银杏内酯对照品

请教 ：我们现在在做银杏内酯的含量测定方法学，做到进样精密度度时用的是供试品溶液，结果RSD很大有5%-9%，但是用对照品溶液做精密度RSD就小好多在2%以下，用的是蒸发光散射检测器，漂移管温度80度，流速2.2 流动相是正丙醇：四氢呋喃：水=1:15:84 安捷伦色谱柱C18 请教高手帮忙 补充我们的样品是复方制剂，样品处理是参照药典方法银杏提取物中的方法

上次有朋友问到过银杏内酯，不过我们的情况似乎有所不同。我们的标样出峰总是前延得很厉害，即使含量很低也还是这样，不知道和那个帖子里提到的双峰有没有联系。但我们进的样品却没有前延，反而总有点脱尾。上次有朋友提到waters的某根柱子做这个效果不错，但我们这里不太好专门为了做一个样品而买柱子，所以恳请哪位大侠为我们分析一下可能的原因。另：上次我们这里有人做红霉素（大环内酯），结果也是比较奇怪。这只是偶然么？还是内酯类的样品做起来有什么特别需要注意的地方呢？请教。

我想做从银杏黄酮中提取银杏内酯的生产，不知需要哪些设备和仪器?设备投资大约要多少？

[img]http://www.instrument.com.cn/bbs/images/affix.gif[/img][url=http://www.instrument.com.cn/bbs/download.asp?ID=31408]高含量银杏萜内酯富集方法研究[/url]

