甲醇蛋白测序级

蛋白测序和质谱的区别

听说蛋白酶解肽段二级质谱图可以通过de novo方法测序，请问，除了手工解析，用哪些软件可以快速鉴定辅助解析

各位大侠，给支个招，哪里可以既做高效液相又蛋白测序啊？我的样品现在是两个成分混在一起，分子量又都很小，我想测序，可最好是先用HPLC分开再来测，哪家公司或者研究所提供这方面的服务啊？

甲醇沉淀法除血清中蛋白时，加入甲醇的比例是多少．多谢指教！[em62]

大家好，我们这里现有一个分子量为11kd的蛋白质想要对其进行二级结构的核磁测序,但由于分子量相对比较大,我联系了国内的很多大学和科研机构都不能完成，因为我赶着毕业所以急需可以做这种检测的单位. 我希望大家可以向我提供对外可以做这么大分子量蛋白质核磁测序的单位，我们愿意付费对该蛋白质进行核磁测序. 对您的帮助表示万分感谢!! 谢谢谢谢谢谢！！！！ 我的邮箱：lzjqq001@yahoo.com.cn

甲醇沉淀蛋白时候用调节ph吗？调ph对沉淀效率有影响吗？

Edman降解法是测定蛋白质序列的经典方法，该方法由瑞士生物化学家佩尔维克托于1950年创立。Edman降解法通常是以周期的形式来表征。对于一个完整的周期，异硫氰酸苯酯标记上指定肽段的N末端，环化，之后被标记的氨基酸在酸性条件下从肽链中游离出来，进一步酸化后形成一个更加稳定的乙内酰苯硫脲-氨基酸(PTH-AA)衍生物。PTH-AA衍生物可以通过高效液相色谱鉴定。埃德曼降解周期就是通过反复地将多肽的氨基酸依次降解下来，从而鉴定氨基酸序列。　　1982年，美国应用生物系统(ABI)公司了将第一台商用自动多肽测序仪推向市场，并被实践证明是可靠和耐用的。实际上，在过去几十年中，自动多肽测序仪只有屈指可数的一些改进，但此类自动肽测序仪仍是测定肽序列的黄金标准。然而，串联质谱的使用已经成为日益重要的肽序列测定工具。质谱，特别是串联飞行时间(TOF-TOF 和QTOF)质谱仪可以对少量样本进行更快速的分析。　　与质谱相比，自动Edman降解测序的明显优势在于：已被化学验证的精确性、系统初始投资较小 然而，它的缺点是：分析时间较长、测得序列数有限，典型的测量长度范围是20~50个氨基酸序列。而对于低丰度的肽、无法获得N末端的肽，或者需要更短的分析时间，质谱则是理想的工具。但是，质谱价格高且无法区分同分异构的氨基酸。　　虽然美国应用生物系统(ABI)公司主导了自动多肽测序仪的市场，但由于市场疲软，ABI于2008年6月停止生产自动多肽测序仪。然而岛津公司看准了机会，在2009年匹兹堡会议上将其PPSQ自动多肽测序仪推向北美市场，PPSQ已在日本广泛应用超过20年。另一方面，对用质谱测定蛋白质序列的方法改进的需求保持旺盛，布鲁克道尔顿公司最近推出了Edmass Micro MALDI-TOF和 Edmass Ultra TOF-TOF 系统，这是专门为没有质谱使用经验的多肽化学家们设计的。　　自动多肽测序仪的市场主要来自于科研机构，但过去几年中自动多肽测序仪的市场需求增长处于某种停滞状态，尤其是质谱变得容易获得。但是，随着肽自动测序仪在连续使用过程中的老化，Edamn化学家们正在准备购买新设备。售后服务、附件、耗材及试剂有望在短期内对自动多肽测序仪市场产生推动作用。

[font=宋体][font=宋体]真核蛋白表达系统是一种广泛应用的蛋白表达方式，通常利用酵母、昆虫或哺乳动物细胞作为宿主。这种表达系统所生成的蛋白与目标[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]具有极高的相似性，能诱导高效蛋白表达。那么，在实施真核蛋白表达时，有哪些关键的纯化步骤呢？接下来，我们将详细解析这一过程。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]首先，我们要明确真核蛋白表达的纯化步骤是至关重要的环节。这些步骤不仅关系到最终产品的纯度和产量，还直接影响其生物活性和应用价值。因此，选择合适的纯化方法对于整个实验的成功至关重要。[/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]真核蛋白表达及纯化步骤主要有以下几个方面：[/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1[/font][font=宋体]、重组质粒构建：将目的基因克隆进表达载体，常见的方法包括限制性切酶切割，基因合成等，根据连接酶说明，进行线性载体和目的基因片段的酶联，最后对质粒测序做好验证；[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]、蛋白诱导表达：普适条件下查看蛋白是否表达，若不表达，更换载体，表达菌株等方法查看是否表达，如果表达，继续实验；[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]3[/font][font=宋体]、蛋白表达部位分析：分析蛋白是可溶性还是不溶性的表达，即在超声后上清表达还是沉淀表达；是否与你的目标蛋白表达部位相同，相同进行后续蛋白表达条件优化；[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]4[/font][font=宋体]、蛋白表达优化：优化诱导[/font][font=Calibri]IPTG[/font][font=宋体]浓度、诱导温度，进行放大培养；[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]5[/font][font=宋体]、蛋白纯化：根据目标蛋白的性质进行样本处理，然后进行亲和纯化，获取目的蛋白。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]真核表达系统的选择与应用[/b][/font][font=宋体]酵母蛋白表达系统[/font][font=宋体]酵母真核蛋白表达系统有甲醇酵母表达系统，酿酒酵母表达系统，裂殖酵母表达系统以及克鲁维酸酵母表达系统等，其中最早应用于基因工程的酵母是酿酒酵母，但现在运用最广泛的酵母表达系统还是甲醇酵母表达系统中的毕赤酵母真核蛋白表达系统。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]哺乳动物细胞表达系统[/font][font=宋体][font=宋体]哺乳动物细胞表达系统是真核表达系统中唯一可以表达复杂蛋白的系统，它能够指导真核表达蛋白进行正确折叠，提供复杂的[/font][font=Calibri]N[/font][font=宋体]型糖基化和准确的[/font][font=Calibri]O[/font][font=宋体]型糖基化等多种翻译后加工功能，所以它和昆虫酵母系统比较更具有发展潜力，哺乳动物细胞真核表达的蛋白与天然真核表达蛋白的结构、糖基化类型和方式几乎相同且能正确组装成多亚基蛋白[/font][font=Calibri],[/font][font=宋体]但成本较高也一定程度上减缓了它的发展速度。哺乳动物细胞表达系统主要是通过改造宿主细胞来提高外源蛋白的表达效率，常用的宿主细胞有[/font][font=Calibri]CHO[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]COS[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]BHK[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]SP2 /0N[/font][font=宋体]等，哺乳动物转染方法[/font][font=Calibri]*[/font][font=宋体]有脂质体转染法，电穿孔法以及病毒转染等。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州[url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-techniques][b]蛋白纯化技术[/b][/url]：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-techniques[/font][/font][font=Calibri] [/font]

