叶酸分析标准品

GB 5009.211-2014微生物法测定叶酸标准3.5.1叶酸标准储备液20.5ug/mL的配制：精确称取20.mg叶酸标准品，用氢氧化钠乙醇溶液定容至1000mL，然后在256nm处进行了标定，得到浓度为c1。然后3.5.2配制叶酸标准中间液（0.200ug/mL）时，是吸取1mL上述储备液定容至100mL，但没有用到标定浓度c1啊，这不符合试剂配制原理吧，还是说有什么特殊情况？6.7测定 部分，测定时采用的是540nm，但是标定时采用的254nm，为什么不一样呢？问题1：标准储备液标定的作用是什么？问题2：标定和检测时的波长为什么不一致？

1.原理叶酸是酪乳酸杆菌（Lactobacillus casei, L. C, ATCC 7469）生长所必需的营养素。在一定条件下，L.C的生长繁殖与培养基中叶酸含量呈正比关系，细菌增殖的量以光密度值计，通过与标准曲线相比较，计算出样品中叶酸的含量。2.适用范围参考《Methods of Vitamin Assay》，第4版。本方法适用于各类食物中叶酸的测定。检测限为0.1ng。3.仪器与设备（1） 恒温培养箱（2） 离心机（3） 高压消毒锅（4） 震荡器（5） 接种针和接种环（6） 分光光度计4.试剂除特殊说明外，本实验中所有试剂均为分析纯，水为蒸馏水。（1） 菌种：酪乳酸杆菌（Lactobacillus casei, L.C, ATCC 7469）（2） 磷酸缓冲液(0.05mol/L, pH6.8):称取4.35g Na3PO412H2O,10.39g Na2HPO47H2O溶解于800ml水中。临用前用约5g抗坏血酸调节pH至6.8。（注：叶酸对光、热敏感，易被氧化破坏，抗坏血酸有助于保护叶酸被氧化。）（3） 鸡胰酶溶液： 称取100mg干燥的鸡胰酶（Difco公司）（注：含有叶酸轭合酶，用于水解叶酸多谷氨酸盐）， 加入20ml磷酸缓冲液制成匀浆，3000rpm离心10min,取上清液备用。临用前现配。（4） 蛋白酶-淀粉酶溶液：分别称取200mg蛋白酶（Sigma公司）和淀粉酶（Sigma公司），加入20ml磷酸缓冲液制成匀浆，离心3000rpm 10min,取上清液备用。临用前配制。（5） 2+8乙醇溶液：量取20ml无水乙醇溶液，加入80ml水混匀。（6） 01mol/L NaOH: 称取0.4g氢氧化钠，加2+8乙醇溶液溶解并稀释至1L。（7） 10mol/L NaOH。称取400g氢氧化钠，加水溶解并稀释至1L。（8） 叶酸标准储备液（200mg/ml）：准确称取200mg叶酸标准品（Sigma公司，纯度大于98%），用0.01mol/L NaOH溶解并定容至1L。储存于棕色瓶中。（9） 叶酸标准中间液（200ng/ml）：准确吸取1.0ml叶酸标准储备液，用0.01mol/L NaOH 溶解并定容至1L。储存于棕色瓶中。待标定。标定：准确吸取1ml叶酸标准中间液，用0.1mol/L NaOH定容至10ml。以0.1mol/L NaOH调零点，比色杯厚度1cm，波长256nm，测定3次紫外吸光度值，取平均值，按下式计算标准中间液浓度。X1 =A/E×M ×10×10E6 …………………(1) ` 式中：X1 -- 叶酸标准中间液浓度，ng/ml；A -- 标准中间液平均紫外吸光度值；E -- 摩尔消光系数24,500；M -- 叶酸分子量441.42；10-- 测定紫外吸光度值时的稀释倍数；106 -- 由g/L换算成ng/ml的换算系数。（10） 叶酸标准工作液（0.2ng/ml）:准确吸取1.0ml叶酸标准中间液，用磷酸缓冲液稀释定容至1L。（11） 2.4mol/L HCl：量取20ml浓盐酸，加水稀释至100ml。（12） 酶解酪蛋白溶液：将8g碳酸氢钠溶解于1L水中，加入60g去维生素酪蛋白（Sigma 公司），用10mol/L NaOH调节pH至 8.0（调pH时应小心，不要过碱后再加酸反复调节，避免酪蛋白结块）。加入300mg胰酶，搅拌20min，使胰酶混匀充分。再加入2.5ml甲苯，置37℃恒温箱酶解48～72h（此步骤是将酪蛋白酶解为L.C可以利用的小分子肽。酶解时间不易超过72h，如时间过长，配成的培养基不利于细菌生长）。将酪蛋白液从恒温箱中取出，121℃高压30min以终止反应并去除甲苯。冷却，加10g硅藻土搅拌，用垫有滤纸的布氏漏斗过滤。向滤液中加入约60ml冰乙酸调节pH至3.7。称取活性炭12g，加入滤液中搅拌10min，用布氏漏斗过滤，重复三次。每次过滤时，布氏漏斗内加有10g硅藻土协助过滤。最后滤液用水稀释至1200ml，4℃冰箱保存1年（活性碳可吸附酪蛋白中的叶酸以减少试剂空白，同时也可吸附肽及氨基酸，应注意控制搅拌时间）。取10ml酶解后的酪蛋白溶液加入已称重的蒸发皿中，沸水浴蒸发至干。将蒸发皿置于100℃恒温烤箱内干燥至恒重，在干燥器中冷却至室温。称量蒸发皿的重量，蒸发皿内固体重量，如固体重量小于400mg，即每毫升酪蛋白溶液中固体含量40mg，则弃除酪蛋白液，重新制备。（13） 黄嘌呤溶液：取0.4g黄嘌呤，加入10ml氨水，加热溶解，用水稀释至100ml。冰箱保存。

我在用液相分析叶酸时，做到一个样品含量很低，实在不容易检测，请问各位大虾有没有什么办法进行净化、富集？

分享标准，均自网络收集，上传者不保证资料完整性以及版权。下载仅供研究，请勿用于其他用途。研究完毕请及时删除，若有正版需求，请联系出版单位。GB 5413.16-2010 婴幼儿食品和乳品中叶酸(叶酸盐活

哪位高手做过关于用微生物法检测叶酸的呀？最近在做叶酸检测时标准曲线怎么都做不好，我是按照GB/T 5009.211-2008做的，都做了好久了，每次做出来差距都很大，而且都很不好；还有一个问题是，在做标准曲线时，标准上是按不接种的不含叶酸的管调零，但是标准系列管的0管即不含叶酸但加了菌种的吸光度就不会为0了，但是我看了几篇文献也是按国标做的，其标准曲线都经过了原点，我不知道自己做的问题出在了哪里。希望做过这方面实验的高手能够指点一二，感激不尽~~