[size=20px][color=#93c6bc][b]鉴别[/b][/color][/size][size=16px][color=#e2a4a4]｜[/color][/size] [font=宋体][/font] [font=宋体]（1）取本品粉末1g，加40%乙醇10ml，加热回流10分钟，放冷，滤过，取滤液作为供试品溶液。另取银杏叶对照药材1g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法（通则0502）试验，吸取上述两种溶液各6μl，分别点于同一用4%醋酸钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水（5:3:1:1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以3%三氯化铝乙醇溶液，热风吹干，置紫外光灯（365nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光主斑点。[/font] [font=宋体]（2）取本品粉末1g，加50%丙酮溶液40ml，加热回流3小时，滤过，滤液蒸干，残渣加水20ml使溶解，用乙酸乙酯振摇提取2次，每次20ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加15%乙醇5ml使溶解，加入已处理好的聚酰胺柱（30～60目，1g，内径为1cm，用水湿法装柱）上，用5%乙醇40ml洗脱，收集洗脱液，置水浴上蒸去乙醇，水液用乙酸乙酯振摇提取2次，每次20ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加丙酮1ml使溶解，作为供试品溶液。另取银杏内酯A对照品、银杏内酯B对照品、银杏内酯C对照品及白果内酯对照品，加丙酮制成每1ml各含银杏内酯A 0.5mg、银杏内酯B 0.5mg、银杏内酯C 0.5mg、白果内酯1mg的混合溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（通则0502）试验，吸取上述两种溶液各5μ1，分别点于同一用4%醋酸钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-丙酮-甲醇（10:5:5:0.6）为展开剂，在15℃以下展开，取出，晾干，在醋酐蒸气中熏15分钟，在140～160℃中加热30分钟，置紫外光灯（365nm）下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。[/font] [font=宋体][/font][font=宋体][/font] [font=宋体] [/font] [size=20px][color=#93c6bc][b]检查[/b][/color][/size][size=16px][color=#e2a4a4]｜[/color][/size] [font=宋体][/font] [b][font=宋体][/font][/b] [align=left][b][font=宋体][/font][/b][/align] [b][font=宋体]杂质[/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体]不得过2%（通则2301）。[/font] [b][font=宋体]水分 [/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体]不得过12.0%（通则0832第二法）。[/font] [b][font=宋体]总灰分[/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体]不得过10.0%（通则2302）。[/font] [b][font=宋体]酸不溶性灰分 [/font][/b][font=宋体]不得过2.0%（通则2302）。[/font] [b][font=宋体]【浸出物】 [/font][/b][font=宋体]照醇溶性浸出物测定法（通则2201）项下的热浸法测定，用稀乙醇作溶剂，不得少于25.0%。[/font] [b][font=宋体]【含量测定】 总黄酮醇苷[/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体]照高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]法（通则0512）测定。[/font] [b][font=宋体]色谱条件与系统适用性试验 [/font][/b][font=宋体]以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.4%磷酸溶液（50：50）为流动相；检测波长为360nm。理论板数按槲皮素峰计算应不低于2500。[/font] [b][font=宋体]对照品溶液的制备 [/font][/b][font=宋体]取槲皮素对照品、山奈酚对照品、异鼠李素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含槲皮素30μg、山奈酚30μg、异鼠李素20μg的混合溶液，即得。[/font] [b][font=宋体]供试品溶液的制备 [/font][/b][font=宋体]取本品中粉约1g，精密称定，置索氏提取器中，加三氯甲烷回流提取2小时，弃去三氯甲烷液，药渣挥干，加甲醇回流提取4小时，提取液蒸干，残渣加甲醇-25%盐酸溶液（4:1）混合溶液25ml，加热回流30分钟，放冷，转移至50ml量瓶中，并加甲醇至刻度，摇匀，即得。[/font] [b][font=宋体]测定法 [/font][/b][font=宋体]分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱仪[/color][/url]，测定，分别计算槲皮素、山奈酚和异鼠李素的含量，按下式换算成总黄酮醇苷的含量。[/font] [font=宋体]总黄酮醇苷含量=（槲皮素含量+山奈酚含量+异鼠李素含量）×2.51[/font] [font=宋体]本品按干燥品计算，含总黄酮醇苷不得少于0.40%。[/font] [b][font=宋体]萜类内酯[/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体]照高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]法（通则0512）测定。[/font] [b][font=宋体]色谱条件与系统适用性试验 [/font][/b][font=宋体]以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-四氢呋喃-水（25:10:65）为流动相；蒸发光散射检测器检测。理论板数按白果内酯峰计算应不低于3000。[/font] [b][font=宋体]对照品溶液的制备 [/font][/b][font=宋体]取银杏内酯A对照品、银杏内酯B对照品、银杏内酯C对照品、白果内酯对照品适量，精密称定，加50%甲醇制成每1ml含银杏内酯A 0.18mg、银杏内酯B 0.08mg、银杏内酯C 0.10mg、白果内酯0.20mg的混合溶液，即得。[/font] [b][font=宋体]供试品溶液的制备 [/font][/b][font=宋体]取本品中粉约1.5g，精密称定，置索氏提取器中，加石油醚（30～60℃）在70℃水浴上回流提取1小时，弃去石油醚（30～60℃）液，药渣和滤纸筒挥尽石油醚，置于60℃烘箱中烘干，再加甲醇回流提取6小时，提取液蒸干，残渣加甲醇使溶解，转移至10ml量瓶中，超声处理（功率300W，频率50kHZ）30分钟，取出，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，静置，精密量取上清液5ml，加入酸性氧化铝柱（200～300目，3g，内径为1cm，用甲醇湿法装柱）上，用甲醇25ml洗脱，收集洗脱液，回收溶剂至干，残渣用甲醇5ml分次转移至10ml量瓶中，加水约4.5ml，超声处理（功率300W，频率50kHz）30分钟，取出，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，即得。[/font] [b][font=宋体]测定法 [/font][/b][font=宋体]分别精密吸取对照品溶液10μl、20μl，供试品溶液10～20μl，注入[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱仪[/color][/url]，测定，用外标两点法对数方程分别计算银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C和白果内酯的含量，即得。[/font] [font=宋体]本品按干燥品计算，含萜类内酯以银杏内酯A（C[sub]20[/sub]H[sub]24[/sub]O[sub]9[/sub]），银杏内酯B（C[sub]20[/sub]H[sub]24[/sub]O[sub]10[/sub]），银杏内酯C（C[sub]20[/sub]H[sub]24[/sub]O[sub]11[/sub]）和白果内酯（C[sub]15[/sub]H[sub]18[/sub]O[sub]8[/sub]）的总量计，不得少于0.25%。[/font] [align=left][font=宋体][/font][/align] [font=宋体][/font]

我在做银杏叶帖类内酯时出现了问题,跑的时候开始还好好的,但跑了一段时间后,就出现双头峰,或肩峰(就是峰的肩膀出现了点小峰).换了新柱子后,情况还是如此,样品,流动相都没问题.怀疑是柱子跑内酯太久了,里面有强保留物质,有什么方法解决吗????

各位朋友大家好，最近在用药典方法检测银杏内酯时遇到了几个问题，想请大家帮忙解决一下，就是四氢呋喃做流动相，柱压总是一直在走高，最终导致柱子蹦开，起初是用国产的四氢呋喃，后来换用一瓶fisher的四氢呋喃，是不加稳定剂的那种，就不出现压力变化的现象，而且每次用完试剂后，我都是充氮气保存，但是最近情况是有个师妹做实验后忘记充氮气了，现在检测时发现压力有上去了，而且柱子也堵了，请问大家遇到过这种现象吗？怎么解决啊？

[img]http://www.instrument.com.cn/bbs/images/affix.gif[/img][url=http://www.instrument.com.cn/bbs/download.asp?ID=31407]大孔吸附树脂对银杏内酯和白果内酯吸附性能的研究[/url]

[color=#444444]波长选取 220nm 波速选择 1ml/min 但是流动相选择甲醇的话，内酯A B的峰分不开，出峰时间基本上是一样的，求大神指导？需要调什么才能使银杏内酯A B峰分开？[/color]