传统的蛋白鉴定方法，如免疫印迹法、内肽的化学测序、已知或未知蛋白的comigration分析，或者在一个有机体中有意义的基因的过表达通常耗时、耗力，不适合高流通量的筛选。 目前，所选用的技术包括对于蛋白鉴定的图象分析、微量测序、进一步对肽片段进行鉴定的氨基酸组分分析和与质谱相关的技术。1 图象分析技术（Image analysis）“满天星”式的2-DE图谱分析不能依靠本能的直觉，每一个图象上斑点的上调、下调及出现、消失，都可能在生理和病理状态下产生，必须依靠计算机为基础的数据处理，进行定量分析。 在一系列高质量的2-DE凝胶产生（低背景染色，高度的重复性）的前提下，图象分析包括斑点检测、背景消减、斑点配比和数据库构建。 首先，采集图象通常所用的系统是电荷耦合CCD（charge coupled device）照相机；激光密度仪（laser densitometers）和Phospho或Fluoroimagers，对图象进行数字化。 并成为以象素（pixels）为基础的空间和网格。 其次，在图象灰度水平上过滤和变形，进行图象加工，以进行斑点检测。 利用Laplacian，Gaussian，DOG（difference of Gaussians） opreator使有意义的区域与背景分离，精确限定斑点的强度、面积、周长和方向。图象分析检测的斑点须与肉眼观测的斑点一致。 在这一原则下，多数系统以控制斑点的重心或最高峰来分析，边缘检测的软件可精确描述斑点外观，并进行边缘检测和邻近分析，以增加精确度。 通过阈值分析、边缘检测、销蚀和扩大斑点检测的基本工具还可恢复共迁移的斑点边界。 以PC机为基础的软件Phoretix-2D正挑战古老的Unix为基础的2-D分析软件包。 第三，一旦2-DE图象上的斑点被检测，许多图象需要分析比较、增加、消减或均值化。 由于在2-DE中出现100%的重复性是很困难的，由此凝胶间的蛋白质的配比对于图象分析系统是一个挑战。 IPG技术的出现已使斑点配比变得容易。 因此，较大程度的相似性可通过斑点配比向量算法在长度和平行度观测。 用来配比的著名软件系统包括Quest，Lips，Hermes，Gemini等，计算机方法如相似性、聚类分析、等级分类和主要因素分析已被采用，而神经网络、子波变换和实用分析在未来可被采用。 配比通常由一个人操作，其手工设定大约50个突出的斑点作为“路标”，进行交叉配比。 之后，扩展至整个胶。例如：精确的PI和MW（分子量）的估计通过参考图上20个或更多的已知蛋白所组成的标准曲线来计算未知蛋白的PI和MW。 在凝胶图象分析系统依据已知蛋白质的pI值产生PI网络，使得凝胶上其它蛋白的PI按此分配。 所估计的精确度大大依赖于所建网格的结构及标本的类型。 已知的未被修饰的大蛋白应该作为标志，变性的修饰的蛋白的PI估计约在±0。25个单位。 同理，已知蛋白的理论分子量可以从数据库中计算，利用产生的表观分子量的网格来估计蛋白的分子量。 未被修饰的小蛋白的错误率大约30%，而翻译后蛋白的出入更大。 故需联合其他的技术完成鉴定。2 微量测序（microsequencing）蛋白质的微量测序已成为蛋白质分析和鉴定的基石，可以提供足够的信息。 尽管氨基酸组分分析和肽质指纹谱（PMF）可鉴定由2-DE分离的蛋白，但最普通的N-末端Edman降解仍然是进行鉴定的主要技术。 目前已实现蛋白质微量测序的自动化。 首先使经凝胶分离的蛋白质直接印迹在PVDF膜或玻璃纤维膜上，染色、切割，然后直接置于测序仪中，可用于subpicomole水平的蛋白质的鉴定。 但有几点需注意：Edman降解很缓慢，序列以每40 min 1个氨基酸的速率产生；与质谱相比，Edman降解消耗大；试剂昂贵，每个氨基酸花费

大家好，氨基酸分析仪与蛋白质测序仪有主要区别在什么地方呢？目前实验室需要进行氨基酸的测序分析，究竟买一台蛋白质测序仪好呢，还是氨基酸分析仪好呢？价格大概有多少呢？这些仪器有没有国产的呢 QQ：2392795357

