工作，设法重演STAP结果。

干细胞使与衰老有关的肌无力的速度放缓 在小鼠中的一则新的研究报告指出，用干细胞来增加年轻的肌肉可减缓与年龄老化相关的肌无力的进程。 这些发现可能会导致再生性肌肉疗法的出现，这种疗法也许会对罹患肌营养不良症的病人或是那些虚弱的老年人有帮助。 文章的作者提出，如果科学家们能够发现可刺激肌肉中干细胞的小分子或分子组合（这可能会比将干细胞移植到人体内要更容易些），那么这些分子可被用于增进肌肉修复或减少肌肉丧失。 在成年期，损伤后或疾病后肌肉再生主要是靠卫星细胞，这是一种会分裂并参与修复、重新恢复活力和控制骨骼肌组织的干细胞，它可通过发育成为肌肉细胞而令肌肉生长。 Bradley Olwin及其同事在这里利用了干细胞的能力并防止了在幼小的小鼠中某一单一肌肉的与年龄老化有关的消瘦。 在该研究中，研究人员将少数的干细胞移植到肌肉受伤的幼小小鼠体内。 该研究小组在两年后对这些小鼠进行检查时发现，这种手术永久性地改变了移植的细胞，使得它们能够抵抗肌肉中的老化过程。 明确地说，这些移植的细胞能够控制它们所在的肌肉并与肌肉融合以形成新的肌肉纤维。 尽管人们对这一过程的机制还不了解，但这些发现提示，通过模仿这些移植的干细胞的功效，科学家们也许能够防止肌肉功能和重量的丧失，而这些通常是在人类老化时出现的情况。

[size=14px] [/size] [size=14px]造血干细胞（HSC）是维持血液和免疫系统健康的重要基础。在机体衰老过程中，HSC功能随之退化，表现出重建造血能力下降以及谱系分化异常，是衰老的十二大特征之一。寻找能有效改善HSC衰老的药物，对于延缓衰老助力健康老龄化具有极其重要的意义。何首乌是传统补益精血、延缓衰老的著名中药，王伽伯团队前期研究表明其所含主要成分反式二苯乙烯苷（TSG）安全性良好，不会引起肝损伤，且根据文献可知TSG可通过清除自由基、调节脂质代谢紊乱及保护神经等方式发挥良好的抗衰老作用，但其在改善HSC衰老及增强衰老机体造血免疫功能方面的活性及机制尚未有报道。[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]著名抗衰老中药何首乌的主要成分反式二苯乙烯苷（TSG）具有最显著的改善造血干/祖细胞衰老的作用。机制上，TSG通过直接结合并激活能量感受器AMPK增强衰老造血干/祖细胞再生功能，并通过AMPK介导的Tet2表观遗传调控促进HSC向淋系细胞分化，部分改善HSC的髓系分化偏移。这项研究开辟了一条通过激活AMPK来减缓 HSC 衰老的途径，并肯定TSG是一种非常有前途的候选者，可以作为天然AMPK激活剂，用于开发抗衰老药物。[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]Highlights[/size] [size=14px]1）首先测试了9种选定的药物对全身辐射（TBI）小鼠造血系统过早衰老的影响；[/size] [size=14px]2）何首乌主要活性成分TSG被成功鉴定为衰老HSC的有效再生剂；[/size] [size=14px]3）TSG治疗增加2种衰老小鼠中共同淋巴祖细胞CLP及其B淋巴细胞的数量；[/size] [size=14px]4）TSG 治疗增强衰老小鼠的HSC/CLP增殖潜力，且无明显副作用；[/size] [size=14px]5）TSG可通过AMPK-Tet2轴恢复再生能力的丧失和淋巴细胞生成的下降。[/size] [size=14px]研究结果[/size] [size=14px]1、筛选能够使衰老的HSC恢复活力的化合物[/size] [size=14px]作者首先基于文献及临床试验调研，确定9种源自抗衰老中药的天然产物，这9种天然产物是经过精心挑选的来自9个不同中药配方的化合物，已知对人类造血具有高度有益的作用。随后利用辐射诱导（TBI）的早衰小鼠模型筛选，结果发现何首乌TSG不仅展现出最显著的改善HSC衰老作用，并诱导骨髓淋系祖细胞（CLP）以及下游的各发育阶段B细胞和不同类型T细胞数目显著增加，恢复到接近正常对照组的水平。[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]2、TSG 恢复自然衰老的 HSC活力且无任何明显副作用[/size] [size=14px]进一步作者评估TSG是否也可以使自然衰老小鼠中老化的HSC恢复活力。结果证实TSG能够显著提高骨髓中CLP和B细胞、胸腺T细胞各发育阶段绝对数目及外周血中淋系细胞比例，将老龄小鼠恢复到接近年轻小鼠的水平，TSG 治疗并没有以任何显著的方式改变体重、外周血细胞、血液化学和肝脏的组织学特征。