序号：作者：[b]胡军华[size=12px]1,2[/size]钱频非[size=12px]1,3[/size]于桂芳[size=12px]1,2[/size]王雪[size=12px]1,2[/size]王振中[size=12px]1,[/size][size=12px]题名：[b]银杏二萜内酯葡胺注射液与一次性输液器的相容性考察[/b][/size][b]期刊：中国医药工业杂志[font=&][size=12px][color=#666666]. [/color][/size][/font]2020,51(06)[/b][size=12px][b]全文链接：[url=https://kns.cnki.net/kcms/detail/detail.aspx?dbcode=CJFD&dbname=CJFDLAST2020&filename=ZHOU202006017&uniplatform=NZKPT&v=chmA29uEAKaP8hXH7w2QzZ7RHLPqUTm30v1zTjBgPI9Dp0kJO0_WR1UryB1aND5w]银杏二萜内酯葡胺注射液与一次性输液器的相容性考察 - 中国知网 (cnki.net)[/url][/b][/size][/b]

[color=#333333]HPLC法在做欧前胡素的阴性对照，然后在和欧前胡素对照品溶液出峰时间差半分钟地方出现一个峰，请问各位老师这算有干扰么？[/color]

各位大神，请教一下用高效液相做欧前胡素的阴性对照，然后在和欧前胡素对照品溶液出峰时间差半分钟地方出现一个峰，请问各位老师这算阴性有干扰么？

硝酸铝显色法测银杏提取物总黄酮含量，以芦丁为对照，紫外波长扫描结果显示芦丁对照品在500nm左右有最大吸收峰，而供试品在400-600nm范围内均无最大吸收峰，而是呈上升趋势。特此求助，谢谢！

有没有更好的方法检测银杏内酯，银杏内酯的检测条件？？？

在制定中药制剂的标准中，鉴别、含量测定都必须作阴性对照，各位战友谈谈阴性对照样品通常要求是什么？最终产品？或可以是压片装胶囊之前的颗粒粉末，抑或是所有提取步骤完成后的产品？通常是企业提供？或是也有为做标准自己制备的？

求助，关于银杏叶提取物的总银杏酸含量测定。请问各位有没有做过的，我怎么做了几次都做不出来呢。条件都是按照药典要求做的，对照品都不出峰。我都要疯了。有谁做过帮忙分析一下或者上传一张图谱，谢谢。