几种常用的蛋白鉴定方法传统的蛋白鉴定方法，如免疫印迹法、内肽的化学测序、已知或未知蛋白的comigration分析，或者在一个有机体中有意义的基因的过表达通常耗时、耗力，不适合高流通量的筛选。 目前，所选用的技术包括对于蛋白鉴定的图象分析、微量测序、进一步对肽片段进行鉴定的氨基酸组分分析和与质谱相关的技术。1 图象分析技术（Image analysis）“满天星”式的2-DE图谱分析不能依靠本能的直觉，每一个图象上斑点的上调、下调及出现、消失，都可能在生理和病理状态下产生，必须依靠计算机为基础的数据处理，进行定量分析。 在一系列高质量的2-DE凝胶产生（低背景染色，高度的重复性）的前提下，图象分析包括斑点检测、背景消减、斑点配比和数据库构建。 首先，采集图象通常所用的系统是电荷耦合CCD（charge coupled device）照相机；激光密度仪（laser densitometers）和Phospho或Fluoroimagers，对图象进行数字化。 并成为以象素（pixels）为基础的空间和网格。 其次，在图象灰度水平上过滤和变形，进行图象加工，以进行斑点检测。 利用Laplacian，Gaussian，DOG（difference of Gaussians） opreator使有意义的区域与背景分离，精确限定斑点的强度、面积、周长和方向。图象分析检测的斑点须与肉眼观测的斑点一致。 在这一原则下，多数系统以控制斑点的重心或最高峰来分析，边缘检测的软件可精确描述斑点外观，并进行边缘检测和邻近分析，以增加精确度。 通过阈值分析、边缘检测、销蚀和扩大斑点检测的基本工具还可恢复共迁移的斑点边界。 以PC机为基础的软件Phoretix-2D正挑战古老的Unix为基础的2-D分析软件包。 第三，一旦2-DE图象上的斑点被检测，许多图象需要分析比较、增加、消减或均值化。 由于在2-DE中出现100%的重复性是很困难的，由此凝胶间的蛋白质的配比对于图象分析系统是一个挑战。 IPG技术的出现已使斑点配比变得容易。 因此，较大程度的相似性可通过斑点配比向量算法在长度和平行度观测。 用来配比的著名软件系统包括Quest，Lips，Hermes，Gemini等，计算机方法如相似性、聚类分析、等级分类和主要因素分析已被采用，而神经网络、子波变换和实用分析在未来可被采用。 配比通常由一个人操作，其手工设定大约50个突出的斑点作为“路标”，进行交叉配比。 之后，扩展至整个胶。例如：精确的PI和MW（分子量）的估计通过参考图上20个或更多的已知蛋白所组成的标准曲线来计算未知蛋白的PI和MW。 在凝胶图象分析系统依据已知蛋白质的pI值产生PI网络，使得凝胶上其它蛋白的PI按此分配。 所估计的精确度大大依赖于所建网格的结构及标本的类型。 已知的未被修饰的大蛋白应该作为标志，变性的修饰的蛋白的PI估计约在±0。25个单位。 同理，已知蛋白的理论分子量可以从数据库中计算，利用产生的表观分子量的网格来估计蛋白的分子量。 未被修饰的小蛋白的错误率大约30%，而翻译后蛋白的出入更大。 故需联合其他的技术完成鉴定。2 微量测序（microsequencing）蛋白质的微量测序已成为蛋白质分析和鉴定的基石，可以提供足够的信息。 尽管氨基酸组分分析和肽质指纹谱（PMF）可鉴定由2-DE分离的蛋白，但最普通的N-末端Edman降解仍然是进行鉴定的主要技术。 目前已实现蛋白质微量测序的自动化。 首先使经凝胶分离的蛋白质直接印迹在PVDF膜或玻璃纤维膜上，染色、切割，然后直接置于测序仪中，可用于subpicomole水平的蛋白质的鉴定。 但有几点需注意：Edman降解很缓慢，序列以每40 min 1个氨基酸的速率产生；与质谱相比，Edman降解消耗大；试剂昂贵，每个氨基酸花费3～4$。 这都说明泛化的Edman降解蛋白质不适合分析成百上千的蛋白质。 然而，如果在一个凝胶上仅有几个有意义的蛋白质，或者如果其他技术无法测定而克隆其基因是必需的，则需要进行泛化的Edman降解测序。近来，应用自动化的Edman降解可产生短的N-末端序列标签，这是将质谱的序列标签概念用于Edman降解，业已成为一种强有力的蛋白质鉴定。 当对Edman的硬件进行简单改进，以迅速产生N-末端序列标签达10～20个/d，序列检签将适于在较小的蛋白质组中进行鉴定。若联合其他的蛋白质属性，如氨基酸组分分析、肽质质量、表现蛋白质分子量、等电点，可以更加可信地鉴定蛋白质。 选择BLAST程序，可与数据库相配比。 目前，采用一种Tagldent的检索程序，还可以进行种间比较鉴定，又提高了其在蛋白质组研究中的作用。3 与质谱（mass spectrometry）相关的技术质谱已成为连接蛋白质与基因的重要技术，开启了大规模自动化的蛋白质鉴定之门。 用来分析蛋白质或多肽的质谱有两个主要的部分，1）样品入机的离子源，2）测量被介入离子的分子量的装置。 首先是基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）为一脉冲式的离子化技术。 它从固相标本中产生离子，并在飞行管中测其分子量。 其次是电喷雾质谱（ESI-MS），是一连续离子化的方法，从液相中产生离子，联合四极质谱或在飞行时间检测器中测其分子量。 近年来，质谱的装置和技术有了长足的进展。在MALDI-TOF中，最重要的进步是离子反射器（ion reflectron）和延迟提取（delayed ion extraction），可达相当精确的分子量。 在ESI-MS中，纳米级电雾源（nano-electrospray source）的出现使得微升级的样品在30～40 min内分析成为可能。将反相液相色谱和串联质谱（tandem MS）联用，可在数十个picomole的水平检测；若利用毛细管色谱与串联质谱联用，则可在低picomole到高femtomole水平检测；当利用毛细管电泳与串联质谱连用时，可在小于femtomole的水平检测。 甚至可在attomole水平进行。 目前多为酶解、液相色谱分离、串联质谱及计算机算法的联合应用鉴定蛋白质。 下面以肽质指纹术和肽片段的测序来说明怎样通过质谱来鉴定蛋白质。(1)肽质指纹术（peptide mass fingerprint， PMF）由Henzel等人于1993年提出。 用酶（最常用的是胰酶）对由2-DE分离的蛋白在胶上或在膜上于精氨酸或赖氨酸的C-末端处进行断裂，断裂所产生的精确的分子量通过质谱来测量（MALDI-TOF-MS，或为ESI-MS），这一技术能够完成的肽质量可精确到0。1个分子量单位。 所有的肽质量最后与数据库中理论肽质量相配比（理论肽是由实验所用的酶来“断裂”蛋白所产生的）。 配比的结果是按照数据库中肽片段与未知蛋白共有的肽片段数目作一排行榜，“冠军”肽片段可能代表一个未知蛋白。若冠亚军之间的肽片段存在较大差异，且这个蛋白可与实验所示的肽片段覆盖良好，则说明正确鉴定的可能性较大。(2)肽片段（peptide fragment）的部分测序肽质指纹术对其自身而言，不能揭示所衍生的肽片段或蛋白质。 为进一步鉴定蛋白质，出现了一系列的质谱方法用来描述肽片段。 用酶或化学方法从N-或C-末端按顺序除去氨基酸，形成梯形肽片段（ladder peptide）。 首先以一种可控制的化学模式从N-末端降解，可产生大小不同的一系列的梯形肽片段，所得一定数目的肽质量由MALDI-TOF-MS测量。 另一种方法涉及羧基肽酶的应用，从C-末端除去不同数目的氨基酸形成肽片段。 化学法和酶法可产生相对较长的序列，其分子量精确至以区别赖氨酸（128。09）和谷氨酰胺（128。06）。 或者，在质谱仪内应用源后衰变（post-source decay， PSD）和碰撞诱导解离（collision-induced dissociation， CID），目的是产生包含有仅异于一个氨基酸残基质量的一系列肽峰的质谱。 因此，允许推断肽片段序列。 肽片段PSD的分析在MALDI反应器上能产生部分序列信息。 首先进行肽质指纹鉴定。 之后，一个有意义的肽片段在质谱仪被选作“母离子”，在飞行至离子反应器的过程中降解为“子离子”。 在反应器中，用逐渐降低的电压可测量至检测器的不同大小的片段。 但经常产生不完全的片段。 现在用肽片段来测序的方法始于70年代末的CID，可以一个三联四极质谱ESI-MS或MALDI-TOF-MS联合碰撞器内来完成。 在ESI-MS中，由电雾源产生的肽离子在质谱仪的第一个四极质谱中测量，有意义的肽片段被送至第二个四极质谱中，惰性气体轰击使其成为碎片，所得产物在第三个四极质谱中测量。 与MALDI-PSD相比，CID稳定、强健、普遍，肽离子片段基本沿着酰胺键的主架被轰击产生梯形序列。 连续的片段间差异决定此序列在那一点的氨基酸的质量。 由此，序列可被推测。 由CID图谱还可获得的几个序列的残基，叫做“肽序列标签”。 这样，联合肽片段母离子的分子量和肽片段距N- C端的距离将足以鉴定一个蛋白质。4 氨基酸组分分析1977年首次作为鉴定蛋白质的一种工具，是一种独特的“脚印”技术。 利用蛋白质异质性的氨基酸组分特征，成为一种独立于序列的属性，不同于肽质量或序列标签。 Latter首次表明氨基酸组分的数据能用于从2-DE凝胶上鉴定蛋白质。 通过放射标记的氨基酸来测定蛋白质的组分，或者将蛋白质印迹到PVDF膜上，在15