[font=宋体][color=#333333][back=white] 叶酸是一种水溶性维生素，也叫维生素[/back][/color][/font][font='Times New Roman',serif][color=#333333][back=white]B9[/back][/color][/font][font=宋体][color=#333333][back=white]。最初从菠菜中发现了这种生物因子，因此命名为叶酸，叶酸富含于新鲜的水果、蔬菜、肉类食品中，尤以酵母、肝及绿叶蔬菜中含量比较多，但天然叶酸极不稳定，易受阳光、加热的影响而发生氧化，所以人体真正能从食物中获得的叶酸并不多。合成的叶酸在数月或数年内可保持稳定，容易吸收且人体利用度高。[/back][/color][/font][font=宋体][color=#333333][back=white] 人体缺少叶酸可导致红血球的异常，未成熟细胞的增加，贫血以及白血球减少。孕妇缺乏叶酸有可能导致胎儿出生时出现低体重、唇腭裂、心脏缺陷等。因此，怀孕前[/back][/color][/font][font='Times New Roman',serif][color=#333333][back=white]3[/back][/color][/font][font=宋体][color=#333333][back=white]个月就要开始吃[/back][/color][/font][font=宋体][color=#333333]叶酸[back=white]，每天[/back][/color][/font][font='Times New Roman',serif][color=#333333][back=white]0.4mg[/back][/color][/font][font=宋体][color=#333333][back=white]，即一粒[/back][/color][/font][font=宋体][color=#333333]叶酸，[back=white]可以降低胎儿神经管畸形率至[/back][/color][/font][font='Times New Roman',serif][color=#333333][back=white]85%[/back][/color][/font][font=宋体][color=#333333][back=white]。服用[/back][/color][/font][font='Times New Roman',serif][color=#333333][back=white]5 mg[/back][/color][/font][font=宋体][color=#333333][back=white]的叶酸则用来治疗女性贫血，消费者可根据不同情况进行选择。[/back][/color][/font][font=宋体][color=#333333][back=white] 叶酸测定试剂盒是以化学发光免疫分析法为原理定量测定人血清中叶酸含量的试剂盒，对贫血的临床诊断和治疗起辅助作用，最重要的是判断后期孕妇需不需要继续补充叶酸。叶酸的测定检查一般是在怀孕[/back][/color][/font][font='Times New Roman',serif][color=#333333][back=white]3-4[/back][/color][/font][font=宋体][color=#333333][back=white]个月进行，判断后期孕妇需不需要继续补充叶酸，检测结果主要有三种：低风险，代表对叶酸的吸收和代谢能力是正常的或者接近正常，可以正常补充叶酸。中度风险，代表对叶酸的吸收和代谢能力存在障碍，可能会出现叶酸缺乏导致胎儿异常。高度风险，出现叶酸缺乏可能性就会非常高，女性需要在整个孕期补充叶酸。[/back][/color][/font][font=宋体][color=#333333][back=white] 叶酸测定试剂盒的检测效果至关重要，直接关系到优生优育。相关检测机构一般会按照以下要求对该试剂盒进行检测：[/back][/color][/font][font='Times New Roman',serif][color=#333333][back=white]1.[/back][/color][/font][font=宋体][color=#333333][back=white]外观：试剂盒各组分应齐全、完整，液体无渗漏。[/back][/color][/font][font='Times New Roman',serif][color=#333333][back=white]2.[/back][/color][/font][font=宋体][color=#333333][back=white]溯源性：生产企业应根据有关规定提供所用叶酸校准品的来源、赋值过程以及测量不确定度等内容。[/back][/color][/font][font='Times New Roman',serif][color=#333333][back=white]3.[/back][/color][/font][font=宋体][color=#333333][back=white]准确度：[/back][/color][/font][font='Times New Roman',serif][color=#333333][back=white]a)[/back][/color][/font][font=宋体][color=#333333][back=white]相对偏差[/back][/color][/font][font='Times New Roman',serif][color=#333333][back=white]:[/back][/color][/font][font=宋体][color=#333333][back=white]使用可用于评价常规方法的有证参考物质[/back][/color][/font][font='Times New Roman',serif][color=#333333][back=white](CRM)[/back][/color][/font][font=宋体][color=#333333][back=white]进行测定，实测值与标示值的相对偏差应在士[/back][/color][/font][font='Times New Roman',serif][color=#333333][back=white]15%[/back][/color][/font][font=宋体][color=#333333][back=white]范围内[/back][/color][/font][font='Times New Roman',serif][color=#333333][back=white] b)[/back][/color][/font][font=宋体][color=#333333][back=white]回收试验[/back][/color][/font][font='Times New Roman',serif][color=#333333][back=white]:[/back][/color][/font][font=宋体][color=#333333][back=white]回收率应在[/back][/color][/font][font='Times New Roman',serif][color=#333333][back=white]85%-115%[/back][/color][/font][font=宋体][color=#333333][back=white]范围内。[/back][/color][/font][font='Times New Roman',serif][color=#333333][back=white] [/back][/color][/font][font='Times New Roman',serif][color=#333333][back=white]4.[/back][/color][/font][font=宋体][color=#333333][back=white]检出限：应不大于[/back][/color][/font][font='Times New Roman',serif][color=#333333][back=white]1.0ng/mL[/back][/color][/font][font=宋体][color=#333333][back=white]。[/back][/color][/font][font='Times New Roman',serif][color=#333333][back=white]5.[/back][/color][/font][font=宋体][color=#333333][back=white]线性：在不窄于[/back][/color][/font][font='Times New Roman',serif][color=#333333][back=white]15-200ng/mL[/back][/color][/font][font=宋体][color=#333333][back=white]区间内，相关系数[/back][/color][/font][font='Times New Roman',serif][color=#333333][back=white]r≥0.99[/back][/color][/font][font=宋体][color=#333333][back=white]。[/back][/color][/font][font='Times New Roman',serif][color=#333333][back=white]6.[/back][/color][/font][font=宋体][color=#333333][back=white]重复性[/back][/color][/font][font='Times New Roman',serif][color=#333333][back=white]:[/back][/color][/font][font=宋体][color=#333333][back=white]利用同一批试剂盒对浓度在[/back][/color][/font][font='Times New Roman',serif][color=#333333][back=white]15-60ng/mL[/back][/color][/font][font=宋体][color=#333333][back=white]和[/back][/color][/font][font='Times New Roman',serif][color=#333333][back=white]11-19ng/mL[/back][/color][/font][font=宋体][color=#333333][back=white]的样本各重复检测[/back][/color][/font][font='Times New Roman',serif][color=#333333][back=white]10[/back][/color][/font][font=宋体][color=#333333][back=white]次，其变异系数[/back][/color][/font][font='Times New Roman',serif][color=#333333][back=white](CV)[/back][/color][/font][font=宋体][color=#333333][back=white]应不大于[/back][/color][/font][font='Times New Roman',serif][color=#333333][back=white]10%[/back][/color][/font][font=宋体][color=#333333][back=white]。[/back][/color][/font][font='Times New Roman',serif][color=#333333][back=white]7.[/back][/color][/font][font=宋体][color=#333333][back=white]批间差[/back][/color][/font][font='Times New Roman',serif][color=#333333][back=white]:[/back][/color][/font][font=宋体][color=#333333][back=white]用[/back][/color][/font][font='Times New Roman',serif][color=#333333][back=white]3[/back][/color][/font][font=宋体][color=#333333][back=white]个批号试剂盒检测浓度在[/back][/color][/font][font='Times New Roman',serif][color=#333333][back=white]11-19ng/mL[/back][/color][/font][font=宋体][color=#333333][back=white]的同一份样本，则[/back][/color][/font][font='Times New Roman',serif][color=#333333][back=white]3[/back][/color][/font][font=宋体][color=#333333][back=white]个批号试剂盒之间的批间变异系数[/back][/color][/font][font='Times New Roman',serif][color=#333333][back=white](CV) 15%[/back][/color][/font][font=宋体][color=#333333][back=white]。[/back][/color][/font][font='Times New Roman',serif][color=#333333][back=white]8.[/back][/color][/font][font=宋体][color=#333333][back=white]稳定性[/back][/color][/font][font='Times New Roman',serif][color=#333333][back=white]: a)[/back][/color][/font][font=宋体][color=#333333][back=white]效期稳定性试验生产企业应规定试剂盒的有效期。取效期末的试剂盒检测其试剂准确度、检出限线性和重复性，应符合[/back][/color][/font][font='Times New Roman',serif][color=#333333][back=white]3~6[/back][/color][/font][font=宋体][color=#333333][back=white]的要求；[/back][/color][/font][font='Times New Roman',serif][color=#333333][back=white]b)[/back][/color][/font][font=宋体][color=#333333][back=white]热稳定性试验[/back][/color][/font][font='Times New Roman',serif][color=#333333][back=white]:[/back][/color][/font][font=宋体][color=#333333][back=white]取有效期内的试剂盒根据生产企业所声称的热稳定性条件，检测其试剂准确度检出限线性和重复性，应符合[/back][/color][/font][font='Times New Roman',serif][color=#333333][back=white]3~6[/back][/color][/font][font=宋体][color=#333333][back=white]的要求。[/back][/color][/font]