大肠埃希氏菌在KF上不生长，作为阴性对照他后续可以不用做么？还是需要用适宜培养基培养后后续实验用。

脑卒中是全球致伤致残致死3大原因之一，据全球疾病负担统计2019年全世界有1 220万人发病[1]，我国有394万人首发[2]；另一统计称2020年我国有340万人首发并有约220万人留下残疾[3-4]。缺血性脑卒中（ischemic stroke，IS）约占卒中类型的85%[4-5]。IS预后结局差，复发率高而且极有可能造成后遗症如偏瘫、后肢痉挛、震颤等。其病理机制也十分复杂，涉及细胞过度自噬、离子失衡与谷氨酸过度释放、氧化应激与自由基、炎症爆发和神经细胞凋亡[5-7]等。 目前治疗IS的主要方法为重组组织型纤溶酶原激活剂（recombinant tissue-type plasminogen activator，rt-PA）静脉溶栓、手术取栓和神经保护。手术风险高，rt-PA治疗时间窗短，且有出血风险，符合治疗条件的病人不到10%[8]，而神经保护的药物在临床上的效果不如动物实验那么有效，目前急需开发更安全可靠的治疗IS的用药。在长期的医学实践中，银杏叶提取物在治疗脑卒中和心肌梗死方面疗效显著[9]。其中，银杏内酯作为天然的血小板活化因子（platelet activating factor，PAF）受体拮抗剂，因其具有抗炎、抗氧化、抗凋亡和神经保护的作用[10-12]而越来越受到关注。 银杏二萜内酯葡胺注射液（Diterpene Ginkgolides Meglumine Injection，DGMI）以银杏叶提取物为原料，主要组成为银杏内酯A（ginkgolide A，GA，35%）、银杏内酯B（GB，60%）、银杏内酯C（GC，2%）、银杏内酯K（GK，2%），含总银杏内酯5 mg/mL[13]，银杏二萜内酯成分达98%以上[14]。临床显示，DGMI可有效改善IS发病90 d时患者的神经缺损评分，同时改善患者认知和行动能力，并且在中老年患者中疗效优于银杏叶提取物注射液（金纳多）[15-18]，Zhao等[15]认为DGMI与rt-PA联用治疗急性卒中效果更佳。最新一项临床研究发现，单独使用DGMI对急性缺血性脑卒中治疗有效[19]。也有多项体内外实验证明DGMI具有改善脑缺血再灌注损伤（cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI）的作用，主要与PAF受体[20]、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）- 蛋白激酶B（protein kinase B，PKB）、核因子-红细胞2相关因子2（nuclear factor-erythroid 2 related factor 2，Nrf2）[13]等通路有关。 黑质为重要的运动和感知调节中枢，是脑内合成多巴胺的主要核团，与背侧基底核、底丘脑构成基底运动环路[21]，可能通过多巴胺能神经与IS引发的震颤等运动障碍相关。为明确DGMI在黑质脑区抗CIRI的作用通路，本研究通过建立小鼠大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型，模拟急性IS时脑内局灶性缺血缺氧的状态，利用转录组测序对小鼠脑样本进行测序，并结合生信分析鉴定DGMI在黑质脑区抗脑缺血损伤的作用通路及功能效应，为深入探索其作用机制提供思路。 1 材料 1.1 动物 SPF级雄性C57BL/6小鼠，6～8周龄，体质量18～22 g，购自南京市江宁区青龙山动物养殖场公司，生产质量合格证SCXK（浙）2019-0002。动物于江苏康缘药业有限公司动物房普通清洁级环境中适应性饲养1周，温度（24±2）℃、12 h光昼交替，自由进食饮水。动物实验经江苏康缘药业有限公司动物委员会批准（批号2023110101）。 1.2 药品与试剂 DGMI（商品名为尤赛金，国药准字z20120024，批号220703）由江苏康缘药业有限公司提供；银杏叶提取物761（Ginkgo biloba extract-761，EGb-761，商品名为金纳多，3.5 mg/mL，国药准字HC20181022，批号P6001）由台湾济生医药生技股份有限公司提供；1800AA型小鼠硅胶线栓购自广州佳灵生物有限公司；舒泰50（货号BN8G4VA）购自法国维克公司；2,3,5-氯化三苯基四氮唑（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC，批号BCCJ6488）购自美国Sigma公司；RNA提取试剂盒（批号AM90890A）购自日本Takara公司；Qubit RNA BR Assay kit（批号2506001）、Qubit 1X dsDNA HS assay kit（批号2483579）购自美国Invitrogen公司；Illumina Poly(A) Capture（批号20733163）、Illumina RNA Prep Ligation（批号20723247）、IDT for Illumina RNA Index Anchors（批号20717954）、IDT for Illumina DNA/RNA UD Indexes（批号20739487）、NextSeqTM 2000 P3 300循环试剂盒（批号20751014）购自美国Illumina公司；RNA Screen Tape（批号02020849-192）、RNA Screen Tape缓冲液（批号0006698095）、D1000 Screen Tape（批号0202853-39）、D1000试剂（批号0006739609）购自美国Agilent公司。 1.3 仪器 DOM-1001型显微镜、RFLSI ZW型激光散斑血流成像系统（深圳市瑞沃德生命科技有限公司）；PY-SM5（LCD）型LCD高精度智能温控器（余姚市品益电器有限公司）；NanoDrop分光光度计（美国Thermo Fisher Scientific公司）；4150型TapeStation自动化电泳系统（美国Agilent公司）；Qubit 4.0型核酸定量仪（美国Invitrogen公司）；NextSeqTM 2000型测序仪（美国Illumina公司）。 2 方法 2.1 动物分组、造模及给药 小鼠适应性饲养5 d后，随机分为假手术组、模型组、DGMI（25 mg/kg）组及EGb-761（100 mg/kg）组，为确保各组术后存活10只小鼠，假手术组设置10只，模型组设置16只，EGb-761组和DGMI组设置14只。 小鼠ip舒泰50麻醉后，参照LONGA法[22]复制MCAO模型。用线栓阻塞小鼠大脑中动脉血流，缺血1 h时，拔出线栓恢复血流，进行再灌注，并结扎颈外动脉剪口。假手术组小鼠进行颈动脉暴露处理，但不插入栓线。手术过程室温控制在（26±1）℃，术后使用加热垫等设备维持小鼠体温保持37 ℃。线栓进入后，将小鼠俯卧位固定，纵向剪开头皮，充分暴露颅骨，置于激光散斑血流成像系统下进行血流检测，确保造模成功。采用RFLSI Analysis v2.0.29.26606软件分析数据，在缺血侧及对侧一致位置添加相同的区域，得到脑血流量统计结果。对造模小鼠进行筛选，排除造模不成功、大出血、蛛网膜出血及过早死亡的小鼠，最终纳入统计的共有40只小鼠，每组分别10只。 基于本课题组预实验结果，DGMI对小鼠MCAO模型术后24 h脑梗死面积改善程度的最佳剂量为25 mg/kg。因此，本研究采用25 mg/kg剂量开展DGMI的药效评价。DGMI组术后30 min ip药物（DGMI以生理盐水将稀释成2.5 mg/mL的溶液），EGb-761组术前1 h ip药物，假手术组和模型组ip等体积生理盐水。 