蛋白质结构分析：制备、鉴定与微量测序

请问生物育种、基因测序、蛋白质 这些方面有哪些仪器啊？这些有关生物学方面的知识我一点都不明白。就连这个问题问的对不对，我都不知道！

传统的蛋白鉴定方法，如免疫印迹法、内肽的化学测序、已知或未知蛋白的comigration分析，或者在一个有机体中有意义的基因的过表达通常耗时、耗力，不适合高流通量的筛选。 目前，所选用的技术包括对于蛋白鉴定的图象分析、微量测序、进一步对肽片段进行鉴定的氨基酸组分分析和与质谱相关的技术。1 图象分析技术（Image analysis）“满天星”式的2-DE图谱分析不能依靠本能的直觉，每一个图象上斑点的上调、下调及出现、消失，都可能在生理和病理状态下产生，必须依靠计算机为基础的数据处理，进行定量分析。 在一系列高质量的2-DE凝胶产生（低背景染色，高度的重复性）的前提下，图象分析包括斑点检测、背景消减、斑点配比和数据库构建。 首先，采集图象通常所用的系统是电荷耦合CCD（charge coupled device）照相机；激光密度仪（laser densitometers）和Phospho或Fluoroimagers，对图象进行数字化。 并成为以象素（pixels）为基础的空间和网格。 其次，在图象灰度水平上过滤和变形，进行图象加工，以进行斑点检测。 利用Laplacian，Gaussian，DOG（difference of Gaussians） opreator使有意义的区域与背景分离，精确限定斑点的强度、面积、周长和方向。图象分析检测的斑点须与肉眼观测的斑点一致。 在这一原则下，多数系统以控制斑点的重心或最高峰来分析，边缘检测的软件可精确描述斑点外观，并进行边缘检测和邻近分析，以增加精确度。 通过阈值分析、边缘检测、销蚀和扩大斑点检测的基本工具还可恢复共迁移的斑点边界。 以PC机为基础的软件Phoretix-2D正挑战古老的Unix为基础的2-D分析软件包。 第三，一旦2-DE图象上的斑点被检测，许多图象需要分析比较、增加、消减或均值化。 由于在2-DE中出现100%的重复性是很困难的，由此凝胶间的蛋白质的配比对于图象分析系统是一个挑战。 IPG技术的出现已使斑点配比变得容易。 因此，较大程度的相似性可通过斑点配比向量算法在长度和平行度观测。 用来配比的著名软件系统包括Quest，Lips，Hermes，Gemini等，计算机方法如相似性、聚类分析、等级分类和主要因素分析已被采用，而神经网络、子波变换和实用分析在未来可被采用。 配比通常由一个人操作，其手工设定大约50个突出的斑点作为“路标”，进行交叉配比。 之后，扩展至整个胶。例如：精确的PI和MW（分子量）的估计通过参考图上20个或更多的已知蛋白所组成的标准曲线来计算未知蛋白的PI和MW。 在凝胶图象分析系统依据已知蛋白质的pI值产生PI网络，使得凝胶上其它蛋白的PI按此分配。 所估计的精确度大大依赖于所建网格的结构及标本的类型。 已知的未被修饰的大蛋白应该作为标志，变性的修饰的蛋白的PI估计约在±0。25个单位。 同理，已知蛋白的理论分子量可以从数据库中计算，利用产生的表观分子量的网格来估计蛋白的分子量。 未被修饰的小蛋白的错误率大约30%，而翻译后蛋白的出入更大。 故需联合其他的技术完成鉴定。

[font=宋体]蛋白质是包括人类在内的各种生物有机体的重要组成成分，是生命的物质基础之一。生物体的生长、发育、遗传和繁殖等一切生命活动都离不开蛋白质。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]随着分子生物学、结构生物学、基因组学等研究的不断深入，人们意识到仅仅依靠基因组的序列分析来试图阐明生命活动的现象和本质是远远不够的。只有从蛋白质组学的角度对所有蛋白质的总和进行研究，才能更科学地掌握生命现象和活动规律，更完善地揭示生命的本质。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]由此许多学者将生命科学领域的研究焦点从基因转向蛋白质，使蛋白质成为揭示生命活动现象和分子生物学机理的重要研究对象。研究蛋白质首要的步骤是将目的蛋白从复杂的大分子混合物中分离纯化出来，得到高纯度具有生物学活性的目的物。因此，高效的纯化技术和手段是蛋白质研究的重要基础和关键之一。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=宋体]蛋白纯化的目的[/font] [/font][/b][font=宋体][font=宋体]蛋白纯化的目的是将目标蛋白质从细胞裂解液的全部组分中分离出来，同时仍保留蛋白的生物学活性及化学完整性。蛋白质的分离和提纯工作是一项艰巨而繁重的任务，需根据蛋白的特性选择合适的纯化方法来提高获得的蛋白制品的纯度。[/font] [/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=宋体]蛋白纯化的原理[/font] [/font][/b][font=宋体][font=宋体]不同蛋白质的氨基酸序列及空间结构不同，导致其在物理、化学、生物学等性质上存在差异，利用待分离蛋白质与其它蛋白质性质上的差异，即可以设计出一套合理的蛋白纯化方案。蛋白的纯化大致分为粗分离阶段和精细纯化阶段两个阶段。粗分离阶段主要将目的蛋白和其他细胞成分如[/font] [font=Calibri]RNA[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]DNA [/font][font=宋体]等分开，常用的方法为硫酸铵沉淀法。精细纯化阶段的目的是把目的蛋白与其他大小及理化性质接近的蛋白区分开来，[/font][/font][b][font=宋体][font=宋体]常用的方法有：凝胶过滤层析、离子交换层析、疏水层析、亲和层析等。[/font] [/font][/b][font=宋体] [/font][b][font=宋体]①[/font][font=宋体]凝胶过滤层析[/font][/b][font=宋体]凝胶过滤层析（又叫做分子筛）是根据样品的分子大小对样品进行分离的一种简单温和的层析技术。凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析，是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。不同于离子交换层析和亲和层析，凝胶过滤的层析样品不与层析柱料结合，因此，缓冲液成分不直接影响分辨率。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]原理：层析柱中的填料是球状颗粒的惰性的多孔网状结构的柱料，多是交联的聚糖[/font][font=Calibri]([/font][font=宋体]如葡聚糖或琼脂糖[/font][font=Calibri])[/font][font=宋体]类物质。在加入样品之后，样品中的小分子物质能进入球状填料内部，在柱子中停留时间较长；而大分子物质不能进入球状填料内部，停留时间较短。所以当样品经过凝胶过滤层析柱分离后，样品中的不同分子大小的物质就可以被分离开了。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]特点：[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]根据分子大小和形状进行分离[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]是一种非吸附的分离方式[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]缓冲液成分不直接影响分辨率，只需要一种缓冲液[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]操作便捷[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]②[/font][font=宋体]离子交换层析[/font][/b][font=宋体]离子交换层析是目前蛋白质分离纯化中应用最广泛的方法之一。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]原理：不同蛋白等电点差异，分子大小差异，在同一个流动相中电荷密度分布不同，电荷量不等，与具有相反电荷的离子交换介质结合强度不同，在流动相洗脱时保留时间不同，从而得以分离。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体]特点：[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]根据分子大小和等电点差异进行分离[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]灵敏度高，重复性，选择性好，分析速度快[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]③[/font][font=宋体]疏水层析[/font][/b][font=宋体]原理：疏水层析是依据蛋白质疏水性差异分离的。即根据蛋白质和疏水介质表面的疏水基团的可逆相互作用进行分离。蛋白的疏水性在高离子强度下被增强，因此在高离子强度环境中结合，通常采用降低离子强度的方式进行洗脱。独特的吸附分离模式使得疏水层析成为硫酸铵盐析后或离子交换高盐洗脱后理想的纯化方式。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]特点：[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]采用了盐的水溶液作为流动相，色谱条件温和，生物大分子的活性回收率很高。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]蛋白质在[/font][font=Calibri]HIC[/font][font=宋体]操作过程中是高盐上样，低盐洗脱（高盐浓度的样品不必作处理就可直接上样）。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]在一次色谱中可同时实现出去盐酸胍、蛋白质复性和分离三个目的。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]温度升高，蛋白质天然折叠伸展，暴露出更多内部疏水集团，使蛋白质的[/font][font=Calibri]HIC[/font][font=宋体]保留发生变化。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]色谱填料稳定性好，盐水体系作流动相无环境污染。[/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]④[/font][font=宋体]亲和层析[/font][/b][font=宋体][font=宋体]原理：[url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-by-ac][b]亲和层析[/b][/url]是应用生物高分子与配基可逆结合的原理，将配基通过共价键牢固结合于载体上而制得的层析系统。这种可逆结合的作用主要是靠生物高分子对它的配基的空间结构的识别。常用的生物亲和关系有酶[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]底物、底物类似物、抑制剂、激活剂、辅因子，抗体[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]抗原，激素[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]受体蛋白、载体蛋白，外源凝集素[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]多糖、糖蛋白、细胞表面受体，核酸[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]互补核苷酸序列、组蛋白、核酸结合蛋白等，具有高效、简单、快速的优点，是当前最为理想的分离纯化蛋白的方法。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]更多详情可以参看蛋白纯化技术[/font][font=Calibri]/[/font][font=宋体]方法：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-techniques[/font][/font][font=Calibri] [/font]