[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]3、TSG可以增强衰老HSC的再生潜力[/size] [size=14px]老化的HSC 会显著降低再生潜力，作者随后检查了TSG是否可以增强衰老小鼠中HSC的增殖能力，通过HSC和CLP移植实验结果的两组实验数据表明，显示用TSG治疗衰老小鼠可显著增强造血干/祖细胞造血的增殖能力。[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]4、TSG诱导显著的转录变化并促进静止特征[/size] [size=14px]作者接着研究了TSG治疗对衰老HSC影响的潜在机制，发现TSG 治疗对CLP增殖和凋亡以及ROS无显著影响，进一步对年轻小鼠、衰老小鼠和TSG治疗的小鼠的HSC进行转录组分析，发现与未治疗的衰老小鼠相比，经TSG治疗的衰老小鼠的HSC转录组表现出与“年轻”HSC类似的转录组特征，转录组分析的结果还表明，TSG处理导致氧化磷酸化（OXPHOS）基因的表达显著减少，但静止相关基因的表达水平增加，这些结果表明TSG 治疗可以通过将衰老的转录组逆转到与年轻 HSC 相似的状态来促进衰老 HSC 的年轻化。此外，TSG可以抑制衰老 HSC的代谢，促进AMPK通路的激活以及向静止状态的转变。[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]5、TSG使衰老 HSC恢复活力的作用依赖于AMPK通路[/size][size=14px]为了进一步验证TSG中AMPK对HSC衰老的再生作用，作者利用特异性AMPK抑制剂（Com C）和AMPK 激活剂（AICAR）来抑制或激活AMPK，探讨TSG对小鼠HSC衰老的影响，发现Com C显著阻断了 TSG 对骨髓中CLP和下游B细胞数量以及衰老小鼠外周血中 B 细胞比例的保护作用，AICAR治疗可以增加骨髓中CLP的数量和/或B细胞和前B细胞的总数，并通过增加 B细胞百分比来纠正外周血的不平衡。这些结果表明TSG主要通过激活AMPK来有效增强HSC功能和淋巴分化。[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]6、TSG可以在体外与 AMPK 发生直接互作[/size] [size=14px]为了进一步研究TSG通过激活AMPK导致HSC衰老的分子机制，作者采用分子对接发现TSG 可以与 AMPKα1β1γ1 和 AMPKα2β1γ1 蛋白的激酶结构域结合，通过SPR实验发现TSG能够以比AMPKα2β1γ1更高的亲和力与AMPKα1β1γ1结合。ADPGlo? 激酶测定发现TSG可激活AMPKα1β1γ1和AMPKα2β1γ1活性。结果表明TSG可以通过与AMPK直接互作来促进AMPK激活。[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]7、TSG可以通过AMPK-Tet2轴逆转衰老 HSC的甲基化谱[/size] [size=14px]表观遗传改变与HSC的表型和功能变化密切相关，Tet2被认为是重要的表观遗传调节因子，在HSC的稳态和分化中发挥着重要作用，而AMPK激活对于维持Tet2稳定性至关重要。因此，作者分析了TSG对AMPK激活和Tet2表达的影响，亚硫酸氢盐测序评估全基因组 DNA 甲基化状态发现衰老小鼠的 LT 整体 DNA 甲基化水平显著增加，TSG治疗衰老小鼠的DNA甲基化水平显著下降，降至与年轻小鼠非常相似的水平。此外，这种效果随着Com C的共同处理而减弱。TSG治疗并没有导致Tet2突变小鼠中CLP和B细胞绝对数量的显著增加，TSG治疗导致8周龄小鼠骨髓LSK的淋巴细胞生成潜力显著增加，并且这种效应被Tet2抑制剂Bobcat339减弱。这些结果表明Tet2作为AMPK激活的下游效应子，促进HSC的淋巴细胞生成潜力，而TSG可以通过影响该AMPK-Tet2轴来促进淋巴细胞生成。[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]该研究筛选了一组源自几种著名中药配方的假定天然抗衰老化合物，并鉴定出TSG作为老化HSC的强效再生剂。TSG是中药何首乌中多酚的天然衍生物，具有多种功效，包括抗氧化、抗炎、抗高脂血症和神经保护以及抗衰老。作者发现TSG治疗不仅大大提高了CLP及其下游B淋巴细胞的绝对数量，而且还通过衰老供体嵌合的快速扩张增强了HSC/CLP的再增殖能力。此外，TSG可以恢复衰老HSC的静止状态，促进表观遗传重编程，通过激活AMPK及其底物Tet2，改变 DNA 甲基化谱，从而控制HSC的命运决定。这项研究开辟了一条通过激活AMPK来减缓 HSC 衰老的途径，并确定TSG是一种非常有前途的候选者，可以作为天然AMPK激活剂用于开发抗衰老药物。[/size]