2.2 神经功能评分与脑组织TTC染色 小鼠再灌注24 h后进行改良版神经功能缺损评分（modified neurological severity score，mNSS）[23]。评分后取血，迅速取脑组织，?20 ℃冰箱中冷冻15 min，随后将冷冻后的脑组织切成厚度为2 mm的冠状切片共6片，使用2% TTC染液于37 ℃恒温水浴锅中避光染色10 min，用4%多聚甲醛溶液对脑片进行固定，24 h后拍照。使用Image-Pro Plus 6.0软件计算脑梗死面积。 脑梗死面积＝白色缺血面积/总面积 2.3 脑黑质RNA提取和转录组测序 取小鼠脑黑质，每组4个样本，经高速冷冻研磨机粉碎成匀浆后，按照RNA提取试剂盒说明书提取RNA。经过RNA质量控制后，筛选3个符合条件的样品，按照Illumina文库制备体系，完成文库的构建稀释与上机测序。 2.4 转录组数据分析 2.4.1 转录组数据处理与质量分析 利用Trimmomatic[24]软件对测序数据进行滤过，获取高质量的数据信息，直接从基因组网站下载参考基因组和基因模型注释文件，使用HISAT2[25]和String Tie[26]软件将clean reads与参照基因组进行比对和拼接。 2.4.2 降维分析与模型评价 将各组数据进行降维分析，主要分为主成分分析和tSNE降维分析，比较各组离散程度。 2.4.3 差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）筛选 采用DESeq[27]软件包对各组细胞的基因表达量进行差异分析，模型组DEGs以模型组vs假手术组筛选，给药组DEGs以给药组vs模型组筛选，筛选标准为|log2差异倍数（fold change，FC）|≥2且Padjust≤0.05。 2.4.4 基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA） GSEA通路富集分析不局限于某些目标基因集，而是从所有基因的表达丰度出发，分析在不同的通路中的基因的整体表达影响，理论上更容易囊括细微但协调性的变化对生物通路的影响。参照徐小波等[28]研究，计算药物干预后表达趋势逆转的通路数与模型组特征通路总数的比值（响应值），并评价药物抗脑缺血再损伤的能力。 2.4.5 基因本体（gene ontology，GO）功能及京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析 运用R语言limma[29]软件包对差异基因进行GO功能和KEGG通路富集分析，并用R语言将相关信息可视化。GO功能包括生物学过程（biological process，BP）、细胞组分（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）。使用超几何检验进行富集分析。FDR校正的P≤0.05被认为显著富集。 2.5 qRT-[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]验证关键基因表达 按照试剂盒说明书提取脑黑质中总RNA并合成cDNA，进行qRT-[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]分析。采用2?ΔΔCt法计算相关关键基因表达。溶质载体家族6成员A3（solute carrier family 18 member A3，Slc6a3）、钙调蛋白样4（calmodulin like 4，Calml4）、G蛋白亚基γ14（G protein subunit gamma 14，Gng14）、C-C基序趋化因子2（C-C motif chemokine ligand 2，Ccl2）、色氨酸羟化酶2（tryptophan hydroxylase 2，Tph2）、C-X-C趋化因子1（C-X-C motif chemokine ligand 1，Cxcl1）、β-actin引物序列见表1。 图片 2.6 统计学分析 实验结果使用Graghpad prism 9.0软件进行统计分析。两组间比较采用独立样本t检验，组间多重比较采用单因素方差分析（One way ANOVA）和Dunnett-t检验，数据以表示。 3 结果 3.1 脑血流成像结果 通过脑血流仪监测小鼠脑皮质血流量变化，如图1和表2所示，发现插入线栓缺血时，与假手术组比较，各组小鼠手术缺血侧脑皮质血流量均显著降低（P＜0.001），表明缺血造模成功，建立的小鼠MCAO脑缺血再灌注模型稳定可靠。 图片图片 3.2 DGMI对MCAO模型小鼠的药效评价 3.2.1 DGMI对MCAO模型小鼠mNSS的影响 脑缺血再灌注后24 h，各组小鼠mNSS结果见图2，假手术组为0分，无神经功能损伤；与假手术组比较，模型组小鼠mNSS显著升高（P＜0.001），神经功能损伤严重；与模型组比较，各给药组mNSS显著降低（P＜0.01、0.001）。表明MCAO造模可导致小鼠神经功能受到损伤，引起小鼠行为学发生变化；EGb-761和DGMI可显著改善小鼠缺血再灌注造成的神经功能损伤。 图片 3.2.2 DGMI对MCAO模型小鼠脑梗死面积的影响 如图3所示，TTC染色后，假手术组脑切片呈均匀的红色，模型组脑切片缺血侧有明显的白色梗死部位；与模型组比较，各给药组小鼠脑梗死面积 显著减小（P＜0.001）。表明DGMI和EGb-761可显著改善小鼠脑梗死面积，对小鼠脑梗死有一定治疗作用。 图片 3.3 转录组测序分析 3.3.1 转录组测序数据质量分析 在建立的测序文库中，超过Q30的比例在94%以上，对测序数据中reads进行滤过后，数据质量控制结果显示，与参考基因组的序列比对率在70%以上，表明测序结果较好。 3.3.2 降维分析与模型评价 经主成分分析发现，假手术组和模型组明显分离（图4-A）。对各组进行tSNE降维分析，发现DGMI组与模型组明显分离（图4-B）。 图片 3.3.3 DEGs分析 如图5-A～C所示，与假手术组比较，模型组共筛选得到88个差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs），其中78个基因上调，10个基因下调。与模型组比较，DGMI组有21个基因上调，108个基因下调；EGb-761组有92个基因上调，84个基因下调。分别对模型组和DGMI、EGb-761组的DEGs取交集，如图5-D所示，DGMI组与模型组共有32个差异基因重合，EGb-761组与模型组共有31个差异基因重合，三者共有10个DEGs重合。 图片 图6中展示了EGb-761组、DGMI组和模型组DEGs重叠部分的热图，共53个DEGs。可以发现，这部分DEGs在给药后有不同程度的逆转。此外，在Lv等[30]通过131个小鼠和39个大鼠样本MCAO模型筛选出的15个共同DEGs中，模型组DEGs中有活化转录因子3（activating transcription factor 3，Atf3）、组织基质金属蛋白酶抑制剂1（tissue inhibitor of metalloproteinases 1，Timp1）、分化抗原14（cluster of differentiation 14，Cd14）、半乳糖结合凝集素3（lectin, galactoside-binding, soluble 3，Lgals3）、血红素加氧酶（heme oxygenase 1，Hmox1）、Ccl2、上皮膜蛋白1（epithelial membrane protein 1，Emp1）、热休克蛋白家族B成员1（heat shock protein family B member 1，Hspb1）、血小板反应蛋白基序1型去整合素和金属蛋白酶（a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 1，Adamts1）、波形蛋白（vimentin protein，Vim）共10个基因重合（66.7%）。