【序号】：1【作者】：段纯明 董海洲 【题名】：玉米醇溶蛋白的特性及应用研究【书名】：《粮食与食品工业》 【年、卷、期、起止页码】： 2007年01期 【全文链接】：http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-LSSP200701009.htm【序号】：2【作者】：耿存花 【题名】：高粱醇溶蛋白的提取及应用研究【书名】：《吉林农业大学》 【年、卷、期、起止页码】： 2014年 【全文链接】：http://cdmd.cnki.com.cn/Article/CDMD-10193-1014053185.htm【序号】：3【作者】：王维坚 郭立泉 【题名】：超声强化溶剂回流法提取玉米醇溶蛋白工艺的研究【书名】：《长春师范学院学报(自然科学版)》 【年、卷、期、起止页码】： 2009年02期 【全文链接】：http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-CCSS200902015.htm【序号】：4【作者】：姚晓敏 孙向军 卢杰 【题名】：可食性玉米醇溶蛋白成膜工艺的研究【书名】：《食品工业科技》 【年、卷、期、起止页码】： 2002年01期 【全文链接】：http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-SPKJ200201005.htm【序号】：5【作者】：贾祥祥 【题名】：制备条件对玉米醇溶蛋白膜性能的影响研究【书名】：《河南工业大学》 【年、卷、期、起止页码】： 2012年【全文链接】：http://cdmd.cnki.com.cn/Article/CDMD-10463-1012516468.htm

[font=宋体]重组蛋白的表达（尤其是使用细菌载体和宿主）是一项成熟的技术。难点在于如何将其以活化形式分离。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]重组蛋白的纯化是生物学研究中的重要技术。为了研究蛋白的特定功能和结构，研究人员必须将重组蛋白从生物体中分离并纯化。蛋白纯化方法主要利用不同重组蛋白之间的相似性和差异性。可以根据蛋白之间的相似性去除非蛋白物质，然后根据蛋白之间的差异分离纯化目标重组蛋白。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-tag][b]蛋白标签[/b][/url]是一种可以提高重组蛋白的溶解度、简化蛋白纯化的简单有效的工具，并通过简单的方法跟踪蛋白表达和纯化过程。此外，蛋白标签是追踪活细胞中蛋白和进程的一种有效工具，可以通过显微镜直接跟踪或者通过[/font][font=Calibri]Western blot[/font][font=宋体]、免疫沉淀或免疫染色间接进行跟踪。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]蛋白纯化的原理：[/b][/font][font=宋体]不同的重组蛋白具有不同的氨基酸序列和空间结构，导致其物理、化学和生物学特性存在差异。我们也可以根据目标蛋白与其他蛋白和裂解液的性质差异设计合理的蛋白纯化方案。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]大多数的纯化方案需要不止一步才能达到理想的纯度水平。该过程中的每一步都会造成一定的产品损失，假设每一步的获得率为[/font][font=Calibri]80%[/font][font=宋体]。因此，建议尽可能减少纯化步骤。起始原料的选择是纯化过程设计的关键。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]在背景信息、检测方法和样品规格都已到位的情况下，可以考虑采用三阶段纯化策略。纯化分为捕获、中度纯化和精细纯化三个阶段，每个阶段都有特定的目标。捕获阶段的目标是分离、浓缩和稳定目标产物。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification]蛋白纯化[/url]操作步骤：[/b][/font][font=宋体]理想情况下，最终的纯化过程包括样品制备，其中包括在需要时进行萃取和澄清，然后进行上述捕获、中度纯化和精细纯化三个阶段的纯化。步骤的数量始终取决于所需的纯度和蛋白的预期用途。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州提供不同表达系统的蛋白纯化服务，有细菌系统蛋白纯化、哺乳动物瞬时系统蛋白纯化、杆状病毒系统蛋白纯化。详情可以参看：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification[/font][/font]

[font=宋体] [font=宋体]重组蛋白纯化要利用不同蛋白间内在的相似性与差异，利用各种蛋白间的相似性来除去非蛋白物质的污染，而利用各蛋白质的差异将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来。每种蛋白间的大小、形状、电荷、疏水性、溶解度和生物学活性都会有差异，利用这些差异可将蛋白从混合物如大肠杆菌裂解物中提取出来得到重组蛋白。[/font][/font][font=宋体] [font=宋体][b]重组蛋白纯化常用的几个方法如下：[/b][/font][/font][font=宋体] [font=Calibri]1.[/font][font=宋体]蛋白纯化色谱法：[/font][/font][font=宋体] [font=宋体]色谱法无疑是下游处理中主要和常用的操作，因为色谱法相比其他单元操作具有某些优势。例如色谱法支持高分辨率的效率，可以分离分子性质非常相似的复杂粗制混合物。此外，色谱法是生物工艺中遇到的稀释溶液中捕获分子的理想选择。[/font][/font][font=宋体] [font=宋体]柱色谱法[/font][font=Calibri]([/font][font=宋体]层析法[/font][font=Calibri])[/font][font=宋体]的原理是将一个大的蛋白池分离成许多小的蛋白池，其中一些富集了目标蛋白。虽然柱色谱法有昂贵的专业设备，但只需要基本的设备就可以了。[/font][/font][font=宋体] [font=Calibri]2.[/font][font=宋体]亲和色谱法：[/font][/font][font=宋体] [font=宋体]亲和色谱法依赖于蛋白对基质结合配体的特异性和可逆性结合。该配体可以直接与目的蛋白结合或共价连接到蛋白的标签上与其相结合。亲和层析通常是最有效的纯化方法，通常用在纯化方案的早期阶段。这种特定的亲和相互作用能够捕获目标物，同时去除溶液中的污染物或其他分子，并一步富集或纯化目标分子，使其与其他不能结合配体的分子分离。[/font][/font][font=宋体] [font=宋体]除了理论上蛋白能够通过免疫亲和色谱纯化之外，亲和法仅限于具有特异结合特性的蛋白，而免疫亲和色谱是所有亲和技术中特异性最高的。[/font][/font][font=宋体] [font=Calibri]3.[/font][font=宋体]离子交换色谱法：[/font][/font][font=宋体] [font=宋体]离子交换色谱[/font][font=Calibri](IEX)[/font][font=宋体]是一种主要基于蛋白净电荷的色谱分离方法，通常用于追踪脱酰胺和琥珀酰亚胺的形成。[/font][font=Calibri]IEX[/font][font=宋体]有两种类型：阳离子交换和阴离子交换色谱法。当缓冲液[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值高于此[/font][font=Calibri]IP[/font][font=宋体]时，蛋白带负电（阴离子）；当[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值低于此[/font][font=Calibri]IP[/font][font=宋体]时，蛋白带正电（阳离子）。[/font][/font][font=宋体] [font=宋体]所有蛋白都表现出净电荷，这取决于蛋白氨基酸组成和任何共价连接的修饰。蛋白净电荷受溶解它的溶剂[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]所影响，因为溶剂会与蛋白进行氢离子交换。通常情况下，蛋白与[/font][font=Calibri]IEX[/font][font=宋体]的结合必须通过反复试验来确定，使用一系列[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值的溶剂以确定蛋白保留的最佳[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]。通常溶剂的[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值与[/font][font=Calibri]pI[/font][font=宋体]相差约一个[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]单位就足以实现蛋白结合。[/font][/font][font=宋体] [font=Calibri]4.HPLC[/font][font=宋体]法蛋白纯化：[/font][/font][font=宋体] [font=宋体]色谱法是一种常用分析技术，可以将混合物分离成单独的成分。高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]法通常称为[/font][font=Calibri]HPLC[/font][font=宋体]，在化学生物学研究实验室中广泛应用。[/font][/font][font=宋体] [font=宋体]在化学生物学中，单个分析物（如多肽）通常经色谱纯化后作为一种功能工具使用。高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]法[/font][font=Calibri](HPLC)[/font][font=宋体]是一种用于分析和分离液体样品的方法。在化学生物学实验室中，[/font][font=Calibri]HPLC[/font][font=宋体]是纯化多肽（人工合成或用合成器自动合成）和其他中小型有机分子不可或缺的过程。它还允许使用颗粒非常小的柱填料，这就给固定相和流经它的分子之间产生相互作用提供了更大的表面积，这样可以更好地分离混合物的成分。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]针对特定应用开发的[/font][font=Calibri]HPLC[/font][font=宋体]色谱柱有很多种类，如正相[/font][font=Calibri]HPLC(NP-HPLC)[/font][font=宋体]和反相[/font][font=Calibri]HPLC(RP-HPLC)[/font][font=宋体]。正确选择色谱柱是获得良好的[/font][font=Calibri]HPLC[/font][font=宋体]结果的关键。色谱柱的选择取决于我们希望分离的混合物的组分特性。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州提供从基因合成、载体构建到蛋白质表达、纯化的一站式服务，可以根据客户需求，选用不同表达[/font][font=Calibri]/[/font][font=宋体]纯化标签、表达宿主等，真正为客户实现深度私人定制。多种纯化体系，为蛋白表达、纯化提供多种选择，我们致力于为客户提供高质量、低成本的重组蛋白。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]更多[url=https://cn.sinobiological.com/services/recombinant-protein-expression-service][b]重组蛋白表达纯化服务[/b][/url]详情尽在：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/recombinant-protein-expression-service[/font][/font]