[align=center][b]HPLC法测定果冻类样品中叶酸含量的方法学建立[/b][/align][align=center]顾琛 [/align][align=left][b]摘要：目的：[/b]本文采用反相高效液相色谱法建立测定果冻类食品叶酸（folic acid）含量的分析的方法。[b]方法：[/b]使用C[sub]18[/sub]柱作为分析柱，磷酸缓冲液和甲醇作为流动相，紫外检测器作为检测器，叶酸（Pteroylmonoglutamic acid）作为对照品，果冻食品作为样品。[b]结论：[/b]该法在50ng/mL-1000ng/mL之间呈良好的线性，重现性好RSD＜2%，回收率在107±2%，稳定性良好，最小检测限20ng/mL。样品测试结果与微生物检测结果相符。本法可以作为测定食品中叶酸含量的一个方法。[/align][b]关键词：[/b]叶酸，HPLC， 果冻样品[b]Abstracts ：Aim:[/b] A simple method for the determination offolic acid in gel sample by high-performance liquid chromatography withUV-detection is reported. [b]Methods: [/b]The method was simple by using RP-column (C[sub]18[/sub])with phosphorate -methanol as mobile phase and UV as a detector. [b]Conclusion: [/b]The calibration graph was linear from 50 to1000ng/mL for folic acid with a correlation coefficient of 0.999(n=5). Thedetection limit is 20ng/mL. The method was successfully applied fordetermination of folic acid in the gel sample. The recovery was 107±1.5% and the reletive standard deviation was no morethan 2%. Compared with microbiology method, the results of the samples are same.This method can be used for content determination of the folic acid in gelsample.[b]Key Words:[/b] folic acid, HPLC, gel sample [b]1.前言与文献综述1.1叶酸的理化性质，生物学功能[/b] 叶酸(folic acid)是一组含有碟酰谷氨酸结构的一类化合物统称。食物中的叶酸绝大多数是以喋酰多谷氨酸(或称多谷氨酸叶酸)的形式存在的。叶酸为淡黄色结晶粉末，微溶于水，不溶于乙醇、乙醚及其它有机溶剂；叶酸的钠盐易溶于水，但在水溶液中易被光解破坏，分解成碟啶和氨基苯甲酰谷氨酸盐。在酸性溶液中对热不稳定，而在中性和碱性溶液中却十分稳定。食品中叶酸经受热易损失。 食物叶酸经小肠粘膜细胞内特异叶酰多谷氨酸水解酶的作用，水解为喋酰单谷氨酸(或称单谷氨酸叶酸，PteGlu①)后吸收。吸收后的单谷氨酸叶酸一部分又转变为多谷氨酸叶酸，在肝脏、红细胞及其他组织细胞内贮存，其余部分则以单谷氨酸叶酸的形式分布于血浆、组织液、胆汁及尿液中。肝脏的叶酸浓度是血浆的几百倍，但其单谷氨酸叶酸浓度与血浆相近。叶酸以8种辅酶形式存在于生物体内，为一碳单位的载体参与嘌呤、嘧啶等重要物质的合成。[sup] [/sup]因此叶酸在DNA、RNA、核酸和蛋白质的生物合成中起着重要作用，是细胞增殖和机体发育的物质基础。叶酸在体内的含量直接影响到多种物质如核苷酸的代谢，进而影响血细胞的形成。[b]1.2目前测定叶酸的一些主要方法以及对各个方法的评价1.2.1微生物法[/b] 微生物法是检测生物体内叶酸的经典方法。[color=black]它最根本的原理在于利用了微生物对于某些营养物质的特异性。大量的研究发现，某种微生物会对某种维生素具有极强的特异性，是其正常生长所必需的维生素，并且在一定条件下，其生长与繁殖速度与溶液中该维生素的含量成一定的对应关系，含量高则生长快，反之则慢，微生物法便利用了这种对应关系间接地测定出样品中该维生素的含量。[/color]通常所用的微生物有干酪样乳酸杆菌（L.casei）、粪链球菌和啤酒小球菌属。此3种微生物对不同形式叶酸的敏感度不同。粪链球菌只对非甲基化叶酸敏感，如PteGlu、二氢叶酸(DHF)和四氢叶酸(THF)。 微生物分析叶酸[color=black]具有极高的灵敏度准确度高、先期投入少，见效快、测定结果反映了样品中具有生物活性的被测物含量等优点。许多国际标准方法机构仍旧将微生物法作为叶酸分析的标准方法或第一方法。[/color] 但是微生物法也有许多局限性，如整个实验周期长，批间检测结果重复性差，检测结果受样品中所含抗叶酸药物或抗生素成分的影响，[color=black]只能反映维生素的总含量，不能测定维生素各种异构体的组成和含量[/color]等。[b]1.2.2同位素放射免疫法[/b] 同位素放射免疫法检测血清叶酸始于70年代初。该方法具有快速、简便的特点，同时由于叶酸放射免疫试剂盒的出现，很快得到普及，尤其广泛应用于临床实验室。放射免疫法与微生物法检测叶酸，除原理不同外，检测结果的意义也有所不同。对大量标本总体而言，两种方法结果相关性较好，但对个体标本，两种方法结果的差异较大。微生物法对多谷氨酸叶酸响应值低，不能直接用于检测叶酸含量。但微生物法对所有单谷氨酸叶酸及其衍生物的反应灵敏度相同，故在用叶酸水解酶处理样品使所有叶酸形式转变为单谷氨酸叶酸后进行检测，可得到准确的叶酸值。同位素放射免疫法对多谷氨酸叶酸反应的相对灵敏度有较大的差别，随着叶酸浓度增加，反应的相对灵敏度增加，但多谷氨酸叶酸的反应曲线不可能与单谷氨酸叶酸的反应曲线重合；另一方面，多谷氨酸叶酸与结合蛋白的亲合性与单谷氨酸叶酸相比较高，不同的单谷氨酸叶酸衍生物反应灵敏度不同，放射免疫法也不适用于检测单谷氨酸叶酸衍生混合物。由于上述原因，尽管放射免疫法可用于检测和评价叶酸的营养状况，但从定量检测的角度来讲，难以得到准确的叶酸含量值。[b]1.2.3离子捕获法[/b] Wilson等提出离子 捕获法检测叶酸，该技术可谓叶酸检测技术中的最新方法，即在实验中，样品加入变性剂后叶酸与内源性结合蛋白分离，释放后的叶酸再与带有大量阴离子的亲合试剂结合，合成产物经过离子捕获池而与阳离子纤维结合，最后通过碱性磷酸酶与喋酸(叶酸的类似物)结合物对叶酸结合蛋白上游离结合位点的探查，定量分析样品的叶酸含量。该研究证实，离子捕获法测定血清或红细胞叶酸，其结果与同位素放射免疫法的结果具有良好的相关性，相关系数分别为0.96 和0.93。[b]1.3色谱法和HPLC法在测定食品中叶酸含量的现状[/b][align=left] 色谱法也称层析法，是一种分配平衡为基础的分离分析技术。色谱分离体系包含两相：固定相和流动相。由流动相带领的[color=black]物质分子在固定相间分配达到“平衡”的过程。通过不同物质分配平衡性质的差异达到彼此分离。[/color][/align][align=left][color=black] 20[/color][color=black]世纪[/color][color=black]70[/color][color=black]年代初发展起来的高效液相色谱（[/color][color=black]High performance liquidchromatography, HPLC[/color][color=black]）吸收了普通液相层析和[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]气相色谱[/url]的优点，经过适当改进发展起来的。它既有普通液相层析的功能（可在常温下分离制备水溶性物质），又有[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]气相色谱[/url]诸多优点（高速、高分辨率和高灵敏度）。适用于很多不易挥发、受热易分解的物质定性定量分析。[/color][sup][/sup][color=black][/color][/align][align=left] 运用高效液相色谱（HPLC）方法来定量食品中叶酸含量在近年来得到了普及。借助于色谱柱的高分离效果和灵敏的检测器，有能力来分离检测不同形式叶酸。中国药典方法使用高效液相色谱－紫外检测器检测叶酸。由于有些叶酸具有荧光特性，D.MP.Johan等[sup][/sup]使用高效液相色谱－荧光－紫外检测器的串连（HPLC-FD-UV）分析面包酵母中叶酸含量。R.Stefania[sup][/sup]等同样使用HPLC-FD-UV分析意大利食品中叶酸含量。由于食品中的干扰物质多，且叶酸含量较少，E.J.M.Konings[sup][/sup] 使用固相萃取法（SPE）对样品进行纯化和富集，然后使用HPLC-FD-UV检测牛奶，肝脏，蔬菜，面粉中的叶酸。L.H Douglas[sup][/sup] 等用HPLC-柱前衍生和HPLC-电化学检测器分别检测牛奶和其它食品中叶酸含量。随着技术的进步，高效液相色谱和质谱联用（HP[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LC-MS[/color][/url]）提供了专一性好，灵敏的方法。A.Freisleben[sup][/sup]使用LC-FD-MS联用检测食品中叶酸含量。[/align][align=center][b]表一：几种液相色谱联用的检测器方法的比较：[/b][/align][align=center][b]Table 1. Comparison of some detectors of HPLC [/b][/align] [table=649][tr][td=1,1,61] [align=center]检测器[/align] [/td][td=1,1,192] [align=center]原理[/align] [/td][td=1,1,72] [align=center]灵敏度[/align] [/td][td=1,1,84] [align=center]专一性[/align] [/td][td=1,1,108] [align=center]检测限②[/align] [/td][td=1,1,132] [align=center]评注[/align] [/td][td=1,1,0] [/td][/tr][tr][td=1,2,61] [align=center]紫外[/align] [align=center](UV)[/align] [/td][td=1,2,192] 物质在紫外光谱有吸收[/td][td=1,2,72] [align=center]较高[/align] [/td][td=1,2,84] [align=center]稍强[/align] [/td][td=1,2,108] [align=center]2μg/100mL[/align] [/td][td=1,2,132] 受到食品中其它物质干扰较大。