Lv等[30]发现的与人类卒中易感基因联系最强的基因Adamts1、锌指蛋白（zinc finger protein 36，Zfp36）、核因子κB抑制剂zeta（nuclear factor kappa B inhibitor zeta，Nfkbiz）、Ccl2和Hmox1中，本研究模型组中也有3个重合。 图片 3.3.4 GSEA结果 如图7所示，GSEA结果显示，与假手术组比较，模型组表达相反的通路有35条，定义这些通路为模型组的特征通路；DGMI与模型组趋势相反的通路有7条，如帕金森症、色氨酸代谢、嘧啶代谢等通路，响应值为20%左右。 图片 3.3.5 DEGs的GO功能富集分析 为明确小鼠MCAO造模及药物干预后所涉及的生物学功能变化，对模型组和DGMI组小鼠脑组织DEGs进行GO功能富集分析，见图8。结果显示，模型组主要富集在细胞对白细胞介素-1和γ干扰素的反应、趋化因子互作和免疫细胞的浸润等BP，细胞外空间、细胞外区域等CC，趋化因子受体结合等MF。DGMI干预后，主要富集在分泌颗粒、神经肽激素信号通路等BP，细胞外空间与区域，多巴胺能神经突触等CC，S100蛋白结合、激素与神经肽激素等MF。 图片 3.3.6 DEGs的KEGG通路富集分析 为明确DGMI对MCAO模型小鼠KEGG通路的影响，基于获得的DEGs进行KEGG通路富集分析，见图9。结果显示，模型组前15条KEGG通路主要与炎症、凋亡和免疫反应相关，富集在细胞因子-细胞因子受体相互作用、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）信号通路、白细胞介素-17（interleukin-17，IL-17）信号通路、趋化因子信号通路、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路等。DGMI组KEGG通路主要富集在神经活性配体-受体作用、多巴胺能神经突触等。 图片 进一步分析发现，模型组KEGG通路中出现频率较高（≥3）的关键差异基因为Ccl12、Ccl2、Cxcl1等，见表3。DGMI组KEGG通路中出现频率较高（≥3）的关键差异基因是Gng14、Slc6a3、Calml4等，见表4。 图片 Ccl12、Ccl2与免疫细胞趋化浸润脑区有关，Gng14编码的蛋白质参与G蛋白偶联受体通路，而Slc6a3、Calml4与多巴胺在脑内的转运分泌密切相关，提示DGMI治疗IS可能与多巴胺能信号通路密切相关。 3.4 qRT-[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]验证关键基因表达 对模型组和DGMI组部分关键基因表达进行qRT-[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]验证，如图10所示，与对照组比较，模型组小鼠脑组织Slc6a3、Tph2基因表达水平显著降低（P＜0.001），Calml4、Ccl2、Gng14、Cxcl1基因表达显著升高（P＜0.05、0.01、0.001）；与模型组比较，DGMI组小鼠脑组织Slc6a3、Tph2基因表达显著升高（P＜0.01、0.001），Calml4、Ccl2、Gng14、Cxcl1基因表达显著降低（P＜0.05、0.01、0.001）。6个基因表达量的qRT-[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]检测结果均与转录组测序结果一致；值得注意的是，Calml4和Gng14 2个基因通过qRT-[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]和转录组测序方法获得的表达量在3个受试样本间差异较大，这可能是由于2种检测方法对基因的检测区域不同产生的，因此说明qRT-[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]检测对RNA-seq结果验证的必要性。总之，综合qRT-[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]与转录组测序结果，DGMI可能通过影响炎症和多巴胺相关通路改善IS。 图片 4 讨论 目前，银杏叶提取物作为天然药物产物，已被证明具有抗炎、抗氧化等多种药理作用，可以有效治疗IS。DGMI是国内常用的银杏叶提取物制剂之一，目前虽然在临床前和临床研究上都获得一定成果，但是其治疗IS的作用机制尚缺乏深入的探索。在DGMI作用机制探索的初期首先面对3方面主要的问题。第一，缺乏机制研究方向的指导。面对此问题，在组学水平，例如采用转录组测序方法，获得与疾病进程和发展相关，以及药物治疗途径相关的必要信息，将对后续针对性及更深入的研究提供方向指导。第二，对于IS，临床实验样本的获取比较困难，使得目前相关研究集中在细胞和动物实验，目前关于DGMI在动物IS实验上的转录组测序还没有相关研究内容发表以作参考。第三，由于大脑功能的实行分区域进行，且十分复杂，采用全脑均质化样本进行检测难以对获得的结果进行解析，取特定的脑区进行研究可以更精准地反映疾病和药物对脑特定的功能结构造成的变化影响。 4.1 多巴胺能神经、黑质与卒中炎症 CCL2基因编码的单核细胞趋化蛋白，可以吸引单核和淋巴细胞。CCL2/CCR2趋化因子信号通路在卒中急性期中呈现促炎作用[31]，临床试验和动物实验都证明CCL2基因高表达是IS的危险因素，而且在临床上CCL2可作为多种卒中亚型急性期的标志物[32-33]。CCL2因子可由小胶质细胞促炎亚型分泌，CCL2还可能与其他趋化因子共同作用，在急性期介导CD8+ T细胞在脑中的活化和浸润[34]。不过在急性期后的慢性期，CCL2可能有利于促进血管生成和卒中恢复[35]。卒中后活化的星型胶质细胞等分泌的CXCL-1是中性粒细胞趋化因子，可以募集中性粒细胞浸润脑区。中性粒细胞会通过胞外诱捕网等方式进一步加剧卒中[36-38]。 DGMI组和模型组黑质脑区DEGs的KEGG以及GO结果显示，DGMI治疗IS可能和多巴胺能神经相关，尤其是多巴胺的转运和代谢。溶质载体蛋白（solute carrier，Slc）是一类跨膜转运蛋白，Slc18a2基因调控的囊泡单胺转运蛋白2（Vesicular monoamine transporter 2，VMAT2）依赖于质子浓度，介导多巴胺在突触前神经元中从胞质溶胶进入囊泡储存[39-41]，囊泡经突触小泡循环将多巴胺运至突触前膜附近，释放多巴胺进入突触间隙，多巴胺结合突触后膜的受体后失活，而Slc6a3调控的多巴胺转运蛋白1（dopamine transporter1，DAT1）位于突触前末梢周围，依赖于Na+/Cl?从突触间隙再摄取多巴胺至突触前末梢[42]。包括多巴胺、乙酰胆碱在内的多种神经递质的受体为G蛋白偶联受体，小鼠Gng14编码的蛋白为G蛋白γ亚基，与人类GNG14同源，Gng14可能通过调节G蛋白亚基发挥作用，而Calml4是钙调蛋白，通过与钙离子结合作用于钙离子信号通路对下游信号产生影响。TPH2是5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）合成的关键酶，同时也会影响多巴胺的浓度，涉及其转运与代谢[43]。 多巴胺能神经元控制着脑内的奖赏系统、成瘾性以及运动功能[44]，还能调控疼痛和神经炎症[45-46]。黑质-纹状体通路是主要的多巴胺能通路之一