很多朋友问这样一个问题：为什么毕赤酵母表达困难?他们自己也很纳闷，重组酵母pcr检测也证明目的基因重组了，但是诱导之后就是在表达上清中检测不到目的蛋白，仔细研究操作手册后仍然不知道原因。本人，根据自己的经验，采用倒推的方法，按实验过程从后向前分析，供大家参考：1、诱导之后表达上清中检测不到目的蛋白：分析1：检测的方法是否有问题，要考虑是不是蛋白表达量低而没有检测到? 如果是蛋白表达低，可以选择浓缩蛋白，具体的方法很多，有TCA、丙酮、浓缩柱等等方法，之前在本版已经发过帖，在此不赘述。 2、如果蛋白浓缩N倍之后仍然检测不到，那基本可以确证蛋白并不在上清中。那么蛋白到哪里去了，考虑是否没有分泌出来，而是在胞内，那就需要通过裂解酵母来检 测胞内蛋白，具体的方法很多，在此也不赘述，曾整理过相关破碎的帖子。 3、如果胞内也没有目的蛋白表达，那么基本可以确定蛋白并没有表达。 4、为什么没有表达呢?倒推回来就是诱导的过程了，诱导体系是什么?甲醇浓度是多少?培养问题是多少，转速是多少?这些都要注意。甲醇一般是0.5%-1.0%，本人用的 是0.5%，也有很多人也用1.0%，曾见过一个帖子，说超过1.5%反而会抑制表达，没有验证过，供大家参考。培养问题28-30度比较合适，转速250rpm比较合适，诱导 体系没有固定的体系，说明书上推荐的是BMGY到OD600 2~6，换到BMMY中OD600 为1左右。 5、如果诱导的过程也没有问题，那问题就复杂了，特别是重组酵母PCR检测证明目的基因确实已经发生了重组。这个时候是最郁闷的了，但是郁闷怎么办，还是要找原 因，在此我给的建议是先做RT-PCR证明mRNA水平的情况，也就是说有没有转录。如果转录了，后续的操作也没有问题(本帖的1、2、3、4项)，那么只有重新设计实 验，比如换酵母株，有文章上说：用GS115表达不出蛋白，换KM71H后，大部分克隆能表达。 6、有个帖子说的很好，在此和大家分享一下。 1、 菌株：用GS115表达不出蛋白，换KM71H后，大部分克隆能表达。 2、温度：　在28度和室温下诱导表达，表达水平可能都不低。 3、pH：手册上用6.0，pH提高到6.8，不表达的蛋白可能就表达出来。BMMY的pH7.0-7.5比较合适。国内外做的最好的rHSA，最适pH大概5-6左右。pH3的时 候yeast和peptone好像会沉淀的，可以用磷酸和磷酸二氢钾调，具体比例自己去试试。 4、偏爱密码子： codon bias一般不是主要的问题，你要表达的蛋白特性才是主要问题，酵母对分子量大(30KD以上)，结构复杂(如一些蛋白酶)，二硫键含量多的 蛋白往往不能有效表达，尤其是分泌表达。密码子改造对一些较小的而且结构简单的蛋白表达量的提高可能有一些作用。比如一位战友用Pichia酵母表达一个单链 抗体，29KD，含有2对二硫键，表达量约几毫克每升，选用酵母偏好密码子全基因合成后，表达量没有什么提高。 5、表达时间与空质粒转化对照：诱导时间长了以后，是会有很多蛋白分泌出来的，时间越长杂蛋白就越多，且分子量都比较大。最好做一个空质粒转化的对照， 这样就会比较肯定到底是不是自身的蛋白分泌的结果。 6、污染：每个样品从G418板上挑10个左右单克隆于2ml BMGY摇菌(30ml玻璃管，比LB管大一点)，纱布一般用8层，一天左右看着比较浑离心，留样1ml，余 1ml换2ml BMMY诱导表达，3,4层纱布足够了。 污染一般都是跟瓶口覆盖有关的原因造成的，只盖纱布肯定会污染。加盖报纸后，就再没遇到过污染。如果只用6层纱布，污染的可能当然很大，100ml三角瓶， 装量10ml培养液，用橡筋把8层纱布和2层报纸拴紧封口，空气浴摇床。 7、不表达：蛋白有没有表达就要看你的运气了，一般重复2-3次实验都没有表达菌株，这个蛋白就放弃表达了。 8、表达量： 30KD,10mg/L表达量已经很高，最直接的方法是发酵，一般提高5-10倍。大肠杆菌一样出现大团的超表达蛋白。 9、糖基化：酵母分泌表达的N糖基化是可以预测的，有如下序列：N X S/T就是潜在的糖基化位点，X为任意氨基酸，1个糖基化位点会加上1-3KD左右的糖基。另外可 能还有O糖基化话，但是无法预测其位点，不过很少听说表达蛋白有O糖基化的。如果胞内表达，不存在糖基化的问题。 10、表型与表达：重组SalI和BglII酶切产生单交换和双交换，结果就是产生Mut+和Muts表型的菌株;前者在甲醇诱导表达时生长快，消耗的甲醇多，后者生长慢，消耗 的甲醇少，所以诱导表达时Muts表型要求更高的菌体浓度。一般用Mut+表型的较多，但是对某些蛋白Muts菌株可能表达的更好，只有试试才知道你的蛋白用那种菌 株表达较好。 11、培养基 YPD：最基本的培养用;BMGY：诱导表达前培养用;BMMY：诱导表达用;MD：电转化后筛选his+用。 YEPD是不能代替BMGY的，因为有葡萄糖，这样残留的葡萄糖会影响下一步的诱导表达。不过有一种方法是可行的，就是用YPG培养基代替，只是把YEPD中的葡萄糖 用3%的甘油代替，也可以降低成本。摇瓶毕竟不能和发酵罐比，甘油残余会抑制甲醇利用。 BMGY、BMMY灭菌后才能加甲醇、磷酸钾、生物素。配制BMMY时也没必要用5%过滤除菌的甲醇，在灭菌后使用前加100%甲醇至你要的浓度。 YNB可以高压灭菌，没问题的，也可以0.22um过滤处理，天冬氨酸和苏氨酸要待培养基高压灭菌后加入;配YPD时可以加入YPD一起灭菌，但时间不能太长，温度不能 太高，一般121-125度12-15分钟足够了。若时间过长，温度过高，可能导致YPD焦化。glucose和含氮化合物在一起容易产生美拉德反应，这是配制培养基中的禁忌。 颜色很深的话，基本不能使用了。或者含有葡萄糖和/或YNB的培养基108度35min高压灭菌。 小量发酵其实可以把培养基成分中的YNB和生物素去除，培养基价格便宜，操作又方便，可以直接灭菌，效果也很好(效果不比含YNB的差)。 如果是用自己配置的培养基，如玉米浸提液、麦芽浸提液、麦麸浸提液等等，可以不用换液，采取添料来维持酵母对培养基的营养需要。 用无机盐进行大规模发酵，更省钱。更多有关蛋白表达纯化的相关资料，请点击：资料专区