[/td][td=1,1,0] [/td][/tr][tr][td=1,1,0] [/td][/tr][tr][td=1,2,61] [align=center]荧光[/align] [align=center](FD)[/align] [/td][td=1,2,192] 共轭结构在激发光下电子激发到高能态，退激回基态时能量以荧光形式释放，根据荧光强度得待测物浓度。[/td][td=1,2,72] [align=center]高[/align] [/td][td=1,2,84] [align=center]强[/align] [/td][td=1,2,108] [align=center]不能检测[/align] [/td][td=1,2,132] 能检测四氢叶酸和5－甲基四氢叶酸。而叶酸（Pt-Glu）③无荧光性质。[/td][td=1,1,0] [/td][/tr][tr][td=1,1,0] [/td][/tr][tr][td=1,2,61] [align=center]电化学(ECD)[/align] [/td][td=1,2,192] 外加电压使特征物质失去电子，根据失去电子形成电流大小得出待测物质的浓度。[/td][td=1,2,72] [align=center]高[/align] [/td][td=1,2,84] [align=center]强[/align] [/td][td=1,2,108] [align=center]0.32pmol[/align] [/td][td=1,2,132] 灵敏度高，专一性强。但是装备复杂。[/td][td=1,1,0] [/td][/tr][tr][td=1,1,0] [/td][/tr][tr][td=1,2,61] [align=center]质谱[/align] [align=center](MS)[/align] [/td][td=1,2,192] 特征碎片离子检测[/td][td=1,2,72] [align=center]较高[/align] [/td][td=1,2,84] [align=center]强[/align] [/td][td=1,2,108] [align=center]0.1μg/100mL[/align] [/td][td=1,2,132] 不普及，价格高。但是发展方向。[/td][td=1,1,0] [/td][/tr][tr][td=1,1,0] [/td][/tr][/table][b]1.4方法学建立的目的和意义以及技术路线1.4.1方法学建立的目的和意义[/b] 由于人体内的叶酸几乎完全依赖于食物的摄入，因此当摄入量不足或利用率低时，体内便会出现叶酸缺乏的状况。近年来的研究表明，叶酸缺乏会导致贫血、慢性下痢、食欲不振、发育迟缓等疾病，孕妇补充叶酸可防止因神经系统发育不全而形成的畸胎，儿童服用叶酸可提高智商，促进智力发展。所以，叶酸强化食品的摄取对人类健康具有重要意义。而叶酸强化食品的含量的科学性显得十分重要。 确实食品添加剂的质和量决定着加工类食品的营养和安全性。国外对于食品营养和安全十分关注，通过在加工食品的包装上注明的添加成分、营养物质的含量、适宜人群在产品包装，以利于不同需求的消费者选择。随着国内外交流的加强和HACCP认证的推进以及质量意识的增强，食品安全，食品营养受到了消费者和食品生产企业的关注。随着分析测试仪器的先进化和自动化给食品中各个成分的测定提供了强有力的“武器”，尤其是高效液相色谱的普及，它的高效性、准确性、方便、微量等优点是食品分析的一场“革命”。国内外HPLC法测定食品营养成份和食品添加剂方法发展得很快，相关报道较多。但是由于叶酸在食品中添加量甚微，食品中干扰物质较多，所以相应的文章报道相对较少。基于以上考虑设立本项目，具体目的有以下四点：[list=1][*]建立高效液相色谱方法分离分析果冻类样品中叶酸含量的方法学；[*]通过色谱条件的摸索和优化，获得叶酸分离的最佳条件；[*]对样品前处理条件的摸索和调整，得到简便、快速、有效的样品前处理方法；[*]通过对本套方法学的验证包括线性、精密度、回收率、稳定性等实验，建立可靠、完善、准确的测定果冻类样品中叶酸含量的方法学。本方法的建立，可为检测果冻类样品中叶酸含量提供可靠和准确的手段，也为检测其他食品中叶酸含量提供参考资料，所以本研究具有社会效益和经济价值。[/list][b]1.4.2技术路线[/b] 色谱条件的建立（流动相配比、色谱柱选取、检测波长、流速、柱温） [img=,51,13]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2024/03/202403181710139504_8563_1626663_3.png[/img] 积分条件的建立 [img=,51,14]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2024/03/202403181710137869_6909_1626663_3.png[/img] 确立标准品、样品配制方法 [img=,51,13]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2024/03/202403181710142106_9538_1626663_3.png[/img] 方法学验证（线性回归、精密度、回收率、稳定性、样品含量测定）[img=,40,14]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2024/03/202403181710143330_4024_1626663_3.png[/img] 方法学的改进 [b]2.实验部分2.1实验样品的描述2.1.1样品性质[/b] 无色或淡黄色果胶类样品。常温下为胶态和液态混合物。样品名称（AminoVital Supersports；AminoVital-1；AminoVital-2）。[b]2.1.2样品中添加的主要物质[/b] 添加氨基酸，维生素类，甜味剂，食用香精，食用色素，有机酸。[b]2.1.3可能的干扰因素[/b] 根据配料表信息，氨基酸、甜味剂、色素等物质在样品中较维生素几十倍量添加，而维生素中又以维生素C添加量最大，叶酸添加量相当少。所以上述物质对叶酸分析造成较大的干扰。[b] 2.1.4标准品和样品保存条件[/b] 标准品避光保存于冰箱冷冻柜中。样品置于-18℃冷藏库中保存。[b]2.2实验条件2.2.1仪器和试剂及标准品[/b]仪器配置：岛津LC-10A系列 泵：LC-10ADVP真空脱气机：DGU-12A控制器：SCL-10AVP紫外检测器：SPD-10AVP自动进样器：SIL-10ADVP柱温箱：CTO-10ASVP积分仪：CR-8A和LC-Solution积分工作站试剂：磷酸二氢钾（GR），氢氧化钾（GR），甲醇（HPLC），氨水（GR），纯水（HPLC）标准品：叶酸标准品（Pteroylglutamic Acid），纯度：98.0～102.0％ 和光特级[b]2.2.2HPLC方法条件建立[/b]2.2.2.1流动相配制 0.05mol/L磷酸二氢钾（pH=6.33）：甲醇＝92：8（体积比），作为流动相。 称取7.0g KH[sub]2[/sub]PO[sub]4[/sub]置于1000mL烧杯，加入800mL纯水，溶解。通过滴加0.1mol/L KOH溶液，调节缓冲液pH值为6.33，转移至1000mL容量瓶中，加入80mL甲醇，再用纯水定容至刻度，摇匀。用0.45μm微孔滤膜过滤。装瓶。2.2.2.2检测器和检测波长 使用紫外检测器。使用λ＝285nm作为检测波长。2.2.2.3色谱柱 ODS柱作为本次实验的分离分析柱。2.2.2.4流速和柱温选 流速设0.6mL/min；柱温选定为35.0℃2.2.2.5色谱条件： 色谱柱：Shim-pack VP-ODS 4.6mm×150mm 粒度：5μm (P/N 228-34937-91) 流速：0.6mL/min 检测器：紫外检测器 波长：λ＝285nm 进样量：100μL 分析时间：100分钟（对于标准品测试仅需40分钟） 柱温：35.0 ℃ [b]2.3标准品配制（线性浓度配制）[/b] 标准品在使用前先放置于五氧化二磷干燥器至室温，并且避光保存。称取5.1mg叶酸（Pteroylglutamic Acid, 纯度：98.0～102.0％ 和光特级）标准品，置于50mL棕色容量瓶中，用0.5％氨水溶液稀释，定容，摇匀。作为贮备液。用移液管吸取叶酸贮备液1mL，移入100mL棕色容量瓶中，用0.5％氨水溶液稀释，定容，摇匀。浓度为1020ng/mL.（STD 5）。分别吸取STD 5溶液1mL, 1mL, 5mL, 5mL, 置于20mL, 10mL, 25mL, 10mL容量瓶中，用0.5％氨水溶液稀释，定容，摇匀。浓度分别为 51ng/mL.（STD 1）；102ng/mL.（STD 2）；204ng/mL.（STD 3）；510ng/mL.（STD 4）。[align=center][b]表二：标准品及对应的浓度[/b][/align][align=center][b]Table 2．Standard and their concentrations[/b][/align][align=center] [table=307][tr][td=1,1,72] [align=center]标准品[/align] [/td][td=1,1,72] [align=center]　[/align] [/td][td=1,1,72] [/td][td=1,1,91] 浓度(ng/mL)[/td][/tr][tr][td] [align=center]STD1[/align] [/td][td] [align=center] [/align] [/td][td] [align=center] [/align] [/td][td] [align=center]51[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]STD2[/align] [/td][td] [align=center] [/align] [/td][td] [align=center] [/align] [/td][td] [align=center]102[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]STD3[/align] [/td][td] [align=center] [/align] [/td][td] [align=center] [/align] [/td][td] [align=center]204[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]STD4[/align] [/td][td] [align=center] [/align] [/td][td] [align=center] [/align] [/td][td] [align=center]510[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]STD5[/align] [/td][td] [align=center]　[/align] [/td][td] [align=center]　[/align] [/td][td] [align=center]1020[/align] [/td][/tr][/table][/align][b]2.4精密度重复性[/b] 5个标准均连续进样6次，测试标准品相对标准偏差。