中国科技网讯 （记者何屹）据每日科学网站2月20日（北京时间）报道，斯坦福大学的科学家开发出一种系统，可以实时观察活鼠大脑活动情况，对研究诸如阿尔茨海默氏症等神经退行性疾病的新治疗手段具有十分重要的作用。该研究发表在近期出版的《自然·神经科学》杂志上。 研究人员首先利用基因疗法令老鼠神经细胞表达绿色荧光蛋白，该蛋白对钙离子敏感。当神经元受到刺激时，细胞内充满钙离子，荧光蛋白被激活，整个细胞会发出明亮的绿色荧光，就像一朵灿烂的绿色小烟花在黑色背景下绽放。随后，研究人员在老鼠大脑负责空间和情景记忆的海马体上方植入一个微型显微镜，显微镜与相机芯片相连，并可将数字图片传送到电脑，在电脑屏幕上显示老鼠大脑活动的实时视频。 海马体对环境非常敏感，在不同的环境下会有不同的细胞响应。当老鼠在实验环境的某个特定区域挠墙时，刺激特定的神经元闪烁绿色荧光。当小鼠流窜到别的区域时，绿色荧光会从某个神经元褪色，转而刺激新的神经元细胞发光。科学家在掌握了小鼠行为和神经元之间的关联后，仅仅通过小鼠脑部荧光闪烁的混乱图景，就能够清楚地了解老鼠究竟位于何处。 该研究小组发现，小鼠神经元的刺激模式十分稳定，实验间隔时间长达一月之后，仍可保持不变。而观察相同的细胞对于了解脑部疾病非常重要。如果某一个特定的神经元在测试时发生功能障碍，表明正常神经元已经死亡或出现神经退化疾病。研究人员就可以利用某些实验性的治疗试剂进行治疗，然后在相同刺激条件下，确定神经元能否恢复功能。 目前这项技术尚不能应用于人类，但小鼠模型是研究人类神经退行性疾病新疗法的一个重要起点，该系统将成为临床前研究评估的一种非常有用的工具。目前研究人员已经成立了一个公司，生产和销售该设备。 总编辑圈点 一般所说的“读脑仪”，通常指对脑意识进行探测和显现的电子设备，譬如测谎仪就算一种读脑设备。但在本文的研究中，“读脑”是为了找出实验对象的行为和神经元之间的关联，再进行医学药理学的分析。与意识探测相同的是，关乎“脑”研究，人类都还只是接触到皮毛，不过，随着近几年新进展的不断出炉，无论是“倾听大脑的思想”，还是将小鼠模型应用于研究人类神经退行性疾病新疗法，相信只是时间问题。 《科技日报》（2013-02-21 一版）

俄亥俄州哥伦布市一项新的研究表明，成熟脑细胞表面的三种特定蛋白量的增加可促使细胞产生新的生长延伸。该研究探讨了小鼠脑神经细胞上的三个相关的受体蛋白：GPR3，GPR6和GPR12。当研究人员增加这三种蛋白的量后，细胞生长延伸比蛋白水平正常时的神经细胞的生长大三倍，延伸速度比对照细胞快4-8倍。俄亥俄州立大学医学中心的项目主持人Yoshinaga Saeki说，“我们的研究结果显示，这三种蛋白可能是用于治疗中风、脑和脊髓损伤及神经退行性疾病的重要靶点。”该研究刊登在4月6日的《生物化学杂志》（Journal of Biological Chemistry）上。 这些蛋白量的增加与神经细胞cAMP内的一种重要的信号分子的水平的增加有关。这个分子在调控神经细胞生长、分化和生存，以及传输神经冲动的轴突再生中起着关键作用。随着哺乳动物神经细胞的成熟，其细胞内的cAMP水平下降，这可以部分解释为什么成熟神经细胞受损的轴突不能再生。神经外科副教授、俄亥俄州州立dardinger神经肿瘤及神经科学实验室主管Saeki声称，“我们的发现为cAMP在轴突生长中起着重要作用这一观点提供了更多证据，并显示出这些受体蛋白可能在调节神经细胞cAMP的产生中起主要作用。” 该研究的第一作者Shigeru Tanaka是Saeki所在实验室的一名博士后研究员。在本项研究中，他与同事从小鼠与大鼠脑组织神经母细胞瘤中取得神经细胞，使之在培养基中生长以了解更多关于这三种蛋白及其调控cAMP生长中的作用。他们向这些细胞中注入三种基因以增加这三种蛋白的含量水平，然后用一种被称为核糖核酸干扰的实验室技术关闭这三种蛋白的产生。上述三个蛋白分子中GPR3在神经细胞中最为丰富，而GPR12刺激神经细胞延伸的作用最强。研究表明，阻断GPR3的产生会大大减慢神经细胞的生长速度，研究者们通过修复GPR3或GPR12的产生扭转了这种效应。三种蛋白质的含量水平高也与较高水平的cAMP有关，同时GPR6和GPR12能增加两倍到三倍的水平。 Saeki说，“总的来说，我们的研究结果显示，这三种蛋白能加快神经细胞的生长即使在抑制分子的存在下也是如此，我们迫切希望能找出可以在临床前中风或脊髓损伤动物模型身上重现此结果的方法。”来源：生物谷