【序号】：1【作者】：刘君 【题名】：玉米醇溶蛋白在醇水中的凝聚行为和性质研究【书名】：天津科技大学 【年、卷、期、起止页码】： 2013年【全文链接】：http://d.wanfangdata.com.cn/Thesis/Y2517798【序号】：2【作者】：李崇达 【题名】：小麦醇溶蛋白的提取及其磁性微球的制备与性能研究【书名】：《河南工业大学》 【年、卷、期、起止页码】： 2011年【全文链接】：http://cdmd.cnki.com.cn/Article/CDMD-10463-1012461756.htm【序号】：3【作者】：王昶光 【题名】：小麦醇溶蛋白载体材料及其肝靶向给药系统的研究【书名】：《四川大学》 【年、卷、期、起止页码】： 2007年【全文链接】：http://cdmd.cnki.com.cn/Article/CDMD-10610-2007219987.htm

[font=宋体]在分子生物学和生物工程领域，蛋白表达载体构建是至关重要的技术之一，它涉及到将目的基因插入到适当的表达载体中，以便在宿主细胞内进行蛋白表达。这一过程不仅有助于研究基因的功能和蛋白质的结构，还为药物开发、基因治疗等领域提供了有力支持。本文将详细介绍蛋白表达载体构建的整个流程，包括目的基因的选择、载体的选择与改造、基因插入、转化、筛选与鉴定等关键步骤。[/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]蛋白表达载体构建流程：[/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]①[/font][font=Calibri]NCBI[/font][font=宋体]查找目的基因的[/font][font=Calibri]CDS[/font][font=宋体]序列[/font][/font][font=宋体][font=宋体]进入[/font][font=Calibri]NCBI[/font][font=宋体]（美国国家生物技术信息中心）的网站。[/font][/font][font=宋体]在搜索框中输入目的基因的名称或关键词。[/font][font=宋体][font=宋体]在搜索结果中找到[/font][font=Calibri]CDS[/font][font=宋体]（[/font][font=Calibri]Coding Sequence[/font][font=宋体]）序列，通常会显示基因的[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]序列。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]记录或复制所需的[/font][font=Calibri]CDS[/font][font=宋体]序列信息。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]②选择合适的表达载体[/font][font=宋体]根据目的基因的性质和所需的表达水平，选择适合的表达载体。[/font][font=宋体]考虑载体的克隆容量、复制子类型、筛选标记等。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]③确定双酶切位点[/font][font=宋体]根据目的基因和载体，选择合适的双酶切位点。[/font][font=宋体][font=宋体]确保酶切位点在[/font][font=Calibri]CDS[/font][font=宋体]序列和载体上都是独特的，避免切割其他部位。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]④[/font][font=Calibri]Primer 5[/font][font=宋体]预测目的序列酶切位点[/font][/font][font=宋体][font=宋体]使用[/font][font=Calibri]Primer 5[/font][font=宋体]或其他相关软件，根据已知的[/font][font=Calibri]CDS[/font][font=宋体]序列设计酶切位点的引物。[/font][/font][font=宋体]通过软件预测引物的特异性，确保它们仅与目的基因结合。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]⑤双酶切[/font][font=Calibri]buffer[/font][/font][font=宋体][font=宋体]根据选择的酶，准备相应的酶切[/font][font=Calibri]buffer[/font][font=宋体]。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]注意[/font][font=Calibri]buffer[/font][font=宋体]的[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值和离子浓度，确保酶的活性。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]⑥目的基因[/font][font=Calibri]CDS[/font][font=宋体]序列引物设计[/font][/font][font=宋体][font=宋体]根据[/font][font=Calibri]CDS[/font][font=宋体]序列，设计一对引物用于[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]扩增目的基因。[/font][/font][font=宋体]确保引物的特异性，避免与其他基因序列发生非特异性结合。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体]⑦转化[/font][font=宋体][font=宋体]制备感受态细胞，使其处于易于接受外源[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]的状态。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]将[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]扩增得到的目的基因与载体混合，进行转化反应。[/font][/font][font=宋体]将转化后的细菌在选择培养基上培养，筛选含有重组载体的阳性克隆。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体]⑧双酶切及鉴定[/font][font=宋体][font=宋体]提取阳性克隆的质粒[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]。[/font][/font][font=宋体]使用设计的引物进行双酶切反应。[/font][font=宋体]对酶切产物进行电泳分析，观察是否获得预期的片段，并进行凝胶回收。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体]⑨测序[/font][font=宋体]将回收的酶切产物进行序列测定。[/font][font=宋体][font=宋体]对比测序结果与目的基因的[/font][font=Calibri]CDS[/font][font=宋体]序列，确保没有突变或错误。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体]⑩阳性菌落扩大培养，用于后期蛋白纯化研究[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]选择测序正确的阳性菌落进行扩大培养。[/font][font=宋体]在摇瓶或发酵罐中进行高密度培养，为后续的蛋白表达提供充足的原料。[/font][font=宋体]在确定目的基因在载体上正确表达后，可以进行蛋白纯化研究。[/font][font=宋体]通过适当的纯化技术，如亲和层析、离子交换等，分离和纯化目的蛋白。[/font][font=宋体]对纯化的蛋白进行质量分析和功能研究。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]综上所述，蛋白表达载体构建是一个系统性的过程，涉及到多个关键步骤和复杂的技术操作。通过遵循这一流程，研究人员能够成功地在宿主细胞内表达所需蛋白，并进一步对其进行分析和功能研究。随着生物技术的不断发展，蛋白表达载体构建的应用领域将越来越广泛，为人类对生命现象的深入理解和疾病的防治提供更多可能性。因此，不断优化和完善这一技术对于生命科学领域的发展至关重要。更多[url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-production][b]蛋白表达生产[/b][/url]详情可以关注[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-production[/font][/font]

我正在做细胞色素C 胰蛋白酶酶解后[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LC-MS[/color][/url]测序，我想请教一下酶解的条件。酶的用量，时间，温度,pH,还有缓冲溶剂的配置

常用蛋白质沉淀剂的蛋白质沉淀效率 上清液PH 沉淀0。5ml血浆95%以上蛋白时所需沉淀剂体积/ml 三氯醋酸(0.1g/ml) 1.4~2.0 0.2 高氯酸 (0.06g/ml) 1.5 0.4 钨酸 2.2~3.9 0.6 焦磷酸(0.05g/ml) 1.6~2.7 0.4 硫酸铜-钨酸钠 5.7~7.3 1.0 氢氧化锌 6.5~7.5 1.5 硫酸铵 7.0~7.7 2.0 乙腈 8.5~9.5 1.0 丙酮 9~10 1.0 乙醇 9~10 1.5 甲醇 8.5~9.5 1.5