[b]2.5标准品稳定性[/b] 5℃保存的半个月的叶酸标准品贮备液，放至室温。用移液管吸取1mL移入100mL棕色容量瓶中，用0.5％氨水定容，摇匀。再用移液管吸取上述溶液，移入10mL棕色容量瓶中。用0.5％氨水定容，摇匀。连同新试验配制的同浓度标准品一起测试。观察叶酸标准品在0.5％氨水溶液中的稳定性。 [b]2.6样品前处理步骤[/b] 精密称取样品5.00g置于25mL棕色容量瓶中，用0.5%氨水溶解，定容，摇匀。超声波超声10分钟。10000rpm离心10分钟。取上清液，用0.45μm微孔滤膜过滤。作为检液。[b]2.7样品配制[/b] 每个样品测试3次，样品分析后，在各样品中添加1mL STD5标准品，来确定样品溶液中叶酸的保留时间。样品分析时间100分钟。[b]2.8样品回收率[/b] 样品名称：Amino Vital ATP 19582 精密称取样品5.00g，置于25mL棕色容量瓶中，用0.5％氨水溶解，定容，摇匀。10000rpm离心10分钟。吸取上清液，用0.45μm微孔滤膜过滤。作为空白检液。 精密称取10.00g样品，置于50mL棕色容量瓶中，用移液管吸取5mLSTD 5 溶液，移入同一容量瓶中， 用0.5％氨水溶解，定容，摇匀。10000rpm离心10分钟。吸取上清液，用0.45μm微孔滤膜过滤。作为回收率试验检液。[b]2.9确定最小检测浓度[/b] 用移液管吸取STD3标准品1mL置于10mL棕色容量瓶中，用0.5％氨水溶解，定容，摇匀。浓度为20ng/mL.[b]3.结论3.1标准曲线[/b][align=center][b]表三：标准品浓度和峰面积[/b][/align][align=center][b]Table 3.Standard concentration with their peak area[/b][/align][align=center] [table=288][tr][td=1,1,72] [align=center]C(ng/mL)[/align] [/td][td=1,1,72] [align=center]　[/align] [/td][td=1,1,72] [align=center]　[/align] [/td][td=1,1,72] [align=center]平均面积[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]51[/align] [/td][td] [align=center] [/align] [/td][td] [align=center] [/align] [/td][td] [align=center]16661[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]102[/align] [/td][td] [align=center] [/align] [/td][td] [align=center] [/align] [/td][td] [align=center]33061[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]204[/align] [/td][td] [align=center] [/align] [/td][td] [align=center] [/align] [/td][td] [align=center]66948[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]510[/align] [/td][td] [align=center] [/align] [/td][td] [align=center] [/align] [/td][td] [align=center]168852[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]1020[/align] [/td][td] [align=center]　[/align] [/td][td] [align=center]　[/align] [/td][td] [align=center]331618[/align] [/td][/tr][/table][/align][align=center][img=,547,246]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2024/03/202403181710144650_39_1626663_3.png[/img][/align][align=center][b]图一：叶酸标准品浓度和面积线性关系图[/b][/align][align=center][b]Fig1.Linearity of HPLC method[/b][/align]叶酸标准品线性回归方程： Y＝325.58x+555.10 R=0.9999 式中Y是面积；x是浓度；R是相关系数。[img=,553,174]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2024/03/202403181710143198_4423_1626663_3.png[/img][align=center][b]图二：204ng/mL叶酸标准品色谱图[/b][/align][align=center][b]Fig 2.Chromatogram of folic acid standard (204g/mL)[/b][/align][b]3.2精密度[/b]每个标准品重复测试6次，各相对标准偏差见表四：[align=center][b] [/b][/align][align=center][b]表四：叶酸标准品精密度测试数据[/b][/align][align=center][b]Table4.Percise of standards[/b][/align][align=center] [table=288][tr][td=1,1,72] [align=center]C(ng/mL)[/align] [/td][td=1,1,72] [align=center]　[/align] [/td][td=1,1,72] [align=center]　[/align] [/td][td=1,1,72] [align=center]RSD%[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]51[/align] [/td][td] [align=center] [/align] [/td][td] [align=center] [/align] [/td][td] [align=center]1.13%[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]102[/align] [/td][td] [align=center] [/align] [/td][td] [align=center] [/align] [/td][td] [align=center]1.20%[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]204[/align] [/td][td] [align=center] [/align] [/td][td] [align=center] [/align] [/td][td] [align=center]1.53%[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]510[/align] [/td][td] [align=center] [/align] [/td][td] [align=center] [/align] [/td][td] [align=center]0.22%[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]1020[/align] [/td][td] [align=center]　[/align] [/td][td] [align=center]　[/align] [/td][td] [align=center]0.34%[/align] [/td][/tr][/table][/align][b]3.3样品测试结果表五：HPLC方法测定的果冻类样品中叶酸含量Table 5. Folic acid content in gel samples(μg/100g) by HPLC[/b] [table][tr][td=1,1,516] 样品名 HPLC测定量(μg/100g)[/td][/tr][/table]1.Amino Vital 31.7Supersports 2. Amino Vital-1 17.63.Amino Vital-2　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 17.9 [table][tr][td=1,1,516] [/td][/tr][/table][b]3.4 回收率[/b]样品名：Amino Vital 　ATP 19582[b] 表六：添加回收率测定Table 6. Recoveries of folic acid to sample[/b] [table][tr][td=1,1,504] Amino Vital 回收率[/td][/tr][/table]1． 106％2 107%3． 