银杏（Ｇｉｎｋｇｏ ｂｉｌｏｂａＬ．）归属于银杏科、银杏属，为中生代孑遗的稀有物种，目前为我国特产，有“活化石”之称。作为中药，常以其叶和种子入药。２０２０年版《中国药典》描述，银杏叶味甘、苦、涩、平，归心、肺经。有活血化瘀、通络止痛、敛肺平喘、化浊降脂之功效，临床主用于对瘀血阻络、胸痹心痛、中风偏瘫和肺虚咳喘等疾病的治疗。在血管相关性疾病治疗方面，取得了较好的临床疗效。 银杏酮酯（Ｇｉｎｋｇｏ ｂｉｌｏｂａ ｅｘｔｒａｃｔ５０，ＧＢＥ５０）是将银杏叶经过“双重吸附、双重去除”等工艺提取，是我国自主开发研制的第五代新型银杏叶提取物，是银杏叶提取物的标准化产品。 银杏酮酯药物质量标准的测定： ①总黄酮醇苷含量为２４.０％～３５.０％；同时建立紫外--可见分光光度（ＵＶ）法测定银杏总黄酮，规定其含量为４４.０％～５５.０％； ②规定其萜类内酯（银杏内酯Ａ、Ｂ、Ｃ和白果内酯）含量在６.０％～１２.０％之间； ③毒性成分银杏酸含量≤５ｍｇｋｇ－１； ④建立指纹图谱检测指标，规定其相似度不得低于９０.０％。 该提取物展现出较好的科研及药用开发价值，在血管性疾病中具有重要的临床应用价值。