受蛋白类污染的硅胶基质反相柱，纯有机溶剂如乙腈或甲醇不能溶解多肽和蛋白质，所以清洗能力是不强的。那么其他的方法呢？

[align=left][font='times new roman'][size=16px]动植物膜脂和膜蛋白提取方法[/size][/font][/align][align=left][font='times new roman'][size=16px]大豆卵磷脂和肺腺癌细胞膜脂提取物的制备[/size][/font][/align]对于大豆卵磷脂样品，首先去除胶囊，将100 mg大豆卵磷脂样品用10 mL正己烷/异丙醇（1:1，v/v）稀释溶解，样品在4℃下超声10 min，样品再经0.45 μm微孔膜过滤，以备后续使用。肺腺癌细胞膜脂的提取方法参照Folch法。首先裂解肺腺癌细胞，向细胞液中加入18 mL已经配好的氯仿-甲醇（2:1，v/v）混合溶剂，摇匀后置于高速低温离心机4℃，3000 r/min离心10 min（摇匀过程中时刻注意溶液的温度，尽量避免温度过高）。然后向该体系中加入约2 mL的超纯水，摇匀后离心。上清液移除后用少量的甲醇-水（1:1，v/v）小心清洗上表面，得到肺腺癌磷脂提取物，过0.45 μm滤膜后，N[font='times new roman'][sub][size=16px]2[/size][/sub][/font]吹干，备用。冰箱-20℃保存，临用时现配溶液。[align=left][font='times new roman'][size=16px] [/size][/font][font='times new roman'][size=16px]肝脏膜蛋白质的制备[/size][/font][/align]参考试剂盒提取小鼠肝脏膜蛋白质的步骤如下：，试剂准备和组织预处理：取148 mg小鼠肝脏组织，用手术剪刀剪碎，移入4 mL离心管中，加入1 mL的膜蛋白提取剂A，冰浴15 min，之后将离心管中液体移入冰浴预冷玻璃匀浆器中，匀浆70次。去除未破碎的细胞：在4℃下将样品于900 g离心10 min，为了确保上清液的纯度应尽量避免接触沉淀。收集肝脏浆蛋白和细胞膜碎片：将上清液继续在4℃下1400 g离心40 min，获得细胞膜碎片。上清液（肝脏浆蛋白）应置于-70℃下保存备用。提取肝脏膜蛋白质：尽量将上一步骤中上清液吸取干净，避免肝脏浆蛋白的干扰。加入300 μL膜蛋白提取剂B，高速涡旋10 s后立即进行冰浴10 min，重复上述步骤三次。随后立即4℃下14,000 g离心15 min，吸取上清肝脏膜蛋白溶液，-70℃下保存备用。

[font=宋体][b]蛋白纯化的原理：[/b][/font][font=宋体]不同的重组蛋白具有不同的氨基酸序列和空间结构，导致其物理、化学和生物学特性存在差异。我们也可以根据目标蛋白与其他蛋白和裂解液的性质差异设计合理的蛋白纯化方案。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]大多数的纯化方案需要不止一步才能达到理想的纯度水平。该过程中的每一步都会造成一定的产品损失，假设每一步的获得率为[/font][font=Calibri]80%[/font][font=宋体]。因此，建议尽可能减少纯化步骤。起始原料的选择是纯化过程设计的关键。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]在背景信息、检测方法和样品规格都已到位的情况下，可以考虑采用三阶段纯化策略。纯化分为捕获、中度纯化和精细纯化三个阶段，每个阶段都有特定的目标。捕获阶段的目标是分离、浓缩和稳定目标产物。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]蛋白纯化实际操作：[/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体]理想情况下，最终的纯化过程包括样品制备，其中包括在需要时进行萃取和澄清，然后进行上述三个阶段的纯化。步骤的数量始终取决于所需的纯度和蛋白的预期用途。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]分析纯化通常利用三个特性来分离蛋白。首先，蛋白可以通过[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]梯度凝胶或离子交换柱，根据其等电点进行纯化。其次，根据蛋白大小或分子量，可以通过体积排除色谱法分离或通过[/font][font=Calibri]SDS-PAGE([/font][font=宋体]十二烷基硫酸钠[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]聚丙烯酰胺凝胶电泳[/font][font=Calibri])[/font][font=宋体]分析。通常采用[/font][font=Calibri]2D-PAGE[/font][font=宋体]对蛋白进行纯化，然后进行肽质量指纹图谱分析，以确定蛋白的特性。这对于实现科学目的非常有用，目前蛋白的检测限非常低，纳克级的蛋白足以用于分析。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]如何应用纯化原则：[/b][/font][font=宋体]①纯化技术的选择和组合：[/font][font=宋体]这种组合的目的是发展出一条最快的方法来获得所需纯度的产品。对于任何色谱分离来说，不同的技术在回收率、分辨率、速度和容量方面的表现都各不相同。我们可以对一种技术进行优化，使其专注于其中一个参数；例如分辨率要在速度和容量两个参数之间达到最佳。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]分辨率是通过技术的选择和色谱基质产生窄峰的效率来实现的。一般来说，此时目标蛋白和杂质具有非常相似的性质，分辨率是最难实现的。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]②标签蛋白的纯化[/font][font=Calibri]:[/font][/font][font=宋体][font=宋体]在蛋白中添加标签可以使蛋白具有它本来不具有的结合亲和力。通常重组蛋白是混合物中唯一具有这种亲和力的蛋白，有助于蛋白分离。最常见的标签是对镍或钴离子有亲和力的组氨酸标签（[/font][font=Calibri]His[/font][font=宋体]标签）。因此，我们通过将镍离子或钴离子固定在树脂上，可以创建与组氨酸标签蛋白特异性结合的亲和介质。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]③评估纯化产量：[/font][font=宋体][font=宋体]通常使用[/font][font=Calibri]SDS PAGE[/font][font=宋体]监测纯化过程中的不同步骤。这一方法只能粗略地测量混合物中不同蛋白的量，并且无法区分具有相似分子量的蛋白。为了评估多步纯化的过程，必须将特定蛋白的量与总蛋白的量进行比较。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]蛋白表达纯化实验中注意事项有哪些？[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1. [/font][font=宋体]选择表达载体时，要根据所表达蛋白的最终应用考虑。如为方便纯化，可选择融合表达；如为获得天然蛋白，可选择非融合表达。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]2. [/font][font=宋体]融合表达时在选择外源[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]同载体分子连接反应时，对转录和转译过程中密码结构的阅读不能发生干扰。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]3. [/font][font=宋体]菌液[/font][font=Calibri]OD[/font][font=宋体]值要小于[/font][font=Calibri]1[/font][font=宋体]，否则细胞太浓太老，不易破碎，且质粒易丢失。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]4. [/font][font=宋体]诱导时间最好做一个梯度，不同蛋白诱导时间需摸索。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]5. [/font][font=宋体]诱导温度适当摸索。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]6. IPTG[/font][font=宋体]浓度：一般在[/font][font=Calibri]1 mM [/font][font=宋体]以内，可适当摸索。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]7. [/font][font=宋体]超声条件可视实际情况改变，只要使菌体裂解充分即可，即菌液清亮不粘稠。[/font][font=宋体][b]义翘神州提供[/b][url=https://cn.sinobiological.com/services/e-coli-protein-expression-service][b]原核蛋白纯化服务[/b][/url][b]，服务内容包括：[/b][/font][font=宋体]①基因合成及密码子优化[/font][font=宋体]②载体构建[/font][font=宋体]③表达鉴定和可溶性分析[/font][font=宋体][font=宋体]④放大表达和[/font][font=Calibri]1-2[/font][font=宋体]步纯化[/font][/font][font=宋体]⑤大量表达及纯化[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]更多详情可以关注：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/e-coli-protein-expression-service[/font][/font]