109％ [table][tr][td=1,1,504] 平均回收率为107±1.5％[/td][/tr][/table][b] [/b][img=,528,162]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2024/03/202403181710147516_2748_1626663_3.png[/img][align=center][b]图三：回收率测试空白图谱（Amino Vital ATP 19582）[/b][/align][align=center][b]Fig 3.Recovery test chromatogram Blank(Amino Vital )[/b][/align][img=,528,164]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2024/03/202403181710146335_2905_1626663_3.png[/img][align=center][b]图四：回收率测试添加叶酸标准溶液图谱（Amino Vital ）[/b][/align][align=center][b]Fig 4.Recovery test chromatogram by adding folic acid standardsolution(Amino Vital )[/b][/align][b] 3.5 HPLC法与微生物法测试结果比较[/b]日本的国家标准是使用微生物方法测定叶酸的含量。微生物方法测定的是食品中总的叶酸含量，应该比HPLC方法测的的值要大些。为了比较HPLC方法的准确性，通过对应样品比较得知。[b]表七：微生物测定值与HPLC测定值比较Table 7. Comparison of the result of mircobiology method and HPLC method[/b] [table][tr][td=1,1,516] 样品名 微生物测定值(μg/100g) HPLC测定值(μg/100g)[/td][/tr][/table]1.Amino Vital 44 31.7Super sports 2. Amino Vital 18 17.6 3.Amino Vital　　　　　　　　　20　　　　　　　　 　17.9 [table][tr][td=1,1,516] [/td][/tr][/table][b]3.6总体评价及方法适应性[/b] 通过以上实验以及对实验数据的分析和比较，得出本方法线性拟合良好， 精密度高，最小检测限低。样品添加回收率在107±2％内，并且样品测试结果与微生物方法测试结果作比较，两者数据相近。本方法简便，前处理相对简便，可以为检测果冻类样品中叶酸含量提供可靠和准确的分析手段，同时也为其它食品中叶酸含量的检测提供参考。[b]4.讨论4.1分析条件选取 4.1.1流动相 [/b]流动相在HPLC分离分析中起着至关重要的作用。 过实验确定了本次实验的流动相。原因如下：[list=1][*]叶酸在碱性水溶液中溶解且稳定性较好，而大多数ODS柱在pH=2.0～7.0范围内使用，所以本文使用的流动相pH值在6.3比较适合[*]通过实验发现水相和甲醇的配比为92：8（v/v）分离效果最好。样品中叶酸和前面的杂质完全分离。[*]使用磷酸二氢钾和氢氧化钾来调节离子浓度和pH值。这时色谱峰形呈正态曲线，柱效最高。[/list][b]4.1.2检测器和检测波长[/b] 叶酸中有苯环和碟酰结构，图五。所以可以用紫外检测器来检测。虽然叶酸中有共轭结构，但是通过实验发现Pteroylglutamic Acid 无荧光吸收。所以不能使用荧光检测器。 由于条件限制，无全波长扫描的紫外光度计和二极管阵列检测器。所以通过文献和实验来找最佳波长。根据报道[sup][/sup]，叶酸在265nm，285nm至290nm以及365nm处有极大吸收。在265nm，285nm，290nm，365nm分析同一叶酸标准品，发现λ＝285nm处峰形最高。[b] [/b][align=center][img=,363,124]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2024/03/202403181710151110_6182_1626663_3.png[/img][/align][align=center][b]图五：叶酸的分子结构[/b][/align][align=center][b]Fig 5. Molecular structure of folicacid (Pteroylglutamic Acid)[/b][/align][b]4.1.3 进样量[/b] 所以根据本实验室条件，100μL的进样量适合并且满足实验要求。[b] 4.1.4分析时间[/b] 由于标准品在30分钟内就已出来，所以标准品采集时间仅需30分钟。但是样品中成分复杂，一定把样品中组分全部出尽才能进下一个样品。通过实验样品的采集时间为100分钟。[b]4.2试样标准的配制讨论 4.2.1样品试液选取[/b] 原则：确保叶酸在溶液中溶解且不被破坏。 实验证明：叶酸不溶解于纯水中，在酸性溶液中不稳定。而使用0.5％氨水溶液较好地溶解叶酸，而且通过稳定性实验，叶酸在该试液中稳定，峰面积无显著变化。[b] 4.2.2标准品浓度选取[/b] 本实验样品的浓度恰好在线性范围内，而且标准品浓度与响应值呈一元线性关系。[b] 4.2.3样品前处理[/b] 样品使用0.5％氨水溶液溶解。由于样品呈液胶状，超声波超声可以击碎胶状物质，使其分散。通过实验发现10分钟超声可以使之形成均一、稳定的溶液。[b]5.后续工作及前景[/b] 由于条件的限制和目的要求的局限，本文只对一种叶酸化合物进行分析测试，而食品中的叶酸形式有五种之多。通过流动相摸索和梯度洗脱完全能够使不同形式的叶酸得到分离，以此扩大分析的范围。同时叶酸分析也可以通过色谱条件的摸索与其它物质（尤其是水溶性维生素）一起分析，达到提高效率的目的。为了使灵敏度提高，高效能的检测器的选择有着可观的前景。现在困扰我们分析叶酸含量的主要问题是样品中叶酸含量甚微，仅仅是ng级。紫外检测器最小检测限也就是这个级别。本文也指出：一味地扩大样品称样量或增加样品进样量会导致噪音增大，同样不能提高灵敏度。所以象一些专属性较强的检测器如荧光检测器，电化学检测器是考虑的一个方向。荧光检测器的灵敏度可以达到pg级。对于荧光检测器不能检测Pteroylglutamic Acid，是由于该物质没有荧光发色基团。我们可以通过柱前或柱后衍生的方法让其接上荧光发色基团，或者是柱前分离柱后通过反应液改变它的结构，提高检测的灵敏度。而使用电化学检测器需要摸索诸如电离电压，流动相等等条件。由于电化学检测器它的专属性很高，不容易受到干扰物质的影响。它应该是一个发展方向。从样品前处理的角度考虑，前处理步骤越少，分析时间更短，目标物在处理时损失越少，相对实验成本越低是改进原有实验方法的目标。一般对于含有复杂成分且目标分析物含量甚微的样品要去除干扰物质然后富集待测组分。固相萃取技术（solidphase extraction, SPE）应当是一个比较好的样品前处理方法。但是固相萃取技术的一个弱点是样品容易损失，回收率不高引起准确性不高。荷兰的Knoing教授使用亲和层析（affinity chromatography）的方法来提高待测物富集和纯化的效率。可见食品中叶酸分析应该还是一个难点，同时又是一个热点。快速高效准确的方法会随着仪器性能的进步和方法的进一步完善成熟而成熟。[b]6.参考文献[/b][list=1][*]中国药典编委会．中国药典（2000）二部，北京：化学工业出版社，2000.[*]Johan D.M. P. Jelena A. J. Sofia B.H., Development of aSimplified Method for the Determination of Folates in Baker’s Yeast by HPLCwith Ultraviolet and Fluorescence Detection. J.Agric. Food Chem. 2005,53:2406-2411.[*]Douglas L.H. RandyL.W. Michael G.Z., Determination ofnative folates in milk and other dairy products by high-performance liquidchromatography. J.Chrom. 1988, 449 : 271-279.[*]Stefania R. Liisa T.V. AlteroA., Determination of folate vitamersin food and in Italian reference diet by high-performance liquidchromatography.J.Chrom A . 1999, 855: 237-245.[*]Konings EJM，A validated LC method for the determinationof folates in vegetables, milk powder, liver and flour.J AOAC Int. 1999, 82: 119-127.[*]Eduward Chu. James C.Drake. Donna Boarman, Mechanism of Thymidylate Synthase Inhibition by Methotrexate inHuman Neoplastic Cell Lines and Normal Human Myeloid Progenitor, J. Biochem.1990,265: 8470-8473.[*]Pamela J.Bagley Jacob selhub,Analysis of Folate Form Distribution by Affinity Followed by Reversed-PhaseChromatography with Electrochemical Detection, Clin. Chem. 2000, 46: 404.[*] FreislebenA. Schieberle P. Rychlik M., Comparison of folate quantification in foods byhight-performance liquid chromatography-fluorescence detection to that bystable isotope dilution assays using high-performance liquid chromatography-tandemmass spectrometry. Anal. Biochem. 2003, 315: 247-255.[*] 赵永芳.生物化学技术原理及应用(第三版)．北京：科学出版社，2003.10[*] 吴坤等.营养与食品卫生学（第五版）．北京：人民卫生出版社，2005.[/list][hr/] ①PteroylglutamicAcid②检测限是以叶酸（Pt-Glu）来计算。③微生物测定值是日本食品研究所用微生物法测定。