RT目前开展的阪崎肠杆菌pcr实验，看到出入境的标准是用大肠杆菌作为阴性对照，但我不太明白他们为什么要用大肠杆菌作为阴性对照？原则是什么？我们还有金黄色葡萄球菌、沙门氏菌这些需要做PCR，同样不知道选择哪一种菌作为阴性对照？？？谢谢各位~~~

大家在做总银杏叶酸时，如何称取对照品A和B的，图谱里有几个峰呢？多长时间出？用的什么色谱柱呢？问题有点多，希望有兴趣的来讨论下

正在测牛奶中抗生素的含量，不知如何做阴性对照啊？？？从市场上买了不同品牌的奶粉和液态奶，但是空白对照怎么确定呢？需要版友们帮忙。谢谢！

[color=#333333][font=宋体] 供试品溶液的制备取本品20片，除去包衣，精密称定，研细。取相当于萜类内酯19.2 mg的粉末［8］，精密加入甲醇50 ml，称定重量。超声处理40 min，放冷，再称定重量。用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液20 ml，回收甲醇，残渣加水10 ml，置水浴中温热使溶散。加2% HCl溶液2滴，用醋酸乙酯振摇提取4次（15，10，10，10 ml）。合并提取液，用5%醋酸钠20 ml洗涤。分取醋酸钠液，再用醋酸乙酯10 ml洗涤。合并醋酸乙酯提取液及洗液，用水洗涤两次，20 ml/次，合并水洗液。用醋酸乙酯10 ml洗涤，合并醋酸乙酯溶液，回收醋酸乙酯至干，残渣用丙酮溶解并转移至5 ml量瓶中。加丙酮至刻度，摇匀，0.45 μm滤膜滤过，即得。请问上述加甲醇 hcl 乙酸乙酯 醋酸钠 水洗 丙酮的 作用以及每部提取的注意事项及原理 上述方法作出的峰杂质很多，是哪步提取不干净吗？[/font][/color]

我们做的原料药的细菌内毒素的供试品阳性对照怎么老是阴性？该如何去除干扰呢？http://simg.instrument.com.cn/bbs/images/brow/em09512.gif

我在做银杏叶片萜类内酯含量测定时，流动相是正丙醇四氢呋喃和水，标准规定对照品溶液（甲醇溶剂）进5和20ul，进5ul峰型很正常，柱效很高，但是在进20ul的时候，峰就变形了，上坡像连绵起伏的山峰，下坡倒正常，后来我进了一针样品（丙酮溶剂，20ul），个个峰都变形。但是非常奇怪的是，我在不久前刚做了这项含量，各个条件基本是一模一样的，连对照都是同一份溶液，对照在进20ul时峰型很正常。柱子不可能有问题，而且换了一根也是同样问题，流动相是配在一起的。1、请教一下，我的流动相是配在一起的，会不会有可能吸滤头脏了。2、另外，我曾在别的液相和蒸发光检测器上按上述方法测过，峰型很好，会是什么原因。

流动相是乙腈水8比2，对照品的溶剂是甲醇（ 标样不溶乙腈 ），检测波长208。用的是新的C18色谱柱，默克的乙腈请问：阴性对照是进一针什么？流动相？纯的乙腈？纯的甲醇？试过进一针流动相，出了2个峰，再进一针标准品，也出了2个峰，且与流动相出的2个峰重叠，并随进样体积增而增大。如果是溶剂峰，是不是不管进样体积如何变化，是不是都是 一样的？

我公司生产一保健品含有银杏叶提取物、沙棘提取物等多种含黄酮类物质，请问如何测定此保健品的总黄酮含量？？ 用液相以槲皮素做对照品还是用紫外以卢丁做对照品测定呢？？ 或有更好的办法？ [em40] [em43] [em46]