关于食品中叶酸的测定新国标的一些问题1.在6.4.2.1微孔板法中，试样系列管要求加入100、200、300 μL，补水至500 μL，相当于试管法缩小了10倍；而6.4.2.2标准管则要求按比例缩减至1mL，请问这里的1mL是指加入培养基后的总体积为1mL还是补水至1mL，即缩小十倍还是五倍。

[size=5]GB 15570－1995 食品添加剂 叶酸[/size]

1.在6.4.2.1微孔板法中，试样系列管要求加入100、200、300 μL，补水至500 μL，相当于试管法缩小了10倍；而6.4.2.2标准管则要求按比例缩减至1mL，请问这里的1mL是指加入培养基后的总体积为1mL还是补水至1mL，即缩小十倍还是五倍。2.在7.2试样结果计算中，依然要求叶酸含量在0.1～0.8ng的范围，请问微孔板法是否应该按比例缩小，缩小比例应该是多少。3.在7.2中注的描述是微孔板法对应的Vx分别为1、2、3mL，这里是否只是描述微孔板法与试管法互相对应的梯度，叶酸浓度是否还是用100、200、300 μL进行计算。

叶酸是溶解于水中，用氨水调PH到9~10之间，再用含少量乙腈的水稀释定容的。流动相就是普通的水和甲醇、离子对试剂，调PH至酸性。峰型还好，但精密度很差，线性一般只有0.99*，有时候是0.999，但液相做到4个9我觉得才是正常的。3个9误差太大了。后来改用水稀释定容试了一下，结果更差。1微克/毫升的出峰比2微克/毫升的小得太多，3微克/毫升比2微克/毫升峰还略小。

摘 要 目的：本文采用反相高效液相色谱法建立测定果冻类食品叶酸（folic acid）含量的分析的方法。方法：使用C18柱作为分析柱，磷酸缓冲液和甲醇作为流动相，紫外检测器作为检测器，叶酸（Pteroylmonoglutamic acid）作为对照品，果冻食品作为样品。结论：该法在50ng/mL-1000ng/mL之间呈良好的线性，重现性好RSD＜2%，回收率在107±2%，稳定性良好，最小检测限20ng/mL。样品测试结果与微生物检测结果相符。本法可以作为测定食品中叶酸含量的一个方法。 关键词：叶酸，HPLC， 果冻样品 Abstracts Aim: A simple method for the determination of folic acid in gel sample by high-performance liquid chromatography with UV-detection is reported. Methods: The method was simple by using RP-column (C18) with phosphorate –methanol as mobile phase and UV as a detector. Conclusion: The calibration graph was linear from 50 to 1000ng/mL for folic acid with a correlation coefficient of 0.999(n=5). The detection limit is 20ng/mL. The method was successfully applied for determination of folic acid in the gel sample. The recovery was 107±1.5% and the reletive standard deviation was no more than 2%. Compared with microbiology method, the results of the samples are same. This method can be used for content determination of the folic acid in gel sample. Key Words: folic acid, HPLC, gel sample

[align=center][font=DengXian]维生素[/font]B11([font=DengXian]叶酸[/font])[/align][font=DengXian]绿色蔬菜和动物肝脏中富含叶酸，乳中含量较低。蔬菜中的叶酸呈结合型，而肝中的叶酸呈游离态。人体肠道中可合成部分叶酸。[/font][font=DengXian]分子结构中含有蝶啶、对氨基苯甲酸和[/font]L-[font=DengXian]谷氨酸三部分。[/font][font=DengXian]叶酸缺乏时，脱氧胸苷酸，嘌呤核苷酸的形式及氨基酸的互变受阻，细胞内[/font]DNA[font=DengXian]合成减少，细胞的分裂成熟发生障碍，引起巨幼红细胞性贫血。[/font] [font=DengXian]小肠疾病能干扰食物叶酸的吸收和经肝肠循环的再循环过程，故叶酸缺乏是小肠疾病常见的一种并发症。[/font]

[color=#444444]各位大神，我用[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]液质联用[/color][/url]0.1%甲酸：甲醇10:90，或者0.5%乙酸：甲醇=50:50等比例跑流动相，配的叶酸标准溶液连总离子流图都没有出峰。请问这是为何啊？[/color]

婴幼儿食品叶酸检测的周期大概是多少？我们做了半个月正常吗？望老师不吝赐教

我的样品及对照品的谱图中，除了内标峰，还有一个5min左右的小峰，还有一个面积较大的峰，其保留时间一直在推后，第二天进同一个样品溶液时，这个峰就不见了，这个峰是什么原因产生的呢？是叶酸的峰吗？5min的小峰是什么峰呢？不是溶剂峰。在样品溶液没有变化的情况下，加入了叶酸样品，5min的峰变大，可以由此断定此峰就是叶酸峰吗？请大家指教！！拜谢！！

大家在做总银杏叶酸时，如何称取对照品A和B的，图谱里有几个峰呢？多长时间出？用的什么色谱柱呢？问题有点多，希望有兴趣的来讨论下

请问用什么填料的色谱柱分离叶酸和叶酸络合物较好？

急用水果中叶酸的测定方法！请各位高手赐教！万分感谢！

[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]气相[/url]分析脂肪酸甲酯标准品，怎样处理标准品？用什么溶剂稀释？

求助：有哪位测过叶酸，用什么溶剂溶解的呢？我试过甲醇、乙腈和水，都不溶？谢谢

本人最近做了一个饲料中的烟酸叶酸，方法按照相关国标中测定的。方法很简单，直接提取过滤或者离心就上机，但是回收率为0。重复多次都是这样的结果，多次调整实验中固液比例仍然是此结果。以前也做过饲料中的烟酸叶酸，但是没有遇到过这样的问题。想求助高人解释一下为什么会出现这样的问题

水溶性； 　　维生素B族中的一种，亦称为维生素BC或维生素M； 　　计量单位是微克（mcg）； 　　是制造红血球不可缺少的物质； 　　帮助蛋白质的代谢。 　　成人的建议每日摄取量是180～200mcg，孕妇加倍，哺乳期的妇女在头6个月需要280mcg，之后的6个月则需260mcg； 　　在制造核酸（核糖核酸、脱氧核糖核酸）上扮演重要的角色； 　　是细胞增殖不可少的物质； 　　人体在利用糖分和氨基酸时的必要物质； 　　在室温中长时间无遮护的贮存时将被破坏。 　　效用 　　促进乳汁的分泌； 　　防治肠内的寄生虫和食物中毒； 　　增进皮肤的健康； 　　有镇痛剂的作用； 　　与泛酸及对氨基苯甲酸一起服用时，可防止白发； 　　在身体衰弱（健康状态不良）时，可增进食欲； 　　防止口腔粘膜溃疡； 　　预防贫血。 　　缺乏症 　　巨红血球性贫血 　　富含叶酸的食物 　　深绿叶蔬菜、胡萝卜、动物肝脏、蛋黄、美国甜瓜、杏、南瓜、鳄梨、豆类、全麦、黑裸麦面粉。 　　营养补品 　　一般是400mcg的制剂。如果有医生的处方，可以买到lmg（1000mcg）剂量的叶酸。 　　有的复合维生素B制剂中含有400mcg的叶酸，但大多数复合维生素B制剂中只含有100mcg（请查看标签）。 　　一般的每日摄取量是400mcg～500mcg。 　　营养补品 　　并未发现有副作用。有些人服用后会引起过敏性皮肤炎。 　　叶酸之敌 　　水、磺胺药剂、阳光、雌激素、食品加工（特别是煮沸）、高温。 　　建议 　　如果您是常喝酒的人，多摄取叶酸为好； 　　大量的维生素C会加速叶酸的排出，所以，摄取维生素C在2g以上的人必须增加叶酸的量； 　　正使用苯妥英（抗癫痫药），或是服用雌激素、磺胺类药物、苯巴比妥（安眠药与镇定剂）、阿司匹林时，应该增加叶酸的摄取量； 　　我曾经发现，有许多人在短期间内每天摄取1～5mg的叶酸，结果皮肤上的斑点消失了。如果您有这方面的烦恼，可以去请教营养医师； 　　如果您感觉到似乎要生病，或者是已经生病了，必须要摄取抗紧张感的营养补品，切记要先查看其中是否含有充分的叶酸。叶酸不足时，抗体会减少，抵抗力将减弱； 　　大量摄取叶酸会使服食二苯乙内酰脲的癫痫症患者产生痉挛现象。

我们在检测婴幼儿乳粉的叶酸时，一直连曲线都做不好，求助高手帮忙！！！！

请问哪位老师做过乳粉中叶酸的检测，用液相色谱或液质的方法，希望可以分享一下。